JP2023520714A - Ｔｓｌｐに特異的な二環式ペプチドリガンド - Google Patents

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Abstract

本発明は、2つ以上のペプチドループが分子スキャフォールドへの取付点の間に内在するように、該スキャフォールドに共有結合しているポリペプチドに関する。特に、本発明は、胸腺間質性リンパ球新生因子(TSLP)の高親和性バインダーであるペプチドを記載する。本発明は、該ペプチドリガンドを含む医薬組成物、及びTSLPによって媒介される疾患又は障害の予防、抑制、又は治療における該ペプチドリガンドの使用も含む。【選択図】なし

Description

(発明の分野)
本発明は、2つ以上のペプチドループが分子スキャフォールドへの取付点の間に内在するように、該スキャフォールドに共有結合しているポリペプチドに関する。特に、本発明は、胸腺間質性リンパ球新生因子(TSLP)の高親和性バインダーであるペプチドを記載する。本発明は、該ペプチドリガンドを含む医薬組成物、及びTSLPによって媒介される疾患又は障害の予防、抑制、又は治療における該ペプチドリガンドの使用も含む。
(発明の背景)
喘息は、好発する肺の気道の長期炎症性疾患である。これは、一定ではなくかつ再発性の症状、可逆的な気流閉塞、及び容易に誘発される気管支痙攣を特徴とする。症状としては、喘鳴、咳嗽、胸部絞扼感、及び息切れのエピソードが挙げられる。これらは、1日あたり数回又は1週間あたり数回起こる場合もある。人によっては、喘息症状が、夜間や運動時に悪化することもある。
喘息は、遺伝的要因及び環境要因の組合せによって引き起こされると考えられている。環境要因としては、大気汚染及びアレルゲンへの曝露が挙げられる。可能性のある他の誘発因子としては、アスピリン及びベータブロッカーなどの医薬品が挙げられる。診断は、通常、症状のパターン、療法に対する経時的な反応、及びスパイロメトリー肺機能試験に基づく。喘息は、症状の頻度、1秒量(強制呼気量の1秒量)(FEV1)、及び最大呼気流量に従って分類される。また、これは、アトピー性又は非アトピー性として分類されることもあり、ここで、アトピーは、1型過敏症反応を発症しやすい傾向をいう。
アレルギー性喘息においては、気道の炎症が、気道のリモデリング及び損傷をもたらす鍵となる要素である。Tヘルパー2細胞によって媒介される免疫及びそれによって産生されるIL-3、IL-4、IL-5、IL-9、IL-13、及びGM-CSFなどのサイトカインが、本疾患において主要な役割を果たすことが示されている(Holgateらの文献(2012) Nat. Med. 18, 73-83)。
胸腺間質性リンパ球新生因子(TSLP)は、炎症促進性の刺激に応答して上皮細胞によって放出されるサイトカインである。これは、IL-7Rαサブユニット及びユニークなTSLP受容体からなるヘテロ二量体の受容体を介して信号を発する(Westの文献(2012), Drug Discovery Today: Disease Mechanisms 9, e83-e88)。このサイトカインは、いくつかの異なる免疫細胞に対して作用して、炎症反応及び高レベルのIL-4、IL-5、及びIL-13(全て喘息の病態形成に関与している)を発現するTH2細胞へのナイーブT細胞の分化を開始させる。
喘息には治癒させる方法(cure)が存在せず、従って、喘息などの呼吸器障害の症状を改善すること又は取り除くことができる治療薬剤が強く求められている。
(発明の概要)
本発明の第1の態様によれば、少なくとも2つのループ配列によって隔てられた少なくとも3つのシステイン残基を含むポリペプチド及び該ポリペプチドのシステイン残基と共有結合を形成する分子スキャフォールドを含み、少なくとも2つのポリペプチドループが、該分子スキャフォールド上に形成されている、TSLPに特異的なペプチドリガンドが提供される。
本発明のさらなる態様によれば、本明細書で定義されるペプチドリガンドを、1種以上の医薬として許容し得る賦形剤との組合せで含む医薬組成物が提供される。
本発明のなおさらなる態様によれば、TSLPによって媒介される疾患又は障害の予防、抑制、又は治療において使用するための本明細書で定義されるペプチドリガンドが提供される。
(発明の詳細な説明)
本発明の第1の態様によれば、少なくとも2つのループ配列によって隔てられた少なくとも3つのシステイン残基を含むポリペプチド及び該ポリペプチドのシステイン残基と共有結合を形成する分子スキャフォールドを含み、少なくとも2つのポリペプチドループが、該分子スキャフォールド上に形成されている、TSLPに特異的なペプチドリガンドが提供される。
一実施態様において、前記ループ配列は、3、4、5、6、又は7個のアミノ酸酸を含む。
さらなる実施態様において、前記ペプチドリガンドは、第1のループ配列が5つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が4つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含む。
一実施態様において、前記ペプチドリガンドは、第1のループ配列が5つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が4つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含み、かつ該ペプチドリガンドは、以下:
Figure 2023520714000001
Figure 2023520714000002
Figure 2023520714000003
Figure 2023520714000004
Figure 2023520714000005
のうちの1つのアミノ酸配列又はその医薬として許容し得る塩を含む。
さらなる実施態様において、前記ペプチドリガンドは、第1のループ配列が5つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が4つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含み、かつ該ペプチドリガンドは、N-及び/又はC末端修飾を任意に含み、かつ以下:
Ac-(配列番号:1)(以下、実施例1という);
Ac-(配列番号:2)(以下、実施例2という);
Ac-(配列番号:3)(以下、実施例3という);
tertBuCO-(配列番号:3)(以下、実施例6という);
R1-(配列番号:3)(以下、実施例7という);
Ac-(配列番号:4)(以下、実施例4という);
Ac-(配列番号:5)(以下、実施例5という);
Ac-(配列番号:6)(以下、実施例8という);
Ac-(配列番号:7)(以下、実施例9という);
Ac-(配列番号:8)(以下、実施例10という);
Ac-(配列番号:9)(以下、実施例11という);
Ac-(配列番号:10)(以下、実施例12という);
Ac-(配列番号:11)(以下、実施例13という);
Ac-(配列番号:12)(以下、実施例14という);
オクタノイル-(配列番号:13)(以下、実施例15という);
Ac-(配列番号:14)(以下、実施例16という);
Ac-(配列番号:15)(以下、実施例17という);
Ac-(配列番号:15)-[dA](以下、実施例33という);
(配列番号:15)-COOH(以下、実施例48という);
Ac-(配列番号:16)(以下、実施例18という);
Ac-(配列番号:17)(以下、実施例19という);
Ac-(配列番号:18)(以下、実施例20という);
Ac-(配列番号:19)(以下、実施例21という);
Ac-(配列番号:20)(以下、実施例22という);
Ac-(配列番号:21)(以下、実施例23という);
Ac-(配列番号:22)(以下、実施例24という);
(配列番号:23)(以下、実施例252という);
Ac-(配列番号:23)(以下、実施例25という);
Ac-(配列番号:23)-[dA](以下、実施例29という);
Ac-(配列番号:24)(以下、実施例26という);
Ac-(配列番号:25)(以下、実施例27という);
Ac-(配列番号:26)(以下、実施例28という);
Ac-(配列番号:27)(以下、実施例30という);
Ac-(配列番号:28)(以下、実施例31という);
Ac-(配列番号:29)(以下、実施例32という);
Ac-(配列番号:30)(以下、実施例34という);
Ac-(配列番号:31)(以下、実施例35という);
Ac-(配列番号:32)(以下、実施例36という);
Ac-(配列番号:33)(以下、実施例37という);
Ac-(配列番号:34)(以下、実施例38という);
Ac-(配列番号:34)-[dA](以下、実施例49という);
Ac-(配列番号:34)-COOH(以下、実施例69という);
Ac-(配列番号:35)(以下、実施例43という);
Ac-(配列番号:35)-COOH(以下、実施例39という);
Ac-(配列番号:36)(以下、実施例40という);
Ac-(配列番号:37)(以下、実施例41という);
A-(配列番号:38)-ADGDML(以下、実施例42という);
GTDSAE-(配列番号:38)-A(以下、実施例45という);
Ac-A-(配列番号:38)-PLD(以下、実施例53という);
Ac-(配列番号:38)-APDERD(以下、実施例54という);
A-(配列番号:38)-DDAHAP(以下、実施例55という);
TMEYRD-(配列番号:38)-A(以下、実施例56という);
A-(配列番号:38)-SSSDQS(以下、実施例59という);
SDEQRT-(配列番号:38)-A(以下、実施例61という);
DDEIMQ-(配列番号:38)-A(以下、実施例64という);
RTDETG-(配列番号:38)-A(以下、実施例67という);
A-(配列番号:38)-A(以下、実施例68という);
ETNNLE-(配列番号:38)-A(以下、実施例71という);
Ac-(配列番号:38)(以下、実施例79という);
DPPKPR-(配列番号:38)-A(以下、実施例87という);
(配列番号:38)-DTSTHS(以下、実施例128という);
Ac-(配列番号:39)(以下、実施例44という);
Ac-(配列番号:40)(以下、実施例46という);
Ac-(配列番号:41)(以下、実施例47という);
Ac-(配列番号:42)(以下、実施例50という);
Ac-(配列番号:43)(以下、実施例51という);
Ac-(配列番号:44)(以下、実施例52という);
Ac-(配列番号:45)(以下、実施例57という);
Ac-(配列番号:46)(以下、実施例58という);
Ac-(配列番号:47)(以下、実施例60という);
Ac-(配列番号:48)(以下、実施例62という);
A-(配列番号:49)-ADS(以下、実施例63という);
Ac-(配列番号:50)(以下、実施例65という);
Ac-(配列番号:51)(以下、実施例66という);
Ac-(配列番号:52)(以下、実施例70という);
Ac-(配列番号:53)(以下、実施例72という);
SPP-(配列番号:54)-A(以下、実施例73という);
Ac-(配列番号:55)(以下、実施例74という);
A-(配列番号:56)-HLE(以下、実施例75という);
A-(配列番号:57)-A(以下、実施例76という);
Ac-(配列番号:58)(以下、実施例77という);
Ac-(配列番号:59)(以下、実施例78という);
Ac-(配列番号:60)(以下、実施例80という);
Ac-(配列番号:61)(以下、実施例81という);
Ac-(配列番号:62)(以下、実施例82という);
Ac-(配列番号:63)(以下、実施例83という);
tertBuCO-(配列番号:64)(以下、実施例84という);
R1-(配列番号:64)(以下、実施例89という);
R2-(配列番号:64)(以下、実施例95という);
ベンジル-(配列番号:64)(以下、実施例93という);
Ac-(配列番号:64)-[N-フェネチルアミド](以下、実施例96という);
R3-(配列番号:64)(以下、実施例99という);
R4-(配列番号:64)(以下、実施例103という);
Ac-(配列番号:64)-[N-ベンジルアミド](以下、実施例109という);
A-(配列番号:64)-A(以下、実施例115という);
ベンゾイル-(配列番号:64)(以下、実施例116という);
Ac-(配列番号:64)-R5(以下、実施例120という);
サクシニル-(配列番号:64)(以下、実施例121という);
Ac-(配列番号:64)-[N-オクチルアミド](以下、実施例122という);
Ac-(配列番号:64)-[N-ペンチルアミド](以下、実施例123という);
Ac-(配列番号:64)(以下、実施例124という);
Ac-(配列番号:64)-R6(以下、実施例127という);
(配列番号:64)(以下、実施例129という);
デカノイル-(配列番号:64)(以下、実施例137という);
ヘキサノイル-(配列番号:64)(以下、実施例139という);
SPT-(配列番号:65)-A(以下、実施例85という);
Ac-(配列番号:66)(以下、実施例86という);
TIK-(配列番号:67)-A(以下、実施例88という);
Ac-(配列番号:68)(以下、実施例90という);
Ac-(配列番号:69)(以下、実施例91という);
Ac-(配列番号:70)(以下、実施例92という);
Ac-(配列番号:71)(以下、実施例94という);
DNH-(配列番号:72)-A(以下、実施例97という);
HPN-(配列番号:73)-A(以下、実施例98という);
Ac-(配列番号:74)-TTS(以下、実施例100という);
A-(配列番号:75)-A(以下、実施例101という);
(配列番号:76)(以下、実施例102という);
Ac-(配列番号:76)(以下、実施例104という);
Ac-(配列番号:77)(以下、実施例105という);
DQD-(配列番号:78)-A(以下、実施例106という);
Ac-(配列番号:79)(以下、実施例107という);
Ac-(配列番号:80)(以下、実施例108という);
Ac-(配列番号:81)(以下、実施例110という);
Ac-(配列番号:82)(以下、実施例111という);
Ac-(配列番号:83)(以下、実施例112という);
Ac-(配列番号:84)(以下、実施例113という);
Ac-(配列番号:85)(以下、実施例114という);
REN-(配列番号:86)-A(以下、実施例117という);
Ac-(配列番号:87)(以下、実施例118という);
Ac-(配列番号:88)(以下、実施例119という);
A-(配列番号:89)-HEE(以下、実施例125という);
Ac-(配列番号:90)(以下、実施例126という);
Ac-(配列番号:91)(以下、実施例130という);
Ac-(配列番号:92)(以下、実施例131という);
Ac-(配列番号:93)(以下、実施例132という);
Ac-(配列番号:94)(以下、実施例133という);
Ac-(配列番号:95)(以下、実施例134という);
Ac-(配列番号:96)(以下、実施例135という);
A-(配列番号:97)-HSE(以下、実施例136という);
A-(配列番号:98)-ETA(以下、実施例138という);
Ac-(配列番号:99)(以下、実施例140という);
A-(配列番号:100)-A(以下、実施例141という);
Ac-(配列番号:101)(以下、実施例142という);
Ac-(配列番号:102)(以下、実施例143という);
Ac-(配列番号:103)(以下、実施例144という);
Ac-(配列番号:104)(以下、実施例145という);
Ac-(配列番号:105)(以下、実施例146という);
Ac-(配列番号:106)(以下、実施例147という);
Ac-(配列番号:107)(以下、実施例148という);
Ac-(配列番号:108)(以下、実施例149という);
A-(配列番号:109)-A(以下、実施例150という);
Ac-(配列番号:110)(以下、実施例151という);
Ac-(配列番号:111)(以下、実施例152という);
Ac-(配列番号:112)(以下、実施例153という);
Ac-(配列番号:113)(以下、実施例154という);
Ac-(配列番号:114)(以下、実施例155という);
(配列番号:114)(以下、実施例156という);
Ac-(配列番号:115)(以下、実施例157という);
Ac-(配列番号:116)(以下、実施例158という);
Ac-(配列番号:117)(以下、実施例159という);及び
Ac-(配列番号:118)(以下、実施例160という);
(式中、Acは、アセチルを表し、tertBuCOは、
Figure 2023520714000006
 を表し、
R1は:
Figure 2023520714000007
 を表し、
R2は:
Figure 2023520714000008
 を表し、
R3は:
Figure 2023520714000009
 を表し、
R4は:
Figure 2023520714000010
 を表し、
R5は:
Figure 2023520714000011
 を表し、かつ
R6は:
Figure 2023520714000012
 を表す)、
又はその医薬として許容し得る塩から選択される。
さらなる実施態様において、前記ペプチドリガンドは、第1のループ配列が7つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が5つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含む。
一実施態様において、前記ペプチドリガンドは、第1のループ配列が7つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が5つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含み、かつ該ペプチドリガンドは、以下:
Figure 2023520714000013
 のうちの1つのアミノ酸配列又はその医薬として許容し得る塩を含む。
さらなる実施態様において、前記ペプチドリガンドは、第1のループ配列が7つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が5つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含み、かつ該ペプチドリガンドは、N-及び/又はC末端修飾を任意に含み、かつ、以下:
A-(配列番号:119)-A(以下、実施例161という);
A-(配列番号:120)-A(以下、実施例162という);
A-(配列番号:121)-A(以下、実施例163という);
(配列番号:121)(以下、実施例185という);
A-(配列番号:122)-A(以下、実施例164という);
YATTQV-(配列番号:122)-A(以下、実施例171という);
KDNRVD-(配列番号:122)-A(以下、実施例172という);
EYQRDV-(配列番号:122)-A(以下、実施例173という);
A-(配列番号:122)-SNSYDMA(以下、実施例174という);
A-(配列番号:122)-SESVHTA(以下、実施例175という);
A-(配列番号:122)-SSDTTDA(以下、実施例176という);
A-(配列番号:122)-KPDHVDA(以下、実施例177という);
A-(配列番号:122)-ANV(以下、実施例186という);
RVNTHQ-(配列番号:122)-A(以下、実施例190という);
YDRDFT-(配列番号:122)-A(以下、実施例191という);
EVDTYP-(配列番号:122)-A(以下、実施例192という);
A-(配列番号:122)-ADGLYDA(以下、実施例193という);
AHP-(配列番号:123)-A(以下、実施例165という);
YGA-(配列番号:124)-A(以下、実施例166という);
A-(配列番号:125)-APN(以下、実施例167という);
A-(配列番号:126)-YDE(以下、実施例168という);
A-(配列番号:127)-AGD(以下、実施例169という);
A-(配列番号:128)-AHP(以下、実施例170という);
(配列番号:129)(以下、実施例178という);
(配列番号:130)(以下、実施例179という);
(配列番号:131)(以下、実施例180という);
(配列番号:132)(以下、実施例181という);
(配列番号:133)(以下、実施例182という);
A-(配列番号:134)-A(以下、実施例183という);
A-(配列番号:135)-A(以下、実施例184という);
RAP-(配列番号:136)-A(以下、実施例187という);
SHV-(配列番号:137)-A(以下、実施例188という);
RDL-(配列番号:138)-A(以下、実施例189という);
(配列番号:139)(以下、実施例194という);及び
(配列番号:140)(以下、実施例195という);
又はその医薬として許容し得る塩から選択される。
さらなる実施態様において、前記ペプチドリガンドは、第1のループ配列が7つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が3つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含む。
一実施態様において、前記ペプチドリガンドは、第1のループ配列が7つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が3つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含み、かつ該ペプチドリガンドは、以下:
Figure 2023520714000014
 のうちの1つのアミノ酸配列又はその医薬として許容し得る塩を含む。
さらなる実施態様において、前記ペプチドリガンドは、第1のループ配列が7つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が3つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含み、かつ該ペプチドリガンドは、N-及び/又はC末端修飾を任意に含み、かつ、以下:
A-(配列番号:141)-A(以下、実施例196という);
A-(配列番号:142)-A(以下、実施例197という);
A-(配列番号:143)-A(以下、実施例198という);
A-(配列番号:144)-A(以下、実施例199という);
DEQHHE-(配列番号:144)-A(以下、実施例209という);
SNATKQ-(配列番号:144)-A(以下、実施例210という);
GNIKKS-(配列番号:144)-A(以下、実施例211という);
A-(配列番号:144)-DPSSKQA(以下、実施例212という);
A-(配列番号:144)-YDNEMSA(以下、実施例213という);
SEAQET-(配列番号:144)(以下、実施例214という);
SPTEPP-(配列番号:144)(以下、実施例215という);
(配列番号:144)-EPETGQ(以下、実施例216という);
NRSPSE-(配列番号:144)(以下、実施例217という);
Ac-(配列番号:144)(以下、実施例218という);
R7-(配列番号:144)(以下、実施例219という);
A-(配列番号:144)-EPETGQA(以下、実施例221という);
(配列番号:144)-GDMSVS(以下、実施例222という);
(配列番号:144)-YDNEMS(以下、実施例223という);
(配列番号:144)-APDHLP(以下、実施例224という);
(配列番号:144)-DPSSKQ(以下、実施例226という);
(配列番号:144)-ANSEFE(以下、実施例227という);
(配列番号:144)-GAGESS(以下、実施例228という);
DHD-(配列番号:145)-A(以下、実施例200という);
ADG-(配列番号:146)-A(以下、実施例201という);
TLP-(配列番号:147)-A(以下、実施例202という);
SQE-(配列番号:148)-A(以下、実施例203という);
AET-(配列番号:149)-A(以下、実施例204という);
A-(配列番号:150)-DPN(以下、実施例205という);
A-(配列番号:151)-API(以下、実施例206という);
A-(配列番号:152)-ANT(以下、実施例207という);
A-(配列番号:153)-FAE(以下、実施例208という);
AND-(配列番号:154)-A(以下、実施例220という);及び
ERN-(配列番号:155)-A(以下、実施例225という);
(式中、R7は、
Figure 2023520714000015
 を表す)又はその医薬として許容し得る塩から選択される。
さらなる実施態様において、前記ペプチドリガンドは、第1のループ配列が6つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が5つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含む。
一実施態様において、前記ペプチドリガンドは、第1のループ配列が6つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が5つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含み、かつ該ペプチドリガンドは、以下:
Figure 2023520714000016
 のうちの1つのアミノ酸配列又はその医薬として許容し得る塩を含む。
さらなる実施態様において、前記ペプチドリガンドは、第1のループ配列が6つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が5つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含み、かつ該ペプチドリガンドは、N-及び/又はC末端修飾を任意に含み、かつ、以下:
A-(配列番号:156)-A(以下、実施例229という);及び
A-(配列番号:157)-A(以下、実施例230という);
又はその医薬として許容し得る塩から選択される。
さらなる実施態様において、前記ペプチドリガンドは、第1のループ配列が6つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が6つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含む。
実施態様において、前記ペプチドリガンドは、第1のループ配列が6つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が6つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含み、かつ該ペプチドリガンドは、以下:
Figure 2023520714000017
 のうちの1つのアミノ酸配列又はその医薬として許容し得る塩を含む。
さらなる実施態様において、前記ペプチドリガンドは、第1のループ配列が6つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が6つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含み、かつ該ペプチドリガンドは、N-及び/又はC末端修飾を任意に含み、かつ、以下:
A-(配列番号:158)-A(以下、実施例231という);及び
A-(配列番号:159)-A(以下、実施例232という);
又はその医薬として許容し得る塩から選択される。
一実施態様において、前記ペプチドリガンドは、2つの修飾されたアミノ酸残基の連結によって形成される追加のループを含む。さらなる実施態様において、該2つの修飾されたアミノ酸残基は、リンカー部位によって隔てられた修飾されたグリシン残基(本明細書では、modGと称される)である。
一実施態様において、前記リンカーは、二重結合又はトリアジニル環(1,2,3 トリアジニル環など)を任意に組み込んでいる-(CH2)2-10-リンカー(例えば、-(CH2)3-9-リンカーなど)を含む。
前記2つのmodG残基の間のリンカーの具体例としては:
Figure 2023520714000018
 が挙げられる。
追加のループを含むペプチドリガンドの好適な例としては:
Figure 2023520714000019
 又はその医薬として許容し得る塩が挙げられる。
前記追加のループを含むペプチドリガンドの具体例としては、実施例233～249が挙げられる。
一実施態様において、前記ペプチドリガンドは、少なくとも2つ(例えば、3つなど)の二環式ペプチドリガンドを含む多量体結合複合体を含み、該ペプチドリガンドは、同じであっても異なっていてもよく、それぞれが、少なくとも2つのループ配列によって隔てられた少なくとも3つの反応性基を含むポリペプチド、及び該ポリペプチドの該反応性基と共有結合を形成する分子スキャフォールドを含み、少なくとも2つのポリペプチドループが、該分子スキャフォールド上に形成されている。
さらなる実施態様において、前記多量体結合複合体は、三量体部位(すなわち、3つの二環式ペプチド)を含む。さらなる実施態様において、多量体結合複合体は、三量体部位(すなわち、3つの同一の二環式ペプチド)を含む。なおさらなる実施態様において、前記ペプチドリガンドは、実施例250及び251から選択される三量体部位を含む。
別途定義されない限り、本明細書で使用される技術用語及び科学用語は全て、当該技術分野、例えば、ペプチド化学、細胞培養、及びファージディスプレイ、核酸化学、並びに生化学の分野の専門家によって一般に理解されているものと同じ意味を有する。標準的な技法が、分子生物学、遺伝学、及び生化学の方法に使用される(引用により本明細書中に組み込まれる、Sambrookらの文献、分子クローニング:実験室マニュアル(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)、第3版、2001, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY; Ausubelらの文献、分子生物学のショートプロトコル(Short Protocols in Molecular Biology)(1999) 第4版、John Wiley ＆ Sons社を参照)。
(命名法)
(付番)
本発明のペプチド内のアミノ酸残基位置に言及する場合、反応性基(例えば、システイン残基)は不変であるので、これらは付番から省略され、それゆえ、本発明のペプチド内のアミノ酸残基の付番は、以下のように示される:
-C-Q1-TrpMe2-tBuA3-Q4-D5-C-TrpMe6-ADMA7-G8-4F3ClPhe9-C-(配列番号:1)。
本明細書の目的のために、全ての二環式ペプチドは、1,1',1''-(1,3,5-トリアジナン-1,3,5-トリイル)トリプロパ-2-エン-1-オン(TATA)と環化されて、三置換構造を生じることが想定される。TATAを用いる環化は、3つのシステイン残基のそれぞれにおいて生じる。
(分子フォーマット)
二環コア配列へのN-又はC末端伸長は、ハイフンによって隔てられた、配列の左側又は右側に付加される。例えば、N末端βAla-Sar10-Alaテールは:
βAla-Sar10-A-(配列番号:X)
と表される。
(逆向きのペプチド配列)
Nairらの文献(2003) J Immunol 170(3), 1362-1373における開示を踏まえ、本明細書に開示されるペプチド配列は、そのレトロ-インベルソ(retro-inverso)形態でも有用性を見出すことが想定される。例えば、配列が逆転し(すなわち、N末端がC末端になり、C末端がN末端になり)、その立体化学もまた逆転する(すなわち、D-アミノ酸がL-アミノ酸になり、L-アミノ酸がD-アミノ酸になる)。
(ペプチドリガンド)
本明細書において言及されるペプチドリガンドは、分子スキャフォールドに共有結合したペプチドを指す。典型的には、そのようなペプチドは、スキャフォールドに対して共有結合を形成することができる2つ以上の反応基(すなわち、システイン残基)と、ペプチドがスキャフォールドに結合したときにループを形成するのでループ配列と呼ばれる、該反応基間に内在する配列とを含む。この場合、ペプチドは、少なくとも3つのシステイン残基を含み、かつスキャフォールド上に少なくとも2つのループを形成する。
(ペプチドリガンドの利点)
本発明の特定の二環式ペプチドは、それを注射、吸入、経鼻、点眼、経口、又は局所投与のための好適な薬物様分子とみなすことができるいくつかの有利な特性を有する。そのような有利な特性としては、以下のもの挙げられる:
－種交差反応性。これは、前臨床的な薬力学及び薬物動態評価の典型的な必要条件である;
－プロテアーゼ安定性。二環式ペプチドリガンドは、理想的には、血漿プロテアーゼ、上皮(「膜固定型」)プロテアーゼ、胃腸プロテアーゼ、肺表面プロテアーゼ、細胞内プロテアーゼなどに対する安定性を示すべきである。プロテアーゼ安定性は、二環リード候補を動物モデルで開発できるだけでなく、自信を持ってヒトに投与することもできるように、異なる種の間で維持されているべきである;
－望ましい溶解性プロファイル。これは、製剤化及び吸収のために重要である、荷電した親水性残基と疎水性残基との比率並びに分子内/分子間H-結合の関数である;及び
－循環中での最適な血漿半減期。臨床的適応及び治療レジメンに応じて、これは、急性疾患管理設定で短期曝露用の二環式ペプチドを開発するため、又は循環中での保持が増強された二環式ペプチドを開発するために必要となることがあり、従ってより慢性的な疾患状態の管理に最適である。望ましい血漿半減期を推進する他の要因は、薬剤の持続的曝露による随伴毒性との対比での最大治療効率のための持続的曝露の要求である。
－選択性。本発明の特定のペプチドリガンドは、他のサイトカインよりも良好な選択性を示す。
(医薬として許容し得る塩)
塩形態が本発明の範囲内であり、ペプチドリガンドへの言及が該リガンドの塩形態を含むことが理解されるであろう。
本発明の塩は、従来の化学的方法、例えば、医薬塩:特性、選択、及び使用(Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use)、P. Heinrich Stahl(編者)、Camille G. Wermuth(編者)、ISBN: 3-90639-026-8, Hardcover, 388頁、August 2002に記載されている方法によって、塩基性又は酸性部分を有する親化合物から合成することができる。通常、そのような塩は、これらの化合物の遊離酸又は塩基形態を、適切な塩基又は酸と、水中もしくは有機溶媒中で、又はこれら2つの混合物中で反応させることにより調製することができる。
酸付加塩(モノ塩又はジ塩)は、無機と有機の双方の多種多様な酸と形成することができる。酸付加塩の例としては、酢酸、2,2-ジクロロ酢酸、アジピン酸、アルギン酸、アスコルビン酸(例えば、L-アスコルビン酸)、L-アスパラギン酸、ベンゼンスルホン酸、安息香酸、4-アセトアミド安息香酸、ブタン酸、(+)カンファー酸、カンファースルホン酸、(+)-(1S)-カンファー-10-スルホン酸、カプリン酸、カプロン酸、カプリル酸、ケイ皮酸、クエン酸、シクラミン酸、ドデシル硫酸、エタン-1，2-ジスルホン酸、エタンスルホン酸、2-ヒドロキシエタンスルホン酸、ギ酸、フマル酸、粘液酸、ゲンチジン酸、グルコヘプトン酸、D-グルコン酸、グルクロン酸(例えば、D-グルクロン酸など)、グルタミン酸(例えば、L-グルタミン酸など)、α-オキソグルタル酸、グリコール酸、馬尿酸、ハロゲン化水素酸(例えば、臭化水素酸、塩酸、ヨウ化水素酸)、イセチオン酸、乳酸(例えば、(+)-L-乳酸、(±)-DL-乳酸)、ラクトビオン酸、マレイン酸、リンゴ酸、(-)-L-リンゴ酸、マロン酸、(±)-DL-マンデル酸、メタンスルホン酸、ナフタレン-2-スルホン酸、ナフタレン-1,5-ジスルホン酸、1-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸、ニコチン酸、硝酸、オレイン酸、オロト酸、シュウ酸、パルミチン酸、パモ酸、リン酸、プロピオン酸、ピルビン酸、L-ピログルタミン酸、サリチル酸、4-アミノサリチル酸、セバシン酸、ステアリン酸、コハク酸、硫酸、タンニン酸、(+)-L-酒石酸、チオシアン酸、p-トルエンスルホン酸、ウンデシレン酸、及び吉草酸、並びにアシル化アミノ酸及び陽イオン交換樹脂からなる群から選択される酸と形成されるモノ塩又はジ塩が挙げられる。
塩の1つの特定の群は、酢酸、塩酸、ヨウ化水素酸、リン酸、硝酸、硫酸、クエン酸、乳酸、コハク酸、マレイン酸、リンゴ酸、イセチオン酸、フマル酸、ベンゼンスルホン酸、トルエンスルホン酸、硫酸、メタンスルホン酸(メシル酸)、エタンスルホン酸、ナフタレンスルホン酸、吉草酸、プロパン酸、ブタン酸、マロン酸、グルクロン酸、及びラクトビオン酸から形成される塩からなる。1つの特定の塩は、塩酸塩である。別の特定の塩は、酢酸塩である。
化合物がアニオン性であるか、又はアニオン性であり得る官能基を有する(例えば、-COOHが-COO-であり得る)場合、塩を有機又は無機塩基と形成させ、好適なカチオンを生成させることができる。好適な無機カチオンの例としては、Li+、Na+、及びK+などのアルカリ金属イオン、Ca2+及びMg2+などのアルカリ土類金属カチオン、及びAl3+又はZn+などの他のカチオンが挙げられるが、これらに限定されない。適切な有機カチオンの例としては、アンモニウムイオン(すなわち、NH4 +)及び置換アンモニウムイオン(例えば、NH3R+、NH2R2 +、NHR3 +、NR4 +)が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの好適な置換アンモニウムイオンの例としては、メチルアミン、エチルアミン、ジエチルアミン、プロピルアミン、ジシクロヘキシルアミン、トリエチルアミン、ブチルアミン、エチレンジアミン、エタノールアミン、ジエタノールアミン、ピペラジン、ベンジルアミン、フェニルベンジルアミン、コリン、メグルミン、及びトロメタミン、並びにリジン及びアルギニンなどのアミノ酸に由来するものが挙げられる。一般的な第四級アンモニウムイオンの例は、N(CH3)4 +である。
本発明のペプチドがアミン官能基を含有する場合、これらは、例えば、当業者に周知の方法によるアルキル化剤との反応によって、第四級アンモニウム塩を形成し得る。そのような第四級アンモニウム化合物は、本発明のペプチドの範囲内である。
(修飾誘導体)
本明細書で定義されるペプチドリガンドの修飾誘導体が、本発明の範囲内であることが理解されるであろう。そのような好適な修飾誘導体の例としては:N末端及び/又はC末端修飾;1以上のアミノ酸残基の1以上の非天然アミノ酸残基による置換(例えば、1以上の極性アミノ酸残基の1以上の等配電子(isosteric)又は等電子(isoelectronic)アミノ酸による置換;1以上の非極性アミノ酸残基の他の非天然等配電子又は等電子アミノ酸による置換);スペーサー基の付加;1以上の酸化感受性アミノ酸残基の1以上の酸化抵抗性アミノ酸残基による置換;1以上のアミノ酸残基のアラニンによる置換、1以上のL-アミノ酸残基の1以上のD-アミノ酸残基による置換;二環式ペプチドリガンド内の1以上のアミド結合のN-アルキル化;1以上のペプチド結合の代用結合による置換;ペプチド骨格長の変更;1以上のアミノ酸残基のα-炭素上の水素の別の化学基による置換、システイン、リジン、グルタミン酸/アスパラギン酸、及びチロシンなどのアミノ酸を官能基化するような、該アミノ酸の好適なアミン、チオール、カルボン酸、及びフェノール反応性試薬による修飾、並びに官能基化に好適である直交反応性(orthogonal reactivity)を導入するアミノ酸、例えば、それぞれ、アルキン又はアジドを有する部分による官能基化を可能にするアジド又はアルキン基を有するアミノ酸の導入又は置換:から選択される1以上の修飾が挙げられる。
一実施態様において、修飾誘導体は、N末端及び/又はC末端修飾を含む。さらなる実施態様において、修飾誘導体は、好適なアミノ反応化学を用いるN末端修飾、及び/又は好適なカルボキシ反応化学を用いるC末端修飾を含む。さらなる実施態様において、該N末端又はC末端修飾は、限定されないが、細胞傷害性剤、放射性キレート剤、又は発色団を含む、エフェクター基の付加を含む。
さらなる実施態様において、修飾誘導体は、N末端修飾を含む。さらなる実施態様において、N末端修飾は、N末端アセチル基を含む。この実施態様において、N末端システイン基は、ペプチド合成の間に無水酢酸又は他の適切な試薬でキャッピングされ、N末端がアセチル化された分子をもたらす。この実施態様は、アミノペプチダーゼの潜在的な認識点を除去するという利点を提供し、二環式ペプチドの分解の可能性を回避する。
別の実施態様において、N末端修飾は、エフェクター基のコンジュゲーション及びその標的に対する二環式ペプチドの効力の保持を促進する分子スペーサー基の付加を含む。
さらなる実施態様において、修飾誘導体は、C末端修飾を含む。さらなる実施態様において、C末端修飾は、アミド基を含む。この実施態様において、C末端システイン基は、ペプチド合成の間にアミドとして合成され、C末端がアミド化された分子をもたらす。この実施態様は、カルボキシペプチダーゼの潜在的な認識点を除去するという利点を提供し、二環式ペプチドのタンパク質分解の可能性を低下させる。
一実施態様において、修飾誘導体は、1以上のアミノ酸残基の1以上の非天然アミノ酸残基による置換を含む。この実施態様においては、分解性プロテアーゼによって認識されることも、標的効力に何らかの有害作用を有することもない等配電子/等電子側鎖を有する非天然アミノ酸を選択してもよい。
あるいは、近くのペプチド結合のタンパク質分解性加水分解が立体配座的に(conformationally)及び立体的(sterically)に妨害されるように、拘束されたアミノ酸側鎖を有する非天然アミノ酸を使用してもよい。特に、これらは、プロリン類似体、嵩高い側鎖、Cα-二置換誘導体(例えば、アミノイソ酪酸、Aib)、及びシクロアミノ酸に関し、単純な誘導体はアミノ-シクロプロピルカルボン酸である。
一実施態様において、修飾誘導体は、スペーサー基の付加を含む。さらなる実施態様において、修飾誘導体は、N末端システイン及び/又はC末端システインへのスペーサー基の付加を含む。
一実施態様において、修飾誘導体は、1以上の酸化感受性アミノ酸残基の1以上の酸化抵抗性アミノ酸残基による置換を含む。さらなる実施態様において、修飾誘導体は、トリプトファン残基のナフチルアラニン又はアラニン残基による置換を含む。この実施態様は、得られる二環式ペプチドリガンドの医薬安定性プロファイルを改善するという利点を提供する。
一実施態様において、修飾誘導体は、1以上の荷電アミノ酸残基の1以上の疎水性アミノ酸残基による置換を含む。別の実施態様において、修飾誘導体は、1以上の疎水性アミノ酸残基の1以上の荷電アミノ酸残基による置換を含む。荷電アミノ酸残基と疎水性アミノ酸残基の正しいバランスは、二環式ペプチドリガンドの重要な特徴である。例えば、疎水性アミノ酸残基は、血漿タンパク質結合の程度、したがって、血漿中の利用可能な遊離画分の濃度に影響を及ぼし、一方、荷電アミノ酸残基(特に、アルギニン)は、ペプチドと細胞表面のリン脂質膜との相互作用に影響を及ぼす可能性がある。この2つの組合せは、ペプチド薬の半減期、分布容積、及び曝露に影響を及ぼす可能性があり、臨床的なエンドポイントに応じて調整することができる。さらに、荷電アミノ酸残基と疎水性アミノ酸残基の正しい組合せ及び数は、注射部位(ペプチド薬が皮下投与された場合)での刺激を軽減することができる。
一実施態様において、修飾誘導体は、1以上のL-アミノ酸残基の1以上のD-アミノ酸残基による置換を含む。この実施態様は、立体障害により及びβ-ターン立体構造を安定化させるD-アミノ酸の傾向により、タンパク質分解の安定性を高めると考えられる(Tugyiらの文献(2005) PNAS, 102(2), 413-418)。
一実施態様において、修飾誘導体は、任意のアミノ酸残基の除去及びアラニンによる置換を含む。この実施態様は、潜在的なタンパク質分解攻撃部位を除去するという利点を有する。
上述の修飾の各々は、ペプチドの効力又は安定性を意図的に向上させる役割を果たすことに留意すべきである。修飾に基づくさらなる効力向上は、以下の機序によって達成することができる:
－より高い親和性が達成されるように、疎水性効果を利用し、より低い解離速度をもたらす疎水性部位を組み込むこと;
－長距離イオン相互作用を利用し、より速い会合速度をもたらし、より高い親和性をもたらす荷電基を組み込むこと(例えば、Schreiberらの文献、タンパク質の急速静電アシスト会合(Rapid, electrostatically assisted association of proteins)(1996)、Nature Struct. Biol. 3, 427-31を参照);並びに
－例えば、エントロピーの損失が標的結合時に最小になるように、アミノ酸の側鎖を正しく拘束すること、エントロピーの損失が標的結合時に最小になるように、骨格のねじれ角度を拘束すること、及び同一の理由で分子内にさらなる環化を導入することにより、さらなる拘束性をペプチドに組み込むこと
(総説については、Gentilucciらの文献、Curr. Pharmaceutical Design, (2010), 16, 3185-203、及びNestorらの文献、Curr. Medicinal Chem (2009), 16, 4399-418を参照)。
(同位体バリエーション)
本発明は、1以上の原子が、同じ原子番号を有するが、天然に通常見られる原子質量又は質量数とは異なる原子質量又は質量数を有する原子によって置き換えられている、本発明の医薬として許容し得る全ての(放射性)同位体標識ペプチドリガンド、並びに関連する(放射性)同位体を保持することができる金属キレート基が取り付けられている本発明のペプチドリガンド(「エフェクター」と呼ばれる)、並びに特定の官能基が関連する(放射性)同位体又は同位体標識された官能基で共有結合的に置き換えられている本発明のペプチドリガンドを含む。
本発明のペプチドリガンドに含めるために好適な同位体の例は、水素の同位体、例えば、2H(D)及び3H(T)、炭素の同位体、例えば、11C、13C及び14C、塩素の同位体、例えば、36Cl、フッ素の同位体、例えば、18F、ヨウ素の同位体、例えば、123I、125I、及び131I、窒素の同位体、例えば、13N及び15N、酸素の同位体、例えば、15O、17O、及び18O、リンの同位体、例えば、32P、硫黄の同位体、例えば、35S、銅の同位体、例えば、64Cu、ガリウムの同位体、例えば、67Ga又は68Ga、イットリウムの同位体、例えば、90Y、並びにルテチウムの同位体、例えば、177Lu、並びにビスマスの同位体、例えば、213Biを含む。
本発明の特定の同位体標識ペプチドリガンド、例えば、放射性同位体を組み込んでいるものは、薬物及び/又は基質の組織分布研究において、並びに罹患組織上のTSLP標的の存在及び/又は不在を臨床的に評価するために有用である。本発明のペプチドリガンドは、標識化合物と他の分子、ペプチド、タンパク質、酵素、又は受容体との間の複合体の形成を検出又は同定するために使用することができるという点で、価値ある診断特性をさらに有することができる。検出又は同定方法は、例えば、放射性同位体、酵素、蛍光物質、発光物質(例えば、ルミノール、ルミノール誘導体、ルシフェリン、イクオリン、及びルシフェラーゼ)などの標識剤で標識されている化合物を使用することができる。放射性同位体のトリチウム、すなわち、3H(T)及び炭素-14、すなわち、14Cは、その組込みの容易さ及び検出の手段が用意されていることを考慮して、この目的のために特に有用である。
重水素、すなわち、2H(D)などのより重い同位体による置換は、より大きい代謝安定性、例えば、増加したインビボ半減期又は低下した必要投薬量の結果として得られる、特定の治療的利点をもたらす場合があり、それゆえ、いくつかの状況では、好ましい場合がある。
11C、18F、15O、及び13Nなどの陽電子放出同位体による置換は、標的占有率を調べるための陽電子放出トポグラフィー(PET)試験において有用であり得る。
本発明のペプチドリガンドの同位体標識化合物は、通常、当業者に公知の従来の技法によるか、又は以前に利用されていた非標識試薬の代わりに適切な同位体標識試薬を使用する添付の実施例に記載されているものと類似のプロセスによって調製することができる。
(分子スキャフォールド)
分子スキャフォールドは、例えば、WO 2009/098450並びに該明細書の引例、特にWO 2004/077062及びWO 2006/078161に記載されている。
一実施態様において、分子スキャフォールドは、非芳香族スキャフォールドである。本明細書における「非芳香族分子スキャフォールド」への言及は、芳香族(すなわち、不飽和)炭素環式又は複素環系を含まない本明細書で定義される任意の分子スキャフォールドを意味する。
非芳香族分子スキャフォールドの好適な例は、Heinisらの文献(2014) Angewandte Chemie, International Edition 53(6) 1602-1606に記載されている。
前述の文書に記載されているように、分子スキャフォールドは、有機小分子などの小分子であってもよい。
一実施態様において、分子スキャフォールドは、巨大分子であってもよい。一実施態様において、分子スキャフォールドは、アミノ酸、ヌクレオチド、又は炭水化物で構成される巨大分子である。
一実施態様において、分子スキャフォールドは、ポリペプチドの官能基(複数可)と反応して、共有結合を形成することができる反応性基を含む。
分子スキャフォールドは、アミン、チオール、アルコール、ケトン、アルデヒド、ニトリル、カルボン酸、エステル、アルケン、アルキン、アジド、無水物、コハク酸イミド、マレイミド、ハロゲン化アルキル、及びハロゲン化アシルなどの、ペプチドと結合を形成する化学基を含んでもよい。
αβ不飽和カルボニルを含有する化合物の例は、1,1',1''-(1,3,5-トリアジナン-1,3,5-トリイル)トリプロパ-2-エン-1-オン(TATA)(Angewandte Chemie, International Edition (2014), 53(6)、1602-1606)である。
(結合活性)
本明細書の文脈において特異性は、リガンドの、それの関連標的(cognate target)に類似するものは除外しつつ、該標的に結合したりその他のやり方で該標的と相互作用したりする能力を意味する。例えば、特異性は、ヒト酵素の相互作用を阻害するが異なる種由来の相同酵素は阻害しないというリガンドの能力を意味する場合がある。本明細書に記載されるアプローチを用いて、特異性を調節することができる、すなわち、該リガンドを、意図される標的のホモログ又はパラログとより強く又は弱く相互作用することができるようにするために、増加又は低減させることができる。特異性が、活性、親和性、又はアビディティーと同義語であることは意図されず、リガンドのその標的に対する作用の効力(例えば、結合親和性又は阻害レベルなど)は、その特異性には必ずしも関連していない。
本明細書で使用される場合結合活性は、例えば、本明細書に記載されるもののような結合アッセイで得られる定量的な結合測定値を意味する。従って、結合活性は、所与の目標濃度での結合するペプチドリガンドの量を意味する。
多重特異性(multispecificity)は、2つ以上の標的に結合する能力である。通常、結合性ペプチドは、それらの立体構造的性質のために単一の標的(抗体の場合にはエピトープなど）に結合することができる。しかしながら、2つ以上の標的に結合することができるペプチド;二重特異性抗体、例えば、上述の技術分野において公知のものを開発することができる。本発明においては、ペプチドリガンドを、2つ以上の標的に結合することができ、従って、多重特異性であるものとすることができる。好適には、ペプチドリガンドは、2つの標的に結合し、二重特異的である。結合は、非依存性であってもよく、これは、ペプチド上の標的に対する結合部位が、標的のうちの一方又は他方の結合によって構造的に邪魔されないことを意味するであろう。この場合、双方の標的は独立に結合されることができる。より一般的には、一方の標的の結合が、他方の結合を少なくとも部分的に妨げるであろうことが期待される。
二重特異性リガンドと2つの関連標的を包含する特異性を有するリガンドとの間には根本的な差が存在する。第1の場合、リガンドは、標的の双方に対して別々に特異的であり、それぞれと特異的に相互作用する。例えば、リガンド中の第1のループは、第1の標的に結合し、第2のループは、第2の標的に結合し得る。第2の場合、リガンドは、それが、例えば、該2つの標的の双方に共通のエピトープと相互作用することによって該2つの標的を区別しないという理由で非特異的である。
本発明の文脈において、例えば、標的及びオルソログに関して活性を有するリガンドが、二重特異性リガンドである可能性がある。しかしながら、一実施態様において、リガンドは、二重特異性ではなく、それが標的及び1以上のオルソログの双方に結合するようなより厳密ではない特異性を有する。一般に、標的及びそのオルソログの双方に対して選択されたものではないリガンドは、二重特異性に対する選択圧の非存在のために二重特異性である可能性が低い。二環式ペプチドにおけるループ長が、より関連性の低いホモログに対して高い選択性を維持しつつ良好な標的及びオルソログ交差反応性を得ることができるような特化された結合表面の提供の決め手となり得る。
リガンドが本当に二重特異性である場合、一実施態様において、リガンドの標的特異性の少なくとも一方は、選択されたリガンドの間で共通となるであろう。また、この特異性のレベルを、本明細書に開示される方法によって調節することができる。第2の又はさらなる特異性が、共有される必要はなく、本明細書に記載される手法の対象である必要はない。
標的は、ペプチドリガンドが結合するか又はその他のやり方で相互作用する分子又はその部分である。結合は、大部分の種類の活性の必要条件としてみなされ、それ自体で活性であり得るが、他の活性も想定される。従って、本発明は、直接的又は間接的な結合の測定を必要とはしない。
分子スキャフォールドは、ペプチドを複数の地点で接続して、該ペプチドに1種以上の構造的な特徴を付与することができる任意の分子である。好ましくは、分子スキャフォールドは、スキャフォールド反応性基と呼ばれる、ペプチドに対する少なくとも3つの取付点を含む。これらの基は、ペプチド上のシステイン残基と反応して、共有結合を形成することができる。これらは、単に、還元的切断及び同時に生じる分子の崩壊が生じやすいジスルフィド結合を形成するのではなく、安定な共有結合性チオエーテル結合を形成する。好ましい分子スキャフォールドの構造を、以下に記載する。
(合成)
本発明のペプチドは、標準的な技法及びそれに続くインビトロでの分子スキャフォールドとの反応によって合成的に製造することができる。これを実施する場合、標準的な化学を使用することができる。これにより、さらなる下流での実験又は検証のための可溶性材料の迅速な大規模調製が可能になる。そのような方法は、Timmermanらの文献(上記)に開示されているものなどの慣用の化学を用いて達成され得る。
したがって、本発明はまた、本明細書に記載されているように選択されるポリペプチドの製造に関するものであり、ここで、該製造は、以下に説明されるような任意のさらなる工程を含む。一実施態様において、これらの工程は、化学合成によって作られた最終生成物のポリペプチドに対して実施される。
任意に、対象となるポリペプチド中のアミノ酸残基は、コンジュゲート又は複合体を製造するときに置換されてもよい。
ペプチドを伸長させて、例えば、別のループを組み込み、それゆえ、複数の特異性を導入することもできる。
ペプチドを伸長させるために、それを、単純に、標準的な固相又は液相化学を用いて、直交保護されたリジン(及び類似体)を用いて、そのN末端もしくはC末端で又はループ内で化学的に伸長してもよい。標準的な(バイオ)コンジュゲーション技法を用いて、活性化された又は活性化可能なN-又はC末端を導入してもよい。或いは、付加は、例えば、(Dawsonらの文献、1994、ネイティブケミカルライゲーションによるタンパク質の合成(Synthesis of Proteins by Native Chemical Ligation). Science 266:776-779)に記載されている断片縮合もしくはネイティブケミカルライゲーションによるか、又は例えば(Changらの文献、Proc Natl Acad Sci U S A. 1994 Dec 20; 91(26):12544-8もしくはHikariらの文献、Bioorganic ＆ Medicinal Chemistry Letters、第18巻、第22号、2008年11月15日、6000～6003頁)に記載されているサブチリガーゼを用いて、酵素により行われてもよい。
或いは、ペプチドは、ジスルフィド結合を介するさらなるコンジュゲーションによって伸長又は修飾されてもよい。これは、第一及び第二のペプチドが細胞の還元環境内で一度互いに解離することを可能にするという追加の利点を有する。この場合、分子スキャフォールド(例えば、TATA)は、3つのシステイン基と反応するように第一のペプチドの化学合成の間に付加されることができ;その後、さらなるシステイン又はチオールが第一のペプチドのN又はC末端に付加されることができ、その結果、このシステイン又はチオールが第二のペプチドの遊離のシステイン又はチオールとのみ反応して、ジスルフィド結合した二環式ペプチド-ペプチドコンジュゲートを形成した。
同様の技法は、四重特異性分子を潜在的に生じさせる、2つの二環式二重特異性大環状分子の合成/カップリングに等しく適用される。
さらに、他の官能基又はエフェクター基の付加は、適切な化学を用いて、N-もしくはC末端で、又は側鎖を介してカップリングさせて、同じ方法で達成されてもよい。一実施態様において、カップリングは、いずれかの実体の活性を遮断しないような方法で実行される。
(医薬組成物)
本発明のさらなる態様によれば、本明細書で定義されるペプチドリガンドを、1以上の医薬として許容し得る賦形剤との組合せで含む医薬組成物が提供される。
通常、本ペプチドリガンドは、薬理学的に適切な賦形剤又は担体と一緒に精製された形態で利用される。典型的には、これらの賦形剤又は担体は、生理食塩水及び/又は緩衝化媒体を含む、水性もしくはアルコール/水性溶液、エマルジョン、又は懸濁液を含む。非経口ビヒクルとしては、塩化ナトリウム溶液、ブドウ糖リンゲル液、ブドウ糖及び塩化ナトリウム並びに乳酸加リンゲル液が挙げられる。生理的に許容し得る好適なアジュバントは、ポリペプチド複合体を懸濁状態に保つために必要な場合、カルボキシメチルセルロース、ポリビニルピロリドン、ゼラチン、及びアルギネートなどの増粘剤から選択されてもよい。
静脈内ビヒクルとしては、流体及び栄養補充液及び電解質補充液、例えば、ブドウ糖リンゲル液に基づくものが挙げられる。また、防腐剤並びに他の添加物、例えば、抗微生物薬、抗酸化剤、キレート剤、及び不活性ガスが存在してもよい(Mackの文献(1982)、レミントンの薬科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)、第16版)。
本発明のペプチドリガンドは、別々に投与される組成物として、又は他の薬剤と併せて使用されてもよい。これらとしては、抗体、抗体断片、並びに様々な免疫療法薬、例えば、シクロスポリン、メトトレキサート、アドリアマイシン、又はシスプラチン、及び免疫毒素を挙げることができる。医薬組成物は、本発明のタンパク質リガンドと併せた様々な細胞傷害性薬剤もしくは他の薬剤の「カクテル」、又は投与前にプールされているか、プールされていないかを問わず、異なる標的リガンドを用いて選択されたポリペプチドなどの、異なる特異性を有する本発明による選択されたポリペプチドの組合せさえも含むことができる。
本発明による医薬組成物の投与の経路は、当業者に一般的に公知の任意のものであってもよい。療法のために、本発明のペプチドリガンドは、標準的な技法に従って任意の患者に投与することができる。投与は、非経口、静脈内、筋肉内、腹腔内、経皮的、肺経路を介するもの、又は同じく適切に、カテーテルを用いる直接輸液によるものを含め、任意の適切な様式によるものであることができる。好ましくは、本発明による医薬組成物は、吸入によって投与される。投薬量及び投与の頻度は、患者の年齢、性別、及び状態、他の薬物の同時的な投与、禁忌、並びに臨床医によって考慮される他のパラメーターによって決まる。
本発明のペプチドリガンドは、保存のために凍結乾燥し、使用前に好適な担体中で再構成することができる。この技法は、効果的であることが示されており、当技術分野で公知の凍結乾燥及び再構成技法を利用することができる。凍結乾燥及び再構成は様々な程度の活性損失をもたらし得ること、及び補償するためにレベルを上方に調整する必要があり得ることが当業者によって理解されるであろう。
本発明のペプチドリガンド又はそのカクテルを含有する組成物は、予防的及び/又は治療的処置のために投与することができる。特定の治療用途において、選択される細胞の集団の少なくとも部分的な阻害、抑制、調節、死滅化、又は何らかの他の測定可能なパラメーターを達成するために十分な量が、「治療有効用量」として定義される。この投薬量を達成するために必要とされる量は、疾患の重症度及び患者自身の免疫系の全般的な状態によって決まるが、概ね、体重1キログラム当たり0.005～5.0mgの選択されるペプチドリガンドの範囲であり、0.05～2.0mg/kg/用量の用量がより一般的に使用される。予防用途のために、本ペプチドリガンド又はそのカクテルを含有する組成物はまた、同様の又はわずかに少ない投薬量で投与されてもよい。
本発明によるペプチドリガンドを含有する組成物を予防的及び治療的な設定で利用して、哺乳動物における選択標的細胞集団の変化、不活性化、死滅化、又は除去を助けることができる。さらに、本明細書に記載されるペプチドリガンドを体外で又はインビトロで用いて、細胞の異成分集合体から標的細胞集団を選択的に死滅させるか、枯渇させるか、又は他の形で効果的に除去することができる。哺乳動物由来の血液を、選択されたペプチドリガンドと体外で組み合わせることができ、それにより、標準的な技法に従って哺乳動物に戻すために、望ましくない細胞を死滅させるか、又は別の形で血液から除去する。
(治療的使用)
本発明の二環式ペプチドは、TSLPバインダーとして特に有用である。胸腺間質性リンパ球新生因子(TSLP)は、サイトカインファミリーに属するタンパク質である。これは、抗原提示細胞の活性化を介するT細胞集団の成熟に重要な役割を果たすことが知られている。TSLPは、主として、線維芽細胞、上皮細胞、及び別の種類の間質細胞又は間質様細胞などの非造血性細胞によって産生される。これらの細胞は、TSLP活性が必要とされる領域に存在している。TSLPは、主に(ainly)骨髄系細胞に影響を及ぼし、単球からのT細胞誘引性ケモカインの放出を誘導し、骨髄系(CD11c+)樹状細胞の成熟を強化する。また、TSLPは、ランゲルハンス細胞と呼ばれる、表皮内に存在する樹状細胞の特定のサブセットの成熟を促進することが示されている。胸腺内では、骨髄系及び形質細胞様(CD123+)の双方の樹状細胞のTSLP活性化が、制御性T細胞の産生をもたらす。TSLPは、胸腺間質性リンパ球新生因子受容体CRLF2及びIL-7Rアルファ鎖で構成されるヘテロ二量体の受容体複合体を介してシグナルを送る。結合後、STAT5のリン酸化が誘導され、上流の転写因子の発現をもたらす
本発明の方法に従って選択されたポリペプチドリガンドは、インビボでの治療的及び予防的用途、インビトロ及びインビボでの診断用途、インビトロでのアッセイ及び試薬用途などにおいて利用することができる。選択されたレベルの特異性を有するリガンドは、交差反応性が望ましい非ヒトの動物における試験を伴う用途において、又はホモログもしくはパラログとの交差反応性を注意深く制御する必要がある診断用途において有用である。ワクチン用途などの一部の用途では、所定の範囲の抗原に対する免疫応答を誘発する能力を活用して、特定の疾患及び病原体に合わせたワクチンを作成することができる。
少なくとも90～95％の均質性の実質的に純粋なペプチドリガンドは、哺乳動物への投与に好ましく、98～99％又はそれを上回る均質性は、特に、哺乳動物がヒトである場合、医薬としての使用に最も好ましい。部分的に又は所望の均質性になるまで精製したら、選択されたポリペプチドを、診断的にもしくは治療的に(体外を含めて)使用してもよく、又はアッセイ手順、免疫蛍光染色などを開発及び実施する際に使用してもよい(Lefkovite及びPernisの文献(1979年及び1981年)、免疫学的方法(Immunological Methods)、第I巻及び第II巻、Academic Press, NY)。
本発明のさらなる態様によれば、TSLPによって媒介される疾患又は障害の予防、抑制、又は治療において使用するための、本明細書で定義されるペプチドリガンドが提供される。
本発明のさらなる態様によれば、TSLPによって媒介される疾患又は障害を予防、抑制、又は治療する方法であって、それを必要としている患者に、本明細書で定義されるペプチドリガンドを投与することを含む、前記方法が提供される。
一実施態様において、TSLPは、哺乳動物TSLPである。さらなる実施態様において、哺乳動物のTSLPは、ヒトTSLPである。
一実施態様において、TSLPによって媒介される疾患又は障害は:呼吸器障害、炎症性障害、皮膚障害、及びアレルギー性障害から選択される。
さらなる実施態様において、TSLPによって媒介される疾患又は障害は:呼吸器障害(喘息など)、炎症性障害(炎症性関節炎及び好酸球性食道炎など)、皮膚障害(アトピー性皮膚炎及び湿疹など)、並びにアレルギー性障害から選択される。
なおさらなる実施態様において、TSLPによって媒介される疾患又は障害は:呼吸器障害(喘息及びCOPDなど)から選択される。
なおさらなる実施態様において、TSLPによって媒介される疾患又は障害は:喘息、炎症性関節炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、及び好酸球性食道炎から選択される。
なおさらなる実施態様において、TSLPによって媒介される疾患又は障害は、喘息である。
「予防」という用語への本明細書における言及は、疾患の誘導前の防御的な組成物の投与を含む。「抑制」は、誘導性事象の後であるが、疾患の臨床的出現の前の組成物の投与をいう。「治療」は、疾患症状が顕在化した後の防御的な組成物の投与を含む。
疾患からの防御又は疾患の治療におけるペプチドリガンドの有効性をスクリーニングするために使用することができる動物モデル系が利用可能である。動物モデル系の使用は、ヒト及び動物の標的と交差反応することができるポリペプチドリガンドの開発を可能にし、動物モデルの使用を可能にする本発明によって促進される。
本発明を、以下の実施例を参照して、以下でさらに説明する。
(実施例)
(略語)
Figure 2023520714000020
Figure 2023520714000021
Figure 2023520714000022
Figure 2023520714000023
(一般方法)
NMRスペクトルは、Bruker Avance、Avance II、又はAvance III分光計で300、400、500、又は600MHzのプロトン周波数で記録された。クロロホルム-δ(H 7.26ppm)、CD3OD(H 3.30ppm)、又はDMSO-d6(H 2.50ppm)の中央ピークを、内部参照として使用した。LCMS実験は、ESIモードのWaters Xevo Q-ToF Massと組み合わせたWaters Acquityシステムを用いて行った。LCは、2種類の設定:1)BEH C18カラム(1.7μm 2.1×50mm)と1.0mL/分の流速のpH 10の水性46mM炭酸アンモニウム/アンモニアバッファー(A)及びMeCN(B)のグラジエント(5分間で2％から95％のB)との組み合わせ、又はBEH C18カラム(1.7μm 2.1×50mm)と1.0mL/分の流速の水及びTFA(0.05％)(A)並びにCH3CN及びTFA(0.05％)(B)のグラジエント(2分で5％から95％のB)との組み合わせで実施された。HRMS(高分解能質量分析)は、エレクトロスプレーイオン化(ESI)を用いる高分解能(R＝9000fwhm)LCMSシステム(Waters Acquity-Xevo Q-ToF)で実施した。分取HPLCは、種々のカラムを用いて、統合されたMS検出を用いるWaters FractionLynxシステム又は統合されたUV検出を用いるGilson GX-281を用いて実施した。例としては、Waters Sunfire C18 OBD5μm 19mm×150mmもしくは30mm×150mm、XBridge BEH C18 OBD 5μm 19mm×150mmもしくは30mm×150mm、XSelect CSH C18 OBD 5μm 19mm×150mm、又はChromasil C8 10μm 20mm×250mmもしくは50mm×250mmカラムが挙げられる。
(材料及び方法)
(タンパク質試薬)
(ヒトTSLP及びTSLP受容体)
(クローニング)
TEVで切断可能なN末端の6×HNタグ、C末端のAviタグを有し、ネイティブシグナル配列がcd33シグナル配列と交換された完全長ヒトTSLPを、HEK細胞に対してコドン最適化し、Genscriptによって合成した。得られた構築体spCD33-6×HN-TEV-hTSLP(29-159)-Aviを、SacII及びNotI制限酵素部位を用いて、自家製のpEBNAZベクター(pDEST12.2誘導体)中にクローニングした。
(TSLP配列:
Figure 2023520714000024
 TEVで切断可能なN末端の6×HNタグを有し、ネイティブシグナル配列がIgKシグナル配列と交換された完全長ヒトTSLP受容体を、HEK細胞に対してコドン最適化し、Genscriptによって合成した。得られた構築体spCD33-6×HN-TEV-hTSLPR(25-231)を、SacII及びNotI制限酵素部位を用いて自家製のpEBNAZベクター(pDEST12.2誘導体)中にクローニングした。
TSLPR配列:
Figure 2023520714000025
(細胞培養及び一過性トランスフェクション)
標的であるspCD33-6×HN-TEV-hTSLP(29-159)をコードするトランスフェクショングレードのプラスミドを、Genscriptから入手した。Expi293F細胞を、無血清Expi293発現培地(Thermo Fisher Scientific)中で成長させ、25mmのオービタル振盪インキュベーター(Infors HT)内の三角フラスコ(Corning社)中で37℃、8％ CO2で維持した。トランスフェクションの1日前に、細胞を、Optimum Growth Flask(Thomson Instrument Company)中に2×10e6 c/mlで播種した。トランスフェクションの当日に、1.5μg/mlのDNA及び6μg/mlのPEI Max (Polysciences, Inc.)をExpi293発現培地中に別々に希釈し、次いで、混合し(1:4のDNA/PEI比)、15分間室温でインキュベーションした。得られたトランスフェクション複合体を、細胞培養に添加し、それに続き、37℃、8％ CO2でインキュベーションした。115rpm。トランスフェクションの24時間後に50％(v/v)Expi293発現培地を細胞に供給した。培養上清を、6日間のインキュベーション後に回収した。
(精製)
hTSLP及びhTSLPRを、5mMのイミダゾールの存在下でのExcel樹脂へのバッチ結合によって、培地から直接捕獲した。その後、樹脂を、小型のカラムに移し、20mMのトリスHCl pH 7.5、500mMのNaCl、及び20mMのイミダゾールを含有するバッファーで洗浄した。樹脂を、400mMイミダゾールを含有すること以外は同一のバッファー中で溶出させた。タンパク質を、20mMのトリス・HCl pH 7.5及び200mMのNaClを含有するバッファー中に脱塩した。さらに、TSLPを、TEV(1:1の化学量論で添加)で3時間10℃で処理し、それに続き、負の固定化金属アフィニティークロマトグラフィー(negative immobilized-metal affinity chromatography)を行った。
(ヒトIL7受容体アルファ)
ヒトIL7Rアルファ(His ＆ FCタグ)を、Sino Biologicalから購入した(カタログ番号:10975-H08H-100)。
(ペプチド合成)
直鎖状ペプチドは、以下のペプチド合成装置:Peptide Instruments製のSymphony、BiotageのBiotage Initiator+ Alstra and Syro II、及びCEMのLiberty Blueのうちの1つを用い、Fmoc化学に基づいて固相ペプチド合成(SPPS)によって合成した。担持量が約0.5mmol/gのBiotageのRink Amide Chemmatrix樹脂(100～200メッシュ)を、特に断りのない限り用いた。以下の側鎖保護基:Arg(Pbf)又はArg(Boc)2;Asn(Trt);Asp(OtBu);Cys(Trt);Glu(OtBu);Gln(Trt);His(Trt);Lys(Boc);Ser(tBu);Thr(tBu);Trp(Boc);及びTyr(tBu)を有する標準的なFmoc-アミノ酸を採用した。生成物の同定及び純度は、LCMS及びHRMSによって決定した。
別段の記載がない限り、全てのアミノ酸は、L-立体配置で用いられた。
非天然アミノ酸は、上述の一般方法を用いてペプチド配列中に組み込まれた。
本明細書で採用される非天然アミノ酸前駆体のリストを、表1にまとめる:
表1: 採用された非天然アミノ酸
Figure 2023520714000026
Figure 2023520714000027
Figure 2023520714000028
(プロトコール1: Symphony合成装置を用いる合成)
ペプチド合成は、Peptide Instruments製のSymphonyペプチド合成装置を用いて、Fmoc化学に基づくものとした。標準的なFmoc-アミノ酸(Sigma, Merck)を適切な側鎖保護基とともに利用し:適用可能な場合、標準的なカップリング条件を各々の場合に使用し、その後、標準的な方法論を用いて、脱保護を行った。HPLCを用いてペプチドを精製し、単離後、これを1,3,5-トリアクリロイルヘキサヒドロ-1,3,5-トリアジン(TATA、Sigma)で修飾した。このために、直鎖状ペプチドを50:50 MeCN:H2Oで約35mLまで希釈し、アセトニトリル中の約500μLの100mM TATAを添加し、5mLのH2O中1MのNH4HCO3で反応を開始させた。反応を室温で約30分から60分間進行させ、(MALDIにより判断して)反応が終了したら、凍結乾燥させた。終了したら、H2O中の1mLの1M L-システイン塩酸塩一水和物(Sigma)を、反応に室温で約60分間添加し、過剰のTATAをすべてクエンチした。凍結乾燥後、修飾されたペプチドを上記のように精製し、一方、Luna C8をGemini C18カラム(Phenomenex)と交換し、酸を0.1％トリフルオロ酢酸に変更した。正しいTATA修飾材料を含有する純粋な画分をプールし、凍結乾燥させ、保存のために20℃で保持した。
(プロトコール2: Biotage Initiator+ Alstra合成装置を用いる合成)
ペプチドを、Biotage Initiator+ Alstraで10又は30mLの反応バイアル中0.1～0.5mmolスケールで合成した。攪拌は、ボルテックス操作及び一時停止のサイクルで行った。反応を、マイクロ波シングルノード腔内で加熱した。アミノ酸及び試薬の溶液を、N2雰囲気下に保った。
典型的な手順を、以下に記載する。
DCM又はDMF(10mL反応器の場合4.5mL又は30mL反応器の場合9mL)中での樹脂の膨潤化後、反応器を空にした。樹脂(1当量)に、DMF中のFmoc-アミノ酸の溶液(0.1～0.3M、4当量)、DMF中のエチル シアノ(ヒドロキシイミノ)アセテート(オキシマ)の溶液(0.24M、4当量)、及びDMF中のN,N′-ジイソプロピルカルボジイミド(DIC)の溶液(1.0M、4当量)を順次添加した。反応を、75℃で5分間加熱した(45～50℃で20分間カップリングさせたFmoc-S-トリチル-システインのカップリングの場合を除く)。Fmoc-Arg-Pbfについては、カップリング工程を2回繰り返した。反応後、樹脂を、DMF(10mL反応器の場合4.5mL又は30mL反応器の場合9mL)で4回洗浄した。
Fmoc-groupの脱保護を、以下のように行った:洗浄した樹脂に、DMF(20％、10mL反応器の場合4.5mL又は30mL反応器の場合9mL)中のピペリジンの溶液を添加した。反応を、室温で3分間行った。溶媒を除去し、このプロセスを繰り返したが、反応は10分間行った。反応器を空にし、樹脂をDMF(10mL反応器の場合4.5mL又は30mL反応器の場合9mL)で4回洗浄した。所望のペプチド配列の調製後、典型的には、Fmoc基を切り取り、N末端をアセチル基で以下のようにキャッピングした:洗浄した樹脂に、DMF中の無水酢酸の溶液(5M、4当量)及びNMP中のDIPEAの溶液(2M、4当量)を添加した。10分間の反応後、樹脂をDMF(10mL反応器の場合4.5mL又は30mL反応器の場合9mL)で4回洗浄した。
切断前の最終の洗浄を、以下のように行った:洗浄した樹脂に、DCM(10mL反応器の場合4.5mL又は30mL反応器の場合9mL)を添加し、反応器を空にした。この手順を6回繰り返してから、樹脂を真空下で乾燥させ、冷凍庫の中で保管した。
(プロトコール3: Biotage SYRO II合成装置を用いる合成)
ペプチドを、Biotage SYRO II(自動パラレルペプチド合成装置)で10mLの反応バイアル中0.05又は0.1mmolのスケールで合成した。この合成装置を、N2雰囲気下室温で作動させ、攪拌は、ボルテックス操作のサイクルで行い、停止させた。樹脂の膨張化を、以下のようにDMF中で6回行った:樹脂にDMF(1.3mL)を添加し、それを、5分間撹拌してから、反応器を空にした。
アミノ酸のカップリングを、以下のように4倍モルの過剰で2回行った:洗浄した樹脂(1当量)に、DMF中のFmoc-アミノ酸の溶液(0.25M、4当量)、次いで、DMF中の1-[ビス(ジメチルアミノ)メチレン]-1H-1,2,3-トリアゾロ[4,5-b]ピリジニウム 3-オキシド ヘキサフルオロ-ホスフェート(HATU、0.24M、4当量)の溶液及びNMP中のDIPEAの溶液(1.0M、4当量)を順次添加した。40分間の反応後、樹脂を、DMF(2.1mL)で3回洗浄した。最後のアミノ酸のカップリングを除く各カップリング工程の後、Fmoc脱保護の前に、残っている未反応アミンを、以下のようにAc2Oでキャッピングした:洗浄した樹脂に、Ac2O/2,6-ルチジン/NMP(5/6/89 v/v、4当量)の溶液を添加した。10分の反応時間の後に、樹脂を、DMF(1.1mL)で3回洗浄した。
アミンのFmoc脱保護を、以下のように行った:洗浄した樹脂に、DMF中のピペリジンの溶液(40％、1.2mL)を添加した。反応を3分間行った。溶媒を空にし、追加のDMF中のピペリジン(40％、0.6mL)を添加し、それに続きDMF(0.6mL)を添加した。10分間の反応後、樹脂をDMF(1.3mL)で6回洗浄した。
最後のアミノ酸のカップリング後、Fmoc脱保護を行い、それに続き上述のようなアセチル化を行った。次いで、7回の溶媒での最終の洗浄を、以下のように行った:洗浄した樹脂に、溶媒(3mL)を添加した。1分間のボルテックス操作の後に、反応器を空にし、次の溶媒を添加した。用いた溶媒は、順に:DCM(2×)、MeOH、DCM、MeOH(2×)、及びEt2Oであった。合成の後に、樹脂を真空下で乾燥させ、冷凍庫の中で保管した。
(プロトコール4: CEM Liberty Blue合成装置)
ペプチドを、CEM Liberty Blue(自動マイクロ波ペプチド合成装置)で0.1又は0.25mmolスケールで合成した。攪拌は、混合物に窒素をバブリングさせることにより達成された。溶媒、アミノ酸の溶液、及び試薬は、N2雰囲気下に保たれた。反応を、N2雰囲気下マイクロ波シングルノード腔内で加熱した。
樹脂の膨張を、DMF中で以下のように行った:樹脂に、DMF(15mL)を添加し、混合物を5分間そのままとした後に、反応器を空にした。
アミノ酸のカップリングを、以下のように4倍モルの過剰で行った:洗浄した樹脂(1当量)に、DMF中のFmoc-アミノ酸の溶液(0.2M、4当量)、それに続き、DICの溶液(0.5M、4当量)、及びDMF中のオキシマ(1M、4当量)を順次添加した。反応を90℃で4分間加熱した。Fmoc-Arg-Pbfを、2回カップリングさせた。反応器を空にし、樹脂をDMF(7mL)で4回洗浄した。
アミンのFmoc脱保護を、以下のように行った:洗浄した樹脂に、DMF中のピペリジンの溶液(20％、10mL)を添加した。反応を、90℃で2分間加熱した。溶媒を空にし、追加のDMF中のピペリジン(20％、10mL)を添加した。反応を90℃でさらに2分間加熱した。反応器を空にし、樹脂をDMF(7mL)で4回洗浄した。
Nアセチル化が望まれる場合、以下の手順をFmoc脱保護後に行った:洗浄した樹脂に、DMF中のAc2Oの溶液(5M、4当量)及びDMF中のDIPEAの溶液(2M、10mL反応器の場合には2.5mL又は30mL反応器の場合には濃縮された4当量)を添加した。10分間の反応後、樹脂をDMF(10mL反応器の場合4.5mL又は30mL反応器の場合9mL)で4回洗浄した。
切断前の最終の洗浄を、以下のように行った:洗浄した樹脂に、DCM(10mL反応器の場合4.5mL又は30mL反応器の場合9mL)を添加し、反応器を空にした。この手順を6回繰り返してから、樹脂を真空下で乾燥させ、冷凍庫の中で保管した。
(プロトコール5:樹脂からのペプチドの切断）
樹脂からの直鎖状ペプチドの切断及び脱保護を、以下のように行った:トリフルオロ酢酸(TFA)/トリイソプロピルシラン(TIS)/3,6-ジオキサ-1,8-オクタンジチオール(DODT)/水(92.5/2.5/2.5/2.5、90/2.5/2.5/5、又は95/2.5/0/2.5vol/vol、5～20mL)の溶液を、乾燥させた樹脂に添加した。反応を室温で2～4時間ボルテックスした。樹脂を、濾過によって除去し、DCM(3×10mL)、MeOH(3×10mL)で洗浄し、再度DCM(3×10mL)で洗浄した。合わせた濾液の体積を、10～20mLまで減少させ、ペプチドを氷冷Et2O又はMTBE(20～40mL)で沈殿させた。混合物を遠心分離し、液体をデカンテーションで除去し、沈降物を冷エーテル中で再懸濁させ、再度遠心分離した。この沈殿プロセスを、さらに2回繰り返した。
ペプチドを真空下で乾燥させ又はMeCN及び水の混合物から凍結乾燥させ、冷凍庫の中で保管した。通常、直鎖状ペプチドは、さらに精製することなくTATA環化工程で用いられた。
濾液の体積を、真空下で約20mlまで減少させ、ヘプタン-MTBEの混合物1:1 v/v(100ml)を添加することによりペプチド沈殿させた。遠心分離後、液体をデカンテーションし、固体をヘプタン-MTBEの混合物中に再懸濁させ、再度遠心機にかけた。全プロセスをもう一度繰り返した。
(プロトコール6: TATAを用いる直鎖状ペプチドの環化)
1,3,5-トリアクリロイル-1,3,5-トリアジナン(TATA、1当量)をMeCN(2～4mL)に溶解させ、水性NH4HCO3バッファー(0.06M、pH 7.9、10～20mL)を、MeCN(8～16mL)及び水(10～20mL)の混合物中の粗体直鎖状ペプチド(10～200mg)の溶液に添加した。反応を、室温で2～24時間撹拌し、LCMSによってモニタリングした。通常、反応を、HCO2H(0.5～2mL)でクエンチしたが、この工程は、省くこともできたであろう。それに続き、混合物を濾過し、濾液を凍結乾燥し、得られた粗生成物をRP-HPLCによって精製した。精製後、該当する画分をプールし、凍結乾燥して、所望の生成物を得た。
いくつかのアミノ酸が、以下に示されるように調製されている。
(中間体1: 4-クロロ-N-{[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}-3-フルオロ-L-フェニルアラニン)
Figure 2023520714000029
 (工程1: メチル 4-クロロ-N-{[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}-3-フルオロ-L-フェニルアラニナート)
Figure 2023520714000030
 Ross、A. J.、Lang、L. H.及びJackson、R. F. W.の文献(J. Org. Chem. 2010、75、245-248)に記載されている手順に従った。亜鉛粉末(1.2g,18.35mmol)を、10％ HCl中で20秒間活性化させ、脱ミネラル水(deminineralized water)及びメタノールで洗浄し、高真空中で12時間にわたり乾燥させた。活性化させた亜鉛を、無水DMF(25ml)中に懸濁させた。ヨウ素(30mg、0.12mmol)を添加し、生じた混合物を、ヨウ素の褐色が消失するまで撹拌した。その後、DMF(25ml)中のメチル N-{[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}-3-ヨード-L-アラニナート(Sigma Aldrich、2.5g、5.54mmol)を添加し、それに続き、ヨウ素(30mg)を添加した。混合物を、90分間撹拌し、次いで、Pd2(dba)3(22.9mg、0.025mmol)及びS-Phos(19.4mg、0.05mmol)を、無水のDMF(5ml)中で混合し、混合物を窒素でバブリングしながら5分間撹拌した。得られた溶液を、有機亜鉛試薬に添加し、それに続き、4-クロロ-3-フルオロ-1-ブロモベンゼン(1.563g、6.09mmol)を添加した。混合物を1晩室温で撹拌した。反応混合物を、シリカゲル(10g SiO2)のパッドに通し、TBMEで溶出させ、濾液を減圧下でエバポレートした。残渣を、Biotage Auto flashシステム(溶離液:ヘプタン-EtOAc 0～50％)を用いるシリカゲルでのクロマトグラフィーによって精製した。生成物を含有する画分をエバポレートして、表題化合物を琥珀色の固体として得た(1.81g、72％)。LCMS ES+ m/z＝454、456 [M+H]+。
Figure 2023520714000031
(工程2: 4-クロロ-N-{[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}-3-フルオロ-L-フェニルアラニン)
工程1のメチルエステル(1.80g、3.96mmol)を、ジオキサン(20ml)に溶解させ、混合物を、氷浴中で0℃まで冷却し、次いで、水(10ml)に溶解させたLiOH(0.211g、8.77mmol)の溶液を滴下した。生じた混合物を、0℃で30分間撹拌し、1N HClで酸性化し、EtOAcで抽出した(3回)。有機相を、MgSO4で乾燥させ、減圧下でエバポレートすると、表題化合物がオイルとして残り、これをさらに精製することなく用いた(1.51g、78％)。LCMS ES- m/z＝438、440 [M-H]-。
Figure 2023520714000032
中間体2、3、及び4を、中間体1に対して記載した手順に従い調製した。
(中間体2:(2S)-3-(4-クロロナフタレン-1-イル)-2-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)プロパン酸)
Figure 2023520714000033
 (工程1: メチル (2S)-3-(4-クロロナフタレン-1-イル)-2-({[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}アミノ)プロパノエート)
Figure 2023520714000034
 スケール:5.56mmolのヨード-L-アラニナート;収量:2.11g、78％。LCMS ES- m/z＝486、488 [M+H]+。
(工程2:(S)-2-((((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)アミノ)-3-(4-クロロナフタレン-1-イル)プロパン酸)
収量:1.11g、54％。LCMS ES- m/z＝470、472 [M-H]-。
Figure 2023520714000035
(中間体3: 4-クロロ-N-{[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}-3,5-ジフルオロ-L-フェニルアラニン)
Figure 2023520714000036
 (工程1: メチル 4-クロロ-N-{[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}-3,5-ジフルオロ-L-フェニルアラニナート)
Figure 2023520714000037
 スケール:2g、4.43mmolのヨード-L-アラニナート;収量:0.8g、38％。LCMS ES+ m/z＝494、496 [M+Na]+。
(工程2: 4-クロロ-N-{[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}-3,5-ジフルオロ-L-フェニルアラニン)
スケール:1.4g、2.97mmol;収量:500mg、36.8％。LCMS ES- m/z＝456、458 [M-H]-。
Figure 2023520714000038
(中間体4: 3-クロロ-N-{[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}-4-フルオロ-L-フェニルアラニン)
Figure 2023520714000039
 (工程1: メチル 3-クロロ-N-{[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}-4-フルオロ-L-フェニルアラニナート)
Figure 2023520714000040
 スケール:24g、(53.18mmol)のヨード-L-アラニナート;4バッチの収量、各6g;合計収量:16.0g、66％。LCMS ES+ m/z＝476、478 [M+Na]+。
Figure 2023520714000041
(工程2: 3-クロロ-N-{[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}-4-フルオロ-L-フェニルアラニン)
スケール:17.1g、37.67mmolのヨード-L-アラニナート;収量:3.0g、18％。LCMS ES- m/z＝438、440 [M-H]-。
Figure 2023520714000042
(中間体5: 3-アセトアミド-4-クロロ-N-{[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}-L-フェニルアラニン)
Figure 2023520714000043
 (工程1: メチル 3-アミノ-4-クロロ-N-{[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}-L-フェニルアラニナート)
Figure 2023520714000044
 表題化合物を、0.10～2.52g(0.22～5.58mmol)のヨード-L-アラニナート及び0.549～1.38g(0.27～6.70mmol)の5-ブロモ-2-クロロアニリンから、工程1で中間体1について記載したように調製した。収量:0.073～0.52g、21～73％。LCMS ES+ m/z＝451、453 [M+H]+。
Figure 2023520714000045
(工程2: メチル 3-アセトアミド-4-クロロ-N-{[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}-L-フェニルアラニナート)
Figure 2023520714000046
 無水酢酸(0.105mL、1.12mmol)を、DCM(3mL)中の前述の生成物(300mg、0.56mmol)及びTEA(0.234mL、1.68mmol)の撹拌溶液に滴下し、氷浴上で0℃まで冷却した。生じた混合物を、室温で1晩撹拌した。反応を、DCMで希釈し、飽和NaHCO3で洗浄し、フェーズセパレーターを通して乾燥させ、減圧下濃縮した。残渣を、Biotage(登録商標) KP-SIL 25gカラムでの自動フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。移動相として、ヘプタン中6％から55％までのEtOAcのグラジエントを10カラム体積(CV)にわたって使用し、次いで、55％ EtOAcを5CVにわたって使用した。所望の画分をプールし、濃縮して、表題化合物(177mg、64％)を黄色固体として得た。LCMS ES+ m/z＝493、495 [M+H]+。
Figure 2023520714000047
(工程3: 3-アセトアミド-4-クロロ-N-{[(9H-フルオレン-9-イル)メトキシ]カルボニル}-L-フェニルアラニン)
前述の化合物(137mg、0.28mmol)を、ジオキサン(1.60mL)に溶解させた。得られた溶液を、氷浴を用いて冷却し、次いで、水(0.8mL)に溶解させたLiOH(13.31mg、0.56mmol)を滴下し、生じた混合物を0℃で撹拌した。35分後のLCMS分析は、完全な反応を示す。反応混合物を、HCl(1M)で酸性化した。沈殿が生じ、それを、濾過によって単離し、水で洗浄し、真空下50℃で一晩乾燥した。表題化合物(87mg、65％)を、さらに精製することなく使用した。LCMS ES+ m/z＝479、481 [M+H]+。
Figure 2023520714000048
(N末端のアセテート又は遊離アミノ基を有する5×4の二環の調製)
(実施例129の調製)
Figure 2023520714000049
 (工程1: Cys-His-Trp-Leu-Glu-Asn-Cys-Trp-Arg-Gly-Phe-Cys-NH2の調製)
樹脂に結合させた保護されたペプチドを、プロトコール2で記載されているが、最終のアセチル化工程を省略した手順により30mLの反応バイアル中でBiotage Initiator+ Alstraで0.25mmolスケールで調製した。樹脂の膨潤化を、DCM中室温で30分間行った。最後のアミノ酸のカップリング及び脱保護後、0.08mmolのペプチドに相当する量の樹脂を、10mLのTFA/TIS/フェノール/H2Oの混合物(10mL、88:2:5:5)で2時間処理した。粗生成物を、分取HPLC(カラム:Chromasil C8 10μm 250×20mm。移動相:A-H2O/MeCN/TFA 95/5/0.1及びB-MeCN;グラジエント:5分で5％から27％のB、次いで、25分で27％から32％のB;流速19mL/分)によって精製して、直鎖状ペプチド(55mg、44％)を得た。LCMS (Acquity CSH C18 1.7μm、pH 3、保持時間1.10分、4分で10％のMeCNから90％のMeCN):ES+ m/z＝776.1 [M+2H]2+、純度100％。
(工程2: TATA環化)
前述の直鎖状ペプチド(55mg、0.03mmol)を、TATA環化手順に従いTATAを用いて1.5時間環化させた。該ペプチドを、分取HPLC カラム: Waters Atlantis T3 ODB 5μm 150×19mm;移動相: A-H2O/TFA 100/0.15及びB-MeCN;グラジエント:1分間5％のB、3分で5％から22％のB、15分で22％から27％のB;流速30mL/分、室温、検出220nm、注入体積2mL、試料濃度10mg/mL)によって精製して、表題化合物(11mg、17％)を得た。HRMS: (C81H108N24O18S3 +2H)2+についての計算値901.3796;実測値(ESI [M+2H]2+)901.3743、純度97％。
(実施例252の調製)
Figure 2023520714000050
 (工程1:C-(NMe-Ala)-(1-ナフチル-Ala)-(tBu-Ala)-Q-D-C-(NMe-Trp)-(ジメチル-Arg)-G-(4-F-Phe)-C-a-NH2の調製)
直鎖状ペプチドを、実施例1に記載した手順に従い調製した。スケール:730mgのRinkアミド樹脂(0.35mmol、0.48mmol/g)。樹脂からの切断及び脱保護を、TFA(20mL)、水(1.5mL)、TIS(0.8mL)、および0.8ml DODT(0.8mL)の混合物を用いて4時間かけて行った。樹脂を濾過して取り除き、DCM(3×10ml)及びMeOH(3×10ml)で洗浄した。濾液を、20ml前後まで真空下で減容させ、ペプチドを、ヘプタン-MTBE 1:1 v/v (100ml)の混合物を添加することにより沈殿させた。遠心分離後、液体をデカンテーションで除去し、沈降物を、ヘプタン-MTBEの混合物中に再懸濁させ、再び遠心分離した。残渣を、MeCN-水 1:1(約100ml)の混合物に溶解させ、凍結乾燥させて、直鎖状ペプチド(463mg、80％)を得た。LCMS (Acquity CSH C18 1.7μm、pH 3、保持時間1.10分、4分で10％から90％のMeCN): ES+ m/z＝830.3 [M+2H]2+、純度82％。
(工程2: TATA環化)
前述の直鎖状ペプチド(463mg、0.28mmol)を、窒素雰囲気下でMeCN(95ml)、水(100ml)、及び60mM NH4HCO3バッファー(60mM、100ml)の混合物に溶解させた。MeCN(5ml)に溶解させたTATA(69.7mg、0.28mmol)を、約3分かけて分割添加した。生じた混合物を、室温で1時間撹拌し、ギ酸(4ml)で酸性化し、凍結乾燥した。残渣を、分取RP-LC(カラム: Chromasil C-18 5×100 cm、移動相: A-H2O/TFA(0.2％ TFA)及びB-MeCN;グラジエント:30分で10％から60％のB、流速100ml/分.)にかけて、表題化合物(99mg、17％)を得た。HRMS:(C88H121FN22O19S3 +2H)2+についての計算値953.4240;実測値(ESI [M+2H]2+) 953.4250、純度90％。
(実施例76の調製)
Figure 2023520714000051
 プロトコール1に記載した方法によって調製した。
HRMS:(C87H118N26O20S3 +2H)2+についての計算値947.8953;実測値(ESI [M+2H]2+) 947.8984、純度82％。
(実施例5の調製:)
Figure 2023520714000052
 (工程1: Ac-Cys-(NMe-Ala)-(NMe-Trp)-(tBu-Ala)-Gln-Asp-Cys-(NMe-Trp)-(ジメチル-Arg)-Gly-(4-F-Phe)-Cys-NH2の調製)
プロトコール2及び実施例129に記載されている手順に従い、直鎖状ペプチドを、0.2mmolスケールでBiotage Initiator+ Alstraで調製して、215mg(66％)を得た。LCMS (Acquity CSH C18 1.7μm、pH 3、保持時間6.02分、10分で20％から60％のMeCN): ES+ 819.3 [M+2H]2+。
(工程2:TATA環化)
プロトコール2及び実施例129に記載されている手順に従い、直鎖状ペプチドを環化させて、分取HPLC(カラム: Waters Atlantis T3 ODB 5μm 150×19mm;移動相: A-H2O/TFA 100/0.15及びB-MeCN;グラジエント: 0.5分間5％のB、1.5分で5％から33％のB、14分で33％から38％のB;流速30mL/分、室温、検出230nm)による精製後に、表題化合物(29mg、19％)を得た。HRMS: (C86H119FN22O19S3 +2H)2+についての計算値940.4162;実測値(ESI [M+2H]2+) 940.4159、純度93％。
(アセテート以外のN末端修飾)
(実施例84の調製)
Figure 2023520714000053
 (工程1: Piv-Cys-His-Trp-Leu-Glu-Asn-Cys-Trp-Arg-Gly-Phe-Cys-NH2の調製)
Fmoc保護ペプチドを、プロトコール2で記載した手順により30mL反応バイアル中で0.25mmolスケールでBiotage Initiator+ Alstraで調製した。樹脂の膨潤化を、DCMを用いて室温で20分間行った。中間体のポリマーに結合した生成物を、冷凍庫内に保存し、0.123mmolのペプチドに相当する量を用いて、Biotage Initiator+ AlstraでN末端基を導入した。膨潤化及びFmoc脱保護の後に、樹脂を、ピバル酸(0.3M、6当量)、DIC(0.5M、6当量)、及びオキシマ(0.5M、6当量)と75℃で5分間カップリングさせた。脱保護及び切断は、振盪機上で樹脂を10mLのTFA/TIS/H2O(92.5:2.5:2)で3時間処理することにより達成された。TFAを蒸発させ、冷Et2Oを用いて析出させ、遠心分離し、真空下乾燥させて、表題化合物を無色固体として得た(108mg、54％)。LCMS (Acquity CSH、C18 1.7μm、pH 3、保持時間2.27分、4分で10％から90％のMeCN): ES+ m/z＝819.3 [M+2H]2+-;純度73％。
(工程2: TATAを用いる環化)
前述のペプチド(108mg、0.07mmol)を、TATA(16mg、0.07mmol)を用いてTATA環化手順に従い2時間環化させた。粗生成物を、分取HPLC(カラム: Waters Atlantis T3 ODB 5μm 150×19mm. 移動相: A-H2O/TFA 100/0.15及びB-MeCN;グラジエント:1分間5％のB、3分で5％から23％のB、15分で23％から28％のB;流速30mL/分、室温、検出230nm、注入体積0.6mL、試料濃度50mg/mL)によって精製して、表題化合物を無色固体として得た(14mg、11％)。HRMS:(C86H116N24O19S3 +2H)2+についての計算値943.4083;実測値(ESI [M+2H]2+) 943.3998、純度96％。
(実施例93の調製)
Figure 2023520714000054
 (工程1: Bn-Cys-His-Trp-Leu-Glu-Asn-Cys-Trp-Arg-Gly-Phe-Cys-NH2の調製)
樹脂に結合させた保護されたペプチドを、最終のアセチル化工程を省略してプロトコール2に従い、Biotage Initiator+ Alstraで30mLの反応バイアル中で0.25mmolのスケールで調製して、遊離N末端アミノ基を有する中間体を得た。0.1mmolのペプチドに相当する量の樹脂を用いて、ベンジル基を導入した。樹脂の膨潤化及び濾過後、DCM(10mL)を添加し、それに続き、ベンズアルデヒド(0.104mL、1.00mmol)及びトリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム(0.218g、1.00mmol)を添加した。バイアルを密閉し、室温で15時間振盪した。得られた樹脂を、MeOH(3×)及びDCM(3×)で洗浄し、次いで、真空下室温で2時間乾燥させた。脱保護及び切断は、混合物を窒素バブリングしながら、樹脂を2時間20mLのTFA/TIS/フェノール(w/v)/ H2O 88:2:5:5)で処理することにより達成された。TFAを蒸発させ、冷Et2Oで析出させ、遠心分離し、真空下乾燥させた後に、表題化合物を、無色固体(127mg、77％)として得た。LCMS (Acquity CSH、C18 1.7μm、pH 3、保持時間5.19分、10分で3％から60％のMeCN): ES+ m/z＝822.2 [M+2H]2+、純度75％。
(工程2: TATAを用いる環化)
前述のペプチド(127mg、0.06mmol)を、TATA環化手順に従いTATAを用いて2時間環化させた。粗生成物を、分取HPLC(カラム: XBridge 5μm 150×19mm;移動相: A-H2O/MeCN/NH3 95/5/0.2及びB-MeCN;グラジエント:1分間5％のB、3分で5％から28％のB、15分で28％から33％のB;流速30mL/分、室温、検出230nm)によって精製して、表題化合物(14mg、13％)を得た。HRMS: (C88H114N24O18S3 +2H)2+についての計算値946.4031;実測値(ESI [M+2H]2+) 946.3397、純度93％。
表2の化合物を、実施例84及び93に関して上述した手順により調製した。
表2: N末端修飾された5×4の二環
RCys-His-Trp-Leu-Glu-Asn-Cys-Trp-Arg-Gly-Phe-Cys-NH2
Figure 2023520714000055
(実施例15の調製)
Figure 2023520714000056
 (工程1: n-オクタノイル-Cys-NMeAla-1MeW-Ala(tBu)-Gln-Asp-Cys-1MeW-ADMA-Gly-4Fphe-Cys-NH2の調製)
Fmoc保護ペプチドを、0.2mmolのスケールでBiotage Initiator+ Alstraで30mLの反応バイアル中でプロトコール2に従い調製した。樹脂の膨潤化を、DMF中70℃で20分間行った。中間体のポリマーに結合した生成物を、冷凍庫内に保存した。このうち、0.1mmolのペプチドに相当する量を取り出した。N末端基の導入を、CEM Liberty Blueで以下のように行った:膨潤化及びFmoc脱保護の後に、樹脂を、オクタン酸(58mg、4当量)、DIC、及びオキシマと90℃で4分間カップリングさせた。ペプチドを脱保護し、TFA/TIS/H2O 92.5:2.5:2.5の混合物を10mL用いて、振盪機上で3時間かけて樹脂から切断した。得られた表題化合物(110mg、64％)は、無色固体であることが認められ、それを、次の工程でそのまま用いた。LCMS (Acquity CSH C18 1.7μm、pH 3、保持時間8.73分、10分で20％から60％のMeCN): ES+ m/z＝858.4、[M+2H]2+、純度71％。
(工程2: TATAを用いる環化)
前述の化合物(110mg、0.05mmol)を、TATA環化手順に従いTATAを用いて3時間かけて環化させた。ペプチドを、分取HPLC(カラム:Waters XSelect CSHフルオロフェニル 5μm 150×19mm;移動相: A-H2O/TFA 100/0.15及びB-MeCN;グラジエント: 0.5分間5％のB、1.5分で5％から35％のB、14分で35％から40％のB.流速30mL/分、室温)によって精製し、凍結乾燥後に表題化合物(13mg、14％)を得た。HRMS: (C92H131FN22O19S3 +2H)2+についての計算値946.4031;実測値(ESI [M+2H]2+) 946.3397、純度93％。
表3の化合物を、実施例15に記載した手順により調製した。
表3: N末端修飾された5×4の二環
R-C-Q-(NMe-Trp)-(tBu-Ala)-E-D-C-(NMe-Trp)-(ジメチル-Arg)-G-(4-F-Phe)-C-NH2
Figure 2023520714000057
 (5×4の二環のC末端修飾)
(実施例96の調製)
Figure 2023520714000058
 (工程1: 樹脂の調製)
Figure 2023520714000059
 4-((4-フェニル)メトキシ)-2,6-ジメトキシベンズアルデヒドポリスチレン樹脂(1g、1gあたり1～1.5mmolの担持、ABCR(登録商標))を、ジクロロエタン(10ml)中で20分間膨潤させ、次いで、2-フェニルエタン-1-アミン(0.485g、4.00mmol)を10mlのジクロロエタン中に添加し、生じた混合物を30分振盪した。ナトリウムトリアセトキシボロヒドリド(1.696g、8.00mmol)を、混合物に添加し、振盪を1晩継続した。樹脂を、濾過によって単離し、DCM(3×10ml)、MeOH+5％ TEAを含有(5×10ml)、及びMeOH(3×10ml)で洗浄し、最後に真空下で乾燥させた。
(工程2: Fmoc-Cys(Tr)の担持)
Figure 2023520714000060
 N-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-S-トリチル-L-システイン(3.51g、6.0mmol)を、無水DCM(50ml)に溶解させた。DIPEA(1.1ml、6.30mmol)及びフルオロ-N,N,N',N'-テトラメチルホルムアミジニウムヘキサフルオロホスフェート(1.6g、6.06mmol)を添加し、混合物を窒素下で3時間撹拌し、対応するアミノ酸フルオリドを生成させた。この混合物に、工程1で調製した樹脂(1.2g、約1.5mmolに対応)を添加し、それに続きDIPEA(1.1ml、6.3mmol)を添加した。混合物を160分振盪し、次いで、樹脂を濾過によって単離し、DCM(2×20ml)、MeOH(5×20ml)、及びDCM(3×20ml)で洗浄した。真空下での乾燥後、52mgの樹脂を、TES(0.1mL)を含有するTFA(1ml)で1時間処理した。樹脂を濾過し、DCM(3×1ml)及びMeOH(3×1ml)で洗浄すると、濾液が得られ、それを乾固するまで蒸発させて、粗生成物であるFmoc-システインフェニルエチルアミドを得た(14mg、Mw＝446.6Da;樹脂担持量計算値0.6mmol/g)。LCMS ES+ m/z＝447.5 [M+H]+。
(工程3:Ac-Cys-His-Trp-Leu-Glu-Asn-Cys-Trp-Arg-Gly-Phe-Cys-NHCH2CH2Phの調製)
前述の樹脂(0.7g、0.42mmol)を、プロトコール2に従いBiotage Initiator+ Alstraで30mLの反応バイアル中で用いて、表題化合物を合成した。樹脂からの切断後、199mg(17％)の無色粉末を得て、それを、さらに精製することなく用いた。LCMS (Acquity CSH、C18 1.7μm、pH 3、保持時間2.09分、4分で20％から60％のMeCN)。ES+ m/z＝850.1 [M+2H]2+、純度47％。
(工程4: TATAを用いる環化)
前述のペプチド(85mg、0.05mmol)を、TATA環化手順に従いTATAを用いて2時間かけて環化させた。粗生成物を、分取HPLC(カラム: XBridge 5μm、150×19mm;移動相: A-H2O/MeCN/NH3 95/5/0.2及びB-MeCN;グラジエント:0.5分間5％のB、1.5分で5％から29％のB、14分で29％から34％のB;流速30mL/分、室温、検出230nm)によって精製して、表題化合物(6mg、6％)を得た。HRMS: (C91H118N24O19S3 +2H)2+についての計算値974.4162;実測値(ESI [M+2H]2+) 974.4167、純度97％。
(クロロトリチル樹脂を用いる実施例123の調製)
Figure 2023520714000061
 (工程1: 9H-フルオレン-9-イルメチル N-[(1R)-2-オキソ-2-(ペンチルアミノ)-1-(トリチルスルファニルメチル)エチル] カルバメート)
Figure 2023520714000062
 N-(((9H-フルオレン-9-イル)メトキシ)カルボニル)-S-トリチル-L-システイン(3g、5.12mmol)を、無水DCM(50ml)に溶解させた。DIPEA(0.984mL、5.63mmol)及びフルオロ-N,N,N',N'-テトラメチルホルムアミジニウム ヘキサフルオロホスフェート(1.488g、5.63mmol)を添加し、混合物を1時間室温で撹拌した。その後、DIPEA(0.984mL、5.63mmol)及びペンタン-1-アミン(0.66mL、5.63mmol)を添加し、生じた混合物を1時間室温で撹拌した。反応混合物を、DCM(50ml)で希釈し、5％クエン酸(25ml)で洗浄した。相を分離し、水相を、DCMで再抽出し、合わせた有機相をMgSO4で乾燥させた。蒸発させると、表題化合物(3.21g、96％)が得られ、これをさらに精製することなく用いた。
(工程2: 9H-フルオレン-9-イルメチル N-[(1R)-2-オキソ-2-(ペンチルアミノ)-1-(スルファニルメチル)エチル] カルバメート)
Figure 2023520714000063
 工程1の化合物(3.21g、4.9mmol)を、TES(1.1ml)を含有するDCM中50％のTFA溶液(20ml)で2時間処理した。揮発性物質を真空下除去し、残ったオイルを、Biotage(登録商標) KP-SILでのフラッシュクロマトグラフィー(340gカラム、ヘプタン-EtOAc 0-60％)によって精製した。所望の生成物を含有する画分をプールし、蒸発させて、表題化合物を泡状物(1.69g、84％)として得た。LCMS ES+ m/z＝413.6 [M+H]+。
Figure 2023520714000064
(工程3: 樹脂の調製)
Figure 2023520714000065
 前述の化合物(1.69g、4.1mmol)を、無水DCM(30mL)に溶解させ、塩化クロロトリチル樹脂(Novabiochem(登録商標)、1g、1.9mmol/g)及びTEA(0.7ml)を添加し、混合物を1晩室温で振盪した。樹脂を、DCM(3×20ml)、MeOH(3×20ml)、及び再度DCM(3×20mL)で洗浄し、真空下で乾燥させた。41mgの樹脂を、TES(0.1mL)を含有するTFA(1ml)で1時間処理した。樹脂を濾過し、DCM(3×1ml)及びMeOH(3×1ml)で洗浄すると、濾液が得られ、それを、乾固するまで蒸発させて、約0.50mmol/gの樹脂担持量に対応する、8.1mgの9H-フルオレン-9-イルメチル N-[(1R)-2-オキソ-2-(ペンチルアミノ)-1-(スルファニルメチル)エチル] カルバメートを得た。
(工程4: Ac-Cys-His-Trp-Leu-Glu-Asn-Cys-Trp-Arg-Gly-Phe-Cys-NH(CH2)4CH3の調製)
前述の樹脂(1.0g、0.5mmol)を、プロトコール2に従いBiotage Initiator+ Alstraで30mLの反応バイアル中で用いて、表題化合物を合成した。樹脂からの切断後、直鎖状ペプチド(312mg,37％)を得て、これをさらに精製することなく用いた。LCMS (Acquity CSH、C18 1.7μm、pH 3、保持時間2.06分、4分で20％から60％のMeCN): ES+ m/z＝833.1 [M+2H]2+、純度68％。
(工程5: TATAを用いる環化)
前述のペプチド(103mg、0.06mmol)を、TATA環化手順に従いTATAを用いて2時間かけて環化させた。粗生成物を、分取HPLC(カラム: XBridge 5μm、150×19mm;移動相: A-H2O/TFA 95/5及びB-MeCN;グラジエント:0.5分間5％のB、1.5分で5％から29％のB、14分で29％から34％のB;流速30mL/分、室温、検出230nm)によって精製して、表題化合物を無色固体(19mg、15％)として得た。HRMS:(C88H120N24O19S3 +2H)2+についての計算値957.4240;実測値(ESI [M+2H]2+) 957.4255、純度95％。
表4のペプチドを、実施例96及び123に関して記載したものと類似の手順を用いて合成した。
表4: C末端修飾された5×4の二環
AcCHWLENCWRGFC-NHZ
Figure 2023520714000066
(5×4の二環式ペプチドの多量体化)
(実施例250の調製)
Figure 2023520714000067
 (工程1: エチル N2,N6-ジペンタ-4-インオイル-L-リジネート)
Figure 2023520714000068
 エチル L-リジネート二塩酸塩(650mg、2.63mmol)の懸濁液に、DCM(25mL)中のHATU(2.5g、6.57mmol)、ペンタ-4-イン酸(645mg、6.57mmol)、及びEt3N(1.823mL、13.15mmol)を添加した。反応を室温で1晩撹拌した。反応を、水性NaHCO3(8％、25mL)でクエンチし、水相をDCM(3×25mL)で抽出した。有機相をプールし、H3PO4(1M、25mL)及びブライン(25mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、蒸発させた。残渣を、Biotage(登録商標) KP-SIL 50gカラムでの自動フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。10CVにわたるヘプタン中の40％から100％のEtOAcのグラジエントを、移動相として使用して、不純物をいくらか含有する表題化合物(1.05g、119％)を、無色オイルとして得た。それは、静置するとゆっくりと固体化した。
Figure 2023520714000069
(工程2: N2,N6-ジペンタ-4-インオイル-L-リジン)
Figure 2023520714000070
 NaOH(aq)(4.0M、1.314mL、5.26mmol)を、1,4-ジオキサン(10mL)/水(10mL)中のエチル N2,N6-ジペンタ-4-インオイル-L-リジネート(879mg、2.63mmol)の溶液に添加した。反応を4.5時間室温で撹拌した。その後、H2O(30mL)を添加し、水相を、Et2O(2×25mL)で洗浄した。水相を、H3PO4でpH 1まで酸性化し、いくらかのNaClを、それに添加し、DCM(8×20mL)で抽出した。有機相をプールし、乾燥させ(Na2SO4)、濾過し、蒸発させて、表題化合物(618mg、77％)を無色オイルとして得た。
Figure 2023520714000071
(工程3: N-ブタ-3-イン-1-イル-N2,N6-ジペンタ-4-インオイル-L-リシンアミド)
Figure 2023520714000072
 HATU(920mg、2.42mmol)を、DMF及びDCM(5及び10mL)の混合物中のN2,N6-ジペンタ-4-インオイル-L-リジン(618mg、2.02mmol)、ブタ-3-イン-1-アミニウムクロリド(319mg、3.03mmol)、及びEt3N(0.559mL、4.03mmol)の懸濁液に添加した。反応を室温で18時間撹拌した。反応を、Na2CO3(10％、25mL)の水溶液でクエンチし、水相をDCM(3×25mL)で抽出した。有機相をプールし、水性H3PO4(1M、25mL)で洗浄し、乾燥させ(MgSO4)、濾過し、蒸発させた。 残渣を、Biotage(登録商標) KP-SIL 50gカラムでの自動フラッシュクロマトグラフィーによって精製した。10CVにわたるEtOAc中0％から10％のMeOHのグラジエントを、移動相として使用して、表題化合物(799mg、111％)を得て、これをさらに精製することなく用いた。小量の試料をRP-HPLCによって精製して、分光学的データを得た。LCMS ES+ m/z＝358.2 [M+H]+。
Figure 2023520714000073
(工程4: 直鎖状ペプチド N3CH2C(O)NH(CH2CH2O)3CH2CH2(CO)-Cys-NMeAla-1MeW-Ala(tBu)-Gln-Asp-Cys-1MeW-ADMA-Gly-4Fphe-Cys-NH2の調製)
ペプチドを、プロトコール2に従い0.2mmolスケールでBiotage Initiator+ Alstraにおいて30mLの反応バイアル中で調製した。樹脂の膨潤化を、DMF中70℃で20分間行った。最後2回のカップリング(Fmoc-NH-PEG3-CH2CH2COOHそれに続きN3CH2COOH)は、室温で60分行った。2時間にわたる20mLのTFA/TIS/DODT/H2O 92.5:2.5:2.5:2.5の混合物を用いる樹脂からの切断後、表題化合物(263mg、70％)を、無色固体として得て、さらに精製することなく用いた。また、白色固体であることが認められた。LCMS (Acquity CSH C18 1.7μm、pH 3、保持時間6.32分、10分で20％から60％のMeCN): ES+ m/z＝938.4 [M+2H]2+、純度82％。
(工程5: TATA環化)
Figure 2023520714000074
 前述の直鎖状ペプチド(263mg、0.12mmol)を、TATA環化手順に従いTATAを用いて2日間かけて環化させた。ペプチドを、分取HPLC(カラム: Waters Atlantis T3 ODB 5μm 150×19mm;移動相: A-H2O/TFA 100/0.15及びB-MeCN;グラジエント: 0.5分間5％のB、1.5分で5％から34％のB、14分で34％から39％のB;流速30mL/分、室温、検出230nm、注入体積1mL)によって精製して、表題化合物(30mg、12％)を得た。HRMS: (C95H135FN26O23S3 +2H)2+についての計算値1062.4747;実測値(ESI [M+2H]2+) 1062.4716、純度98％。
(工程6: 実施例250の調製)
Figure 2023520714000075
 (+)-L-アスコルビン酸ナトリウム(4.7mg、0.02mmol)を、N2雰囲気下、t-BuOH(5mL)/H2O(10mL)中の前述の化合物(25mg、0.01mmol)、N-ブタ-3-イン-1-イル-N2,N6-ジペンタ-4-インオイル-L-リシンアミド(2.103mg、5.88μmol)、及びCuSO4・5H2O(5.88mg、0.02mmol)の溶液に添加した。溶液は乳濁した。4時間後、反応を、水性Na2CO3(10％、0.050mL、0.05mmol)でクエンチし、濾過した。濾液を凍結乾燥し、残渣を分取RP-HPLC(カラム: Waters XSelect CSH C18 ODB 5μm 150×19mm;移動相: A-H2O/TFA 100/0.15及びB-MeCN;グラジエント: 0.5分間5％のB、1.5分で5％から36％のB、14分で36％から41％のB;流速30mL/分、室温、検出230nm)によって精製して、表題化合物(6.8mg、9％)を得た。HRMS: (C305H432F3N81O72S9 +4H)4+についての計算値1682.5096;実測値(ESI [M+4H]4+) 1682.5154、純度97％。
(実施例251の調製)
Figure 2023520714000076
 (工程1: N3CH2C(O)NH(CH2CH2O)2CH2C(O)-Cys-NMeAla-1MeW-Ala(tBu)-Gln-Asp-Cys-1MeW-ADMA-Gly-4Fphe-Cys-NH2の調製)
Figure 2023520714000077
 表題化合物を、最後から2番目のカップリング工程においてFmoc-NH-(CH2CH2O)2-CH2COOHを用いて、0.1mmolスケールで、実施例250の工程4に記載されているように調製した。98mg(54％)の表題化合物を得た。LCMS (Acquity CSH C18 1.7μm、pH 3、保持時間6.26分、10分で20％から60％のMeCN):ES+ m/z [M+2H]2+＝909.4、純度78％。
(工程2: TATA環化)
Figure 2023520714000078
 前述の直鎖状ペプチド(98mg、0.04mmol)を、TATA環化手順に従いTATAを用いて18時間かけて環化させて、105mgの粗生成物を得て、これをさらに精製することなく次の工程で用いた。LCMS (Acquity CSH C18 1.7μm、pH 3、保持時間2.47分、4分で20％から60％のMeCN): ES+ m/z＝1033.8 [M+2H]2+、純度91％。
(工程3: 実施例251の調製)
Figure 2023520714000079
 (+)-L-アスコルビン酸ナトリウム(16mg、0.08mmol)を、N2雰囲気下、t-BuOH (10mL)/H2O(20mL)中の前述の化合物(105mg、0.05mmol)、N2,N6-ジペンタ-4-インオイル-L-リジン(6mg、0.02mmol)及びCuSO4・5H2O(20mg、0.08mmol)の溶液に添加した。溶液は乳濁した。反応を、室温で6.5時間撹拌し、さらなるN2,N6-ジペンタ-4-インオイル-L-リジン(6mg、0.02mmol)を添加した。23時間後、反応を、水性Na2CO3(0.166mL、0.16mmol)でクエンチし、濾過した。濾液を凍結乾燥し、粗生成物を分取HPLC(カラム: Waters Atlantis T3 ODB 5μm 150×19mm;移動相: A-H2O/TFA 100/0.15及びB-MeCN;グラジエント: 0.5分間5％のB、1.5分で5％から38％のB、14分で38％から43％のB;流速30mL/分、室温、検出230nm)によって精製して、表題化合物(5.5mg、3％)を得た。HRMS: (C200H280F2N54O48S6 +3H)3+についての計算値1479.6552;実測値(ESI [M+3H]3+) 1479.6583、純度82％。
(架橋された5×4の二環式ペプチドの調製)
(実施例234(異性体1)及び実施例235(異性体2)の調製)
Figure 2023520714000080
 (工程1: 樹脂上での直鎖状前駆体の調製)
Figure 2023520714000081
 樹脂に結合させたペプチドを、合成の前にDCM(40mL)で処理され30分間そのままとしたTGR R樹脂(NovaSyn、2g、0.48mmol、担持量:0.24mmol/g)を用いて手動で調製した。適当なFmoc保護アミノ酸(1.5当量)及びHATU(1.5当量)を、DMF(10mL)に溶解させ、溶液を、樹脂に添加し、それに続き、DIPEA(3当量)を添加した。反応を、室温で45分間撹拌した。各カップリングの後に、樹脂を、DMF(3×5mL)、DCM(3×5mL)及びMeOH(3×5mL)で洗浄した。Fmoc保護基を、DMF(5mL、v/v)中20％のピペリジン溶液中の樹脂を10分間撹拌することによって除去し、DMF(3×5mL)で洗浄した。この手順をさらに2回繰り返した。最後のカップリング工程後は、Fmoc保護基を除去しなかった。次いで、樹脂を、DMF(3×5mL)、DCM(3×10分間)、及びMeOH(3×5mL)で洗浄し、真空下、室温で乾燥させて、2.13gの官能化樹脂を得た。
(工程2: 閉環メタセシス)
Figure 2023520714000082
 工程1の乾燥させた樹脂(2.13g、0.24mmol/g、理論上のペプチド担持量0.48mmol)を、無水DCM(130mL)と混合し、窒素を溶液に5分間バブリングした。生じた混合物に、DCM(5mL)に溶解させたベンジリデンビス(トリシクロヘキシルホスフィン)-ジクロロルテニウム(Grubbs触媒第1世代、107mg、0.128mmol)を添加し、反応混合物を窒素下40℃で72時間撹拌した。この時点で、樹脂からの反応混合物の切断及びLCMS(Acquity CSH、フルオロフェニルカラム、2.1X50mm、1.8μm、pH 3、10分で30％から70％のMeCN)による分析によって、2つの位置異性体生成物(それぞれ、RT:4.54及び4.71分、35％及び42％)の生成及び約11％の残存直鎖状ペプチド(保持時間6.95分)が示されていた。樹脂を、濾過によって単離し、DMF、DCM、及びMeOH(それぞれ3×5mL)で洗浄し、乾燥させた。
(工程3: N-アセチル化及び切断)
Figure 2023520714000083
 Fmoc基を、DMF(5mL、v/v)中20％のピペリジン溶液中で樹脂を10分間撹拌することによって除去し、DMF(3×5mL)で洗浄した。脱保護手順をさらに2回繰り返した。次いで、樹脂を、DMF(3×5mL)、DCM(3×10分間)、及びMeOH(3×5mL)で洗浄し、真空下で乾燥させた。室温で20分間の5mLのDMF及びi-Pr2NEtに溶解させたAc2O(10当量)での処理を用いて、N末端アセチル基を取り付けた。次いで、樹脂をDMF(3×5mL)、DCM(3×5mL)、及びMeOH(3×5mL)、並びにEt2O(3×5mL)で洗浄し、真空下で乾燥させた。結合しているペプチドを、樹脂から切断し、TFA/TIS/H2O/DODTの混合物中(92.5/2.5/2.5/2.5、v/v、20mL)での穏やかな2.5時間の攪拌によって脱保護した。冷エーテルから析出させ、遠心分離し、高真空下で乾燥させると、所望の粗体ペプチド(284mg、41％)が得られ、これをさらに精製することなく用いた。
(工程4: TATA環化)
Figure 2023520714000084
 工程3で得た粗体ペプチド(146mg、0.1mmol)を、MeCN/H2O(10mL、1:1、v/v)の混合物に溶解させ、水性NH4CO3バッファー(0.06M、20mL)を添加し、それに続き、MeCN(5mL)中のTATA(20mg、0,08mmol)の溶液を35分かけて滴加した。混合物を室温で1時間撹拌した。その後、ギ酸(0.5mL)を添加し、生じた混合物を凍結乾燥した。粗生成物を、分取HPLC(カラム: Waters Atlantis T3 ODB 5μm 150×19mm;移動相: A-H2O/TFA 100/0.1及びB-MeCN;グラジエント: 0.5分間5％のB、2分で5％から23％のB、30分で23％から33％のB;流速30mL/分、室温、検出210nm)によって精製して、第1の画分として表題化合物の異性体1(8.2mg、4.8％)及び第2の画分として異性体2(9.5mg、5.6％)を得た。
異性体1: HRMS: (C75H101FN18O21S3 +2H)2+についての計算値853.3345;実測値(ESI [M+2H]2+) 853.3354、純度92％。
異性体2: HRMS: (C75H101FN18O21S3 +2H)2+についての計算値853.3345;実測値(ESI [M+2H]2+) 853.3353、純度86％。
(実施例236の調製)
Figure 2023520714000085
 (工程1: 水素添加及び樹脂からの切断)
Figure 2023520714000086
 実施例234/235の工程2に記載されるように調製された1.5gの樹脂(理論上のペプチド担持量:0.25mmol)を、オートクレーブ内のDCM/MeOH(10mL、v/v)の混合物中に懸濁させた。ウイルキンソン触媒(100mg、0.11mmol)を添加し、反応を水素圧力(4バール(400kPa))下40℃で24時間撹拌した。樹脂を、濾過によって単離し、DMF(3×5mL)、DCM(3×5mL)、及びMeOH(3×5mL)で洗浄した。Fmoc切断、アセチル化、及び樹脂からのペプチドの切断は、実施例234/235の工程3に記載したように行い、57mg(16％)の粗生成物を得て、これをさらに精製することなく用いた。
(工程3: TATA環化)
Figure 2023520714000087
 前述の工程の粗体ペプチド(57mg、0.04mmol)を、実施例23/235の工程4に記載したようにTATAを用いて環化させた。粗生成物を、分取HPLC(カラム: Waters XSelect(登録商標) CSH Prep、C18 5μm OBD(商標)、19×150mm;移動相: A-H2O＋TFA(0.1％)及びB-MeCN＋TFA(0.1％);グラジエント:0.5分間5％のB、2分で5％から20％のB、20分で20％から30％のB;流速30mL/分、室温、検出210nm)によって精製して、表題化合物(3.3mg、3.9％)を得た。HRMS: (C75H103FN18O21S3 +2H)2+についての計算値854.3424;実測値(ESI [M+2H]2+ 854.3429、純度99％。
実施例234～236に記載した方法を用いて、表5及び6に示される化合物を調製した。
(表5: ホチキス留めされたような(stapled)5×4の二環)
Figure 2023520714000088
 (表6: ホチキス留めされたような5×4の二環)
Figure 2023520714000089
(実施例248の調製)
Figure 2023520714000090
 (工程1. Ac-Cys-Gln-X2-Leu-Glu-Asp-Cys-Trp-X1-G-Phe(4-F)-CysNH2(X1＝L-2-アミノ-アジドブタン酸、X2＝L-2-アミノヘプト-6-イン酸)の調製)
樹脂に結合したペプチドを、合成の前にDCM(20mL)で処理し30分間そのままとしたChemmatrix Rinkアミド樹脂(Biotage、531mg、0.25mmol、担持量:0.48mmol/g)を用いて手動で調製した。適当なFmoc保護アミノ酸(1.5当量)及びHATU(1.5当量)を、DMF(10mL)に溶解させ、その溶液を、樹脂に添加し、それに続き、DIPEA(3当量)を添加した。反応を、室温で45分間撹拌した。各カップリングの後に、樹脂を、DMF(3×5mL)、DCM(3×5mL)、及びMeOH(3×5mL)で洗浄した。Fmoc保護基を、DMF(5mL、v/v)中20％のピペリジン溶液中で樹脂を10分間撹拌することによって除去し、DMF(3×5mL)で洗浄した。この手順をさらに2回繰り返した。最後のカップリング及びFmoc保護基の除去の後に、樹脂をDMF(5mL)中のAc2O(10当量)及びDIPEA(10当量)で60分間処理した。濾過後、樹脂をDMF(3×5mL)、DCM(3×10分間)、及びEt2O(3×5mL)で洗浄し、真空下で乾燥させた。結合しているペプチドを、樹脂から切断し、TFA/TIS/H2O/DODTの混合物(92.5/2.5/2.5/2.5、v/v、27mL)中での穏やかな攪拌によって2.5時間脱保護した。冷エーテルから析出させ、遠心分離し、高真空下で乾燥させると、所望の粗体ペプチド(353mg、92％)が得られ、これをさらに精製することなく用いた。
(工程2: TATA環化)
前述の工程の粗体ペプチド(353mg、0.24mmol、70％純度)を、MeCN/H2O(20mL、1:1、v/v)に溶解させ、水性NH4CO3バッファー(0.06M、40mL)を添加し、それに続き、MeCN(10mL)中のTATA(48mg、0.192mmol)の溶液を20分かけて滴加した。混合物を室温で1時間撹拌した。その後、ギ酸(2mL)を添加し、生じた混合物を凍結乾燥して、210mgの粗生成物を得た。
(工程3:クリック反応)
工程2で得た粗生成物(100mg、0.06mmol)及びCuSO4五水和物(66mg、0.26mmol)を、水及びtert-ブタノールの混合物(2:1、v/v、100mL)中に可溶化させた。この混合物に、水(2mL)中のアスコルビン酸ナトリウム(52mg、0.26mmol)の溶液をゆっくりと添加した。生じた混合物を2時間室温で撹拌した。アルコールを真空下で蒸発させ、残渣を凍結乾燥した。粗生成物を、分取HPLC(カラム: Waters XSelect(登録商標) CSH Prep、C18 5μm OBD(商標)、19×150mm;移動相: A-H2O＋TFA(0.1％)及びB-MeCN＋TFA(0.1％);グラジエント:0.5分間5％のB、2分で5％から25％のB、20分で25％から30％のB;流速30mL/分、室温、検出210nm)によって精製して、表題化合物(1.2mg、1％)を得た。HRMS: (C75H100FN21O21S3 +2H)2+についての計算値873.8353;実測値(ESI [M+2H]2+ 873.8361、純度99％。
(実施例249の調製)
Figure 2023520714000091
 実施例248に記載した手順に従って、表題化合物(0.6mg、0.5％)を得た。LCMS:(C75H100FN21O21S3 +2H)2+についての計算値874.5;実測値ESI [M+2H]2+ 874.4、純度95％。
(生物学的データ)
(ヒトTSLP表面プラズモン共鳴(SPR)結合アッセイ)
ビオチン化ヒトTSLPを、ストレプトアビジンでコーティングされたバイオセンサーチップ(GE Helathcare又はXanTec bioanalytics GmbH)上に固定化した。典型的なキャプチャーレベルは、500～2000レスポンスユニット(RU)であった。バッファー条件は、50mM HEPES pH 7.4、150mM NaCl、0.005％(v/v) Tween20、及び1％ DMSOであった。ペプチドを、30μL/分の流速で注入し、結合を、最高濃度を10又は100μMとし、かつ1/3希釈段階を用いる7又は10の濃度反応系列で決定した。典型的な接触時間は、60秒とし、180～600秒の解離をそれに続けた。センサーグラムを、定常状態又は速度論的1:1結合モデルのいずれかとフィッティングさせてKD値を得た。実験は、20℃で行った。
実施例1～252の化合物を、上述のヒトTSLP SPRアッセイで試験した。結果を、下記表7に示す。
表7: 本発明のペプチドリガンドについてのヒトTSLP SPRデータ
Figure 2023520714000092
Figure 2023520714000093
Figure 2023520714000094
Figure 2023520714000095
Figure 2023520714000096
Figure 2023520714000097
(ヒト末梢血単核細胞アッセイ)
ヒト末梢血単核細胞(PMBC)を、Lymphoprep(StemCell Technologies、Vancouver、BC)を製造業者の説明書に従い用いる密度勾配遠心分離によってヘパリン処理全血(健康なドナー)から得た。このPBMCを、2mM EDTA及び2％ウシ胎仔血清(FCS)を含有するPBSで2回洗浄し、10％ FCS及び2％ PenStrepを含有するRPMI中に、300万細胞/mLの最終濃度で再構成した。この細胞懸濁液(100μL)を、96ウェル平底組織培養プレートの各ウェル内に分割した。次いで、5μLの二環ペプチド又はビヒクル(完全培地中0.1％のDMSO)を添加し、5μLのTSLPビヒクル(完全培地)と混合した。本アッセイにおけるTSLP(100ng/mL)の最終濃度は、50、400、又は666pMであった。プレートを、30分間室温でインキュベーションした。この混合物のうちの10μLを、細胞に添加し、プレートを10％ CO2の加湿インキュベーター内で37℃で24時間インキュベーションした。プレートを、300×gで5分間遠心分離し、集めた上清を、後続のCCL17/TARC分析用に-20℃で凍結させた。
CCL17/TARCを、製造業者の説明書に従ってMSD(MesoScale Discovery, Maryland, USA)によって決定した。
試験された化合物についての化合物阻害作用を、GraphPad Prismソフトウェアを用いて以下の計算方法;
化合物の作用(％)＝100×[(X-min)/(max-min)]
(式中、Xは、Min(DMSO)及びMax(50、400、又は666pMのTSLP) に基づいて化合物について規格化された値を表す)
を用いて計算した。
特定の本発明の化合物を、上述のCCL17結合アッセイで試験した。結果を、下記表8に示す。
表8: 本発明のペプチドリガンドについてのCCL17結合データ
Figure 2023520714000098

Claims (22)

  1. 少なくとも2つのループ配列によって隔てられた少なくとも3つのシステイン残基を含むポリペプチド及び該ポリペプチドのシステイン残基と共有結合を形成する分子スキャフォールドを含み、少なくとも2つのポリペプチドループが、該分子スキャフォールド上に形成されている、TSLPに特異的なペプチドリガンド。
  2. 前記ループ配列が、3、4、5、6、又は7個のアミノ酸酸を含む、請求項1記載のペプチドリガンド。
  3. 第1のループ配列が5つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が4つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含む、請求項1又は2記載のペプチドリガンド。
  4. 第1のループ配列が5つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が4つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含み、かつ以下:
    Figure 2023520714000099
    Figure 2023520714000100
    Figure 2023520714000101
    Figure 2023520714000102
    Figure 2023520714000103
    Figure 2023520714000104
    又はその医薬として許容し得る塩、
    例えば:
    Ac-(配列番号:1)(以下、実施例1という);
    Ac-(配列番号:2)(以下、実施例2という);
    Ac-(配列番号:3)(以下、実施例3という);
    tertBuCO-(配列番号:3)(以下、実施例6という);
    R1-(配列番号:3)(以下、実施例7という);
    Ac-(配列番号:4)(以下、実施例4という);
    Ac-(配列番号:5)(以下、実施例5という);
    Ac-(配列番号:6)(以下、実施例8という);
    Ac-(配列番号:7)(以下、実施例9という);
    Ac-(配列番号:8)(以下、実施例10という);
    Ac-(配列番号:9)(以下、実施例11という);
    Ac-(配列番号:10)(以下、実施例12という);
    Ac-(配列番号:11)(以下、実施例13という);
    Ac-(配列番号:12)(以下、実施例14という);
    オクタノイル-(配列番号:13)(以下、実施例15という);
    Ac-(配列番号:14)(以下、実施例16という);
    Ac-(配列番号:15)(以下、実施例17という);
    Ac-(配列番号:15)-[dA](以下、実施例33という);
    (配列番号:15)-COOH(以下、実施例48という);
    Ac-(配列番号:16)(以下、実施例18という);
    Ac-(配列番号:17)(以下、実施例19という);
    Ac-(配列番号:18)(以下、実施例20という);
    Ac-(配列番号:19)(以下、実施例21という);
    Ac-(配列番号:20)(以下、実施例22という);
    Ac-(配列番号:21)(以下、実施例23という);
    Ac-(配列番号:22)(以下、実施例24という);
    (配列番号:23)(以下、実施例252という);
    Ac-(配列番号:23)(以下、実施例25という);
    Ac-(配列番号:23)-[dA](以下、実施例29という);
    Ac-(配列番号:24)(以下、実施例26という);
    Ac-(配列番号:25)(以下、実施例27という);
    Ac-(配列番号:26)(以下、実施例28という);
    Ac-(配列番号:27)(以下、実施例30という);
    Ac-(配列番号:28)(以下、実施例31という);
    Ac-(配列番号:29)(以下、実施例32という);
    Ac-(配列番号:30)(以下、実施例34という);
    Ac-(配列番号:31)(以下、実施例35という);
    Ac-(配列番号:32)(以下、実施例36という);
    Ac-(配列番号:33)(以下、実施例37という);
    Ac-(配列番号:34)(以下、実施例38という);
    Ac-(配列番号:34)-[dA](以下、実施例49という);
    Ac-(配列番号:34)-COOH(以下、実施例69という);
    Ac-(配列番号:35)(以下、実施例43という);
    Ac-(配列番号:35)-COOH(以下、実施例39という);
    Ac-(配列番号:36)(以下、実施例40という);
    Ac-(配列番号:37)(以下、実施例41という);
    A-(配列番号:38)-ADGDML(以下、実施例42という);
    GTDSAE-(配列番号:38)-A(以下、実施例45という);
    Ac-A-(配列番号:38)-PLD(以下、実施例53という);
    Ac-(配列番号:38)-APDERD(以下、実施例54という);
    A-(配列番号:38)-DDAHAP(以下、実施例55という);
    TMEYRD-(配列番号:38)-A(以下、実施例56という);
    A-(配列番号:38)-SSSDQS(以下、実施例59という);
    SDEQRT-(配列番号:38)-A(以下、実施例61という);
    DDEIMQ-(配列番号:38)-A(以下、実施例64という);
    RTDETG-(配列番号:38)-A(以下、実施例67という);
    A-(配列番号:38)-A(以下、実施例68という);
    ETNNLE-(配列番号:38)-A(以下、実施例71という);
    Ac-(配列番号:38)(以下、実施例79という);
    DPPKPR-(配列番号:38)-A(以下、実施例87という);
    (配列番号:38)-DTSTHS(以下、実施例128という);
    Ac-(配列番号:39)(以下、実施例44という);
    Ac-(配列番号:40)(以下、実施例46という);
    Ac-(配列番号:41)(以下、実施例47という);
    Ac-(配列番号:42)(以下、実施例50という);
    Ac-(配列番号:43)(以下、実施例51という);
    Ac-(配列番号:44)(以下、実施例52という);
    Ac-(配列番号:45)(以下、実施例57という);
    Ac-(配列番号:46)(以下、実施例58という);
    Ac-(配列番号:47)(以下、実施例60という);
    Ac-(配列番号:48)(以下、実施例62という);
    A-(配列番号:49)-ADS(以下、実施例63という);
    Ac-(配列番号:50)(以下、実施例65という);
    Ac-(配列番号:51)(以下、実施例66という);
    Ac-(配列番号:52)(以下、実施例70という);
    Ac-(配列番号:53)(以下、実施例72という);
    SPP-(配列番号:54)-A(以下、実施例73という);
    Ac-(配列番号:55)(以下、実施例74という);
    A-(配列番号:56)-HLE(以下、実施例75という);
    A-(配列番号:57)-A(以下、実施例76という);
    Ac-(配列番号:58)(以下、実施例77という);
    Ac-(配列番号:59)(以下、実施例78という);
    Ac-(配列番号:60)(以下、実施例80という);
    Ac-(配列番号:61)(以下、実施例81という);
    Ac-(配列番号:62)(以下、実施例82という);
    Ac-(配列番号:63)(以下、実施例83という);
    tertBuCO-(配列番号:64)(以下、実施例84という);
    R1-(配列番号:64)(以下、実施例89という);
    R2-(配列番号:64)(以下、実施例95という);
    ベンジル-(配列番号:64)(以下、実施例93という);
    Ac-(配列番号:64)-[N-フェネチルアミド](以下、実施例96という);
    R3-(配列番号:64)(以下、実施例99という);
    R4-(配列番号:64)(以下、実施例103という);
    Ac-(配列番号:64)-[N-ベンジルアミド](以下、実施例109という);
    A-(配列番号:64)-A(以下、実施例115という);
    ベンゾイル-(配列番号:64)(以下、実施例116という);
    Ac-(配列番号:64)-R5(以下、実施例120という);
    サクシニル-(配列番号:64)(以下、実施例121という);
    Ac-(配列番号:64)-[N-オクチルアミド](以下、実施例122という);
    Ac-(配列番号:64)-[N-ペンチルアミド](以下、実施例123という);
    Ac-(配列番号:64)(以下、実施例124という);
    Ac-(配列番号:64)-R6(以下、実施例127という);
    (配列番号:64)(以下、実施例129という);
    デカノイル-(配列番号:64)(以下、実施例137という);
    ヘキサノイル-(配列番号:64)(以下、実施例139という);
    SPT-(配列番号:65)-A(以下、実施例85という);
    Ac-(配列番号:66)(以下、実施例86という);
    TIK-(配列番号:67)-A(以下、実施例88という);
    Ac-(配列番号:68)(以下、実施例90という);
    Ac-(配列番号:69)(以下、実施例91という);
    Ac-(配列番号:70)(以下、実施例92という);
    Ac-(配列番号:71)(以下、実施例94という);
    DNH-(配列番号:72)-A(以下、実施例97という);
    HPN-(配列番号:73)-A(以下、実施例98という);
    Ac-(配列番号:74)-TTS(以下、実施例100という);
    A-(配列番号:75)-A(以下、実施例101という);
    (配列番号:76)(以下、実施例102という);
    Ac-(配列番号:76)(以下、実施例104という);
    Ac-(配列番号:77)(以下、実施例105という);
    DQD-(配列番号:78)-A(以下、実施例106という);
    Ac-(配列番号:79)(以下、実施例107という);
    Ac-(配列番号:80)(以下、実施例108という);
    Ac-(配列番号:81)(以下、実施例110という);
    Ac-(配列番号:82)(以下、実施例111という);
    Ac-(配列番号:83)(以下、実施例112という);
    Ac-(配列番号:84)(以下、実施例113という);
    Ac-(配列番号:85)(以下、実施例114という);
    REN-(配列番号:86)-A(以下、実施例117という);
    Ac-(配列番号:87)(以下、実施例118という);
    Ac-(配列番号:88)(以下、実施例119という);
    A-(配列番号:89)-HEE(以下、実施例125という);
    Ac-(配列番号:90)(以下、実施例126という);
    Ac-(配列番号:91)(以下、実施例130という);
    Ac-(配列番号:92)(以下、実施例131という);
    Ac-(配列番号:93)(以下、実施例132という);
    Ac-(配列番号:94)(以下、実施例133という);
    Ac-(配列番号:95)(以下、実施例134という);
    Ac-(配列番号:96)(以下、実施例135という);
    A-(配列番号:97)-HSE(以下、実施例136という);
    A-(配列番号:98)-ETA(以下、実施例138という);
    Ac-(配列番号:99)(以下、実施例140という);
    A-(配列番号:100)-A(以下、実施例141という);
    Ac-(配列番号:101)(以下、実施例142という);
    Ac-(配列番号:102)(以下、実施例143という);
    Ac-(配列番号:103)(以下、実施例144という);
    Ac-(配列番号:104)(以下、実施例145という);
    Ac-(配列番号:105)(以下、実施例146という);
    Ac-(配列番号:106)(以下、実施例147という);
    Ac-(配列番号:107)(以下、実施例148という);
    Ac-(配列番号:108)(以下、実施例149という);
    A-(配列番号:109)-A(以下、実施例150という);
    Ac-(配列番号:110)(以下、実施例151という);
    Ac-(配列番号:111)(以下、実施例152という);
    Ac-(配列番号:112)(以下、実施例153という);
    Ac-(配列番号:113)(以下、実施例154という);
    Ac-(配列番号:114)(以下、実施例155という);
    (配列番号:114)(以下、実施例156という);
    Ac-(配列番号:115)(以下、実施例157という);
    Ac-(配列番号:116)(以下、実施例158という);
    Ac-(配列番号:117)(以下、実施例159という);及び
    Ac-(配列番号:118)(以下、実施例160という);
    (式中、Acは、アセチルを表し、tertBuCOは、
    Figure 2023520714000105
     を表し、
    R1は:
    Figure 2023520714000106
     を表し、
    R2は:
    Figure 2023520714000107
     を表し、
    R3は:
    Figure 2023520714000108
     を表し、
    R4は:
    Figure 2023520714000109
     を表し、
    R5は:
    Figure 2023520714000110
     を表し、かつ
    R6は:
    Figure 2023520714000111
     を表す)
    又はその医薬として許容し得る塩など
    のうちの1つのアミノ酸配列を含む、請求項3記載のペプチドリガンド。
  5. 第1のループ配列が7つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が5つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含む、請求項1又は2記載のペプチドリガンド。
  6. 第1のループ配列が7つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が5つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含み、かつ以下:
    Figure 2023520714000112
     又はその医薬として許容し得る塩、
    例えば、
    A-(配列番号:119)-A(以下、実施例161という);
    A-(配列番号:120)-A(以下、実施例162という);
    A-(配列番号:121)-A(以下、実施例163という);
    (配列番号:121)(以下、実施例185という);
    A-(配列番号:122)-A(以下、実施例164という);
    YATTQV-(配列番号:122)-A(以下、実施例171という);
    KDNRVD-(配列番号:122)-A(以下、実施例172という);
    EYQRDV-(配列番号:122)-A(以下、実施例173という);
    A-(配列番号:122)-SNSYDMA(以下、実施例174という);
    A-(配列番号:122)-SESVHTA(以下、実施例175という);
    A-(配列番号:122)-SSDTTDA(以下、実施例176という);
    A-(配列番号:122)-KPDHVDA(以下、実施例177という);
    A-(配列番号:122)-ANV(以下、実施例186という);
    RVNTHQ-(配列番号:122)-A(以下、実施例190という);
    YDRDFT-(配列番号:122)-A(以下、実施例191という);
    EVDTYP-(配列番号:122)-A(以下、実施例192という);
    A-(配列番号:122)-ADGLYDA(以下、実施例193という);
    AHP-(配列番号:123)-A(以下、実施例165という);
    YGA-(配列番号:124)-A(以下、実施例166という);
    A-(配列番号:125)-APN(以下、実施例167という);
    A-(配列番号:126)-YDE(以下、実施例168という);
    A-(配列番号:127)-AGD(以下、実施例169という);
    A-(配列番号:128)-AHP(以下、実施例170という);
    (配列番号:129)(以下、実施例178という);
    (配列番号:130)(以下、実施例179という);
    (配列番号:131)(以下、実施例180という);
    (配列番号:132)(以下、実施例181という);
    (配列番号:133)(以下、実施例182という);
    A-(配列番号:134)-A(以下、実施例183という);
    A-(配列番号:135)-A(以下、実施例184という);
    RAP-(配列番号:136)-A(以下、実施例187という);
    SHV-(配列番号:137)-A(以下、実施例188という);
    RDL-(配列番号:138)-A(以下、実施例189という);
    (配列番号:139)(以下、実施例194という);及び
    (配列番号:140)(以下、実施例195という);
    又はその医薬として許容し得る塩など
    のうちの1つのアミノ酸配列を含む、請求項5記載のペプチドリガンド。
  7. 第1のループ配列が7つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が3つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含む、請求項1又は2記載のペプチドリガンド。
  8. 第1のループ配列が7つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が3つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含み、かつ以下:
    Figure 2023520714000113
     又はその医薬として許容し得る塩、
    例えば、
    A-(配列番号:141)-A(以下、実施例196という);
    A-(配列番号:142)-A(以下、実施例197という);
    A-(配列番号:143)-A(以下、実施例198という);
    A-(配列番号:144)-A(以下、実施例199という);
    DEQHHE-(配列番号:144)-A(以下、実施例209という);
    SNATKQ-(配列番号:144)-A(以下、実施例210という);
    GNIKKS-(配列番号:144)-A(以下、実施例211という);
    A-(配列番号:144)-DPSSKQA(以下、実施例212という);
    A-(配列番号:144)-YDNEMSA(以下、実施例213という);
    SEAQET-(配列番号:144)(以下、実施例214という);
    SPTEPP-(配列番号:144)(以下、実施例215という);
    (配列番号:144)-EPETGQ(以下、実施例216という);
    NRSPSE-(配列番号:144)(以下、実施例217という);
    Ac-(配列番号:144)(以下、実施例218という);
    R7-(配列番号:144)(以下、実施例219という);
    A-(配列番号:144)-EPETGQA(以下、実施例221という);
    (配列番号:144)-GDMSVS(以下、実施例222という);
    (配列番号:144)-YDNEMS(以下、実施例223という);
    (配列番号:144)-APDHLP(以下、実施例224という);
    (配列番号:144)-DPSSKQ(以下、実施例226という);
    (配列番号:144)-ANSEFE(以下、実施例227という);
    (配列番号:144)-GAGESS(以下、実施例228という);
    DHD-(配列番号:145)-A(以下、実施例200という);
    ADG-(配列番号:146)-A(以下、実施例201という);
    TLP-(配列番号:147)-A(以下、実施例202という);
    SQE-(配列番号:148)-A(以下、実施例203という);
    AET-(配列番号:149)-A(以下、実施例204という);
    A-(配列番号:150)-DPN(以下、実施例205という);
    A-(配列番号:151)-API(以下、実施例206という);
    A-(配列番号:152)-ANT(以下、実施例207という);
    A-(配列番号:153)-FAE(以下、実施例208という);
    AND-(配列番号:154)-A(以下、実施例220という);及び
    ERN-(配列番号:155)-A(以下、実施例225という);
    (式中、R7は、
    Figure 2023520714000114
     を表す)、又はその医薬として許容し得る塩など
    のうちの1つのアミノ酸配列を含む、請求項7記載のペプチドリガンド。
  9. 第1のループ配列が6つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が5つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含む、請求項1又は2記載のペプチドリガンド。
  10. 第1のループ配列が6つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が5つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含み、かつ以下:
    Figure 2023520714000115
     又はその医薬として許容し得る塩、
    例えば、
    A-(配列番号:156)-A(以下、実施例229という);及び
    A-(配列番号:157)-A(以下、実施例230という);
    又はその医薬として許容し得る塩など
    のうちの1つのアミノ酸配列を含む、請求項9記載のペプチドリガンド。
  11. 第1のループ配列が6つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が6つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含む、請求項1又は2記載のペプチドリガンド。
  12. 一実施態様において、第1のループ配列が6つのアミノ酸からなり、かつ第2のループ配列が6つのアミノ酸からなる2つのループ配列によって隔てられた3つのシステイン残基を含み、かつ以下:
    Figure 2023520714000116
     又はその医薬として許容し得る塩、
    例えば、
    A-(配列番号:158)-A(以下、実施例231という);及び
    A-(配列番号:159)-A(以下、実施例232という);
    又はその医薬として許容し得る塩など
    のうちの1つのアミノ酸配列を含む、請求項11記載のペプチドリガンド。
  13. 二重結合又はトリアジニル環(1,2,3 トリアジニル環など)を任意に組み込んだ-(CH2)2-10-リンカー(-(CH2)3-9-リンカーなど)から選択されるリンカー部位によって隔てられた2つの修飾されたグリシン残基(本明細書では、modGと称される)などの2つの修飾されたアミノ酸残基の連結によって形成される追加のループを含み、
    特に、該2つのmodG残基の間のリンカーが、以下:
    Figure 2023520714000117
     から選択される、請求項1～12のいずれか1項記載のペプチドリガンド。
  14. 以下:
    Figure 2023520714000118
     又はその医薬として許容し得る塩、
    例えば、実施例233～249など
    から選択される、請求項13記載のペプチドリガンド。
  15. 少なくとも2つ(例えば、3つなど)の二環式ペプチドリガンドを含む多量体結合複合体を含み、
    該ペプチドリガンドが、同じであっても異なっていてもよく、それぞれが、少なくとも2つのループ配列によって隔てられた少なくとも3つの反応性基を含むポリペプチド、及び該ポリペプチドの該反応性基と共有結合を形成する分子スキャフォールドを含み、少なくとも2つのポリペプチドループが、該分子スキャフォールド上に形成されている、請求項1～14のいずれか1項記載のペプチドリガンド。
  16. 前記多量体結合複合体が、三量体部位(すなわち、3つの二環式ペプチド、例えば、3つの同一の二環式ペプチドなど)、特に、実施例250及び251から選択される三量体部位を含む、請求項15記載のペプチドリガンド。
  17. 前記分子スキャフォールドが、1,1',1''-(1,3,5-トリアジナン-1,3,5-トリイル)トリプロパ-2-エン-1-オン(TATA)から選択される、請求項1～16のいずれか1項記載のペプチドリガンド。
  18. 前記医薬として許容し得る塩が、遊離酸又はナトリウム、カリウム、カルシウム、アンモニウム塩から選択される、請求項1～17のいずれか1項記載のペプチドリガンド。
  19. 請求項1～18のいずれか1項記載のペプチドリガンドを、1種以上の医薬として許容し得る賦形剤との組合せで含む、医薬組成物。
  20. TSLPによって媒介される疾患又は障害の予防、抑制、又は治療において使用するための、請求項1～18のいずれか1項記載のペプチドリガンド又は請求項19記載の医薬組成物。
  21. 前記TSLPが、哺乳動物のTSLP、例えば、ヒトTSLPなどである、請求項20記載の使用のためのペプチドリガンド又は医薬組成物。
  22. 前記TSLPによって媒介される疾患又は障害が:呼吸器障害、炎症性障害、皮膚障害、及びアレルギー性障害、例えば、喘息、炎症性関節炎、アトピー性皮膚炎、湿疹、及び好酸球性食道炎など、特に、喘息から選択される、請求項20又は21記載の使用のためのペプチドリガンド又は医薬組成物。
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