CN117615794A - 与il-2缀合的检查点抑制剂及其用途 - Google Patents

与il-2缀合的检查点抑制剂及其用途 Download PDF

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CN117615794A CN202280048804.1A CN202280048804A CN117615794A CN 117615794 A CN117615794 A CN 117615794A CN 202280048804 A CN202280048804 A CN 202280048804A CN 117615794 A CN117615794 A CN 117615794A
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维杰亚·拉格万·帕塔比拉曼
贝托尔特·克雷夫特
让-菲利普·卡拉洛特
鲁本·阿尔瓦雷斯桑切斯
马加利·穆勒
马蒂尔德·阿雷瓦洛-鲁伊斯
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Mingfeng Treatment Co ltd
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Abstract

本公开内容涉及修饰的抗PD‑1多肽、包含修饰的抗PD‑1多肽的药物组合物、制备抗PD‑1多肽的方法以及使用修饰的抗PD‑1多肽用于治疗疾病的方法。在一方面，本公开内容涉及使用修饰的抗PD‑1多肽治疗受试者的癌症的方法。

Description

与IL-2缀合的检查点抑制剂及其用途
交叉引用
本申请要求2021年7月9日提交的美国临时申请第63/219,981号和2021年7月9日提交的美国临时申请第63/219,989号的权益，这些申请通过引用以其整体并入本文。
背景
2021年，美国估计将诊断出180万新的癌症病例，并且超过600,000人将死于该疾病。免疫疗法利用受试者的免疫系统来帮助治疗疾病。免疫疗法可以根据被治疗的疾病的性质而设计为激活或抑制免疫系统。用于治疗癌症的各种免疫疗法的目标是刺激免疫系统，使得其识别和破坏肿瘤或其他癌性组织。
细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)是细胞表面上的蛋白，它通过下调免疫系统和通过抑制T细胞炎性活性促进自身耐受来调节免疫系统对人体细胞的响应。细胞程序性死亡配体1(PD-L1)是抑制免疫系统适应性臂的1型跨膜蛋白。PD-1和PD-L1途径表示肿瘤细胞响应于内源免疫抗肿瘤活性而施加的适应性免疫系统抗性机制。PD-1抑制剂，诸如抗PD-1多肽和抗PD-1抗原结合片段是阻断PD-1免疫检查点蛋白活性的检查点抑制剂抗癌剂。然而，在许多情况下，单独的单一剂疗法不足以在癌症患者中实现持久响应。因此，对于改进的治疗癌症的疗法存在需求。
概述
本文描述了抗细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)-白细胞介素2(IL2)免疫缀合物及其用途。
在一方面，本文描述了一种组合物，所述组合物包含：与细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)选择性结合的多肽；修饰的IL-2多肽；以及接头，其中所述接头包含：共价附接至所述修饰的IL-2多肽的非末端残基的第一附接点；和共价附接至所述与PD-1选择性结合的多肽的第二附接点。
在一方面，本文描述了一种组合物，所述组合物包含：与PD-1选择性结合的多肽、修饰的IL-2多肽以及接头；其中所述接头包含：共价附接至所述修饰的IL-2多肽的第一附接点；和共价附接至所述与PD-1选择性结合的多肽的非末端残基的第二附接点。
在另一方面，本文描述了一种组合物，所述组合物包含：与PD-1选择性结合的多肽、修饰的IL-2多肽以及化学接头；其中所述化学接头包含：共价附接至所述修饰的IL-2多肽的第一附接点；和共价附接至所述与PD-1选择性结合的多肽的第二附接点。
在另一方面，本文描述了一种组合物，所述组合物包含：与PD-1选择性结合的多肽、修饰的IL-2多肽以及化学接头；其中所述化学接头包含：共价附接至所述修饰的IL-2多肽的第一附接点；和共价附接至所述与PD-1选择性结合的多肽的第二附接点，其中所述修饰的IL-2多肽偏向于IL-2受体β亚单位。
在另一方面，本文描述了一种组合物，所述组合物包含：IL-2多肽，其中所述IL-2多肽包含：附接在氨基酸残基42处的第一聚合物，其中所述修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列；和与细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)选择性结合的多肽。
在另一方面，本文描述了一种组合物，所述组合物包含：(a)与细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)选择性结合并包含Fc区的抗体或抗原结合片段，所述Fc区包含与SEQ ID NO:105具有90％或更多同一性的氨基酸序列；(b)在选自由以下组成的组的氨基酸残基处共价附接至所述Fc区的一个或更多个接头：(i)SEQ ID NO:105的位置25至35；(ii)SEQ ID NO:105的位置70至80；和(iii)SEQ ID NO:105的位置95至105；以及(c)共价附接至所述接头的一种或更多种细胞因子。
在另一方面，本文描述了一种组合物，所述组合物包含：(a)与PD-1选择性结合并包含Fc区的抗体或其抗原结合片段；(b)在选自由K246、K248、K288、K290和K317(Eu编号)组成的组的氨基酸残基处共价附接至所述Fc区的一个或更多个接头；和(c)共价附接至所述一个或更多个接头的一种或更多种细胞因子。
与PD-1选择性结合的多肽可以是例如重组蛋白，诸如抗体或合成蛋白。
在另一方面，本文描述了一种药物组合物，所述药物组合物包含：a)本文描述的组合物；和b)一种或更多种药学上可接受的载体或赋形剂。
在另一方面，本文描述了一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本文描述的组合物或本文描述的药物组合物中的任何一种。
在另一方面，本文描述了一种制备本文描述的组合物的方法，所述方法包括：a)将反应性基团共价附接至与PD-1选择性结合的多肽的特定残基；b)使所述反应性基团与附接至细胞因子的互补反应性基团接触；并且c)形成组合物。
在另一方面，本文描述了一种产生组合物的方法，所述组合物包含：与细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)选择性结合的多肽；修饰的IL-2多肽；以及接头，其中所述接头包含：共价附接至所述修饰的IL-2多肽的非末端残基的第一附接点；和共价附接至所述与PD-1选择性结合的多肽的第二附接点，所述方法包括：a)提供抗PD-1多肽，所述抗PD-1多肽具有在存在偶联酶的情况下与接头反应的至少一个受体氨基酸残基(acceptor amino acidresidue)；并且b)在存在能够引起在所述至少一个受体氨基酸残基和所述接头之间形成共价键的酶的情况下，使所述抗PD-1多肽与包含伯胺的接头反应，其中所述接头包含反应性基团(R)，其中所述共价键不位于所述R部分处，并且其中所述方法在足以使所述至少一个受体氨基酸残基经由所述接头与所述反应性基团形成共价键的条件下进行，其中所述共价键包括所述接头的第二附接点。
在另一方面，本文描述了一种产生组合物的方法，所述组合物包含：与PD-1选择性结合的多肽；修饰的IL-2多肽；以及接头，其中所述接头包含：共价附接至所述修饰的IL-2多肽的残基的第一附接点；和共价附接至所述与PD-1选择性结合的多肽的第二附接点，所述方法包括：a)提供与PD-1选择性结合的具有在存在官能化Fc结合亲和肽的情况下与接头前体反应的至少一个受体氨基酸残基的多肽；并且b)使所述与PD-1选择性结合的多肽与包含能够与受体氨基酸残基形成键的反应性基团(R)的接头前体反应，并且其中所述方法在足以使所述至少一个受体氨基酸残基经由接头与所述反应性基团形成共价键的条件下进行，其中所述共价键包括所述接头的第二附接点。
根据以下详细描述，本公开内容的另外的方面和优点对本领域技术人员而言将变得明显，详细描述中仅示出和描述了本公开内容的说明性实施方案。如将意识到的，本公开内容能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不偏离本公开内容。相应地，附图和描述应被认为本质上是说明性的而非限制性的。
通过引用并入
本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每一个单独的出版物、专利或专利申请被特别和单独地指明通过引用并入。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与本说明书中包含的公开内容相矛盾的情况，意图本说明书取代和/或优先于任何这样的矛盾材料。
附图简述
图1A图示了本公开内容的抗PD1-IL2免疫细胞因子以及抗PD1-IL2免疫细胞因子通过IL2Rβ/γ上调和PD-1抑制与激活的T细胞的相互作用。
图1B示出了修饰的可缀合细胞因子组合物AB的结构。
图2A示出了通过化学修饰技术对抗PD1抗体进行位点选择性修饰，以引入一个或两个缀合手柄。
图2B示出了未修饰的帕博利珠单抗(pembrolizumab)和带有DBCO缀合手柄的帕博利珠单抗的Q-TOF质谱。
图2C示出了修饰的IL2细胞因子的位点选择性缀合，以产生具有DAR1、DAR2或介于1和2之间的混合DAR的PD1-IL2。
图2D示出了粗制帕博利珠单抗和组合物AB缀合反应的TIC色谱图(上图)和完整的RP-HPLC图(下图)。
图2E示出了与组合物AB缀合反应缀合的粗制帕博利珠单抗的Q-TOF质谱图，显示了药物-抗体比为1(DAR1)和药物-抗体比为2(DAR 2)的物质的形成。
图2F示出了与组合物AB缀合的纯化的帕博利珠单抗的完整RP-HPLC(左上)图。
图2G示出了以混合药物-抗体比(DAR)与组合物AB缀合的纯化的帕博利珠单抗的Q-TOF质谱图。
图2H示出了包含与组合物AB缀合的帕博利珠单抗的纯化的免疫细胞因子的SEC-HPLC。
图3示出了测量未修饰的和缀合的抗PD1抗体与PD1/CD279配体结合的能力的图，该图在y轴上示出了ELISA信号，并且在x轴上示出了生物素化的PD-1蛋白的剂量。未缀合的参考抗体是帕博利珠单抗、纳武单抗(Nivolumab)和LZM-009。该图中测试的缀合抗体是组合物A、组合物C、组合物D、组合物E、组合物F、组合物G和组合物H。
图4示出了测量未修饰的和缀合的抗PD1抗体干扰PD1/PDL1途径的能力的图，该图在y轴上示出了效应细胞NFAT-RE报告物的平均发光强度，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD1抗体的剂量。未缀合的参考抗体是帕博利珠单抗，并且该图中测试的缀合的抗体是组合物B。该图中测试的IL-2多肽是Proleukin和组合物AA。
图5示出了测量未修饰的和缀合的抗PD1抗体在pH 6与人类新生儿Fc受体(FcRn)结合的能力的图，该图在y轴上示出了平均FcRn-IgG信号，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD1抗体的剂量。未缀合的参考抗体是帕博利珠单抗和LZM-009。测试的缀合抗体是组合物A、组合物D、组合物E、组合物H、组合物J和组合物K。
图6A示出了测量未修饰的和缀合的抗PD1抗体与人类Fcγ受体I(CD64)、人类Fcγ受体IIa(CD32a)、人类Fcγ受体IIb(CD32b)和人类Fcγ受体IIIa(CD16)结合的能力的曲线图，该图在y轴上示出了平均ELISA信号，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD1抗体的剂量。未缀合的参考抗体是帕博利珠单抗和LZM-009。测试的缀合的抗体是组合物A、组合物C、组合物D和组合物H。
图6B示出了测量缀合的抗PD1抗体与人类Fcγ受体I(CD64)、人类Fcγ受体IIa(CD32a)、人类Fcγ受体IIb(CD32b)和人类Fcγ受体IIIa(CD16)结合的能力的曲线图，该图在y轴上示出了平均ELISA信号，并且在x轴上示出了缀合的抗PD1抗体的剂量。从上至下测试的缀合的抗体组合物分别是组合物E、组合物J和组合物K。
图7A示出了测量亲本未转导Mo7e(PD1-)细胞和稳定转导的(PD1+)Mo7e细胞上PD-1/CD279的表面表达水平的图。
图7B示出了在y轴上用如x轴上描述的修饰的IL-2多肽或免疫细胞因子处理的亲本PD1-Mo7e细胞(作为“PD1-”)或稳定PD1+Mo7e细胞(作为“PD1+”)的磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的EC50值。对于PD1阴性细胞示出的测量值以黑色实心符号显示，而PD1阳性细胞以灰色空心符号显示。在该图中未缀合的测试的修饰的IL-2多肽是Proleukin和组合物AB。修饰的IL-2抗PD-1免疫细胞因子是组合物A、组合物C和组合物H。组合物O是Her2靶向的IL-2免疫细胞因子，显示为阴性对照。
图8示出了测量未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽对人类T细胞中Teff细胞和Treg细胞的体外诱导的作用的图。在y轴上示出了磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均荧光强度，作为对在x轴上示出的修饰的IL-2多肽或免疫细胞因子的剂量响应。所测试的修饰的IL-2多肽是组合物AA。所测试的IL-2抗PD-1免疫细胞因子是组合物A、组合物B和组合物C。
图9A示出了测量从健康供者的外周血中新鲜分离的静息记忆性(CD45RA-)和幼稚(CD45RA+)CD8+Teff细胞上的PD-1/CD279表面表达水平以及所示细胞类型的卡通描绘的图。
图9B示出了IL-2与PD-1缀合对CD8+Teff细胞的剂量响应效应。测量未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽对人类T细胞体外样品中静息记忆性(CD45RA-)和幼稚(CD45RA+)CD8+Teff细胞的诱导的作用的图，该图在y轴上示出磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均荧光强度，并且在x轴上示出修饰的IL-2多肽和免疫细胞因子的剂量。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物AA。该图中测试的IL-2抗PD-1免疫细胞因子是组合物B。Her2靶向的免疫细胞因子组合物N(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)显示为阴性对照。
图10A示出了测量在存在或不存在过量未缀合的抗PD1抗体帕博利珠单抗的情况下未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽对人类T细胞体外样品中静息幼稚(CD45RA+)CD8+Teff细胞的诱导的作用的图，该图在y轴上示出了磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均荧光强度，并且在x轴上示出了修饰的IL-2多肽和免疫细胞因子的剂量。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物AA，并且在该图中测试的免疫细胞因子是组合物B，并且HER2靶向的免疫细胞因子组合物N(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)作为对照。
图10B示出了测量在存在或不存在过量未缀合的抗PD1抗体帕博利珠单抗的情况下未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽对人类T细胞体外样品中静息记忆性(CD45RA-)CD8+Teff细胞的诱导的作用的图，该图在y轴上示出了磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均荧光强度，并且在x轴上示出了修饰的IL-2多肽和免疫细胞因子的剂量。在该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物AA，并且在该图中测试的免疫细胞因子是组合物B，并且Her2靶向的免疫细胞因子组合物N(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)作为对照。
图11A示出了描述PD-1靶向的和非靶向的免疫细胞因子对hPD1人源化BALB/c小鼠中CT26同系结肠癌肿瘤生长的作用的图。该图中测试的免疫细胞因子是组合物A，在单次注射方案之后作为单一剂以1和2.5mg/kg进行测试。对照Her2靶向的免疫细胞因子组合物O(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)也以2.5mg/kg进行测试。(平均值±SEM)。
图11B示出了描述治疗之后7天hPD1人源化BALB/c小鼠中PD-1靶向的和非靶向的免疫细胞因子对CT26同系结肠癌肿瘤生长的作用的柱状图。该图中测试的免疫细胞因子是组合物A，在单次注射方案之后作为单一剂以1和2.5mg/kg进行测试。对照Her2靶向的免疫细胞因子组合物O(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)也以2.5mg/kg进行测试。(平均值±SEM；**单向ANOVAP值<0.001)。
图12A示出了描述治疗之后7天PD-1靶向的和非靶向的免疫细胞因子对携带CT26肿瘤的hPD1人源化BALB/c小鼠的血液和肿瘤中的幼稚(CD62L高CD44低)CD8+T细胞的扩增的作用的图。该图中测试的免疫细胞因子是组合物A，在单次注射方案之后作为单一剂以1和2.5mg/kg进行测试。对照Her2靶向的免疫细胞因子组合物O(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)也以2.5mg/kg进行测试。(n＝3；平均值±SEM)。
图12B示出了描述治疗之后7天PD-1靶向的和非靶向的免疫细胞因子对携带CT26肿瘤的hPD1人源化BALB/c小鼠的血液和肿瘤中的效应记忆性(CD62L阴性CD44高)CD8+T细胞的扩增的作用的图。该图中测试的免疫细胞因子是组合物A，在单次注射方案之后作为单一剂以1和2.5mg/kg进行测试。对照Her2靶向的免疫细胞因子组合物O(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)也以2.5mg/kg进行测试。(n＝3；平均值±SEM)。
图13A示出了描述免疫细胞因子的PD-1靶向和非靶向对其在携带CT26肿瘤的hPD1人源化BALB/c小鼠的血液和肿瘤中的持久性的作用的图，该图在y轴上示出了PD-1靶向的和对照免疫细胞因子的血浆或肿瘤浓度，并且在x轴上示出了时间。该图中测试的免疫细胞因子是组合物A，在单次注射方案之后作为单一剂以1和2.5mg/kg进行测试。对照Her2靶向的免疫细胞因子组合物O(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)也以2.5mg/kg进行测试。(n＝3；平均值±SD)。
图13B示出了PD-1靶向如何导致PD1-IL2免疫细胞因子在7天的过程中在肿瘤内的逐渐积累。相比之下，非靶向的对照免疫细胞因子(Her2-IL2)在4d内被清除，未显示肿瘤内积累。在携带CT26肿瘤的hPD1人源化BALB/c小鼠中进行分析，并在y轴上示出了PD-1靶向的和对照免疫细胞因子的肿瘤/血浆浓度的比，并且在x轴上示出了时间。所分析的免疫细胞因子是组合物A，在单次应用之后作为单一剂以1和2.5mg/kg进行测试。对照Her2靶向的免疫细胞因子组合物O(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)也以2.5mg/kg进行测试。(n＝3；平均值±SEM)。
图14A示出了描述单次注射缀合的抗PD1抗体对hPD1 C57BL/6小鼠中MC38同系结肠癌肿瘤生长的作用的图。该图中测试的免疫细胞因子是组合物H，作为单一剂以1mg/kg作为单次注射液进行测试。(n＝8；平均值±SEM)。
图14B示出了描述在治疗7天之后单次注射缀合的抗PD1抗体对hPD1 C57BL/6小鼠中MC38同系结肠癌肿瘤生长的作用的柱状图。该图中测试的免疫细胞因子是组合物H，作为单一剂以1mg/kg单次注射液进行测试。(n＝8只动物；平均值±SEM；**单向ANOVAP值<0.005)。
详细描述
本文公开了抗PD-1多肽。在一些实施方案中，抗PD-1多肽与细胞信号传导分子诸如细胞因子缀合。在一些实施方案中，细胞因子是IL-2。图1A图示了包含与IL-2细胞因子缀合的抗PD-1多肽的示例性免疫细胞因子。本公开内容的抗PD-1抗体/IL-2免疫细胞因子(本文称为PD1-IL2)可以具有优异的功效和潜在改进的受试者耐受性。在一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1-IL-2免疫细胞因子可以直接靶向肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。在一些实施方案中，抗PD-1-IL-2免疫细胞因子可以显著减少患有疾病诸如癌症的受试者的抗PD-1多肽或IL-2的治疗剂量。
抗PD-1-IL-2免疫细胞因子可以通过一种或更多种作用模式发挥作用。在一些实施方案中，抗PD-1-IL-2免疫细胞因子可以通过靶向肿瘤内的PD-1和CD8+T细胞来抑制PD-1。在一些实施方案中，抗PD-1-IL-2免疫细胞因子可以经由IL-2Rβγ激活T细胞和NK细胞。
以下描述和实例详细说明了本公开内容的实施方案。应当理解，本公开内容不限于本文描述的特定实施方案，并因此可以变化。本领域的技术人员将认识到，本公开内容有许多变化和修改，这些都包括在本公开内容的范围内。
尽管本公开内容的各个特征可以在单个实施方案的上下文中被描述，但是这些特征也可以单独地或以任何合适的组合被提供。相反，尽管本公开内容可以为了清楚起见在单独的实施方案的上下文中在本文描述，但是本公开内容也可以以单个实施方案实施。
本文使用的章节标题仅用于组织目的，而不应被解释为限制所描述的主题。
定义
所有术语意图按照本领域技术人员将理解的方式理解。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
以下定义补充了本领域的定义，并针对本申请，而不应归于任何相关或不相关的情况，例如任何共同拥有的专利或申请。尽管与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料都可以用于实践对本公开内容的测试，但本文描述了优选的方法和材料。相应地，本文使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，并不意图是限制性的。
本文使用的术语仅为了描述特定情况的目的，并不意图是限制性的。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。如本文使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”意图也包括复数形式，除非上下文另外清楚地指示。
在本申请中，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。如本文使用的术语“和/或”和“其任何组合”及其语法等同物可以可互换使用。这些术语可以表示任何组合都被特别地设想。仅出于说明性目的，以下短语“A、B和/或C”或“A、B、C或其任何组合”可以表示“单独的A；单独的B；单独的C；A和B；B和C；A和C；以及A、B和C”。术语“或”可以结合使用或分别使用，除非上下文明确地指示分别使用。
术语“约”或“大约”可以意指在如由本领域的普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围以内，其将部分地取决于值如何被测量或确定，即，测量系统的限制。例如，“约”可以根据本领域的实践意指1个或多于1个标准差以内。可选地，“约”可以意指特定值的最多20％、最多15％、最多10％、最多5％或最多1％的范围。可选地，特别是关于生物系统或生物过程，该术语可以意指在值的数量级以内、5倍以内或2倍以内。当在本申请和权利要求书中描述特定值时，除非另外说明，否则应该假定术语“约”意指特定值的可接受的误差范围以内。
如本说明书和权利要求书中使用的，词“包含(comprising)”(和包含(comprising)的任何形式，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)，“具有(having)”(和具有(having)的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括(including)”(和包括(including)的任何形式，诸如“包括(includes)”和包括“(include)”)，或“含有(containing)”(和“含有(containing)”的任何形式，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含性的或开放式的，并不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。设想了本说明书中讨论的任何实施方案可以参考本公开内容的任何方法或组合物来实现，并且反之亦然。此外，本公开内容的组合物可以用于实现本公开内容的方法。
说明书中对“一些实施方案”、“实施方案”、“一种实施方案”或“其他实施方案”的提及意指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本公开内容的至少一些实施方案中，但不必包含在所有实施方案中。为了便于理解本公开内容，一些术语和措辞定义如下。
本文提及“附接”或“共价附接”至IL-2多肽的残基的基团。如本文使用的，“附接”或“共价附接”意指该基团被拴系至所指示的残基，并且这样的拴系可以包括连接基团(即，接头)。因此，对于“附接”或“共价附接”至残基的基团，明确地设想这样的连接基团也被涵盖。
结合亲和力是指单个分子和其配体/结合配偶体之间结合相互作用的强度。较高的结合亲和力是指比较低的结合亲和力更高强度的结合。在一些情况下，结合亲和力通过两个相关分子之间的解离常数(KD)来测量。当比较KD值时，具有较低值的结合相互作用将比具有较高值的结合相互作用具有更高的结合亲和力。对于蛋白-配体相互作用，根据以下式计算KD：
其中[L]是配体的浓度，[P]是蛋白的浓度，并且[LP]是配体/蛋白复合物的浓度。
本文提及某些氨基酸序列(例如，多肽序列)，其与参考序列具有一定序列同一性百分比或者涉及在对应于参考序列的位置的位置处的残基。序列同一性使用矩阵BLOSUM62、空位成本存在(Gap Costs Existence):11、延伸(Extension):1和组分调整条件组分评分矩阵调整(Compositional Adjustments Conditional Compositional ScoreMatrix Adjustment)的参数通过蛋白-蛋白BLAST算法测量。这种比对算法也用于通过分析被比较的两个序列的比对来评价残基是否位于“对应的”位置。
术语“药学上可接受的”是指联邦或州政府的管理机构所批准的或可批准的或在美国药典或其他一般公认的药典中列出的用于在动物包括人类中使用的。
“药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂”是指可以与剂一起向受试者施用且不破坏其药理活性并且在以足以递送治疗量的剂的剂量施用时无毒性的赋形剂、载体或稀释剂。
适于本公开内容的“药学上可接受的盐”可以是本领域中通常认为适于与人类或动物的组织接触使用而没有过度的毒性、刺激、过敏响应或其他问题或并发症的酸盐或碱盐。这样的盐包括碱性残基诸如胺的矿物和有机酸盐，以及酸性残基诸如羧酸的碱或有机盐。具体的药物盐包括但不限于以下酸的盐：诸如盐酸、磷酸、氢溴酸、苹果酸、乙醇酸、富马酸、硫酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、甲酸、甲苯磺酸、甲磺酸、苯磺酸、乙二磺酸、2-羟乙基磺酸、硝酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、硬脂酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、帕莫酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、丙酸、羟基马来酸、氢碘酸、苯乙酸、烷酸诸如乙酸、HOOC-(CH2)n-COOH，其中n是0-4等。类似地，药学上可接受的阳离子包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂和铵。本领域普通技术人员将从本公开内容和本领域知识中认识到，其他的药学上可接受的盐包括Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack PublishingCompany，Easton，PA，第1418页(1985)列出的那些。通常，药学上可接受的酸盐或碱盐可以通过任何常规化学方法从包含碱性或酸性部分的母体化合物合成。简言之，这样的盐可以通过将这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当碱或酸在适当的溶剂中反应来制备。
本文提供的范围被理解为该范围内所有值的简写。例如，1至50的范围被理解为包括来自由以下组成的组的任何数字、数字的组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50，以及上述整数之间的所有中间小数数值，诸如，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，从范围的任一端点延伸的“嵌套子范围(nested sub-range)”被特别地设想。例如，1至50的示例性范围的嵌套子范围可以包括在一个方向上的1至10、1至20、1至30和1至40，或者在另一个方向上的50至40、50至30、50至20和50至10。
本文提供的某些式和其他图示描绘了叠氮化物-炔烃环加成反应产生的三唑反应产物。虽然这样的式通常仅描绘在反应中形成的所得三唑的单一位置异构体，但意图的是该式包括所得的两种位置异构体。因此，虽然式仅描绘了单一位置异构体(例如，)，但意图的是另一位置异构体(例如，/>)也被包括。
术语“受试者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。仅以示例的方式，受试者包括但不限于哺乳动物，包括但不限于人类或非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物、牛科动物、马科动物、犬科动物、羊科动物或猫科动物。
术语“任选的”或“任选地”表示随后描述的事件或情形可以发生但不必须发生，并且该描述包括其中该事件或情形发生的情况和其中该事件或情形没有发生的情况。
术语“部分”是指分子的特定区段或官能团。化学部分通常是嵌入或附加至分子的公认的化学实体。
如本文使用的，术语“数均分子量”(Mn)意指样品中所有个体单元的统计平均分子量，并且由式(1)定义：
其中Mi是单元的分子量并且Ni是具有该分子量的单元的数量。
如本文使用的，术语“重均分子量”(Mw)意指由式(2)定义的数：
其中Mi是单元的分子量并且Ni是具有该分子量的单元的数量。
如本文使用的，“峰值分子量”(Mp)意指在特定的分析方法(例如质谱、尺寸排阻色谱、动态光散射、分析型离心等)中最高峰的分子量。
如本文使用的，“非典型”氨基酸可以指不在通常掺入天然存在的蛋白中的20个典型氨基酸之列的D形式或L形式的氨基酸残基。
如本文使用的，“缀合手柄”是指能够在接触互补反应性基团时形成键的反应性基团。在一些情况下，缀合手柄优选地不具有与不包含预期互补反应性基团的其他分子的实质性反应性。缀合手柄、它们各自的互补缀合手柄和对应的反应产物的非限制性实例可以见于下表中。虽然表格标题将某些反应性基团放置于标题“缀合手柄”或“互补缀合手柄”之下，但预期对缀合手柄的任何提及可以代替涵盖表中列出的互补缀合手柄(例如，反式环辛烯可以是缀合手柄，在这种情况下，四嗪将是互补缀合手柄)。在一些情况下，胺缀合手柄和与胺互补的缀合手柄不太优选地用于生物系统，因为胺在生物系统中普遍存在，并且脱靶缀合的可能性增加。
缀合手柄表
在整个本申请中，在术语“缀合手柄”之前使用前缀来表示缀合手柄被连接的官能团。例如，“蛋白缀合手柄”是附接至蛋白(直接或通过接头)的缀合手柄，“抗体缀合手柄”是附接至抗体(直接或通过接头)的缀合手柄，并且“接头缀合手柄”是附接至接头基团(例如，用于连接合成蛋白和抗体的双官能接头)的缀合手柄。
术语“烃基(alkyl)”是指具有1个至20个碳原子并且碳原子通过单键与分子的剩余部分附接的直链或支链的烃链基团。包含最多10个碳原子的烃基称为C1-C10烃基，同样，例如，包含最多6个碳原子的烃基是C1-C6烃基。包含其他数目碳原子的烃基(和本文定义的其他部分)类似地表示。烃基基团包括但不限于C1-C10烃基、C1-C9烃基、C1-C8烃基、C1-C7烃基、C1-C6烃基、C1-C5烃基、C1-C4烃基、C1-C3烃基、C1-C2烃基、C2-C8烃基、C3-C8烃基和C4-C8烃基。代表性烃基基团包括但不限于甲基、乙基、-丙基、1-甲基乙基、-丁基、-戊基、1,1-二甲基乙基、3-甲基己基、2-甲基己基、1-乙基丙基等。在一些实施方案中，烃基是甲基或乙基。在一些实施方案中，烃基是-CH(CH3)2或-C(CH3)3。除非说明书中另外特别说明，否则烃基基团可以任选地被取代。“亚烃基”或“亚烃基链”是指将分子剩余部分连接至基团的直链或支链的二价烃链。在一些实施方案中，亚烃基是-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，亚烃基是-CH2-。在一些实施方案中，亚烃基是-CH2CH2-。在一些实施方案中，亚烃基是-CH2CH2CH2-。除非说明书中另外特别说明，否则亚烃基基团可以任选地被取代。
术语“亚烯基”或“亚烯基链”是指将分子的剩余部分连接至基团的其中存在至少一个碳-碳双键的直链或支链的二价烃链。在一些实施方案中，亚烯基是-CH＝CH-、-CH2CH＝CH-或-CH＝CHCH2-。在一些实施方案中，亚烯基是-CH＝CH-。在一些实施方案中，亚烯基是-CH2CH＝CH-。在一些实施方案中，亚烯基是-CH＝CHCH2-。
术语“炔基”是指其中存在至少一个碳-碳三键的烃基基团类型。在一种实施方案中，炔基基团具有式-C≡C-Rx，其中RX是指炔基基团的剩余部分。在一些实施方案中，RX是H或烃基。在一些实施方案中，炔基选自乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。炔基基团的非限制性实例包括-C≡CH、-C≡CCH3、-C≡CCH2CH和-CH2C℃H。
术语“芳基”是指包含至少一个芳环(其中形成该环的每个原子都是碳原子)的基团。芳基基团可以任选地被取代。芳基基团的实例包括但不限于苯基和萘基。在一些实施方案中，芳基是苯基。根据结构，芳基基团可以是单基(monoradical)或双基(diradical)(即，亚芳基基团)。除非说明书中另外特别说明，否则术语“芳基”或前缀“ar-”(诸如在“芳烃基”中)意指包括任选地被取代的芳基基团。在一些实施方案中，芳基基团包括本文定义的部分还原的环烃基基团(例如，1,2-二氢萘)。在一些实施方案中，芳基基团包括本文定义的完全还原的环烃基基团(例如，1,2,3,4-四氢萘)。当芳基包括环烃基基团时，芳基通过芳环碳原子与分子的剩余部分键合。芳基基团可以是单环或多环(例如，双环、三环或四环)环体系，其可以包括稠合环体系、螺环体系或桥接环体系。
术语“环烃基(cycloalkyl)”是指单环或多环的非芳香族基团，其中形成环的每个原子(即，骨架原子)是碳原子。在一些实施方案中，环烃基是饱和的或部分不饱和的。在一些实施方案中，环烃基是螺环或桥接化合物。在一些实施方案中，环烃基与芳环稠合(在这种情况下，环烃基通过非芳环碳原子键合)。环烃基包括具有3个至10个环原子的基团。代表性环烃基包括但不限于具有三个至十个碳原子、三个至八个碳原子、三个至六个碳原子或三个至五个碳原子的环烃基。单环环烃基基团包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。在一些实施方案中，单环环烃基是环戊基。在一些实施方案中，单环环烃基是环戊烯基或环己烯基。在一些实施方案中，单环环烃基是环戊烯基。多环基团包括，例如，金刚烷基、1,2-二氢萘基、1,4-二氢萘基、四氢萘基、十氢萘基、3,4-二氢萘基-1(2H)-酮、螺[2.2]戊基、降冰片烃基和双环[1.1.1]戊基。除非说明书中另外特别说明，否则环烃基可以任选地被取代。
术语“亚杂烃基”或“亚杂烃基链”是指将分子剩余部分连接至基团的直链或支链的二价杂烃基链。除非说明书中另外特别说明，否则杂烃基或亚杂烃基基团可以如下文描述任选地被取代。代表性亚杂烃基基团包括但不限于-CH2-O-CH2-、-CH2-N(烃基)-CH2-、-CH2-N(芳基)-CH2-、-OCH2CH2O-、-OCH2CH2OCH2CH2O-或-OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2O-。
术语“杂环烃基(heteocycloalkyl)”是指包含选自氮、氧和硫的至少一个杂原子的环烃基基团。除非说明书中另外特别说明，否则杂环烃基基团可以是单环或双环的环体系，其可以包括稠合(当与芳基或杂芳基环稠合时，杂环烃基通过非芳族环原子键合)或桥接的环体系。杂环基基团中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化。氮原子可以任选地被季铵化。杂环烃基基团是部分或完全饱和的。杂环烃基基团的实例包括，但不限于，二氧戊环基、噻吩基[1,3]二噻烷基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基(piperidonyl)、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基(thiomorpholinyl)、硫杂吗啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代-硫代吗啉基、1,1-二氧代-硫代吗啉基。术语杂环烃基还包括糖类的所有环形式，包括但不限于单糖、二糖和寡糖。除非另外说明，否则杂环烃基在环中具有2至12个碳原子。在一些实施方案中，杂环烃基在环中具有2至10个碳原子。在一些实施方案中，杂环烃基在环中具有2至10个碳原子和1或2个N原子。在一些实施方案中，杂环烃基在环中具有2至10个碳原子和3或4个N原子。在一些实施方案中，杂环烃基在环中具有2个至12个碳原子、0-2个N原子、0-2个O原子、0-2个P原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂环烃基在环中具有2个至12个碳原子、1-3个N原子、0-1个O原子和0-1个S原子。应理解，当提及杂环烃基中的碳原子数时，杂环烃基中的碳原子数与构成杂环烃基的原子(包括杂原子)(即，杂环烃基环的骨架原子)总数不同。除非说明书中另外特别说明，否则杂环烃基基团可以任选地被取代。
术语“杂芳基”是指包含选自氮、氧和硫的一个或更多个环杂原子的芳基基团。在一些实施方案中，杂芳基是单环或双环的。杂芳基的说明性实例包括吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、哒嗪基、三嗪基、噁二唑基、噻二唑基、呋咱基、吲哚嗪、吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、1,8-萘啶和蝶啶。单环杂芳基的说明性实例包括吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、哒嗪基、三嗪基、噁二唑基、噻二唑基和呋咱基。双环杂芳基的说明性实例包括吲哚嗪、吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、1,8-萘啶和蝶啶。在一些实施方案中，杂芳基是吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基、噻吩基、噻二唑基或呋喃基。在一些实施方案中，杂芳基在环中包含0-6个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中包含1-4个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中包含4-6个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中包含0-4个N原子、0-1个O原子、0-1个P原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中包含1-4个N原子、0-1个O原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂芳基是C1-C9杂芳基。在一些实施方案中，单环杂芳基是C1-C5杂芳基。在一些实施方案中，单环杂芳基是5元或6元杂芳基。在一些实施方案中，双环杂芳基是C6-C9杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基基团包括本文定义的部分还原的环烃基或杂环烃基基团(例如，7,8-二氢喹啉)。在一些实施方案中，杂芳基基团包括本文定义的完全还原的环烃基或杂环烃基基团(例如，5,6,7,8-四氢喹啉)。在杂芳基包括环烃基或杂环烃基基团时，杂芳基通过杂芳环碳或杂原子与分子的剩余部分键合。杂芳基基团可以是单环或多环的(例如，双环、三环或四环)环体系，其可以包括稠合环体系、螺环体系或桥接环体系。
术语“任选地被取代”或“被取代”意指提及的基团任选地被单独和独立地选自以下的一个或更多个另外的基团取代：D、卤素、-CN、-NH2、-NH(烃基)、-N(烃基)2、-OH、-CO2H、-CO2烃基、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(烃基)、-C(＝O)N(烃基)2、-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2NH(烃基)、-S(＝O)2N(烃基)2、烃基、环烃基、氟烃基、杂烃基、烃氧基、氟烃氧基、杂环烃基、芳基、杂芳基、芳氧基、烃硫基、芳硫基、烃基亚砜、芳基亚砜、烃基砜和芳基砜。在一些其他实施方案中，任选的取代基独立地选自D、卤素、-CN、-NH2、-NH(CH3)、-N(CH3)2、-OH、-CO2H、-CO2(C1-C4烃基)、-C(＝O)NH2、-C(＝O)NH(C1-C4烃基)、-C(＝O)N(C1-C4烃基)2、-S(＝O)2NH2、-S(＝O)2NH(C1-C4烃基)、-S(＝O)2N(C1-C4烃基)2、C1-C4烃基、C3-C6环烃基、C1-C4氟烃基、C1-C4杂烃基、C1-C4烃氧基、C1-C4氟烃氧基、-SC1-C4烃基、-S(＝O)C1-C4烃基和-S(＝O)2C1-C4烃基。在一些实施方案中，任选的取代基独立地选自D、卤素、-CN、-NH2、-OH、-NH(CH3)、-N(CH3)2、-NH(环丙基)、-CH3、-CH2CH3、-CF3、-OCH3和-OCF3。在一些实施方案中，被取代的基团被前述基团中的一个或两个取代。在一些实施方案中，脂族碳原子(无环或环状)上的任选的取代基包括氧代(＝O)。
如本文使用的，“AJICAPTM技术”、“AJICAPTM方法”和类似术语是指使用亲和肽对抗体和相关分子的位点特异性官能化以将期望的官能化递送至期望的位点的系统和方法(目前由Ajinomoto Bio-Pharma Services(Ajinomoto)生产)。用于AJICAPTM方法的一般方案至少见于PCT公布第WO2018199337A1号、PCT公布第WO2019240288A1号、PCT公布第WO2019240287A1号、PCT公布第WO2020090979A1号、Matsuda等人,Mol.Pharmaceutics2021,18,4058-4066，和Yamada等人,AJICAP:Affinity Peptide Mediated RegiodivergentFunctionalization of Native Antibodies.Angew.Chem.,Int.Ed.2019,58,5592-5597，并且特别地美国专利公布第US20200190165A1号的实施例2-4中。在一些实施方案中，这样的方法在选自抗体Fc区(例如，IgG1 Fc区)的位置246、位置248、位置288、位置290和位置317(EU编号)的位置处的赖氨酸残基处位点特异性掺入期望的官能化。在一些实施方案中，期望的官能化掺入在抗体Fc区的残基位置248(EU编号)处。在一些实施方案中，位置248对应于人类IgG CH2区的第18个残基(EU编号)。
组合物AA是指具有SEQ ID NO:3中列出的序列的修饰的IL-2多肽，该修饰的IL-2多肽包含附接在残基Y45处的～0.5kDa PEG基团和附接在残基F42Y处的第二～0.5kDa PEG基团。
组合物AB是指具有SEQ ID NO:3中列出的序列的修饰的IL-2多肽，该修饰的IL-2多肽包含附接在残基Y45处的～0.5kDa PEG基团和在残基F42Y处被叠氮化物官能团加帽以促进缀合的0.5kDa的PEG基团。组合物AB的卡通图像在图1B中示出。组合物AB和相关修饰的IL-2多肽在PCT公布第WO2021140416A2号中描述，该公布特此通过引用并入，如以其整体列出一样。附接至组合物AB的聚合物发挥作用以破坏组合物AB与IL-2受体α亚单位的相互作用，并且使分子偏向有利于IL-2受体β亚单位信号传导，从而与WT IL-2相比增强IL-2多肽体内扩增和/或刺激Teff细胞的能力。
组合物AC是指具有SEQ ID NO:3中列出的序列的修饰的IL-2多肽，该修饰的IL-2多肽包含附接在残基F42Y和Y45处的～0.5kDa PEG基团。组合物AC包含经由戊二酸接头官能团偶联的通过～0.5kDa PEG附接至N-末端A残基的叠氮化物缀合手柄(参见本文提供的结构7)。
组合物A是指从组合物AB和抗PD-1抗体帕博利珠单抗或LZM-009的反应制备的抗PD-1抗体/IL-2缀合物。组合物A从组合物AB的叠氮化物官能团与附接至帕博利珠单抗Fc区的残基K248(EU编号)的DBCO官能团的反应形成。根据来自Ajinomoto的AJICAP技术，使用亲和肽系统向帕博利珠单抗添加DBCO官能团。组合物A具有1的药物-抗体比。
组合物B从组合物B的叠氮化物官能团与附接至帕博利珠单抗Fc区的残基K248(EU编号)的DBCO官能团的反应形成。根据来自Ajinomoto的AJICAP技术，使用亲和肽系统向帕博利珠单抗添加DBCO官能团。组合物B具有1.5的药物-抗体比。
组合物C从组合物AB的叠氮化物官能团与附接至帕博利珠单抗Fc区的残基K248(EU编号)的DBCO官能团的反应形成。根据来自Ajinomoto的AJICAP技术，使用亲和肽系统向帕博利珠单抗添加DBCO官能团。组合物C具有2的药物-抗体比。
组合物D从组合物AB的叠氮化物官能团与附接至帕博利珠单抗Fc区的残基K288(EU编号)的DBCO官能团的反应形成。根据来自Ajinomoto的AJICAP技术，使用亲和肽系统向帕博利珠单抗添加DBCO官能团。组合物D具有1的药物-抗体比。
组合物E从组合物AB的叠氮化物官能团与附接至帕博利珠单抗Fc区的残基K288(EU编号)的DBCO官能团的反应形成。根据来自Ajinomoto的AJICAP技术，使用亲和肽系统向帕博利珠单抗添加DBCO官能团。组合物E具有2的药物-抗体比。
组合物F从组合物AC的叠氮化物官能团与附接至帕博利珠单抗Fc区的残基K248(EU编号)的DBCO官能团的反应形成。根据来自Ajinomoto的AJICAP技术，使用亲和肽系统向帕博利珠单抗添加DBCO官能团。组合物F具有1的药物-抗体比。
组合物G从组合物AC的叠氮化物官能团与附接至帕博利珠单抗Fc区的残基K248(EU编号)的DBCO官能团的反应形成。根据来自Ajinomoto的AJICAP技术，使用亲和肽系统向帕博利珠单抗添加DBCO官能团。组合物G具有2的药物-抗体比。
组合物H从组合物AB的叠氮化物官能团与附接至LZM-009Fc区的残基K248(EU编号)的DBCO官能团的反应形成。根据来自Ajinomoto的AJICAP技术，使用亲和肽系统向LZM-009添加DBCO官能团。组合物H具有1的药物-抗体比。
组合物I从组合物AB的叠氮化物官能团与附接至LZM-009Fc区的残基K248(EU编号)的DBCO官能团的反应形成。根据来自Ajinomoto的AJICAP技术，使用亲和肽系统向LZM-009添加DBCO官能团。组合物I具有2的药物-抗体比。
组合物J从组合物AB的叠氮化物官能团与附接至LZM-009Fc区的残基K288(EU编号)的DBCO官能团的反应形成。根据来自Ajinomoto的AJICAP技术，使用亲和肽系统向LZM-009添加DBCO官能团。组合物J具有1的药物-抗体比。
组合物K从组合物AB的叠氮化物官能团与附接至LZM-009Fc区的残基K288(EU编号)的DBCO官能团的反应形成。根据来自Ajinomoto的AJICAP技术，使用亲和肽系统向LZM-009添加DBCO官能团。组合物K具有2的药物-抗体比。
组合物N从组合物AB的叠氮化物官能团与附接至曲妥珠单抗Fc区的残基K248(EU编号)的DBCO官能团的反应形成。根据来自Ajinomoto的AJICAP技术，使用亲和肽系统将DBCO官能团添加至曲妥珠单抗。组合物N具有1.6的药物-抗体比。
组合物O从组合物AB的叠氮化物官能团与附接至曲妥珠单抗Fc区的残基K248(EU编号)的DBCO官能团的反应形成。根据来自Ajinomoto的AJICAP技术，使用亲和肽系统向曲妥珠单抗添加DBCO官能团。组合物O具有1的药物-抗体比。所有免疫细胞因子组合物的概述呈现在下文表中。
组合物概述
与细胞因子缀合的抗PD-1多肽
细胞程序性死亡蛋白1(又称PD-1和CD279)是细胞表面受体，通过抑制T细胞炎性活性，在下调免疫系统和促进自身耐受方面发挥作用。PD-1是免疫细胞抑制分子，在激活的B细胞、T细胞和髓样细胞上表达。PD-1表示免疫检查点，并经由促进淋巴结中抗原特异性T细胞凋亡(细胞程序性死亡)同时减少调节性T细胞凋亡的双重机制来防止自身免疫。PD-1是CD28/CTLA-4/ICOS共刺激受体家族的成员，递送影响T和B细胞免疫的负信号。PD-1在溶液中以及在细胞表面上均是单体的，这与CTLA-4和其他都是二硫键连接的同源二聚体的家族成员不同。通过PD-1抑制受体结合其配体PD-L1的信号传导抑制针对自身抗原和肿瘤的免疫应答，并在维持外周免疫耐受中发挥作用。PD-1和PD-L1之间的相互作用导致肿瘤浸润性淋巴细胞减少，T细胞受体介导的增殖降低，以及癌性细胞的免疫逃逸。非限制性的、示例性人类PD-1氨基酸序列是
(SEQ ID NO:120)。
本文提供了与缀合至一种或更多种细胞因子分子或其衍生物的细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)结合的多肽，诸如抗体和抗PD-1抗原结合片段。本文提供的缀合物对同时将与PD-1选择性结合的细胞因子和多肽递送至靶细胞诸如CD8+T效应(Teff)细胞有效。两种剂至同一细胞的该同时递送具有许多益处，包括改进的IL-2多肽选择性、增强IL-2的治疗潜力以及潜在减少来自施用IL-2疗法的副作用的风险。
本文提供的缀合物组合物利用接头将与PD-1结合的多肽附接至细胞因子，诸如IL-2多肽及其衍生物。在一些实施方案中，接头在特定残基或残基的特定子集处附接至与PD-1选择性结合的多肽和细胞因子的各自部分。在一些实施方案中，接头以位点选择性的方式附接至各自部分，使得缀合物的群体实质上均匀。这可以通过如本文提供的多种方式实现，包括通过向待缀合的部分位点选择性添加用于缀合反应的试剂，合成或以其他方式制备用于缀合反应的与期望的试剂缀合的部分，或这两种方法的组合。使用这些方法，可以精确地选择接头与各自部分的附接位点(诸如特定的氨基酸残基)。另外地，这些方法允许组合物采用多种接头，这些接头不限于融合蛋白所需的氨基酸残基。在一些实施方案中，接头选择和精确附接至部分的这种组合允许接头还进行调节部分之一的活性的功能，例如如果接头在与细胞因子受体相互作用的位置处附接至细胞因子。
抗PD-1多肽
在一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1多肽与PD-1特异性结合。如果抗PD-1多肽以比其与其他物质结合更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合，则抗体与靶选择性结合或优先结合。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管它可以包括)排他性结合。通常，但不一定，提及特异性结合意指优先结合，其中抗体或其抗原结合片段的亲和力比该抗体对不相关氨基酸序列的亲和力大至少2倍、大至少3倍、大至少4倍、大至少5倍、大至少6倍、大至少7倍、大至少8倍、大至少9倍、大至少10倍、大至少20倍、大至少30倍、大至少40倍、大至少50倍、大至少60倍、大至少70倍、大至少80倍、大至少90倍、大至少100倍或大至少1000倍。本公开内容的抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段可以阻断PD-1与配体(例如，PD-L1)的相互作用。
如本文使用的，术语“抗体”是指具有为抗原结合结构域或与抗原结合结构域同源的结合结构域的免疫球蛋白(Ig)、多肽或蛋白。该术语还包括“抗原结合片段”和如下文描述类似结合片段的其他可互换术语。天然抗体和天然免疫球蛋白(Ig)通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链和两条相同的重链组成。每条轻链通常通过一个共价二硫键与重链连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键(disulfidelinkage)数目不同。每条重和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每个重链在一端具有可变结构域(“VH”)，随后是一些恒定结构域(“CH”)。每条轻链在一端具有可变结构域(“VL”)并在其另一端具有恒定结构域(“CL”)：轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。特定的氨基酸残基被认为在轻链可变结构域和重链可变结构域之间形成界面。
在一些情况下，抗体或抗原结合片段包括分离的抗体或抗原结合片段、纯化的抗体或抗原结合片段、重组抗体或抗原结合片段、修饰的抗体或抗原结合片段、或合成的抗体或抗原结合片段。
本文中的抗体和抗原结合片段可以部分或全部合成产生。抗体或抗原结合片段可以是具有可以是抗原结合结构域或者可以与抗原结合结构域同源的结合结构域的多肽或蛋白。在一种情况下，抗体或抗原结合片段可以在适当的体内动物模型中产生并且然后分离和/或纯化。
取决于免疫球蛋白的重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白(Ig)可以指定为不同的类别。免疫球蛋白存在五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几个可以被进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。在一些情况下，Ig或其一部分可以是人类Ig。在一些情况下，CH3结构域可以来自免疫球蛋白。在一些情况下，抗体或抗原结合片段的链或部分、修饰的抗体或抗原结合片段或结合剂可以来自Ig。在这样的情况下，Ig可以是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM，或者由其衍生。在其中Ig是IgG的情况下，它可以是IgG的亚型，其中IgG的亚型可以包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3或IgG4。在一些情况下，CH3结构域可以来自选自由IgG、IgA、IgD、IgE和IgM组成的组或者由其衍生的免疫球蛋白。在一些实施方案中，本文描述的抗体或抗原结合片段包括IgG，或者由其衍生。在一些情况下，抗体或抗原结合片段包括IgG1，或者由其衍生。在一些情况下，抗体或抗原结合片段包括IgG4，或者由其衍生。在一些实施方案中，本文描述的抗体或抗原结合片段包括IgM，由其衍生，或者是IgM的单体形式。在一些实施方案中，本文描述的抗体或抗原结合片段包括IgE，或者由其衍生。在一些实施方案中，本文描述的抗体或抗原结合片段包括IgD，或者由其衍生。在一些实施方案中，本文描述的抗体或抗原结合片段包括IgA，或者由其衍生。
来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以基于其恒定结构域的氨基酸序列被指定为两种明显不同的类型之一，称为kappa(“κ”或“K”)或lambda(“λ”)。
抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。重链和轻链的可变区各自由被三个互补决定区(CDR)(也被称为高变区)连接的四个框架区(FR)组成。每个链中的CDR被FR极为接近地保持在一起，并且与来自另一个链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。存在至少两种用于确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列可变性(cross-species sequence variability)的方法(例如，Kabat等人,Sequences ofProteins of Immunological Interest,(第5版,1991,National Institutes of Health,Bethesda Md.(1991),第647-669页；以下简称“Kabat”)；和(2)基于抗原-抗体复合物晶体学研究的方法(Al-Iazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。如本文使用的，CDR可以指由任一方法或两种方法的组合定义的CDR。
关于抗体，术语“可变结构域”是指用于每个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的抗体的可变结构域。然而，可变性并不均匀地分布遍及抗体的可变结构域。而是，它集中在轻链可变结构域和重链可变结构域二者中称为高变区(也称为CDR)的三个区段中。可变结构域中更高度保守的部分被称为“框架区”或“FR”。未修饰的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR(FR1、FR2、FR3和FR4)，主要采用β-折叠构型，散布有三个CDR，该CDR形成连接β-折叠结构的环并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每个链中的CDR被FR极为接近地保持在一起，并且与来自另一个链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见，Kabat)。
当本文使用时术语“高变区”和“CDR”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。CDR包含来自三个序列区的以互补方式与抗原结合的氨基酸残基，并且对于VH链和VL链中的每一条被称为CDR1、CDR2和CDR3。根据Kabat，在轻链可变结构域中，CDR通常对应于大约残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)，并且在重链可变结构域中，CDR通常对应于大约残基31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3)。应当理解，不同抗体的CDR可能包含插入，因此氨基酸编号可能不同。Kabat编号系统用编号方案来说明这样的插入，该编号方案利用附接至特定残基的字母(例如，轻链中的CDRL1的27A、27B、27C、27D、27E和27F)以反映不同抗体之间编号中的任何插入。可选地，根据Chothia和Lesk(J.Mol.Biol.,196:901-917(1987))，在轻链可变结构域中，CDR通常对应于大约残基26-32(CDRL1)、50-52(CDRL2)和91-96(CDRL3)，并且在重链可变结构域中，CDR通常对应于大约残基26-32(CDRH1)、53-55(CDRH2)和96-101(CDRH3)。
如本文使用的，“框架区”、“FW”或“FR”是指形成抗原结合口袋或沟槽一部分的框架氨基酸残基。在一些实施方案中，框架残基形成是抗原结合口袋或沟槽的一部分的环，并且环中的氨基酸残基可以接触或可以不接触抗原。框架区通常包括CDR之间的区域。根据Kabat，在轻链可变结构域中，FR通常对应于大约残基0-23(FRL1)、35-49(FRL2)、57-88(FRL3)和98-109，而在重链可变结构域中，FR通常对应于大约残基0-30(FRH1)、36-49(FRH2)、66-94(FRH3)和103-133。如以上对轻链的Kabat编号所讨论的，重链也以类似的方式说明插入(例如，重链中CDRH1的35A、35B)。可选地，根据Chothia和Lesk，同上，在轻链可变结构域中，FR通常对应于大约残基0-25(FRL1)、33-49(FRL2)、53-90(FRL3)和97-109(FRL4)，而在重链可变结构域中，FR通常对应于大约残基0-25(FRH1)、33-52(FRH2)、56-95(FRH3)和102-113(FRH4)。FR的环氨基酸可以通过检查抗体重链和/或抗体轻链的三维结构来评价和确定。可以分析三维结构的溶剂可及的氨基酸位置，因为这样的位置可能形成环和/或在抗体可变结构域中提供抗原接触。一些溶剂可及的位置可以耐受氨基酸序列多样性，并且其他(例如，结构位置)通常不太多样化。抗体可变结构域的三维结构可以从晶体结构或蛋白建模中导出。
在本公开内容中，根据习惯，根据需要使用以下缩写(在括号中)：重链(H链)、轻链(L链)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、互补决定区(CDR)、第一互补决定区(CDR1)、第二互补决定区(CDR2)、第三互决确定区(CDR3)、重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VH CDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)、轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)和轻链第三互补决定区(VL CDR3)。
术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区域。“Fc区”可以是天然序列Fc区或变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能不同，但人类IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。Fc区域的残基编号与Kabat的EU索引的编号相同。免疫球蛋白的Fc区通常包括两个恒定结构域CH2和CH3。
本公开内容中有用的“抗体”涵盖但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、异源缀合物抗体、人源化抗体、人类抗体、接枝抗体、去免疫抗体、其突变体、其融合物、其免疫缀合物、其抗原结合片段和/或免疫球蛋白分子的包含所需特异性的抗原识别位点的任何其他修饰的构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。在本文提供的方法和缀合物的某些实施方案中，抗体需要Fc区来使抗体和蛋白之间的接头能够附接(例如，使用亲和肽附接接头，诸如在AJICAPTM技术中)。
在一些情况下，抗体是单克隆抗体。如本文使用的，“单克隆抗体”是指从实质上同质性的抗体群体中获得的抗体，即，构成该群体的单个抗体除了可能以少量存在的天然发生的突变之外是相同的。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇(表位)。修饰语“单克隆”指示抗体的特征在于自实质上同源的抗体群体获得，且不应理解为需要通过任何特定方法来产生该抗体。
在一些情况下，抗体是人源化抗体。如本文使用的，“人源化”抗体是指包含最少的衍生自非人类免疫球蛋白的序列的特定嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段的非人类(例如，鼠)抗体的形式。人源化抗体的大部分是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基被来自非人类物种(诸如小鼠、大鼠或兔)(供体抗体)的具有所期望的特异性、亲和力和生物活性的CDR的残基替代。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被对应的非人类残基替代。此外，人源化抗体可以包含既不存在于受体抗体中也不存在于输入的CDR或框架序列中但被包括在内以进一步改进和优化抗体性能的残基。通常，人源化抗体实质上包含至少一个并且通常两个可变结构域的全部，其中全部或实质上全部CDR区对应于非人类免疫球蛋白的CDR区，并且全部或大体上全部FR区是人类免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白(通常是人类免疫球蛋白)恒定区或结构域(Fc)的至少一部分。抗体可以具有如例如WO 99/58572中描述修饰的Fc区。其他形式的人源化抗体具有相对于初始抗体被改变的一个或更多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个)，这些CDR也被称为“衍生自”来自初始抗体的一个或更多个CDR的一个或更多个CDR。
如果需要，可以评价本文描述的抗体或抗原结合片段的免疫原性，并且根据需要对其进行去免疫(即，通过改变一个或更多个T细胞表位使抗体的免疫反应性更少)。如本文使用的，“去免疫抗体”意指，抗体序列中的一个或更多个T细胞表位已经被修饰，使得与未去免疫的抗体相比，向受试者施用抗体之后的T细胞响应减少。本文描述的抗体和抗原结合片段中存在的免疫原性和T细胞表位的分析可以经由使用软件和特定数据库进行。示例性软件和数据库包括由英国剑桥的Antitope开发的iTopeTM。iTopeTM是用于分析与人类MHCII类等位基因的肽结合的计算机模拟技术。iTopeTM软件预测与人类MHC II类等位基因的肽结合，并且从而为这样的“潜在T细胞表位”的定位提供初步筛选。iTopeTM软件预测肽的氨基酸侧链和34个人类MHC II类等位基因结合沟槽内的特异性结合口袋之间的有利相互作用。关键结合残基的定位是通过计算机模拟产生跨越测试抗体可变区序列重叠一个氨基酸的9聚体肽实现的。每种9聚体肽可以针对34种MHC II类同种异型中的每一种进行测试，并且基于它们与MHC II类结合沟槽的潜在“适合度”和相互作用进行评分。对>50％的MHC II类等位基因产生高平均结合评分(在iTopeTM评分函数中>0.55)的肽被认为是潜在的T细胞表位。在这样的区域中，分析MHC II类沟槽内肽结合的核心9氨基酸序列，以确定MHC II类口袋残基(P1、P4、P6、P7和P9)和可能的T细胞受体(TCR)接触残基(P-l、P2、P3、P5、P8)。在鉴定任何T细胞表位之后，可以引入氨基酸残基改变、取代、添加和/或缺失来去除鉴定的T细胞表位。可以进行这样的改变，以保持抗体的结构和功能，同时仍然去除已鉴定的表位。示例性改变可以包括但不限于保守的氨基酸改变。
抗体可以是人类抗体。如本文使用的，“人类抗体”意指具有与由人类产生的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或使用用于制备人类抗体的任何合适技术制备的抗体。人类抗体的该定义包括包含至少一种人类重链多肽或至少一种人类轻链多肽的抗体。一个这样的实例是包含鼠轻链多肽和人类重链多肽的抗体。在一种实施方案中，人类抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人类抗体。人类抗体也可以通过将人类免疫球蛋白基因座引入内源免疫球蛋白基因部分或完全失活的转基因动物(例如，小鼠)来制备。可选地，人类抗体可以通过永生化产生针对靶抗原的抗体的人类B淋巴细胞来制备(这样的B淋巴细胞可以从个体中回收或者可以已经在体外免疫)。
本文中的任何抗体都可以是双特异性的。双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体，并且可以使用本文公开的抗体制备。传统上，双特异性抗体的重组产生是基于两条免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条重链具有不同的特异性。双特异性抗体可以由一臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。这种不对称结构(仅在双特异性分子的一半中有免疫球蛋白轻链)有助于从不需要的免疫球蛋白链组合中分离期望的双特异性化合物。
根据制备双特异性抗体的一种方法，将具有期望的结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合可以与免疫球蛋白重链恒定结构域，包括铰链区、CH2区和CH3区的至少一部分一起。包含轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)可以存在于融合物的至少一个中。将编码免疫球蛋白重链融合体和(如果期望)免疫球蛋白轻链的DNA插入到单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。当构建中使用的三条多肽链的不相等比率提供最佳产率时，这为在实施方案中调整三种多肽片段的相互比例方面提供了大的灵活性。然而，当至少两条多肽链以相等比率的表达导致高产率或当该比率没有特别的意义时，可以将两条或所有三条多肽链的编码序列插入在一个表达载体中。
在一些情况下，本文中的抗体是嵌合抗体。非人类(例如，鼠)的“嵌合”形式抗体包括嵌合抗体，其包含最少的衍生自非人类Ig的序列。嵌合抗体的大部分是鼠抗体，其中免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人类免疫球蛋白的恒定区，被插入代替鼠Fc。嵌合或杂合抗体也可以使用合适的合成蛋白化学方法(包括涉及交联剂的方法)体外制备。例如，免疫毒素可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建。用于此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇酯(iminothiolate)和4-巯基丁嘧啶甲酯。
本文提供了抗体及其抗原结合片段、修饰的抗体及其抗原结合片段以及与一种或更多种靶抗原上的一种或更多种表位特异性结合的结合剂。在一种情况下，结合剂与单个抗原上的表位选择性结合。在另一种情况下，结合剂是二价的，并且与单个抗原上的两个不同的表位选择性结合，或者与两个不同抗原上的两个不同的表位选择性结合。在另一种情况下，结合剂是多价的(即，三价，四价等)，并且结合剂与单个抗原上的三个或更多个不同表位结合或与两个或更多(多个)抗原上的三个或更多个不同表位结合。
本文还设想了任何抗体的抗原结合片段。术语“抗体的抗原结合部分”、“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”、“抗体片段”或“抗体的功能片段”在本文中可互换使用，以指抗体的保留与抗原特异性结合能力的一个或更多个片段。代表性抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)2、双特异性F(ab’)2、三特异性F(ab’)2、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)、dsFv、双特异性scFv、可变重结构域、可变轻结构域、可变NAR结构域、双特异性scFv、微抗体、双抗体、双特异性双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、大抗体(maxibody)、骆驼科抗体、VHH、微抗体、胞内抗体、包含抗体部分(例如，结构域抗体)的融合蛋白、单链结合多肽、scFv-Fc、Fab-Fc、双特异性T细胞衔接物(BiTE；作为单个多肽链产生的两个scFv，其中每个scFv包含本文描述的CDR的组合或VL/VL的组合的氨基酸序列)、四价串联双抗体(TandAb；作为以头至尾排列的非共价同源二聚体折叠体产生的抗体片段，例如，包含scFv的TandAb，其中scFv包含本文描述的CDR的组合或VL/VL的组合的氨基酸序列)、双亲和重新靶向抗体(DART；由稳定的链间二硫键连接的不同scFv)、双特异性抗体(bscAb；经由甘氨酸-丝氨酸接头连接的两个单链Fv片段)、单结构域抗体(sdAb)，融合蛋白，双特异性二硫化物稳定的Fv抗体片段(dsFv-dsFv’；通过柔性接头肽连接的两种不同的二硫化物稳定的Fv抗体片段)。在本发明的某些实施方案中，优选全长抗体(例如，抗原结合片段和Fc区)。
包含两种共价连接的抗体或抗体的抗原结合片段的异源缀合物多肽也在本公开内容的范围内。合适的接头可以用于多聚化结合剂。连接肽的非限制性实例包括但不限于(GS)n(SEQ ID NO:24)、(GGS)n(SEQ ID NO:25)、(GGGS)n(SEQ ID NO:26)、(GGSG)n(SEQ IDNO:27)或(GGSGG)n(SEQ ID NO:28)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:29)，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。例如，连接肽可以是(GGGGS)3(SEQ ID NO:30)或(GGGGS)4(SEQ ID NO:31)。在一些实施方案中，连接肽在一个可变区的羧基末端和另一个可变区的氨基末端之间桥接大约3.5nm。已经设计并使用了其他序列的接头。接头又可以被修饰用于另外的功能，诸如药物的附接或固体支持物的附接。
如本文使用的，术语“亲合力”是指两种或更多种剂的复合物在稀释之后对解离的抗性。表观亲和力可以通过方法诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)或任何其他合适的技术来确定。亲合力可以通过方法诸如Scatchard分析或任何其他合适的技术来确定。
如本文使用的，术语“亲和力(affinity)”是指两种剂可逆结合的平衡常数并表示为KD。抗体或抗原结合片段的结合亲和力(KD)可以小于500nM、475nM、450nM、425nM、400nM、375nM、350nM、325nM、300nM、275nM、250nM、225nM、200nM、175nM、150nM、125nM、100nM、90nM、80nM、70nM、50nM、50nM、49nM、48nM、47nM、46nM、45nM、44nM、43nM、42nM、41nM、40nM、39nM、38nM、37nM、36nM、35nM、34nM、33nM、32nM、31nM、30nM、29nM、28nM、27nM、26nM、25nM、24nM、23nM、22nM、21nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、990pM、980pM、970pM、960pM、950pM、940pM、930pM、920pM、910pM、900pM、890pM、880pM、870pM、860pM、850pM、840pM、830pM、820pM、810pM、800pM、790pM、780pM、770pM、760pM、750pM、740pM、730pM、720pM、710pM、700pM、690pM、680pM、670pM、660pM、650pM、640pM、630pM、620pM、610pM、600pM、590pM、580pM、570pM、560pM、550pM、540pM、530pM、520pM、510pM、500pM、490pM、480pM、470pM、460pM、450pM、440pM、430pM、420pM、410pM、400pM、390pM、380pM、370pM、360pM、350pM、340pM、330pM、320pM、310pM、300pM、290pM、280pM、270pM、260pM、250pM、240pM、230pM、220pM、210pM、200pM、190pM、180pM、170pM或其间的任何整数。结合亲和力可以使用以下来确定：表面等离子体共振(SPR)、生物传感器、闪烁接近测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、ORIGEN免疫测定(IGEN)、荧光猝灭、荧光转移、酵母展示或其任何组合。结合亲和力也可以使用合适的生物测定法进行筛选。
如本文使用的，术语“亲合力”是指两种或更多种剂的复合物在稀释之后对解离的抗性。表观亲和力可以通过方法诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的任何其他技术来确定。亲合力可以通过方法诸如Scatchard分析或本领域技术人员熟悉的任何其他技术来确定。
本文还提供了亲和成熟抗体。以下方法可以用于调整抗体的亲和力并且用于表征CDR。一种表征抗体CDR和/或改变(诸如改进)多肽(诸如抗体)结合亲和力的方法被称为“文库扫描诱变”。通常，文库扫描诱变如下工作。CDR中的一个或更多个氨基酸位置被两个或更多个(诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸替代。这产生了克隆的小文库(在一些实施方案中，用于被分析的每个氨基酸位置的一个)，每个具有两个或更多个成员的复杂性(如果两个或更多个氨基酸在每个位置处被取代)。通常，文库还包括包含天然(未取代)氨基酸的克隆。可以筛选来自每个文库的少量克隆，例如，约20-80个克隆(取决于文库的复杂性)对靶多肽(或其他结合靶)的结合特异性或亲和力，并且鉴定具有增加、相同、降低或没有结合的候选物。结合亲和力可以使用Biacore表面等离子体共振分析来确定，该分析检测到约2倍或更大的结合亲和力差异。
在一些情况下，抗体或抗原结合片段是双特异性的或多特异性的，并且可以与多于一种抗原特异性结合。在一些情况下，这样的双特异性或多特异性抗体或抗原结合片段可以与2种或更多种不同的抗原特异性结合。在一些情况下，双特异性抗体或抗原结合片段可以是二价抗体或抗原结合片段。在一些情况下，多特异性抗体或抗原结合片段可以是二价抗体或抗原结合片段、三价抗体或抗原结合片段或四价抗体或抗原结合片段。
本文描述的抗体或抗原结合片段可以是分离的、纯化的、重组的或合成的。
本文描述的抗体可以通过任何合适的方法制备。抗体通常可以大量产生，特别地当利用高水平表达载体时。
在一种实施方案中，本公开内容的抗PD1抗体或抗PD1抗原结合片段包含本文描述的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的组合。在另一种实施方案中，本公开内容的抗PD1抗体或抗PD1抗原结合片段包含本文描述的互补决定区(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3)的组合。在一种实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或抗PD-1抗原结合片段包括修饰的替雷利珠单抗(Tislelizumab)、百泽安(Baizean)、0KVO411B3N、BGB-A317、hu317-1/IgG4mt2、信迪利单抗(Sintilimab)、Tyvyt、IBI-308、特瑞普利单抗(Toripalimab)、TeRuiPuLi、Terepril、Tuoyi、JS-001、TAB-001、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)、HR-301210、INCSHR-01210、SHR-1210、Cemiplimab、Cemiplimab-rwlc、6QVL057INT、H4H7798N、REGN-2810、SAR-439684、Lambrolizumab、帕博利珠单抗、/>MK-3475、SCH-900475、h409A11、纳武单抗、纳武单抗BMS、/>BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、Prolgolimab、Forteca、BCD-100、派安普利单抗(Penpulimab)、AK-105、赛帕利单抗(Zimberelimab)、AB-122、GLS-010、WBP-3055、巴替利单抗(Balstilimab)、1Q2QT5M7EO、AGEN-2034、AGEN-2034w、Genolimzumab、Geptanolimab、APL-501、CBT-501、GB-226、多塔利单抗(Dostarlimab)、ANB-011、GSK-4057190A、P0GVQ9A4S5、TSR-042、WBP-285、斯鲁利单抗(Serplulimab)、HLX-10、CS-1003、瑞弗利单抗(Retifanlimab)、2Y3T5IF01Z、INCMGA-00012、INCMGA-0012、MGA-012、萨善利单抗(Sasanlimab)、LZZ0IC2EWP、PF-06801591、RN-888、司他利珠单抗(Spartalizumab)、NVP-LZV-184、PDR-001、QOG25L6Z8Z、瑞拉利单抗(Relatlimab)/纳武单抗、BMS-986213、Cetrelimab、JNJ-3283、JNJ-63723283、LYK98WP91F、Tebotelimab、MGD-013、BCD-217、BAT-1306、HX-008、MEDI-5752、JTX-4014、卡度尼利单抗(Cadonilimab)、AK-104、BI-754091、Pidilizumab、CT-011、MDV-9300、YBL-006、AMG-256、RG-6279、RO-7284755、BH-2950、IBI-315、RG-6139、RO-7247669、ONO-4685、AK-112、609-A、LY-3434172、T-3011、MAX-10181、AMG-404、IBI-318、MGD-019、INCB-086550、ONCR-177、LY-3462817、RG-7769、RO-7121661、F-520、XmAb-23104、Pd-1-pik、SG-001、S-95016、Sym-021、LZM-009、Budigalimab、6VDO4TY3OO、ABBV-181、PR-1648817、CC-90006、XmAb-20717、2661380、AMP-224、B7-DCIg、EMB-02、ANB-030、PRS-332、[89Zr]Deferoxamide-帕博利珠单抗、89Zr-Df-帕博利珠单抗、[89Zr]Df-帕博利珠单抗、STI-1110、STI-A1110、CX-188、mPD-1Pb-Tx、MCLA-134、244C8、ENUM 224C8、ENUM C8、388D4、ENUM 388D4、ENUM D4、MEDI0680或AMP-514。
在一种实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或抗PD-1抗原结合片段包括修饰的替雷利珠单抗、信迪利单抗、特瑞普利单抗、Terepril、卡瑞利珠单抗、Cemiplimab、帕博利珠单抗纳武单抗、Prolgolimab、派安普利单抗、Zimberelimab、巴替利单抗、Genolimzumab、Geptanolimab、多塔利单抗、斯鲁利单抗、瑞弗利单抗、萨善利单抗、司他利珠单抗、Cetrelimab、Tebotelimab、卡度尼利单抗、APidilizumab、LZM-009或Budigalimab。
在一些实施方案中，抗PD-1多肽是纳武单抗、帕博利珠单抗、LZM-009、Dostarlimab、信迪利单抗、司他利珠单抗、替雷利珠单抗或Cemiplimab。在一些实施方案中，抗PD-1多肽是Dostarlimab、信迪利单抗、司他利珠单抗或替雷利珠单抗。在一些实施方案中，抗PD-1多肽是纳武单抗、帕博利珠单抗、LZM-009或Cemiplimab。
在一些实施方案中，抗PD-1多肽是修饰的帕博利珠单抗。在一些实施方案中，抗PD-1多肽用mAB3修饰。在一些实施方案中，抗PD-1多肽用mAB4修饰。
设想当使用抗体的名称时，也涵盖与所示抗体共有相同氨基酸序列的本文命名抗体的通用或生物仿制药形式。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是以下的生物仿制药：替雷利珠单抗、信迪利单抗、特瑞普利单抗、Terepril、Cemiplimab、帕博利珠单抗、纳武单抗、Prolgolimab、派安普利单抗、Zimberelimab、巴替利单抗、Genolimzumab、Geptanolimab、多塔利单抗、斯鲁利单抗、瑞弗利单抗、萨善利单抗、司他利珠单抗、Cetrelimab、Tebotelimab、卡度尼利单抗、Pidilizumab、LZM-009或Budigalimab。在一些实施方案中，抗PD-1抗体是本文提供的任何一种抗体的生物仿制药。
表1提供了可以被修饰以制备抗PD-1免疫缀合物的示例性抗PD-1多肽(例如，抗PD-1抗体)和抗PD-1抗原结合片段的序列。表1还示出了提供可以用于修饰的抗PD-1免疫缀合物中的CDR的组合。本文提及抗PD-1多肽可选地可以指抗PD-1抗原结合片段。
表1
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抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段可以包含具有SEQ ID NO:32、34、36、38、40、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76和78中任何一个的氨基酸序列的VH。抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段可以包含具有SEQ ID NO:33、35、37、39、41、47、49、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77和79中任何一个的氨基酸序列的VH。
在一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:32的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:33的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:34的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:35的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:36的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:47的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ IDNO:48的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:49的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:50的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQID NO:52的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:53的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VH和具有SEQ IDNO:55的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:57的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:60的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VL。
在一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VH CHR1、具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH CHR2、具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VH CHR3、具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VL CHR1、具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL CHR2和具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VL CHR3。在一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VH CHR1、具有SEQ IDNO:87的氨基酸序列的VH CHR2、具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VH CHR3、具有SEQ IDNO:89的氨基酸序列的VL CHR1、具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VL CHR2和具有SEQ IDNO:91的氨基酸序列的VL CHR3。在一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:92的氨基酸序列的VH CHR1、具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH CHR2、具有SEQ ID NO:94的氨基酸序列的VH CHR3、具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VL CHR1、具有SEQ ID NO:96的氨基酸序列的VL CHR2和具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VL CHR3。在一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VHCHR1、具有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的VH CHR2、具有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VHCHR3、具有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的VL CHR1、具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的VLCHR2和具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的VL CHR3。
在一种情况下，抗PD-1多肽包含融合蛋白。这样的融合蛋白可以是例如在CHO-K1细胞中表达的包含经由人类IgG4的铰链-CH2-CH3 Fc结构域融合的细胞程序性死亡1(PD-1)的胞外结构域(ECD)和肿瘤坏死因子(配体)超家族成员4(TNFSF4或OX40L)的ECD的双侧Fc融合蛋白，其中融合蛋白具有SEQ ID NO:104的示例性氨基酸序列。
本文还提供了一种抗HER2抗体。如本文提供的，抗HER2抗体可以与IL-2多肽缀合。在一些实施方案中，抗HER2抗体是曲妥珠单抗(赫赛汀，Roche，Herclon，RG597，RO452317)。曲妥珠单抗具有以下的VH序列：
曲妥珠单抗的VL序列是
对Fc区的修饰
本文公开了抗PD-1多肽，其中抗PD-1多肽包含Fc区，并且Fc区包含至少一个共价连接的化学接头。在一些实施方案中，化学接头共价附接至天冬酰胺、谷氨酰胺、半胱氨酸或赖氨酸残基。在一些实施方案中，化学接头共价附接至赖氨酸或半胱氨酸残基。在一些实施方案中，化学接头共价附接至赖氨酸残基。在一些实施方案中，化学接头共价附接至抗PD-1多肽的恒定区。在一些实施方案中，化学接头共价附接至抗PD-1多肽的恒定区。
在一些实施方案中，抗PD-1多肽包含Fc区。在一些实施方案中，Fc区是IgG Fc区、IgA Fc区、IgD Fc区、IgM Fc区或IgE Fc区。在一些实施方案中，Fc区是IgG Fc区、IgAFc区或IgD Fc区。在一些实施方案中，Fc区是人类Fc区。在一些实施方案中，Fc区是人源化的Fc区。在一些实施方案中，Fc区是IgG Fc区。在一些情况下，IgG Fc区是IgG1 Fc区、IgG2aFc区或IgG4 Fc区。在一些情况下，IgG Fc区是IgG1 Fc区、IgG2a Fc区或IgG4 Fc区。
一个或更多个突变可以被引入在Fc区域中，以减少抗体或抗原结合片段的Fc介导的效应子功能，诸如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体功能。在一些情况下，修饰的Fc包括包含S228P Fc突变的人源化IgG4κ同种型。在一些情况下，修饰的Fc包含人类IgG1κ，其中重链CH2结构域用以下三重突变工程化，诸如，例如：(a)L238P、L239E和P335S；或(2)K248；K288和K317。
在一些实施方案中，Fc区具有与如SEQ ID NO:105中列出的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列
其中Xaa可以是任何天然存在的氨基酸)。
在一些实施方案中，Fc区包含使得Fc区易于在特定残基处修饰或缀合的一个或更多个突变，诸如通过在SEQ ID NO:105中不含半胱氨酸的位置处掺入半胱氨酸残基。可选地，Fc区可以被修饰以掺入组成缀合手柄的修饰的天然氨基酸或非天然氨基酸，诸如通过接头与修饰的天然氨基酸或非天然氨基酸连接的缀合手柄。在一些实施方案中，Fc区不包含任何促进接头附接至另外的细胞因子(例如、IL-2、IL-7或IL-18多肽)的突变。在一些实施方案中，化学接头附接至如SEQ ID NO:105中列出的天然残基。在一些实施方案中，化学接头附接至SEQ ID NO:105的天然赖氨酸残基。
在一些实施方案中，化学接头可以共价附接至抗PD-1多肽的Fc区的一个氨基酸残基。在一些实施方案中，化学接头共价附接至Fc区的非末端残基。在一些实施方案中，非末端残基位于抗PD-1多肽的CH1区、CH2区或CH3区。在一些实施方案中，非末端残基位于抗PD-1多肽的CH2区。
在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:105的位置10-90中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ SEQ ID NO:105的位置10-20、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、1-80、10-90、10-100、10-110、10-120、10-130、10-140、10-150、10-160、10-170、10-180、10-190或10-200中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:105的位置10-30、50-70或80-100中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:105的位置20-40、65-85或90-110中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:105的位置15-26、55-65或85-90中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:105的位置25-35、70-80或95-105中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:105的位置30、32、72、74、79或101中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:105的位置K30、K32、K72、K74、Q79或K101中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:105的氨基酸残基30处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:105的氨基酸残基32处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:105的氨基酸残基72处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:105的氨基酸残基74处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:105的氨基酸残基79处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ IDNO:105的氨基酸残基101处附接至Fc区。
在一些实施方案中，化学接头共价附接在选择性结合癌症或炎性相关抗原的多肽(例如，抗PD-1抗体)的使得该多肽的功能被维持(例如，而不使多肽变性)的氨基酸残基处。例如，当多肽是抗体诸如人类IgG(例如，人类IgG1)时，暴露的赖氨酸残基、暴露的谷氨酰胺残基和暴露的酪氨酸残基存在于以下位置处(参考网站imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html，按EU编号)。示例性暴露的赖氨酸残基：CH2结构域(位置246、位置248、位置274、位置288、位置290、位置317、位置320、位置322和位置338)CH3结构域(位置360、位置414和位置439)。示例性暴露的谷氨酰胺残基：CH2结构域(位置295)。示例性暴露的酪氨酸残基：CH2结构域(位置278、位置296和位置300)CH3结构域(位置436)。
人类IgG，诸如人类IgG1，也可以在以上列出的位置中的任何一个处用赖氨酸、谷氨酰胺或酪氨酸残基修饰，以便提供理想地暴露于表面用于随后修饰的残基。
在一些实施方案中，化学接头共价附接在抗PD-1抗体的恒定区中的氨基酸残基处。在一些实施方案中，化学接头共价附接在CH1区、CH2区或CH3区中的氨基酸残基处。在一些实施方案中，化学接头共价附接在CH2区中的氨基酸残基处。在一些实施方案中，化学接头可以共价附接至选自人类IgG Fc中按照EU编号的残基的以下组的一个残基：氨基酸残基1-478、氨基酸残基2-478、氨基酸残基1-477、氨基酸残基2-477、氨基酸残基10-467、氨基酸残基30-447、氨基酸残基50-427、氨基酸残基100-377、氨基酸残基150-327、氨基酸残基200-327、氨基酸残基240-327和氨基酸残基240-320。
在一些实施方案中，化学接头共价附接至人类IgG Fc区的一个赖氨酸或谷氨酰胺残基。在一些实施方案中，化学接头共价附接在抗PD-1多肽的Fc区的Lys 246处，其中氨基酸残基位置号是基于Eu编号。在一些实施方案中，化学接头共价附接在抗PD-1多肽的Fc区的Lys 248处，其中氨基酸残基位置号是基于Eu编号。在一些实施方案中，化学接头共价附接在抗PD-1多肽的Fc区的Lys 288处，其中氨基酸残基位置号是基于Eu编号。在一些实施方案中，化学接头共价附接在抗PD-1多肽的Fc区的Lys 290处，其中氨基酸残基位置号是基于Eu编号。在一些实施方案中，化学接头共价附接在抗体多肽的Fc区的Gln 295处，其中氨基酸残基位置号是基于Eu编号。在一些实施方案中，化学接头共价附接在抗PD-1多肽的Lys317处，其中氨基酸残基位置号是基于Eu编号。
在一些实施方案中，化学接头可以共价附接至选自氨基酸残基子集的氨基酸残基。在一些实施方案中，该子集包含抗PD-1多肽的Fc区的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸残基。在一些实施方案中，化学接头可以共价附接至抗PD-1多肽的Fc区的两个赖氨酸残基之一。
在一些实施方案中，抗PD-1多肽将包含共价附接至抗PD-1多肽的Fc区的两个接头。在一些实施方案中，两个接头中的每一个将共价附接至抗PD1多肽的不同重链。在一些实施方案中，两个接头中的每一个将在相同的残基位置处共价附接至抗PD-1多肽的不同重链。在一些实施方案中，两个接头中的每一个将在不同的残基位置处共价附接至抗PD-1多肽的不同重链。当两个接头共价附接至不同的残基位置时，本文提供的残基位置的任何组合都可以组合地使用。
在一些实施方案中，第一化学接头共价附接在抗PD-1多肽的第一Fc区的Lys 248处，并且第二化学接头共价附接在抗PD-1多肽的第二Fc区的Lys 288处，其中残基位置号是基于Eu编号。在一些实施方案中，第一化学接头共价附接在抗PD-1多肽的第一Fc区的Lys246处，并且第二化学接头共价附接在抗PD-1多肽的第二Fc区的Lys 288处，其中残基位置号是基于Eu编号。在一些实施方案中，第一化学接头共价附接在抗PD-1多肽的第一Fc区的Lys 248处，并且第二化学接头共价附接在抗PD-1多肽的第二Fc区的Lys 317处，其中残基位置编号是基于Eu编号。在一些实施方案中，第一化学接头共价附接在抗PD-1多肽的第一Fc区的Lys 246处，并且第二化学接头共价附接在抗PD-1多肽的第二Fc区的Lys 317处，其中残基位置编号是基于Eu编号。在一些实施方案中，第一化学接头共价附接在抗PD-1多肽的第一Fc区的Lys 288处，并且第二化学接头共价附接在抗PD-1多肽的第二Fc区的Lys 317处，其中残基位置编号是基于Eu编号。
修饰Fc区的方法
本文还提供了制备与细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)选择性结合的多肽的修饰的Fc区的方法，诸如用于将接头、缀合手柄或细胞因子附接至与PD-1选择性结合的多肽。用于与PD-1结合的抗体或其他多肽的Fc区的位点特异性修饰的多种方法是本领域已知的。
用被配置为将接头位点特异性附接至抗体的亲和肽的修饰
在一些实施方案中，Fc区被修饰以掺入接头、缀合手柄或其组合。在一些实施方案中，修饰通过使Fc区与携带有效载荷的亲和肽接触来进行，所述亲和肽被配置为将接头或其他基团附接至Fc区，诸如在Fc区的特定残基处。在一些实施方案中，接头使用与Fc区残基形成键的反应性基团(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯)附接。在一些实施方案中，亲和肽包含可裂解接头。可裂解接头被配置在亲和肽上，使得在接头或其他基团附接至Fc区之后，亲和肽可以被去除，仅留下附接至Fc区的期望的接头或其他基团。然后，接头或其他基团可以进一步用于将另外的基团诸如细胞因子或附接至细胞因子的接头添加附接至Fc区。
这样的亲和肽的非限制性实例至少可以见于PCT公布第WO2018199337A1号、PCT公布第WO2019240288A1号、PCT公布第WO2019240287A1号和PCT公布第WO2020090979A1号中，它们中的每一个都通过引用并入，如同以其整体在本文中列出一样。在一些实施方案中，亲和肽是已经被修饰以递送接头/缀合手柄有效载荷到抗体Fc区的一个或更多个特定残基的肽。在一些实施方案中，亲和肽对选自以下中的肽具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性(1)
或在N-末端处被截短一个、两个、三个、四个或五个残基的对应肽。下文示出了具有能够将有效载荷附接至如本文提供的抗体的残基K248的可裂解接头和缀合手柄有效载荷的示例性亲和肽(如Matsuda等人,“Chemical Site-Specific Conjugation Platform to Improve the Pharmacokineticsand Therapeutic Index of Antibody-Drug Conjugates,”Mol.Pharmaceutics 2021,18,11,4058-4066中报告的)。
靶向Fc区的可选残基的可选亲和肽在以上引用的关于AJICAPTM技术的参考文献中描述，并且这样的亲和肽可以用于将期望的官能团附接至Fc区的可选残基(例如，K246、K288等)。例如，以上亲和肽的二硫化物基团可以被硫酯替代，以提供巯基保护基团作为连接基团的可裂解部分(例如，亲和肽的相关部分将具有以下结构：或下文讨论的另一种可裂解接头)。
本公开内容的亲和肽可以包含可裂解接头。在一些实施方案中，亲和肽的可裂解接头将亲和肽连接至将要附接至Fc区的基团，并且被配置为使得肽可以在组成接头或缀合手柄的基团被附接之后被裂解。在一些实施方案中，可裂解接头是二价基团。在一些实施方案中，可裂解接头可以包括硫酯基团、酯基团、硫烷基团；甲亚胺基团；氧乙烯基(oxyvinyl)基团；硫代丙酸酯基团；乙烷-1,2-二醇基团；(咪唑-1-基)甲-1-酮基团；硒代醚基团；甲硅烷基醚基团；二-氧基硅烷(di-oxysilane)基团；醚基团；二-氧基甲烷(di-oxymethane)基团；四氧螺[5.5]十一烷基团；乙酰胺乙基亚磷酰胺基团；双(甲硫基)-吡唑并吡唑-二酮基团；甲酸2-氧代-2-苯乙酯基团；4-氧苄基氨基甲酸酯基团；2-(4-羟基-氧苯基)吖嗪基)苯甲酸基团；4-氨基-2-(2-氨基-2-氧乙基)-4-氧代丁-2-烯酸基团；2-(2-亚甲基肼基)吡啶基团；N’-亚甲基甲酰肼基团；或异丙基氨基甲酸酯基团，其中的任何一个是未被取代的或被取代的。可裂解接头与亲和肽的组成和附接点以及相关的使用方法至少在PCT公布第WO2018199337A1号、PCT公布第WO2019240288A1号、PCT公布第WO2019240287A1号和PCT公布第WO2020090979A1号中描述。
在一些实施方案中，可裂解接头是：
其中：
-A或B中的一个是对接头的附接点，而A或B中的另一个是对亲和肽的附接点；
-每个R2a独立地是H或任选地取代的烃基；
-每个R2b独立地是H或任选地取代的烃基；
-R2c是H或任选地取代的烃基；
-J是亚甲基、N、S、Si或O原子；并且
-r是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
亲和肽包含被配置为能够使接头/缀合手柄共价附接至Fc区的反应性基团。在一些实施方案中，反应性基团对Fc区的被掺入以促进接头的附接的特定氨基酸残基诸如赖氨酸残基、酪氨酸残基、丝氨酸残基、半胱氨酸残基或非天然氨基酸残基的官能团是选择性的。反应性基团可以是任何合适的官能团，诸如用于与赖氨酸反应的活化酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯或其衍生物、五氟苯基酯等)或用于与半胱氨酸反应的巯基反应性基团(例如，迈克尔受体(Michael acceptor)，诸如α-β不饱和羰基或马来酰亚胺)。在一些实施方案中，反应性基团是：
-R5a、R5b和R5c各自独立地是H、卤素或任选地取代的烃基；
-每个j是1、2、3、4或5；并且
-每个k是1、2、3、4或5。
在一些实施方案中，亲和肽用于将反应性部分递送至期望的氨基酸残基，使得反应性部分在可裂解接头裂解时暴露。作为非限制性实例的方式，反应性基团与多肽Fc区的期望残基形成共价键，由于亲和肽和Fc区之间的相互作用，该Fc区与抗PD-1选择性结合。在该共价键形成后，可裂解接头在适当的条件下被裂解以露出反应性部分(例如，如果可裂解接头包含硫酯，则在可裂解接头裂解后，游离巯基基团被附接至Fc区)。然后，该新的反应性部分可以用于随后通过包含拴系至巯基反应性基团(例如，α-卤代羰基基团、α-β不饱和羰基基团、马来酰亚胺基团等)的缀合手柄的试剂添加另外的部分，诸如缀合手柄。
在一些实施方案中，亲和肽用于将游离巯基基团递送至Fc区的赖氨酸。在一些实施方案中，然后游离巯基基团与双官能连接试剂反应，以将新的缀合手柄附接至Fc区。在一些实施方案中，然后新的缀合手柄用于形成对附接的细胞因子的接头。在一些实施方案中，新的缀合手柄是炔烃官能团。在一些实施方案中，新的缀合手柄是DBCO官能团。
可用于此目的的示例性双官能连接试剂具有式A-B-C，其中A是巯基反应性缀合手柄(例如，马来酰亚胺、α，β-不饱和羰基、a-卤代羰基)，B是连接基团，并且C是新的缀合手柄(例如，炔烃，诸如DBCO)。双官能连接试剂的具体非限制性实例包括 以及/>其中每个n独立地是1-6的整数，并且每个m独立地是1-30的整数，以及相关分子(例如，异构体)。
可选地，亲和肽可以被配置为使得在反应性基团和Fc区的残基之间形成共价键之后，立即将缀合手柄添加至Fc区(诸如通过接头基团)。在这样的情况下，亲和肽被裂解，并且缀合手柄立即准备好随后与IL-2多肽(或其他细胞因子)缀合。
可选的酶介导的附接方法
尽管上文提供的亲和肽介导的抗体Fc区的修饰具有许多优于可以用于位点特异性修饰Fc区的其他方法的优点(例如，易于使用，能够快速产生许多不同的抗体缀合物，能够使用许多“现货供应的(off-the-shelf)”商业抗体，而不需要进行耗时的蛋白工程化等)，进行修饰的其他方法也被认为在本公开内容的范围内。
在一些实施方案中，本公开内容一般涉及转谷氨酰胺酶介导的位点特异性抗体-药物缀合物(ADC)，其包含：1)含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺(例如，未工程化的天然谷氨酰胺，诸如可变结构域CDR中的谷氨酰胺等)，和/或通过抗体工程化或工程化的转谷氨酰胺酶反应制备的内源谷氨酰胺；和2)包含胺供体单元、接头和剂部分的胺供体剂。这样的转谷氨酰胺酶介导的位点特异性修饰的非限制性实例至少可以见于公布WO2020188061、US2022133904、US2019194641、US2021128743、US9764038、US10675359、US9717803、US10434180、US9427478中，这些公布通过引用并入，如同以其整体在本文中列出一样。
在另一方面，本公开内容提供了一种工程化含Fc的多肽缀合物，该工程化含Fc的多肽缀合物包含式：(含Fc的多肽-T-A)，其中T是在特定位点处工程化的含酰基供体谷氨酰胺的标签，其中A是胺供体剂，其中胺供体剂在含Fc的多肽中的羧基末端、氨基末端处或另一位点处与含酰基供体谷氨酰胺的标签位点特异性缀合，其中含酰基供体谷氨酰胺的标签包含氨基酸序列XXQX，其中X是任何氨基酸(例如，X可以是相同或不同的氨基酸)，并且其中所述工程化含Fc的多肽缀合物在位置295处包含从谷氨酰胺至天冬酰胺的氨基酸取代(Q295N；EU编号方案)。
在一些实施方案中，含酰基供体谷氨酰胺的标签在空间上不与多肽或含Fc的多肽中反应性Lys相邻(例如，在存在酰基供体和转谷氨酰胺酶的情况下形成作为胺供体的共价键的能力)。在一些实施方案中，多肽或含Fc的多肽相对于野生型多肽羧基末端的最后一个氨基酸位置处在相同位置处包含氨基酸修饰。氨基酸修饰可以是氨基酸缺失、插入、取代、突变或其任何组合。
在一些实施方案中，多肽缀合物包含全长抗体重链和抗体轻链，其中含酰基供体谷氨酰胺的标签位于重链、轻链或重链和轻链二者的羧基末端处。
在一些实施方案中，多肽缀合物包含抗体，其中抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、微抗体、双抗体或抗体片段。在一些实施方案中，抗体是IgG。
在另一方面，本文描述了一种用于制备工程化含Fc的多肽缀合物的方法，该工程化含Fc的多肽缀合物包含式：(含Fc的多肽-T-A)，其中T是在特定位点处工程化的含酰基供体谷氨酰胺的标签，其中A是胺供体剂，其中胺供体剂在含Fc的多肽中的羧基末端、氨基末端处或另一位点处与含酰基供体谷氨酰胺的标签位点特异性缀合，其中含酰基供体谷氨酰胺的标签包含氨基酸序列XXQX，其中X是任何氨基酸(例如，X可以是相同或不同的氨基酸)，并且其中工程化含Fc的多肽缀合物在位置295处包含从谷氨酰胺至天冬酰胺的氨基酸取代(Q295N；EU编号方案)，该方法包括以下步骤：a)提供包含含Fc的多肽和含酰基供体谷氨酰胺的标签的工程化(含Fc的多肽)-T分子；b)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使胺供体剂与工程化(含Fc的多肽)-T分子接触；并且c)允许工程化(含Fc的多肽)-T共价连接至胺供体剂，形成工程化含Fc的多肽缀合物。
在另一方面，本文描述了一种用于制备工程化多肽缀合物的方法，该工程化多肽缀合物包含式：多肽-T-A，其中T是在特定位点处工程化的含酰基供体谷氨酰胺的标签，其中A是胺供体剂，其中胺供体剂在多肽中的羧基末端、氨基末端处或另一位点处与含酰基供体谷氨酰胺的标签位点特异性缀合，并且其中含酰基供体谷氨酰胺的标签包含氨基酸序列LLQGPX(SEQ ID NO:153)，其中X是A或P，或者GGLLQGPP(SEQ ID NO:154)，该方法包括以下步骤：a)提供包含多肽和含酰基供体谷氨酰胺的标签的工程化多肽-T分子；b)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使胺供体剂与工程化多肽-T分子接触；并且c)允许工程化多肽-T共价附接至胺供体剂以形成工程化含Fc的多肽缀合物。
在一些实施方案中，如本文描述的工程化多肽缀合物(例如，工程化含Fc的多肽缀合物、工程化含Fab的多肽缀合物或工程化抗体缀合物)具有至少约51％的缀合效率。在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含如本文描述的工程化多肽缀合物(例如，工程化含Fc的多肽缀合物、工程化含Fab的多肽缀合物或工程化抗体缀合物)和药学上可接受的赋形剂。
在一些实施方案中，本文描述了一种用于将感兴趣的部分(Z)与抗体缀合的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供具有(例如，在恒定区的一级序列内)在存在偶联酶例如转氨酶的情况下与连接试剂(接头)反应的至少一个受体氨基酸残基(例如，天然存在的氨基酸)的抗体；并且(b)使所述抗体与包含反应性基团(R)，任选地受保护的反应性基团或任选地未受保护的反应性基团的连接试剂(例如，包含伯胺的接头)在存在能够引起在受体氨基酸残基和连接试剂(除了在R部分以外)之间形成共价键的酶的情况下在足以获得包含经由连接试剂(共价)连接至反应性基团(R)的受体氨基酸残基的抗体的条件下反应。任选地，抗体或抗体片段的所述受体残基在+2位置处侧接非天冬氨酸残基。任选地，在+2位置处的残基是非天冬氨酸残基。在一种实施方案中，在+2位置处的残基是非天冬氨酸、非谷氨酰胺残基。在一种实施方案中，在+2位置处的残基是非天冬氨酸、非天冬酰胺残基。在一种实施方案中，在+2位置处的残基是非带负电荷的氨基酸(除了天冬氨酸或谷氨酸以外的氨基酸)。任选地，受体谷氨酰胺位于抗体重链的Fc结构域中，任选地进一步在CH2结构域中。任选地，抗体不含重链N297连接的糖基化。任选地，受体谷氨酰胺在抗体重链的位置295处，而在+2位置处的残基是在抗体重链的位置297处的残基(EU索引编号)。
在一方面，本文描述了一种用于将感兴趣的部分(Z)与抗体缀合的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供具有至少一个受体谷氨酰胺残基的抗体；并且(b)使所述抗体与包含反应性基团(R)，优选地受保护的反应性基团的包含伯胺的接头(基于赖氨酸的接头)在存在转谷氨酰胺酶(TGase)的情况下在足以获得包含经由所述接头(共价)连接至反应性基团(R)的受体谷氨酰胺的抗体的条件下反应。任选地，抗体或抗体片段的所述受体谷氨酰胺残基在+2位置处侧接非天冬氨酸残基。任选地，在+2位置处的残基是非天冬氨酸残基。在一种实施方案中，在+2位置处的残基是非天冬氨酸、非谷氨酰胺残基。在一种实施方案中，在+2位置处的残基是非天冬氨酸、非天冬酰胺残基。在一种实施方案中，在+2位置处的残基是非带负电荷的氨基酸(除了天冬氨酸或谷氨酸以外的氨基酸)。任选地，受体谷氨酰胺位于抗体重链的Fc结构域中，任选地进一步在CH2结构域中。任选地，抗体不含重链N297连接的糖基化。任选地，受体谷氨酰胺在抗体重链的位置295处，而在+2位置处的残基是在抗体重链的位置297处的残基(EU索引编号)。
包含经由包含伯胺的接头(基于赖氨酸的接头)连接至反应性基团(R)的受体残基或受体谷氨酰胺残基的抗体此后可以与包含感兴趣部分(Z)的反应伴侣反应，以产生包含经由接头连接至感兴趣部分(Z)的受体残基或受体谷氨酰胺残基的抗体。因此，在一种实施方案中，该方法还包括步骤(c)：使(i)步骤b)的包含经由包含伯胺的接头(基于赖氨酸的接头)(任选地固定在固体支持物上)连接至反应性基团(R)的受体谷氨酰胺的抗体与(ii)包含感兴趣部分(Z)和能够与反应性基团R反应的反应性基团(R’)的化合物在足以获得包含经由包含伯胺的接头(基于赖氨酸的接头)连接至感兴趣部分(Z)的受体谷氨酰胺的抗体的条件下反应。优选地，包含感兴趣部分(Z)和能够与反应性基团R反应的反应性基团(R’)的所述化合物以抗体的少于80倍、40倍、20倍、10倍、5倍或4摩尔当量提供。在一种实施方案中，抗体包含两个受体谷氨酰胺，并且包含感兴趣部分(Z)和反应性基团(R’)的化合物以抗体的10摩尔当量或更少摩尔当量提供。在一种实施方案中，抗体包含两个受体谷氨酰胺，并且包含感兴趣部分(Z)和反应性基团(R’)的化合物以抗体的5摩尔当量或更少摩尔当量提供。在一种实施方案中，抗体包含四个受体谷氨酰胺，并且包含感兴趣部分(Z)和反应性基团(R’)的化合物以抗体的20摩尔当量或更少摩尔当量提供。在一种实施方案中，抗体包含四个受体谷氨酰胺，并且包含感兴趣部分(Z)和反应性基团(R’)的化合物以抗体的10摩尔当量或更少摩尔当量提供。在一种实施方案中，步骤(b)和/或(c)在水性条件下进行。任选地，步骤(c)包括：将包含官能化受体谷氨酰胺残基的抗体的样品固定在固体支持物上，以提供包含固定的抗体的样品，使包含固定的抗体的样品与化合物反应，任选地回收任何未反应的化合物，并且将这样的回收的化合物重新引入固体支持物，用于与固定的抗体反应，并且洗脱抗体缀合物，以提供包含Z部分的组合物。
缀合手柄化学
在一些实施方案中，与PD-1选择性结合的多肽的适当修饰的Fc区将包含缀合手柄，该缀合手柄用于将与PD-1选择性结合的多肽与IL-2多肽缀合。
能够与附接至IL-2多肽的互补反应性基团反应的任何合适的反应性基团都可以用作缀合手柄。在一些实施方案中，缀合手柄包括用于以下的试剂：Cu(I)催化或“无铜”的炔烃-叠氮三唑形成反应(例如，应力促进的环加成(strain promoted cycloaddition))、Staudinger连接、逆电子需求Diels-Alder(IEDDA)反应、“光点击”化学、用反式环辛烯的四嗪环加成或金属介导的过程诸如烯烃复分解和Suzuki-Miyaura或Sonogashira交叉偶联。
在一些实施方案中，缀合手柄包括用于“无铜”炔烃叠氮三唑形成反应的试剂。用于所述炔烃叠氮三唑形成反应的炔烃的非限制性实例包括环辛炔试剂(例如，含(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇的试剂、二苯并环辛炔-胺试剂、二氟环辛炔或其衍生物)。在一些实施方案中，炔烃官能团附接至Fc区。在一些实施方案中，叠氮化物官能团附接至Fc区。
在一些实施方案中，缀合手柄包括选自以下的反应性基团：叠氮化物、炔烃、四嗪、卤化物、巯基、二硫化物、马来酰亚胺、活化酯、烯烃、醛、酮、亚胺、肼和酰肼。在一些实施方案中，IL-2多肽包含与Fc区的缀合手柄互补的反应性基团。在一些实施方案中，缀合手柄和互补缀合手柄包括“点击”化学试剂。点击化学残基的示例性基团在Hein等人,“ClickChemistry,APowerful Tool for Pharmaceutical Sciences,”PharmaceuticalResearch,第25卷,第2216-2230页(2008)；Thirumurugan等人,“Click Chemistry forDrug Development and Diverse Chemical-Biology Applications,”Chem.Rev.2013,113,7,4905-4979；US20160107999A1；US10266502B2；和US20190204330A1中示出，其中每一个通过引用以其整体并入。
接头结构
在一些实施方案中，用于附接与PD-1选择性结合的多肽和细胞因子(诸如IL-2多肽)的接头在两个部分处包含附接点。附接点可以是如本文提供的用于促进附接的残基中的任何一个。接头结构可以是用于在两个部分之间产生空间附接的任何合适的结构。在一些实施方案中，接头提供两个部分的共价附接。在一些实施方案中，接头是化学接头(例如，不是像融合蛋白中的表达的多肽)。
在一些实施方案中，接头包括聚合物。在一些实施方案中，接头包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，接头包括聚(环氧烷)(poly(alkylene oxide))、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，接头包括聚(环氧烷)。在一些实施方案中，聚(环氧烷)是聚乙二醇或聚丙二醇或其组合。在一些实施方案中，聚(环氧烷)是聚乙二醇。
在一些实施方案中，接头是双官能接头。在一些实施方案中，双官能接头包括酰胺基团、酯基团、醚基团、硫醚基团或羰基基团。在一些实施方案中，接头包括非聚合物接头。在一些实施方案中，接头包括非聚合物双官能接头。在一些实施方案中，非聚合物双官能接头包括琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯；马来酰亚胺己酰基；缬氨酸-瓜氨酸；烯丙基(4-甲氧基苯基)二甲基甲硅烷；6-(烯丙基氧基羰基氨基)-1-己醇；4-氨基丁醛二乙基缩醛；或(E)-N-(2-氨基乙基)-4-{2-[4-(3-叠氮丙氧基)苯基]二氮烯基}苯甲酰胺盐酸盐。
接头可以是支链的或线性的。在一些实施方案中，接头是线性的。在一些实施方案中，接头是支链的。在一些实施方案中，接头包括至少10、20、50、100、500、1000、2000、3000或5000个原子的链的线性部分(例如，在第一附接点和第二附接点之间)。在一些实施方案中，接头包括至少10、20、30、40或50个原子的链的线性部分。在一些实施方案中，接头包括至少10个原子的线性部分。在一些实施方案中，接头是支链的，并且包括至少10、20、50、100、500、1000、2000、3000或5000个原子的链的线性部分。
在一些实施方案中，接头具有约200道尔顿至约2000道尔顿的分子量。在一些实施方案中，接头具有200道尔顿至100,000道尔顿的分子量。在一些实施方案中，接头具有以下的分子量：200道尔顿至500道尔顿、200道尔顿至750道尔顿、200道尔顿至1,000道尔顿、200道尔顿至5,000道尔顿、200道尔顿至10,000道尔顿、200道尔顿至20,000道尔顿、200道尔顿至50,000道尔顿、200道尔顿至100,000道尔顿、500道尔顿至750道尔顿、500道尔顿至1,000道尔顿、500道尔顿至5,000道尔顿、500道尔顿至10,000道尔顿、500道尔顿至20,000道尔顿、500道尔顿至50,000道尔顿、500道尔顿至100,000道尔顿、750道尔顿至1,000道尔顿、750道尔顿至5,000道尔顿、750道尔顿至10,000道尔顿、750道尔顿至20,000道尔顿、750道尔顿至50,000道尔顿、750道尔顿至100,000道尔顿、1,000道尔顿至5,000道尔顿、1,000道尔顿至10,000道尔顿、1,000道尔顿至20,000道尔顿、1,000道尔顿至50,000道尔顿、1,000道尔顿至100,000道尔顿、5,000道尔顿至10,000道尔顿、5,000道尔顿至20,000道尔顿、5,000道尔顿至50,000道尔顿、5,000道尔顿至100,000道尔顿、10,000道尔顿至20,000道尔顿、10,000道尔顿至50,000道尔顿、10,000道尔顿至100,000道尔顿、20,000道尔顿至50,000道尔顿、20,000道尔顿至100,000道尔顿或50,000道尔顿至100,000道尔顿。在一些实施方案中，接头具有以下的分子量：200道尔顿、500道尔顿、750道尔顿、1,000道尔顿、5,000道尔顿、10,000道尔顿、20,000道尔顿、50,000道尔顿或100,000道尔顿。在一些实施方案中，接头具有以下的分子量：至少200道尔顿、500道尔顿、750道尔顿、1,000道尔顿、5,000道尔顿、10,000道尔顿、20,000道尔顿或50,000道尔顿。在一些实施方案中，接头具有以下的分子量：至多500道尔顿、750道尔顿、1,000道尔顿、5,000道尔顿、10,000道尔顿、20,000道尔顿、50,000道尔顿或100,000道尔顿。在优选的实施方案中，接头具有小于5000道尔顿、小于4000道尔顿、小于3000道尔顿或小于2000道尔顿的分子量，并且接头是单分散的(例如，对于本文的缀合物组合物群体，与PD-L1特异性结合的多肽和IL-2多肽(或其他细胞因子)之间存在接头的结构高度均匀性)。
在一些实施方案中，接头包括一对或更多对缀合手柄及其互补的缀合手柄的反应产物。在一些实施方案中，反应产物包括三唑、腙、哒嗪、硫化物、二硫化物、酰胺、酯、醚、肟、烯烃或其任何组合。在一些实施方案中，反应产物包括三唑。反应产物可以通过接头的任何部分与第一附接点和第二附接点分开。在一些实施方案中，反应产物实质上位于接头的中心。在一些实施方案中，反应产物实质上比另一个附接点更靠近一个附接点。
在一些实施方案中，接头包括式(X)的结构
其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、L8和L9各自独立地是-O-、-NRL-、-N(RL)2 +-、-OP(＝O)(ORL)O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)O-、-NRLC(＝O)NRL-、-NRLC(＝S)NRL-、-CRL＝N-、-N＝CRL、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-C(＝O)NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRLC(＝O)-、取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的C1-C6亚杂烃基、取代或未取代的C2-C6亚烯基、取代或未取代的C2-C6亚炔基、取代或未取代的C6-C20亚芳基、取代或未取代的C2-C20亚杂芳基、-(CH2-CH2-O)qa-、-(O-CH2-CH2)qb-、-(CH2-CH(CH3)-O)qc-、-(O-CH(CH3)-CH2)qd-、缀合手柄和互补缀合手柄的反应产物，或不存在；
每个RL独立地是氢、取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C1-C4杂烃基、取代或未取代的C2-C6烯基、取代或未取代的C2-C5炔基、取代或未取代的C3-C8环烃基、取代或未取代的C2-C7杂环烃基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；并且
qa、qb、qc和qd各自独立地是1-100的整数，
其中每个是针对与PD-1选择性结合的多肽或细胞因子(例如，IL-2多肽)的附接点。
在一些实施方案中，接头包括式(Xa)的结构
其中L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8和L9各自独立地是-O-、-NRL-、-(C1-C6亚烃基)NRL-(-(C1-C6 alkylene)NRL-)、-NRL(C1-C6亚烃基)-、-N(RL)2 +-、-(C1-C6亚烃基)N(RL)2 +-、-N(RL)2 +-(C1-C6亚烃基)-、-OP(＝O)(ORL)O-、-S-、-(C1-C6亚烃基)S-、-S(C1-C6亚烃基)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-(C1-C6亚烃基)C(＝O)-、-C(＝O)(C1-C6亚烃基)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-C(＝O)NRL(C1-C6亚烃基)-、-(C1-C6亚烃基)C(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-(C1-C6亚烃基)NRLC(＝O)-、-NRLC(＝O)(C1-C6亚烃基)-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)O-、-NRLC(＝O)NRL-、-NRLC(＝S)NRL-、-CRL＝N-、-N＝CRL、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-C(＝O)NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRLC(＝O)-、取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的C1-C6亚杂烃基、取代或未取代的C2-C6亚烯基、取代或未取代的C2-C6亚炔基、取代或未取代的C6-C20亚芳基、取代或未取代的C2-C20亚杂芳基、-(CH2-CH2-O)qa-、-(O-CH2-CH2)qb-、-(CH2-CH(CH3)-O)qc-、-(O-CH(CH3)-CH2)qd-、缀合手柄和互补缀合手柄的反应产物，或不存在；(C1-C6亚烃基)
每个RL独立地是氢、取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C1-C4杂烃基、取代或未取代的C2-C6烯基、取代或未取代的C2-C5炔基、取代或未取代的C3-C8环烃基、取代或未取代的C2-C7杂环烃基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；并且
qa、qb、qc和qd各自独立地是1-100的整数，
其中每个是针对与PD-1选择性结合的多肽或细胞因子(例如，IL-2多肽)的附接点。
在一些实施方案中，接头包括式(X’)的结构
其中每个L’独立地是-O-、-NRL-、-(C1-C6亚烃基)NRL-、-NRL(C1-C6亚烃基)-、-N(RL)2 +-、-(C1-C6亚烃基)N(RL)2 +-、-N(RL)2 +-(C1-C6亚烃基)-、-OP(＝O)(ORL)O-、-S-、-(C1-C6亚烃基)S-、-S(C1-C6亚烃基)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-(C1-C6亚烃基)C(＝O)-、-C(＝O)(C1-C6亚烃基)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-C(＝O)NRL(C1-C6亚烃基)-、-(C1-C6亚烃基)C(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-(C1-C6亚烃基)NRLC(＝O)-、-NRLC(＝O)(C1-C6亚烃基)-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)O-、-NRLC(＝O)NRL-、-NRLC(＝S)NRL-、-CRL＝N-、-N＝CRL、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-C(＝O)NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRLC(＝O)-、取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的C1-C6亚杂烃基、取代或未取代的C2-C6亚烯基、取代或未取代的C2-C6亚炔基、取代或未取代的C6-C20亚芳基、取代或未取代的C2-C20亚杂芳基、-(CH2-CH2-O)qa-、-(O-CH2-CH2)qb-、-(CH2-CH(CH3)-O)qc-、-(O-CH(CH3)-CH2)qd-、缀合手柄和互补缀合手柄的反应产物，或不存在；(C1-C6亚烃基)；
每个RL独立地是氢、取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C1-C4杂烃基、取代或未取代的C2-C6烯基、取代或未取代的C2-C5炔基、取代或未取代的C3-C8环烃基、取代或未取代的C2-C7杂环烃基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；
qa、qb、qc和qd各自独立地是1-100的整数；并且，
g是1-100的整数，
其中每个是针对修饰的IL-2多肽或抗体或抗原结合片段的附接点。
在一些实施方案中，式(X)或式(Xa)或式(X’)的接头包括以下结构：
其中
是针对所述与PD-1选择性结合的多肽的赖氨酸残基的第一附接点；
L是连接基团；并且
是针对与第一附接点连接的连接基团的附接点，
或其位置异构体。
在一些实施方案中，L具有结构/> 其中，每个n独立地是1-6的整数，并且每个m是1-30的整数。在一些实施方案中，每个m独立地是2或3。在一些实施方案中，每个m是1-24、1-18、1-12或1-6的整数。
在一些实施方案中，式(X)或式(Xa)或式(X’)的接头包括以下结构：
其中
是针对所述与PD-1选择性结合的多肽的赖氨酸残基的第一附接点；
L是连接基团；并且
是针对与第一附接点连接的连接基团的附接点，
或其位置异构体。
在一些实施方案中，L”具有结构 其中，每个n独立地是1-6的整数，并且每个m独立地是1-30的整数。在一些实施方案中，每个m独立地是2或3。在一些实施方案中，每个m是1-24、1-18、1-12或1-6的整数。
在一些实施方案中，L或L”包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个亚单位，该亚单位各自独立地选自 以及/>其中，每个n独立地是1-30的整数。在一些实施方案中，每个n独立地是1-6的整数。在一些实施方案中，L或L”包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个亚单位。
在一些实施方案中，L或L”是式(X”)的结构
其中L1a、L2a、L3a、L4a、L5a各自独立地是-O-、-NRLa-、-(C1-C6亚烃基)NRLa-、-NRLa(C1-C6亚烃基)-、-N(RL)2 +-、-(C1-C6亚烃基)N(RLa)2 +(C1-C6亚烃基)-、-N(RL)2 +-、-OP(＝O)(ORLa)O-、-S-、-(C1-C6亚烃基)S-、-S(C1-C6亚烃基)-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-(C1-C6亚烃基)C(＝O)-、-C(＝O)(C1-C6亚烃基)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRLa-、-C(＝O)NRLa(C1-C6亚烃基)-、-(C1-C6亚烃基)C(＝O)NRLa-、-NRLaC(＝O)-、-(C1-C6亚烃基)NRLaC(＝O)-、-NRLaC(＝O)(C1-C6亚烃基)-、-OC(＝O)NRLa-、-NRLaC(＝O)O-、-NRLaC(＝O)NRLa-、-NRLaC(＝S)NRLa-、-CRLa＝N-、-N＝CRLa、-NRLaS(＝O)2-、-S(＝O)2NRLa-、-C(＝O)NRLaS(＝O)2-、-S(＝O)2NRLaC(＝O)-、取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的C1-C6亚杂烃基、取代或未取代的C2-C6亚烯基、取代或未取代的C2-C6亚炔基、取代或未取代的C6-C20亚芳基、取代或未取代的C2-C20亚杂芳基、-(CH2-CH2-O)qe-、-(O-CH2-CH2)qf-、-(CH2-CH(CH3)-O)qg-、-(O-CH(CH3)-CH2)qh-、缀合手柄和互补缀合手柄的反应产物，或不存在；
每个RLa独立地是氢、取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C1-C4杂烃基、取代或未取代的C2-C6烯基、取代或未取代的C2-C5炔基、取代或未取代的C3-C8环烃基、取代或未取代的C2-C7杂环烃基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；并且
qe、qf、qg和qh各自独立地是1-100的整数。
在一些实施方案中，L或L”包括2至10、2至15、2至20、2至25或2至30个原子的线性链。在一些实施方案中，线性链包括一个或更多个烃基基团(例如，低级烃基(C1-C4))、一个或更多个芳族基团(例如，苯基)、一个或更多个酰胺基团、一个或更多个醚基团、一个或更多个酯基团或其任何组合。
在一些实施方案中，与第一附接点(例如，针对细胞因子的附接点)连接的连接基团包括聚(乙二醇)。在一些实施方案中，连接基团包括约2至约30个聚(乙二醇)单元。在一些实施方案中，与第一附接点(例如，针对细胞因子的附接点)连接的连接基团是附接至本文提供的包含叠氮化物(例如，三唑是叠氮化物的反应产物)的细胞因子的官能团。
在一些实施方案中，L是-O-、-NRL-、-N(RL)2+-、-OP(＝O)(ORL)O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)2-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)-、-OC(＝O)NRL-、-NRLC(＝O)O-、-NRLC(＝O)NRL-、-NRLC(＝S)NRL-、-CRL＝N-、-N＝CRL、-NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRL-、-C(＝O)NRLS(＝O)2-、-S(＝O)2NRLC(＝O)-、取代或未取代的C1-C6亚烷基、取代或未取代的C1-C6亚杂烃基、取代或未取代的C2-C6亚烯基、取代或未取代的C2-C6亚炔基、取代或未取代的C6-C20亚芳基、取代或未取代的C2-C20亚杂芳基、-(CH2-CH2-O)qa-、-(O-CH2-CH2)qb-、-(CH2-CH(CH3)-O)qc-、-(O-CH(CH3)-CH2)qd-，其中RL是氢、取代或未取代的C1-C4烷基、取代或未取代的C1-C4杂烃基、取代或未取代的C2-C6烯基、取代或未取代的C2-C5炔基、取代或未取代的C3-C8环烃基、取代或未取代的C2-C7杂环烃基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；并且qa、qb、qc和qd各自独立地是1-100的整数。
在一些实施方案中，缀合手柄和互补缀合手柄的每个反应产物独立地包括三唑、腙、哒嗪、硫化物、二硫化物、酰胺、酯、醚、肟或烯烃。在一些实施方案中，缀合手柄和互补缀合手柄的每个反应产物包括三唑。在一些实施方案中，缀合手柄和互补缀合手柄的每个反应产物包括以下结构： 或其位置异构体或衍生物。
在一些实施方案中，接头是可裂解接头。在一些实施方案中，可裂解接头在肿瘤微环境处、肿瘤微环境附近或肿瘤微环境中被裂解。在一些实施方案中，肿瘤在肿瘤微环境处、肿瘤微环境附近或肿瘤微环境中被机械或物理裂解。在一些实施方案中，肿瘤在肿瘤微环境处、肿瘤微环境附近或肿瘤微环境中被化学裂解。在一些实施方案中，可裂解接头是还原敏感接头。在一些实施方案中，可裂解接头是氧化敏感接头。在一些实施方案中，可裂解接头由于肿瘤微环境处、附近或其中的pH而被裂解。在一些实施方案中，接头在肿瘤微环境处、肿瘤微环境附近或肿瘤微环境中被肿瘤代谢物裂解。在一些实施方案中，可裂解接头在肿瘤微环境处、肿瘤微环境附近或肿瘤微环境中被蛋白酶裂解。
IL-2细胞因子
细胞因子是体内产生的在细胞信号传导中重要的蛋白。细胞因子可以调节免疫系统，并且细胞因子疗法利用分子的免疫调节特性来增强受试者的免疫系统并杀伤癌细胞。本文公开了与细胞因子缀合的抗PD-1多肽，其可以表现出增强的生物活性。
白细胞介素-2(IL-2)是在调节免疫系统中重要的细胞因子信号传导分子。IL-2参与帮助免疫系统区分外来与内源细胞类型，从而防止免疫系统攻击受试者自己的细胞。IL-2通过与由淋巴细胞表达的IL-2受体(IL-2R)相互作用而实现其活性。通过这些结合相互作用，IL-2可以调节受试者的T-效应(Teff)细胞、自然杀伤(NK)细胞和调节性T细胞(Treg)的群体。
IL-2已被单独及与其他疗法组合用于治疗癌症。然而，使用IL-2作为治疗受到IL-2的毒性、不期望的副作用诸如血管渗漏综合征和IL-2半衰期短的限制。IL-2与本公开内容的抗PD-1多肽的缀合可以改进IL-2多肽的选择性，增强IL-2的治疗潜力，并且潜在地减少来自施用IL-2疗法的副作用的风险。
本公开内容描述了与修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽缀合的抗PD-1多肽及其作为治疗剂的用途。本文提供的修饰的IL-2多肽可以用作免疫疗法或作为其他免疫疗法方案的部分。这样的修饰的IL-2多肽可以对IL-2受体(IL-2R)展示出与野生型IL-2不同的结合特征。在一方面，本文描述的修饰的IL-2多肽对IL-2Rαβγ复合物(IL-2Rα)具有降低的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβγ复合物(IL-2Rβ)具有增加的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽与IL-2Rβ之间的结合亲和力等于或高于野生型IL-2与IL-2Rβ之间的结合亲和力。在本文描述的实施方案中利用的IL-2氨基酸序列的非限制性实例在下文的表8中提供。
在本公开内容的一些实施方案中，与野生型IL-2相比，优选的是IL-2多肽偏向有利于通过IL-2受体β亚单位的信号传导。在一些实施方案中，这通过以下的一项或两项来实现：a)抑制或减少IL-2多肽与IL-2受体α亚单位的结合(例如，在接触α亚单位的残基处具有突变，向接触α亚单位的残基添加聚合物，或通过接头将与PD-1结合的多肽附接至接触α亚单位的残基)和/或b)增强IL-2多肽与IL-2受体的β亚单位的结合(例如，在接触β亚单位的残基处具有增强结合的突变)。在一些实施方案中，与野生型IL-2相比，本文提供的免疫细胞因子组合物的IL-2多肽偏向于IL-2受体β亚单位。具有偏向于IL-2受体β信号传导的修饰的IL-2多肽的非限制性实例在例如PCT公布第WO2021140416A2号、第WO2012065086A1号、第WO2019028419A1号、第WO2012107417A1号、第WO2018119114A1号、第WO2012062228A2号、第WO2019104092A1号、第WO2012088446A1号和第WO2015164815A1号中描述，其中每个特此通过引用并入，如同以其整体在本文中列出一样。
化学接头针对IL-2多肽的附接点
本文提供了包含与通过化学接头连接至IL-2多肽的PD-1结合的多肽诸如抗体的组合物。如上文讨论的，化学接头可以在本文提供的位置中的任何一个处附接至抗PD-1多肽。接头的第二附接点附接至如本文提供的IL-2多肽。
在一些实施方案中，化学接头在氨基酸残基处附接至IL-2多肽。在一些实施方案中，化学接头附接在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-133中的任何一个的氨基酸残基处。在一些实施方案中，化学接头附接在非末端氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸残基2-132中的任何一个，或SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-133中的任何一个，其中N-末端或C-末端已经被一个或更多个氨基酸残基延伸)处。在一些实施方案中，化学接头附接在IL-2多肽的非末端氨基酸残基处，其中IL-2多肽包含相对于SEQ ID NO:1的N-末端截短或C-末端截短。
在一些实施方案中，化学接头在与IL-2受体(IL-2R)蛋白或亚单位相互作用的氨基酸残基处附接至IL-2多肽。在一些实施方案中，化学接头附接在与IL-2Rα亚单位(IL-2Rα)、IL-2Rβ亚单位(IL-2Rβ)或IL-2Rγ亚单位(IL-2Rγ)相互作用的氨基酸残基处。在一些实施方案中，化学接头附接在与IL-2Rα亚单位(IL-2Rα)相互作用的氨基酸残基处。在一些实施方案中，化学接头附接在与IL-2Rβ亚单位(IL-2Rβ)相互作用的氨基酸残基处。在一些实施方案中，化学接头附接在与IL-2Rγ亚单位(IL-2Rγ)相互作用的氨基酸残基处。
在一些实施方案中，选择针对IL-2多肽的附接点，使得IL-2多肽与至少一个IL-2受体亚单位的相互作用被降低或阻断。在一些实施方案中，选择附接点，使得IL-2多肽与IL-2Rα的相互作用被减少或阻断。在一些实施方案中，选择附接点，使得IL-2多肽与IL-2Rβ的相互作用被减少。
在一些实施方案中，接头在破坏IL-2多肽与IL-2受体α亚单位(IL-2Rα)结合的残基处附接至IL-2多肽。这些残基的实例包括残基3、5、34、35、36、37、38、40、41、42、43、44、45、60、61、62、63、64、65、67、68、69、71、72、103、104、105和107，如在例如PCT公布第WO2019028419A1号、第WO2020056066A1号、第WO2021140416A2号和第WO2021216478A1号中描述的，其中每个特此通过引用并入，如同以其整体列出一样。
在一些实施方案中，接头在位置1-110中的任何一个的氨基酸残基处附接至IL-2多肽，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，接头在位置1-10、1-20、1-30、30-50、30-70、30-100、40-50、40-70、40-100或40-110中的任何一个的氨基酸残基处附接至IL-2多肽。在一些实施方案中，接头在位置1、35、37、38、41、42、43、44、45、60、61、62、64、65、68、69、71、72、104、105和107中的任何一个的氨基酸残基处附接至IL-2多肽，其中修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，接头在位置1、35、37、38、41、42、43、44、45、60、61、62、64、65、68、69、71、72、104、105和107中的任何一个的氨基酸残基处附接至IL-2多肽，其中修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，接头在位置1、35、37、38、41、42、43、44、60、61、62、64、65、68、69、71、72、104、105和107中的任何一个的氨基酸残基处附接至IL-2多肽，其中修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，接头在位置1、35、37、38、41、43、44、60、61、62、64、65、68、69、71、72、104、105和107中的任何一个的氨基酸残基处附接至IL-2多肽，其中修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，接头在位置1、35、37、38、39、40、41、42、43、44、45或46中的任何一个的氨基酸残基处附接至IL-2多肽。在一些实施方案中，接头在位置1、41、42、43、44和45中的任何一个的氨基酸残基处附接至IL-2多肽，其中修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，接头附接在氨基酸残基1、42或45处。在一些实施方案中，接头附接在氨基酸残基1处。在一些实施方案中，接头附接在氨基酸残基42处。在一些实施方案中，接头附接在氨基酸残基45处。
在一些实施方案中，接头附接至是如SEQ ID NO:1中列出的IL-2多肽的天然氨基酸残基的残基。在一些实施方案中，接头附接至是如SEQ ID NO:1中列出的IL-2多肽的天然氨基酸残基的修饰形式的氨基酸残基。这样的修饰的非限制性实例包括将缀合手柄掺入或附接至天然氨基酸残基(包括通过接头)，或使用任何相容的方法将化学接头附接至天然氨基酸。在一些实施方案中，接头附接至与SEQ ID NO:1的IL-2多肽相比是取代的氨基酸残基的氨基酸残基。取代可以是更易于另外官能团的附接的天然存在的氨基酸(例如，天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸)、任何天然存在的氨基酸的修饰形式的衍生物、或任何非天然氨基酸(例如，包含期望的反应性基团(诸如点击化学试剂，诸如叠氮化物、炔烃等)的氨基酸)。可以被取代的氨基酸的非限制性实例包括但不限于-α-(9-芴甲氧羰基)-L-联苯丙氨酸(Fmoc-L-Bip-OH)和N-α-(9-芴甲氧羰基)-O-苄基-L-酪氨酸(Fmoc-L-Tyr(Bzl)-OH)。示例性非典型氨基酸包括对乙酰基-L-苯丙氨酸、对碘-L-苯丙氨酸、对甲氧基苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、对炔丙基氧基苯丙氨酸、对炔丙基苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对硼苯丙氨酸、O-炔丙基酪氨酸、L-磷酸丝氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、对溴苯丙氨酸、硒半胱氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、叠氮基-赖氨酸(AzK)、酪氨酸氨基酸的类似物；谷氨酰胺氨基酸的类似物；苯丙氨酸氨基酸的类似物；丝氨酸氨基酸的类似物；苏氨酸氨基酸的类似物；烷基(alkyl)、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸(borate)、硼酸酯(boronate)、磷酸、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮基或氨基取代的氨基酸、β-氨基酸；除了脯氨酸或组氨酸之外的环状氨基酸；除了苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸之外的芳族氨基酸；或其组合。在一些实施方案中，非典型氨基酸选自β-氨基酸、高氨基酸、环状氨基酸和具有衍生化侧链的氨基酸。在一些实施方案中，非典型氨基酸包括β-丙氨酸、β-氨基丙酸、哌啶酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基庚二酸、锁链素、二氨基庚二酸、Nα-乙基甘氨酸、Nα-乙基天冬氨酸、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、ω-甲基精氨酸、Nα-甲基甘氨酸、Nα-甲基异亮氨酸、Nα-甲基缬氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、Nα-乙酰丝氨酸、Nα-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸和/或其他类似氨基酸。
在一些实施方案中，接头附接在非天然氨基酸残基处。在一些实施方案中，非天然氨基酸残基组成缀合手柄。在一些实施方案中，缀合手柄促进接头向修饰的IL-2多肽的添加。缀合手柄可以是本文提供的缀合手柄中的任何一个。在一些实施方案中，接头位点特异性地共价附接至非天然氨基酸。组成缀合手柄的氨基酸残基的非限制性实例可以见于例如PCT公布第WO2015054658A1号、第WO2014036492A1号及第WO2021133839A1号、第WO2006069246A2和第WO2007079130A2号，其中每个通过引用并入，如同以其整体列出一样。
在一些实施方案中，接头附接至已被天然氨基酸取代的氨基酸残基。在一些实施方案中，接头附接至已被半胱氨酸残基、赖氨酸残基或酪氨酸残基取代的氨基酸残基。在一些实施方案中，接头附接至已被半胱氨酸残基取代的残基。在一些实施方案中，接头附接至已被赖氨酸残基取代的氨基酸残基。在一些实施方案中，接头附接至已被酪氨酸残基取代的氨基酸残基。
在一些实施方案中，接头在N-末端A1、K35、F42Y、K43、F44Y或Y45处附接至氨基酸残基。在一些实施方案中，接头在N-末端A1、F42Y或Y45处附接至氨基酸残基。在一些实施方案中，接头附接至氨基末端残基。在一些实施方案中，接头附接至氨基酸残基A1。在一些实施方案中，接头附接至氨基酸残基F42Y。在一些实施方案中，接头附接至氨基酸残基Y45。
对IL-2多肽的修饰
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含一个或更多个修饰的氨基酸残基。这样的修饰可以采取以下形式：野生型IL-2多肽诸如SEQ ID NO:1的氨基酸序列的突变，从SEQ ID NO:1的序列中添加和/或缺失氨基酸或向氨基酸残基添加部分。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含从SEQ ID NO:1序列的第一氨基酸的缺失。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含C125S突变，使用SEQ ID NO:1的序列作为参考序列。可以向氨基酸残基添加的部分包括但不限于聚合物、接头、间隔物及其组合。当向某些氨基酸残基添加时，这些部分可以调节修饰的IL-2多肽与野生型IL-2相比的活性或其他特性。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含氨基酸残基35-46范围内的两个修饰。在一些实施方案中，一个修饰位于氨基酸残基40-43的范围内。在一些实施方案中，一个修饰位于氨基酸残基42处。在一些实施方案中，一个修饰位于氨基酸残基44-46的范围内。在一些实施方案中，一个修饰位于氨基酸残基45处。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含一种或更多种聚合物。例如，向某些氨基酸残基添加聚合物可以具有破坏修饰的IL-2多肽与IL-2R(特别是αβγ复合物)的结合相互作用的效果。在一些实施方案中，添加聚合物以破坏这种相互作用的残基包括F42和Y45。在一些实施方案中，向残基42或45添加的聚合物也充当IL-2多肽和与PD-1结合的多肽之间的接头。
在一些实施方案中，聚合物是水溶性聚合物，诸如聚乙二醇(PEG)聚合物。F42残基可以突变为另一残基，以促进PEG聚合物(或接头)的添加，例如向酪氨酸残基的添加。聚合物可以添加至残基F42和Y45或其突变体中的任一个或两个中。这些聚合物可以呈IL-2多肽和与PD-1选择性结合的多肽之间的接头的形式，或者可以是除了接头以外的另外的聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含选自表2的一个或更多个氨基酸突变。
表2
*残基位置编号基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含选自表3的一个或更多个氨基酸突变。
表3
/>
*残基位置编号基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含一种或更多种选自表4的聚合物。
表4
在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含表5中提供的突变和聚合物。在一些实施方案中，表的聚合物中的一种或更多种被附接至与PD-1结合的多肽的接头的一部分取代或包含该接头的一部分。
表5
*残基位置编号基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
在一些情况下，本文描述的修饰的IL-2多肽可以是重组的。本文描述的修饰的IL-2多肽也可以化学合成而不是表达为重组多肽。合成IL-2多肽至少已经在PCT公布第WO2021140416A2号、美国专利申请公布第US20190023760A1号和Asahina等人，Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,8226-8230中描述，其中每个通过引用并入，如同以其整体在本文中列出一样。修饰的IL-2多肽可以通过合成全长的修饰的IL-2多肽的一种或更多种片段、将片段连接在一起、并使所连接的全长多肽折叠来制备。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含氨基酸序列中的F42Y突变、共价附接至氨基酸残基F42Y的约500Da的第一PEG聚合物、共价附接至氨基酸残基Y45的约500Da的第二PEG聚合物、以及共价附接至修饰的IL-2多肽N-末端的约6kDa的任选的第三PEG聚合物。在一些实施方案中，PEG聚合物包含将IL-2多肽附接至与PD-1结合的多肽的接头的一部分。
在一些实施方案中，化学合成的IL-2多肽包含附接至一个或更多个残基的缀合手柄，以促进接头至与PD-1选择性结合的多肽的附接。缀合手柄可以是本文提供的任何这样的缀合手柄，并且可以附接在接头可以被附接的任何残基处。在一些实施方案中，缀合手柄附接至IL-2多肽的残基42或45。在一些实施方案中，缀合手柄包括叠氮化物或炔烃。可选地，在一些实施方案中，缀合手柄被掺入到重组IL-2多肽的非天然或修饰的天然氨基酸中。具有非天然氨基酸的重组IL-2多肽可以使用如例如，专利合作条约公布第WO2016115168号、第WO2002085923号、第WO2005019415号和第WO2005003294号中描述的方法制备。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽当施用至受试者时增强T效应(Teff)细胞或自然杀伤(NK)细胞增殖。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽当向受试者施用时增强Teff细胞或NK细胞增殖而阻止调节性T细胞(Treg)的优先激活。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽增加CD8+T细胞和NK细胞。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽当向受试者施用时产生接近1的Teff/Treg比。
在一方面，本文描述了一种修饰的多肽，所述修饰的多肽包含修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，其中修饰的IL-2多肽包含共价附接的第一聚合物。本文描述了一种修饰的多肽，该修饰的多肽包含修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，其中修饰的IL-2多肽包含共价附接在残基F42Y处的第一聚合物，并且其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ IDNO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第一聚合物与附接IL-2多肽和与PD-1选择性结合的多肽的接头相同。在一些实施方案中，第一聚合物是不同于接头的另外的聚合物。在另一方面，本文描述了一种修饰的多肽，该修饰的多肽包含：修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，其中修饰的IL-2多肽对表达高亲和力异源三聚体IL-2受体(IL-2Rαβ/γ)的细胞表现出减少的功能活性，而对表达中等亲和力异源二聚体IL-2受体(IL-2Rβ/γ)的细胞表现出更大的功能活性，如通过在激动剂测定中对原代Treg(表达IL-2Rα/β/γ受体)和静息CD8+Teff(表达IL-2Rβ/γ受体)的一半最大有效浓度(EC50)测量的，并且其中修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ的EC50值相比于修饰的IL-2多肽对IL-2Rα的EC50值的比低于3:1。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表8或表5中提供的修饰的IL-2多肽、具有表2或表3中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表4中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
生物活性
在一些实施方案中，如本文提供的包含与抗PD-1多肽缀合的修饰的IL-2多肽的免疫缀合物显示出对位于肿瘤(例如，肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL))或肿瘤引流淋巴结内表达高水平PD-1(CD279)的免疫细胞的增强的亲和力，同时对表达低或中等水平表面PD-1的外周免疫细胞的降低的亲和力。
在一些实施方案中，与非靶向的IL-2多肽或非靶向的IL-2免疫缀合物相比，包含与抗PD-1多肽缀合的修饰的IL-2多肽的免疫缀合物在肿瘤或肿瘤引流淋巴结内表现出与在血浆中的暴露相比增强的暴露。在一些实施方案中，与非靶向的IL-2免疫缀合物或未缀合的IL-2多肽相比，PD1-IL2免疫缀合物在肿瘤或肿瘤引流淋巴结内的暴露相比于在血浆或血清中的暴露的比高至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍或更高。在一些实施方案中，PD1-IL2免疫缀合物在肿瘤或肿瘤引流淋巴结中的半衰期与其在血浆或血清中的半衰期相比高10至100倍。在一些实施方案中，与非靶向的IL-2免疫缀合物或未缀合的IL-2多肽相比，PD1-IL2免疫缀合物在肿瘤或肿瘤引流淋巴结内的暴露相比于在血浆或血清中的暴露的比高10倍至100倍、20倍至100倍、30倍至100倍、40倍至100倍、20倍至75倍、30倍至75倍、40倍至100倍或40倍至75倍。
在一些实施方案中，与不靶向PD-1的IL-2免疫缀合物或IL-2多肽相比，PD1-IL2免疫缀合物表现出肿瘤或肿瘤引流淋巴结暴露相比于血浆或血清暴露的增强的比。在一些实施方案中，与不靶向PD-1的IL-2免疫缀合物或IL-2多肽相比，抗PD1-IL-2免疫缀合物的肿瘤或肿瘤引流淋巴结暴露相比于血浆或血清暴露的比高至少2倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍。在一些实施方案中，与不靶向PD-1的IL-2免疫缀合物或IL-2多肽相比，抗PD1-IL-2免疫缀合物的肿瘤或肿瘤引流淋巴结暴露相比于血浆或血清暴露的比高10倍至100倍。在一些实施方案中，与非靶向的IL-2免疫缀合物或IL-2多肽相比，PD1-IL2免疫缀合物的肿瘤或肿瘤引流淋巴结暴露相比于血浆或血清暴露的比高10倍至100倍、20倍至100倍、30倍至100倍、40倍至100倍、20倍至75倍、30倍至75倍、40倍至100倍或40倍至75倍。
在一些实施方案中，由PD1-IL2免疫缀合物诱导的肿瘤内(例如，肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL))和肿瘤引流淋巴结内的免疫细胞群体的扩增相比于其他组织中的免疫细胞群体(例如，其他组织中相同类型的免疫细胞)的扩增的比多至少1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5或更多。在一些实施方案中，由PD1-IL2免疫缀合物诱导的肿瘤和肿瘤引流淋巴结内的免疫细胞群体的扩增相比于其他组织中的免疫细胞群体的扩增的比是约1.5至10、约2至10、约2.5至10、约3至10、约1.5至8、约2至8、约2.5至8、约3至8、约1.5至6、约2至6、约2.5至6或约3至6。在一些实施方案中，免疫细胞群体是选自以下的至少一种：幼稚CD8+细胞、CD4+辅助性细胞、CD8+中央记忆性细胞、CD8+效应记忆性细胞、NK细胞、NKT细胞或其任何组合。在一些实施方案中，在施用后的指定时间(例如，6小时、12小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天或7天)测量该比。
在一些实施方案中，包含与抗PD-1多肽缀合的修饰的IL-2多肽的PD1-IL2免疫缀合物显示出增强的效力，这是由于与不表达PD-1或仅表达中等水平PD-1的细胞相比，修饰的IL-2多肽在表达高水平PD-1的细胞上的顺式-信号传导。在一些实施方案中，对于PD1-IL2免疫缀合物，不表达PD-1或仅表达中等水平PD-1的细胞中IL-2途径参与的EC50值(pSTAT5测定)相比于表达高水平PD-L1的细胞中IL-2途径参与的EC50值(pSTAT5测定)的比是至少10、至少50、至少100、至少250、至少500、至少750、至少1000、至少1500、至少2000、至少2500或至少3000。在一些实施方案中，对于PD1-IL2免疫缀合物，与不靶向PD-1的IL-2免疫缀合物或IL-2多肽相比，不表达PD-1或仅表达中等水平PD-1的细胞中IL-2途径参与的EC50值(pSTAT5测定)相比于表达高水平PD-L1的细胞中IL-2途径参与的EC50值(pSTAT5测定)的比是至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少200倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍、至少600倍、至少700倍、至少800倍、至少900倍或至少1000倍。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽展示出不同于野生型IL-2的活性。在一些实施方案中，本文下文提供的这些修饰的生物活性适用于单独的IL-2多肽(例如，未与PD-1结合的多肽缀合或以其他方式附接)，以及当IL-2多肽与PD-1结合的多肽缀合或以其他方式附接时(例如，修饰的生物活性在缀合或附接后被保留)。因此，当本文将修饰的IL-2多肽描述为具有指示的活性时，还可以设想本文提供的免疫细胞因子组合物(例如，附接至与PD-1结合的多肽的IL-2多肽)具有相同的活性。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽能够扩增CD4+辅助性细胞、CD8+中央记忆性细胞、CD8+效应记忆性细胞、幼稚CD8+细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞群体或其组合。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表8或表5中提供的修饰的IL-2多肽、具有表2或表3中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表4中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽扩增效应T细胞(Teff细胞)的细胞群体。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该细胞群体扩增至少20％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该细胞群体扩增至少30％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该细胞群体扩增至少40％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该细胞群体扩增至少50％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该细胞群体扩增至少100％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该细胞群体扩增至少200％。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽扩增效应T细胞(Teff细胞)的细胞群体。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该细胞群体扩增至多5％、至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多75％、至多100％或至多500％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该细胞群体扩增至多5％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该细胞群体扩增至多20％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该细胞群体扩增至多50％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该细胞群体扩增至多100％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与Teff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该细胞群体扩增至多500％。
在一些实施方案中，由本文描述的修饰的IL-2多肽扩增的Teff细胞的细胞群体扩增相比于Treg细胞的细胞群体扩增的比是约0.1至约15、约0.5至约10、约0.75至约5或约1至约2。在一些实施方案中，由修饰的IL-2多肽扩增的Teff细胞的细胞群体扩增相比于Treg细胞的细胞群体扩增的比是0.1至15。在一些实施方案中，由修饰的IL-2多肽扩增的Teff细胞的细胞群体扩增相比于Treg细胞的细胞群体扩增的比是0.1至0.5、0.1至0.75、0.1至1、0.1至2、0.1至5、0.1至10、0.1至15、0.5至0.75、0.5至1、0.5至2、0.5至5、0.5至10、0.5至15、0.75至1、0.75至2、0.75至5、0.75至10、0.75至15、1至2、1至5、1至10、1至15、2至5、2至10、2至15、5至10、5至15、10至15或其间的任何数字或范围。在一些实施方案中，由修饰的IL-2多肽扩增的Teff细胞的细胞群体扩增相比于Treg细胞的细胞群体扩增的比是约0.1、0.5、0.75、1、2、5、10或15。在一些实施方案中，由修饰的IL-2多肽扩增的Teff细胞的细胞群体扩增相比于Treg细胞的细胞群体扩增的比是至少0.1、0.5、0.75、1、2、5或10。在一些实施方案中，由修饰的IL-2多肽扩增的Teff细胞的细胞群体扩增相比于Treg细胞的细胞群体扩增的比是至多0.5、0.75、1、2、5、10或15。
在一些实施方案中，由本文提供的修饰的IL-2多肽扩增的细胞群体是体外细胞群体、体内细胞群体或离体细胞群体。在一些实施方案中，细胞群体是体外细胞群体。在一些实施方案中，细胞群体是体内细胞群体。在一些实施方案中，细胞群体是离体细胞群体。细胞群体可以是CD4+辅助性细胞、CD8+中央记忆性细胞、CD8+效应记忆性细胞、幼稚CD8+细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞或其组合的群体。
在一些实施方案中，在注射修饰的IL-2多肽之后1小时测量细胞水平。在一些实施方案中，在注射修饰的IL-2多肽之后2小时测量细胞水平。在一些实施方案中，在注射修饰的IL-2多肽之后4小时测量细胞水平。在一些实施方案中，在注射修饰的IL-2多肽之后30分钟测量细胞水平(例如，对于体外实验)。在一些实施方案中，在延长的时间点(例如，6h、12h、24h、72h、96h、120h、144h、168h等)测量细胞水平，特别是对于体内实验。
在一些实施方案中，本文提供的免疫缀合物组合物(例如，通过接头附接至IL-2多肽的与PD-1结合的多肽(例如，抗PD-1抗体，诸如帕博利珠单抗或LZM-009))在两个基团之间形成连接之后维持与组分中的至少一种关联的结合亲和力。在一些实施方案中，例如，在包含与IL-2多肽连接的抗PD-1抗体或抗原结合片段的免疫缀合物组合物中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段保留与一种或更多种Fc受体的结合。在一些实施方案中，与未缀合的抗体相比，组合物展示出与一种或更多种Fc受体的结合减少不多于约5倍、不多于约10倍、不多于约15倍或不多于约20倍。在一些实施方案中，一种或更多种Fc受体是FcRn受体、FcγRI受体(CD64)、FcγRIIa受体(CD32α)、FcγRIIβ受体(CD32β)、FcγRIII受体(CD16a)或其任何组合。在一些实施方案中，与未缀合的抗体相比，组合物与FcRn受体、FcγRI受体(CD64)、FcγRIIa受体(CD32α)和FcγRIIβ受体(CD32β)、FcγRIII受体(CD16a)中每一种的结合减少不多于约10倍。
在一些实施方案中，与PD-1结合的多肽(例如，抗体)与PD-1的结合实质上不受与IL-2多肽缀合的影响。在一些实施方案中，与未缀合的抗体相比，多肽与PD-1的结合减少不多于约5％。
位点特异性修饰
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含在一个或更多个氨基酸残基处的一个或更多个修饰。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于野生型人类IL-2多肽作为参考序列。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表8或表5中提供的修饰的IL-2多肽、具有表2或表3中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表4中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
本文描述的多肽的修饰包括突变、各种官能团的添加、氨基酸的缺失、氨基酸的添加、或者蛋白或蛋白片段的野生型形式的任何其他改变。可以添加至多肽的官能团包括聚合物、接头、烃基基团、可检测的分子诸如生色团或荧光团、反应性官能团或其任何组合。在一些实施方案中，官能团被添加至多肽的个体氨基酸。在一些实施方案中，官能团被位点特异性地添加至多肽。在一些实施方案中，官能团包括用于将IL-2多肽附接至与PD-1选择性结合的多肽的接头的至少一部分。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含在来自残基35-46区域的氨基酸残基处的修饰，其中残基编号是基于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，修饰位于K35、L36、T37、R38、M39、L40、T41、F42、K43、F44、Y45或M46处。在一些实施方案中，修饰位于F42处。在一些实施方案中，修饰位于Y45处。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在N末端残基处的修饰。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含C125S突变。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含A1缺失。在一些实施方案中，修饰包括被用于将IL-2多肽附接至与PD-1选择性结合的多肽的接头的附接。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含共价附接在残基35-46中的任何一个中的氨基酸残基处的第一聚合物，其中修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含共价附接在残基39-43中的任何一个中的氨基酸残基处的第一聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含共价附接在氨基酸残基F42处的第一聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含共价附接在氨基酸残基F42Y处的第一聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含共价附接在残基44-46中的任何一个中的氨基酸残基处的第一聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含共价附接在氨基酸残基Y45处的第一聚合物。在一些实施方案中，第一聚合物是将IL-2多肽附接至与PD-1选择性结合的多肽的接头的一部分。在一些实施方案中，第一聚合物是与将IL-2多肽附接至与PD-1选择性结合的多肽的接头不同的修饰。
在一些实施方案中，本文描述的修饰IL-2多肽包含位于氨基酸残基35至氨基酸残基45区域中的氨基酸残基处的一个或更多个PEG化酪氨酸。在一些实施方案中，一个或更多个PEG化酪氨酸位于氨基酸残基42、氨基酸残基45或二者处。在一些实施方案中，一个或更多个PEG化酪氨酸位于氨基酸残基42处。在一些实施方案中，一个或更多个PEG化酪氨酸位于氨基酸残基45处。在一些实施方案中，一个或更多个PEG化酪氨酸位于氨基酸残基42和氨基酸残基45二者处。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含两个PEG化酪氨酸，每个PEG化酪氨酸独立地具有式(I)的结构。本文提供的具有如本文提供的各种接头附接点和聚合物的修饰的IL-2多肽的非限制性集合在下文表7中示出。
表7
IL-2构建体 接头附接点 聚合物1附接点 聚合物2附接点
A N-末端 残基42 残基45
B N-末端 残基42 无
C N-末端 残基45 无
D 残基42 残基45 无
E 残基42 N-末端 残基45
F 残基42 N-末端 无
G 残基45 残基42 无
H 残基45 N-末端 残基42
I 残基45 N-末端 无
J N-末端 残基65 无
K 残基65 N-末端 无
*残基位置编号基于SEQ ID No:1作为参考序列
在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽是合成的。在一方面，本文公开了一种修饰的IL-2多肽，所述修饰的IL-2多肽包含一个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含F42Y和Y45。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于氨基酸残基35-45中的任何一个中的高丝氨酸(Hse)残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于氨基酸残基61-81中的任何一个中的Hse残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于氨基酸残基94-114中的任何一个中的Hse残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含1个、2个、3个或更多个Hse残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41、Hse71、Hse104或其组合。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41、Hse71和Hse104。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至少两个氨基酸取代，其中所述至少两个氨基酸取代选自(a)位于氨基酸残基35-45中的任何一个中的高丝氨酸(Hse)残基；(b)位于氨基酸残基61-81中的任何一个中的高丝氨酸残基；和(c)位于氨基酸残基94-114中的任何一个中的高丝氨酸残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41和Hse71。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41和Hse104。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse71和Hse104。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse71。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse104。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含1、2、3或更多个正亮氨酸(Nle)残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于残基18-28的任何一个中的Nle残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于氨基酸残基34-50中的任何一个中的一个或更多个Nle残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于氨基酸残基20-60中的任何一个中的Nle残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含三个Nle取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Nle23、Nle39和Nle46。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含具有A1缺失的SEQ ID NO:3。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ IDNO:4。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含A1缺失。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含具有A1缺失的SEQ ID NO:4。
在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含表8中提供的SEQ ID NO:3-23中的任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:3-23中的任何一个的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:3的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:4的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:9的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:10的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQID NO:11的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:12的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:13的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:14的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:15的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ IDNO:17的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:18的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:19的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:20的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:21的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:22的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:23的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含3个至9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含3个或4个氨基酸取代、3个至5个氨基酸取代、3个至6个氨基酸取代、3个至7个氨基酸取代、3个至9个氨基酸取代、4个或5个氨基酸取代、4个至6个氨基酸取代、4个至7个氨基酸取代、4个至9个氨基酸取代、5个或6个氨基酸取代、5个至7个氨基酸取代、5个至9个氨基酸取代、6个或7个氨基酸取代、6个至9个氨基酸取代或7个至9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含3个氨基酸取代、4个氨基酸取代、5个氨基酸取代、6个氨基酸取代、7个氨基酸取代或9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至多4个氨基酸取代、5个氨基酸取代、6个氨基酸取代、7个氨基酸取代或9个氨基酸取代。在一些实施方案中，一个或更多个氨基酸取代选自表2。在一些实施方案中，一个或更多个氨基酸取代选自表3。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表8或表5中提供的修饰的IL-2多肽、具有表2或表3中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表4中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含第二修饰。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含第三修饰。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含第二修饰和第三修饰。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:3的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或100％的序列同一性。在一些实施方案中，序列同一性使用矩阵BLOSUM62的以下参数通过蛋白-蛋白BLAST算法测量：空位成本存在:11、延伸:1和组分调整条件组分评分矩阵调整(Compositional Adjustments Conditional Compositional Score MatrixAdjustment)。
如本文描述的修饰的IL-2多肽可以包含一个或更多个非典型氨基酸。在一些实施方案中，在一些情况下，Tyr 45和/或Phe 42被非典型氨基酸取代。在一些实施方案中，位于表2和/或表3中提供的位置处的一个或更多个氨基酸被一个或更多个非典型氨基酸取代。非典型氨基酸包括但不限于N-α-(9-芴甲基氧羰基)-L-联苯丙氨酸(Fmoc-L-Bip-OH)和N-α-(9-芴甲基氧羰基)-O-苄基-L-酪氨酸(Fmoc-L-Tyr(Bzl)-OH)。示例性非典型氨基酸包括对乙酰基-L-苯丙氨酸、对碘-L-苯丙氨酸、对甲氧基苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、对炔丙基氧基苯丙氨酸、对炔丙基苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对硼苯丙氨酸、O-炔丙基酪氨酸、L-磷酸丝氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、对溴苯丙氨酸、硒半胱氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、叠氮基-赖氨酸(AzK)、酪氨酸氨基酸的类似物；谷氨酰胺氨基酸的类似物；苯丙氨酸氨基酸的类似物；丝氨酸氨基酸的类似物；苏氨酸氨基酸的类似物；烷基、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸、硼酸酯、磷酸、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮基或氨基取代的氨基酸、β-氨基酸；除了脯氨酸或组氨酸之外的环状氨基酸；除了苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸之外的芳族氨基酸；或其组合。在一些实施方案中，非典型氨基酸选自β-氨基酸、高氨基酸、环状氨基酸和具有衍生化侧链的氨基酸。在一些实施方案中，非典型氨基酸包括β-丙氨酸、β-氨基丙酸、哌啶酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基庚二酸、锁链素、二氨基庚二酸、Nα-乙基甘氨酸、Nα-乙基天冬氨酸、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、ω-甲基精氨酸、Nα-甲基甘氨酸、Nα-甲基异亮氨酸、Nα-甲基缬氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、Nα-乙酰丝氨酸、Nα-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸和/或其他类似氨基酸。在一些实施方案中，Tyr 45和/或Phe 42被修饰的酪氨酸残基取代。在一些实施方案中，修饰的酪氨酸残基包含氨基、叠氮化物、烯丙基、酯和/或酰胺官能团。在一些实施方案中，位置42或45处的修饰的酪氨酸残基用作将IL-2多肽附接至与PD-1选择性结合的多肽的接头的附接点。在一些实施方案中，位置42和/或45处的修饰的酪氨酸残基具有从前体结构1、结构2、结构3、结构4或结构5构建的结构，其中结构1是
结构2是：
结构3是：
结构4是：
并且结构5是：
聚合物
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含共价附接在其上的一种或更多种聚合物。在一些实施方案中，描述的修饰的IL-2多肽包含与修饰的IL-2多肽共价附接的1种、2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种聚合物。在一些实施方案中，描述的修饰的IL-2多肽包含第一聚合物。在一些实施方案中，第一聚合物包含将IL-2多肽附接至与PD-1选择性结合的多肽的接头的至少一部分。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表4中提供的修饰的IL-2多肽、具有表2或表3中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表3中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。
在一些实施方案中，第一聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧烷)。在一些实施方案中，水溶性聚合物是多糖。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧乙烷)。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含与IL-2多肽的N末端共价附接的第一聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与其共价附接的第二聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与其共价附接的第二聚合物和第三聚合物。在一些实施方案中，第二聚合物共价附接至氨基酸残基42或45，其中修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第二聚合物共价附接至氨基酸残基F42Y或Y45，其中修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第二聚合物和第三聚合物共价附接至氨基酸残基42和45，其中修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第二聚合物和第三聚合物共价附接至氨基酸残基F42Y和Y45，其中修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第一聚合物、第二聚合物或第三聚合物中的至少一种包含用于将IL-2多肽附接至与PD-1选择性结合的多肽的接头的至少一部分。
在一些实施方案中，附接的聚合物诸如第一聚合物具有约120道尔顿至约1,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有以下的重均分子量：约120道尔顿至约250道尔顿、约120道尔顿至约300道尔顿、约120道尔顿至约400道尔顿、约120道尔顿至约500道尔顿、约120道尔顿至约1,000道尔顿、约250道尔顿至约300道尔顿、约250道尔顿至约400道尔顿、约250道尔顿至约500道尔顿、约250道尔顿至约1,000道尔顿、约300道尔顿至约400道尔顿、约300道尔顿至约500道尔顿、约300道尔顿至约1,000道尔顿、约400道尔顿至约500道尔顿、约400道尔顿至约1,000道尔顿或约500道尔顿至约1,000道尔顿。在一些实施方案中，聚合物具有约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有至少约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿或约500道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有至多约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的重均分子量。
在一些实施方案中，附接的聚合物诸如第一聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧烷)，诸如聚乙二醇(例如，聚环氧乙烷)。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚乙二醇。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括改性的聚(环氧烷)。在一些实施方案中，改性的聚(环氧烷)包含一个或更多个接头基团。在一些实施方案中，一个或更多个接头基团包括双官能接头，诸如酰胺基团、酯基团、醚基团、硫醚基团、羰基基团等。在一些实施方案中，一个或更多个接头基团包括酰胺接头基团。在一些实施方案中，改性的聚(环氧烷)包含一个或更多个间隔物基团。在一些实施方案中，间隔物基团包括被取代或未被取代的C1-C6亚烃基基团。在一些实施方案中，间隔物基团包括-CH2-、-CH2CH2-或-CH2CH2CH2-。在一些实施方案中，接头基团是双正交反应(例如，生物相容性和选择性反应)的产物。在一些实施方案中，生物正交反应是Cu(I)催化或“无铜”的炔-叠氮三唑形成反应、Staudinger连接、逆电子需求Diels-Alder(IEDDA)反应、“光点击”化学或金属介导的过程，诸如烯烃复分解和Suzuki-Miyaura或Sonogashira交叉偶联。在一些实施方案中，第一聚合物经由点击化学与IL-2多肽附接。在一些实施方案中，第一聚合物包含将IL-2多肽附接至与PD-1选择性结合的多肽的接头的至少一部分。
在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含促进修饰的IL-2多肽与衍生化分子或部分(诸如抗体和聚合物)缀合的反应基团。在一些实施方案中，反应基团包括以下的一种或更多种：羧酸衍生的活性酯、混合酸酐、酰基卤化物、酰基叠氮化物、烃基卤化物、N-马来酰亚胺、亚氨基酯、异氰酸酯和异硫氰酸酯。在一些实施方案中，反应基团包括叠氮化物。在一些实施方案中，反应基团形成将IL-2多肽附接至与PD-1选择性结合的多肽的接头的一部分。
在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含共价附接至氨基酸残基的化学试剂。在一些实施方案中，化学试剂包括生物正交试剂。在一些实施方案中，化学试剂包括叠氮化物。在一些实施方案中，化学试剂包括炔烃。在一些实施方案中，化学试剂附接在35-46的氨基酸残基处，其中氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，化学试剂附接在39-43的氨基酸残基处，其中氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，化学试剂附接在氨基酸残基42处，其中氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，化学试剂附接在氨基酸残基F42Y,处，其中氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，化学试剂附接在44-46的氨基酸残基处，其中氨基酸残基位置编号是基于SEQID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，化学试剂附接在氨基酸残基45处，其中氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，化学试剂附接在表2或表3所示的任何氨基酸残基处。在一些实施方案中，化学试剂形成将IL-2多肽附接至与PD-1选择性结合的多肽的接头的一部分。
在一些实施方案中，水溶性聚合物包含1个至10个聚乙二醇链。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽还包含与修饰的IL-2多肽共价附接的第二聚合物。在一些实施方案中，第二聚合物在残基40至残基50的氨基酸残基区域处共价附接。在一些实施方案中，第二聚合物共价附接在氨基酸残基Y45处。在一些实施方案中，第二聚合物与修饰的IL-2多肽的N末端共价附接。在一些实施方案中，第二聚合物包含将IL-2多肽附接至与PD-1选择性结合的多肽的接头的至少一部分。
在一些实施方案中，第二聚合物具有约120道尔顿至约1,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第二聚合物具有以下的重均分子量：约120道尔顿至约250道尔顿、约120道尔顿至约300道尔顿、约120道尔顿至约400道尔顿、约120道尔顿至约500道尔顿、约120道尔顿至约1,000道尔顿、约250道尔顿至约300道尔顿、约250道尔顿至约400道尔顿、约250道尔顿至约500道尔顿、约250道尔顿至约1,000道尔顿、约300道尔顿至约400道尔顿、约300道尔顿至约500道尔顿、约300道尔顿至约1,000道尔顿、约400道尔顿至约500道尔顿、约400道尔顿至约1,000道尔顿或约500道尔顿至约1,000道尔顿。在一些实施方案中，第二聚合物具有约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第二聚合物具有至少约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿或约500道尔顿的重均分子量。在一些实施方案中，第二聚合物具有至多约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的重均分子量。
在一些实施方案中，第二聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧烷)。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧乙烷)。在一些实施方案中，第二聚合物经由点击化学与IL-2多肽附接。在一些实施方案中，第二聚合物包含将IL-2多肽附接至与PD-1选择性结合的多肽的接头的至少一部分。
在一些实施方案中，第二水溶性聚合物包含1个至10个聚乙二醇链。
在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽还包含与修饰的IL-2多肽共价附接的第三聚合物。在一些实施方案中，第三聚合物共价附接在氨基酸残基40至氨基酸残基50的氨基酸残基区域。在一些实施方案中，第三聚合物共价附接在氨基酸残基Y45处。在一些实施方案中，第三聚合物共价附接在修饰的IL-2多肽的N-末端。
在一些实施方案中，每种聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，每种水溶性聚合物是聚(环氧烷)。在一些实施方案中，每种水溶性聚合物是聚乙二醇。
在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含1个至5个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含单个聚乙二醇链。
在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地是线性的或支链的。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链是线性聚乙二醇。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链是支链聚乙二醇。例如，在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种都包含线性聚乙二醇链。
在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用羟基、烃基、烃氧基、酰胺基或氨基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用氨基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用酰胺基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用烃氧基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用烃基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用羟基基团末端封端。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含具有式(I)结构的一个或更多个PEG化酪氨酸，
其中n是选自4至30的整数。在一些实施方案中，n是4至6、4至8、4至10、4至15、4至20、4至25、4至30、6至8、6至10、6至15、6至20、6至25、6至30、8至10、8至15、8至20、8至25、8至30、10至15、10至20、10至25、10至30、15至20、15至25、15至30、20至25、20至30、或25至30。在一些实施方案中，n是4、6、8、10、15、20、25或30。在一些实施方案中，n是至少4、6、8、10、15、20或25。在一些实施方案中，n是至多6、8、10、15、20、25或30。在一方面，如本文描述的修饰的IL-2多肽包含在一个或两个氨基酸残基处共价附接的一种或两种水溶性聚合物。例如，在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含具有如表6中所示的特征和附接位点的一种或两种水溶性聚合物。
表6.示例性多肽结构和水溶性聚合物特征
在一些实施方案中，可以与修饰的IL-2多肽附接的水溶性聚合物包含式(D)的结构：
在一些实施方案中，聚合物从合适的前体物质合成。在一些实施方案中，聚合物从结构6、结构7、结构8或结构9的前体物质合成，其中结构6是
结构7是：
结构8是：
结构9是：
正交有效载荷
本公开内容的抗PD-1-IL-2免疫缀合物可以包含双重正交有效载荷。在一种非限制性情况下，抗PD-1-IL-2免疫缀合物可以包含抗PD-1多肽、一种修饰的IL-2多肽和一种通过化学正交连接基团与抗PD-1多肽连接的有效载荷。正交有效载荷可以是氨基酸、氨基酸衍生物、肽、蛋白、细胞因子、烃基基团、芳基或杂芳基基团、治疗性小分子药物、聚乙二醇(PEG)部分、脂质、糖、生物素、生物素衍生物、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或肽核酸(PNA)，其中任何一种是取代的、未取代的、修饰的或未修饰的。在一些实施方案中，正交有效载荷是治疗性小分子。在一些实施方案中，正交有效载荷是PEG部分。在一些实施方案中，正交有效载荷是另外的细胞因子，例如，IL-7或IL-18。在一种示例性情况下，人类IL-7具有以下的氨基酸序列：
或者是修饰的IL-7。在一种示例性情况下，人类IL-18具有以下的氨基酸序列：
或者是修饰的IL-18。在一些情况下，可以在IL-18的Cys68、Glu69、Lys70中的一个或更多个处添加缀合手柄。
药物组合物
在一方面，本文描述了一种药物组合物，所述药物组合物包含：本文描述的连接至修饰的IL-2多肽的与PD-1选择性结合的多肽；和药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物还包含一种或更多种赋形剂，其中一种或更多种赋形剂包括但不限于糖类、无机盐、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂或其任何组合。在一些实施方案中，药物组合物还包含一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种赋形剂，其中一种或更多种赋形剂包括但不限于糖类、无机盐、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂或其任何组合。
在一些实施方案中，药物组合物还包含糖类。在某些实施方案中，糖类选自由以下组成的组：果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖、棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、右旋糖酐、淀粉、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇(葡糖醇)、吡喃糖山梨醇、肌醇、环糊精及其组合。
可选地或另外地，药物组合物还包含无机盐。在某些实施方案中，无机盐选自由以下组成的组：氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾、硫酸钠或其组合。
可选地或另外地，药物组合物包含抗氧化剂。在某些实施方案中，抗氧化剂选自由以下组成的组：抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、焦亚硫酸钾、没食子酸丙酯、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、维生素E、3,4-二羟基苯甲酸及其组合。
可选地或另外地，药物组合物还包含表面活性剂。在某些实施方案中，表面活性剂选自由以下组成的组：聚山梨醇酯、失水山梨醇酯、脂质、磷脂、磷脂酰乙醇胺、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、EDTA、锌及其组合。
可选地或另外地，药物组合物还包含缓冲剂。在某些实施方案中，缓冲剂选自由以下组成的组：柠檬酸、磷酸钠、磷酸钾、乙酸、乙醇胺、组氨酸、氨基酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、乳酸、tris、HEPES或其组合。
在一些实施方案中，药物组合物被配制为用于肠胃外或肠内施用。在一些实施方案中，药物组合物被配制为用于静脉内(IV)施用或皮下(SQ)施用。在一些实施方案中，药物组合物呈冻干形式。
在一方面，本文描述了液体或冻干组合物，所述液体或冻干组合物包含所述的连接至修饰的IL-2多肽的与PD-1选择性结合的多肽。在一些实施方案中，连接至修饰的IL-2多肽的与PD-1选择性结合的多肽是冻干粉末。在一些实施方案中，将冻干粉末重悬于缓冲溶液中。在一些实施方案中，缓冲溶液包含缓冲剂、糖、盐、表面活性剂或其任何组合。在一些实施方案中，缓冲溶液包含磷酸盐。在一些实施方案中，磷酸盐是Na2HPO4。在一些实施方案中，盐是氯化钠。在一些实施方案中，缓冲溶液包括磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方案中，缓冲溶液包含甘露醇。在一些实施方案中，将冻干粉末悬浮于包含约10mM Na2HPO4缓冲剂、约0.022％SDS和约50mg/mL甘露醇并具有约7.5的pH的溶液中。
剂型
连接至本文描述的修饰的IL-2多肽的与PD-1选择性结合的多肽可以呈多种剂型。在一些实施方案中，连接至修饰的IL-2多肽的与PD-1选择性结合的多肽作为重构的冻干粉末给药。在一些实施方案中，连接至修饰的IL-2多肽的与PD-1选择性结合的多肽作为悬浮液给药。在一些实施方案中，连接至修饰的IL-2多肽的与PD-1选择性结合的多肽作为溶液给药。在一些实施方案中，连接至修饰的IL-2多肽的与PD-1选择性结合的多肽作为注射液给药。在一些实施方案中，连接至修饰的IL-2多肽的与PD-1选择性结合的多肽作为IV溶液给药。在一些实施方案中，连接至修饰的IL-2多肽的与PD-1选择性结合的多肽通过皮下施用或肌内施用来施用。
治疗方法
在一方面，本文描述了一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，该方法包括：向受试者施用有效量的如本文描述的连接至修饰的IL-2多肽的与PD-1选择性结合的多肽或药物组合物。在一些实施方案中，癌症是实体癌症。癌症或肿瘤可以是例如原发性癌症或肿瘤或转移性癌症或肿瘤。待治疗的癌症和肿瘤包括但不限于黑素瘤、肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)等)、上皮癌(carcinoma)(例如，皮肤鳞状细胞癌(CSCC)、尿路上皮癌(UC)、肾细胞癌(RCC)、肝细胞癌(HCC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、食管鳞状细胞癌(ESCC)、胃食管接合部(GEJ)癌、子宫内膜癌(EC)、Merkel细胞癌(MCC)等)、膀胱癌(BC)、微卫星不稳定性高(MSI-H)/错配修复缺陷(dMMR)实体瘤(例如，结肠直肠癌(CRC))、肿瘤突变负荷高(TMB-H)实体瘤、三阴性乳腺癌(TNBC)、胃癌(GC)、宫颈癌(CC)、胸膜间皮瘤(PM)、经典霍奇金淋巴瘤(cHL)或原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。
本文设想了与一种或更多种另外的活性剂的组合疗法。在一些实施方案中，第二治疗剂基于肿瘤类型、起源的肿瘤组织、肿瘤分期或肿瘤表达的基因突变来选择。例如，抗PD-1抗体可以与以下一种或更多种组合施用：化疗剂、免疫检查点抑制剂、免疫激动剂、生物癌症剂、低分子量抗癌剂、合成肽抗癌剂、抗癌蛋白降解剂、癌症特异性剂、细胞因子疗法、抗血管生成药物、靶向癌症代谢的药物、标记癌细胞表面进行破坏的抗体、抗体-药物缀合物、细胞疗法、常用的抗肿瘤剂、CAR-T疗法、溶瘤病毒、非药物疗法、神经传递阻断剂或神经元生长因子阻断剂。
在一些实施方案中，癌症是实体癌症。在一些实施方案中，实体癌症是肾上腺癌、肛门癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑癌、乳腺癌、类癌、宫颈癌、结肠直肠癌、食管癌、眼癌、胆囊癌、胃肠间质瘤、生殖细胞癌、头颈癌、肾癌、肝癌、肺癌、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、神经内分泌癌、口腔癌、口咽癌、卵巢癌、胰腺癌、小儿癌症(pediatric cancer)、阴茎癌、垂体癌、前列腺癌、皮肤癌、软组织癌、脊髓癌、胃癌、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、输尿管癌、子宫癌、阴道癌或外阴癌。
在一些实施方案中，癌症是血液癌症。在一些实施方案中，血液癌症是白血病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、多发性骨髓瘤、浆细胞瘤、移植后淋巴增生性紊乱或Waldenstrom巨球蛋白血症。
当受试者经历疾病的病征或症状的部分或全部缓解或减少、肿瘤负荷的减少、肿瘤负荷增加的时间延长(肿瘤进展)，并且特别地包括但不限于存活期的延长时，实现了有效响应。取决于包括复发次数、疾病分期和其他因素的预后因素，预期的无进展存活时间可以以数月至数年测量。延长存活期包括但不限于至少1个月(mo)、约至少2个月、约至少3个月、约至少4个月、约至少6个月、约至少1年、约至少2年、约至少3年、约至少4年、约至少5年等的时间。总存活期或无进展存活期也可以以数月至数年来测量。可选地，有效响应可以是受试者的症状或癌症负荷保持不变，且不恶化。治疗适应症的进一步指示在下文更详细地描述。在一些情况下，癌症或肿瘤被减少至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。
在一些实施方案中，连接至修饰的IL-2多肽的与PD-1选择性结合的多肽以有效量的修饰的IL-2多肽的单剂量施用，包括另外的实施方案，其中(i)连接至修饰的IL-2多肽的与PD-1选择性结合的多肽被每天一次施用；或(ii)连接至修饰的IL-2多肽的与PD-1选择性结合的多肽在一天跨度内向受试者施用多于一次。在一些实施方案中，连接至修饰的IL-2多肽的与PD-1选择性结合的多肽被施用每天一次、每隔一天一次、每周3次、每周一次、每2周一次、每3周一次、每4周一次、每5周一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每两周一次、每周3次、每周4次、每周5次、每周6次、每月一次、每月2次、每月3次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次或每6个月一次。施用包括但不限于通过任何合适的途径注射(例如，肠胃外、肠内、静脉内、皮下等)。在优选的实施方案中，组合物每周、每两周、每三周或每四周一次地被施用。
制备方法
在一方面，本文描述了一种制备组合物的方法，该方法包括提供与PD-1选择性结合的多肽，其中与PD-1选择性结合的多肽包含反应性基团(例如，缀合手柄)，使反应性基团与附接至细胞因子的互补反应性基团接触，并且形成组合物。所得组合物是本文提供的组合物中的任何一种。
在一些实施方案中，与PD-1选择性结合的多肽是抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，提供包含反应性基团的抗体包括将反应性基团附接至抗体。在一些实施方案中，反应性基团被位点特异性添加。在一些实施方案中，将反应性基团附接至抗体包括使抗体与包含与抗体的特定残基形成键的反应性官能团的亲和基团接触。在一些实施方案中，将反应性基团附接至抗体包括使抗体与酶接触。在一些实施方案中，酶被配置为将反应性基团位点特异性附接至抗体的特异性残基。在一些实施方案中，酶是糖基化酶或转谷氨酰胺酶。
在一些实施方案中，方法还包括将互补反应性基团附接至细胞因子。在一些实施方案中，将互补反应性基团附接至细胞因子包括化学合成细胞因子。
在一些实施方案中，方法包括制备修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，制备修饰的IL-2多肽的方法包括合成修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段并连接所述片段。在一些实施方案中，制备修饰的IL-2多肽的方法包括a.合成修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段，b.连接所述片段；并且c.使所连接的片段折叠。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段被化学合成。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段通过固相肽合成来合成。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段在自动化肽合成仪上合成。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽从2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种肽片段连接。在一些实施方案中，修饰的肽从2种肽片段连接。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽从3种肽片段连接。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽从4种肽片段连接。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽从2种至10种肽片段连接。
在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的两种或更多种片段被连接在一起。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的三种或更多种片段以顺序方式连接。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的三种或更多种片段以一锅反应连接。
在一些实施方案中，使连接的片段折叠。在一些实施方案中，折叠包括在修饰的IL-2多肽内形成一个或更多个二硫键。在一些实施方案中，连接的片段经历折叠过程。在一些实施方案中，连接的片段使用本领域熟知的方法折叠。在一些实施方案中，连接的多肽或折叠的多肽通过在其上附接一种或更多种聚合物来进一步修饰。在一些实施方案中，连接的多肽或折叠的多肽通过PEG化来进一步修饰。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽是合成的。
IL-2多肽的序列(SEQ ID NO)
表8
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在以上表8中，Nle是正亮氨酸残基，并且Hse是高丝氨酸残基。
尽管已经详细描述了本公开内容及其优点，但应当理解，本文可以进行各种变化、替代和改变，而不偏离如所附权利要求书中限定的本公开内容的精神和范围。
本公开内容在以下实施例中进一步说明，这些实施例仅为了说明目的而提供，并不意图以任何方式限制本公开内容。
实施例
实施例1：帕博利珠单抗-(IL-2多肽)免疫缀合物的制备
利用美国专利申请第US20200190165A1号的实施例2-4中描述的方法制备修饰的帕博利珠单抗多肽。简言之，带有DBCO缀合基团的加Aji帽(AJICAPTM由Ajinomoto Bio-Pharma Services，至少在PCT公布第WO2018199337A1号、PCT公布第WO2019240288A1号、PCT公布第WO2019240287A1号、PCT公布第WO2020090979A1号、Matsuda等人，Mol.Pharmaceutics 2021,18,4058-4066，和Yamada等人,AJICAP:Affinity PeptideMediated Regiodivergent Functionalization of Native Antibodies.Angew.Chem.,Int.Ed.2019,58,5592-5597，并且特别是美国专利公布第US20200190165A1号的实施例2-4中描述)的帕博利珠单抗多肽与(IL-2多肽)叠氮化物多肽在室温反应48小时。粗制帕博利珠单抗-(IL-2多肽)免疫缀合物使用疏水相互作用色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、DBCO-PEG捕获、蛋白A色谱或DBCO树脂柱纯化来分开。
AJICAPTM方法的示例过程如下：包含DBCO缀合手柄的修饰的抗体(例如，抗PD-1抗体，诸如LZM-009的帕博利珠单抗)使用从美国专利公布第US20200190165A1号的实施例2-4修改的方案制备。简言之，具有附接至Fc区赖氨酸残基侧链的游离巯基基团的抗PD1抗体通过使抗体与被配置为将受保护形式的巯基基团(例如，硫酯或可还原的二硫化物)递送至赖氨酸残基的亲和肽接触来制备。能够进行该反应的示例性肽如下文所示，如在Matsuda等人，Mol.Pharmaceutics 2021,18,4058-4066中报告的，该肽经由NHS酯将巯基基团选择性附接在抗体的Fc区的残基K248处：
靶向Fc区可选残基的可选亲和肽在以上引用的关于AJICAPTM技术的参考文献中描述，并且这样的亲和肽可以用于将期望的官能团附接至Fc区的可选残基(例如，K246、K288等)。例如，以上亲和肽的二硫化物基团可以被硫酯代替以提供巯基保护基团(例如，亲和肽的相关部分将具有以下结构：)。
然后去除保护基团，露出游离巯基(例如，通过硫酯的水解或用TCEP还原二硫化物)。然后使游离巯基与包含通过连接基团连接至DBCO缀合手柄的溴乙酰胺或溴酮基团的双官能试剂(例如，溴乙酰氨基--酰氨基-DBCO)反应。该方法可以用于产生这样的抗体，该抗体具有一个DBCO基团存在(DAR1)和/或两个DBCO基团附接至抗体(DAR2，抗体的每个Fc与一个DBCO基团连接)。然后使期望的叠氮化物修饰的IL-2多肽(例如，组合物AB)与DBCO修饰的抗体反应以产生免疫细胞因子。
在另一种实施方案中，包含单个DBCO缀合手柄的抗体通过首先使过量的抗PD-1抗体与适当负载的亲和肽反应以在适当去除保护基团(例如，二硫键还原或硫酯裂解)之后引入单个巯基来制备。然后使具有巯基反应性缀合手柄和DBCO缀合手柄的双官能连接基团(例如，溴乙酰氨基--酰氨基-DBCO)与单个巯基反应，以产生包含单个DBCO的抗体。然后将包含单个DBCO的抗体与合适的含叠氮化物的IL-2(例如，组合物AB)缀合以获得DAR为1的抗PD-1-IL-2免疫缀合物。
图2A示出了通过化学修饰技术对抗PD1抗体进行位点选择性修饰，以引入一个或两个缀合手柄。图2B示出了未修饰的帕博利珠单抗和使用AJICAP技术与DBCO缀合手柄缀合的帕博利珠单抗的Q-TOF质谱。图2C示出了IL2细胞因子的位点选择性缀合以产生具有DAR1或DAR 2的PD1-IL2。也可以制备具有介于1和2之间的混合DAR的PD1-IL2群体。图2D示出了粗制帕博利珠单抗和组合物AB缀合反应混合物的TIC色谱图(上图)和完整的RP-HPLC图(下图)。DAR0表示没用IL-2缀合的帕博利珠单抗，DAR1表示用1个IL-2缀合的帕博利珠单抗，并且DAR2表示用2个IL-2缀合的帕博利珠单抗。图2E示出了粗制帕博利珠单抗和(组合物AB)缀合反应混合物的Q-TOF质谱图，显示了DAR1和DAR 2物质(species)的形成。图2F示出了纯化的PD1-IL2的代表性RP-HPLC色谱图，图2G示出了纯化的PD1-IL2的代表性Q-TOF质谱，并且图2H示出了纯化的PD1-IL2(组合物B)的代表性分析SEC。
下文表9总结了根据本文提供的方法或别处描述的类似方法制备的多种免疫细胞因子。
表9：免疫细胞因子的特性
实施例2：PD-1结合ELISA测定(图3)
未修饰的和缀合的抗PD1抗体与PD-1(CD279)的相互作用通过ELISA测定来测量。对于这些研究，将Corning高结合半面积板(Fisher Scientific,Reinach,Switzerland)用25μL在PBS中的2.5μg/ml的未修饰的或缀合的抗PD1抗体在4℃包被过夜。然后将板用100μlPBS-0.02％Tween20洗涤四次。将板表面用25μl PBS-0.02％Tween20-1％BSA在37℃封闭1h。然后将板用100μl PBS-0.02％Tween20洗涤四次。将25微升来自Biolegend(789406,London,United Kingdom)的重组生物素化PD1/CD279蛋白以从23nM开始降至0.0003nM的5倍连续稀释液添加在PBS-0.02％Tween20-0.1％BSA中，并且在2h期间在37℃孵育。然后将板用100μlPBS-0.02％Tween20洗涤四次。将25微升在PBS-0.02％Tween20-0.1％BSA中以1:500稀释的链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(#RABHRP3，Merck，Buchs，Switzerland)添加在每个孔，并且在30min期间在室温孵育。然后将板用100μl PBS-0.02％Tween20洗涤四次。向每个孔添加50微升TMB底物试剂(#CL07,Merck,Buchs,Switzerland)，并且在5min期间在37℃孵育。在37℃5min之后，通过添加50μl/孔的0.5M H2SO4终止溶液来终止辣根过氧化物酶反应。然后在来自Perkin Elmer(Schwerzenbach,Switzerland)的EnSpire读板器上在450nm处测量ELISA信号。
表10：如通过ELISA测量的免疫细胞因子与PD-1相互作用的KD值
NT：未测试
图3示出了描述未修饰的和缀合的抗PD1抗体与PD1/CD279配体结合的能力的图，该图在y轴上示出了ELISA信号，并且在x轴上示出了生物素化的PD-L1蛋白的剂量。该图中测试的未缀合的参考抗体和缀合的抗体分别是组合物帕博利珠单抗(PEMBROLIZUMAB)、纳武单抗(NIVOLUMAB)、LZM-009和组合物A、组合物C、组合物D、组合物E、组合物F、组合物G和组合物H。
PD-1/PD-L1阻断生物测定：PD-1/PD-L1阻断生物测定用于确定帕博利珠单抗-(IL-2多肽)免疫缀合物阻断PD-1/PD-L1相互作用的能力。
未修饰的和缀合的抗PD1抗体干扰PD1/PDL1途径的能力使用来自Promega(目录号J1250,Madison,WI,USA)的PD-1/PD-L1阻断生物测定来测量。PD-1/PD-L1阻断生物测定是基于生物发光细胞的测定，基于效应细胞与模拟免疫突触的靶细胞的共培养。表达人类PD-1和由NFAT响应元件(NFAT-RE)驱动的萤光素酶报告物的Jurkat T细胞被表达人类PD-L1的CHO-K1细胞和设计用于激活Jurkat的同源TCR的工程化细胞表面蛋白激活。同时相互作用PD-1/PD-L1抑制TCR信号传导并抑制NFAT-RE-介导的发光。添加阻断PD-1/PD-L1相互作用的抗PD-1或抗PD-L1抗体释放抑制信号，恢复TCR激活并导致NFAT-RE发光报告物信号的获得。
简言之，将PD-L1 aAPC/CHO-K1靶细胞铺板在白色组织培养96孔板中，并且在37℃/5％CO2培养过夜。在从1uM开始降至0.002nM的四倍连续稀释液中测量测试分子，并且在靶细胞上预孵育10min，然后添加新鲜解冻的PD-1Jurkat效应细胞。在37℃/5％CO2 6h之后，NFAT-RE发光报告物的活性通过添加Bio-Glo试剂来评价，并且在Perkin Elmer(Schwerzenbach,Switzerland)的EnSpire读板器(1秒/孔)上测量。
图4示出了描述未修饰的和缀合的抗PD1抗体阻断PD1/PDL1途径的能力的图，该图在y轴上示出了效应细胞NFAT-RE报告物的平均发光强度，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD1抗体的剂量。该图中测试的未缀合的参考抗体和缀合的抗体分别是帕博利珠单抗和组合物B。该图中测试的修饰的IL-2多肽是Proleukin和组合物AA。
未修饰的和缀合的抗PD1抗体与人类新生儿Fc受体(FcRn)在pH 6的相互作用使用来自Perkin Elmer(Schwerzenbach,Switzerland)的人类FcRn结合试剂盒(AL3095C)来测量。FcRn和IgG结合的/>检测使用IgG包被的/>受体珠来与链霉抗生物素蛋白包被的供体珠上捕获的生物素化人类FcRn相互作用。当参考IgG与FcRn结合时，供体珠和受体珠接近，使得单线态氧转移，触发受体珠中的级联能量转移反应，导致在615nm的光发射的尖锐峰。向/>混合物中添加游离IgG抗体产生FcRn与参考抗体结合的竞争，导致信号丢失。
简言之，在从5uM开始降至64pM，并且与反应混合物在pH 6MES缓冲液中孵育的连续稀释液中测量测试分子，该反应混合物由800nM重组生物素化人类FcRn、40μg/ml人类IgG缀合的受体珠和40μg/ml链霉抗生物素蛋白包被的供体珠组成。在黑暗中在23℃90min之后，在来自Perkin Elmer(Schwerzenbach,Switzerland)的EnSpire读板器上测量/>信号(在680nm激发，在615nm发射)。
图5示出了描述未修饰的和缀合的抗PD1抗体在pH 6与人类新生儿Fc受体(FcRn)结合的能力的图，该图在y轴上示出了平均FcRn-IgG信号，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD1抗体的剂量。该图中测试的未缀合的参考抗体和缀合的抗体分别是帕博利珠单抗、LZM-009和组合物A、组合物D、组合物E、组合物H、组合物J、组合物K。
表11：alphaISA法测量的免疫细胞因子与人类FcRn受体在pH 6相互作用的KD值
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NT：未测试。
实施例3：人类FcγR结合测定(图6)
未修饰的和缀合的抗PD1抗体与人类Fcγ受体I(FcγRI/CD64)、人类Fcγ受体IIa(FcγRIIa/CD32a)、抑制性人类Fcγ受体IIb(FcγRIIb/CD32b)和人类Fcγ受体III FcγR3a/CD16的相互作用通过ELISA测量。简言之，将Corning高结合半面积板(FisherScientific,Reinach,Switzerland)用25μl在PBS中的2.5μg/ml的未修饰的和缀合的抗PD1抗体在4℃包被过夜。然后将板用100μl PBS-0.02％Tween20洗涤四次。将板表面用25μlPBS-0.02％Tween20-1％BSA在37℃封闭1h。然后将板用100μl PBS-0.02％Tween20洗涤四次。然后25微升重组人类FcγRI/CD64蛋白(R&D systems,1257-FC-050,CF)、重组人类FcγRIIA/CD32a(H167)蛋白(R&D systems,9595-CD-050,CF)、重组人类FcγRIIB/CD32b Avi标签蛋白(R&D systems,AVI1875-050,CF)或重组人类FcγRIIIA/CD16a蛋白(R&D systems,4325-FC-050；CF)以范围为1000nM至0.001nM的五倍连续稀释液添加到PBS-0.02％Tween20-0.1％BSA中，并且在2h期间在37℃孵育。然后将板用100μl PBS-0.02％Tween20洗涤四次。将25微升在PBS-0.02％Tween20-0.1％BSA中以1:500稀释的链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(#RABHRP3，Merck，Buchs，Switzerland)添加到每个孔，并在室温孵育30min。然后将板用100μl PBS-0.02％Tween20洗涤四次。向每个孔添加50微升TMB底物试剂(#CL07,Merck,Buchs,Switzerland)，并且在5min期间在37℃孵育。在37℃5min之后，通过添加50μl/孔的0.5M H2SO4终止溶液来终止辣根过氧化物酶反应。然后在来自Perkin Elmer(Schwerzenbach,Switzerland)的EnSpire读板器上在450nm处测量ELISA信号。在黑暗中在23℃90min之后，
表12：如通过ELISA测量的免疫细胞因子与人类Fcγ受体相互作用的KD值
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NT：未测试。
图6A示出了描述未修饰的和缀合的抗PD1抗体与人类Fcγ受体I(CD64)、人类Fcγ受体IIa(CD32a)、人类Fcγ受体IIb(CD32b)和人类Fcγ受体IIIa(CD16)结合的能力的曲线图，该图在y轴上示出了平均ELISA信号，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD1抗体的剂量。未缀合的参考抗体是帕博利珠单抗、LZM-009和组合物A，并且该图中测试的结合抗体是组合物C、组合物D和组合物H。
图6B示出了描述未修饰的和缀合的抗PD1抗体与人类Fcγ受体I(CD64)、人类Fcγ受体IIa(CD32a)、人类Fcγ受体IIb(CD32b)和人类Fcγ受体IIIa(CD16)结合的能力的曲线图，该图在y轴上示出了平均ELISA信号，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD1抗体的剂量。该图中测试的缀合的抗体是组合物E、组合物J和组合物K。
实施例4：IL2-诱导的PD1阳性与PD1阴性Mo7e细胞中pStat5的激活(图7A-图7B)
建立了稳定表达人类PD-1的人类Mo7e细胞系。简言之，将250×105个Mo7e细胞用携带人类PD1基因的慢病毒颗粒(PDCD1 NM_005018；Origene,目录号:RC210364L3V)以4的MOI(感染复数)转导。在完全培养基(RPMI、20％FBS、10ng/ml GM-CSF)中，在存在5μg/ml聚凝胺和10mM HEPES的情况下，在90min期间，在37℃以1260g进行旋转感染(spinfection)。转导之后5天，添加0.75μg/ml的嘌呤霉素以选择PD-1阳性细胞。通过表面染色验证PD-1的稳定且均匀表达。
进行实验以确定多种IL-2多肽对PD-1阴性(亲本未转导菌株)和表达PD-1(转导)的Mo7e细胞的作用。将细胞以每孔100,000个细胞进行分配，并且在37℃/5％CO2用未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽的949nM开始浓度降至10pM的10倍连续稀释液刺激40min。孵育之后，使用转录因子磷酸缓冲试剂盒(BD Biosciences)固定和透化细胞，随后对PD-1和pStat5进行表面和细胞内免疫染色，以实现细胞鉴定和Stat5(信号转导及转录激活因子5)磷酸化水平的测量。FACS(荧光激活细胞分选)测量用来自Acea的Quanteon流式细胞仪完成。
图7A示出了描述亲本未转导Mo7e(PD1-)细胞和稳定转导的(PD1+)Mo7e细胞上PD-1/CD279的表面表达水平的图。
图7B示出了描述未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽对体外诱导PD1阴性(黑色实心符号)和PD1阳性(灰色实心符号)Mo7e细胞上的IL-2信号传导途径的作用的图，该图在y轴上示出了磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均EC50值，并且在x轴上示出了修饰的IL-2多肽和免疫细胞因子的剂量。该图中测试的修饰的IL-2多肽是Proleukin和组合物AB。该图中测试的免疫细胞因子是组合物A、组合物C、组合物H、组合物L以及Her2靶向的免疫细胞因子组合物O(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)作为对照。
表13：PD1-和PD1+Mo7e细胞中STAT5磷酸化测定的EC50值
NT：未测试
实施例5：IL2诱导原代T细胞中的pStat5激活(图8-图10)
进行实验以确定不同的IL-2多肽对人类T细胞群体的影响。原代泛T细胞(CD4+T细胞、CD8+T细胞和Treg T细胞)通过使用ficoll梯度离心进行外周血单个核细胞(PBMC)纯化，随后用磁珠负分离，从健康供者血沉棕黄层(buffy coat)中获得，并且然后冷冻保存直至使用。将泛T细胞解冻，允许它们在T细胞培养基(RPMI 10％FCS、1％谷氨酰胺、1％NEAA、25μMβMeoH、1％丙酮酸钠(Napyrovate))中恢复过夜，并在用PBS的两个洗涤步骤之后，将细胞重悬于PBS中。当指定时，将细胞与100nM未缀合的抗PD1抗体帕博利珠单抗在20min期间在37℃预孵育。然后将细胞以每孔200,000个细胞进行分配，并且在37℃/5％CO2用未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽的316nM开始浓度降至3pM的3.16倍连续稀释液刺激40min。孵育之后，将细胞使用转录因子磷酸缓冲液试剂盒固定并透化，随后对CD4、CD8、CD25、FoxP3、CD45RA和pStat5进行表面和细胞内免疫染色，以能够实现细胞亚群鉴定和测量Stat5(信号转导及转录激活因子5)磷酸化水平。FACS(荧光激活细胞分选)测量用来自Acea的NovoCyte或Quanteon流式细胞仪进行。
将以下T细胞亚群的pStat5 MFI(中位荧光强度)信号针对野生型或修饰的IL-2多肽的浓度作图。半最大有效浓度(EC50)使用GraphPad PRISM软件基于可变斜率四参数分析进行计算。
用于T细胞亚群鉴定的门控策略
T-Reg CD4+、CD25Hi、FoxP3+
CD8 Teff CD8+
幼稚CD8 Teff CD8+、CD45RA+
记忆性CD8 Teff CD8+、CD45RA-
CD4 conv CD4+、FoxP3-
表14：原代人类T细胞中STAT5磷酸化测定的EC50值
图8示出了描述未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽对人类T细胞体外样品中Teff和Treg细胞诱导的作用的图，该图在y轴上示出了磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均荧光强度，并且在x轴上示出了修饰的IL-2多肽和免疫细胞因子的剂量。该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物AA。该图中测试的免疫细胞因子是组合物A、组合物B和组合物C。
图9A示出了描述PD-1/CD279在从健康供者的外周血中新鲜分离的静息记忆性(CD45RA-)和幼稚(CD45RA+)CD8+Teff细胞上的表面表达水平的图。
图9B示出了描述未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽对人类T细胞体外样品中静息记忆性(CD45RA-)和幼稚(CD45RA+)CD8+Teff细胞的诱导的作用的图，该图在y轴上示出磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均荧光强度，并且在x轴上示出修饰的IL-2多肽和免疫细胞因子的剂量。该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物AA，并且该图中测试的免疫细胞因子是组合物B以及免疫细胞因子组合物N(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)作为对照。
图10A示出了测量在存在或不存在过量未缀合的抗PD1抗体帕博利珠单抗的情况下未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽对人类T细胞体外样品中静息幼稚(CD45RA+)CD8+Teff细胞的诱导的作用的图，该图在y轴上示出了磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均荧光强度，并且在x轴上示出了修饰的IL-2多肽和免疫细胞因子的剂量。该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物AA，并且该图中测试的免疫细胞因子是组合物B以及Her2靶向的免疫细胞因子组合物N(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)作为对照。
图10B示出了测量在存在或不存在过量未缀合的抗PD1抗体帕博利珠单抗的情况下未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽对人类T细胞体外样品中静息记忆性(CD45RA-)CD8+Teff细胞的诱导的作用的图，该图在y轴上示出了磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均荧光强度，并且在x轴上示出了修饰的IL-2多肽和免疫细胞因子的剂量。该图中测试的修饰的IL-2多肽是组合物AA，并且该图中测试的免疫细胞因子是组合物B以及Her2靶向的免疫细胞因子组合物N(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)作为对照。
实施例6：携带肿瘤的小鼠中的PK/PD研究(图11-图13)
在小鼠中进行体内PK/PD研究。将初始6-8周龄的BALB/c-hPD1雌性小鼠(GemPharmatech Co,Ltd,Nanjing,China)用在0.1mL PBS中的野生型CT26肿瘤细胞(3×105)在左侧腹皮下接种，用于肿瘤发展。将动物随机化(使用基于Excel的随机化软件，根据肿瘤体积进行分层随机化)，并且当平均肿瘤体积达到大约186mm3时开始治疗。用组合物A治疗的动物接受单次10mL/kg团注静脉内(i.v.)注射1和2.5mg/kg与修饰的IL-2多肽缀合的PD-1抗体。用对照Her2靶向的免疫细胞因子组合物O(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)治疗的动物接受单次10mL/kg团注静脉内(i.v.)注射2.5mg/kg与修饰的IL-2多肽缀合的抗Her2抗体。接种之后，每天检查动物的发病率和死亡率。在那时，检查对动物的肿瘤生长和正常行为的影响，诸如活动能力、食物和水的消耗、体重增加/损失(每周两次测量体重)、眼睛/毛发缠结(hair matting)和任何其他异常影响。每周三次使用卡尺在两个维度测量肿瘤尺寸，并且体积使用以下式以mm3表示：V＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。死亡和观察到的临床体征基于每个亚群内的动物数量进行记录。
药代动力学研究包括9个时间点(5min、1h、6h、12h、24h、72h、96h、120h、168h)，每个时间点取样3只小鼠。在指定的时间点，在存在EDTA的情况下，经由尾静脉取样或经由心脏穿刺(终点)收集血液样品。另外地，注射之后72h、96h、120h、168h每组处死3只小鼠，并且收集肿瘤样品。
将来自每只小鼠的新鲜肿瘤样品单独切碎，并且在C管中用混合酶消化。将C管附接到Gentle MACS解离器的套筒上，然后运行程序“m_imptumor_01_01”一次。然后将C管在37℃孵育30分钟，随后进行另一轮程序“m_imptumor_01_01”。将消化的组织通过70μm细胞过滤器过滤。将细胞用DPBS洗涤两次，然后染色。
将在存在EDTA的情况下收集的小鼠血液立即在4℃以4,000rpm离心样品管5min。收集血浆(上清液)并储存在-80℃，直到生物分析。然后将1体积的细胞沉淀物与20体积的1×红细胞裂解溶液混合。然后孵育3min并离心。如果血液裂解不良，将再次用2mL 1×红细胞裂解溶液悬浮，并孵育3min。
将细胞用DPBS洗涤两次。将每次测试100μL重悬的细胞(浓度为1000万/mL)接种在96V孔板上。离心之后，将细胞用100μL DPBS悬浮。添加活的/死的BV510，并在黑暗中在4℃孵育30min。将细胞用DPBS洗涤两次。细胞外抗体孵育之后，将细胞用染色缓冲液洗涤两次，固定并透化30min。添加纯化的大鼠抗小鼠CD16/CD32孵育5min，并根据具体细胞内抗体说明书中指示的程序对细胞进行染色。然后将细胞洗涤两次，并用200μL染色缓冲液悬浮。将染色的细胞通过BD Fortessa X20流式细胞仪分析。
表15：用以下抗体组进行染色。
# 荧光染料 抗体 供应商 目录号 克隆
1 BUV395 CD8 BD 563786 53-6.7
2 BUV737 F4/80 BD 749283 T45-2342
3 BV421 CD62L BioLegend 104436 MEL-14
4 BV510 Live/Dead Invitrogen L34957 -
5 BV605 MHCII BioLegend 107639 M5/114.15.2
6 BV785 muPD-L1 BioLegend 124331 10F.9G2
7 BV785 Isotype BioLegend 400647 RTK4530
8 FITC CD45 BD 553080 30-F11
9 PerCP-Cy5.5 CD44 BD 560570 IM7
10 PE CD206 eBioscience 12-2061-82 MR6F3
11 PE-CF594 CD49b BD 562453 DX5
12 PE-Cy7 CD4 BioLegend 100422 GK1.5
13 APC hPD-1 BioLegend 621610 A17188B
14 APC Isotype BioLegend 400322 MPC-11
15 AF700 CD11b BD 557960 M1/70
16 APC-Cy7 CD3 BioLegend 100222 17A2
图11A示出了描述PD-1靶向的和非靶向的免疫细胞因子对hPD1人源化BALB/c小鼠中CT26同系结肠癌肿瘤生长的作用的图。该图中测试的免疫细胞因子是组合物A，在单次注射方案之后作为单一剂以1和2.5mg/kg进行测试。对照Her2靶向的免疫细胞因子组合物O(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)也以2.5mg/kg进行测试。(平均值±SEM)。
图11B示出了描述PD-1靶向的和非靶向的免疫细胞因子对治疗之后7天hPD1人源化BALB/c小鼠中CT26同系结肠癌肿瘤生长的作用的柱状图。该图中测试的免疫细胞因子是组合物A，在单次注射方案之后作为单一剂以1和2.5mg/kg进行测试。对照Her2靶向的免疫细胞因子组合物O(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)也以2.5mg/kg进行测试。(平均值±SEM；**单向ANOVAP值<0.001)。
图12A示出了描述PD-1靶向的和非靶向的免疫细胞因子对治疗之后7天携带CT26肿瘤的hPD1人源化BALB/c小鼠的血液和肿瘤中的幼稚(CD62L高CD44低)CD8+T细胞的扩增的作用的图。该图中测试的免疫细胞因子是组合物A，在单次注射方案之后作为单一剂以1和2.5mg/kg进行测试。对照Her2靶向的免疫细胞因子组合物O(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)也以2.5mg/kg进行测试。(n＝3；平均值±SEM)。
图12B示出了描述PD-1靶向的和非靶向的免疫细胞因子对治疗之后7天携带CT26肿瘤的hPD1人源化BALB/c小鼠的血液和肿瘤中的效应记忆性(CD62L阴性CD44高)CD8+T细胞的扩增的作用的图。该图中测试的免疫细胞因子是组合物A，在单次注射方案之后作为单一剂以1和2.5mg/kg进行测试。对照Her2靶向的免疫细胞因子组合物O(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)也以2.5mg/kg进行测试。(n＝3；平均值±SEM)。
图13A示出了描述免疫细胞因子的PD-1靶向和非靶向对其在携带CT26肿瘤的hPD1人源化BALB/c小鼠中的持久性的作用的图，该图在y轴上示出了PD-1靶向的和对照免疫细胞因子的血浆或肿瘤浓度，并且在x轴上示出了时间。该图中测试的免疫细胞因子是组合物A，在单次注射方案之后作为单一剂以1和2.5mg/kg进行测试。对照Her2靶向的免疫细胞因子组合物O(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)也以2.5mg/kg进行测试。(n＝3；平均值±SD)。
图13B示出了描述免疫细胞因子的PD-1靶向和非靶向对其在携带CT26肿瘤的hPD1人源化BALB/c小鼠的肿瘤与血液中相比的持久性的作用的图，该图在y轴上示出了PD-1靶向的和对照免疫细胞因子的肿瘤/血浆浓度的比，并且在x轴上示出了时间。该图中测试的免疫细胞因子是组合物A，在单次注射方案之后作为单一剂以1和2.5mg/kg进行测试。对照Her2靶向的免疫细胞因子组合物O(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)也以2.5mg/kg进行测试。(n＝3；平均值±SEM)。
实施例7：效力研究(图14A-图14B)
在小鼠中进行了体内效力研究。将初始6-8周龄的C57BL/6-hPD1雌性小鼠(GemPharmatech Co,Ltd,Nanjing,China)用在0.1mL PBS中的MC38肿瘤细胞(3×105)在右上侧腹皮下接种，用于肿瘤发展。将动物随机化(使用基于Excel的随机化软件，根据肿瘤体积进行分层随机化)，并且当平均肿瘤体积达到大约90mm3时开始治疗。用组合物H治疗的动物接受单次10mL/kg团注静脉内(i.v.)1mg/kg与修饰的IL-2多肽缀合的PD-1抗体。接种之后，每天检查动物的发病率和死亡率。在那时，检查对动物的肿瘤生长和正常行为的影响，诸如活动能力、食物和水的消耗、体重增加/损失(每周两次测量体重)、眼睛/毛发缠结(hair matting)和任何其他异常影响。主要终点是延迟的肿瘤生长或完全的肿瘤消退。每周三次使用卡尺在两个维度测量肿瘤尺寸，并且体积使用以下式以mm3表示：V＝0.5a×b2，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。死亡和观察到的临床体征基于每个亚群内的动物数量进行记录。
图14A示出了描述单次注射缀合的抗PD1抗体对hPD1 C57BL/6小鼠中MC38同系结肠癌肿瘤生长的作用的图。该图中测试的免疫细胞因子是组合物H，作为单一剂以1mg/kg作为单次i.v.注射液进行测试。(n＝8；平均值±SEM)。
图14B示出了描述在治疗7天之后单次注射缀合的抗PD1抗体对hPD1 C57BL/6小鼠中MC38同系结肠癌肿瘤生长的作用的柱状图。该图中测试的免疫细胞因子是组合物H，作为单一剂以1mg/kg单次i.v.注射液进行测试。(n＝8只动物；平均值±SEM；**单向ANOVAP值<0.005)。
实施例8：组合物AB的合成
包含附接在残基F42Y处的叠氮基-PEG、在Y45处的PEG基团并且具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列的修饰的IL-2多肽组合物AB通过连接使用固相肽合成(SPPS)合成的单独的肽来合成。单独的肽使用下文描述的方法在自动化肽合成仪上合成。本文提供的相关的修饰的IL-2使用类似方案合成。
商业上可得的试剂从Sigma-Aldrich、Acros、Merck或TCI Europe购买，并且不经进一步纯化地使用。用于固相肽合成的具有合适侧链保护基团的Fmoc氨基酸从Novabiochem、Christof Senn Laboratories AG或PeptART购买，并且将其按供应使用。用于肽合成的聚乙二醇衍生物由PolyPure购买。来自Sigma Aldrich的HPLC级CH3CN用于分析型和制备型HPLC纯化。
肽和蛋白的高分辨率质谱(FTMS)使用4-羟基-α-氰基肉桂酸(HCCA)作为基质在配有双ESI/MALDI-FTICR源的Bruker solariX(9.4T磁体)上测量。CD光谱用具有光程长为1.0mm的池的Jasco J-715光谱仪记录。在以下连续扫描模式在25℃收集光谱：标准灵敏度(100mdeg)，0.5nm数据间距(data pitch)，50nm/min扫描速度，1nm带宽和5次积累。
肽和蛋白片段通过反相高效液相色谱(RP-HPLC)进行分析和纯化。肽分析和反应监测在具有双泵、混合器和在线脱气器(in-line degasser)、自动进样器、可变波长UV检测器(在220nm和254nm处同时监测洗脱液)和装有100μL注射环的注射器的分析型Jasco仪器上进行。肽片段的纯化在具有20mL注射环的Gilson制备型仪器上进行。在两种情况下，流动相是含有0.1％TFA的MilliQ-H2O(缓冲液A)和含有0.1％TFA的HPLC级CH3CN(缓冲液B)。分析型HPLC在bioZenTM Intact C4柱(3.6μm,150×4.6mm)或Shiseido Capcell Pak MG III柱(5μm,150×4.6mm)上以1mL/min的流量进行。制备型HPLC在Shiseido Capcell Pak UG80C18柱(5μm,50mm I.D.×250mm)上以40mL/min的流量进行。
使用Fmoc SPPS化学在Syro I或CS Bio 136X肽合成仪上合成肽区段。使用以下具有侧链保护基团的Fmoc氨基酸：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(1-Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH。在必要时将Fmoc-假脯氨酸二肽(Fmoc-pseudoprolinedipeptides)掺入合成。Fmoc脱保护用DMF中的20％哌啶进行(2×8min)，并在304nm处通过UV以反馈回路监测以确保完全Fmoc去除。用Fmoc-氨基酸(3.0-5.0当量，相对于树脂取代)、作为偶联试剂的HCTU或HATU(2.9-4.9当量)、以及在DMF中的DIPEA或NMM(6-10当量)在室温或50℃进行偶联。预激活3min之后，将溶液转移并允许与树脂上的肽反应30min或2h，取决于氨基酸。在一些情况下，需要双重偶联。偶联之后，将树脂用DMF中的20％乙酸酐处理，用于对任何未反应的游离胺加帽。在需要时进行LiCl洗涤。烯丙基酯脱保护使用苯基硅烷(24当量)和四(三苯基膦)钯(0)(0.5当量)在无水二氯甲烷中进行。
通过SPPS进行的肽区段合成通过对相应树脂进行微裂解和分析来监测。使用95:2.5:2.5TFA:DODT:H2O(在α酮酸树脂上合成的α酮酸区段)或95:2.5:2.5TFA:TIPS:H2O(在2-氯三苯甲基聚苯乙烯树脂上合成的肽)的混合物将肽从树脂裂解，持续2小时。滤去树脂，并将滤液蒸发，并用冷乙醚处理，研磨并离心。仔细地倾析乙醚层，并将剩余物重悬于乙醚中，研磨并离心。重复乙醚洗涤两次。
1.1IL-2的组合物AB变体的合成
IL-2(1-39)-Leu-α-酮酸的合成
IL2(1-39)-Leu-α-酮酸(参见SEQ ID NO:3)在预先装载具有0.25mmol/g的取代量(substitution capacity)的保护的Fmoc-α-Leu-酮酸的Rink-酰胺树脂上合成。为此，将Fmoc-Rink酰胺MBHA树脂(4g)在DMF中预溶胀15min，并进行Fmoc-脱保护。将Fmoc-亮氨酸-保护的-α-酮酸(795mg，1mmol，1.00当量)溶解在40mL DMF中，并用HATU(361mg，0.95mmol，0.95当量)和DIPEA(348μL，2mmol，2.00当量)预活化。允许偶联在室温继续进行6h。然后，对树脂加帽，随后进行Fmoc-脱保护。使用一般方法部分中描述的程序，通过自动化Fmoc SPPS在0.250mmol规模上进行该区段的合成直到Ala1。通过使用(95:2.5:2.5)TFA:DODT:H2O的混合物进行微裂解和分析持续1.5h来监测肽合成的进展。HPLC分析在C18柱上在60℃进行。遵循一般方法中描述的程序，使用95:2.5:2.5TFA:DODT:H2O的混合物(15mL/g树脂)将肽从树脂裂解，持续2h。通过以下制备型HPLC进行粗IL2(1-39)的纯化：使用Shiseido capcellpak C18柱(50×250mm)，梯度为在30min内含有0.1％TFA的30％至80％CH3CN。将纯的产物级分汇集(pool)并冻干以获得650mg纯的IL2(1-39)1-39)-Leu-α-酮酸(对于肽合成、树脂裂解和纯化步骤，收率为69％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C204H346N56O61[M]，计算的m/z：4556.5694；测量的m/z：4556.5783。
组合物AB的Opr-IL2(42-69)光保护的-Leu-α-酮酸的合成
Opr-IL2(42-69)(参见SEQ ID NO:3)光保护的-Leu-α-酮酸区段在预先装载具有0.25mmol/g的取代量的Fmoc-亮氨酸-光保护的-α-酮酸的Rink酰胺MBHA树脂上制备。为此，将4g Fmoc-Rink酰胺MBHA树脂用DMF溶胀15min，并进行Fmoc-脱保护。将Fmoc-亮氨酸-光保护的-α-酮酸(795mg，1mmol，1.00当量)溶解在40mL DMF中，并用HATU(361mg，0.95mmol，0.95当量)和DIPEA(348μL，2mmol，2.00当量)预激活。将反应在室温搅拌6h。然后，对树脂加帽，随后进行Fmoc-脱保护。使用一般方法部分中描述的程序，通过自动化Fmoc SPPS在0.151mmol规模上进行该区段的合成直到Nle46。Cys(Acm)-OH(10当量，相对于树脂)用于使用DIC(5当量，相对于树脂)通过对称酸酐方法进行Cys58的偶联，在rt持续2h。预形成的氨基酸Fmoc-Tyr(Ac0.5kDaPEG)-OH(3当量)使用HATU(2.9当量)和DIPEA(6当量)通过单偶联在位置45中被偶联。Phe44和Lys43通过自动化SPPS偶联，随后在位置42和位置41中分别手动偶联Fmoc Tyr-烯丙基乙酸酯和Boc-5-(S)-氧杂脯氨酸。烯丙基酯脱保护遵循建立的标准条件使用苯基硅烷(449μL，3.6mmol，24当量)和Pd(Ph3)4(87mg，0.075mmol，0.5当量)在rt进行30min。脱保护之后，O-(2-氨基乙基)-O’-(2-叠氮乙基)九乙二醇(237mg，0.450mmol，3当量)在50℃偶联1.5h。通过使用(95:2.5:2.5)TFA:DODT:H2O的混合物进行微裂解和分析持续1.5h来监测肽合成的进展。HPLC分析在C18柱上在60℃进行。遵循一般方法中描述的程序，使用95:2.5:2.5TFA:DODT:H2O的混合物(15mL/g树脂)将肽从树脂裂解，持续2h。使用冷醚:戊烷混合物(1:1)来处理和洗涤粗肽。通过以下制备型HPLC进行粗IL2(42-69)的纯化：使用Shiseido capcell pak C18柱(50×250mm)，以两步骤梯度：首先，在5min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的10％至30％CH3CN，然后，在30min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的30％至60％CH3CN。将纯的产物级分汇集并冻干以获得110.6mg纯的IL2(42-69)(对于肽合成、树脂裂解和纯化步骤，收率为16％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C230H376N46O74S[M]，计算的m/z：4998.6794；测量的m/z：4998.6749。
组合物AB的Fmoc-Opr IL2(72-102)-Phe-α-酮酸的合成
Fmoc-Opr IL2(72-102)-苯丙氨酸-α-酮酸在预先装载具有～0.25mmol/g的取代量的Fmoc-Phe-保护的-α-酮酸的Rink酰胺ChemMatrix树脂上合成。使用HCTU作为偶联试剂，通过自动化Fmoc SPPS在0.588mmol规模上进行合成直到Ala73。残基72(Fmoc-Leu)的偶联用HATU作为偶联试剂来进行。将偶联在45℃重复另外两次，以确保完全偶联。在rt使用HATU(2.95当量，相对于树脂)和NMM(6.00当量，相对于树脂)将Fmoc-5-氧杂脯氨酸(3.00当量，相对于树脂)手动偶联至游离胺，持续2h。通过使用(95:2.5:2.5)TFA:DODT:H2O的混合物进行微裂解和分析持续2h来监测肽合成的进展。HPLC分析在C18柱上在60℃进行。使用95:2.5:2.5TFA:DODT:H2O的混合物(15mL/g树脂)将肽从树脂裂解，持续2.0h。通过以下制备型HPLC进行粗区段的纯化：使用在60℃预热的Shiseido Capcell Pak C18柱(50×250mm)，梯度为在30min内含有0.1％TFA的20％至75％CH3CN。将纯的产物级分汇集并冻干以获得>98％纯度的Fmoc-Opr IL2(72-102)-Phe-α-酮酸(147.9mg，对于合成、裂解和纯化步骤，收率为6％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C184H285N47O53[M]，计算的m/z：4001.1051；测量的m/z：4001.1227。
Opr-IL2(105-133)的合成
Opr-IL2(105-133)在预先装载具有0.25mmol/g的取代量的Fmoc-Thr-OH的2-氯三苯甲基-树脂上合成。加帽(二异丙基乙胺、甲醇)之后，通过自动化Fmoc SPPS在0.34mmol规模(1.5g树脂)上进行合成，直到Glu106。Cys(Acm)-OH(10当量，相对于树脂)用于使用DIC(5当量，相对于树脂)通过对称酸酐方法进行Cys105的偶联，在rt持续2h。然后，使用HATU(1.95当量)和NMM(4当量)将Boc-5-氧杂脯氨酸(2.00当量，相对于树脂)偶联至树脂上的游离胺。通过使用(95:2.5:2.5)TFA:TIPS:H2O的混合物进行微裂解和分析持续1.5h来监测肽合成的进展。HPLC分析在C18柱上在60℃进行。使用95:2.5:2.5TFA:TIPS:H2O的混合物(15mL/g树脂)将肽从树脂裂解，持续2.0h。通过以下制备型HPLC进行粗Opr-IL2(105-133)的纯化：使用在60℃预热的Shiseido Capcell Pak C4柱(50×250mm)，梯度为在10min内含有0.1％TFA的10％至65％CH3CN，然后在20min内含有0.1％TFA的65％至95％CH3CN。将纯的产物级分汇集并冻干以获得>98％纯度的Opr-IL2(105-133)(108.5mg，对于合成、裂解和纯化步骤，收率为9％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS来确认产物的纯度和精确质量。对于C158H242N37O52S[M+H]，计算的m/z：3521.7145；测量的m/z：3521.7140。
组合物AB的IL2-Seg12通过KAHA连接的合成
KAHA连接：将Seg1(44mg，9.6μmol，1.2当量)和Seg2(40mg，8.0μmol，1当量)溶解在包含0.1M草酸的DMSO:H2O(9:1)中(400μL，20mM)，并允许在60℃反应20h。通过将连接瓶包裹在铝箔中使其避光。通过以下uHPLC监测KAHA连接的进展：使用在60℃的Phenomenex C18柱(150×4.6mm)，以包含0.1％TFA的CH3CN/H2O作为流动相，梯度为在7min内5％至95％CH3CN。
光-脱保护和纯化：连接完成之后，将混合物用含有0.1％TFA的CH3CN/H2O(1:1)稀释～20倍(8mL)，并在365nm波长处辐照1h。光解反应的完成通过使用先前描述方法将样品注入到uHPLC上来确认。光脱保护的样品通过以下制备型HPLC纯化：使用保持在60℃的Shiseido Capcell Pack UG80 C18柱(50×250mm)，以2步骤梯度：含有0.1％TFA的在水中的CH3CN的双梯度：在5min内10％至35％，然后在35min内35％至65％，以40mL/min的流量，以包含0.1％TFA的CH3CN和MQ-H2O作为洗脱液。将包含产物的级分汇集并冻干以得到纯的Seg12(25.4mg，对于连接和纯化步骤，收率为40％)。对于C422H709N101O130S[M]，计算的m/z：9304.1694；测量的m/z：9304.1639。
用于通过KAHA连接制备组合物AB的IL2-Seg34的KAHA连接
连接：将Seg3(136mg，34μmol，1.2当量)和Seg4(100mg，28.40μmol，1当量)溶解在包含0.1M草酸的DMSO:H2O(9:1)中(1.8mL，15mM)，并允许在60℃反应16h。通过以下uHPLC监测KAHA连接的进展：使用在60℃的Phenomenex C18柱(150×4.56mm)，使用包含0.1％TFA的CH3CN/H2O作为流动相，梯度为在7min内30％至70％CH3CN。
Fmoc脱保护和纯化：连接完成之后，将反应混合物用DMSO(6mL)稀释，添加5％二乙胺(300μL)并将反应混合物在室温振荡7min。为制备纯化样品，将其用含有TFA(300μL)的DMSO(4mL)稀释。
通过以下制备型HPLC纯化样品：保持在60℃的Shiseido Capcell Pack UG80 C18柱(50×250mm)上，使用在35min内含有0.1％TFA的在水中的30％至70％CH3CN的梯度，以40mL/min的流量。将包含产物的级分汇集并冻干以得到纯的Seg34(43.4mg，连接纯化之后，收率为21％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS确认产物的纯度和精确质量。对于C326H516N84O101S[M]，计算的m/z：7255.7545；测量的m/z：7255.7653。
用于通过KAHA连接制备IL2线性蛋白组合物AB的最终KAHA连接
连接：将Seg12(59.2mg，6.35μmol，1.2当量)和Seg34(38.5mg，5.3μmol，1当量)溶解在包含0.1M草酸的DMSO:H2O(9:1)(423μL，15mM)中，并允许连接在60℃继续进行24h。通过以下分析型HPLC监测KAHA连接的进展：使用在60℃的Shiseido Capcell Pak UG80C18柱(250×4.6mm)，以及包含0.1％TFA的CH3CN/H2O作为流动相，梯度为在14min内30％至95％CH3CN。
纯化：连接完成之后，将反应混合物用150μL DMSO稀释，随后用包含0.1％TFA的(1:1)CH3CN:H2O混合物(7mL)进一步稀释。样品通过注入到以下制备型HPLC上进行纯化：使用在60℃预热的Shiseido Capcell Pack UG80 C18柱(50×250mm)，以2步骤梯度：在5min内10％至40％，以及在35min内40％至80％，流量：40mL/min，以包含0.1％TFA的CH3CN和MQ-H2O作为洗脱液。将包含产物的级分汇集并冻干以得到纯的具有Acm的组合物AB线性蛋白(42.3mg，对于连接和纯化步骤，收率为48％)。使用分析型HPLC和ESI-HRMS确认产物的纯度和精确质量。对于C747H1225N185O229S2[M]，计算的m/z：16515.9340；测量的m/z：16515.9008。
Acm脱保护：将具有Acm的肽IL2线性蛋白(35.4mg，2.14μmol)溶解在AcOH/H2O(1:1)中(8.6mL，0.25mM)，并向溶液中添加86mg AgOAc(1％m/v)。将混合物在50℃避光振荡2.5小时。反应完成(如通过HPLC确定)之后，将样品用包含0.1％TFA的CH3CN:H2O(1:1)稀释，并通过以下制备型HPLC纯化：使用保持在60℃的Shiseido CapCell Pak UG80 C18柱(20×250mm)。使用2步骤梯度进行纯化：在5min内10％至40％，以及在30min内40％至95％，流量：10mL/min，以包含0.1％TFA的CH3CN和MQ-H2O作为洗脱液。将包含产物的级分汇集并冻干以得到纯的IL2线性蛋白(26.1mg，对于脱保护和纯化步骤，收率为74％)。对于C741H1215N183O227S2[M]，计算的m/z：16373.8597；测量的m/z：16373.8253
折叠的IL-2组合物AB的合成
组合物AB
线性蛋白的重排：将线性蛋白(20mg，1.221μmol)溶解在含有0.1M Tris和30mM还原型谷胱甘肽的6M Gu·HCl水溶液中(81mL，15μM蛋白浓度)，将其用6M HCl水溶液调节至pH 8.0。将混合物在50℃温和地振荡2h，并通过以下分析型反相HPLC进行监测：使用在25℃的bioZenTM 3.6μm Intact C4柱(150×4.6mm)，梯度为在18min内含有0.1％TFA的在MQ-H2O中的30％至95％CH3CN，流量：1.0mL/min。
线性重排蛋白的折叠：将先前的溶液冷却至室温，并用含有0.1M Tris和1.5mM氧化型谷胱甘肽的pH 8.0的第二缓冲溶液(240mL)稀释3倍。将混合物储存在室温，并通过以下分析型HPLC进行监测：使用在25℃的bioZenTM 3.6μm Intact C4柱(150×4.6mm)，梯度为在18min内含有0.1％TFA的30％至95％乙腈，流量：1.0mL/min。20h之后，将折叠溶液用10％的TFA水溶液酸化至～pH 3，并在以下制备型HPLC上纯化：使用Shiseido ProteonaviC4柱(20×250mm)，以在60min内含有0.1％TFA的5％至40％至95％乙腈的两步骤梯度，流量：10.0mL/min。将包含折叠的IL2蛋白的级分汇集在一起并冻干。纯的折叠的蛋白(3.5mg，收率为18％)的纯度和身份通过分析型RP-HPLC和高分辨率ESI质谱进一步确认。对于C741H1213N183O227S2[M]，计算的m/z：16371.8441；测量的m/z：16371.8107，确认组合物AB的合成成功。

Claims (103)

1.一种组合物，所述组合物包含：
与细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)选择性结合的多肽；
修饰的IL-2多肽；以及
接头，其中所述接头包含：
共价附接至所述修饰的IL-2多肽的非末端残基的第一附接点；和
共价附接至所述与PD-1选择性结合的多肽的第二附接点。
2.一种组合物，所述组合物包含：
与PD-1选择性结合的多肽；
修饰的IL-2多肽；以及
接头，其中所述接头包含：
共价附接至所述修饰的IL-2多肽的第一附接点；和
共价附接至所述与PD-1选择性结合的多肽的非末端残基的第二附接点。
3.一种组合物，所述组合物包含：
与PD-1选择性结合的多肽；
修饰的IL-2多肽；以及
接头，其中所述接头是化学接头，其中所述接头包含：
共价附接至所述修饰的IL-2多肽的第一附接点；和
共价附接至所述与PD-1选择性结合的多肽的第二附接点。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的组合物，其中所述第一附接点位于所述修饰的IL-2多肽的氨基酸残基30-110区域中的残基处，其中所述IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述第一附接点位于选自由氨基酸残基35、37、38、41、42、43、44、45、60、61、62、64、65、68、69、71、72、104、105和107组成的组的氨基酸残基处，其中所述修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
6.根据权利要求1-4中任一项所述的组合物，其中所述第一附接点位于氨基酸残基42或45处，其中所述修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
7.根据权利要求2或3所述的组合物，其中所述第一附接点位于氨基酸残基F42Y或Y45处，或者位于N-末端残基处。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的组合物，其中所述IL-2多肽包含共价附接至其的非接头聚合物。
9.根据权利要求1-8中任一项所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽包含Fc区。
10.根据权利要求1-9中任一项所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽是抗PD-1抗体或抗原结合片段。
11.根据权利要求10所述的组合物，其中所述抗PD-1抗体或抗原结合片段包含Fc区。
12.根据权利要求9或11所述的组合物，其中所述第二附接点位于所述Fc区的氨基酸残基处。
13.根据权利要求9、11或12中任一项所述的组合物，其中所述Fc区包含与SEQ ID NO:105的氨基酸序列具有90％或更多同一性的氨基酸序列。
14.根据权利要求13所述的组合物，其中所述第二附接点位于选自由SEQ ID NO:105的氨基酸残基25至105组成的组的氨基酸残基处。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述第二附接点是(a)SEQ ID NO:105的位置25至35处的氨基酸残基、(b)SEQ ID NO:105的位置70至80处的氨基酸残基或(c)SEQ IDNO:105的氨基酸残基95-105。
16.根据权利要求9或11-15中任一项所述的组合物，其中所述第二位置附接点位于所述Fc区处K248氨基酸残基、K288氨基酸残基、K317氨基酸残基或其组合(Eu编号)的位置处。
17.根据权利要求16所述的组合物，其中所述第二附接点位于所述K248氨基酸残基处。
18.根据权利要求1-17中任一项所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽是单克隆抗体、人源化抗体、接枝抗体、嵌合抗体、人类抗体、去免疫抗体或双特异性抗体。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽是抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包括Fab、Fab’、F(ab’)2、双特异性F(ab’)2、三特异性F(ab’)2、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)、dsFv、双特异性scFv、可变重结构域、可变轻结构域、可变NAR结构域、双特异性scFv、微抗体、双抗体、双特异性双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、大抗体、骆驼科抗体、VHH、微抗体、胞内抗体、包含抗体部分(结构域抗体)的融合蛋白、单链结合多肽、scFv-Fc、Fab-Fc、双特异性T细胞衔接物(BiTE)、四价串联双抗体(TandAb)、双亲和重新靶向抗体(DART)、双特异性抗体(bscAb)、单结构域抗体(sdAb)、融合蛋白或双特异性二硫键稳定的Fv抗体片段(dsFv-dsFv’)。
20.根据权利要求1-19中任一项所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD，或者由其衍生。
21.根据权利要求20所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽包括所述IgG，并且其中所述IgG是IgG1、IgG4，或者由其衍生。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽包括替雷利珠单抗、百泽安、0KVO411B3N、BGB-A317、hu317-1/IgG4mt2、信迪利单抗、tyvyt、IBI-308、特瑞普利单抗、TeRuiPuLi、terepril、tuoyi、JS-001、TAB-001、Tamrelizumab、HR-301210、INCSHR-01210、SHR-1210、Temiplimab、Cemiplimab-rwlc、6QVL057INT、H4H7798N、REGN-2810、SAR-439684、lambrolizumab、帕博利珠单抗、MK-3475、SCH-900475、h409A11、纳武单抗、BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、Prolgolimab、Forteca、BCD-100、派安普利单抗、AK-105、赛帕利单抗、AB-122、GLS-010、WBP-3055、巴替利单抗、1Q2QT5M7EO、AGEN-2034、AGEN-2034w、Genolimzumab、Geptanolimab、APL-501、CBT-501、GB-226、多塔利单抗、ANB-011、GSK-4057190A、P0GVQ9A4S5、TSR-042、WBP-285、斯鲁利单抗、HLX-10、CS-1003、瑞弗利单抗、2Y3T5IF01Z、INCMGA-00012、INCMGA-0012、MGA-012、萨善利单抗、LZZ0IC2EWP、PF-06801591、RN-888、司他利珠单抗、PDR-001、QOG25L6Z8Z、BMS-986213、Cetrelimab、JNJ-3283、JNJ-63723283、LYK98WP91F、Tebotelimab、MGD-013、BCD-217、BAT-1306、HX-008、MEDI-5752、JTX-4014、卡度尼利单抗、AK-104、BI-754091、Pidilizumab、CT-011、MDV-9300、YBL-006、AMG-256、RG-6279、RO-7284755、BH-2950、IBI-315、RG-6139、RO-7247669、ONO-4685、AK-112、609-A、LY-3434172、T-3011、AMG-404、IBI-318、MGD-019、ONCR-177、LY-3462817、RG-7769、RO-7121661、F-520、XmAb-23104、Pd-1-pik、SG-001、S-95016、Sym-021、LZM-009、Budigalimab、6VDO4TY3OO、ABBV-181、PR-1648817、CC-90006、XmAb-20717、2661380、AMP-224、B7-DCIg、EMB-02、ANB-030、PRS-332、STI-1110、STI-A1110、CX-188、mPD-1、MCLA-134、244C8、ENUM 224C8、ENUM C8、388D4、ENUM 388D4、ENUM D4、MEDI0680、NVP-LZV-184或AMP-514。
23.根据权利要求22所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽包括纳武单抗、帕博利珠单抗、LZM-009、Dostarlimab、Dintilimab、司他利珠单抗、替雷利珠单抗或Cemiplimab。
24.根据权利要求1-23中任一项所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽包含与表1的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。
25.根据权利要求1-24中任一项所述的组合物，其中所述第二附接点是针对所述与PD-1选择性结合的多肽上的赖氨酸残基。
26.根据权利要求1-25中任一项所述的组合物，其中所述第二附接点位于所述与PD-1选择性结合的多肽的非末端氨基酸残基处。
27.根据权利要求1-26中任一项所述的组合物，其中所述接头包括聚合物。
28.根据权利要求27所述的组合物，其中所述聚合物包括水溶性聚合物。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中所述水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。
30.根据权利要求27-29中任一项所述的组合物，其中所述聚合物具有以下的重均分子量：至少约0.1kDa、至少约0.5kDa或至少约1kDa。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的组合物，其中所述接头包括在所述第一附接点和所述第二附接点之间的至少50个原子的链。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的组合物，其中所述接头包括以下结构：
其中
是针对所述与PD-1选择性结合的多肽的赖氨酸残基的第一附接点；
L是连接基团；并且
是针对与所述第一附接点连接的连接基团的附接点。
33.根据权利要求1-32中任一项所述的组合物，其中所述修饰的IL-2多肽包含共价附接至其的非接头聚合物。
34.根据权利要求33所述的组合物，其中所述非接头聚合物附接在选自由氨基酸残基35、37、38、41、42、43、44、45、60、61、62、64、65、68、69、71、72、104、105和107组成的组的N-末端氨基酸残基处。
35.根据权利要求1-34中任一项所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽包括异源抗体或抗原结合片段。
36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述异源抗体或抗原结合片段还包含接头，并且其中所述接头包含(GS)n(SEQ ID NO:24)、(GGS)n(SEQ ID NO:25)、(GGGS)n(SEQ ID NO:26)、(GGSG)n(SEQ ID NO:27)或(GGSGG)n(SEQ ID NO:28)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:29)，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
37.一种组合物，所述组合物包含：
IL-2多肽，其中所述IL-2多肽包含：
附接在氨基酸残基42处的第一聚合物，其中所述修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列；和
与细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)选择性结合的多肽。
38.根据权利要求37所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽是抗PD-1抗体或抗原结合片段。
39.根据权利要求38所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽是单克隆的、人源化的、接枝的、嵌合的、人类的、去免疫的或双特异性的。
40.根据权利要求37-39中任一项所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽包括Fab、Fab’、F(ab’)2、双特异性F(ab’)2、三特异性F(ab’)2、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)、dsFv、双特异性scFv、可变重结构域、可变轻结构域、可变NAR结构域、双特异性scFv、微抗体、双抗体、双特异性双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、大抗体、骆驼科抗体、VHH、微抗体、胞内抗体、包含抗体部分(结构域抗体)的融合蛋白、单链结合多肽、scFv-Fc、Fab-Fc、双特异性T细胞衔接物(BiTE)、四价串联双抗体(TandAb)、双亲和重新靶向抗体(DART)、双特异性抗体(bscAb)、单结构域抗体(sdAb)、融合蛋白、双特异性二硫键稳定的Fv抗体片段(dsFv-dsFv’)。
41.根据权利要求37-40中任一项所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽包括IgG抗体、IgM抗体、IgE抗体、IgA抗体、IgD抗体，或者由其衍生。
42.根据权利要求41所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽包括所述IgG，并且其中所述IgG包括IgG1、IgG4，或者由其衍生。
43.根据权利要求37-42中任一项所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽包括替雷利珠单抗、百泽安、0KVO411B3N、BGB-A317、hu317-1/IgG4mt2、信迪利单抗、tyvyt、IBI-308、特瑞普利单抗、TeRuiPuLi、terepril、tuoyi、JS-001、TAB-001、Tamrelizumab、HR-301210、INCSHR-01210、SHR-1210、Temiplimab、Cemiplimab-rwlc、6QVL057INT、H4H7798N、REGN-2810、SAR-439684、Lambrolizumab、帕博利珠单抗、MK-3475、SCH-900475、h409A11、纳武单抗、BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、Prolgolimab、Forteca、BCD-100、派安普利单抗、AK-105、赛帕利单抗、AB-122、GLS-010、WBP-3055、巴替利单抗、1Q2QT5M7EO、AGEN-2034、AGEN-2034w、Genolimzumab、Geptanolimab、APL-501、CBT-501、GB-226、多塔利单抗、ANB-011、GSK-4057190A、P0GVQ9A4S5、TSR-042、WBP-285、斯鲁利单抗、HLX-10、CS-1003、瑞弗利单抗、2Y3T5IF01Z、INCMGA-00012、INCMGA-0012、MGA-012、萨善利单抗、LZZ0IC2EWP、PF-06801591、RN-888、司他利珠单抗、PDR-001、QOG25L6Z8Z、BMS-986213、Cetrelimab、JNJ-3283、JNJ-63723283、LYK98WP91F、Tebotelimab、MGD-013、BCD-217、BAT-1306、HX-008、MEDI-5752、JTX-4014、卡度尼利单抗、AK-104、BI-754091、Pidilizumab、CT-011、MDV-9300、YBL-006、AMG-256、RG-6279、RO-7284755、BH-2950、IBI-315、RG-6139、RO-7247669、ONO-4685、AK-112、609-A、LY-3434172、T-3011、AMG-404、IBI-318、MGD-019、ONCR-177、LY-3462817、RG-7769、RO-7121661、F-520、XmAb-23104、Pd-1-pik、SG-001、S-95016、Sym-021、LZM-009、Budigalimab、6VDO4TY3OO、ABBV-181、PR-1648817、CC-90006、XmAb-20717、2661380、AMP-224、B7-DCIg、EMB-02、ANB-030、PRS-332、STI-1110、STI-A1110、CX-188、mPD-1、MCLA-134、244C8、ENUM 224C8、ENUM C8、388D4、ENUM 388D4、ENUM D4、MEDI0680、NVP-LZV-184或AMP-514。
44.根据权利要求37-43中任一项所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽包括纳武单抗、帕博利珠单抗、LZM-009、Dostarlimab、Dintilimab、司他利珠单抗、替雷利珠单抗或Cemiplimab。
45.根据权利要求37-44中任一项所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽包含与表1的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。
46.根据权利要求37-45中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物在第二附接点处共价附接至所述与PD-1选择性地结合的多肽。
47.根据权利要求37-46中任一项所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽包含Fc区。
48.根据权利要求46所述的组合物，其中所述第二附接点位于所述Fc区的氨基酸残基处。
49.根据权利要求47或48所述的组合物，其中所述Fc区包含与SEQ ID NO:105的氨基酸序列具有90％或更多同一性的氨基酸序列。
50.根据权利要求49所述的组合物，其中所述第二附接点位于选自由SEQ ID NO:105的氨基酸序列集合的氨基酸残基10至900组成的组的氨基酸残基处。
51.根据权利要求46-50中任一项所述的组合物，其中所述第二附接点是(a)SEQ IDNO:105的位置25至35处的氨基酸残基、(b)SEQ ID NO:105的位置70至80处的氨基酸残基或(c)SEQ ID NO:105的氨基酸残基95-105。
52.根据权利要求37-51中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物具有约200至约2000道尔顿的重均分子量。
53.根据权利要求37-52中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物包括水溶性聚合物。
54.根据权利要求37-53中任一项所述的组合物，其中所述第一聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯基吡咯烷酮)、聚乙烯醇、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。
55.根据权利要求54所述的组合物，其中所述第一聚合物包括聚(环氧烷)。
56.根据权利要求37-55中任一项所述的组合物，其中所述修饰的IL-2多肽还包含共价附接至所述IL-2多肽的第二聚合物。
57.根据权利要求56所述的组合物，其中所述第二聚合物共价附接在选自由所述Fc区的氨基酸残基35、37、38、41、43、44、45、60、61、62、64、65、68、69、71、72、104、105和107组成的组的N-末端氨基酸残基处。
58.根据权利要求56或57所述的组合物，其中所述第二聚合物共价附接在所述IL-2多肽的残基45处。
59.根据权利要求56-58中任一项所述的组合物，其中所述第二聚合物共价附接在所述IL-2多肽的残基Y45处。
60.根据权利要求56-59中任一项所述的组合物，其中所述第二聚合物在第二附接点处共价附接至所述IL-2多肽。
61.根据权利要求56-60中任一项所述的组合物，其中所述第二聚合物具有以下的重均分子量：至少约500道尔顿、至少约1000道尔顿、至少约2000道尔顿、至少约3000道尔顿、至少约4000道尔顿、至少约5000道尔顿或至少约6000道尔顿。
62.根据权利要求56-61中任一项所述的组合物，其中所述第二聚合物具有以下的重均分子量：至少约120道尔顿、至少约250道尔顿、至少约300道尔顿、至少约400道尔顿、至少约500道尔顿、至少约1000道尔顿、至少约2000道尔顿、至少约3000道尔顿、至少约4000道尔顿、至少约5000道尔顿或至少6000道尔顿。
63.根据权利要求37-62中任一项所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽包括异源抗体或抗原结合片段。
64.根据权利要求63所述的组合物，其中所述异源抗体或抗原结合片段还包含接头，并且其中所述接头包含(GS)n(SEQ ID NO:24)、(GGS)n(SEQ ID NO:25)、(GGGS)n(SEQ ID NO:26)、(GGSG)n(SEQ ID NO:27)或(GGSGG)n(SEQ ID NO:28)、(GGGGS)n(SEQ ID NO:29)，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。
65.一种组合物，所述组合物包含：
(a)抗PD-1抗体或抗原结合片段，并且所述抗PD-L1抗体或抗原结合片段包含Fc区，所述Fc区包含与SEQ ID NO:105具有80％或更多同一性的氨基酸序列；
(b)在选自由以下组成的组的氨基酸残基处共价附接至所述Fc区的一个或更多个接头：
(i)SEQ ID NO:105的位置25至35；
(i)SEQ ID NO:105的位置70至80；和
(iii)SEQ ID NO:105的位置95至105；以及
(c)共价附接至所述接头的一种或更多种细胞因子。
66.根据权利要求65所述的组合物，其中所述氨基酸残基是赖氨酸、酪氨酸、色氨酸或半胱氨酸。
67.根据权利要求65或66所述的组合物，其中所述氨基酸残基是赖氨酸残基。
68.根据权利要求65-67中任一项所述的组合物，其中所述抗PD-1抗体或抗原结合片段是单克隆抗体、人源化抗体、接枝抗体、嵌合抗体、人类抗体、去免疫抗体或双特异性抗体。
69.根据权利要求65-68中任一项所述的组合物，其中所述抗PD-1抗体或抗原结合片段包括IgG抗体、IgM抗体、IgE抗体、IgA抗体、IgD抗体，或者由其衍生。
70.根据权利要求69所述的组合物，其中所述抗PD-1抗体或抗原结合片段包括所述IgG，并且其中所述IgG包括IgG1、IgG4，或者由其衍生。
71.根据权利要求65-70中任一项所述的组合物，其中所述抗PD-1抗体或抗原结合片段包括，其中所述与PD-1选择性结合的多肽包括替雷利珠单抗、百泽安、0KVO411B3N、BGB-A317、hu317-1/IgG4mt2、信迪利单抗、tyvyt、IBI-308、特瑞普利单抗、TeRuiPuLi、terepril、tuoyi、JS-001、TAB-001、Tamrelizumab、HR-301210、INCSHR-01210、SHR-1210、Temiplimab、Cemiplimab-rwlc、6QVL057INT、H4H7798N、REGN-2810、SAR-439684、Lambrolizumab、帕博利珠单抗、MK-3475、SCH-900475、h409A11、纳武单抗、BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、Prolgolimab、Forteca、BCD-100、派安普利单抗、AK-105、赛帕利单抗、AB-122、GLS-010、WBP-3055、巴替利单抗、1Q2QT5M7EO、AGEN-2034、AGEN-2034w、Genolimzumab、Geptanolimab、APL-501、CBT-501、GB-226、多塔利单抗、ANB-011、GSK-4057190A、P0GVQ9A4S5、TSR-042、WBP-285、斯鲁利单抗、HLX-10、CS-1003、瑞弗利单抗、2Y3T5IF01Z、INCMGA-00012、INCMGA-0012、MGA-012、萨善利单抗、LZZ0IC2EWP、PF-06801591、RN-888、司他利珠单抗、PDR-001、QOG25L6Z8Z、BMS-986213、Cetrelimab、JNJ-3283、JNJ-63723283、LYK98WP91F、Tebotelimab、MGD-013、BCD-217、BAT-1306、HX-008、MEDI-5752、JTX-4014、卡度尼利单抗、AK-104、BI-754091、Pidilizumab、CT-011、MDV-9300、YBL-006、AMG-256、RG-6279、RO-7284755、BH-2950、IBI-315、RG-6139、RO-7247669、ONO-4685、AK-112、609-A、LY-3434172、T-3011、AMG-404、IBI-318、MGD-019、ONCR-177、LY-3462817、RG-7769、RO-7121661、F-520、XmAb-23104、Pd-1-pik、SG-001、S-95016、Sym-021、LZM-009、Budigalimab、6VDO4TY3OO、ABBV-181、PR-1648817、CC-90006、XmAb-20717、2661380、AMP-224、B7-DCIg、EMB-02、ANB-030、PRS-332、STI-1110、STI-A1110、CX-188、mPD-1、MCLA-134、244C8、ENUM 224C8、ENUM C8、388D4、ENUM 388D4、ENUM D4、MEDI0680、NVP-LZV-184或AMP-514。
72.根据权利要求65-71中任一项所述的组合物，其中所述抗PD1抗体包括纳武单抗、帕博利珠单抗、LZM-009、Dostarlimab、Dintilimab、司他利珠单抗、替雷利珠单抗或Cemiplimab。
73.根据权利要求65-69中任一项所述的组合物，其中所述抗PD1抗体或抗原结合片段包含与表1的氨基酸序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列。
74.根据权利要求65-73中任一项所述的组合物，其中所述一种或更多种细胞因子包括IL-2多肽、IL-7多肽、IL-18多肽或其组合。
75.根据权利要求74所述的组合物，其中所述一种或更多种细胞因子包括修饰的IL-2多肽、修饰的IL-7多肽、修饰的IL-18多肽或其组合。
76.根据权利要求74或75所述的组合物，其中所述接头共价附接在所述IL-2多肽、所述IL-7多肽、所述IL-18多肽、所述修饰的IL-2多肽、所述修饰的IL-7多肽、所述修饰的IL-18多肽或其组合的非末端残基处。
77.根据权利要求74-76中任一项所述的组合物，其中所述接头共价附接在选自由35、37、38、41、43、44、45、60、61、62、64、65、68、69、71、72、104、105和107组成的组的氨基酸残基处，其中所述IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
78.根据权利要求77所述的组合物，其中所述接头共价附接在氨基酸残基45处，其中所述修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
79.根据权利要求77或78所述的组合物，其中所述接头共价附接在所述IL-2多肽中的酪氨酸残基处。
80.根据权利要求75-79中任一项所述的组合物，其中所述修饰的IL-2多肽、所述修饰的IL-7多肽、所述修饰的IL-18多肽或其组合包含共价附接至其的非接头聚合物。
81.根据权利要求80所述的组合物，其中所述非接头聚合物附接在选自由35、37、38、41、42、43、44、45、60、61、62、64、65、68、69、71、72、104、105和107组成的组的N-末端氨基酸残基处，其中所述修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。
82.根据权利要求65-81中任一项所述的组合物，其中所述接头包括聚合物。
83.根据权利要求82所述的组合物，其中所述聚合物是水溶性聚合物。
84.根据权利要求83所述的组合物，其中所述水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。
85.根据权利要求82-84中任一项所述的组合物，其中所述聚合物包括在所述第一附接点和所述第二附接点之间的至少50个原子的链。
86.根据权利要求82-85中任一项所述的组合物，其中所述聚合物具有以下的重均分子量：至少约0.5kDa、至少约1kDa或至少约5kDa。
87.根据权利要求75-86中任一项所述的组合物，其中所述修饰的IL-2多肽包含SEQ IDNO:3-23中的任何一个的氨基酸序列。
88.根据权利要求75-86中任一项所述的组合物，其中所述一种或更多种细胞因子包括两种相同的修饰的IL-2多肽、两种不同的修饰的IL-2多肽、一种修饰的IL-2多肽和一种修饰的IL-7多肽、一种修饰的IL-2多肽和一种修饰的IL-18多肽或一种修饰的IL-7多肽和一种修饰的IL-18多肽。
89.根据权利要求1-88中任一项所述的组合物，其中所述与PD-1选择性结合的多肽或所述抗PD-1抗体或抗原结合片段包含重组多肽或合成多肽。
90.一种药物组合物，所述药物组合物包含：
a)根据前述权利要求中任一项所述的组合物；和
b)一种或更多种药学上可接受的载体或赋形剂。
91.根据权利要求90所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为用于肠胃外或肠内施用。
92.根据90或91所述的药物组合物，其中所述药物组合物被配制为用于静脉内或皮下施用。
93.根据权利要求90-92中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物呈冻干形式。
94.根据权利要求90-93中任一项所述的药物组合物，其中所述一种或更多种药学上可接受的载体或赋形剂包括以下的每一个的一种或更多种：糖类、无机盐、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂或其任何组合。
95.根据权利要求90-94中任一项所述的药物组合物，所述药物组合物包含一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种赋形剂。
96.一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求1-89中任一项所述的组合物或权利要求90-95中任一项所述的药物组合物。
97.根据权利要求96所述的方法，其中所述癌症是上皮癌、肉瘤或其组合。
98.根据权利要求97所述的方法，其中所述癌症是所述上皮癌，并且其中所述上皮癌包括皮肤鳞状细胞癌(CSCC)、尿路上皮癌(UC)、肾细胞癌(RCC)、肝细胞癌(HCC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、食管鳞状细胞癌(ESCC)、胃食管结合部(GEJ)癌、子宫内膜癌(EC)、Merkel细胞癌(MCC)或其组合。
99.根据权利要求92所述的方法，其中所述癌症是黑素瘤、肺癌、膀胱癌(BC)、微卫星不稳定性高(MSI-H)/错配修复缺陷(dMMR)实体瘤、肿瘤突变负荷高(TMB-H)实体瘤、三阴性乳腺癌(TNBC)、胃癌(GC)、宫颈癌(CC)、胸膜间皮瘤(PM)、经典霍奇金淋巴瘤(cHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)或其组合。
100.一种制备根据权利要求1-89中任一项所述的组合物的方法，所述方法包括：
a)将反应性基团共价附接至与PD-1选择性结合的多肽的特定残基；
b)使所述反应性基团与附接至细胞因子的互补反应性基团接触；并且
c)形成所述组合物。
101.一种产生组合物的方法，所述组合物包含：
与细胞程序性死亡蛋白1(PD-1)选择性结合的多肽；
修饰的IL-2多肽；以及
接头，其中所述接头包含：
共价附接至所述修饰的IL-2多肽的非末端残基的第一附接点；和
共价附接至所述与PD-1选择性结合的多肽的第二附接点，所述方法包括：
a)提供具有在存在偶联酶的情况下与接头反应的至少一个受体氨基酸残基的抗PD-1抗体或抗原结合片段；并且
b)在存在能够引起在所述至少一个受体氨基酸残基和所述接头之间形成共价键的酶的情况下，使所述抗体或抗原结合片段与包含伯胺的接头反应，其中所述接头包含反应性基团(R)，
其中所述共价键不位于所述R部分处，并且其中所述方法在足以使所述至少一个受体氨基酸残基经由所述接头与所述反应性基团形成共价键的条件下进行，其中所述共价键包括所述接头的第二附接点。
102.根据权利要求101所述的方法，其中所述酶包括转氨酶。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述酶包括转谷氨酰胺酶。
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