CN117616036A

CN117616036A - 用于治疗炎性疾病和自身免疫性疾病的修饰的il-2多肽

Info

Publication number: CN117616036A
Application number: CN202280048801.8A
Authority: CN
Inventors: 贝托尔特·克雷夫特; 维杰亚·拉格万·帕塔比拉曼; 鲁本·阿尔瓦雷斯桑切斯; 马加利·穆勒; 让-菲利普·卡拉洛特
Original assignee: Mingfeng Treatment Co ltd
Current assignee: Mingfeng Treatment Co ltd
Priority date: 2021-07-09
Filing date: 2022-07-09
Publication date: 2024-02-27
Also published as: CN117615793A

Abstract

本公开内容涉及修饰的IL‑2多肽、包含修饰的IL‑2多肽的组合物、制备它们的方法以及使用修饰的IL‑2多肽用于治疗疾病包括自身免疫性疾病的方法。在一方面，本公开内容涉及使用修饰的IL‑2多肽治疗自身免疫性疾病。在一些实施方案中，所公开的IL‑2多肽表现出与IL‑2受体α的结合增强和/或与IL‑2受体β的结合降低。在另一方面，与T效应细胞相比，修饰的IL‑2多肽表现出增强的激活T调节细胞的能力。

Description

用于治疗炎性疾病和自身免疫性疾病的修饰的IL-2多肽

交叉引用

本申请要求2021年7月9日提交的美国临时申请第63/219,995号、和2021年7月9日提交的美国临时申请第63/219,989号的权益，这些申请通过引用以其整体并入本文。

背景

白细胞介素-2(IL-2)是在调节免疫系统中重要的细胞因子信号传导分子。IL-2参与帮助免疫系统区分外源与内源细胞类型，从而防止免疫系统攻击受试者自己的细胞。IL-2通过与由淋巴细胞表达的IL-2受体(IL-2R)相互作用而实现其活性。通过这些结合相互作用，IL-2可以调节受试者的T效应(T_eff)细胞、自然杀伤(NK)细胞和调节性T细胞(T_reg)的群体。

IL-2调节免疫系统的能力至少部分由IL-2与IL-2Rα亚基(CD25)和IL-2Rβ亚基(CD122)的不同亲和力所驱动。天然IL-2通过由IL-2Rβ和IL-2Rγ亚基组成的中等亲和力受体作用于静息淋巴细胞。激活的淋巴细胞和T_reg细胞另外表达IL-2Rα亚基，它与β和γ亚基结合以形成对IL-2具有高亲和力的受体。当作用于高亲和力αβγ受体时，IL-2可增强T_reg细胞的激活和增殖，从而调节受试者的免疫应答。

由于这些原因，IL-2已被用于治疗涉及免疫系统的各种疾病，无论是单独使用还是与其他疗法联合使用。然而，IL-2作为治疗的使用受到毒性(其包括危及生命以及有时致命的血管渗漏综合征)以及它的短半衰期(需要在八天内每天给药三次)的限制。需要对各种IL-2受体亚基具有不同选择性的改进的IL-2多肽，例如，增强IL-2Rα的结合以增强治疗潜力并将IL-2疗法副作用的风险降到最低。

概述

在一方面，本文提供了一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，包括：修饰的IL-2多肽，其中修饰的IL-2多肽包含至多7个天然氨基酸取代，其中7个天然氨基酸取代包含残基Y31、K35和Q74处的氨基酸取代；并且其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ IDNO:1作为参考序列。

在另一方面，本文提供了一种修饰的IL-2多肽，包含：修饰的IL-2多肽，其中修饰的IL-2多肽对IL-2受体α亚基(IL-2Rα)表现出约0.1nM和约100nM之间的结合亲和力，并且其中修饰的IL-2多肽对IL-2受体β亚基(IL-2Rβ)表现出至少约1000nM的结合亲和力。

根据以下详细描述，本公开内容的另外的方面和优点对本领域技术人员而言将变得明显，详细描述中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方案。如将意识到的，本公开内容能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不偏离本公开内容。相应地，附图和描述应被认为本质上是说明性的而非限制性的。

通过引用并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每一个单独的出版物、专利或专利申请被特别和单独地指明通过引用并入。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相矛盾的情况，意图本说明书取代和/或优先于任何这样的矛盾材料。

附图简述

本公开内容的新颖特征特别地在所附权利要求书中阐述。通过参考以下详细描述和附图(本文中也称为“图(figure)”和“图(FIG.)”)将获得对本公开内容的特征和优点的更好理解，该详细描述阐述了其中利用了本公开内容的原理的说明性实施方案，在附图中：

图1示出了合成如本文提供的作为线性缩酚肽(depsipeptide)的修饰的IL-2多肽的合成方案。

图2示出了重排和折叠线性缩酚肽以提供如本文所提供的折叠的修饰的IL-2多肽的方案。

图3示出了产生如本文提供的PEG化修饰的IL-2多肽的方案。

图4A示出了通过不同浓度的阿地白介素、组合物A和组合物A1处理后，T_eff细胞中STAT5磷酸化的平均荧光强度(MFI)。

图4B示出了通过不同浓度的阿地白介素、组合物A和组合物A1处理后，T_eff细胞中STAT5磷酸化的平均荧光强度(MFI)。

图4C示出了本文提供的修饰的IL-2多肽对多种T细胞亚型的STAT5磷酸化的EC₅₀值。

图5示出了通过生物层干涉法(BLI)确定的组合物A1和阿地白介素对IL-2Rα和IL-2Rβ的亚基的结合亲和力。

图6示出了向小鼠皮下施用的0.1mg/kg或0.3mg/kg的组合物A1的药代动力学。

图7示出了施用所示剂量后不同时间点组合物A1或阿地白介素对不同淋巴细胞群体的免疫药效学效应。上部左图示出了pSTAT5阳性T_reg细胞％；上部中图示出了pSTAT5阳性T_eff细胞％；上部右图示出了pSTAT5阳性NK细胞％；中部左图示出了Ki67阳性T_reg细胞％；中部中图示出了Ki67阳性T_eff细胞％；中部右图示出了Ki67阳性NK细胞％；下部左图示出了T_reg计数相对于基线的倍数变化；下部中图示出了T_eff计数相对于基线的倍数变化；下部右图示出了NK计数相对于基线的倍数变化。

图8A示出了评估组合物A1延缓小鼠对钥孔血蓝蛋白超敏性的能力的实验设计。

图8B示出了作为24、48、72和96小时肿胀的量度的以mm报告的右耳(用KLH攻击)和对侧耳(注射盐水)之间的耳厚度差异。进行双因素ANOVA揭示了时间(F(4,216)＝48.16；p<0.0001)和治疗(F(5,54)＝13.74；p<0.0001)的显著影响，表明随时间的推移，这些变化受到组合物A1治疗的调节。数据以平均值±SEM报告(每个实验组n＝10)。

图8C示出了作为攻击后整体肿胀的量度的以曲线下面积(AUC)报告的右耳(用KLH攻击)和对侧耳(注射盐水)之间的耳厚度差异。进行单因素ANOVA揭示了治疗的显著效果(F(5,54)＝12.59；p<0.0001)，表明该参数受治疗的调节。多重比较与Dunnett检验显示，与媒介物对比，组合物A1在所有方案下都显著降低了耳部肿胀(**p<0.01，****p<0.0001)。数据以平均值±SEM报告(每个实验组n＝10)。

详细描述

本公开内容涉及可用作治疗剂的修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽。本文提供的修饰的IL-2多肽可用于治疗各种疾病和紊乱，包括炎性疾病或其他自身免疫性疾病。这样的修饰的IL-2多肽可以显示与野生型IL-2(SEQ ID NO:1)或阿地白介素(SEQ ID NO:2)不同的对IL-2受体(IL-2R)的结合特性。在一方面，本文描述的修饰的IL-2多肽对IL-2Rα复合物具有的增加的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβγ复合物具有未调节的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβγ复合物具有降低的亲和力。在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽可以包含增强对IL-2Rα受体亚基的结合亲和力的氨基酸取代。在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含降低对IL-2Rβ受体亚基的亲和力的氨基酸取代。在一些实施方案中，当体内施用时，与野生型IL-2或阿地白介素相比，修饰的IL-2多肽具有诱导更少T效应(T_eff)细胞的生物活性。在一些实施方案中，当体内施用时，与野生型IL-2或阿地白介素相比，本文提供的修饰的IL-2多肽具有相当的诱导调节性T细胞(T_reg)的能力(例如，具有不超过10倍大、不超过100倍大的EC₅₀)。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含修饰的氨基酸残基。这样的修饰可以采取野生型IL-2多肽(诸如SEQ ID NO:1的氨基酸序列)的氨基酸取代的形式，对SEQ ID NO:1的序列添加或缺失氨基酸，或在氨基酸残基上添加部分。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:1序列中的第一氨基酸的缺失。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含C125S取代，使用SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含选自Y31、K35、Q74和/或N88的一个或更多个残基处的取代，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。这些取代可以与C125S取代和/或N-末端缺失组合，诸如SEQ ID NO:1序列中第一氨基酸的缺失。在一些实施方案中，Y31取代是Y31H取代。在一些实施方案中，K35取代是K35R取代。在一些实施方案中，Q74取代是Q74P取代。在一些实施方案中，N88取代是N88D取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Y31H取代、K35R取代和Q74P取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Y31H取代、K35R取代、Q74P取代和N88D取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Y31H取代、K35S取代、Q74P取代和C125S取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Y31H取代、K35S取代、Q74P取代、N88D取代和C125S取代。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽是合成的多肽。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽通过α-酮酸-羟胺(KAHA)酰胺形成连接来合成。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含非天然氨基酸，诸如高丝氨酸，其在KAHA连接反应中用于连接多于一个多肽片段以合成全长修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，这些是修饰的IL-2多肽中仅有的非天然氨基酸。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在野生型IL-2或阿地白介素中存在的一个或更多个甲硫氨酸残基处的正亮氨酸(Nle)残基取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在位置23、39和46处的正亮氨酸残基。

本文所述的修饰的IL-2多肽可以包含一个或更多个非典型氨基酸(本文也称为“非天然氨基酸”)。“非典型”氨基酸可以指不属于通常掺入天然存在的蛋白中的20种典型氨基酸的D形式或L形式的氨基酸残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的一个或更多个氨基酸用一个或更多个非典型氨基酸取代。非典型氨基酸包括但不限于N-α-(9-芴甲氧羰基)-L-叠氮基赖氨酸(Fmoc-L-Lys(N₃)-OH)、N-α-(9-芴甲氧羰基)-L-联苯丙氨酸(Fmoc-L-Bip-OH)和N-α-(9-芴甲氧羰基)-O-苄基-L-酪氨酸(Fmoc-L-Tyr(Bzl)-OH)或它们的未受保护的类似物。

此外，聚合物可以被添加至修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，添加聚合物以便增加多肽的半衰期。这样的半衰期延长性聚合物可以添加至修饰的IL-2多肽的N-末端。半衰期延长性聚合物可以具有任何尺寸，包括至多约6kDa、至多约30kDa或至多约50kDa。在一些实施方案中，半衰期延长性聚合物是PEG聚合物。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含选自表1的一个或更多个氨基酸取代或缺失。

表1

WT IL-2残基数*	WT IL-2残基	取代或修饰
			1	A	缺失
18	L	R,K
			22	Q	N,H,K,Y,I,E
23	M	L,R,S,T,V,A
			29	N	S
31	Y	H
			35	K	R,E,D,Q
37	T	A,R
			46	M	A
48	K	E,C
			69	V	A
71	N	R
			74	Q	P
81	R	A,G,S,T
			85	L	V
86	I	V
			88	N	A,D,E,F,G,H,I,M,Q,R,S,T,V,W
89	I	V
			92	I	K,R
125	C	S,E,K,H,W,I,V,A
			126	Q	A,C,D,E,F,G,H,I,K,L,M,N,R,S,T,Y

*残基位置编号基于SEQ ID NO:1作为参考序列

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含选自表2的一个或更多个氨基酸取代。

表2

*残基位置编号基于SEQ ID NO:1作为参考序列

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含一种或更多种选自表3的聚合物。在一些实施方案中，一种或更多种聚合物共价附接至修饰的IL-2多肽的N-末端。

表3

本文描述的修饰的IL-2多肽也可以化学合成而不是表达为重组多肽。修饰的IL-2多肽可以通过合成全长的修饰的IL-2多肽的一种或更多种片段、将片段连接在一起、并使所连接的全长多肽折叠来制备。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Y31H、K35R、Q74P和C125S取代，以及任选地共价附接至修饰的IL-2多肽的N-末端的PEG聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Y31H、K35R、Q74P、N88D和C125S取代，以及任选地共价附接至修饰的IL-2多肽的N-末端的PEG聚合物。

在一些实施方案中，当施用于受试者时，修饰的IL-2多肽使调节性T细胞(T_reg)的细胞增殖或激活增强。在一些实施方案中，当施用于受试者时，修饰的IL-2多肽使T_reg的增殖或激活增强，而不损害(sparing)T效应细胞(T_eff)和/或自然杀伤(NK)细胞。在一些实施方案中，当施用于受试者时，修饰的IL-2多肽使T_reg细胞增加，而不使CD8+T细胞和NK细胞大幅增加。

以下描述和实例详细说明了本公开内容的实施方案。应当理解，本公开内容不限于本文描述的特定实施方案，并因此可以变化。本领域的技术人员将认识到，本公开内容有许多变化和修改，这些都包括在本公开内容的范围内。

尽管本公开内容的各个特征可以在单个实施方案的上下文中被描述，但是这些特征也可以单独地或以任何合适的组合被提供。相反，尽管本公开内容可以为了清楚起见在单独的实施方案的上下文中在本文描述，但是本公开内容也可以以单个实施方案实施。

本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。

所有术语意图按照本领域技术人员将理解的方式理解。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

以下定义补充了本领域的定义，并针对本申请，而不应归于任何相关或不相关的情况，例如任何共同拥有的专利或申请。尽管与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料都可以用于实践对本公开内容的测试，但本文描述了优选的方法和材料。相应地，本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的，并不意图是限制性的。

I.定义

本文使用的术语仅用于描述特定情况的目的，并不意图是限制性的。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。如本文使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”意图也包括复数形式，除非上下文另外清楚地指示。

在本申请中，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。如本文使用的术语“和/或”和“其任何组合”及其语法等同物可以可互换使用。这些术语可以表示任何组合都被特别地设想。仅出于说明的目的，以下措辞“A、B和/或C”或“A、B、C或其任何组合”可以意指“单独地A；单独地B；单独地C；A和B；B和C；A和C；以及A、B、C”。除非上下文特别指分开使用，否则术语“或”可以结合地或分开地使用。

术语“约”或“大约”可以意指在如由本领域的普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围以内，其将部分地取决于值如何被测量或确定，即，测量系统的限制。例如，“约”可以根据本领域的实践意指1个或多于1个标准差以内。可选地，“约”可以意指特定值的最多20％、最多15％、最多10％、最多5％或最多1％的范围。可选地，特别是关于生物系统或生物过程，该术语可以意指在值的数量级以内，5倍以内或2倍以内。当在本申请和权利要求书中描述特定值时，除非另外说明，否则应该假定术语“约”意指特定值的可接受的误差范围以内。

如本说明书和权利要求书中使用的，词“包含(comprising)”(和包含(comprising)的任何形式，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)，“具有(having)”(和具有(having)的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括(including)”(和包括(including)的任何形式，诸如“包括(include)”和包括“(include)”)，或“含有(containing)”(和“含有(containing)”的任何形式，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含性的或开放式的，并不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。设想了本说明书中讨论的任何实施方案可以参考本公开内容的任何方法或组合物来实现，并且反之亦然。此外，本公开内容的组合物可以用于实现本公开内容的方法。

说明书中对“一些实施方案”、“实施方案”、“一种实施方案”或“其他实施方案”的提及意指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本公开内容的至少一些实施方案中，但不必包含在所有实施方案中。为了便于理解本公开内容，一些术语和措辞定义如下。

本文提及了“附接”或“共价附接”到IL-2多肽残基上的聚合物。如本文所用，“附接”或“共价附接”意指聚合物被拴系至指示的残基，并且这种拴系可以包括连接基团(即，接头)。因此，对于“附接”或“共价附接”到残基的聚合物，明确地设想这样的连接基团也被包括在内。

结合亲和力是指单个分子与其配体/结合配偶体之间结合相互作用的强度。较高的结合亲和力是指比较低的结合亲和力更高强度的结合。在一些情况下，结合亲和力通过两个相关分子之间的解离常数(K_D)来测量。当对K_D值进行比较时，具有较低值的结合相互作用将比具有较高值的结合相互作用具有更高的结合亲和力。对于蛋白质-配体相互作用，K_D根据以下公式计算：

其中[L]是配体的浓度，[P]是蛋白质的浓度，并且[LP]是配体/蛋白质复合物的浓度。

本文提及了某些氨基酸序列(例如，多肽序列)，其与参考序列具有一定百分比的序列同一性，或者涉及在对应于参考序列的位置的位置处的残基。序列同一性使用矩阵BLOSUM62的以下参数通过蛋白-蛋白BLAST算法测量：空位成本存在(Gap CostsExistence):11、延伸(Extension):1和组分调整条件组分评分矩阵调整(CompositionalAdjustments Conditional Compositional Score Matrix Adjustment)。这种比对算法也用于通过分析被比较的两个序列的比对来评估残基是否处于“对应”位置。

术语“药学上可接受的”是指联邦或州政府的管理机构所批准的或可批准的或在美国药典或其他一般公认的药典中列出的用于在动物包括人类中使用的。

“药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂”是指可以与剂一起向受试者施用且不破坏其药理活性并且在以足以递送治疗量的剂的剂量施用时无毒性的赋形剂、载体或稀释剂。

适于本公开内容的“药学上可接受的盐”可以是本领域中通常认为适于与人类或动物的组织接触使用而没有过度的毒性、刺激、过敏响应或其他问题或并发症的酸盐或碱盐。这样的盐包括碱性残基诸如胺的矿物和有机酸盐，以及酸性残基诸如羧酸的碱或有机盐。特定的药物盐包括但不限于以下酸的盐：诸如盐酸、磷酸、氢溴酸、苹果酸、乙醇酸、富马酸、硫酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、甲酸、甲苯磺酸、甲磺酸、苯磺酸、乙烷二磺酸、2-羟乙基磺酸、硝酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、硬脂酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、帕莫酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、丙酸、羟基马来酸、氢碘酸、苯乙酸、烷酸诸如乙酸、HOOC-(CH₂)n-COOH，其中n是0-4等。类似地，药学上可接受的阳离子包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂和铵。本领域普通技术人员将从本公开内容和本领域知识中认识到，其他的药学上可接受的盐包括Remington’s Pharmaceutical Sciences,第17版,Mack PublishingCompany,Easton,PA,第1418页(1985)列出的那些。通常，药学上可接受的酸盐或碱盐可以通过任何常规化学方法从包含碱性或酸性部分的母体化合物合成。简言之，这样的盐可以通过将这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当碱或酸在适当的溶剂中反应来制备。

本文提供的范围被理解为该范围内所有值的简写。例如，1至50的范围被理解为包括来自由以下组成的组的任何数字、数字的组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50，以及上述整数之间的所有中间小数数值，诸如，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，从范围的任一端点延伸的“嵌套子范围(nested sub-range)”被特别地设想。例如，1至50的示例性范围的嵌套子范围可以包括在一个方向上的1至10、1至20、1至30和1至40，或者在另一个方向上的50至40、50至30、50至20和50至10。

术语“受试者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。仅以示例的方式，受试者包括但不限于哺乳动物，包括但不限于人类或非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物、牛科动物、马科动物、犬科动物、羊科动物或猫科动物。

本文提供的某些式和其他图示描绘了由叠氮化物-炔烃环加成反应产生的三唑反应产物。虽然这样的式通常仅描绘在反应中形成的所得三唑的单一位置异构体，但意图的是该式包括所得的两种位置异构体。因此，虽然式仅描绘了单一位置异构体(例如，)，但意图的是另一位置异构体(例如，/>)也被包括。

术语“任选的”或“任选地”表示随后描述的事件或情形可以发生但不必须发生，并且表示该描述包括其中该事件或情形发生的情况和其中该事件或情形没有发生的情况。

术语“部分”是指分子的特定区段或官能团。化学部分通常是嵌入或附加至分子上的公认的化学实体。

如本文所用的，“具有戊二酸和0.5kDa叠氮基PEG的N-末端”是指具有以下结构的对本文提供的IL-2多肽的N-末端胺的修饰：

虽然描述为具有叠氮化物官能团，但设想了在其中修饰的IL-2多肽包含具有戊二酸和0.5kDa叠氮基PEG的N-末端的每种情况下，叠氮化物可以被替代的缀合手柄代替。

“组合物A”是指修饰的SEQ ID NO:3的IL-2多肽，其包含具有戊二酸和0.5kDa叠氮基PEG的N-末端。

“组合物A1”是指组合物A与包含具有约30kDa的分子量的PEG的DBCO之间形成的反应产物。

“组合物B”是指修饰的SEQ ID NO:4的IL-2多肽，其包含具有戊二酸和0.5kDa叠氮基PEG的N-末端。

“组合物B1”是指组合物B与包含具有约30kDa的分子量的PEG的DBCO之间形成的反应产物。

“组合物C”是指修饰的SEQ ID NO:5的IL-2多肽，其包含具有戊二酸和0.5kDa叠氮基PEG的N-末端。

“组合物C1”是指组合物C与包含具有约30kDa的分子量的PEG的DBCO之间形成的反应产物。

“组合物D”是指修饰的SEQ ID NO:6的IL-2多肽，其包含具有戊二酸和0.5kDa叠氮基PEG的N-末端。

“组合物D1”是指组合物D与包含具有约30kDa的分子量的PEG的DBCO之间形成的反应产物。

“组合物E”是指修饰的SEQ ID NO:7的IL-2多肽，其包含具有戊二酸和0.5kDa叠氮基PEG的N-末端。

“组合物E1”是指组合物E与包含具有约30kDa的分子量的PEG的DBCO之间形成的反应产物。

“组合物F”是指修饰的SEQ ID NO:8的IL-2多肽，其包含具有戊二酸和0.5kDa叠氮基PEG的N-末端。

如本文所用，“缀合手柄”是指能够在接触互补反应基团时形成键的反应基团。在一些情况下，缀合手柄优选不具有与不包含预期互补反应基团的其他分子的实质性的反应性。缀合手柄、它们各自的互补缀合手柄、以及相应的反应产物的非限制性实例可见于下表中。虽然表格标题将某些反应基团置于标题“缀合手柄”或“互补缀合手柄”之下，但意图是对缀合手柄的任何引用可以代替地包括表中所列的互补缀合手柄(例如，反式环辛烯可以是缀合手柄，在这种情况下，四嗪将是互补缀合手柄)。在一些情况下，胺缀合手柄和与胺互补的缀合手柄不太优选用于生物系统，因为胺在生物系统中是普遍存在的，并且脱靶缀合的可能性增加。

缀合手柄的表

如本文使用的，术语“数均分子量”(Mn)意指样品中所有个体单元的统计平均分子量，并且由式(1)定义：

其中M_i是单元的分子量并且N_i是具有该分子量的单元的数量。

如本文使用的，术语“重均分子量”(Mw)意指由式(2)定义的数：

如本文使用的，“峰值分子量”(Mp)意指在特定的分析方法(例如质谱、尺寸排阻色谱、动态光散射、分析型离心等)中最高峰值的分子量。

II.描述

在一方面，本文描述了一种修饰的IL-2多肽，与T_eff细胞相比，其偏向于T_reg细胞的激活。在一方面，本文描述了包含修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽的修饰多肽，其中修饰的IL-2多肽包含一个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至少一个在选自Y31、K35、Q74和N88的残基处的氨基酸取代，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽在残基Y31、K35和Q74中的每一个处都包含氨基酸取代，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ IDNO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Y31H、K35R和Q74P的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽在残基Y31、K35、Q74和N88中的每一个处都包含氨基酸取代，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Y31H、K35R、Q74P和N88D的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含对修饰的IL-2多肽与IL-2Rα受体的结合有实质性影响的任何另外取代。

在另一方面，本文描述了一种修饰的多肽，包含：修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，其中，与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比，修饰的IL-2多肽表现出显著较低的激活T_eff细胞的能力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽保留了激活T_reg细胞的能力。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比，修饰的IL-2多肽表现出增强的激活T_reg细胞的能力。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比，修饰的IL-2多肽对IL-2Rα表现出降低至少约4x的解离常数(K_d)。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比，修饰的IL-2多肽对IL-2Rα表现出降低2倍至10倍的解离常数(K_d)。

结合亲和力

在一方面，本文描述了一种修饰的IL-2多肽，与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比，该修饰的IL-2多肽对IL-2受体α亚基表现出更大的亲和力。在一些实施方案中，通过解离常数(K_d)来测量对IL-2受体α亚基的亲和力。如本文所用，措辞“修饰的IL-2多肽/IL-2受体α亚基的K_d”意指修饰的IL-2多肽和CD25结合相互作用的解离常数。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2受体α亚基的K_d小于10nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2受体α亚基的K_d小于10nM、小于7.5nM、小于5nM、小于4nM或小于3nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2受体α亚基的K_d在约1nM和0.1nM之间。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2受体α亚基的K_d在约10nM和约0.1nM之间。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2受体α亚基的K_d在约10nM和约1nM之间。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2受体α亚基的K_d在约7.5nM和约0.1nM之间。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2受体α亚基的K_d在约7.5nM和约1nM之间。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2受体α亚基的K_d在约5nM和约0.1nM之间。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2受体α亚基的K_d在约5nM和约1nM之间。在一些实施方案中，K_d通过表面等离子体共振测量。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比，修饰的IL-2多肽对IL-2受体α亚基表现出至少约10％、50％、100％、250％或500％的更大的亲和力。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比，修饰的IL-2多肽对IL-2受体α亚基表现出至多约500％、750％或1000％的更大亲和力。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比，修饰的IL-2多肽对IL-2受体α亚基表现出约1.5倍至约10倍的更大的亲和力。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比，修饰的IL-2多肽对IL-2Rα表现出基本相同的结合亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2Rα表现出的K_d是SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽与IL-2Rα之间的K_d的约2倍之内，约4倍之内，约6倍之内，约8倍之内，或者约10倍之内。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比，修饰的IL-2多肽对IL-2受体β亚基(IL-2Rβ)表现出降低的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ表现出降低至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍或至少约500倍的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ表现出降低至少约100倍的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ基本上没有表现出亲和力。在一些实施方案中，亲和力被测量为解离常数K_d(例如，较低的亲和力与较高的离解常数相关)。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ表现出至少500nM、至少1000nM、至少5000nM、至少10000nM、至少50000nM或至少100000nM的结合亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ基本上没有表现出结合亲和力。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rα比对IL-2Rβ表现出至少约30倍大、至少约50倍大、至少约75倍大、至少约100倍大、至少约500倍大，或至少约1000倍大的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rα比对IL-2Rβ表现出至少约100倍大的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rα比对IL-2Rβ表现出至少约1000倍大的亲和力。

生物活性

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽能够扩增调节性T细胞(T_reg)细胞群体。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽不损害对效应T细胞(T_eff)的扩增。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比，修饰的IL-2多肽具有至多中度降低的激活T_reg细胞的半最大有效浓度(EC₅₀)。在一些实施方案中，当与修饰的IL-2多肽接触时，通过评估T细胞群体中STAT5磷酸化的变化来测量T_reg细胞的激活。在一些实施方案中，通过CD4⁺、CD25+和FoxP3⁺来识别T_reg细胞。在一些实施方案中，还通过显示CD25的表达升高(CD25^Hi)来识别T_reg细胞。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至多约100nM、至多约75nM、至多约50nM、至多约40nM、至多约35nM、至多约30nM或至多约25nM的激活T_reg细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至多约50nM、至多约40nM、至多约35nM、至多约30nM、或至多约25nM、至多约20nM、至多约15nM、至多约10nM或至多约5nM的激活T_reg细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至多约100nM的激活T_reg细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至多约50nM的激活T_reg细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至多约25nM的激活T_reg细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有从约0.1nM至约100nM、从约1nM至约100nM、从约0.1nM至约50nM、从约1nM至约50nM、从约0.1nM至约25nM、从约1nM至约25nM、从约0.1nM至约10nM或从约1nM至约10nM的激活T_reg细胞的EC₅₀。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比，修饰的IL-2多肽具有至多2倍、至多5倍、至多10倍、至多20倍、至多50倍、至多100倍、至多200倍、至多500倍或至多1000倍大的激活T_reg细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至多2倍大的激活T_reg细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至多5倍大的激活T_reg细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至多10倍大的激活T_reg细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至多50倍大的激活T_reg细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至多100倍大的激活T_reg细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至多200倍大的激活T_reg细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至多500倍大的激活T_reg细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至多1000倍大的激活T_reg细胞的EC₅₀。

在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比，修饰的IL-2多肽具有实质上更大的激活T_eff细胞的半最大有效浓度(EC₅₀)。在一些实施方案中，T_eff细胞是CD8 T_eff细胞(例如CD8⁺)、初始CD8细胞(例如，CD8⁺、CD45RA⁺)或CD4 Con细胞(例如，CD4⁺、FoxP3^-)中的1、2或3种或其任何组合。在一些实施方案中，当与修饰的IL-2多肽接触时，通过评估T细胞群体中STAT5磷酸化的变化来测量细胞的激活。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至少约10nM、至少约50nM、至少约100nM、至少约500nM、至少约1000nM、至少约2000nM、至少约3000nM、至少约4000nM或至少约5000nM的激活T_eff细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至少约100nM的激活T_eff细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至少约500nM的激活T_eff细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至少约1000nM的激活T_eff细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至少约5000nM的激活T_eff细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比，修饰的IL-2多肽具有至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍大的激活T_eff细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至少10倍大的激活T_eff细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至少50倍大的激活T_eff细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至少100倍大的激活T_eff细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至少500倍大的激活T_eff细胞的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽具有至少1000倍大的激活T_eff细胞的EC₅₀。

在一些实施方案中，与T_eff细胞相比，修饰的IL-2多肽表现出更大的激活T_reg细胞的能力。在一些实施方案中，激活T_eff细胞类型的EC₅₀与激活T_reg细胞类型的EC₅₀的比率为至少10、至少20、至少50、至少100、至少150或至少200。在一些实施方案中，激活T_eff细胞类型的EC₅₀与激活T_reg细胞类型的EC₅₀的比率为至少100。在一些实施方案中，激活T_eff细胞类型的EC₅₀与激活T_reg细胞类型的EC₅₀的比率为至少200。在一些实施方案中，激活T_eff细胞类型的EC₅₀与激活T_reg细胞类型的EC₅₀的比率为至少300。在一些实施方案中，激活T_eff细胞类型的EC₅₀与激活T_reg细胞类型的EC₅₀的比率为至少500。在一些实施方案中，激活T_eff细胞类型的EC₅₀与激活T_reg细胞类型的EC₅₀的比率为至少1000。

在一些实施方案中，在与修饰的IL-2多肽孵育(例如，在固定细胞进行体外实验实验前0.5h至1h)后约0.5h至约1h后测量激活水平。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含共价附接的聚合物用于半衰期延长。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含用于血浆或血清半衰期延长的共价附接的聚合物。在一些实施方案中，与未附接聚合物的野生型IL-2多肽(SEQ ID NO:1)或阿地白介素(SEQ ID NO:2)的血浆或血清半衰期相比，附接有聚合物的修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期长至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期与没有半衰期延长性聚合物的修饰的IL-2多肽的血浆或血清半衰期相比长至少1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或10倍。

位点特异性修饰

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含在一个或更多个氨基酸残基处的一个或更多个修饰。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的残基位置编号基于野生型人类IL-2多肽作为参考序列。

本文描述的多肽的修饰包括氨基酸取代、各种官能团的添加、氨基酸的缺失、氨基酸的添加、或者蛋白或蛋白片段的野生型形式的任何其他改变。可以添加至多肽的官能团包括聚合物、接头、烃基(alkyl)基团、可检测的分子诸如生色团或荧光团、反应性官能团或其任何组合。在一些实施方案中，官能团被添加至多肽的个体氨基酸。在一些实施方案中，官能团被位点特异性地添加至多肽。

在一方面，本文提供了一种包含一个或更多个氨基酸取代的修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，氨基酸取代影响修饰的IL-2多肽与IL-2受体亚基(例如α、β或γ亚基)或与IL-2受体复合物(例如IL-2受体αβγ复合物或βγ复合物)的结合特性。在一些实施方案中，氨基酸取代位于修饰的IL-2多肽和IL-2受体亚基或IL-2受体复合物之间结合相互作用的界面上的位置。在一些实施方案中，氨基酸取代导致对IL-2受体αβγ复合物或α亚基的亲和力增加。在一些实施方案中，氨基酸取代导致对IL-2受体βγ复合物或β亚基的亲和力降低。

在一方面，本文提供了一种修饰的IL-2多肽，其包含：包含相对于WT IL-2(SEQ IDNO:1)的天然氨基酸取代的修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至多7个天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至多六个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至多五个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至多四个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至多三个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含三至七个、三至六个、三至五个、三至四个、四至七个、四至六个、四至五个、五至七个、五至六个或六至七个天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个氨基酸取代。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含Y31、K35、Q74和N88D中的至少一个天然氨基酸取代，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Y31、K35、Q74和N88中的至少两个天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Y31、K35、Q74和N88中的至少三个天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽在Y31、K35、Q74和N88中的每一个处都包含天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含氨基酸取代Y31H、K35R、Q74P和N88D。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽还包含任选的C125取代(例如，C125S或C125A)。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽还包含残基A1的任选的A1缺失或取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽还包含任选的A1缺失。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含Y31取代，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，Y31取代是针对芳族氨基酸。在一些实施方案中，Y31取代是针对碱性氨基酸。在一些实施方案中，碱性氨基酸是弱碱性的。在一些实施方案中，Y31取代选自Y31F、Y31H、Y31W、Y31R和Y31K。在一些实施方案中，Y31取代是Y31H。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含K35取代，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，K35取代是针对碱性氨基酸。在一些实施方案中，K35取代是针对带正电荷的氨基酸。在一些实施方案中，K35取代是K35R、K35E、K35D或K35Q。在一些实施方案中，K35取代是K35R。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含Q74取代，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，Q74取代是环状氨基酸。在一些实施方案中，环状氨基酸包含共价附接到α碳上的环基团和附接到α碳上的氮。在一些实施方案中，Q74取代是Q74P。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含N88取代，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，N88取代是带电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，N88取代是带负电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，N88取代是N88D或N88E。在一些实施方案中，N88取代是N88D或N88E。在一些实施方案中，N88取代是N88D。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含C125取代，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，C125取代使修饰的IL-2多肽稳定。在一些实施方案中，C125取代基本上不改变修饰的IL-2多肽的活性。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含C125S取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含C125A取代。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含残基A1处的修饰，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰是A1缺失。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含对与IL-2受体α亚基或αβγ复合物的结合产生影响的另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含对与IL-2受体β亚基或βγ复合物的结合产生影响的另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至少一个选自表1的另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至少一个在残基E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、N88、I89或I92处的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至少一个在残基E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、I89或I92处的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含1、2、3或4个在选自E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、N88、I89或I92的残基处的天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含1、2、3或4个在选自E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、I89或I92的残基处的天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含1个在选自E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、N88、I89或I92的残基处的天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含2个。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至多2个在选自E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、N88、I89或I92的残基处的天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至多3个在选自E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、N88、I89或I92的残基处的天然氨基酸取代。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包含E15A、E15G或E15S。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包含N29S。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包含N30S。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包含T37A或T37R。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包含K48E。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包含V69A。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包含N71R。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包含N88A、N88D、N88E、N88F、N88G、N88H、N88I、N88M、N88Q、N88R、N88S、N88T、N88V或N88W。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包含N88D。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包含I89V。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包含I92K或I92R。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含Y31、K35、Q74处和任选的C125S的取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含实质上影响与IL-2受体α亚基或αβγ复合物结合的任何另外的取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含对与IL-2受体β亚基或βγ复合物的结合产生影响的另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含选自表1中鉴定的位置的任何另外的天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含选自表1的任何另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽在残基E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、N88、I89或I92处不包含任何另外的天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽在残基E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、N88、I89或I92处不包含任何另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽没有V69取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽没有V69A取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽没有K48取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽没有K48E取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含在V69或K48处的取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含在V69或K48任一处的取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含V69A或K48E取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含V69A或K48E任一取代。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含Y31、K35、Q74、N88处和任选的C125S的取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含实质上影响与IL-2受体α亚基或αβγ复合物结合的任何另外的取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含对与IL-2受体β亚基或βγ复合物的结合产生影响的另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含选自表1中鉴定的位置的任何另外的天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含选自表1的任何另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽在残基E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、I89或I92处不包含任何另外的天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽在残基E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、I89或I92处不包含任何另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽没有V69取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽没有V69A取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽没有K48取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽没有K48E取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含在V69或K48处的取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含在V69或K48任一处的取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含V69A或K48E取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含V69A或K48E任一取代。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含N-末端缺失。在一些实施方案中，N-末端缺失是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸。在一些实施方案中，N-末端缺失是至少1个氨基酸。在一些实施方案中，N-末端缺失是至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在一些实施方案中，N-末端缺失是从1至15个氨基酸。在一些实施方案中，N-末端缺失是单个氨基酸的缺失(例如，SEQ ID NO:1的A1缺失)。

如本文描述的修饰的IL-2多肽可以包含一个或更多个非天然氨基酸。“非天然”氨基酸可以指不属于通常掺入天然存在的蛋白中的20种典型氨基酸的D形式或L形式的氨基酸残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的一个或更多个氨基酸用一个或更多个非天然氨基酸取代。非天然氨基酸包括但不限于L-叠氮基赖氨酸和L-联苯丙氨酸。

示例性的非天然氨基酸还包括高丝氨酸、正亮氨酸、对乙酰基-L-苯丙氨酸、对碘-L-苯丙氨酸、对炔丙基氧基苯丙氨酸、对炔丙基苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对硼苯丙氨酸、对溴苯丙氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、酪氨酸氨基酸的类似物；谷氨酰胺氨基酸的类似物；苯丙氨酸氨基酸的类似物；丝氨酸氨基酸的类似物；苏氨酸氨基酸的类似物；β-氨基酸；除了脯氨酸或组氨酸之外的环状氨基酸；除了苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸之外的芳族氨基酸；或其组合。在一些实施方案中，非天然氨基酸选自β-氨基酸、高氨基酸和环状氨基酸。在一些实施方案中，非天然氨基酸包括β-丙氨酸、β-氨基丙酸、哌啶酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基庚二酸、锁链素、二氨基庚二酸、N^α-乙基甘氨酸、N^α-乙基天冬酰胺、异锁链素、别异亮氨酸、N^α-甲基甘氨酸、N^α-甲基异亮氨酸、N^α-甲基缬氨酸、γ-羧基谷氨酸、N^α-乙酰丝氨酸、N^α-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸和/或其他类似氨基酸。

在一些实施方案中，除非另有说明，否则除了本文提供的天然氨基酸取代的任何组合之外，本文提供的非天然氨基酸取代也可以掺入到IL-2多肽中。例如，在描述包含例如Y31H、K35R和Q74P天然氨基酸取代的修饰的IL-2多肽的情况下，明确设想了修饰的IL-2多肽也可以包含非天然氨基酸取代(例如，Hse41、Hse71、Hse104、Nle23、Nle39和Nle46)。作为另一实例，在本文提供的修饰的IL-2多肽被描述为具有Y31H、K35R、Q74P和N88D天然氨基酸取代的情况下，修饰的IL-2多肽还可以步包含非天然氨基酸取代(例如，Hse41、Hse71、Hse104、Nle23、Nle39和Nle46)。特别地，本文提供的重组修饰的IL-2多肽中存在的天然氨基酸取代的任何组合也可以掺入到修饰的IL-2多肽的合成形式中(例如，包含例如Hse41、Hse71、Hse104、Nle23、Nle39和Nle46的相应修饰的IL-2多肽)。

在一方面，本文公开了包含一个或更多个氨基酸取代的修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至少两个非天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至少一个在选自Y31、K35、Q74和N88的残基处的氨基酸取代，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于残基36-45的任何一个中的高丝氨酸(Hse)残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于残基61-81的任何一个中的Hse残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于残基94-114的任何一个中的Hse残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含1个、2个、3个或更多个Hse残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41、Hse71、Hse104或其组合。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41、Hse71和Hse104。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至少两个氨基酸取代，其中所述至少两个氨基酸取代选自(a)位于残基36-45的任何一个中的高丝氨酸(Hse)残基；(b)位于残基61-81的任何一个中的高丝氨酸残基；和(c)位于残基94-114的任何一个中的高丝氨酸残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41和Hse71。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41和Hse104。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse71和Hse104。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse71。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse104。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含1、2、3或更多正亮氨酸(Nle)残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于残基18-28的任何一个中的Nle残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于残基34-50的任何一个中的一个或更多个Nle残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于残基20-60的任何一个中的Nle残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含三个Nle取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Nle23、Nle39和Nle46。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含具有A1缺失的SEQ ID NO:3。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含表7中提供的SEQ ID NO:3-43的任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:3-43的任何一个的序列至少85％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:3-43的任何一个的序列至少85％相同的氨基酸序列，其中保留了参考氨基序列中相对于SEQ ID NO:1被取代的每个残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:3的序列至少85％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:3的序列至少80％、至少90％、至少95％或至少98％相同的氨基酸序列，其中保留了SEQ ID NO:3中相对于SEQ ID NO:1被取代的每个残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ IDNO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:4的序列至少85％相同的氨基酸序列，其中保留了SEQ ID NO:4中相对于SEQ ID NO:1被取代的每个残基。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:3至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:4至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％的序列同一性。在一些实施方案中，序列同一性使用矩阵BLOSUM62的以下参数通过蛋白-蛋白BLAST算法测量：空位成本存在:11、延伸:1和组分调整条件组分评分矩阵调整。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含3个至9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含3个或4个氨基酸取代、3个至5个氨基酸取代、3个至6个氨基酸取代、3个至7个氨基酸取代、3个至9个氨基酸取代、4个或5个氨基酸取代、4个至6个氨基酸取代、4个至7个氨基酸取代、4个至9个氨基酸取代、5个或6个氨基酸取代、5个至7个氨基酸取代、5个至9个氨基酸取代、6个或7个氨基酸取代、6个至9个氨基酸取代或7个至9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含3个氨基酸取代、4个氨基酸取代、5个氨基酸取代、6个氨基酸取代、7个氨基酸取代或9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至多4个氨基酸取代、5个氨基酸取代、6个氨基酸取代、7个氨基酸取代或9个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或更多个氨基酸取代选自表1。在一些实施方案中，一个或更多个氨基酸取代选自表2。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含用于修饰的天然氨基酸残基的取代，该取代可用于另外的官能团的附接，另外的官能团可用于促进各种有效载荷(例如聚合物)与修饰的IL-2多肽的缀合反应或附接。取代可以是更易于另外的官能团的附接的天然存在的氨基酸(例如，天冬氨酸/天冬酰胺、半胱氨酸、谷氨酸/谷氨酰胺、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸)、任何天然存在的氨基酸的修饰形式的衍生物、或任何非天然氨基酸(例如，包含期望的反应性基团(诸如点击化学试剂，诸如叠氮化物、炔烃等)的氨基酸)。修饰的天然氨基酸残基的非限制性实例包括下面提供的修饰的赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸和半胱氨酸：

其中每个n是1-30的整数。可以进行类似修饰的天然氨基酸的其他实例包括那些具有杂原子的氨基酸，该杂原子能够容易地与合适的基团形成键以将聚合物基团连接到氨基酸(例如，酪氨酸、丝氨酸、苏氨酸)。修饰的氨基酸残基的这些非限制性实例可用于期望向修饰的IL-2多肽添加另外的官能团(例如聚合物或另外的多肽)的任何位置处。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含包括聚合物的末端残基(例如，N-末端残基或C-末端残基)的修饰。在一些实施方案中，对末端残基的修饰包括将缀合手柄附接到修饰的IL-2多肽的末端残基。在一些实施方案中，缀合手柄通过修饰的IL-2多肽的N-末端氨基基团或C-末端羧基基团附接到修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，缀合手柄通过修饰的IL-2多肽的N-末端氨基基团附接到修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，缀合手柄通过戊二酰-氨基-PEG接头附接到修饰的IL-2多肽的N-末端氨基基团。在一些实施方案中，缀合手柄通过具有以下结构的加合物附接到修饰的IL-2多肽的N-末端氨基基团：

其中每个n独立地是1-30的整数(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)，并且其中X是缀合手柄(例如，本文提供的叠氮化物或其他缀合手柄，诸如DBCO基团)。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽将包含上述加合物，但是缀合手柄X被缀合手柄和互补缀合手柄(例如，1,2,3三唑)的反应产物替代，将修饰的IL-2多肽连接到另外的部分(例如，较大的聚合物或另外的多肽)。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的N-末端氨基基团包含具有以下结构的加合物：

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与另外的多肽连接。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与另外的多肽形成融合多肽。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与另外的多肽缀合在一起。在一些实施方案中，另外的多肽包含抗体或其结合片段。在一些实施方案中，抗体包括人源化抗体、鼠抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、其任何片段或其任何组合。在一些实施方案中，抗体是单克隆抗体或其任何片段(例如，抗原结合片段)。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不与另外的多肽缀合。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不与抗体缀合。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不与抗TNFα抗体缀合。

聚合物

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含共价附接在其上的一种或更多种聚合物。在一些实施方案中，描述的修饰的IL-2多肽包含与修饰的IL-2多肽共价附接的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种聚合物。在一些实施方案中，描述的修饰的IL-2多肽包含共价附接到IL-2多肽N-末端的聚合物。本文提供的聚合物可以直接附接到修饰的IL-2多肽的残基，也可以通过小的连接基团来附接(例如，通过与掺入到修饰的IL-2多肽中的缀合手柄反应来附接)。

本文提供的聚合物可以附接在IL-2多肽的任何所需残基处。在一些实施方案中，优选的是聚合物附接在不影响IL-2多肽与IL-2受体或特定IL-2受体亚基(例如，IL-2受体α亚基)结合的残基处。在一些实施方案中，聚合物附接在修饰的IL-2多肽的N-末端或靠近N-末端处。在一些实施方案中，聚合物与修饰的IL-2多肽的N-末端附接。在一些实施方案中，N-末端是IL-2多肽的残基A1，其中残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，N-末端是IL-2多肽的残基P2，其中残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列(例如，修饰的IL-2多肽包含序列中残基A1的缺失)。在一些实施方案中，聚合物附接在阻断或减少修饰的IL-2多肽与IL-2受体β亚基结合的残基位置处。这样的残基位置在美国专利公布第20200231644A1号中提供，该专利公布通过引用并入本文，如同以其整体在此阐述，并且包括例如残基位置K8、K9、L12、E15、H16、L19、D20、Q22、M23、N26、D84、N88、E95和Q126。

在一些实施方案中，聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧烷)。在一些实施方案中，水溶性聚合物是多糖。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧乙烷)。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含与IL-2多肽的N-末端共价附接的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与其共价附接的第二聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与其共价附接的第二聚合物和第三聚合物。

在一些实施方案中，附接的聚合物诸如聚合物具有约6,000道尔顿至约50,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有以下的重均分子量：约6,000道尔顿至约10,000道尔顿、约6,000道尔顿至约30,000道尔顿、约6,000道尔顿至约50,000道尔顿、约10,000道尔顿至约30,000道尔顿、约10,000道尔顿至约50,000道尔顿或约30,000道尔顿至约50,000道尔顿。在一些实施方案中，聚合物具有约6,000道尔顿、约10,000道尔顿、约30,000道尔顿或约50,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有至少约6,000道尔顿、约10,000道尔顿或约30,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有至多约10,000道尔顿、约30,000道尔顿或约50,000道尔顿的重均分子量。

在一些实施方案中，附接的聚合物，诸如附接到N-末端的聚合物具有约120道尔顿至约1,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有以下的重均分子量：约120道尔顿至约250道尔顿、约120道尔顿至约300道尔顿、约120道尔顿至约400道尔顿、约120道尔顿至约500道尔顿、约120道尔顿至约1,000道尔顿、约250道尔顿至约300道尔顿、约250道尔顿至约400道尔顿、约250道尔顿至约500道尔顿、约250道尔顿至约1,000道尔顿、约300道尔顿至约400道尔顿、约300道尔顿至约500道尔顿、约300道尔顿至约1,000道尔顿、约400道尔顿至约500道尔顿、约400道尔顿至约1,000道尔顿或约500道尔顿至约1,000道尔顿。在一些实施方案中，聚合物具有约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有至少约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿或约500道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有至多约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的重均分子量。

在一些实施方案中，附接的聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧烷)，诸如聚乙二醇(即，聚环氧乙烷)。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚乙二醇。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括改性聚(环氧烷)。

在一些实施方案中，改性聚(环氧烷)包含一个或更多个接头基团。在一些实施方案中，一个或更多个接头基团包括双官能接头，诸如酰胺基团、酯基团、醚基团、硫醚基团、羰基基团等。在一些实施方案中，一个或更多个接头基团包括酰胺接头基团。在一些实施方案中，改性聚(环氧烷)包含一个或更多个间隔物基团。在一些实施方案中，间隔物基团包括被取代或未被取代的C₁-C₆亚烃基(alkylene)基团。在一些实施方案中，间隔物基团包括-CH₂-、-CH₂CH₂-或-CH₂CH₂CH₂-。在一些实施方案中，接头基团是双正交反应(例如，生物相容性和选择性反应)的产物。在一些实施方案中，生物正交反应是Cu(I)催化或“无铜”的炔-叠氮三唑形成反应、Staudinger连接、逆电子需求Diels-Alder(IEDDA)反应、“光点击”化学或金属介导的过程，诸如烯烃复分解和Suzuki-Miyaura或Sonogashira交叉偶联。在一些实施方案中，聚合物经由点击化学与IL-2多肽附接。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含促进修饰的IL-2多肽与衍生化分子或部分(诸如抗体和聚合物(例如，另外的较大的聚合物))缀合的反应基团。在一些实施方案中，反应基团包括以下的一种或更多种：羧酸衍生的活性酯、混合酸酐、酰基卤化物、酰基叠氮化物、烃基卤化物、N-马来酰亚胺、亚氨基酯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。在一些实施方案中，反应基团包括叠氮化物。在一些实施方案中，反应基团包括炔烃。

在一些实施方案中，聚合物包含缀合手柄，该缀合手柄可用于进一步将另外的部分附接到修饰的IL-2多肽(例如，添加另外的多肽，诸如抗体)。能够与附接到另一个部分的互补反应基团反应的任何合适的反应基团都可以用作缀合手柄。

在一些实施方案中，聚合物包含缀合手柄或缀合手柄与互补缀合手柄的反应产物。在一些实施方案中，缀合手柄与互补缀合手柄的反应产物由KAT连接(酰基三氟硼酸钾与羟胺的反应)、Staudinger连接(叠氮化物与膦的反应)、四嗪环加成(四嗪与反式环辛烯的反应)、或Huisgen环加成(炔烃与叠氮化物的反应)产生。在一些实施方案中，聚合物包含缀合手柄与用于将聚合物附接到修饰的IL-2多肽的互补缀合手柄的反应产物。在一些实施方案中，聚合物包含叠氮化物部分。在一些实施方案中，聚合物包含炔烃部分。在一些实施方案中，聚合物包含叠氮化物部分、炔烃部分或叠氮基-炔烃环加成反应的反应产物。在一些实施方案中，叠氮基-炔烃环加成反应的反应产物是1,2,3-三唑。

在一些实施方案中，通过使用双官能接头将聚合物附接到修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，双官能接头与修饰的IL-2多肽上的氨基酸残基的反应基团(例如，半胱氨酸巯基)反应形成共价键。在一些实施方案中，在第二步中，双官能接头的第二反应基团(例如，缀合手柄，诸如叠氮化物或炔烃)然后用于附接第二部分，诸如聚合物。

在一些实施方案中，聚合物包含含有式(X)的结构的接头

其中L¹、L²、L³、L⁴、L⁵、L⁶、L⁷、L⁸和L⁹中的每一个独立地是-O-、-NR^L-、-(C₁-C₆亚烃基)NR^L-、-NR^L(C₁-C₆亚烃基)-、-N(R^L)₂ ⁺-、-(C₁-C₆亚烃基)N(R^L)₂ ⁺-、-N(R^L)₂ ⁺-(C₁-C₆亚烃基)-、-OP(＝O)(OR^L)O-、-S-、-(C₁-C₆亚烃基)S-、S(C₁-C₆亚烃基)-、-S(＝O)-、-S(＝O)₂-、-C(＝O)-、-(C₁-C₆亚烃基)C(＝O)-、-C(＝O)(C₁-C₆亚烃基)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NR^L-、-C(＝O)NR^L(C₁-C₆亚烃基)-、-(C₁-C₆亚烃基)C(＝O)NR^L-、-NR^LC(＝O)-、-(C₁-C₆亚烃基)NR^LC(＝O)-、-NR^LC(＝O)(C₁-C₆亚烃基)-、-OC(＝O)NR^L-、-NR^LC(＝O)O-、-NR^LC(＝O)NR^L-、-NR^LC(＝S)NR^L-、-CR^L＝N-、-N＝CR^L、-NR^LS(＝O)₂-、-S(＝O)₂NR^L-、-C(＝O)NR^LS(＝O)₂-、-S(＝O)₂NR^LC(＝O)-、被取代或未被取代的C₁-C₆亚烷基、被取代或未被取代的C₁-C₆亚杂烃基(C1-C6 heteroalkylene)、被取代或未被取代的C₂-C₆亚烯基、被取代或未被取代的C₂-C₆亚炔基、被取代或未被取代的C₆-C₂₀亚芳基、被取代或未被取代的C₂-C₂₀亚杂芳基、-(CH₂-CH₂-O)_qa-、-(O-CH₂-CH₂)_qb-、-(CH₂-CH(CH₃)-O)_qc-、-(O-CH(CH₃)-CH₂)_qd-、缀合手柄和互补缀合手柄的反应产物，或不存在；(C₁-C₆亚烃基)

每个R^L独立地是氢，被取代或未被取代的C₁-C₄烷基、被取代或未被取代的C₁-C₄杂烃基、被取代或未被取代的C₂-C₆烯基、被取代或未被取代的C₂-C₅炔基、被取代或未被取代的C₃-C₈环烃基(C3-C8 cycloalkyl)、被取代或未被取代的C₂-C₇杂环烃基、被取代或未被取代的芳基，或被取代或未被取代的杂芳基；并且

qa、qb、qc和qd中的每一个独立地是1-100的整数，

其中每个是与修饰的IL-2多肽或聚合物的聚合物部分附接的点。

在一些实施方案中，聚合物包含含有式(X’)结构的接头

其中每个L’独立地是-O-、-NR^L-、-(C₁-C₆亚烃基)NR^L-、-NR^L(C₁-C₆亚烃基)-、-N(R^L)₂ ⁺-、-(C₁-C₆亚烃基)N(R^L)₂ ⁺-、-N(R^L)₂ ⁺-(C₁-C₆亚烃基)-、-OP(＝O)(OR^L)O-、-S-、-(C₁-C₆亚烃基)S-、S(C₁-C₆亚烃基)-、-S(＝O)-、-S(＝O)₂-、-C(＝O)-、-(C₁-C₆亚烃基)C(＝O)-、-C(＝O)(C₁-C₆亚烃基)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NR^L-、-C(＝O)NR^L(C₁-C₆亚烃基)-、-(C₁-C₆亚烃基)C(＝O)NR^L-、-NR^LC(＝O)-、-(C₁-C₆亚烃基)NR^LC(＝O)-、-NR^LC(＝O)(C₁-C₆亚烃基)-、-OC(＝O)NR^L-、-NR^LC(＝O)O-、-NR^LC(＝O)NR^L-、-NR^LC(＝S)NR^L-、-CR^L＝N-、-N＝CR^L、-NR^LS(＝O)₂-、-S(＝O)₂NR^L-、-C(＝O)NR^LS(＝O)₂-、-S(＝O)₂NR^LC(＝O)-、被取代或未被取代的C₁-C₆亚烷基、被取代或未被取代的C₁-C₆亚杂烃基、被取代或未被取代的C₂-C₆亚烯基、被取代或未被取代的C₂-C₆亚炔基、被取代或未被取代的C₆-C₂₀亚芳基、被取代或未被取代的C₂-C₂₀亚杂芳基、-(CH₂-CH₂-O)_qa-、-(O-CH₂-CH₂)_qb-、-(CH₂-CH(CH₃)-O)_qc-、-(O-CH(CH₃)-CH₂)_qd-、缀合手柄和互补缀合手柄的反应产物，或不存在；(C₁-C₆亚烃基)

每个R^L独立地是氢，被取代或未被取代的C₁-C₄烷基、被取代或未被取代的C₁-C₄杂烃基、被取代或未被取代的C₂-C₆烯基、被取代或未被取代的C₂-C₅炔基、被取代或未被取代的C₃-C₈环烃基、被取代或未被取代的C₂-C₇杂环烃基、被取代或未被取代的芳基，或被取代或未被取代的杂芳基；

qa、qb、qc和qd中的每一个独立地是1-100的整数；并且

g是1-100的整数，

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含聚合物，该聚合物包含选自表4的接头。在表4中，每个是与修饰的IL-2多肽(例如，修饰的IL-2多肽的氨基基团)或聚合物的聚合物部分附接的点。

表4

在一些实施方案中，水溶性聚合物包含1个至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，水溶性聚合物包含1个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物包括1个聚乙二醇链至2个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至4个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、1个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至4个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链至6个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链或6个聚乙二醇链至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，水溶性聚合物包含1个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链、6个聚乙二醇链或10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，水溶性聚合物包含至少1个聚乙二醇链、2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链或6个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一水溶性聚合物包含至多2个聚乙二醇链、4个聚乙二醇链、6个聚乙二醇链或10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，水溶性聚合物包含4个聚乙二醇链。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括式(I)的结构

其中每个m独立地是4-30的整数。在一些实施方案中，水溶性聚合物的至少一个聚乙二醇链包含式(II)的结构

其中每个m独立地是4-30的整数，并且每个n独立地是1-10的整数。在一些实施方案中，水溶性聚合物的每个聚乙二醇链包含式(II)的结构。在式(II)的一些实施方案中，m是4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或40。在式(II)的一些实施方案中，n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地包含约5个至约300个、约10个至约200个、约20个至约100个或约25个至约50个乙二醇单元。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地包含5个乙二醇单元至300个乙二醇单元。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地包含5个乙二醇单元至10个乙二醇单元、5个乙二醇单元至20个乙二醇单元、5个乙二醇单元至25个乙二醇单元、5个乙二醇单元至50个乙二醇单元、5个乙二醇单元至100个乙二醇单元、5个乙二醇单元至200个乙二醇单元、5个乙二醇单元至300个乙二醇单元、10个乙二醇单元至20个乙二醇单元、10个乙二醇单元至25个乙二醇单元、10个乙二醇单元至50个乙二醇单元、10个乙二醇单元至100个乙二醇单元、10个乙二醇单元至200个乙二醇单元、10个乙二醇单元至300个乙二醇单元、20个乙二醇单元至25个乙二醇单元、20个乙二醇单元至50个乙二醇单元、20个乙二醇单元至100个乙二醇单元、20个乙二醇单元至200个乙二醇单元、20个乙二醇单元至300个乙二醇单元、25个乙二醇单元至50个乙二醇单元、25个乙二醇单元至100个乙二醇单元、25个乙二醇单元至200个乙二醇单元、25个乙二醇单元至300个乙二醇单元、50个乙二醇单元至100个乙二醇单元、50个乙二醇单元至200个乙二醇单元、50个乙二醇单元至300个乙二醇单元、100个乙二醇单元至200个乙二醇单元、100个乙二醇单元至300个乙二醇单元或200个乙二醇单元至300个乙二醇单元。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地包含5个乙二醇单元、10个乙二醇单元、20个乙二醇单元、25个乙二醇单元、50个乙二醇单元、100个乙二醇单元、200个乙二醇单元或300个乙二醇单元。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地包含至少5个乙二醇单元、10个乙二醇单元、20个乙二醇单元、25个乙二醇单元、50个乙二醇单元、100个乙二醇单元或200个乙二醇单元。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地包含至多10个乙二醇单元、20个乙二醇单元、25个乙二醇单元、50个乙二醇单元、100个乙二醇单元、200个乙二醇单元或300个乙二醇单元。

在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地是线性的或支链的。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链是线性聚乙二醇。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链是支链聚乙二醇。例如，在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种都包含线性聚乙二醇链。

在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用羟基、烃基、烷氧基、酰胺基或氨基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用氨基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用酰胺基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用烷氧基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用烃基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用羟基基团末端封端。在一些实施方案中，一个或更多个聚乙二醇链独立地具有结构其中n是4-30的整数。在一些实施方案中，一个或更多个聚乙二醇链独立地具有结构其中m是4-30的整数。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与其共价附接的多于一种聚合物。在一些实施方案中，每种聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，每种水溶性聚合物是聚(环氧烷)。在一些实施方案中，每种水溶性聚合物是聚乙二醇。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含1个至10个共价附接的水溶性聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含1个至10个共价附接的水溶性聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含1个或2个共价附接的水溶性聚合物、1个至3个共价附接的水溶性聚合物、1个至4个共价附接的水溶性聚合物、1个至6个共价附接的水溶性聚合物、1个至8个共价附接的水溶性聚合物、1个至10个共价附接的水溶性聚合物、2个或3个共价附接的水溶性聚合物、2个至4个共价附接的水溶性聚合物、2个至6个共价附接的水溶性聚合物、2个至8个共价附接的水溶性聚合物、2个至10个共价附接的水溶性聚合物、3个或4个共价附接的水溶性聚合物、3个至6个共价附接的水溶性聚合物、3个至8个共价附接的水溶性聚合物、3个至10个共价附接的水溶性聚合物、4个至6个共价附接的水溶性聚合物、4个至8个共价附接的水溶性聚合物、4个至10个共价附接的水溶性聚合物、6个至8个共价附接的水溶性聚合物、6个至10个共价附接的水溶性聚合物或8个至10个共价附接的水溶性聚合物。

在一些实施方案中，可以与修饰的IL-2多肽附接的水溶性聚合物包含式(A)的结构：

在一些实施方案中，可以与修饰的IL-2多肽附接的水溶性聚合物包含式(B)的结构：

在一些实施方案中，可以与修饰的IL-2多肽附接的水溶性聚合物包含式(C)的结构：

在一些实施方案中，可以与修饰的IL-2多肽附接的水溶性聚合物包含式(D)的结构：

在一些实施方案中，可以与修饰的IL-2多肽附接的水溶性聚合物包含式(E)的结构：

在一些实施方案中，与修饰的IL-2多肽附接的水溶性聚合物包含一个或更多个接头和/或间隔物。在一些实施方案中，一个或更多个接头包含一个或更多个酰胺基团。在一些实施方案中，一个或更多个接头包含一个或更多个赖氨酸基团。在一些实施方案中，与修饰的IL-2多肽附接的水溶性聚合物包含式(I)、式(II)、式(III)或其组合的结构。在一些实施方案中，与修饰的IL-2多肽附接的水溶性聚合物包含式(A)、式(B)、式(C)、式(D)、式(E)或其组合的结构。在一些实施方案中，与修饰的IL-2多肽附接的水溶性聚合物包含以下结构

在一些实施方案中，附接在N-末端处的水溶性聚合物包含一个或更多个接头和/或间隔物。在一些实施方案中，一个或更多个接头包含一个或更多个酰胺基团。在一些实施方案中，一个或更多个接头包含一个或更多个赖氨酸基团。在一些实施方案中，附接在N-末端处的水溶性聚合物包含式(I)、式(II)、式(III)或其组合的结构。在一些实施方案中，附接在N-末端处的水溶性聚合物包含式(A)、式(B)、式(C)、式(D)、式(E)或其组合的结构。在一些实施方案中，附接的水溶性聚合物包含以下结构

在一些实施方案中，聚合物由合适的前体物质合成。在一些实施方案中，聚合物由结构5、结构6、结构7或结构8的前体物质合成，其中结构5是

结构6是

结构7是

并且结构8是

III.组合物药物制剂

在一方面，本文描述了一种药物制剂，包含：本文描述的修饰的IL-2多肽；和药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，药物制剂包含多于一种修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，药物制剂还包含选自糖类、无机盐、抗氧化剂、表面活性剂或缓冲剂的一种或更多种赋形剂。

在一些实施方案中，药物制剂还包含糖类。在某些实施方案中，糖类选自由以下组成的组：果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖、棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、右旋糖酐、淀粉、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇(葡糖醇)、吡喃糖山梨醇、肌醇、环糊精及其组合。

在一些实施方案中，药物制剂包含无机盐。在某些实施方案中，无机盐选自由以下组成的组：氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾、硫酸钠或其组合。

在某些实施方案中，药物制剂包含抗氧化剂。在某些实施方案中，抗氧化剂选自由以下组成的组：抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、焦亚硫酸钾、没食子酸丙酯、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、维生素E、3,4-二羟基苯甲酸及其组合。

在某些实施方案中，药物制剂包含表面活性剂。在某些实施方案中，表面活性剂选自由以下组成的组：聚山梨醇酯、失水山梨醇酯、脂质、磷脂、磷脂酰乙醇胺、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、EDTA、锌及其组合。

在某些实施方案中，药物制剂包含缓冲剂。在某些实施方案中，缓冲剂选自由以下组成的组：柠檬酸、磷酸钠、磷酸钾、乙酸、乙醇胺、组氨酸、氨基酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、乳酸、tris、HEPES或其组合。

在一些实施方案中，药物制剂被制备为用于肠胃外或肠内施用。在一些实施方案中，药物制剂被制备为用于静脉内或皮下施用。在一些实施方案中，药物制剂呈冻干形式。

在一方面，本文描述了一种液体或冻干组合物，液体或冻干制剂包含描述的修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽是冻干粉末。在一些实施方案中，将冻干粉末重悬于缓冲溶液中。在一些实施方案中，缓冲溶液包含缓冲剂、糖、盐、表面活性剂或其任何组合。在一些实施方案中，缓冲溶液包含磷酸盐。在一些实施方案中，磷酸盐是钠Na₂HPO₄。在一些实施方案中，盐是氯化钠。在一些实施方案中，缓冲溶液包括磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方案中，缓冲溶液包含甘露醇。在一些实施方案中，将冻干粉末悬浮在包含10mM Na₂HPO₄缓冲液pH 7.5、0.022％ SDS和50mg/mL甘露醇的溶液中。

剂型

本文描述的修饰的IL-2多肽可以是各种剂型。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽作为冻干粉末的形式给药。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽作为悬浮液给药。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽作为溶液给药。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽作为可注射溶液给药。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽作为静脉内(IV)溶液给药。

IV.治疗方法

在一方面，本文描述了一种治疗有相应需要的受试者的自身免疫性疾病或紊乱的方法，包括：向受试者施用有效量的如本文描述的修饰的IL-2多肽或药物组合物。在一方面，本文描述了一种治疗有相应需要的受试者的癌症炎性疾病或紊乱的方法，包括：向受试者施用有效量的如本文描述的修饰的IL-2多肽或药物组合物。在一些实施方案中，自身免疫性疾病是T细胞介导的自身免疫性疾病。在一些实施方案中，炎性疾病或紊乱包括炎症(例如，软骨炎症)、自身免疫性疾病、特应性疾病、副肿瘤性自身免疫性疾病、关节炎、类风湿性关节炎(例如，活动性类风湿性关节炎)、幼年型关节炎、幼年特发性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、少关节类风湿性关节炎、少关节幼年类风湿性关节炎、多关节幼年类风湿性关节炎、全身性幼年类风湿性关节炎、幼年银屑病性关节炎、银屑病性关节炎、多关节类风湿性关节炎、全身性类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、幼年强直性脊柱炎、幼年肠病性关节炎、反应性关节炎、幼年反应性关节炎、Reiter综合征、幼年Reiter综合征、幼年皮肌炎、幼年硬皮病、幼年血管炎、肠病性关节炎、SEA综合征(血清阴性、附着端病、关节病综合征)、皮肌炎、银屑病性关节炎、硬皮病、血管炎、肌炎、多发性肌炎、皮肌炎、结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿病、动脉炎、风湿性多肌痛、结节病、硬化症、原发性胆道硬化、硬化性胆管炎、干燥综合征、银屑病、斑块型银屑病、点滴状银屑病、反向银屑病、脓疱型银屑病、红皮病型银屑病、皮炎、特应性皮炎、疱疹样皮炎、白塞病、脱发、斑秃、全秃、动脉粥样硬化、狼疮、斯蒂尔氏病、重症肌无力、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、哮喘、COPD、鼻窦炎、鼻窦炎伴息肉、嗜酸性粒细胞食管炎、嗜酸性粒细胞支气管炎、格林-巴利病、甲状腺炎(例如格雷夫斯病)、艾迪生氏病、雷诺氏现象、自身免疫性肝炎、移植物抗宿主病、类固醇难治性慢性移植物抗宿主病、移植排斥(例如肾、肺、心脏、皮肤、等)、肾损伤、丙型肝炎诱导的血管炎、自发性流产、白癜风、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)、微小病变肾病、膜性肾病、ANCA相关肾小球肾病、膜增生性肾小球肾炎、IgA肾病、狼疮性肾炎或其组合。

在一些实施方案中，炎性疾病或紊乱是神经炎性紊乱。在一些实施方案中，神经炎性紊乱是视神经脊髓炎谱系紊乱(neuromyelitis optica spectrum disorder)、多发性硬化症、抗髓磷脂少突胶质细胞糖蛋白抗体紊乱、自身免疫性脑炎、横贯性脊髓炎、视神经炎或神经系统结节病。在一些实施方案中，疾病或紊乱是肌萎缩侧索硬化。

V.制备方法

在一方面，本文描述了一种制备修饰的IL-2多肽的方法。在另一方面，本文描述了一种制备修饰的IL-2多肽的方法，该方法包括合成修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段并连接所述片段。在另一方面，本文描述了一种制备修饰的IL-2多肽的方法，该方法包括a.合成修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段，b.连接所述片段；以及c.折叠所连接的片段。合成IL-2多肽的方法的实例也可见于例如至少PCT公布第WO2021140416A2号、美国专利申请公布第US20190023760A1号和Asahina等人,Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,8226-8230中，其中的每一个通过引用并入文本，如同以其整体在此阐述。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段被化学合成。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段通过固相肽合成来合成。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段在自动化肽合成仪上合成。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽由2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种肽片段连接。在一些实施方案中，修饰的肽由2种肽片段连接。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽由3种肽片段连接。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽由4种肽片段连接。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽由2种至10种肽片段连接。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段被连接在一起。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的三种或更多种片段以顺序方式连接。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的三种或更多种片段以一锅反应连接。

在一些实施方案中，使连接的片段折叠。在一些实施方案中，折叠包括在修饰的IL-2多肽内形成一个或更多个二硫键。在一些实施方案中，连接的片段经历折叠过程。在一些实施方案中，连接的片段使用本领域熟知的方法折叠。在一些实施方案中，连接的多肽或折叠的多肽通过在其上附接一种或更多种聚合物来进一步修饰。在一些实施方案中，连接的多肽或折叠的多肽通过PEG化来进一步修饰。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽是合成的。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽是重组体。在一方面，本文描述了包含修饰的IL-2多肽的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞、禽类细胞以及昆虫细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞、COS细胞或酵母细胞。

在一方面，本文描述了产生修饰的IL-2多肽的方法，其中该方法包括在宿主细胞中表达修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，宿主细胞是原核细胞或真核细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是哺乳动物细胞、禽类细胞以及昆虫细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是CHO细胞、COS细胞或酵母细胞。

VI.SEQ ID

表5

/>

在以上表5中，Nle是正亮氨酸残基，并且Hse是高丝氨酸残基。

尽管已经详细描述了本公开内容及其优点，但应当理解，本文可以进行各种变化、替代和改变，而不偏离如所附权利要求书中限定的本公开内容的精神和范围。

本公开内容在以下实施例中进一步说明，这些实施例仅为了说明目的而提供，并不意图以任何方式限制本公开内容。

实施例1：修饰的IL-2多肽的合成——一般程序

IL-2线性蛋白的制备(代表性方案)

一般策略：本文所述的修饰的IL-2多肽，诸如具有例如SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:3-8或40-43中的任何、或SEQ ID NO:9-39中任何一个的合成版本的氨基酸序列的修饰的IL-2多肽，或本文另外描述的修饰的IL-2多肽，可以通过连接由固相肽合成(SPPS)制备的单独肽区段来合成。使用下文描述的方法在自动化肽合成仪上合成单独的肽。

材料和溶剂：具有适合Fmoc-SPPS的侧链保护基团的Fmoc-氨基酸、用于肽功能化的树脂聚乙二醇衍生物和试剂是商业上可获得的，并且不经进一步纯化而使用。HPLC级CH₃CN用于分析型和制备型RP-HPLC纯化。

保护的酮酸衍生物(区段1-3)在胺基树脂上的装载：将5g Rink-酰胺MBHA或ChemMatrix树脂(1.8mmol规模)在DMF中溶胀30min。在室温将树脂用含20％哌啶的DMF(v/v)处理两次，10min，进行Fmoc脱保护，随后用DMF洗涤几次。将Fmoc-AA-保护的-α-酮酸(1.8mmol，1.00当量)溶解在20mL DMF中，并用HATU(650mg，1.71mmol，0.95当量)和DIPEA(396μL，3.6mmol，2.00当量)预活化。将反应混合物添加到溶胀的树脂中。让其在室温在温和搅拌下反应6h。用DMF彻底冲洗树脂。对树脂上未反应的胺的封端通过添加在DMF(20mL)中的乙酸酐(1.17mL)和DIPEA(2.34mL)的溶液来进行。让其在室温在温和搅拌下反应15min。树脂用DCM随后用乙醚彻底冲洗，并干燥。通过二苯并富烯(dibenzofulvene)UV定量确定树脂的装载量为0.25mmol/g。

Fmoc-Thr(tBu)-OH在Wang树脂上的装载(区段4)：在Wang树脂上进行Fmoc-Thr-OH的预装载。将4g树脂(装载量：0.56mmol/g，2.24mmol规模)在DMF中溶胀15min。将树脂在室温用含20％(v/v)哌啶的DMF处理20min。将树脂用DMF洗涤几次。将Fmoc-Thr(tBu)-OH(638mg，1.68mmol，0.75当量)和HATU(638mg，1.68mmol，0.75当量)溶解在DMF(12mL)中。通过添加DIPEA(585μL，3.36mmol，1.5当量)在室温进行预活化3min。将反应混合物添加到溶胀的树脂中。让其在室温在温和搅拌下反应过夜。用DMF彻底冲洗树脂。对树脂上未反应的胺的封端通过添加在DMF(12mL)中的乙酸酐(1.27mL)和DIPEA(2.34mL)的溶液来启动。让其在室温在温和搅拌下反应15min。树脂用DCM彻底冲洗，并干燥。测量树脂的装载量(0.34mmol/g)。

固相肽合成(SPPS)：使用Fmoc-SPPS化学在自动化肽合成仪上合成肽区段。使用以下具有侧链保护基团的Fmoc-氨基酸：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc或Boc-Opr-OH(Opr＝5-(S)-氧杂脯氨酸)。在必要时将Fmoc-假脯氨酸二肽(Fmoc-pseudoproline dipeptides)掺入合成。用含有20％哌啶的DMF(2×8min)或包含0.1M Cl-HOBt的含25％哌啶的DMF(2×8min)或包含0.1MCl-HOBt的含20％哌啶的DMF(2×8min)进行Fmoc脱保护，并用反馈回路在304nm处通过UV监测以确保完全去除Fmoc。使用Fmoc-氨基酸(3.0-5.0当量，相对于树脂取代)、HCTU或HATU(2.9-4.9当量)作为偶联试剂，以及DIPEA或NMM(6-10当量)在DMF中在室温或50℃进行偶联。预活化3min后，将含有试剂的溶液添加到树脂中，并根据氨基酸而允许反应30min或2h。在一些情况下，需要双重偶联。在一些情况下，将树脂用DMF中的20％乙酸酐处理，用于对任何未反应的游离胺封端。

肽的树脂裂解和侧链脱保护：在肽合成完成后，在室温使用裂解混合物，将肽从树脂裂解，持续2h。滤去树脂，并浓缩滤液，并用冷乙醚处理，研磨并离心。仔细地倾析乙醚层，将残留物再次悬浮于乙醚中，研磨并离心。重复乙醚洗涤两次。将所得粗肽在真空下干燥并储存在-20℃。将获得的固体等分试样溶解在含有0.1％ TFA(v/v)的1:1的CH₃CN/H₂O中，并使用在60℃的C18柱(4.6×150mm)通过分析型RP-HPLC进行分析。使用MALDI-TOF或LC-MS鉴定产物的分子量。

IL-2区段1和2的连接和光脱保护：将IL-2Seg1(1.2当量)和IL-2Seg2(1当量)溶解在含有0.1M草酸的DMSO:H₂O(9:1，v/v)中(20mM肽浓度)，并允许在60℃反应22h。通过将连接瓶包裹在铝箔中使其避光。使用在60℃的C18柱(4.6×150mm)，使用含有0.1％ TFA的CH₃CN/H₂O作为流动相，以在7min内5％至95％ CH₃CN的梯度，通过HPLC监测KAHA连接的进展。连接完成后，用含有0.1％ TFA的CH₃CN/H₂O(1:1)稀释混合物，并在365nm的波长下照射1h。通过使用前述方法在HPLC上注射样品来确认光解反应的完成。然后通过制备型HPLC纯化溶液。

IL-2区段3和4的连接与Fmoc脱保护：将IL2-Seg3(1.2当量)和IL2-Seg4(1当量)溶解在含有0.1M草酸的DMSO/H₂O(9.8:0.2)中(15mM)，并允许在60℃反应20h。使用在60℃的C18柱(4.6×150mm)，将含有0.1％ TFA的CH₃CN/H₂O作为流动相，以在7min内30％至70％CH₃CN的梯度，通过HPLC监测KAHA连接的进展。连接完成后，用DMSO(6mL)稀释反应混合物，添加5％二乙胺(300μL)并将反应混合物在室温振荡7min。为制备纯化样品，将其用含有TFA(300μL)的DMSO(4mL)稀释。

最终连接：将IL2-Seg12(1.2当量)和IL2-Seg34(1当量)溶解在含有0.1M草酸的DMSO/H₂O(9:1)或(9.8:0.2)中(15mM肽浓度)，并允许连接在60℃进行24h。使用在60℃的C18柱(4.6×250mm)，使用含有0.1％ TFA的CH₃CN/H₂O作为流动相，以在14min内30％至95％CH₃CN的梯度，通过分析型HPLC监测KAHA连接的进展。连接完成后，用DMSO稀释反应混合物，然后用含有0.1％ TFA的(1:1)CH₃CN:H₂O混合物(7mL)进一步稀释。通过注射到制备型HPLC上来纯化样品。

Acm脱保护：将具有2×Acm的IL2线性蛋白溶解在AcOH/H₂O(1:1)中(0.25mM蛋白浓度)，并向溶液中添加AgOAc(1％m/v)。将混合物在50℃避光振荡2.5h。通过HPLC确定反应完成后，用含有0.1％ TFA的CH₃CN:H₂O(1:1)稀释样品，并通过制备型HPLC进行纯化。

肽的纯化：通过RP-HPLC纯化肽区段、连接的肽和线性蛋白。对不同的肽施加不同的梯度。流动相为含0.1％ TFA(v/v)的MilliQ-H₂O(缓冲液A)和含0.1％ TFA(v/v)的HPLC级CH₃CN(缓冲液B)。制备型HPLC在40℃或60℃在(50×250mm)或C18柱(50×250mm)上以40mL/min的流量进行。

肽的表征：通过RP-HPLC分析肽区段、连接的肽和线性蛋白。流动相为含0.1％ TFA(v/v)的MilliQ-H₂O(缓冲液A)和含0.1％ TFA(v/v)的HPLC级CH₃CN(缓冲液B)。分析型HPLC在室温的C4柱(3.6μm，150×4.6mm)上进行或在60℃的C18柱(3.6μm，150×4.6mm)上以1mL/min的流量进行。使用配备有双ESI/MALDI-FTICR源的SolariX(9.4T磁体)质谱仪(Bruker，Billerica，USA)通过高分辨率傅立叶变换质谱(FTMS)对肽和蛋白质进行表征，使用4-羟基-α-氰基肉桂酸(HCCA)作为基质。

实施例2-IL-2(SEQ ID NO:3)的组合物A和A1变体的合成

组合物A的IL-2(1-39)-Leu-α-酮酸(区段1A)的合成

肽合成：IL2(1-39)-Leu-α-酮酸区段1A(参见SEQ ID NO:3的残基1-40)在预先装载具有～0.25mmol/g的取代量的Fmoc-Leu保护的-α-酮酸(0.8g)的Rink-酰胺MBHA树脂上以0.2mmol的规模合成。区段1A的自动Fmoc-SPPS按照“固相肽合成(SPPS)”一般程序进行。缀合手柄的插入如下进行。第一手动偶联反应通过向树脂中添加在DMF中的戊二酸酐(CASRN108-55-4，114.10mg，5当量)和DIPEA(242μL，7当量)，在室温进行30min。其次，通过向树脂中添加在DMF中的DIPEA(276μL，8当量)和HATU(300mg，3.95当量)，与在DMF中的商业上可获得的O-(2-氨基乙基)-O’-(2-叠氮乙基)九乙二醇(化合物2，421mg，当量)在室温进行偶联3小时。用DCM洗涤树脂并在真空下干燥。干燥的肽基树脂的质量为1.6g。粗肽按照“肽的树脂裂解和侧链脱保护”程序，使用95:2.5:2.5的TFA/DODT/H₂O v/v/v的混合物(10mL/g树脂)在室温沉淀2.0小时。

纯化：C18柱(5μm，50×250mm)，流量40mL/min，在60℃，梯度：在25min内30％至80％ B。将含有纯化产物的级分汇集并冻干，以获得纯度为97％的为白色固体的区段1A。基于树脂装载量的分离产量为260mg(25％)。HRMS(ESI)：C₂₂₈H₃₉₄N₆₄O₇₂；平均同位素计算：5182.9193Da[M+H]⁺；测量(found)：5182.9111Da[M+H]⁺。

组合物A的Opr-IL2(42-69)光保护的-Leu-α-酮酸(区段2A)的合成的

肽合成：Opr-IL2(42-69)-Leu-光保护的-α-酮酸区段2A(参见SEQ ID NO:3的残基41-70)在预先装载具有～0.25mmol/g的取代量的Fmoc-Leu-光保护的-α-酮酸(0.8g)的Rink-酰胺MBHA树脂上以0.2mmol的规模合成。区段2A的自动Fmoc-SPPS按照“固相肽合成(SPPS)”一般程序进行。用DCM洗涤树脂并在真空下干燥。干燥的肽基树脂的质量为1.8g。粗肽按照“肽的树脂裂解和侧链脱保护”程序，使用95:2.5:2.5的TFA/DODT/H₂O v/v/v的混合物(15mL/g树脂)的混合物在室温沉淀2.0小时。

纯化：C18柱(5μm，50×250mm)，流量40mL/min，在60℃，梯度：在30min内10％至60％ B。将含有纯化产物的级分汇集并冻干至纯度为97％的为白色固体的区段2A。基于树脂装载量的分离产量为203mg(20％)。HRMS(ESI)：C₁₈₄H₂₈₆N₄₀O₅₂S；平均同位素计算：3922.0742Da[M+H]⁺；测量：3922.0680Da[M+H]⁺。

组合物A的Fmoc-Opr IL2(72-102)-Phe-α-酮酸(区段3A)的合成

肽合成：Fmoc-Opr IL2(72-102)-Phe-α-酮酸区段3A(参见SEQ ID NO:3的残基71-103)在预先装载具有～0.286mmol/g的取代量的Fmoc-Phe-光保护的-α-酮酸(0.8g)的Rink-酰胺ChemMatrix树脂上以0.2mmol的规模合成。区段3A的自动Fmoc-SPPS按照“固相肽合成(SPPS)”一般程序进行。用DCM洗涤树脂并在真空下干燥。干燥的肽基树脂的质量为2.17g。粗肽按照“肽的树脂裂解和侧链脱保护”程序，使用95:2.5:2.5的TFA/DODT/H₂O v/v/v的混合物(10mL/g树脂)在室温沉淀2.0小时。

纯化：C18柱(5μm，50×250mm)，流量40mL/min，在40℃，2步骤梯度：在10min内10％至30％ B，然后在30min内30％至80％ B。将含有纯化产物的级分汇集并冻干至纯度为98％的为白色固体的区段3A。基于树脂装载量的分离产量为200mg(17.6％)。HRMS(ESI)：C₁₈₄H₂₈₃N₄₅O₅₃；平均同位素计算：3973.0891Da[M+H]⁺；测量：3973.0995Da[M+H]⁺。组合物A的IL-2OPR-IL2(105-133)(区段4A)的合成

肽合成：Opr-IL2(105-133)区段4A(参见SEQ ID NO:3的残基104-133)在预先装载具有～0.34mmol/g的取代量的Fmoc-Thr-OH(0.294g)的Wang树脂上以0.1mmol的规模合成。区段4A的自动Fmoc-SPPS按照“固相肽合成(SPPS)”一般程序进行。用DCM洗涤树脂并在真空下干燥。干燥的肽基树脂的质量为725mg。粗肽按照“肽的树脂裂解和侧链脱保护”程序，使用92.5:2.5:2.5:2.5的TFA/TIPS/DODT/H₂O v/v/v/v的混合物(10mL/g树脂)在室温沉淀2小时。

纯化：C18柱(5μm，50×250mm)，流量40mL/min，40℃，梯度：10％至50％ B，40min。将含有纯化产物的级分汇集并冻干，以获得纯度为90.8％的为白色固体的区段4A。基于树脂装载量的分离产量为40mg(8％)。HRMS(ESI)：C₁₅₈H₂₄₁N₃₇O₅₂S；平均同位素计算：1175.2449Da[M+H]⁺³；测量：1175.2440Da[M+H]⁺³

用于制备组合物A的IL2-Seg12(区段12A)的KAHA连接

连接和光脱保护：区段12A按照一般程序“IL-2区段1和2的连接和光脱保护”获得，将34mg(6.56μmol；1.1当量)的区段1A和19mg(4.9μmol；1.0当量)的区段2A溶解于241μL的含0.1M草酸的9.5:0.5v/v DMSO/H₂O中。

纯化：C18柱(5μm，50×250mm)，流量40mL/min，在40℃，2步骤梯度：在5min内10％至40％ B，然后在30min内40％至70％ B。将含有纯化产物的级分汇集并冻干，以获得纯度为98％的为白色固体的区段12A。分离产率为55％(25.5mg)。HRMS(ESI)：C₄₀₀H₆₆₇N₁₀₃O₁₁₉S；平均同位素计算：8855.2806Da[M+H]⁺；测量：8855.9008Da[M+H]⁺。用于制备组合物A的IL2-Seg34(区段34A)的KAHA连接

连接：区段34A按照一般程序“IL-2区段3和4的连接与Fmoc脱保护”获得，将69mg(17.5μmol；1.1当量)的区段3A和59mg(16.6μmol；1.0当量)的区段4A溶解在1100μL的含有0.1M草酸的9.9:0.1DMSO/H₂O v/v溶液中。

纯化：C18柱(5μm，50×250mm)，流量40mL/min，在40℃，梯度：在40min内20％至60％ B。将含有纯化产物的级分汇集并冻干，以获得纯度为95％的为白色固体的区段34A。分离产率为33％(42.3mg)。HRMS(ESI)：C₃₂₆H₅₁₄N₈₂O₁₀₁S；平均同位素计算：7229.7437Da[M+H]⁺；测量：7229.7618Da[M+H]⁺。

用于制备组合物A的IL2线性蛋白(区段1234A)的最终KAHA连接

连接：区段1234A按照一般程序“最终连接”获得，将45mg(5.1μmol；1.2当量)的区段12A和31mg(16.6μmol；1.0当量)的区段34A溶解在220μL的含有0.1M草酸的9.5:0.5DMSO/H₂O v/v中。

纯化：C18柱(5μm，50×250mm)，流量40mL/min，在40℃，梯度：在30min内30％至80％ B。将含有纯化产物的级分汇集并冻干，以获得纯度为95％的为白色固体的Acm保护的区段1234A。分离产率为26％(18mg)。

Acm脱保护：半胱氨酸残基的脱保护按照一般程序“Acm脱保护”进行，以18mg Acm保护的区段1234A作为起始材料。

纯化：C18柱(5μm，20×250mm)，流量10mL/min，在40℃，2步骤梯度：在5min内10％至30％ B，然后在20min内30％至95％ B。将含有纯化产物的级分汇集并冻干，以获得纯度为97％的为白色固体的区段1234A。分离产率为17％(11.6mg)。HRMS(ESI)：C₇₁₉H₁₁₇₁N₁₈₃O₂₁₆S₂；平均同位素计算：15898.5963Da[M+H]⁺；测量：15898.6118Da[M+H]⁺。组合物A的IL-2线性蛋白的折叠

线性蛋白的重排：将IL2-Seg1234-A线性蛋白(11.7mg，0.736μmol)溶解在含有0.1M Tris和30mM还原型谷胱甘肽的6M Gu·HCl水溶液中(15μM蛋白浓度)，并在50℃温和振荡混合物2小时。

线性重排蛋白的折叠(方法1)：重排反应完成后，将样品冷却至室温，并用0.1MTris和1.5mM氧化型谷胱甘肽pH 8.0稀释(5μM蛋白浓度)。允许折叠在室温进行20小时。然后，用TFA将样品酸化至pH 3，并通过以下制备型HPLC进行纯化：使用保持在室温的C4柱(20×250mm)，使用含0.1％ TFA(v/v)的CH₃CN/H₂O作为流动相，以60min内含有0.1％ TFA的5％至40％至95％乙腈的两步骤梯度，流量为10.0mL/min。将含有产物的级分汇集并冻干，以产生纯度为98％的为白色粉末的纯的折叠的蛋白组合物A(2.2mg，折叠和纯化步骤的产率为19％)。通过分析型RP-HPLC、MALDI-TOF和分析型尺寸排阻法确认纯的蛋白的纯度和身份。HRMS(ESI)：C₇₁₉H₁₁₆₉N₁₈₃O₂₁₆S₂；平均同位素计算：15896.5806Da[M+H]⁺；测量：15896.6322Da[M+H]⁺。

IL-2蛋白组合物A1的合成

首先将IL-2组合物A折叠蛋白(39.76mg，1当量)溶解在8mL的10mM乙酸钠缓冲液、8.4％蔗糖、0.02％聚山梨醇酯80pH 5.0中。向溶液中补充22mL的50mM乙酸钠缓冲液pH 5.0和30kDa DBCO-聚乙二醇聚合物(392.05mg，5当量)，并在25℃温和混合下反应17小时。反应混合物在HiTrap Capto S ImpAct柱(5mL)上每次装载10mL，并以2.5mL/min的流量用20CV从50mM乙酸钠缓冲液pH 5.0至含有1M NaCl的50mM乙酸钠缓冲液的梯度纯化。将含有IL-2组合物A1 PEG化蛋白的级分汇集在一起，并针对10mM乙酸钠缓冲液、8.4％蔗糖、0.02％聚山梨醇酯80pH 5.0进行透析，以获得通过BCA测定的12.26mg蛋白级分IL-2组合物A1 PEG化蛋白(PEG化和纯化步骤的产率为31％)。通过分析型RP-HPLC、MALDI-TOF和分析型尺寸排阻法确认纯的PEG化蛋白的纯度和身份。

实施例3IL-2的组合物B和B1变体的合成

对于该变体，除了区段3之外，所有其他区段都与用于组合物A的区段相同。

组合物B的Fmoc-Opr IL2(72-102)-Phe-α-酮酸(区段3B)的合成

Fmoc-Opr IL2(72-102)-Phe-α-酮酸区段3B(参见SEQ ID NO:4的残基71-103)通过类似于区段3A的合成中描述的程序的自动Fmoc-SPPS合成来合成，以产生纯度＞98％的为白色固体的区段3B。基于树脂装载量的分离产率为18％(200mg)。HRMS(ESI)：C₁₈₄H₂₈₄N₄₆O₅₂；平均同位素计算：3972.1051Da[M+H]⁺；测量：3972.1054Da[M+H]⁺。

通过KAHA连接来合成组合物B的IL2-Seg34

连接：区段34B按照一般程序“IL-2区段3和4的连接与Fmoc去保护”获得，将37mg(9.3μmol；1.2当量)的区段3B和27mg(7.8μmol；1.0当量)的区段4A溶解于517μL的含有0.1M草酸的9.8:0.2DMSO/H₂O v/v的溶液中。

纯化：C18柱(5μm，50×250mm)，流量40mL/min，在40℃，2步骤梯度：在5min内10％至40％ B，然后在35min内40％至80％ B。将含有纯化产物的级分汇集并冻干，以获得纯度>99％的为白色固体的区段34B。分离产率为22％(12.6mg)。HRMS(ESI)：C₃₂₆H₅₁₅N₈₃O₁₀₀S；平均同位素计算：7228.7597Da[M+H]⁺；测量：7228.7738Da[M+H]⁺。

用于制备组合物B的IL2线性蛋白(区段1234B)的最终KAHA连接

连接：区段1234B按照一般程序“最终连接”获得，将34mg(3.8μmol；1.2当量)的区段12A和23mg(3.2μmol；1.0当量)的区段34B溶解在214μL的含有0.1M草酸的9.5:0.5DMSO/H₂O v/v中。

纯化：C18柱(5μm,50×250mm)，流量40mL/min，在40℃，2步骤梯度：在5min内10％至40％ B，然后在35min内40％至80％ B。将含有纯化产物的级分汇集并冻干，以获得纯度为96％的为白色固体的Acm保护的区段1234B。分离产率为52％(26.8mg)。HRMS(ESI)：C₇₂₅H₁₁₈₂N₁₈₆O₂₁₇S₂；平均同位素计算：16039.6865Da[M+H]⁺；测量：16039.6389Da[M+H]⁺。

Acm脱保护：半胱氨酸残基的脱保护按照一般程序“Acm脱保护”进行，以26.8mgAcm保护的区段1234B作为起始材料。

纯化：C18柱(5μm,20×250mm)，流量10mL/min，在40℃，2步骤梯度：在5min内10％至30％ B，然后在30min内30％至95％ B。将含有纯化产物的级分汇集并冻干，以获得纯度为97％的为白色固体的区段1234B。分离产率为55％(14.5mg)。HRMS(ESI)：C₇₁₉H₁₁₇₂N₁₈₄O₂₁₅S₂；平均同位素计算：15897.6117Da[M+H]⁺；测量：15897.6195Da[M+H]⁺。组合物B的IL-2线性蛋白的折叠

线性蛋白的重排：将IL2-Seg1234-B线性蛋白(14.5mg，0.913μmol)溶解在含有0.1M Tris和30mM还原型谷胱甘肽的6M Gu·HCl水溶液中(61mL，15μM蛋白浓度)，并在50℃温和振荡混合物2小时。

线性重排蛋白的折叠：重排反应完成后，将样品冷却至室温，并用0.1M Tris和1.5mM氧化型谷胱甘肽pH 8.0稀释(122mL，5μM蛋白浓度)。允许折叠在室温进行20小时。然后，用TFA将样品酸化至pH 3，并通过以下制备型HPLC进行纯化：使用保持在室温的C4柱(20×250mm)，以两步骤梯度：在5min内10％至30％ B，然后在30min内30％至95％ B，流量为10.0mL/min。将含有产物的级分汇集并冻干，以产生纯度>98％的为白色粉末的纯的折叠的IL2-Seg1234-B蛋白。(3.9mg，折叠和纯化步骤的产率为27％)。HRMS(ESI)：C₇₁₉H₁₁₇₀N₁₈₄O₂₁₅S₂；平均同位素计算：15895.5966Da[M+H]⁺；测量：15895.5669Da[M+H]⁺。IL-2蛋白组合物B1的合成

向在1:1CH₃CN:H₂O中的IL2-Seg1234-B(2mg，0.126μmol，1当量)溶液(50mM蛋白浓度)中添加30kDa DBCO-聚乙二醇聚合物(11.7mg，0.403μmol，3.2当量)，并在25℃温和混合下反应20小时。用1:1CH₃CN/H₂O+0.1％ TFA稀释反应混合物，并在制备型HPLC上进行纯化，使用C4柱(20×250mm)，以两步梯度：在5min内10％至30％ B，然后在30min内30％至95％B，流量：10.0mL/min。将含有PEG化IL2-Seg1234-B1蛋白的级分汇集在一起并冻干，以获得2.5mg纯度为98％的为白色粉末的IL2-Seg1234-B1 PEG化蛋白。(PEG化和纯化步骤的产率为29％)。通过分析型RP-HPLC、MALDI-TOF、SEC-HPLC和SDS-page确认纯的PEG化蛋白的纯度和身份。

实施例4IL-2的组合物C和C1变体的合成

对于该变体，除了区段2之外，所有其他区段都与用于组合物A的区段相同。

组合物C的IL-2Fmoc-Opr IL2(42-69)-Leu-α-酮酸(区段2C)的合成

Opr-IL2(42-69)-Leu-光保护的-α-酮酸区段2C(参见SEQ ID NO:5的残基41-70)通过类似于区段2A的合成中描述的程序的自动Fmoc-SPPS合成来合成，以产生纯度为98％的为白色固体的区段2C。基于树脂装载量的分离产率为19.7％(153.7mg)。使用MALDI-TOF来确认获得的所需的产物质量(mass)。

通过KAHA连接来合成组合物C的IL2-Seg12(区段12C)

连接和光脱保护：区段12C按照一般程序“IL-2区段1和2的连接和光脱保护”获得，将90mg的区段1A(17.4μmol；1.1当量)和56mg(14.5μmol；1.0当量)的区段2C溶解在1157μL的含0.1M草酸的9.5:0.5v/v DMSO/H₂O溶液中。

纯化：C18柱(5μm，50×250mm)，流量40mL/min，在40℃，2步骤梯度：在5min内10％至40％ B，然后在30min内40％至70％ B。将含有纯化产物的级分汇集并冻干，以获得纯度>99％的为白色固体的区段12C。分离产率为36％(46.7mg)。

用于制备组合物C的IL2线性蛋白(区段1234C)的最终KAHA连接

连接：区段1234C按照一般程序“最终连接”获得，将46.7mg(5.24μmol；1.2当量)的区段12C和32mg(4.41μmol；1.0当量)的区段34A溶解在683μL的含有0.1M草酸的9.5:0.5DMSO/H₂O v/v中。

纯化：C18柱(5μm，50×250mm)，流量40mL/min，在60℃，梯度：在30min内30％至80％ B。将含有纯化产物的级分汇集并冻干，以获得为白色固体的Acm保护的区段1234C。分离产率为34％(24.5mg)。

Acm脱保护：半胱氨酸残基的脱保护按照一般程序“Acm脱保护”进行，以24.5mgAcm保护的区段1234C作为起始材料。

纯化：C18柱(5μm，20×250mm)，流量10mL/min，在40℃，2步骤梯度：在5min内10％至30％ B，然后在30min内30％至95％ B。将含有纯化产物的级分汇集并冻干，以获得纯度为94％的为白色固体的区段1234C。分离产率为69％(16.6mg)。HRMS(ESI)：C₇₁₇H₁₁₆₇N₁₈₃O₂₁₆S₂；平均同位素计算：15870.5650Da[M+H]⁺；测量：15870.6232Da[M+H]⁺。组合物C的IL-2线性蛋白的折叠

线性蛋白的重排：将IL2-Seg1234-C将线性蛋白(16.6mg，1.04μmol)溶解在含有0.1M Tris和30mM还原型谷胱甘肽的6M Gu·HCl水溶液中(69mL，15μM蛋白浓度)，并在50℃温和振荡混合物2小时。

线性重排蛋白的折叠：重排反应完成后，将样品冷却至室温，并用0.1M Tris和1.5mM氧化型谷胱甘肽pH 8.0稀释(140mL，5μM蛋白浓度)。允许折叠在室温进行20小时。然后，用TFA将样品酸化至pH 3，并通过以下制备型HPLC进行纯化：使用保持在室温的C4柱(20×250mm)，以两步骤梯度：在5min内10％至30％ B，然后在30min内30％至95％ B，流量为10.0mL/min。将含有产物的级分汇集并冻干，以产生纯度>99％的为白色粉末的纯的折叠的IL2-Seg1234-C蛋白(3.4mg，折叠和纯化步骤的产率为20.5％)。HRMS(ESI)：C₇₁₇H₁₁₆₅N₁₈₃O₂₁₆S₂；平均同位素计算：15868.5493Da[M+H]⁺；测量：15868.5979Da[M+H]⁺。

IL-2蛋白组合物C1的合成

向在1:1CH₃CN:H₂O中的IL2-Seg1234-C(2mg，1当量)的溶液(50μM蛋白浓度)中添加30kDa DBCO-聚乙二醇聚合物(11.0mg，3当量)，并在25℃温和混合下反应20小时。用1:1CH₃CN/H₂O+0.1％ TFA稀释反应混合物，并在制备型HPLC上纯化，使用C4柱(20×250mm)，以两步骤梯度：在5min内10％至30％ B，然后在30min内30％至95％ B，流量为10.0mL/min。将含有PEG化IL2-Seg1234-C1蛋白的级分汇集在一起并冻干，以获得1.4mg纯度>99％的为白色粉末的IL2-Seg1234-C1 PEG化蛋白。(PEG化和纯化步骤的产率为25％)。纯的PEG化蛋白的纯度和身份通过分析型RP-HPLC和MALDI-TOF确认。

实施例5：IL-2的组合物D和D1变体的合成

对于该变体，除了区段1之外，所有其他区段都与用于组合物B的区段相同。

组合物D的IL-2(1-39)-Leu-α-酮酸(区段1D)的合成

IL2(1-39)-Leu-α-酮酸区段1D(参见SEQ ID NO:6的残基1-40)通过类似于区段1A的合成中描述的程序的自动Fmoc-SPPS合成来合成，以产生纯度为98％的为白色固体的区段1D。基于树脂装载量的分离产率为20％(209mg)。使用MALDI-TOF来确认获得的所需的产物质量。

通过KAHA连接来合成组合物D的IL2-Seg12(区段12D)

连接和光脱保护：区段12D按照一般程序“IL-2区段1和2的连接和光脱保护”获得，将60mg(11.7μmol；1.1当量)的区段1D和338mg(9.7μmol；1.0当量)的区段2A溶解在780μL的含0.1M草酸的9.5:0.5v/v DMSO/H₂O溶液中。

纯化：C18柱(5μm，50×250mm)，流量40mL/min，在40℃，2步骤梯度：在5min内10％至40％ B，在30min内40％至70％ B。将含有纯化产物的级分汇集并冻干，以获得为白色固体的区段12D。分离产率为54％(46.2mg)。HRMS(ESI)：C₃₉₇H₆₆₁N₁₀₃O₁₁₉S；m/z计算：8812.8698Da[M+H]⁺；测量：8812.8833Da[M+H]⁺。

用于制备组合物D的IL2线性蛋白(区段1234D)的最终KAHA连接

连接：区段1234D按照一般程序“最终连接”获得，将35.2mg(5.24μmol；1.2当量)的区段12D和26mg(3.62μmol；1.0当量)的区段34B溶解在270μL的含有0.1M草酸的9.5:0.5DMSO/H₂O v/v中。

纯化：C18柱(5μm，50×250mm)，流量40mL/min，在60℃，梯度：在30min内30％至80％ B。将含有纯化产物的级分汇集并冻干，以获得为白色固体的Acm保护的区段1234D。分离产率为26％(15mg)。

Acm脱保护：半胱氨酸残基的脱保护按照一般程序“Acm脱保护”进行，以15mg(0.95μmol)的Acm保护的区段1234D为起始材料。

纯化：C18柱(5μm，20×250mm)，流量10mL/min，在40℃，2步骤梯度：在5min内10％至30％ B，然后在30min内30％至95％ B。将含有纯化产物的级分汇集并冻干，以获得纯度为94％的为白色固体的区段1234D。分离产率为80％(12mg)。HRMS(ESI)：C₇₁₆H₁₁₆₆N₁₈₄O₂₁₅S₂；平均同位素计算：15855.5653Da[M+H]⁺；测量：15855.5300Da[M+H]⁺。组合物D的IL-2线性蛋白的折叠

线性蛋白的重排：将IL2-Seg1234-D线性蛋白(9mg，0.568μmol)溶解在含有0.1MTris和30mM还原型谷胱甘肽的6M Gu·HCl水溶液中(38mL，15μM蛋白浓度)，并将混合物在50℃温和振荡2小时。

线性重排蛋白的折叠：重排反应完成后，将样品冷却至室温，并用0.1M Tris和1.5mM氧化型谷胱甘肽pH 8.0稀释(76mL，5μM蛋白浓度)。允许折叠在室温进行44小时。然后，用TFA将样品酸化至pH 3，并通过以下制备型HPLC进行纯化：使用保持在室温的Shiseido ProteonAvi C4柱(20×250mm)，以两步骤梯度：在5min内10％至30％ B，然后在30min内30％至95％ B，流量为10.0mL/min。将含有产物的级分汇集并冻干，以产生纯度>98％的为白色固体的折叠的IL2-Seg1234-D(0.3mg，折叠和纯化步骤的产率为3％)。

IL-2蛋白组合物D1的合成

向在1:1CH₃CN:H₂O中的IL2-Seg1234-D(0.3mg，1当量)的溶液(50μM蛋白浓度)中添加30kDa DBCO-聚乙二醇聚合物(1.8mg，3.2当量)，并在25℃温和混合下反应20小时。用1:1CH₃CN/H₂O+0.1％ TFA稀释反应混合物，并在制备型HPLC上进行纯化，使用C4柱(20×250mm)，以两步骤梯度：在5min内10％至30％ B，然后在30min内30％至95％ B，流量为10.0mL/min。将含有PEG化IL2-Seg1234-D1蛋白的级分汇集在一起并冻干，以获得0.1mg纯度>98％的为白色粉末的IL2-Seg1234-D1 PEG化蛋白质。(PEG化和纯化步骤的产率为11％)。

通过分析型RP-HPLC、MALDI-TOF确认纯的PEG化蛋白的纯度和身份。

实施例6：IL-2的组合物E和E1变体的合成

组合物E的IL-2(1-39)-Leu-α-酮酸(区段1E)的合成

IL2(1-39)-Leu-α-酮酸区段1E(参见SEQ ID NO:7的残基1-40)通过类似于区段1A的合成中描述的程序的自动Fmoc-SPPS合成来合成，以产生纯度为97％的为白色固体的区段1E。基于树脂装载量的分离产率为17％(180mg)。HRMS(ESI)：C₂₂₅H₃₈₈N₆₄O₇₂；平均同位素计算：5140.87247Da[M+H]⁺；测量：5141.8699Da[M+H]⁺。

通过KAHA连接来合成组合物E的IL2-Seg12(区段12E)

连接和光脱保护：区段12E按照一般程序“IL-2区段1和2的连接和光脱保护”获得，将60mg(11.7μmol；1.1当量)的区段1E和38mg(9.7μmol；1.0当量)的区段2A溶解在780μL的含有0.1M草酸的9.5:0.5v/v DMSO/H₂O溶液中。

纯化：C18柱(5μm，50×250mm)，流量40mL/min，在40℃，2步骤梯度：在5min内10％至40％ B，然后在30min内40％至70％ B。将包含纯化产物的级分汇集并冻干，以获得为白色固体的区段12E。分离产率为55％(33.4mg)。HRMS(ESI)：C₃₉₇H₆₆₁N₁₀₃O₁₁₉S；m/z计算：8812.8698Da[M+H]⁺；测量：8812.8833Da[M+H]⁺。

用于制备组合物E的IL2线性蛋白(区段1234E)的最终KAHA连接

连接：区段1234E按照一般程序“最终连接”获得，将17.5mg(1.98μmol；1.2当量)的区段12E的和12mg(1.66μmol；1.0当量)的区段34B溶解在256μL的含有0.1M草酸的9.5:0.5DMSO/H₂O v/v中。

纯化：C18柱(5μm，50×250mm)，流量40mL/min，在60℃，梯度：在30min内30％至80％ B。将包含纯化产物的级分汇集并冻干，以获得为白色固体的Acm保护的区段1234E。分离产率为22％(6.6mg)。使用MALDI-TOF来确认获得的所需的产物质量。

Acm脱保护：半胱氨酸残基的脱保护按照一般程序“Acm脱保护”进行，以6.6mg(0.37μmol)的Acm保护的区段1234E为起始材料。

纯化：C18柱(5μm，20×250mm)，流量10mL/min，在40℃，2步骤梯度：在5min内10％至30％ B，然后在30min内30％至95％ B。将包含纯化产物的级分汇集并冻干，以获得纯度为94％的为白色固体的区段1234E。分离产率为98％(5.8mg)。HRMS(ESI)：C₇₁₆H₁₁₆₆N₁₈₄O₂₁₅S₂；平均同位素计算：15855.5653Da[M+H]⁺；测量：15855.5479Da[M+H]⁺。组合物E的IL-2线性蛋白的折叠

线性蛋白的重排：将IL2-Seg1234-E线性蛋白(5.8mg，0.366μmol)溶解在含有0.1MTris和30mM还原型谷胱甘肽的6M Gu·HCl水溶液中(24mL，15μM蛋白浓度)，并在50℃温和振荡混合物2小时。

线性重排蛋白的折叠：重排反应完成后，将样品冷却至室温，并用0.1M Tris和1.5mM氧化型谷胱甘肽pH 8.0稀释(48mL，5μM蛋白浓度)。允许折叠反应在室温进行20小时。然后，用TFA将样品酸化至pH 3，并通过以下制备型HPLC进行纯化：使用保持在室温的C4柱(20×250mm)，以两步骤梯度：在5min内10％至30％ B，然后在30min内30％至95％ B，流量为10.0mL/min。将包含产物的级分汇集并冻干，以产生纯度>98％的为白色固体的折叠的IL2-Seg1234-E(0.6mg，折叠和纯化步骤的产率为10％)。

IL-2蛋白组合物E1的合成

向在1:1CH₃CN:H₂O中的IL2-Seg1234-E(0.6mg，1当量)的溶液(50μM蛋白浓度)中添加30kDa DBCO-mPEG(3mg，2.7当量)，并在25℃温和混合下反应20小时。用1:1CH₃CN/H₂O+0.1％ TFA稀释反应混合物，并在制备型HPLC上进行纯化，使用Shiseido Proteonavi C4柱(20×250mm)，以两步骤梯度：在5min内10％至30％ B，然后在30min内30％至95％ B，流量为10.0mL/min。将含有PEG化IL2-Seg1234-E1蛋白的级分汇集在一起并冻干，以获得0.2mg的纯度>98％的为白色粉末的IL2-Seg1234-E1 PEG化蛋白。(PEG化和纯化步骤的产率为12％)。通过分析型RP-HPLC、MALDI-TOF确认纯的PEG化蛋白的纯度和身份。

实施例7：组合物F的合成

对于该变体，除了区段2之外，所有其他区段都与用于组合物B的区段相同。

组合物F的Opr-IL2(42-69)-Leu-光保护的-α-酮酸(区段2F)的合成

Opr-IL2(42-69)-Leu-光保护的-α-酮酸区段2F(参见SEQ ID NO:8的残基1-40)通过类似于区段2A的合成中描述的程序的自动Fmoc-SPPS合成来合成，以产生纯度为99％的为白色固体的区段2F。基于树脂装载量的分离产率为35％(269mg)。HRMS(ESI):C₁₈₁H₂₈₀N₄₀O₅₂S；m/z计算：3880.0273Da[M+H]⁺；测量：3880.0207Da[M+H]⁺。

通过KAHA连接来合成组合物F的IL2-Seg12(区段12F)

连接和光脱保护：区段12F按照一般程序“IL-2区段1和2的连接和光脱保护”获得，将34mg(6.6μmol；1.1当量)的区段1A和19mg(4.9μmol；1.0当量)的区段2F溶解在385μL的含0.1M草酸的9.5:0.5v/v DMSO/H₂O溶液中。

纯化：C18柱(5μm，50×250mm)，流量40mL/min，在40℃，2步骤梯度：在5min内10％至40％ B，然后在30min内40％至70％ B。将包含纯化产物的级分汇集并冻干，以获得纯度为96％的为白色固体的区段12F。分离产率为59％(25.5mg)。使用MALDI-TOF来确认获得的所需的产物质量。

用于制备组合物F的IL2线性蛋白(区段1234F)的最终KAHA连接

连接：区段1234F按照一般程序“最终连接”获得，将25.5mg(2.89μmol；1.2当量)的区段12F和17.5mg(2.42μmol；1.0当量)的区段34B溶解在373μL的含0.1M草酸的9.5:0.5DMSO/H₂O v/v中。

纯化：C18柱(5μm，50×250mm)，流量40mL/min，在60℃，梯度：在30min内30％至80％ B。将包含纯化产物的级分汇集并冻干，以获得为白色固体的Acm保护的区段1234F。分离产率为31％(12mg)。使用MALDI-TOF来确认获得的所需的产物质量。

Acm脱保护：半胱氨酸残基的脱保护按照一般程序“Acm脱保护”进行，以12mg(0.75μmol)的Acm保护的区段1234F为起始材料。

纯化：C18柱(5μm，20×250mm)，流量10mL/min，在40℃，2步骤梯度：在5min内10％至30％ B，然后在30min内30％至95％ B。将包含纯化产物的级分汇集并冻干，以获得纯度为94％的为白色固体的区段1234F。分离产率为73％(8.7mg)。HRMS(ESI):C₇₁₆H₁₁₆₆N₁₈₄O₂₁₅S₂；平均同位素计算：15855.5653Da[M+H]⁺；测量：15855.6061Da[M+H]⁺。组合物F的IL-2线性蛋白的折叠

线性蛋白的重排：将IL2-Seg1234-F线性蛋白(8.7mg，0.549μmol)溶解在含有0.1MTris和30mM还原型谷胱甘肽的6M Gu·HCl水溶液中(37mL，15μM蛋白浓度)，并在50℃温和振荡混合物2小时。

线性重排蛋白的折叠：重排反应完成后，将样品冷却至室温，并用0.1M Tris和1.5mM氧化型谷胱甘肽pH 8.0稀释(80mL，5μM蛋白浓度)。允许折叠反应在室温进行44小时。然后，用TFA将样品酸化至pH 3，并通过以下制备型HPLC进行纯化：使用保持在室温的C4柱(20×250mm)，以两步骤梯度：在5min内10％至30％ B，然后在30min内30％至95％ B，流量为10.0mL/min。将包含产物的级分汇集并冻干，以产生纯的IL2-Seg1234-F(0.2mg，对于折叠和纯化步骤的产率为2％)。纯的折叠的蛋白的纯度和身份通过分析型RP-HPLC和MALDI-TOF确认。

实施例8：未缀合的和PEG化的IL-2变体对STAT5的选择性激活

IL-2R的参与导致信号转导及转录激活因子5(STAT5)的磷酸化，并且这可以用作评估T细胞亚群选择性的读出。通过使用ficoll梯度离心，然后用磁珠阴性分离进行外周血单个核细胞(PBMC)纯化，从健康供体血沉棕黄层中获得原代泛T细胞，并且然后冷冻保存直至进一步使用。将泛T细胞解冻并在T细胞培养基(RPMI 10％ FCS、1％谷氨酰胺、1％ NEAA、25μMβMeoH、1％丙酮酸钠(NaPyruvate))中孵育过夜，然后用PBS洗涤两步。将细胞重悬于PBS中，并每孔分布200,000个细胞，然后与阿地白介素、未缀合的IL-2多肽(组合物A)、PEG化IL-2多肽(组合物A1)或本文提供的另一种指定变体在37℃/5％ CO₂孵育40min。孵育后，使用转录因子Phospho缓冲液试剂盒对细胞进行固定和透化，然后对CD4、CD8、CD25、FoxP3和pSTAT5进行表面和细胞内免疫染色，以实现细胞亚群鉴定和STAT5磷酸化水平测量。FACS测量用来自Acea的NovoCyte或Quanteon流式细胞仪进行。将T_reg分类为CD4+CD25+FoxP3+细胞，并且将T_eff分类为CD8+T细胞。来自指定变体对不同免疫细胞类型的STAT5磷酸化测定的EC₅₀结果如下表6所示。

表6

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未缀合的(组合物A)和PEG化的IL-2多肽(组合物A1)两者在T_reg中选择性激活STAT5(图4B)，对T_eff细胞中STAT5激活的影响很小(图4A)。另一方面，阿地白介素非选择性地激活T_reg细胞和_Teff细胞两者中的STAT5。PEG化IL-2多肽(组合物A1)的STAT5激活效力低于未缀合的IL-2多肽(组合物A)，表明PEG化导致活性轻微降低。

此外，未缀合的和PEG化的IL-2多肽两者都激活了来自小鼠和食蟹猴的T_reg中的STAT5，其效力与对人类T_reg相当，从而展示了对小鼠和食蟹猴IL-2R的交叉反应性(表7)。

表7

实施例9：PEG化IL-2多肽(组合物A1)与IL-2受体α和β亚基的结合亲和力

使用生物层干涉测量法(BLI)技术测量PEG化IL-2多肽(组合物A1)和SEQ ID NO:2(阿地白介素)与IL-2Rα和β亚基的结合亲和力。将生物素化的IL-R2α和β(R&D，目录号AVI10305-050和AVI10459-050)分别装载到链霉亲和素生物传感器SAX2上，并将传感器浸入动力学缓冲液中以设定基线。将传感器在分析物溶液中孵育300s，然后在动力学缓冲液中孵育600s以测量解离。使用/>Analysis studio计算K_d值。组合物A1比阿地白介素对α亚基具有更高的亲和力(分别为2.37nM与12.23nM)，而与β亚基的结合被消除(图5)。因此组合物A1代表α-增强、β-死亡的(dead)IL-2多肽。

实施例10：组合物A1在小鼠体内的药代动力学/药效学研究

C57BL/6小鼠接受5次每日皮下注射(sc)0.3mg/kg蛋白质当量的阿地白介素或单次皮下注射0.1mg/kg或0.3mg/kg PEG化IL-2多肽组合物A1，进行单剂量药代动力学/药效学(PK/PD)研究。在不同时间点采集血液样品到K₂EDTA中，通过离心产生血浆，并储存在-80℃直到进行PK分析，并且对细胞沉淀物进行新鲜染色用于流式细胞术分析。

用1×裂解/固定缓冲液(BD Bioscience，558050)处理细胞沉淀物持续10min。洗涤后，将细胞在4℃用抗CD3、抗CD335和抗CD25抗体染色30min。然后使用冷的BD Perm缓冲液III使细胞透化，并用抗Ki67、Siglec-F、CD4、CD8、FoxP3、CD62L、CD44或pSTAT5的抗体染色。FACS(荧光激活细胞分选)测量用来自BD的Fortessa X-20流式细胞仪进行。对于每个细胞亚群，确定pSTAT5阳性细胞的百分比和Ki67阳性细胞的百分比、细胞计数和细胞频率。

使用合格的人类IL-2LegendPlex珠测定法(Biolegend，#740717，#740368，#740758)确定血浆中组合物A1的浓度。通过使用Phoenix WinNonlin软件(版本6.3)对PK数据进行非房室PK分析。应用线性/对数梯形法则获得PK参数。修饰的IL-2多肽的PK谱(图6)在6小时达到峰值，并且由于PEG化，浓度以26和30小时之间的长半衰期下降。PK参数(表8)显示出暴露的剂量的成比例增加。这样的PK谱优于野生型多肽，据报道，野生型多肽在小鼠体内的半衰期在几分钟内。

表8

在同一研究中同时评估阿地白介素和PEG化IL-2多肽组合物A1的免疫PD谱，并监测14天。用PEG化IL-2多肽单剂量处理导致T_reg群体(CD3+、CD4+、CD25Hi、FoxP3+)中的强且持续的STAT5磷酸化，而对CD8+T_eff细胞(CD3+、CD8+、CD4-)和NK细胞(CD3-、CD49b+)没有影响或影响很小(图7)。相反地，5次剂量的阿地白介素处理导致T_reg细胞中更温和的STAT5磷酸化谱，并且对CD8+T_eff细胞和NK细胞也没有影响(图7)。在用组合物A1处理后，T_reg细胞中IL-2受体信号传导通路的激活转化为增殖标志物Ki67的显著且持续的上调，而在CD8+T_eff细胞和NK细胞上未观察到这一现象。相反地，5剂量的阿地白介素处理导致T_reg中有限的Ki67上调(图7)。用组合物A1处理后T_reg亚群增殖活性的增加导致T_reg细胞数量与基线相比非常显著的增加，优于5次每日剂量的阿地白介素处理下观察到的增加。细胞扩增对T_reg亚群具有选择性，而CD8+T_eff和NK细胞保持相对不变(图7)。

实施例11：组合物A1抑制钥孔血蓝蛋白诱导的迟发型超敏反应

迟发型超敏反应(DTH)代表了对先前遇到的抗原的局部T效应物回忆应答。这里，首先通过皮下免疫接种钥孔血蓝蛋白(KLH)使小鼠对KLH过敏，并且然后在几天后通过向耳内皮内注射相同的抗原进行再次攻击，导致局部组织炎症和肿胀。将成年Balb/c小鼠随机分配到实验组(n＝10只/组)，并允许其适应一周。在第0天，通过肩胛骨间皮下注射向动物施用在完全弗氏佐剂(CFA)中的100μg KLH的乳液。在第0天；第0天和第3天；第0、3和5天或第0、3、5和8天皮下施用0.3mg/kg组合物A1(参见图8A)。在第0、3、5和8天皮下施用媒介物。在使用数字卡尺对右耳和左耳厚度进行基线测量后，在第7天，向右耳皮内注射在0.9％氯化钠中的10μg KLH对所有动物进行攻击。对侧(左)耳施用等体积的0.9％氯化钠。使用数字卡尺在24、48、72和96小时测量耳厚度。在媒介物处理组中，耳部炎症在攻击后48小时达到峰值，并且然后缓慢消退(图8A)。与媒介物相比，组合物A1的单次施用在所有时间点都强烈抑制耳部炎症。多于一次给药导致在攻击后24小时出现更早和更浅的炎症峰值，随后快速消退几乎回到基线。在施用组合物A1的每个实例中，通过曲线下面积(AUC)测量的耳部肿胀差异显著小于媒介物对照(参见图8B和图8C)。因此，组合物A1有效地抑制抗原驱动的组织炎症。/>

Claims

1.一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽包含：

修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含至多七个天然氨基酸取代，其中所述七个天然氨基酸取代包含残基Y31、K35和Q74处的氨基酸取代；并且其中所述修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。

2.根据权利要求1所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽相对于SEQ IDNO:1中列出的序列包含3、4、5或6个天然氨基酸取代。

3.根据权利要求1或2所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含至少一个非天然氨基酸取代。

4.根据权利要求3所述的修饰的IL-2多肽，其中所述至少一个非天然氨基酸取代选自：

a)位于残基36-45的任何一个中的高丝氨酸(Hse)残基；

b)位于残基61-81的任何一个中的高丝氨酸残基；以及

c)位于残基94-114的任何一个中的高丝氨酸残基。

5.一种修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，所述修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽包含：

包含至少一个非天然氨基酸取代的修饰的IL-2多肽，其中所述至少一个非天然氨基酸取代选自：

a)位于残基36-45的任何一个中的高丝氨酸(Hse)残基；

b)位于残基61-81的任何一个中的高丝氨酸残基；以及

c)位于残基94-114的任何一个中的高丝氨酸残基；

其中所述修饰的IL-2多肽还包含至少一个在选自L18、Q22、N29、Y31、K35、T37、K48、V69、N71、Q74、L80、R81、L85、I86、N88、I89、I92和Q126的残基处的氨基酸取代；并且其中所述修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。

6.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含Hse41、Hse71、Hse104或其组合。

7.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含Hse41、Hse71和Hse104中的每一个。

8.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含在残基23、残基39或残基46或其任何组合处的正亮氨酸(Nle)取代。

9.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含在残基23、残基39和残基46处的Nle取代。

10.根据权利要求5-9中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含至少一个在选自Y31、K35、Q74和N88的残基处的氨基酸取代。

11.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含选自Y31H、K35R、Q74P和N88D的至少一个氨基酸取代。

12.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含Y31H、K35R、Q74P和N88D氨基酸取代中的2、3或4个。

13.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含Y31H、K35R和Q74P氨基酸取代。

14.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含在残基N88处的氨基酸取代。

15.根据权利要求14所述的修饰的IL-2多肽，其中在残基N88处的所述氨基酸取代是N88D取代。

16.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，还包含在残基C125处的取代。

17.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，还包含C125S取代。

18.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，还包含N-末端缺失。

19.根据权利要求18所述的修饰的IL-2多肽，其中所述N-末端缺失是单个氨基酸的缺失。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含V69A取代。

21.根据权利要求1-19中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽在残基E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、I89或I92处不包含任何天然氨基酸取代。

22.根据权利要求1-19或21中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽不包含V69A或K48E取代。

23.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽不包含任何另外的天然氨基酸取代。

24.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽是合成的。

25.一种修饰的IL-2多肽，所述修饰的IL-2多肽包含：

修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽对IL-2受体α亚基(IL-2Rα)表现出在约0.1nM和约100nM之间的结合亲和力，并且其中所述修饰的IL-2多肽对IL-2受体β亚基(IL-2Rβ)表现出至少约1000nM的结合亲和力。

26.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ表现出至少约1000nM、至少约2000nM、至少约3000nM、至少约5000nM或至少约10000nM的结合亲和力。

27.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽对IL-2Rα表现出至多约100nM、至多约75nM、至多约50nM、至多约40nM、至多约30nM、至多约20nM、至多约10nM或至多约5nM的结合亲和力。

28.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽对IL-2Rα表现出约0.1nM至约100nM、约0.1nM至约50nM、约0.1nM至约20nM、约1nM至约100nM、约1nM至约50nM或约1nM至约20nM的结合亲和力。

29.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽具有至多约100nM、至多约75nM、至多约50nM、至多约40nM、至多约35nM、至多约30nM或至多约25nM的激活T_reg细胞的EC₅₀。

30.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽具有至少约1000nM的激活T_eff细胞的EC₅₀。

31.一种修饰的IL-2多肽，所述修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:3-43中的任何一个具有至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约98％、至少约99％或100％序列同一性的氨基酸序列，其中所述参考氨基序列中相对于SEQ ID NO:1被取代的每个残基被保留。

32.根据权利要求31所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含SEQ IDNO:3、5、8、9、10、11、13、19、22、23、24、25、26、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41或42中的任何一个中列出的序列。

33.根据权利要求31所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含与SEQ IDNO:3中列出的序列具有至少约95％、98％、99％或100％序列同一性的序列。

34.根据权利要求31所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含SEQ IDNO:3中列出的序列。

35.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，还包含与所述修饰的IL-2多肽共价附接的聚合物。

36.根据权利要求35所述的修饰的IL-2多肽，其中所述聚合物与所述修饰的IL-2多肽的N-末端共价附接。

37.根据权利要求35或36所述的修饰的IL-2多肽，其中所述聚合物包括水溶性聚合物。

38.根据权利要求35-37中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。

39.根据权利要求35-38中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述聚合物包括聚(环氧烷)。

40.根据权利要求35-39中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述聚合物包括聚乙二醇。

41.根据权利要求35-40中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述聚合物具有至多约50,000道尔顿的重均分子量。

42.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽包含与N-末端残基附接的缀合手柄。

43.根据权利要求42所述的修饰的IL-2多肽，其中所述N-末端残基具有与所述N-末端胺附接的以下结构：

其中每个n独立地是1-30的整数，并且其中X是缀合手柄。

44.根据前述权利要求中任一项所述的修饰的IL-2多肽，其中所述修饰的IL-2多肽与另外的多肽附接。

45.根据权利要求44所述的修饰的IL-2多肽，其中所述另外的多肽是抗体或其抗原结合片段。

46.一种宿主细胞，所述宿主细胞表达权利要求1-45中任一项所述的修饰的IL-2多肽。

47.一种产生权利要求1-45中任一项所述的修饰的IL-2多肽的方法，所述方法包括在宿主细胞中表达所述修饰的IL-2多肽。

48.根据权利要求46或47所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是原核细胞或真核细胞。

49.根据权利要求46或47所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞、禽类细胞或昆虫细胞。

50.根据权利要求49所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是CHO细胞、COS细胞或酵母细胞。

51.一种药物组合物，所述药物组合物包含：

a)权利要求1-45中任一项所述的修饰的IL-2多肽；和

b)药学上可接受的载体或赋形剂。

52.一种治疗有相应需要的受试者的炎性疾病或紊乱的方法，包括：

向所述受试者施用药学上有效量的权利要求1-45中任一项所述的修饰的IL-2多肽或权利要求50所述的药物组合物。

53.根据权利要求52所述的方法，其中所述炎性疾病或紊乱是包括以下的炎性紊乱：炎症(例如，软骨炎症)、自身免疫性疾病、特应性疾病、副肿瘤性自身免疫性疾病、关节炎、类风湿性关节炎(例如，活动性类风湿性关节炎)、幼年型关节炎、幼年特发性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、少关节类风湿性关节炎、少关节幼年类风湿性关节炎、多关节幼年类风湿性关节炎、全身性幼年类风湿性关节炎、幼年银屑病性关节炎、银屑病性关节炎、多关节类风湿性关节炎、全身性类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、幼年强直性脊柱炎、幼年肠病性关节炎、反应性关节炎、幼年反应性关节炎、Reiter综合征、幼年Reiter综合征、幼年皮肌炎、幼年硬皮病、幼年血管炎、肠病性关节炎、SEA综合征(血清阴性、附着端病、关节病综合征)、皮肌炎、银屑病性关节炎、硬皮病、血管炎、肌炎、多发性肌炎、皮肌炎、结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿病、动脉炎、风湿性多肌痛、结节病、硬化症、原发性胆道硬化、硬化性胆管炎、干燥综合征、银屑病、斑块型银屑病、点滴状银屑病、反向银屑病、脓疱型银屑病、红皮病型银屑病、皮炎、特应性皮炎、疱疹样皮炎、白塞病、脱发、斑秃、全秃、动脉粥样硬化、狼疮、斯蒂尔氏病、重症肌无力、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、哮喘、COPD、鼻窦炎、鼻窦炎伴息肉、嗜酸性粒细胞食管炎、嗜酸性粒细胞支气管炎、格林-巴利病、甲状腺炎(例如格雷夫斯病)、艾迪生氏病、雷诺氏现象、自身免疫性肝炎、移植物抗宿主病、类固醇难治性慢性移植物抗宿主病、移植排斥(例如肾、肺、心脏、皮肤等)、肾损伤、丙型肝炎诱导的血管炎、自发性流产、白癜风、局灶节段性肾小球硬化(FSGS)、微小病变肾病、膜性肾病、ANCA相关肾小球肾病、膜增生性肾小球肾炎、IgA肾病、狼疮性肾炎或其组合。

54.根据权利要求52所述的方法，其中所述炎性疾病或紊乱是自身免疫性疾病。

55.根据权利要求54所述的方法，其中所述自身免疫性疾病是T细胞介导的自身免疫性疾病。

56.根据权利要求52所述的方法，其中所述炎性疾病是神经炎性疾病。

57.一种制备权利要求1-45中任一项所述的修饰的IL-2多肽的方法，所述方法包括：

a)合成所述修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段；

b)连接所述片段；以及

c)折叠所连接的片段。

58.根据权利要求57所述的方法，所述方法还包括将水溶性聚合物与所折叠、连接的片段附接。