CN117615793A

CN117615793A - 抗体缀合物及其制备

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Publication number: CN117615793A
Application number: CN202280048774.4A
Authority: CN
Inventors: 维杰亚·拉格万·帕塔比拉曼; 贝托尔特·克雷夫特; 让-菲利普·卡拉洛特; 鲁本·阿尔瓦雷斯桑切斯; 马加利·穆勒; 马蒂尔德·阿雷瓦洛-鲁伊斯
Original assignee: Mingfeng Treatment Co ltd
Current assignee: Mingfeng Treatment Co ltd
Priority date: 2021-07-09
Filing date: 2022-07-09
Publication date: 2024-02-27
Also published as: CN117616036A

Abstract

本公开内容涉及包含抗体或抗原结合片段、合成蛋白和接头的缀合物组合物。本公开内容还涉及制备该缀合物组合物的方法和使用该缀合物组合物用于治疗疾病的方法。在一方面，本公开内容涉及使用该缀合物组合物治疗癌症。

Description

抗体缀合物及其制备

交叉引用

本申请要求2021年7月9日提交的美国临时申请第63/219,989号、2021年7月9日提交的美国临时申请第63/219,981号、2021年7月9日提交的美国临时申请第63/219,985号、2021年7月9日提交的美国临时申请第63/219,992号和2021年7月9日提交的美国临时申请第63/219,995号的权益，这些申请通过引用以其整体并入本文。

发明概述

本文提供了蛋白-抗体缀合物及其制备方法。在一些实施方案中，蛋白-抗体缀合物采用接头(例如，化学(非肽基)接头)共价附接蛋白(例如，细胞因子)和抗体。在一些实施方案中，构建体实质上保留了两个单独单元的官能团，并且在某些情况下，可以表现出抗体作用模式和蛋白作用模式之间的协同作用。这样的构建体提供了多种治疗潜力。

在一些实施方案中，本文提供的方法和缀合物可易于扩展，并且可以用于快速产生多种这样的构建体。在一方面，蛋白-抗体缀合物从“现成的(off the shelf)”抗体制备，该“现成的(off the shelf)”抗体在使用前不需要遗传修饰并且可以用感兴趣的蛋白(包括细胞因子)快速衍生化。在一些实施方案中，抗体与合成蛋白缀合，该合成蛋白具有在合成期间在期望的附接点掺入的缀合手柄(conjugation handle)，从而能够快速产生定义明确的构建体。在一些实施方案中，本文的结构平台能够附接在抗体或蛋白中的一种或两种的非末端残基(例如，不是N-末端或C-末端)处，因此提供比基于融合蛋白技术的传统缀合物可得的更大的灵活性。

本文提供了包含(a)抗体和(b)重组蛋白或合成蛋白的缀合物，以及制备该缀合物的方法。在一些实施方案中，本文的缀合物在重组蛋白或合成蛋白和不含有便于缀合的任何突变或其他修饰的抗体之间形成。因此，在一些实施方案中，本文提供的方法可以用于用任何“现成的”抗体制备抗体-合成蛋白缀合物。在一些实施方案中，本文提供的方法利用试剂向抗体添加接头，其中接头含有可以促进与重组蛋白或合成蛋白上合适的反应性基团形成共价键的反应性基团(“缀合手柄”)。在一些实施方案中，本公开内容的合成蛋白在合成时被化学合成以含有这样的合适的反应性基团，因此促进蛋白和抗体之间的容易缀合。

本文公开了表现出以下中的一种或更多种的缀合物：协同效力、改进的耐受性、肿瘤浸润性白细胞(TIL)的直接靶向、显著的剂量减少、简化的CMC(与现有抗体产物的化学缀合)、优异的效力、治疗更广泛患者群体的能力；细胞因子与具有不同同种型的抗体的缀合，扩增特异性免疫细胞群体，高度化学选择性缀合；位点选择性缀合以及各种有效载荷可以附接至修饰的抗体。

在一方面，本文公开了一种缀合物，所述缀合物包含：(a)抗体或抗原结合片段；(b)长度为约50至约500个氨基酸残基的重组蛋白或合成蛋白；和(c)将所述抗体或所述抗原结合片段连接至所述重组蛋白或所述合成蛋白的一个或更多个接头。

在另一方面，本文公开了权利要求1-95中任一项所述的缀合物的群体，其中所述缀合物的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％中的每一个的接头附接至每种重组蛋白或每种合成蛋白的相同氨基酸残基位置。

在另一方面，本文公开了一种制备缀合物的方法，所述方法包括：a)化学合成合成蛋白或制备重组蛋白，其中所述蛋白包含蛋白缀合手柄；b)提供抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含抗体缀合手柄，所述抗体缀合手柄与所述蛋白缀合手柄互补；并且c)在所述蛋白缀合手柄和所述抗体缀合手柄之间形成共价键。

在另一方面，本文公开了一种制备缀合物的方法，所述方法包括：a)化学合成合成蛋白或制备重组蛋白，其中所述蛋白包含蛋白缀合手柄；b)提供抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含抗体缀合手柄；c)提供具有第一试剂缀合手柄和第二试剂缀合手柄的双官能试剂，其中所述第一试剂缀合手柄与所述蛋白缀合手柄互补，并且其中所述第二试剂缀合手柄与所述抗体缀合手柄互补；d)在所述蛋白缀合手柄和所述第一试剂缀合手柄之间形成第一共价键；并且e)在所述抗体缀合手柄和所述第二试剂缀合手柄之间形成第二共价键。

在另一方面，本文公开了本文描述的缀合物在制备用于治疗有相应需要的受试者的疾病或紊乱的药物中的用途。

在另一方面，本文公开了一种治疗有相应需要的受试者的疾病或紊乱的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文描述的缀合物或本文描述的缀合物的群体。

通过引用并入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请通过引用并入本文，其程度如同每一个单独的出版物、专利或专利申请被特别和单独地指明通过引用并入。

附图简述

本发明的新颖特征在所附权利要求中具体地阐述。通过参考以下详细描述和附图将获得对本发明的特征和优点的更好理解，该详细描述阐述了其中利用了本发明的原理的说明性实施方案，在附图中：

图1A图示了本公开内容的抗PD-1-IL-2免疫细胞因子以及抗PD-1-IL-2免疫细胞因子通过IL2Rβ/γ上调和PD-1抑制与激活的T细胞的相互作用。

图1B示出了修饰的可缀合的细胞因子CMP-003的结构。CMP-003具有SEQ ID NO:3的氨基酸序列，并且包含附接至残基F42Y的携带叠氮化物的聚合物和附接至残基Y45的另外的聚合物。

图2A示出了通过化学修饰技术对抗PD1抗体进行位点选择性修饰，以引入一个或两个缀合手柄。

图2B示出了未修饰的帕博利珠单抗(pembrolizumab)和带有DBCO缀合手柄的帕博利珠单抗的Q-TOF质谱。

图2C示出了修饰的IL-2细胞因子的位点选择性缀合，以产生具有DAR1、DAR2或介于1和2之间的混合DAR的PD1-IL2。

图2D示出了粗制帕博利珠单抗-IL2(CMP-003)缀合反应的TIC色谱图(上图)和完整的RP-HPLC图(下图)。

图2E示出了粗制帕博利珠单抗-IL2(CMP-003)缀合反应的Q-TOF质谱图，示出了DAR1和DAR 2物质(species)的形成。

图2F示出了纯化的帕博利珠单抗-IL2(CMP-003)免疫细胞因子的完整RP-HPLC(左上)图。

图2G示出了纯化的具有混合DAR的帕博利珠单抗-IL2(CMP-003)的Q-TOF质谱图。

图2H示出了纯化的帕博利珠单抗-IL2(CMP-003)免疫细胞因子的SEC-HPLC。

图3A示出了测量未修饰的和缀合的抗PD1抗体与PD-1配体结合的能力的图，该图在y轴上示出了归一化的ELISA信号，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD1抗体的剂量。该图中测试的未缀合的参考抗体和缀合的抗体分别是组合物CMP-004(帕博利珠单抗)和CMP-005、CMP-007、CMP-001。

图3B示出了与图3A类似的图，其中评价了CMP-033(度伐利尤单抗(Durvalumab))和CMP-034与PD-L1的结合。

图3C示出了与图3A和图3B类似的图，其中评价了CMP-091(亲本抗体生物仿制药阿达木单抗)和CMP-089与TNFα的结合。

图4A示出了测量未修饰的和缀合的抗PD1抗体干扰PD1/PDL1途径的能力的图，该图在y轴上示出了效应细胞NFAT-RE报告物的平均发光强度，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD1抗体的剂量。该图中测试的未缀合的参考抗体和缀合的抗体是组合物帕博利珠单抗(CMP-004)和CMP-005。该图中测试的修饰的IL-2多肽是Proleukin和CMP-002。

图4B示出了与图4A类似的图，用亲本抗PD-L1抗体CMP-033(度伐利尤单抗)和缀合物CMP-034。

图5A示出了测量未修饰的和缀合的抗PD1抗体与人类新生儿Fc受体(FcRn)在pH 6结合的能力的图，该图在y轴上示出了平均FcRn-IgG信号，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD1抗体的剂量。该图中测试的未缀合的参考抗体和缀合的抗体分别是组合物CMP-004(帕博利珠单抗)和CMP-005、CMP-007、CMP-001。

图5B示出了与图5A类似的图，用亲本抗PD-L1抗体CMP-033(度伐利尤单抗)和缀合物CMP-034。

图5C示出了与图5A和图5B类似的图，用亲本抗TNFa抗体CMP-091(生物仿制药阿达木单抗)和缀合物CMP-089(DAR1)和CMP-090(DAR2)。

图6A示出了测量未修饰的和缀合的抗PD1抗体与人类Fcγ受体I(CD64)结合的能力的图，该图在y轴上示出了平均FcγRI-IgG信号，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD1抗体的剂量。未缀合的参考抗体是CMP-004(帕博利珠单抗)；并且缀合的抗体是CMP-005、CMP-007和CMP-001。

图6B示出了测量未修饰的和缀合的抗PD1抗体与人类Fcγ受体IIa(CD32a)结合的能力的图，该图在y轴上示出了平均FcγRIIa-IgG信号，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD1抗体的剂量。未缀合的参考抗体是CMP-004(帕博利珠单抗)；并且缀合的抗体是CMP-005、CMP-007和CMP-001。

图6C示出了测量未修饰的和缀合的抗PD1抗体与人类Fcγ受体IIIa(CD16)结合的能力的图，该图在y轴上示出了平均FcγRIIIa-IgG信号，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD1抗体的剂量。未缀合的参考抗体是CMP-004(帕博利珠单抗)；并且缀合的抗体是CMP-005、CMP-007和CMP-001。

图6D示出了与图6A-图6C类似的图，用于亲本抗PD-L1抗体CMP-033(度伐利尤单抗)和缀合物CMP-034。该图示出了CD64结合(左)、CD32a结合(中)和CD16结合(右)。

图6E示出了与图6A-图6D类似的图，用于亲本抗TNFa抗体CMP-091(生物仿制药阿达木单抗)和缀合物CMP-089和CMP-090。

图7A示出了测量未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽对体外人类T细胞样品中T_eff和T_reg细胞诱导的作用的图，该图在y轴上示出了磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均荧光强度，并且在x轴上示出了修饰的IL-2多肽和免疫细胞因子的剂量。左上处测试的修饰的IL-2多肽是CMP-002。右上处测试的免疫细胞因子是CMP-005，左下是CMP-007，并且右下是CMP-001。

图7B示出了CD8记忆性细胞和CD8幼稚细胞中STAT5磷酸化对CMP-095(合成IL-7)、CMP-039和CMP-041的剂量响应曲线的图。

图8A示出了测量PD-1/CD279在从健康供者的外周血中新鲜分离的静息记忆性(CD45RA-)和幼稚(CD45RA+)CD8+T_eff细胞上的表面表达水平的图。

图8B示出了测量未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽对体外人类T细胞样品中静息记忆性(CD45RA-)和幼稚(CD45RA+)CD8+T_eff细胞的诱导的作用的图，该图在y轴上示出磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均荧光强度，并且在x轴上示出修饰的IL-2多肽和免疫细胞因子的剂量。该图中测试的修饰的IL-2多肽是CMP-002，并且该图中测试的免疫细胞因子是CMP-005和作为对照的CMP-006。

图9A示出了在存在或不存在过量未缀合的抗PD1抗体CMP-004(帕博利珠单抗)的情况下，测量未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽对体外人类T细胞样品中静息幼稚(CD45RA+)CD8+T_eff细胞激活的作用的图，该图在y轴上示出了磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均荧光强度，并且在x轴上示出了修饰的IL-2多肽和免疫细胞因子的剂量。该图中测试的修饰的IL-2多肽是CMP-002，并且该图中测试的免疫细胞因子是CMP-005和作为对照的CMP-006。

图9B示出了在存在或不存在过量未缀合的抗PD1抗体CMP-004(帕博利珠单抗)的情况下，测量未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽对体外人类T细胞样品中静息记忆性(CD45RA-)CD8+T_eff细胞激活的作用的图，该图在y轴上示出了磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均荧光强度，并且在x轴上示出了修饰的IL-2多肽和免疫细胞因子的剂量。该图中测试的修饰的IL-2多肽是CMP-002，并且该图中测试的免疫细胞因子是CMP-005和作为对照的CMP-006。

图10A示出了描述PD-1靶向的和非靶向的免疫细胞因子对hPD1人源化BALB/c小鼠中CT26同系结肠上皮癌肿瘤生长的作用的图。该图中测试的免疫细胞因子是组合物A，在单次注射方案之后作为单一剂以1和2.5mg/kg进行测试。对照Her2靶向的免疫细胞因子组合物O(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)也以2.5mg/kg进行测试。(平均值±SEM)。

图10B示出了描述治疗之后7天hPD1人源化BALB/c小鼠中PD-1靶向的和非靶向的免疫细胞因子对CT26同系结肠上皮癌肿瘤生长的作用的柱状图。该图中测试的免疫细胞因子是组合物A，在单次注射方案之后作为单一剂以1和2.5mg/kg进行测试。对照Her2靶向的免疫细胞因子组合物O(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)也以2.5mg/kg进行测试。(平均值±SEM；**单因素ANOVA P值<0.001)。

图11A示出了测试CMP-092对钥孔血蓝素(KLH)诱导的迟发型超敏反应的作用的实验设计的示意图。

图11B示出了作为在攻击后24小时肿胀的量度的以mm报告的用KLH攻击的左爪与基线相比之间的爪厚度差异。

图11C示出了作为在攻击后48小时肿胀的量度的以mm报告的用KLH攻击的左爪与基线相比之间的爪厚度差异。

图11D示出了作为在攻击后72小时肿胀的量度的以mm报告的用KLH攻击的左爪与基线相比之间的爪厚度差异。

图12示出了描述未缀合的和缀合的抗PD1抗体对hPD1 BALB/c小鼠中CT26同系结肠上皮癌肿瘤生长的作用的图。该图中测试的免疫细胞因子是CMP-041，在QWx2注射方案中，作为单一剂以1、3和10mg/kg进行测试。未缀合的抗PD1抗体CMP-105(LZM-009)也以10mg/kg(平均±SEM)以相同方案进行测试。

图13示出了皮下注射过表达人类CD20的EL4细胞的小鼠中的肿瘤生长抑制。将小鼠用未缀合的亲本抗体CMP-032(生物仿制药利妥昔单抗)以10mg/kg BIW和用免疫细胞因子CMP-030以1.25和2.5mg/kg QW进行治疗。

图14示出了DAR为2的免疫细胞因子的卡通图像，其中CMP-003作为缀合蛋白。

图15提供了条件激活免疫细胞因子(conditionally activatableimmunocytokine)的示意图。

图16示出了具有两种不同有效载荷的免疫细胞因子有效载荷1-mAB-有效载荷2使用化学正交加帽基团的制备。

图17图示了可以与mAB-IL2免疫缀合物缀合的正交有效载荷的实例。

发明详述

定义

所有术语意图按照本领域技术人员将理解的方式理解。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

以下定义补充了本领域的定义，并针对本申请，而不应归于任何相关或不相关的情况，例如任何共同拥有的专利或申请。尽管与本文描述的那些相似或等效的任何方法和材料都可以用于实践对本公开内容的测试，但本文描述了优选的方法和材料。相应地，本文使用的术语仅为了描述特定实施方案的目的，并不意图是限制性的。

本文使用的术语仅为了描述特定情况的目的，并不意图是限制性的。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。如本文使用的，单数形式“一(a)”、“一(an)”和“该(the)”意图也包括复数形式，除非上下文另外清楚地指示。

在本申请中，除非另外说明，否则“或”的使用意指“和/或”。如本文使用的术语“和/或”和“其任何组合”及其语法等同物可以可互换使用。这些术语可以表示任何组合都被特别地设想。仅出于说明性目的，以下短语“A、B和/或C”或“A、B、C或其任何组合”可以表示“单独的A；单独的B；单独的C；A和B；B和C；A和C；以及A、B和C”。术语“或”可以结合使用或分别使用，除非上下文明确地指示分别使用。

术语“约”或“大约”可以意指在如由本领域的普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围以内，其将部分地取决于值如何被测量或确定，即，测量系统的限制。例如，“约”可以根据本领域的实践意指1个或多于1个标准差以内。可选地，“约”可以意指特定值的最多20％、最多15％、最多10％、最多5％或最多1％的范围。可选地，特别是关于生物系统或生物过程，该术语可以意指在值的数量级以内、5倍以内或2倍以内。当在本申请和权利要求书中描述特定值时，除非另外说明，否则应该假定术语“约”意指特定值的可接受的误差范围以内。

如本说明书和权利要求书中使用的，词“包含(comprising)”(和包含(comprising)的任何形式，诸如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)，“具有(having)”(和具有(having)的任何形式，诸如“具有(have)”和“具有(has)”)，“包括(including)”(和包括(including)的任何形式，诸如“包括(includes)”和包括“(include)”)，或“含有(containing)”(和“含有(containing)”的任何形式，诸如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包含性的或开放式的，并不排除另外的、未列举的要素或方法步骤。设想了本说明书中讨论的任何实施方案可以参考本公开内容的任何方法或组合物来实现，并且反之亦然。此外，本公开内容的组合物可以用于实现本公开内容的方法。

说明书中对“一些实施方案”、“实施方案”、“一种实施方案”或“其他实施方案”的提及意指结合实施方案描述的特定特征、结构或特性包括在本公开内容的至少一些实施方案中，但不必包含在所有实施方案中。为了便于理解本公开内容，一些术语和措辞定义如下。

本文提及“附接”或“共价附接”至IL-2多肽的残基的基团。如本文使用的，“附接”或“共价附接”意指该基团被拴系至所指示的残基，并且这样的拴系可以包括连接基团(即，接头)。因此，对于“附接”或“共价附接”至残基的基团，明确地设想这样的连接基团也被涵盖。

结合亲和力是指单个分子和其配体/结合配偶体之间结合相互作用的强度。较高的结合亲和力是指比较低的结合亲和力更高强度的结合。在一些情况下，结合亲和力通过两个相关分子之间的解离常数(KD)来测量。当比较KD值时，具有较低值的结合相互作用将比具有较高值的结合相互作用具有更高的结合亲和力。对于蛋白-配体相互作用，根据以下式计算KD：

其中[L]是配体的浓度，[P]是蛋白的浓度，并且[LP]是配体/蛋白复合物的浓度。

本文提及某些氨基酸序列(例如，多肽序列)，其与参考序列具有一定序列同一性百分比或者涉及在对应于参考序列的位置的位置处的残基。序列同一性使用矩阵BLOSUM62、空位成本存在(Gap Costs Existence):11、延伸(Extension):1和组分调整条件组分评分矩阵调整(Compositional Adjustments Conditional Compositional ScoreMatrix Adjustment)的参数通过蛋白-蛋白BLAST算法测量。这种比对算法也用于通过分析被比较的两个序列的比对来评价残基是否位于“对应的”位置。

术语“药学上可接受的”是指联邦或州政府的管理机构所批准的或可批准的或在美国药典(U.S.P.)或其他一般公认的药典中列出的用于在动物包括人类中使用的。

“药学上可接受的赋形剂、载体或稀释剂”是指可以与剂一起向受试者施用且不破坏其药理活性并且在以足以递送治疗量的剂的剂量施用时无毒性的赋形剂、载体或稀释剂。

适于本公开内容的“药学上可接受的盐”可以是本领域中通常认为适于与人类或动物的组织接触使用而没有过度的毒性、刺激、过敏响应或其他问题或并发症的酸盐或碱盐。这样的盐包括碱性残基诸如胺的矿物和有机酸盐，以及酸性残基诸如羧酸的碱或有机盐。具体的药物盐包括但不限于以下酸的盐：诸如盐酸、磷酸、氢溴酸、苹果酸、乙醇酸、富马酸、硫酸、氨基磺酸、对氨基苯磺酸、甲酸、甲苯磺酸、甲磺酸、苯磺酸、乙二磺酸、2-羟乙基磺酸、硝酸、苯甲酸、2-乙酰氧基苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、乳酸、硬脂酸、水杨酸、谷氨酸、抗坏血酸、帕莫酸、琥珀酸、富马酸、马来酸、丙酸、羟基马来酸、氢碘酸、苯乙酸、烷酸诸如乙酸、HOOC-(CH₂)n-COOH，其中n是0-4等。类似地，药学上可接受的阳离子包括但不限于钠、钾、钙、铝、锂和铵。本领域普通技术人员将从本公开内容和本领域知识中认识到，其他的药学上可接受的盐包括Remington’s Pharmaceutical Sciences，第17版，Mack PublishingCompany，Easton，PA，第1418页(1985)列出的那些。通常，药学上可接受的酸盐或碱盐可以通过任何常规化学方法从包含碱性或酸性部分的母体化合物合成。简言之，这样的盐可以通过将这些化合物的游离酸或碱形式与化学计量量的适当碱或酸在适当的溶剂中反应来制备。

本文提供的范围被理解为该范围内所有值的简写。例如，1至50的范围被理解为包括来自由以下组成的组的任何数字、数字的组合或子范围：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50，以及上述整数之间的所有中间小数数值，诸如，例如1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8和1.9。关于子范围，从范围的任一端点延伸的“嵌套子范围(nested sub-range)”被特别地设想。例如，1至50的示例性范围的嵌套子范围可以包括在一个方向上的1至10、1至20、1至30和1至40，或者在另一个方向上的50至40、50至30、50至20和50至10。

本文提供的某些式和其他图示描绘了叠氮化物-炔烃环加成反应产生的三唑反应产物。虽然这样的式通常仅描绘在反应中形成的所得三唑的单一位置异构体，但意图的是该式包括所得的两种位置异构体。因此，虽然式仅描绘了单一位置异构体(例如，)，但意图的是另一位置异构体(例如，/>)也被包括。

术语“受试者”是指作为治疗、观察或实验对象的动物。仅以示例的方式，受试者包括但不限于哺乳动物，包括但不限于人类或非人哺乳动物，诸如非人灵长类动物、牛科动物、马科动物、犬科动物、羊科动物或猫科动物。

术语“任选的”或“任选地”表示随后描述的事件或情形可以发生但不必须发生，并且该描述包括其中该事件或情形发生的情况和其中该事件或情形没有发生的情况。

术语“部分”是指分子的特定区段或官能团。化学部分通常是嵌入或附加至分子的公认的化学实体。

如本文使用的，术语“数均分子量”(Mn)意指样品中所有个体单元的统计平均分子量，并且由式(1)定义：

其中M_i是单元的分子量并且N_i是具有该分子量的单元的数量。

如本文使用的，术语“重均分子量”(Mw)意指由式(2)定义的数：

如本文使用的，“峰值分子量”(Mp)意指在特定的分析方法(例如质谱、尺寸排阻色谱、动态光散射、分析型离心等)中最高峰的分子量。

如本文使用的，“非典型”氨基酸可以指不在通常掺入天然存在的蛋白中的20个典型氨基酸之列的D形式或L形式的氨基酸残基。

如本文使用的，“缀合手柄”是指能够在接触互补反应性基团时形成键的反应性基团。在一些情况下，缀合手柄优选地不具有与不包含预期互补反应性基团的其他分子的实质性反应性。缀合手柄、它们各自的互补缀合手柄和对应的反应产物的非限制性实例可以见于下表中。虽然表格标题将某些反应性基团放置于标题“缀合手柄”或“互补缀合手柄”之下，但预期对缀合手柄的任何提及可以代替涵盖表中列出的互补缀合手柄(例如，反式环辛烯可以是缀合手柄，在这种情况下，四嗪将是互补缀合手柄)。在一些情况下，胺缀合手柄和与胺互补的缀合手柄不太优选地用于生物系统，因为胺在生物系统中普遍存在，并且脱靶缀合的可能性增加。

缀合手柄表

在整个本申请中，在术语“缀合手柄”之前使用前缀来表示缀合手柄被连接的功能。例如，“蛋白缀合手柄”是附接至蛋白(直接或通过接头)的缀合手柄，“抗体缀合手柄”是附接至抗体(直接或通过接头)的缀合手柄，并且“接头缀合手柄”是附接至接头基团(例如，用于连接合成蛋白和抗体的双官能接头)的缀合手柄。

术语“烃基(alkyl)”是指具有1个至20个碳原子并且碳原子通过单键与分子的剩余部分附接的直链或支链的烃链基团。包含最多10个碳原子的烃基称为C₁-C₁₀烃基，同样，例如，包含最多6个碳原子的烃基是C₁-C₆烃基。包含其他数目碳原子的烃基(和本文定义的其他部分)类似地表示。烃基基团包括但不限于C₁-C₁₀烃基、C₁-C₉烃基、C₁-C₈烃基、C₁-C₇烃基、C₁-C₆烃基、C₁-C₅烃基、C₁-C₄烃基、C₁-C₃烃基、C₁-C₂烃基、C₂-C₈烃基、C₃-C₈烃基和C₄-C₈烃基。代表性烃基基团包括但不限于甲基、乙基、-丙基、1-甲基乙基、-丁基、-戊基、1,1-二甲基乙基、3-甲基己基、2-甲基己基、1-乙基丙基等。在一些实施方案中，烃基是甲基或乙基。在一些实施方案中，烃基是-CH(CH₃)₂或-C(CH₃)₃。除非说明书中另外特别说明，否则烃基基团可以任选地被取代。“亚烃基”或“亚烃基链”是指将分子剩余部分连接至基团的直链或支链的二价烃链。在一些实施方案中，亚烃基是-CH₂-、-CH₂CH₂-或-CH₂CH₂CH₂-。在一些实施方案中，亚烃基是-CH₂-。在一些实施方案中，亚烃基是-CH₂CH₂-。在一些实施方案中，亚烃基是-CH₂CH₂CH₂-。除非说明书中另外特别说明，否则亚烃基基团可以任选地被取代。

术语“亚烯基”或“亚烯基链”是指将分子的剩余部分连接至基团的其中存在至少一个碳-碳双键的直链或支链的二价烃链。在一些实施方案中，亚烯基是-CH＝CH-、-CH₂CH＝CH-或-CH＝CHCH₂-。在一些实施方案中，亚烯基是-CH＝CH-。在一些实施方案中，亚烯基是-CH₂CH＝CH-。在一些实施方案中，亚烯基是-CH＝CHCH₂-。

术语“炔基”是指其中存在至少一个碳-碳三键的烃基基团类型。在一种实施方案中，炔基基团具有式-C≡C-R^x，其中R^X是指炔基基团的剩余部分。在一些实施方案中，R^X是H或烃基。在一些实施方案中，炔基选自乙炔基、丙炔基、丁炔基、戊炔基、己炔基等。炔基基团的非限制性实例包括-C≡CH、-C≡CCH₃、-C≡CCH₂CH和-CH₂C^oCH。

术语“芳基”是指包含至少一个芳环(其中形成该环的每个原子都是碳原子)的基团。芳基基团可以任选地被取代。芳基基团的实例包括但不限于苯基和萘基。在一些实施方案中，芳基是苯基。根据结构，芳基基团可以是单基(monoradical)或双基(diradical)(即，亚芳基基团)。除非说明书中另外特别说明，否则术语“芳基”或前缀“ar-”(诸如在“芳烃基”中)意指包括任选地被取代的芳基基团。在一些实施方案中，芳基基团包括本文定义的部分还原的环烃基基团(例如，1,2-二氢萘)。在一些实施方案中，芳基基团包括本文定义的完全还原的环烃基基团(例如，1,2,3,4-四氢萘)。当芳基包括环烃基基团时，芳基通过芳环碳原子与分子的剩余部分键合。芳基基团可以是单环或多环(例如，双环、三环或四环)环体系，其可以包括稠合环体系、螺环体系或桥接环体系。

术语“环烃基(cycloalkyl)”是指单环或多环的非芳族基团，其中形成环的每个原子(即，骨架原子)是碳原子。在一些实施方案中，环烃基是饱和的或部分不饱和的。在一些实施方案中，环烃基是螺环或桥接化合物。在一些实施方案中，环烃基与芳环稠合(在这种情况下，环烃基通过非芳环碳原子键合)。环烃基包括具有3个至10个环原子的基团。代表性环烃基包括但不限于具有三个至十个碳原子、三个至八个碳原子、三个至六个碳原子或三个至五个碳原子的环烃基。单环环烃基基团包括例如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基和环辛基。在一些实施方案中，单环环烃基是环戊基。在一些实施方案中，单环环烃基是环戊烯基或环己烯基。在一些实施方案中，单环环烃基是环戊烯基。多环基团包括，例如，金刚烷基、1,2-二氢萘基、1,4-二氢萘基、四氢萘基、十氢萘基、3,4-二氢萘基-1(2H)-酮、螺[2.2]戊基、降冰片烃基和双环[1.1.1]戊基。除非说明书中另外特别说明，否则环烃基可以任选地被取代。

术语“亚杂烃基”或“亚杂烃基链”是指将分子剩余部分连接至基团的直链或支链的二价杂烃基链。除非说明书中另外特别说明，否则杂烃基或亚杂烃基基团可以如下文描述任选地被取代。代表性亚杂烃基基团包括但不限于-CH₂-O-CH₂-、-CH₂-N(烃基)-CH₂-、-CH₂-N(芳基)-CH₂-、-OCH₂CH₂O-、-OCH₂CH₂OCH₂CH₂O-或-OCH₂CH₂OCH₂CH₂OCH₂CH₂O-。

术语“杂环烃基(heteocycloalkyl)”是指包含选自氮、氧和硫的至少一个杂原子的环烃基基团。除非说明书中另外特别说明，否则杂环烃基基团可以是单环或双环的环体系，其可以包括稠合(当与芳基或杂芳基环稠合时，杂环烃基通过非芳族环原子键合)或桥接的环体系。杂环基基团中的氮、碳或硫原子可以任选地被氧化。氮原子可以任选地被季铵化。杂环烃基基团是部分或完全饱和的。杂环烃基基团的实例包括，但不限于，二氧戊环基、噻吩基[1,3]二噻烷基、四氢喹啉基、四氢异喹啉基、十氢喹啉基、十氢异喹啉基、咪唑啉基、咪唑烷基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、2-氧代哌嗪基、2-氧代哌啶基、2-氧代吡咯烷基、噁唑烷基、哌啶基、哌嗪基、4-哌啶酮基(piperidonyl)、吡咯烷基、吡唑烷基、奎宁环基、噻唑烷基、四氢呋喃基、三噻烷基、四氢吡喃基、硫代吗啉基(thiomorpholinyl)、硫杂吗啉基(thiamorpholinyl)、1-氧代-硫代吗啉基、1,1-二氧代-硫代吗啉基。术语杂环烃基还包括糖类的所有环形式，包括但不限于单糖、二糖和寡糖。除非另外说明，否则杂环烃基在环中具有2至12个碳原子。在一些实施方案中，杂环烃基在环中具有2至10个碳原子。在一些实施方案中，杂环烃基在环中具有2至10个碳原子和1或2个N原子。在一些实施方案中，杂环烃基在环中具有2至10个碳原子和3或4个N原子。在一些实施方案中，杂环烃基在环中具有2个至12个碳原子、0-2个N原子、0-2个O原子、0-2个P原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂环烃基在环中具有2个至12个碳原子、1-3个N原子、0-1个O原子和0-1个S原子。应理解，当提及杂环烃基中的碳原子数时，杂环烃基中的碳原子数与构成杂环烃基的原子(包括杂原子)(即，杂环烃基环的骨架原子)总数不同。除非说明书中另外特别说明，否则杂环烃基基团可以任选地被取代。

术语“杂芳基”是指包含选自氮、氧和硫的一个或更多个环杂原子的芳基基团。在一些实施方案中，杂芳基是单环或双环的。杂芳基的说明性实例包括吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、哒嗪基、三嗪基、噁二唑基、噻二唑基、呋咱基、吲哚嗪、吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、1,8-萘啶和蝶啶。单环杂芳基的说明性实例包括吡啶基、咪唑基、嘧啶基、吡唑基、三唑基、吡嗪基、四唑基、呋喃基、噻吩基、异噁唑基、噻唑基、噁唑基、异噻唑基、吡咯基、哒嗪基、三嗪基、噁二唑基、噻二唑基和呋咱基。双环杂芳基的说明性实例包括吲哚嗪、吲哚、苯并呋喃、苯并噻吩、吲唑、苯并咪唑、嘌呤、喹嗪、喹啉、异喹啉、噌啉、酞嗪、喹唑啉、喹喔啉、1,8-萘啶和蝶啶。在一些实施方案中，杂芳基是吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、噻唑基、噻吩基、噻二唑基或呋喃基。在一些实施方案中，杂芳基在环中包含0-6个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中包含1-4个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中包含4-6个N原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中包含0-4个N原子、0-1个O原子、0-1个P原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂芳基在环中包含1-4个N原子、0-1个O原子和0-1个S原子。在一些实施方案中，杂芳基是C₁-C₉杂芳基。在一些实施方案中，单环杂芳基是C₁-C₅杂芳基。在一些实施方案中，单环杂芳基是5元或6元杂芳基。在一些实施方案中，双环杂芳基是C6-C9杂芳基。在一些实施方案中，杂芳基基团包括本文定义的部分还原的环烃基或杂环烃基基团(例如，7,8-二氢喹啉)。在一些实施方案中，杂芳基基团包括本文定义的完全还原的环烃基或杂环烃基基团(例如，5,6,7,8-四氢喹啉)。在杂芳基包括环烃基或杂环烃基基团时，杂芳基通过杂芳环碳或杂原子与分子的剩余部分键合。杂芳基基团可以是单环或多环的(例如，双环、三环或四环)环体系，其可以包括稠合环体系、螺环体系或桥接环体系。术语“任选地被取代”或“被取代”意指提及的基团任选地被单独和独立地选自以下的一个或更多个另外的基团取代：D、卤素、-CN、-NH2、-NH(烃基)、-N(烃基)₂、-OH、-CO₂H、-CO₂烃基、-C(＝O)NH₂、-C(＝O)NH(烃基)、-C(＝O)N(烃基)₂、-S(＝O)₂NH₂、-S(＝O)₂NH(烃基)、-S(＝O)₂N(烃基)₂、烃基、环烃基、氟烃基、杂烃基、烃氧基、氟烃氧基、杂环烃基、芳基、杂芳基、芳氧基、烃硫基、芳硫基、烃基亚砜、芳基亚砜、烃基砜和芳基砜。在一些其他实施方案中，任选的取代基独立地选自D、卤素、-CN、-NH₂、-NH(CH₃)、-N(CH₃)₂、-OH、-CO₂H、-CO₂(C₁-C₄烃基)、-C(＝O)NH₂、-C(＝O)NH(C₁-C₄烃基)、-C(＝O)N(C₁-C₄烃基)₂、-S(＝O)₂NH_2、-S(＝O)₂NH(C₁-C₄烃基)、-S(＝O)₂N(C₁-C₄烃基)₂、C₁-C₄烃基、C₃-C₆环烃基、C₁-C₄氟烃基、C₁-C₄杂烃基、C₁-C₄烃氧基、C₁-C₄氟烃氧基、-SC₁-C₄烃基、-S(＝O)C₁-C₄烃基和-S(＝O)₂C₁-C₄烃基。在一些实施方案中，任选的取代基独立地选自D、卤素、-CN、-NH₂、-OH、-NH(CH₃)、-N(CH₃)₂、-NH(环丙基)、-CH₃、-CH₂CH₃、-CF₃、-OCH₃和-OCF₃。在一些实施方案中，被取代的基团被前述基团中的一个或两个取代。在一些实施方案中，脂族碳原子(无环或环状)上的任选的取代基包括氧代(＝O)。

如本文使用的，“AJICAP^TM技术”、“AJICAP^TM方法”和类似术语是指使用亲和肽对抗体和相关分子的位点特异性官能化以将期望的官能化递送至期望的位点的系统和方法(目前由Ajinomoto Bio-Pharma Services(“Ajinomoto”)生产)。用于AJICAP^TM方法的一般方案至少见于PCT公布第WO2018199337A1号、PCT公布第WO2019240288A1号、PCT公布第WO2019240287A1号、PCT公布第WO2020090979A1号、Matsuda等人,Mol.Pharmaceutics2021,18,4058-4066，和Yamada等人,AJICAP:Affinity Peptide MediatedRegiodivergent Functionalization of Native Antibodies.Angew.Chem.,Int.Ed.2019,58,5592-5597，并且特别地美国专利公布第US20200190165A1号的实施例2-4中。在一些实施方案中，这样的方法在选自抗体Fc区(例如，IgG1 Fc区)的位置246、位置248、位置288、位置290和位置317(EU编号)的位置处的赖氨酸残基处位点特异性掺入期望的官能化。在一些实施方案中，期望的官能化掺入在抗体Fc区的残基位置248(EU编号)处。在一些实施方案中，位置248对应于人类IgG CH2区的第18个残基(EU编号)。

“CMP-003”是指具有SEQ ID NO:3中列出的序列的修饰的IL-2多肽，该修饰的IL-2多肽包含附接在残基Y45处的～0.5kDa PEG基团和在残基F42Y处被叠氮化物官能团加帽以促进缀合的0.5kDa的PEG基团。具有2的DAR的与抗体缀合的CMP-003的卡通图像在图14中示出。CMP-003的示例性卡通结构在图1B中示出。CMP-003和相关修饰的IL-2多肽在PCT公布第WO2021140416A2号中描述，该公布特此通过引用并入，如以其整体列出一样。附接至CMP-003的聚合物发挥作用以破坏CMP-003与IL-2受体α亚单位的相互作用，并且使分子偏向有利于IL-2受体β亚单位信号传导，从而与WT IL-2相比增强IL-2多肽体内扩增和/或刺激T_eff细胞的能力。

“CMP-010”是指具有SEQ ID NO:3中列出的序列的修饰的IL-2多肽，该修饰的IL-2多肽包含附接在残基F42Y处的～0.5kDa PEG基团和附接在残基Y45处的～0.5kDa PEG基团。CMP-010包含通过戊二酰基团连接至N-末端胺的经由叠氮化物加帽的～0.5kDa PEG基团附接至N-末端的叠氮化物缀合手柄。CMP-010和相关修饰的IL-2多肽在PCT公布第WO2021140416A2号中描述，该公布特此通过引用并入，如以其整体列出一样。附接至CMP-010的聚合物发挥作用以破坏CMP-010与IL-2受体α亚单位的相互作用，并且使分子偏向有利于IL-2受体β亚单位信号传导，从而与WT IL-2相比增强IL-2多肽体内扩增和/或刺激T_eff细胞的能力。

“CMP-002”是指具有SEQ ID NO:3中列出的序列的修饰的IL-2多肽，该修饰的IL-2多肽包含附接在残基F42Y处的～0.5kDa PEG基团和附接在残基Y45处的第二～0.5kDa PEG基团。CMP-002和相关修饰的IL-2多肽在PCT公布第WO2021140416A2号中描述。附接至CMP-002的聚合物发挥作用以破坏CMP-002与IL-2受体α亚单位的相互作用，并且使分子偏向有利于IL-2受体β亚单位信号传导，从而与WT IL-2相比增强IL-2多肽体内扩增和/或刺激T_eff细胞的能力。

“CMP-095”是指SEQ ID NO:187的可缀合的合成IL-7多肽。CMP-095包含通过戊二酰-PEG₉-接头连接至N-末端胺的叠氮化物部分。

“CMP-086”是指SEQ ID NO:176的可缀合的合成IL-2多肽。CMP-086包含通过戊二酰-PEG₉-接头连接至N-末端胺的叠氮化物部分。CMP-086含有相对于野生型IL-2使分子偏向有利于与IL-2受体α亚单位相互作用从而增强IL-2多肽扩增和/或刺激T_reg细胞(与T_eff细胞相比)的能力的氨基酸取代。

缀合物组合物

本文提供了缀合物，所述缀合物包含(a)与靶抗原结合的多肽，诸如抗体或抗原结合片段，和(b)一种或更多种蛋白(例如，治疗性蛋白诸如合成细胞因子)或其衍生物。在一些实施方案中，本文提供的缀合物组合物有效地将蛋白(包括合成蛋白)和抗体同时递送至靶细胞。在一些实施方案中，这种将两种剂同时递送至同一细胞具有许多益处，包括确保两种剂同时递送至同一细胞，并且减少观察到治疗或其他益处所需的蛋白(重组蛋白或合成蛋白)、抗体或二者的浓度。在一些情况下，抗体和蛋白对细胞有不同的作用，诸如阻断一个信号传导通路(例如，抗体阻断第一受体的受体信号传导)并激活另一途径(例如，蛋白与第二受体结合以激活来自细胞的某种活性或响应)。

本文提供的缀合物组合物利用接头将抗体附接至合成蛋白。在一些实施方案中，接头在特定残基或残基的特定子集处附接至每个部分(抗体和合成蛋白)。在一些实施方案中，接头以位点选择性方式附接至每个部分(例如，在预先选择的残基处)，使得缀合物的群体实质上是均匀的。这可以通过如本文提供的多种方式实现，包括通过向待缀合的部分位点选择性添加用于缀合反应的试剂，合成或以其他方式制备用于缀合反应的与期望的试剂缀合的部分，或这两种方法的组合。使用这些方法，可以精确地选择接头与各自部分的附接位点(诸如特定的氨基酸残基)。另外地，这些方法允许组合物采用多种接头，这些接头不限于融合蛋白所需的氨基酸残基。例如，本公开内容的接头可以是化学聚合物(例如，聚乙二醇、聚丙二醇、聚酯、聚酰胺及其组合)。接头选择和精确附接至部分的这种组合允许接头还进行调节部分之一的活性的功能，例如如果接头在与合成蛋白的受体相互作用的位置处附接至合成蛋白。

图1A图示了包含与IL-2细胞因子缀合的抗PD-1多肽的示例性免疫细胞因子。本公开内容的抗PD-1抗体/IL-2免疫细胞因子(本文称为PD1-IL2)可以具有优异的功效和潜在改进的受试者的耐受性。在一些实施方案中，本公开内容的抗PD-1-IL-2免疫细胞因子可以直接靶向肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。图1A因此示出了免疫细胞因子的潜在用途，并且因此示出了产生蛋白-抗体缀合物(包括与合成蛋白的缀合物，并且特别是合成细胞因子的缀合物)的一般方法的效用。

抗体和抗原结合片段

在一些实施方案中，本公开内容的抗体或抗原结合片段与其靶选择性结合。如果抗体以比其与其他物质结合更大的亲和力、亲合力、更容易和/或更长的持续时间结合，则抗体与靶选择性结合或优先结合。因此，“特异性结合”或“优先结合”不一定需要(尽管它可以包括)排他性结合。通常，但不一定，提及特异性结合意指优先结合，其中抗体、抗原结合片段的亲和力比该抗体对不相关氨基酸序列的亲和力大至少2倍、大至少3倍、大至少4倍、大至少5倍、大至少6倍、大至少7倍、大至少8倍、大至少9倍、大至少10倍、大至少20倍、大至少30倍、大至少40倍、大至少50倍、大至少60倍、大至少70倍、大至少80倍、大至少90倍、大至少100倍或大至少1000倍。本公开内容的抗体或抗原结合片段可以阻断其靶与配体的相互作用，或阻断配体与其受体的相互作用。

如本文使用的，术语“抗体”是指具有为抗原结合结构域或与抗原结合结构域同源的结合结构域的免疫球蛋白(Ig)、多肽或蛋白。该术语还包括“抗原结合片段”和如下文描述类似结合片段的其他可互换术语。天然抗体和天然免疫球蛋白(Ig)通常是约150,000道尔顿的异四聚体糖蛋白，由两条相同的轻链和两条相同的重链组成。每条轻链通常通过一个共价二硫键与重链连接，而不同免疫球蛋白同种型的重链之间的二硫键(disulfidelinkage)数目不同。每条重和轻链还具有规则间隔的链内二硫桥。每条重链在一端具有可变结构域(“V_H”)，随后是一些恒定结构域(“C_H”)。每条轻链在一端具有可变结构域(“V_L”)并在其另一端具有恒定结构域(“C_L”)：轻链的恒定结构域与重链的第一恒定结构域对齐，并且轻链可变结构域与重链的可变结构域对齐。特定的氨基酸残基被认为在轻链可变结构域和重链可变结构域之间形成界面。

在一些情况下，抗体或抗原结合片段包括分离的抗体或抗原结合片段、纯化的抗体或抗原结合片段、重组抗体或抗原结合片段、修饰的抗体或抗原结合片段、或合成的抗体或抗原结合片段。

本文中的抗体和抗原结合片段可以部分或全部合成产生。抗体或抗原结合片段可以是具有可以是抗原结合结构域或者可以与抗原结合结构域同源的结合结构域的多肽或蛋白。在一种情况下，抗体或抗原结合片段可以在适当的体内动物模型中产生并且然后分离和/或纯化。

取决于免疫球蛋白的重链的恒定结构域的氨基酸序列，免疫球蛋白(Ig)可以指定为不同的类别。免疫球蛋白存在五个主要类别：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，并且这些中的几个可以被进一步分为亚类(同种型)，例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。在一些情况下，Ig或其一部分可以是人类Ig。在一些情况下，C_H3结构域可以来自免疫球蛋白。在一些情况下，抗体或抗原结合片段的链或部分、修饰的抗体或抗原结合片段或结合剂可以来自Ig。在这样的情况下，Ig可以是IgG、IgA、IgD、IgE或IgM，或者由其衍生。在其中Ig是IgG的情况下，它可以是IgG的亚型，其中IgG的亚型可以包括IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3和IgG4。在一些情况下，C_H3结构域可以来自选自由IgG、IgA、IgD、IgE和IgM组成的组或者由其衍生的免疫球蛋白。在一些实施方案中，本文描述的抗体或抗原结合片段的链或一部分包括IgG，或者由其衍生。在一些情况下，抗体或抗原结合片段的链或一部分包括IgG1，或者由其衍生。在一些情况下，抗体或抗原结合片段的链或一部分包括IgG4，或者由其衍生。在一些实施方案中，本文描述的抗体或抗原结合片段的链或一部分包括IgM，由其衍生，或者是IgM的单体形式。在一些实施方案中，本文描述的抗体或抗原结合片段的链或一部分包括IgE，或者由其衍生。在一些实施方案中，本文描述的抗体或抗原结合片段的链或一部分包括IgD，或者由其衍生。在一些实施方案中，本文描述的抗体或抗原结合片段的链或一部分包括IgA，或者由其衍生。

来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可以基于其恒定结构域的氨基酸序列被指定为两种明显不同的类型之一，称为kappa(“κ”或“K”)或lambda(“λ”)。

抗体的“可变区”是指单独或组合的抗体轻链的可变区或抗体重链的可变区。重链和轻链的可变区各自由被三个互补决定区(CDR)(也被称为高变区)连接的四个框架区(FR)组成。每个链中的CDR被FR极为接近地保持在一起，并且与来自另一个链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成。存在至少两种用于确定CDR的技术：(1)基于跨物种序列可变性(cross-species sequence variability)的方法(即，Kabat等人,Sequences of Proteinsof Immunological Interest,(第5版,1991,National Institutes of Health,BethesdaMd.))；和(2)基于抗原-抗体复合物晶体学研究的方法(Al-Iazikani等人(1997)J.Molec.Biol.273:927-948))。如本文使用的，CDR可以指由任一方法或两种方法的组合定义的CDR。

关于抗体，术语“可变结构域”是指用于每个特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的抗体的可变结构域。然而，可变性并不均匀地分布遍及抗体的可变结构域。而是，它集中在轻链可变结构域和重链可变结构域二者中称为高变区(也称为CDR)的三个区段中。可变结构域中更高度保守的部分被称为“框架区”或“FR”。未修饰的重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR(FR1、FR2、FR3和FR4)，主要采用β-折叠构型，散布有三个CDR，该CDR形成连接β-折叠结构的环并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的CDR被FR极为接近地保持在一起，并且与来自另一条链的CDR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见，Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991)，第647-669页)。

当本文使用时术语“高变区”和“CDR”是指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。CDR包含来自三个序列区的以互补方式与抗原结合的氨基酸残基，并且对于V_H链和V_L链中的每一条被称为CDR1、CDR2和CDR3。根据Kabat等人，同上，在轻链可变结构域中，CDR通常对应于大约残基24-34(CDRL1)、50-56(CDRL2)和89-97(CDRL3)，并且在重链可变结构域中，CDR通常对应于大约残基31-35(CDRH1)、50-65(CDRH2)和95-102(CDRH3)。应当理解，不同抗体的CDR可能包含插入，因此氨基酸编号可能不同。Kabat编号系统用编号方案来说明这样的插入，该编号方案利用附接至特定残基的字母(例如，轻链中的CDRL1的27A、27B、27C、27D、27E和27F)以反映不同抗体之间编号中的任何插入。可选地，根据Chothia和Lesk(J.Mol.Biol.,196:901-917(1987))，在轻链可变结构域中，CDR通常对应于大约残基26-32(CDRL1)、50-52(CDRL2)和91-96(CDRL3)，并且在重链可变结构域中，CDR通常对应于大约残基26-32(CDRH1)、53-55(CDRH2)和96-101(CDRH3)。

如本文使用的，“框架区”、“FW”或“FR”是指形成抗原结合口袋或沟槽一部分的框架氨基酸残基。在一些实施方案中，框架残基形成是抗原结合口袋或沟槽的一部分的环，并且环中的氨基酸残基可以接触或可以不接触抗原。框架区通常包括CDR之间的区域。根据Kabat等人，同上，在轻链可变结构域中，FR通常对应于大约残基0-23(FRL1)、35-49(FRL2)、57-88(FRL3)和98-109，而在重链可变结构域中，FR通常对应于大约残基0-30(FRH1)、36-49(FRH2)、66-94(FRH3)和103-133。如以上对轻链的Kabat编号所讨论的，重链也以类似的方式说明插入(例如，重链中CDRH1的35A、35B)。可选地，根据Chothia和Lesk，同上，在轻链可变结构域中，FR通常对应于大约残基0-25(FRL1)、33-49(FRL2)、53-90(FRL3)和97-109(FRL4)，而在重链可变结构域中，FR通常对应于大约残基0-25(FRH1)、33-52(FRH2)、56-95(FRH3)和102-113(FRH4)。FR的环氨基酸可以通过检查抗体重链和/或抗体轻链的三维结构来评价和确定。可以分析三维结构的溶剂可及的氨基酸位置，因为这样的位置可能形成环和/或在抗体可变结构域中提供抗原接触。一些溶剂可及的位置可以耐受氨基酸序列多样性，并且其他(例如，结构位置)通常不太多样化。抗体可变结构域的三维结构可以从晶体结构或蛋白建模中导出。

在本公开内容中，根据习惯，根据需要使用以下缩写(在括号中)：重链(H链)、轻链(L链)、重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)、互补决定区(CDR)、第一互补决定区(CDR1)、第二互补决定区(CDR2)、第三互决确定区(CDR3)、重链第一互补决定区(VH CDR1)、重链第二互补决定区(VH CDR2)、重链第三互补决定区(VH CDR3)、轻链第一互补决定区(VL CDR1)、轻链第二互补决定区(VL CDR2)和轻链第三互补决定区(VL CDR3)。

术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区域。“Fc区”可以是天然序列Fc区或变体Fc区。尽管免疫球蛋白重链的Fc区的边界可能不同，但人类IgG重链Fc区通常被定义为从位置Cys226处的氨基酸残基或从Pro230延伸至其羧基末端。Fc区域的残基编号与Kabat等人(Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版.Public HealthService,National Institutes of Health,Bethesda,Md.,1991)的EU索引的编号相同。免疫球蛋白的Fc区通常包括两个恒定结构域C_H2和C_H3。

本公开内容中有用的“抗体”涵盖但不限于单克隆抗体、多克隆抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、异源缀合物抗体、人源化抗体、人类抗体、去免疫抗体、其突变体、其融合物、其免疫缀合物、其抗原结合片段和/或免疫球蛋白分子的包含所需特异性的抗原识别位点的任何其他修饰的构型，包括抗体的糖基化变体、抗体的氨基酸序列变体和共价修饰的抗体。在本文提供的方法和缀合物的某些实施方案中，抗体需要Fc区来使抗体和蛋白之间的接头能够附接(例如，使用亲和肽附接接头，诸如在AJICAP^TM技术中)。

在一些情况下，抗体是单克隆抗体。如本文使用的，“单克隆抗体”是指从实质上同质性的抗体群体中获得的抗体，即，构成该群体的单个抗体除了可能以少量存在的天然发生的突变之外是相同的。与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制品相比，每个单克隆抗体针对抗原上的单个决定簇(表位)。修饰语“单克隆”指示抗体的特征在于自实质上同源的抗体群体获得，且不应理解为需要通过任何特定方法来产生该抗体。

在一些情况下，抗体是人源化抗体。如本文使用的，“人源化”抗体是指包含最少的衍生自非人类免疫球蛋白的序列的特定嵌合免疫球蛋白、免疫球蛋白链或其片段的非人类(例如，鼠)抗体的形式。人源化抗体的大部分是人类免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体互补决定区(CDR)的残基被来自非人类物种(诸如小鼠、大鼠或兔)(供体抗体)的具有所期望的特异性、亲和力和生物活性的CDR的残基替代。在一些情况下，人类免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被对应的非人类残基替代。此外，人源化抗体可以包含既不存在于受体抗体中也不存在于输入的CDR或框架序列中但被包括在内以进一步改进和优化抗体性能的残基。通常，人源化抗体实质上包含至少一个并且通常两个可变结构域的全部，其中全部或实质上全部CDR区对应于非人类免疫球蛋白的CDR区，并且全部或大体上全部FR区是人类免疫球蛋白共有序列的FR区。人源化抗体最佳地还将包含免疫球蛋白(通常是人类免疫球蛋白)恒定区或结构域(Fc)的至少一部分。抗体可以具有如例如WO 99/58572中描述修饰的Fc区。其他形式的人源化抗体具有相对于初始抗体被改变的一个或更多个CDR(一个、两个、三个、四个、五个或六个)，这些CDR也被称为“衍生自”来自初始抗体的一个或更多个CDR的一个或更多个CDR。

如果需要，可以评价本文描述的抗体或抗原结合片段的免疫原性，并且根据需要对其进行去免疫(即，通过改变一个或更多个T细胞表位使抗体的免疫反应性更少)。如本文使用的，“去免疫抗体”意指，抗体序列中的一个或更多个T细胞表位已经被修饰，使得与未去免疫的抗体相比，向受试者施用抗体之后的T细胞响应减少。本文描述的抗体和抗原结合片段中存在的免疫原性和T细胞表位的分析可以经由使用软件和特定数据库进行。示例性软件和数据库包括由英国剑桥的Antitope开发的iTope^TM。iTope^TM是用于分析与人类MHCII类等位基因的肽结合的计算机模拟技术。iTope^TM软件预测与人类MHC II类等位基因的肽结合，并且从而为这样的“潜在T细胞表位”的定位提供初步筛选。iTope^TM软件预测肽的氨基酸侧链和34个人类MHC II类等位基因结合沟槽内的特异性结合口袋之间的有利相互作用。关键结合残基的定位是通过计算机模拟产生跨越测试抗体可变区序列重叠一个氨基酸的9聚体肽实现的。每种9聚体肽可以针对34种MHC II类同种异型中的每一种进行测试，并且基于它们与MHC II类结合沟槽的潜在“适合度”和相互作用进行评分。对>50％的MHC II类等位基因产生高平均结合评分(在iTope^TM评分函数中>0.55)的肽被认为是潜在的T细胞表位。在这样的区域中，分析MHC II类沟槽内肽结合的核心9氨基酸序列，以确定MHC II类口袋残基(P1、P4、P6、P7和P9)和可能的T细胞受体(TCR)接触残基(P-l、P2、P3、P5、P8)。在鉴定任何T细胞表位之后，可以引入氨基酸残基改变、取代、添加和/或缺失来去除鉴定的T细胞表位。可以进行这样的改变，以保持抗体的结构和功能，同时仍然去除已鉴定的表位。示例性改变可以包括但不限于保守的氨基酸改变。

抗体可以是人类抗体。如本文使用的，“人类抗体”意指具有与由人类产生的氨基酸序列相对应的氨基酸序列和/或使用用于制备人类抗体的任何合适技术制备的抗体。人类抗体的该定义包括包含至少一种人类重链多肽或至少一种人类轻链多肽的抗体。一个这样的实例是包含鼠轻链多肽和人类重链多肽的抗体。在一种实施方案中，人类抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人类抗体。人类抗体也可以通过将人类免疫球蛋白基因座引入内源免疫球蛋白基因部分或完全失活的转基因动物(例如，小鼠)来制备。可选地，人类抗体可以通过永生化产生针对靶抗原的抗体的人类B淋巴细胞来制备(这样的B淋巴细胞可以从个体中回收或者可以已经在体外免疫)。

本文中的任何抗体都可以是双特异性的。双特异性抗体是对至少两种不同抗原具有结合特异性的抗体，并且可以使用本文公开的抗体制备。传统上，双特异性抗体的重组产生是基于两条免疫球蛋白重链-轻链对的共表达，其中两条重链具有不同的特异性。双特异性抗体可以由一臂中具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链和另一臂中的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)组成。这种不对称结构(仅在双特异性分子的一半中有免疫球蛋白轻链)有助于从不需要的免疫球蛋白链组合中分离期望的双特异性化合物。

根据制备双特异性抗体的一种方法，将具有期望的结合特异性(抗体-抗原组合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。融合可以与免疫球蛋白重链恒定结构域，包括铰链区、CH2区和CH3区的至少一部分一起。包含轻链结合所需位点的第一重链恒定区(CH1)可以存在于融合物的至少一个中。将编码免疫球蛋白重链融合体和(如果期望)免疫球蛋白轻链的DNA插入到单独的表达载体中，并共转染到合适的宿主生物体中。当构建中使用的三条多肽链的不相等比率提供最佳产率时，这为在实施方案中调整三种多肽片段的相互比例方面提供了大的灵活性。然而，当至少两条多肽链以相等比率的表达导致高产率或当该比率没有特别的意义时，可以将两条或所有三条多肽链的编码序列插入在一个表达载体中。

在一些情况下，本文中的抗体是嵌合抗体。非人类(例如，鼠)的“嵌合”形式抗体包括嵌合抗体，其包含最少的衍生自非人类Ig的序列。嵌合抗体的大部分是鼠抗体，其中免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少一部分，通常是人类免疫球蛋白的恒定区，被插入代替鼠Fc。嵌合或杂合抗体也可以使用合适的合成蛋白化学方法(包括涉及交联剂的方法)体外制备。例如，免疫毒素可以使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建。用于此目的的合适试剂的实例包括亚氨基硫醇酯(iminothiolate)和4-巯基丁嘧啶甲酯。

本文提供了抗体及其抗原结合片段、修饰的抗体及其抗原结合片段以及与一种或更多种靶抗原上的一种或更多种表位特异性结合的结合剂。在一种情况下，结合剂与单个抗原上的表位选择性结合。在另一种情况下，结合剂是二价的，并且与单个抗原上的两个不同的表位选择性结合，或者与两个不同抗原上的两个不同的表位选择性结合。在另一种情况下，结合剂是多价的(即，三价，四价等)，并且结合剂与单个抗原上的三个或更多个不同表位结合或与两个或更多(多个)抗原上的三个或更多个不同表位结合。

本文还设想了任何抗体的抗原结合片段。术语“抗体的抗原结合部分”、“抗原结合片段”、“抗原结合结构域”、“抗体片段”或“抗体的功能片段”在本文中可互换使用，以指抗体的保留与抗原特异性结合能力的一个或更多个片段。代表性抗原结合片段包括但不限于Fab、Fab’、F(ab’)₂、双特异性F(ab’)₂、三特异性F(ab’)₂、可变片段(Fv)、单链可变片段(scFv)、dsFv、双特异性scFv、可变重结构域、可变轻结构域、可变NAR结构域、双特异性scFv、、微抗体、双抗体、双特异性双抗体、三抗体、四抗体、微抗体、大抗体(maxibody)、骆驼科抗体、VHH、微抗体、胞内抗体、包含抗体部分(例如，结构域抗体)的融合蛋白、单链结合多肽、scFv-Fc、Fab-Fc、双特异性T细胞衔接物(BiTE；作为单个多肽链产生的两个scFv，其中每个scFv包含本文描述的CDR的组合或VL/VL的组合的氨基酸序列)、四价串联双抗体(TandAb；作为以头至尾排列的非共价同源二聚体折叠体产生的抗体片段，例如，包含scFv的TandAb，其中scFv包含本文描述的CDR的组合或VL/VL的组合的氨基酸序列)、双亲和重新靶向抗体(DART；由稳定的链间二硫键连接的不同scFv)、双特异性抗体(bscAb；经由甘氨酸-丝氨酸接头连接的两个单链Fv片段)、单结构域抗体(sdAb)，融合蛋白，双特异性二硫化物稳定的Fv抗体片段(dsFv-dsFv’；通过柔性接头肽连接的两种不同的二硫化物稳定的Fv抗体片段)。在本发明的某些情况下，优选全长抗体(例如，抗原结合片段和Fc区)。

包含两种共价连接的抗体的异源缀合物抗体也在本公开内容的范围内。合适的接头可以用于多聚化结合剂。连接肽的非限制性实例包括但不限于(GS)_n(SEQ ID NO:24)、(GGS)_n(SEQ ID NO:25)、(GGGS)_n(SEQ ID NO:26)、(GGSG)_n(SEQ ID NO:27)或(GGSGG)_n(SEQID NO:28)、(GGGGS)_n(SEQ ID NO:29)，其中n是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。例如，连接肽可以是(GGGGS)₃(SEQ ID NO:30)(该连接肽在一个可变区的羧基末端和另一个可变区的氨基末端之间桥接大约3.5nm)，或(GGGGS)₄(SEQ ID NO:31)。已经设计并使用了其他序列的接头。接头又可以被修饰用于另外的功能，诸如药物的附接或固体支持物的附接。

如本文使用的，术语“亲合力”是指两种或更多种剂的复合物在稀释之后对解离的抗性。表观亲和力可以通过方法诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)或任何其他合适的技术来确定。亲合力可以通过方法诸如Scatchard分析或任何其他合适的技术来确定。

如本文使用的，术语“亲和力(affinity)”是指两种剂可逆结合的平衡常数并表示为K_D。抗体或抗原结合片段的结合亲和力(K_D)可以小于500nM、475nM、450nM、425nM、400nM、375nM、350nM、325nM、300nM、275nM、250nM、225nM、200nM、175nM、150nM、125nM、100nM、90nM、80nM、70nM、50nM、50nM、49nM、48nM、47nM、46nM、45nM、44nM、43nM、42nM、41nM、40nM、39nM、38nM、37nM、36nM、35nM、34nM、33nM、32nM、31nM、30nM、29nM、28nM、27nM、26nM、25nM、24nM、23nM、22nM、21nM、20nM、19nM、18nM、17nM、16nM、15nM、14nM、13nM、12nM、11nM、10nM、9nM、8nM、7nM、6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、990pM、980pM、970pM、960pM、950pM、940pM、930pM、920pM、910pM、900pM、890pM、880pM、870pM、860pM、850pM、840pM、830pM、820pM、810pM、800pM、790pM、780pM、770pM、760pM、750pM、740pM、730pM、720pM、710pM、700pM、690pM、680pM、670pM、660pM、650pM、640pM、630pM、620pM、610pM、600pM、590pM、580pM、570pM、560pM、550pM、540pM、530pM、520pM、510pM、500pM、490pM、480pM、470pM、460pM、450pM、440pM、430pM、420pM、410pM、400pM、390pM、380pM、370pM、360pM、350pM、340pM、330pM、320pM、310pM、300pM、290pM、280pM、270pM、260pM、250pM、240pM、230pM、220pM、210pM、200pM、190pM、180pM、170pM或其间的任何整数。结合亲和力可以使用以下来确定：表面等离子体共振(SPR)、生物传感器、闪烁接近测定、酶联免疫吸附测定(ELISA)、ORIGEN免疫测定(IGEN)、荧光猝灭、荧光转移、酵母展示或其任何组合。结合亲和力也可以使用合适的生物测定法进行筛选。

如本文使用的，术语“亲合力”是指两种或更多种剂的复合物在稀释之后对解离的抗性。表观亲和力可以通过方法诸如酶联免疫吸附测定(ELISA)或本领域技术人员熟悉的任何其他技术来确定。亲合力可以通过方法诸如Scatchard分析或本领域技术人员熟悉的任何其他技术来确定。

本文还提供了亲和成熟抗体。以下方法可以用于调整抗体的亲和力并且用于表征CDR。一种表征抗体CDR和/或改变(诸如改进)多肽(诸如抗体)结合亲和力的方法被称为“文库扫描诱变”。通常，文库扫描诱变如下工作。CDR中的一个或更多个氨基酸位置被两个或更多个(诸如3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20个)氨基酸替代。这产生了克隆的小文库(在一些实施方案中，用于被分析的每个氨基酸位置的一个)，每个具有两个或更多个成员的复杂性(如果两个或更多个氨基酸在每个位置处被取代)。通常，文库还包括包含天然(未取代)氨基酸的克隆。可以筛选来自每个文库的少量克隆，例如，约20-80个克隆(取决于文库的复杂性)对靶多肽(或其他结合靶)的结合特异性或亲和力，并且鉴定具有增加、相同、降低或没有结合的候选物。结合亲和力可以使用Biacore表面等离子体共振分析来确定，该分析检测到约2倍或更大的结合亲和力差异。

在一些情况下，抗体或抗原结合片段是双特异性的或多特异性的，并且可以与多于一种抗原特异性结合。在一些情况下，这样的双特异性或多特异性抗体或抗原结合片段可以与2种或更多种不同的抗原特异性结合。在一些情况下，双特异性抗体或抗原结合片段可以是二价抗体或抗原结合片段。在一些情况下，多特异性抗体或抗原结合片段可以是二价抗体或抗原结合片段、三价抗体或抗原结合片段或四价抗体或抗原结合片段。

本文描述的抗体或抗原结合片段可以是分离的、纯化的、重组的或合成的。

本文描述的抗体可以通过任何合适的方法制备。抗体通常可以大量产生，特别地当利用高水平表达载体时。

抗体或抗原结合片段的代表性实例包括但不限于与癌症抗原、免疫细胞靶分子、自身抗原或其组合选择性结合的抗体或抗原结合片段。

癌症抗原包括但不限于细胞程序性死亡1(PD1)、细胞程序性死亡配体1(PDL1)、CD5、CD20、CD19、CD22、CD30、CD33、CD40、CD44、CD52、CD74、CD103、CD137、CD123、CD152、癌胚抗原(CEA)、整联蛋白、表皮生长因子(EGF)受体家族成员、血管表皮生长因子(VEGF)、蛋白聚糖、二唾液酸神经节苷脂、B7-H3、癌症抗原125(CA-125)、上皮细胞黏附分子(EpCAM)、血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2、肿瘤相关糖蛋白、黏蛋白1(MUC1)、肿瘤坏死因子受体、胰岛素样生长因子受体、叶酸受体α、跨膜糖蛋白NMB、C-C趋化因子受体、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体型酪氨酸蛋白激酶(recepteur d'origine nantais，RON)受体、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、结肠癌抗原19.9、胃癌黏蛋白抗原4.2、结直肠上皮癌抗原A33、ADAM-9、AFP癌胎抗原-甲胎蛋白、ALCAM、BAGE、β-连环蛋白、羧肽酶M、B1、CD23、CD25、CD27、CD28、CD36、CD45、CD46、CD52、CD56、CD79a/CD79b、CD317、CDK4、CO-43(血型Le^b)、CO-514(血型Le^a)、CTLA-1、细胞角蛋白8、DR5、E1系列(B血型)、Ephrin受体A2(EphA2)、Erb(ErbB1、ErbB3、ErbB4)、肺腺癌抗原F3、抗原FC10.2、GAGE-1、GAGE-2、GD2/GD3/GD49/GM2/GM3、GICA19-9、gp37、gp75、gp100、HER-2/neu、人类乳脂球抗原、人类乳头瘤病毒-E6/人类乳头瘤病毒-E7、高分子量黑素瘤抗原(HMW-MAA)、分化抗原(I抗原)、存在于胃腺癌中的I(Ma)、整联蛋白α-V-β-6、整联蛋白β6(ITGβ6)、白细胞介素-13受体α2(IL13Rα2)、JAM-3、KID3、KID31、KS1/4泛上皮癌抗原、KSA(17-1A)、人类肺上皮癌抗原L6、人类肺上皮癌抗原L20、LEA、LUCA-2、M1:22:25:8、M18、M39、MAGE-1、MAGE-3、MART、Myl、MUM-1、N-乙酰葡糖胺基转移酶、新糖蛋白、NS-10、OFA-1和OFA-2、制瘤素M(制瘤素受体β)、rho15、前列腺特异性抗原(PSA)、PSMA、多态性上皮黏蛋白抗原(PEMA)、PIPA、前列腺酸性磷酸酯、R24、ROR1、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、sTn、T细胞受体衍生肽、T5A7、组织抗原37、TAG-72、TL5(血型A)、TNF-α受体(TNFαR)、TNFβR、TNFγR、TRA-1-85(血型H)、转铁蛋白受体、TSTA肿瘤特异性移植抗原、VEGF-R、Y半抗原、Le^y、5T4或其组合。

免疫细胞靶分子包括但不限于PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、CD28、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、ICOS配体、ICOS、B7-H3、B7-H4、VISTA、B7-H7(HHLA2)、TMIGD2、4-1BBL、4-1BB、HVEM、BTLA、CD160、LIGHT、MHC I类、MHC II类、LAG3、OX40L、OX40、CD70、CD27、CD40、CD40L、GITRL、GITR、CD155、DNAM-1、TIGIT、CD96、CD48、2B4、半乳凝素-9、TIM-3、腺苷、腺苷A2a受体、CEACAM1、CD47、SIRPα、BTN2A1、DC-SIGN、CD200、CD200R、TL1A、DR3或其组合。

自身抗原包括但不限于肿瘤坏死因子α(TNFα)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白(PLP)、II型胶原(CII)、波形蛋白、α-烯醇酶、簇集素、组蛋白、肽基精氨酸脱亚胺酶-4、转谷氨酰胺酶2(TG2、TGM2)、CD318、肽聚糖识别蛋白1(PGLYRP1)或其组合。

代表性抗体和抗原结合片段

本文描述的抗体或抗原结合片段可以与治疗相关抗原，诸如，例如，癌症抗原、免疫细胞靶分子、自身抗原或其任何组合选择性结合。在一个非限制性方面，本文提供了与例如PD1、PD-L1、CD20或TNFα选择性结合的抗体或抗原结合片段用于在缀合物中使用。

在一种实施方案中，抗体或抗原结合片段与人类PD1选择性结合，其中人类PD1具有以下的氨基酸序列：

在另一种实施方案中，抗体或抗原结合片段与人类PD-L1选择性结合，其中人类PD-L1具有以下的氨基酸序列：

在另一种实施方案中，抗体或抗原结合片段与人类CD20选择性结合，其中人类CD20具有以下的氨基酸序列：

在另一种实施方案中，抗体或抗原结合片段与人类TNF-α选择性结合。人类TNFα跨膜蛋白可以具有以下的氨基酸序列：

重组的成熟人类TNFα可以具有以下的氨基酸序列：

抗PD-1抗体

在一种实施方案中，本公开内容的抗PD1抗体或抗PD1抗原结合片段包含本文描述的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的组合。在另一种实施方案中，本公开内容的抗PD1抗体或抗PD1抗原结合片段包含本文描述的互补决定区(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3)的组合。在一种实施方案中，本公开内容的抗PD-1抗体或抗PD-1抗原结合片段包括修饰的替雷利珠单抗(Tislelizumab)、百泽安(Baizean)、0KVO411B3N、BGB-A317、hu317-1/IgG4mt2、信迪利单抗(Sintilimab)、Tyvyt、IBI-308、特瑞普利单抗(Toripalimab)、TeRuiPuLi、Terepril、Tuoyi、JS-001、TAB-001、卡瑞利珠单抗(Camrelizumab)、HR-301210、INCSHR-01210、SHR-1210、Cemiplimab、Cemiplimab-rwlc、6QVL057INT、H4H7798N、REGN-2810、SAR-439684、Lambrolizumab、帕博利珠单抗、/>MK-3475、SCH-900475、h409A11、纳武单抗、纳武单抗BMS、/>BMS-936558、MDX-1106、ONO-4538、Prolgolimab、Forteca、BCD-100、派安普利单抗(Penpulimab)、AK-105、赛帕利单抗(Zimberelimab)、AB-122、GLS-010、WBP-3055、巴替利单抗(Balstilimab)、1Q2QT5M7EO、AGEN-2034、AGEN-2034w、Genolimzumab、Geptanolimab、APL-501、CBT-501、GB-226、多塔利单抗(Dostarlimab)、ANB-011、GSK-4057190A、P0GVQ9A4S5、TSR-042、WBP-285、斯鲁利单抗(Serplulimab)、HLX-10、CS-1003、瑞弗利单抗(Retifanlimab)、2Y3T5IF01Z、INCMGA-00012、INCMGA-0012、MGA-012、萨善利单抗(Sasanlimab)、LZZ0IC2EWP、PF-06801591、RN-888、司他利珠单抗(Spartalizumab)、NVP-LZV-184、PDR-001、QOG25L6Z8Z、瑞拉利单抗(Relatlimab)/纳武单抗、BMS-986213、Cetrelimab、JNJ-3283、JNJ-63723283、LYK98WP91F、Tebotelimab、MGD-013、BCD-217、BAT-1306、HX-008、MEDI-5752、JTX-4014、卡度尼利单抗(Cadonilimab)、AK-104、BI-754091、Pidilizumab、CT-011、MDV-9300、YBL-006、AMG-256、RG-6279、RO-7284755、BH-2950、IBI-315、RG-6139、RO-7247669、ONO-4685、AK-112、609-A、LY-3434172、T-3011、MAX-10181、AMG-404、IBI-318、MGD-019、INCB-086550、ONCR-177、LY-3462817、RG-7769、RO-7121661、F-520、XmAb-23104、Pd-1-pik、SG-001、S-95016、Sym-021、LZM-009、Budigalimab、6VDO4TY3OO、ABBV-181、PR-1648817、CC-90006、XmAb-20717、2661380、AMP-224、B7-DCIg、EMB-02、ANB-030、PRS-332、[89Zr]Deferoxamide-帕博利珠单抗、89Zr-Df-帕博利珠单抗、[89Zr]Df-帕博利珠单抗、STI-1110、STI-A1110、CX-188、mPD-1Pb-Tx、MCLA-134、244C8、ENUM 224C8、ENUM C8、388D4、ENUM 388D4、ENUM D4、MEDI0680或AMP-514。在一些实施方案中，抗PD-1多肽是修饰的帕博利珠单抗。在一些实施方案中，抗PD-1多肽用mAB3修饰。在一些实施方案中，抗PD-1多肽用mAB4修饰。

下文表1A提供了可以被修饰以制备抗PD-1免疫缀合物的示例性抗PD-1多肽和抗PD-1抗原结合片段的氨基酸序列。表1A还示出了提供可以用于修饰的抗PD-1免疫缀合物中的CDR的组合。本文提及抗PD-1多肽可选地可以指抗PD-1抗原结合片段。

表1A

/>

抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段可以包含具有SEQ ID NO:37、39、41、43、45、51、53、55、57、59、61、63、65、67、69、71、73、75、77、79、81和83中任何一个的氨基酸序列的VH。抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段可以包含具有SEQ ID NO:38、40、42、44、46、48、50、52、54、56、58、60、62、64、66、68、70、72、74、76、78、80、82和84中任何一个的氨基酸序列的VH。

在一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:37的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:38的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:39的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:40的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:41的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:42的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:43的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:44的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:45的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:46的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:51的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:52的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ IDNO:53的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:54的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:55的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:56的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQID NO:57的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:58的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:59的氨基酸序列的VH和具有SEQ IDNO:60的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:61的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:62的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:63的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:64的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:65的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:66的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:67的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:68的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:69的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:70的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:71的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:72的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:73的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:74的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:75的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:76的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:77的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:78的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:79的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:80的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:81的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:82的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:83的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:84的氨基酸序列的VL。

在一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:85的氨基酸序列的VH CHR1、具有SEQ ID NO:86的氨基酸序列的VH CHR2、具有SEQ ID NO:87的氨基酸序列的VH CHR3、具有SEQ ID NO:88的氨基酸序列的VL CHR1、具有SEQ ID NO:89的氨基酸序列的VL CHR2和具有SEQ ID NO:90的氨基酸序列的VL CHR3。在一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:91的氨基酸序列的VH CHR1、具有SEQ IDNO:92的氨基酸序列的VH CHR2、具有SEQ ID NO:93的氨基酸序列的VH CHR3、具有SEQ IDNO:94的氨基酸序列的VL CHR1、具有SEQ ID NO:95的氨基酸序列的VL CHR2和具有SEQ IDNO:96的氨基酸序列的VL CHR3。在一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:97的氨基酸序列的VH CHR1、具有SEQ ID NO:98的氨基酸序列的VH CHR2、具有SEQ ID NO:99的氨基酸序列的VH CHR3、具有SEQ ID NO:100的氨基酸序列的VL CHR1、具有SEQ ID NO:101的氨基酸序列的VL CHR2和具有SEQ ID NO:102的氨基酸序列的VL CHR3。在一种情况下，抗PD-1多肽或抗PD-1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:103的氨基酸序列的VH CHR1、具有SEQ ID NO:104的氨基酸序列的VH CHR2、具有SEQ ID NO:105的氨基酸序列的VH CHR3、具有SEQ ID NO:106的氨基酸序列的VL CHR1、具有SEQ ID NO:107的氨基酸序列的VL CHR2和具有SEQ ID NO:108的氨基酸序列的VL CHR3。

在一种情况下，抗PD-1多肽包含融合蛋白。这样的融合蛋白可以是例如在CHO-K1细胞中表达的包含经由人类IgG4的铰链-CH2-CH3 Fc结构域融合的细胞程序性死亡1(PD-1)的胞外结构域(ECD)和肿瘤坏死因子(配体)超家族成员4(TNFSF4或OX40L)的ECD的双侧Fc融合蛋白，其中融合蛋白具有SEQ ID NO:109的示例性氨基酸序列。

抗PD-L1抗体

在一种实施方案中，本公开内容的抗PD-L1抗体或抗PD-L1抗原结合片段包含本文描述的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的组合。在另一种实施方案中，本公开内容的抗PD-L1抗体或抗PD-L1抗原结合片段包含本文描述的互补决定区(VH CDR1、VH CDR2、VHCDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)的组合。在一种实施方案中，本公开内容的抗PD-L1抗体或抗PD-L1抗原结合片段包含修饰的阿维鲁单抗(Bavencio、451238、KXG2PJ551I、MSB-0010682、MSB-0010718C、PF-06834635、CAS1537032-82-8：EMD Serono、Merck&Co.、MerckKGaA、Merck Serono、美国国家癌症研究所(National Cancer Institute，NCI)，Pfizer)、度伐利尤单抗(Imfinzi、28X28X9OKV(UNII代码)、MEDI-4736、CAS1428935-60-7：AstraZeneca、Celgene、Children's Hospital Los Angeles(CHLA)、City of HopeNational Medical Center、MedImmune、Memorial Sloan-Kettering Cancer Center、Mirati Therapeutics、美国国家癌症研究所(NCI)、Samsung Medical Center(SMC)、Washington University)、阿替利珠单抗(Tecentriq、52CMI0WC3Y、MPDL-3280A、RG-7446、RO-5541267、CAS1380723-44-3：Academisch Medisch Centrum(AMC)、ChugaiPharmaceutical、EORTC、Genentech、Immune Design(Merck&Co.)、Memorial Sloan-Kettering Cancer Center、美国国家癌症研究所(NCI)、Roche、Roche Center forMedical Genomics)、舒格利单抗(Sugemalimab)(CS-1001、WBP-3155：CStonePharmaceuticals、EQRx、Pfizer)、KN-046(CAS2256084-03-2：Jiangsu AlphamabBiopharmaceuticals,Sinovent)、APL-502(CBT-502、TQB-2450：Apollomics、Jiangsu ChiaTai Tianqing Pharmaceutical)、恩沃利单抗(Envafolimab)(3D-025、ASC-22、KN-035、hu56V1-Fc-m1、CAS2102192-68-5：3D Medicines、Ascletis、Jiangsu AlphamabBiopharmaceuticals、Suzhou Alphamab、Tracon Pharmaceuticals,Inc.)、Bintrafuspalfa(M-7824、MSB-0011359C、NW9K8C1JN3、CAS1918149-01-5：EMD Serono、GlaxoSmithKline、Merck KGaA、美国国家癌症研究所(NCI))、STI-1014(STI-A1014、ZKAB-001：Lee's Pharmaceutical、Sorrento Therapeutics)、PD-L1 t-haNK(ImmunityBio、NantKwest)、A-167(HBM-9167、KL-A167：Harbour BioMed、Sichuan Kelun-BiotechBiopharmaceutical)、IMC-001(STI-3031、STI-A-1015、STI-A1015、ImmuneOnciaTherapeutics、Sorrento Therapeutics)、HTI-1088(SHR-1316：Atridia、JiangsuHengrui)、IO-103(IO Biotech)、CX-072(CytomX Therapeutics)、AUPM-170(CA-170：Aurigene、Curis)、GS-4224(Gilead)、ND-021(NM21-1480、PRO-1480：CStonePharmaceuticals、Numab Therapeutics)、BNT-311(DuoBody-PD-L1x4-1BB、GEN-1046：BioNTech、Genmab)、BGB-A333(BeiGene)、IBI-322(Innovent Biologics)、NM-01(NanomabTechnology、Shanghai First People's Hospital)、LY-3434172(Eli Lilly)、LDP(Dragonboat Biopharmaceutical)、CDX-527(Celldex Therapeutics)、IBI-318(InnoventBiologics、Lilly)、89Zr-DFO-REGN3504(Regeneron)、ALPN-202(CD80 vIgD-Fc：AlpineImmune Sciences)、INCB-086550(Incyte)、LY-3415244(Eli Lilly)、SHR-1701(JiangsuHengrui)、JS-003(JS003-30、JS003-SD：Shanghai Junshi Biosciences)、HLX-20(PL2#3：Henlix Biotech、Shanghai Henlius Biotech)、ES-101(INBRX-105、INBRX-105-1：Elpiscience BioPharma、Inhibrx)、MSB-2311(MabSpace Biosciences)、PD-1-Fc-OX40L(SL-279252、TAK-252：Heat Biologics、Shattuck Labs、Takeda)、FS-118、FS118 mAb2、LAG-3/PD-L1 mAb2：F-star Therapeutics、Merck&Co.、Merck KGaA)、FAZ-053(LAE-005：Laekna Therapeutics、Novartis)、Lodapolimab(LY-3300054、NR4MAD6PPB、CAS2118349-31-6：Eli Lilly)、MCLA-145(Incyte、Merus)、BMS-189(BMS-986189、来自Bristol-MyersSquibb的PD-L1-Milla)、Cosibelimab(CK-301、TG-1501、CAS2216751-26-5：CheckpointTherapeutics、Dana-Farber Cancer Institute、Samsung Biologics、TG Therapeutics)、IL-15Rα-SD/IL-15(KD-033：Kadmon)、WP-1066(CAS 857064-38-1：M.D.Anderson CancerCenter、Moleculin Biotech)、BMS-936559(MDX-1105：Bristol-Myers Squibb、Medarex、National Institute Allergy Infect Dis.)、BMS-986192(Bristol-Myers Squibb)、RC-98(RemeGen)、CD-200AR-L(CD200AR-L：OX2 Therapeutics、University of Minnesota)、ATA-3271(Atara Biotherapeutics)、IBC-Ab002(ImmunoBrain Checkpoint)、BMX-101(Biomunex Pharmaceuticals)、AVA-04-VbP(Avacta)、ACE-1708(Acepodia Biotech)、KY-1043(Kymab、Provenance Biopharmaceuticals)、ACE-05(YBL-013：Y-Biologics)、ONC-0055(ONC0055、PRS-344S-095012：Pieris Pharmaceuticals、Servier)、TLJ-1-CK(I-MabBiopharma)、GR-1405(Chinese Academy of Medical Sciences)、PD1ACR-T(TaipeiMedical University)、N-809(N-IL15/PDL1：ImmunityBio)、CB-201(CrescendoBiologics)、MEDI-1109(MedImmune)、AVA-004(AVA-04：Avacta)、CA-327(Aurigene、Curis)、ALN-PDL(Alnylam Pharmaceuticals)、KY-1003(Kymab)、CD22(aPD-L1)CAR-T细胞(SL-22P：Hebei Senlang Biotechnology)、ATA-2271(M28z1XXPD1DNR CAR T细胞：AtaraBiotherapeutics)和Zeushield细胞毒性T淋巴细胞(Second Xiangya Hosp CentralSouth Univ.)。

在一些实施方案中，抗PD-L1多肽用mAB3修饰。在一些实施方案中，抗PD-L1多肽用mAB4修饰。

表1B提供了可以被修饰以制备抗PD-L1免疫缀合物的示例性抗PD-L1多肽和抗PD-L1抗原结合片段的序列。表1B还提供了可以用于修饰的抗PD-L1免疫缀合物中的CDR的示例性组合。本文提及抗PD-L1多肽可选地可以指抗PD-L1抗原结合片段。

表1B

/>

抗PD-L1多肽或抗PD-L1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:110、112、114、116、120、122或126中任何一个的氨基酸序列的VH。抗PD-L1多肽或抗PD-L1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:111、113、115、117、121、123或127中任何一个的氨基酸序列的VH。在一种情况下，抗PD-L1多肽或抗PD-L1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:110的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:111的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-L1多肽或抗PD-L1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:112的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:113的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-L1多肽或抗PD-L1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:114的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:115的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-L1多肽或抗PD-L1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:116的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:117的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-L1多肽或抗PD-L1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:120的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:121的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-L1多肽或抗PD-L1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:122的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:123的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗PD-L1多肽或抗PD-L1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:126的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:127的氨基酸序列的VL。

在一种情况下，抗PD-L1多肽或抗PD-L1抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:128的氨基酸序列的VH CHR1、具有SEQ ID NO:129的氨基酸序列的VH CHR2、具有SEQ ID NO:130的氨基酸序列的VH CHR3、具有SEQ ID NO:131的氨基酸序列的VL CHR1、具有SEQ ID NO:132的氨基酸序列的VL CHR2和具有SEQ ID NO:133的氨基酸序列的VL CHR3。

在一种情况下，抗PD-L1多肽包括具有SEQ ID NO:134的氨基酸序列的单结构域结合抗体、具有SEQ ID NO:135的氨基酸序列的三特异性融合单链抗体构建体或具有SEQ IDNO:136的氨基酸序列的双特异性四聚体抗体样衔接物。

抗CD20抗体

本公开内容的抗CD20抗体或抗CD20抗原结合片段包含修饰的利妥昔单抗奥法木单抗/>奥妥珠单抗(Obinutuzumab)/>或奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)/>在一种实施方案中，本公开内容的抗CD20抗体或抗CD20抗原结合片段包含利妥昔单抗/>奥法木单抗/>奥妥珠单抗/>或奥瑞珠单抗/>的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的组合。在另一种实施方案中，本公开内容的抗CD20抗体或抗CD20抗原结合片段包含利妥昔单抗奥法木单抗/>奥妥珠单抗/>或奥瑞珠单抗的互补决定区(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VL CDR1、VL CDR2和VL CDR3)的组合。

在一种实施方案中，本公开内容的抗CD20抗体或抗CD20抗原结合片段包含融合蛋白或肽免疫治疗剂。在一种实施方案中，本公开内容的抗CD20剂包含细胞，诸如，例如，CART细胞或细胞毒性T淋巴细胞。

表1C提供了可以被修饰以制备抗CD20免疫缀合物的示例性抗CD20多肽和抗CD20抗原结合片段、融合蛋白或肽免疫治疗剂、CART细胞和细胞毒性T淋巴细胞的序列。表1C还提供了可以用于修饰的抗CD20免疫缀合物中的CDR的示例性组合。本文提及抗CD20多肽可选地可以指抗CD20抗原结合片段。

表1C

/>

在一些实施方案中，抗CD20多肽用mAB3修饰。在一些实施方案中，抗CD20多肽用mAB4修饰。

抗CD20多肽或抗CD20抗原结合片段可以包含具有SEQ ID NO:137、139、141或143的氨基酸序列的VH。抗CD20多肽或抗CD20抗原结合片段可以包含具有SEQ ID NO:138、140、142或144的氨基酸序列的VL。在一种情况下，抗CD20多肽或抗CD20抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:137的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:138的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗CD20多肽或抗CD20抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:139的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:140的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗CD20多肽或抗CD20抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:141的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:142的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗CD20多肽或抗CD20抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:143的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:144的氨基酸序列的VL。

抗TNFα抗体

在一种实施方案中，本公开内容的抗TNFα抗体或抗TNFα抗原结合片段包含本文描述的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)的组合。在另一种实施方案中，本公开内容的抗TNFα抗体或抗TNFα抗原结合片段包含本文描述的互补决定区(VH CDR1、VH CDR2、VH CDR3、VLCDR1、VL CDR2和VL CDR3)的组合。在一种实施方案中，本公开内容的抗TNFα抗体或抗TNFα抗原结合片段包含修饰的阿达木单抗。在一种实施方案中，本公开内容的抗TNFα抗体或抗TNFα抗原结合片段包含修饰的英夫利昔单抗/>。

在一种实施方案中，本公开内容的抗TNFα抗体或抗TNFα抗原结合片段包含融合蛋白或肽免疫治疗剂。

在一种实施方案中，本公开内容的抗TNFα剂包含细胞，诸如，例如，CART细胞或细胞毒性T淋巴细胞。

表1D提供了可以被修饰以制备抗TNFα免疫缀合物的示例性抗TNFα多肽和抗TNFα抗原结合片段、融合蛋白或肽免疫治疗剂、CART细胞和细胞毒性T淋巴细胞的序列。表1D还提供了可以用于修饰的抗TNFα免疫缀合物中的CDR的示例性组合。本文提及抗TNFα多肽可选地可以指抗TNFα抗原结合片段。

表1D

在一些实施方案中，抗TNFα多肽用mAB3修饰。在一些实施方案中，抗TNFα多肽用mAB4修饰。

抗TNFα多肽或抗TNFα抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:145或147的氨基酸序列的VH。抗TNFα多肽或抗TNFα抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:146或148的氨基酸序列的VL。

在一种情况下，抗TNFα多肽或抗TNFα抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:145的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:146的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗TNFα多肽或抗TNFα抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:147的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:148的氨基酸序列的VL。在另一种情况下，抗TNFα多肽或抗TNFα抗原结合片段包含具有SEQ ID NO:149的氨基酸序列的VH和具有SEQ ID NO:150的氨基酸序列的VL。

对Fc区的修饰

本文公开了抗体或抗原结合片段，其中抗体或抗原结合片段包含Fc区，并且其中Fc区包含至少一个共价连接的接头(例如，化学接头)。在一些实施方案中，化学接头共价附接至赖氨酸或半胱氨酸残基。在一些实施方案中，化学接头共价附接至赖氨酸残基。在一些实施方案中，化学接头共价附接至抗体或抗原结合片段的恒定区。

Fc区可以具有任何适当的免疫球蛋白同种型。在一些实施方案中，Fc区是IgG Fc区、IgA Fc区、IgD Fc区、IgM Fc区或IgE Fc区。在一些实施方案中，Fc区是IgG Fc区、IgAFc区或IgD Fc区。在一些实施方案中，Fc区是人类Fc区。在一些实施方案中，Fc区是人源化的Fc区。在一些实施方案中，Fc区是IgG Fc区。在一些情况下，IgG Fc区是IgG1 Fc区、IgG2aFc区或IgG4 Fc区。

一个或更多个突变可以被引入在Fc区域中，以减少抗体或抗原结合片段的Fc介导的效应子功能，诸如抗体依赖性细胞毒性(ADCC)和/或补体功能。在一些情况下，修饰的Fc包括包含S229P Fc突变的人源化IgG4κ同种型。在一些情况下，修饰的Fc包含人类IgG1κ，其中重链CH2结构域用以下三重突变工程化，诸如，例如：(a)L238P、L239E和P335S；或(2)K248；K288和K317。

在一些实施方案中，Fc区具有与如SEQ ID NO:151中列出的序列至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％相同的氨基酸序列

其中Xaa可以是任何天然存在的氨基酸)。在一些实施方案中，Fc区包含使得Fc区易于在特定残基处修饰或缀合的一个或更多个突变，诸如通过在SEQ ID NO:151中不含半胱氨酸的位置处掺入半胱氨酸残基。可选地，Fc区可以被修饰以掺入组成缀合手柄的修饰的天然氨基酸或非天然氨基酸，诸如通过接头与修饰的天然氨基酸或非天然氨基酸连接的缀合手柄。在一些实施方案中，Fc区不包含任何促进接头附接至细胞因子(例如IL-2多肽、IL-7多肽或IL-18多肽等)的突变。在一些实施方案中，化学接头附接至如SEQ ID NO:151中列出的天然残基。在一些实施方案中，化学接头附接至SEQ ID NO:151的天然赖氨酸残基。

在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的位置10-90中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ SEQ ID NO:151的位置10-20、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、1-80、10-90、10-100、10-110、10-120、10-130、10-140、10-150、10-160、10-170、10-180、10-190或10-200中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的位置10-30、50-70或80-100中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的位置15-26、55-65或85-90中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的位置16、18、58、60或87中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的位置K16、K18、K58、K60或K87中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的位置16处的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的位置18处的氨基酸残基30处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的位置58处的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的位置60处的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的位置87处的氨基酸残基处附接至Fc区。

在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的位置10-90中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ SEQ ID NO:151的位置10-20、10-30、10-40、10-50、10-60、10-70、1-80、10-90、10-100、10-110、10-120、10-130、10-140、10-150、10-160、10-170、10-180、10-190或10-200中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的位置20-40、65-85或90-110中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的位置10-30、50-70或80-100中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的位置25-35、70-80或95-105中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的位置15-26、55-65或85-90中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的位置30、32、72、74、79或101中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的位置K30、K32、K72、K74、Q79或K101中的任何一个的氨基酸残基处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的氨基酸残基30处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的氨基酸残基32处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的氨基酸残基72处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的氨基酸残基74处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ ID NO:151的氨基酸残基79处附接至Fc区。在一些实施方案中，化学接头在SEQ IDNO:151的氨基酸残基101处附接至Fc区。

化学接头可以共价附接至抗体或抗原结合片段的Fc区的一个氨基酸残基。在一些实施方案中，化学接头共价附接至Fc区的非末端残基。在一些实施方案中，非末端残基位于抗体或抗原结合片段的CH1区、CH2区或CH3区。在一些实施方案中，非末端残基位于抗体或抗原结合片段的CH2区。

在一些实施方案中，化学接头共价附接在抗体或抗原结合片段的使得多肽的功能被维持(例如，而不使多肽变性)的氨基酸残基处。例如，当多肽是抗体诸如人类IgG(例如，人类IgG1)时，暴露的赖氨酸残基和暴露的酪氨酸残基存在于以下位置处(参考网站：www.imgt.org/IMGTScientificChart/Numbering/Hu_IGHGnber.html，按EU编号)。示例性暴露的赖氨酸残基：CH2结构域(位置246、位置248、位置274、位置288、位置290、位置317、位置320、位置322和位置338)CH3结构域(位置360、位置414和位置439)。示例性暴露的酪氨酸残基：CH2结构域(位置278、位置296和位置300)CH3结构域(位置436)。

人类IgG，诸如人类IgG1，也可以在以上列出的位置中的任何一个处用赖氨酸或酪氨酸残基修饰，以便提供理想地暴露于表面用于随后修饰的残基。

在一些实施方案中，化学接头共价附接在抗体或抗原结合片段的恒定区中的氨基酸残基处。在一些实施方案中，化学接头共价附接在CH1区、CH2区或CH3区中的氨基酸残基处。在一些实施方案中，化学接头共价附接在CH2区中的氨基酸残基处。在一些实施方案中，化学接头可以共价附接至选自人类IgG Fc中按照EU编号的残基的以下组的一个残基：氨基酸残基1-478、氨基酸残基2-478、氨基酸残基1-477、氨基酸残基2-477、氨基酸残基10-467、氨基酸残基30-447、氨基酸残基50-427、氨基酸残基100-377、氨基酸残基150-327、氨基酸残基200-327、氨基酸残基240-327和氨基酸残基240-320。

在一些实施方案中，化学接头共价附接至人类IgG Fc区的一个赖氨酸残基。在一些实施方案中，化学接头共价附接在抗体或抗原结合片段的Fc区的Lys 246处，其中氨基酸残基位置号是基于Eu编号。在一些实施方案中，化学接头共价附接在抗体或抗原结合片段的Fc区的Lys 248处，其中氨基酸残基位置号是基于Eu编号。在一些实施方案中，化学接头共价附接在抗体或抗原结合片段的Fc区的Lys 288处，其中氨基酸残基位置号是基于Eu编号。在一些实施方案中，化学接头共价附接在抗体或抗原结合片段的Fc区的Lys 290处，其中氨基酸残基位置号是基于Eu编号。在一些实施方案中，化学接头共价附接在抗体或抗原结合片段的Lys 317处，其中氨基酸残基位置号是基于Eu编号。

在一些实施方案中，化学接头可以共价附接至选自氨基酸残基子集的氨基酸残基。在一些实施方案中，该子集包含抗体或抗原结合片段的Fc区的两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个氨基酸残基。在一些实施方案中，化学接头可以共价附接至抗体或抗原结合片段的Fc区的两个赖氨酸残基之一。

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段将包含共价附接至抗体或抗原结合片段的Fc区的两个接头。在一些实施方案中，两个接头中的每一个将共价附接至抗体或抗原结合片段的不同重链。在一些实施方案中，两个接头中的每一个将在相同的残基位置处共价附接至抗体或抗原结合片段的不同重链。在一些实施方案中，两个接头中的每一个将在不同的残基位置处共价附接至抗体或抗原结合片段的不同重链。当两个接头共价附接至不同的残基位置时，本文提供的残基位置的任何组合都可以组合地使用。

在一些实施方案中，第一化学接头共价附接在抗体或抗原结合片段的第一Fc区的Lys 248处，并且第二化学接头共价附接在抗体或抗原结合片段的第二Fc区的Lys 288处，其中残基位置编号是基于Eu编号。在一些实施方案中，第一化学接头共价附接在抗体或抗原结合片段的第一Fc区的Lys 246处，并且第二化学接头共价附接在抗体或抗原结合片段的第二Fc区的Lys 288处，其中残基位置编号是基于Eu编号。在一些实施方案中，第一化学接头共价附接在抗体或抗原结合片段的第一Fc区的Lys 248处，并且第二化学接头共价附接在抗体或抗原结合片段的第二Fc区的Lys 317处，其中残基位置编号是基于Eu编号。在一些实施方案中，第一化学接头共价附接在抗体或抗原结合片段的第一Fc区的Lys 246处，并且第二化学接头共价附接在抗体或抗原结合片段的第二Fc区的Lys 317处，其中残基位置编号是基于Eu编号。在一些实施方案中，第一化学接头共价附接在抗体或抗原结合片段的第一Fc区的Lys288处，并且第二化学接头共价附接在抗体或抗原结合片段的第二Fc区的Lys 317处，其中残基位置编号是基于Eu编号。

修饰Fc区的方法

本文还提供了制备抗体或抗原结合片段的修饰的Fc区的方法，诸如用于将接头、缀合手柄或细胞因子附接至抗体或抗原结合片段。用于抗体或抗原结合片段的Fc区的位点特异性修饰的多种方法是本领域已知的。

用被配置为将接头位点特异性附接至抗体的亲和肽的修饰

在一些实施方案中，Fc区被修饰以掺入接头、缀合手柄或其组合。在一些实施方案中，修饰通过使Fc区与携带有效载荷的亲和肽接触来进行，所述亲和肽被配置为将接头或其他基团附接至Fc区，诸如在Fc区的特定残基处。在一些实施方案中，接头使用与Fc区残基形成键的反应性基团(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯)附接。在一些实施方案中，亲和肽包含可裂解接头。可裂解接头被配置在亲和肽上，使得在接头或其他基团附接至Fc区之后，亲和肽可以被去除，仅留下附接至Fc区的期望的接头或其他基团。然后，接头或其他基团可以进一步用于将另外的基团诸如细胞因子或附接至细胞因子的接头添加附接至Fc区。在这样的实施方案中，相容的抗体必须含有相容的Fc区(例如，IgG)。

这样的亲和肽的非限制性实例至少可以见于PCT公布第WO2018199337A1号、PCT公布第WO2019240288A1号、PCT公布第WO2019240287A1号和PCT公布第WO2020090979A1号中，它们中的每一个都通过引用并入，如同以其整体在本文中列出一样。在一些实施方案中，亲和肽是已经被修饰以递送接头/缀合手柄有效载荷到抗体Fc区的一个或更多个特定残基的肽。在一些实施方案中，亲和肽对选自以下中的肽具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同一性(1)

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和或在N-末端处被截短一个、两个、三个、四个或五个残基的对应肽。下文示出了具有能够将有效载荷附接至如本文提供的抗体的残基K248的可裂解接头和缀合手柄有效载荷的示例性亲和肽(如Matsuda等人,“Chemical Site-Specific Conjugation Platform to Improve the Pharmacokineticsand Therapeutic Index of Antibody-Drug Conjugates,”Mol.Pharmaceutics2021,18,11,4058-4066中报告的)。

靶向Fc区的可选残基的可选亲和肽在以上引用的关于AJICAP^TM技术的参考文献中描述，并且这样的亲和肽可以用于将期望的官能团附接至Fc区的可选残基(例如，K246、K288等)。例如，以上亲和肽的二硫化物基团可以被硫酯替代，以提供巯基保护基团作为连接基团的可裂解部分(例如，亲和肽的相关部分将具有以下结构：或下文讨论的另一种可裂解接头)。

本公开内容的亲和肽可以包含可裂解接头。在一些实施方案中，亲和肽的可裂解接头将亲和肽连接至将要附接至Fc区的基团，并且被配置为使得肽可以在组成接头或缀合手柄的基团被附接之后被裂解。在一些实施方案中，可裂解接头是二价基团。在一些实施方案中，可裂解接头可以包括硫酯基团、酯基团、硫烷基团；甲亚胺基团；氧乙烯基(oxyvinyl)基团；硫代丙酸酯基团；乙烷-1,2-二醇基团；(咪唑-1-基)甲-1-酮基团；硒代醚基团；甲硅烷基醚基团；二-氧基硅烷(di-oxysilane)基团；醚基团；二-氧基甲烷(di-oxymethane)基团；四氧螺[5.5]十一烷基团；乙酰胺乙基亚磷酰胺基团；双(甲硫基)-吡唑并吡唑-二酮基团；甲酸2-氧代-2-苯乙酯基团；4-氧苄基氨基甲酸酯基团；2-(4-羟基-氧苯基)吖嗪基)苯甲酸基团；4-氨基-2-(2-氨基-2-氧乙基)-4-氧代丁-2-烯酸基团；2-(2-亚甲基肼基)吡啶基团；N’-亚甲基甲酰肼基团；或异丙基氨基甲酸酯基团，其中的任何一个是未被取代的或被取代的。可裂解接头与亲和肽的组成和附接点以及相关的使用方法至少在PCT公布第WO2018199337A1号、PCT公布第WO2019240288A1号、PCT公布第WO2019240287A1号和PCT公布第WO2020090979A1号中描述。

在一些实施方案中，可裂解接头是：

其中：

-A或B中的一个是对接头的附接点，而A或B中的另一个是对亲和肽的附接点；-每个R^2a独立地是H或任选地取代的烃基；

-每个R^2b独立地是H或任选地取代的烃基；

-R^2c是H或任选地取代的烃基；

-J是亚甲基、N、S、Si或O原子；并且

-r是1、2、3、4、5、6、7、8、9或10。

亲和肽包含被配置为能够使接头/缀合手柄共价附接至Fc区的反应性基团。在一些实施方案中，反应性基团对Fc区的被掺入以促进接头的附接的特定氨基酸残基诸如赖氨酸残基、酪氨酸残基、丝氨酸残基、半胱氨酸残基或非天然氨基酸残基的官能团是选择性的。反应性基团可以是任何合适的官能团，诸如用于与赖氨酸反应的活化酯(例如，N-羟基琥珀酰亚胺酯或其衍生物、五氟苯基酯等)或用于与半胱氨酸反应的巯基反应性基团(例如，迈克尔受体(Michael acceptor)，诸如α-β不饱和羰基或马来酰亚胺)。在一些实施方案中，反应性基团是：

其中：

-R_5a、R_5b和R_5c各自独立地是H、卤素或任选地取代的烃基；

-每个j是1、2、3、4或5；并且

-每个k是1、2、3、4或5。

在一些实施方案中，亲和肽用于将反应性部分递送至期望的氨基酸残基，使得反应性部分在可裂解接头裂解时暴露。作为非限制性实例的方式，反应性基团与多肽Fc区的期望残基形成共价键，由于亲和肽和Fc区之间的相互作用，该Fc区与抗体或抗原结合片段选择性结合。在该共价键形成后，可裂解接头在适当的条件下被裂解以露出反应性部分(例如，如果可裂解接头包含硫酯，则在可裂解接头裂解后，游离巯基基团被附接至Fc区)。然后，该新的反应性部分可以用于随后通过包含拴系至巯基反应性基团(例如，α-卤代羰基基团、α-β不饱和羰基基团、马来酰亚胺基团等)的缀合手柄的试剂添加另外的部分，诸如缀合手柄。

在一些实施方案中，亲和肽用于将游离巯基基团递送至Fc区的赖氨酸。在一些实施方案中，然后游离巯基基团与双官能连接试剂反应，以将新的缀合手柄附接至Fc区。在一些实施方案中，然后新的缀合手柄用于形成对附接的细胞因子的接头。在一些实施方案中，新的缀合手柄是炔烃官能团。在一些实施方案中，新的缀合手柄是DBCO官能团。

可用于此目的的示例性双官能连接试剂具有式A-B-C，其中A是巯基反应性缀合手柄(例如，马来酰亚胺、α,β-不饱和羰基、a-卤代羰基)，B是连接基团，并且C是新的缀合手柄(例如，炔烃，诸如DBCO)。双官能连接试剂的具体非限制性实例包括

其中每个n独立地是1-6的整数，并且每个m独立地是1-30的整数，以及相关分子(例如，异构体)。

可选地，亲和肽可以被配置为使得在反应性基团和Fc区的残基之间形成共价键之后，立即将缀合手柄添加至Fc区(诸如通过接头基团)。在这样的情况下，亲和肽被裂解，并且缀合手柄立即准备好随后与IL-2多肽(或其他细胞因子)缀合。

可选的酶介导的附接方法

尽管上文提供的亲和肽介导的抗体Fc区的修饰具有许多优于可以用于位点特异性修饰Fc区的其他方法的优点(例如，易于使用，能够快速产生许多不同的抗体缀合物，能够使用许多“现货供应的(off-the-shelf)”商业抗体，而不需要进行耗时的蛋白工程化等)，进行修饰的其他方法也被认为在本公开内容的范围内。

在一些实施方案中，本公开内容一般涉及转谷氨酰胺酶介导的位点特异性抗体-药物缀合物(ADC)，其包含：1)含谷氨酰胺的标签、内源谷氨酰胺(例如，未工程化的天然谷氨酰胺，诸如可变结构域CDR中的谷氨酰胺等)，和/或通过抗体工程化或工程化的转谷氨酰胺酶反应制备的内源谷氨酰胺；和2)包含胺供体单元、接头和剂部分的胺供体剂。这样的转谷氨酰胺酶介导的位点特异性修饰的非限制性实例至少可以见于公布WO2020188061、US2022133904、US2019194641、US2021128743、US9764038、US10675359、US9717803、US10434180、US9427478中，这些公布通过引用并入，如同以其整体在本文中列出一样。

在另一方面，本公开内容提供了一种工程化含Fc的多肽缀合物，该工程化含Fc的多肽缀合物包含式：(含Fc的多肽-T-A)，其中T是在特定位点处工程化的含酰基供体谷氨酰胺的标签，其中A是胺供体剂，其中胺供体剂在含Fc的多肽中的羧基末端、氨基末端处或另一位点处与含酰基供体谷氨酰胺的标签位点特异性缀合，其中含酰基供体谷氨酰胺的标签包含氨基酸序列XXQX，其中X是任何氨基酸(例如，X可以是相同或不同的氨基酸)，并且其中所述工程化含Fc的多肽缀合物在位置295处包含从谷氨酰胺至天冬酰胺的氨基酸取代(Q295N；EU编号方案)。

在一些实施方案中，含酰基供体谷氨酰胺的标签在空间上不与多肽或含Fc的多肽中反应性Lys相邻(例如，在存在酰基供体和转谷氨酰胺酶的情况下形成作为胺供体的共价键的能力)。在一些实施方案中，多肽或含Fc的多肽相对于野生型多肽羧基末端的最后一个氨基酸位置处在相同位置处包含氨基酸修饰。氨基酸修饰可以是氨基酸缺失、插入、取代、突变或其任何组合。

在一些实施方案中，多肽缀合物包含全长抗体重链和抗体轻链，其中含酰基供体谷氨酰胺的标签位于重链、轻链或重链和轻链二者的羧基末端处。

在一些实施方案中，多肽缀合物包含抗体，其中抗体是单克隆抗体、多克隆抗体、人类抗体、人源化抗体、嵌合抗体、双特异性抗体、微抗体、双抗体或抗体片段。在一些实施方案中，抗体是IgG。

在另一方面，本文描述了一种用于制备工程化含Fc的多肽缀合物的方法，该工程化含Fc的多肽缀合物包含式：(含Fc的多肽-T-A)，其中T是在特定位点处工程化的含酰基供体谷氨酰胺的标签，其中A是胺供体剂，其中胺供体剂在含Fc的多肽中的羧基末端、氨基末端处或另一位点处与含酰基供体谷氨酰胺的标签位点特异性缀合，其中含酰基供体谷氨酰胺的标签包含氨基酸序列XXQX，其中X是任何氨基酸(例如，X可以是相同或不同的氨基酸)，并且其中工程化含Fc的多肽缀合物在位置295处包含从谷氨酰胺至天冬酰胺的氨基酸取代(Q295N；EU编号方案)，该方法包括以下步骤：a)提供包含含Fc的多肽和含酰基供体谷氨酰胺的标签的工程化(含Fc的多肽)-T分子；b)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使胺供体剂与工程化(含Fc的多肽)-T分子接触；并且c)允许工程化(含Fc的多肽)-T共价连接至胺供体剂，形成工程化含Fc的多肽缀合物。

在另一方面，本文描述了一种用于制备工程化多肽缀合物的方法，该工程化多肽缀合物包含式：多肽-T-A，其中T是在特定位点处工程化的含酰基供体谷氨酰胺的标签，其中A是胺供体剂，其中胺供体剂在多肽中的羧基末端、氨基末端处或另一位点处与含酰基供体谷氨酰胺的标签位点特异性缀合，并且其中含酰基供体谷氨酰胺的标签包含氨基酸序列LLQGPX(SEQ ID NO:152)，其中X是A或P，或GGLLQGPP(SEQ ID NO:153)，该方法包括以下步骤：a)提供包含多肽和含酰基供体谷氨酰胺的标签的工程化多肽-T分子；b)在存在转谷氨酰胺酶的情况下，使胺供体剂与工程化多肽-T分子接触；并且c)允许工程化多肽-T共价附接至胺供体剂以形成工程化含Fc的多肽缀合物。

在一些实施方案中，如本文描述的工程化多肽缀合物(例如，工程化含Fc的多肽缀合物、工程化含Fab的多肽缀合物或工程化抗体缀合物)具有至少约51％的缀合效率。在另一方面，本发明提供了一种药物组合物，该药物组合物包含如本文描述的工程化多肽缀合物(例如，工程化含Fc的多肽缀合物、工程化含Fab的多肽缀合物或工程化抗体缀合物)和药学上可接受的赋形剂。

在一些实施方案中，本文描述了一种用于将感兴趣的部分(Z)与抗体缀合的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供具有(例如，在恒定区的一级序列内)在存在偶联酶例如转氨酶的情况下与连接试剂(接头)反应的至少一个受体氨基酸残基(例如，天然存在的氨基酸)的抗体；并且(b)使所述抗体与包含反应性基团(R)，任选地受保护的反应性基团或任选地未受保护的反应性基团的连接试剂(例如，包含伯胺的接头)在存在能够引起在受体氨基酸残基和连接试剂(除了在R部分以外)之间形成共价键的酶的情况下在足以获得包含经由连接试剂(共价)连接至反应性基团(R)的受体氨基酸残基的抗体的条件下反应。任选地，抗体或抗体片段的所述受体残基在+2位置处侧接非天冬氨酸残基。任选地，在+2位置处的残基是非天冬氨酸残基。在一种实施方案中，在+2位置处的残基是非天冬氨酸、非谷氨酰胺残基。在一种实施方案中，在+2位置处的残基是非天冬氨酸、非天冬酰胺残基。在一种实施方案中，在+2位置处的残基是非带负电荷的氨基酸(除了天冬氨酸或谷氨酸以外的氨基酸)。任选地，受体谷氨酰胺位于抗体重链的Fc结构域中，任选地进一步在CH2结构域中。任选地，抗体不含重链N297连接的糖基化。任选地，受体谷氨酰胺在抗体重链的位置295处，而在+2位置处的残基是在抗体重链的位置297处的残基(EU索引编号)。

在一方面，本文描述了一种用于将感兴趣的部分(Z)与抗体缀合的方法，该方法包括以下步骤：(a)提供具有至少一个受体谷氨酰胺残基的抗体；并且(b)使所述抗体与包含反应性基团(R)，优选地受保护的反应性基团的包含伯胺的接头(基于赖氨酸的接头)在存在转谷氨酰胺酶(TGase)的情况下在足以获得包含经由所述接头(共价)连接至反应性基团(R)的受体谷氨酰胺的抗体的条件下反应。任选地，抗体或抗体片段的所述受体谷氨酰胺残基在+2位置处侧接非天冬氨酸残基。任选地，在+2位置处的残基是非天冬氨酸残基。在一种实施方案中，在+2位置处的残基是非天冬氨酸、非谷氨酰胺残基。在一种实施方案中，在+2位置处的残基是非天冬氨酸、非天冬酰胺残基。在一种实施方案中，在+2位置处的残基是非带负电荷的氨基酸(除了天冬氨酸或谷氨酸以外的氨基酸)。任选地，受体谷氨酰胺位于抗体重链的Fc结构域中，任选地进一步在CH2结构域中。任选地，抗体不含重链N297连接的糖基化。任选地，受体谷氨酰胺在抗体重链的位置295处，而在+2位置处的残基是在抗体重链的位置297处的残基(EU索引编号)。

包含经由包含伯胺的接头(基于赖氨酸的接头)连接至反应性基团(R)的受体残基或受体谷氨酰胺残基的抗体此后可以与包含感兴趣部分(Z)的反应伴侣反应，以产生包含经由接头连接至感兴趣部分(Z)的受体残基或受体谷氨酰胺残基的抗体。因此，在一种实施方案中，该方法还包括步骤(c)：使(i)步骤b)的包含经由包含伯胺的接头(基于赖氨酸的接头)(任选地固定在固体支持物上)连接至反应性基团(R)的受体谷氨酰胺的抗体与(ii)包含感兴趣部分(Z)和能够与反应性基团R反应的反应性基团(R’)的化合物在足以获得包含经由包含伯胺的接头(基于赖氨酸的接头)连接至感兴趣部分(Z)的受体谷氨酰胺的抗体的条件下反应。优选地，包含感兴趣部分(Z)和能够与反应性基团R反应的反应性基团(R’)的所述化合物以抗体的少于80倍、40倍、20倍、10倍、5倍或4摩尔当量提供。在一种实施方案中，抗体包含两个受体谷氨酰胺，并且包含感兴趣部分(Z)和反应性基团(R’)的化合物以抗体的10摩尔当量或更少摩尔当量提供。在一种实施方案中，抗体包含两个受体谷氨酰胺，并且包含感兴趣部分(Z)和反应性基团(R’)的化合物以抗体的5摩尔当量或更少摩尔当量提供。在一种实施方案中，抗体包含四个受体谷氨酰胺，并且包含感兴趣部分(Z)和反应性基团(R’)的化合物以抗体的20摩尔当量或更少摩尔当量提供。在一种实施方案中，抗体包含四个受体谷氨酰胺，并且包含感兴趣部分(Z)和反应性基团(R’)的化合物以抗体的10摩尔当量或更少摩尔当量提供。在一种实施方案中，步骤(b)和/或(c)在水性条件下进行。任选地，步骤(c)包括：将包含官能化受体谷氨酰胺残基的抗体的样品固定在固体支持物上，以提供包含固定的抗体的样品，使包含固定的抗体的样品与化合物反应，任选地回收任何未反应的化合物，并且将这样的回收的化合物重新引入固体支持物，用于与固定的抗体反应，并且洗脱抗体缀合物，以提供包含Z部分的组合物。

缀合手柄化学

在一些实施方案中，抗体或抗原结合片段的适当修饰的Fc区将包含缀合手柄，该缀合手柄用于将抗体或抗原结合片段与细胞因子或其衍生物缀合。

能够与附接至合成细胞因子或其衍生物的互补反应性基团反应的任何合适的反应性基团都可以用作缀合手柄。在一些实施方案中，缀合手柄包括用于以下的试剂：Cu(I)催化或“无铜”的炔烃-叠氮三唑形成反应(例如，应力促进的环加成(strain promotedcycloaddition))、Staudinger连接、逆电子需求Diels-Alder(IEDDA)反应、“光点击”化学、用反式环辛烯的四嗪环加成或金属介导的过程诸如烯烃复分解和Suzuki-Miyaura或Sonogashira交叉偶联。

在一些实施方案中，缀合手柄包括用于“无铜”炔烃叠氮三唑形成反应的试剂。用于所述炔烃叠氮三唑形成反应的炔烃的非限制性实例包括环辛炔试剂(例如，含(1R,8S,9s)-双环[6.1.0]壬-4-炔-9-基甲醇的试剂、二苯并环辛炔-胺试剂、二氟环辛炔或其衍生物)。在一些实施方案中，炔烃官能团附接至Fc区。在一些实施方案中，叠氮化物官能团附接至Fc区。

在一些实施方案中，缀合手柄包括选自以下的反应性基团：叠氮化物、炔烃、四嗪、卤化物、巯基、二硫化物、马来酰亚胺、活化酯、烯烃、醛、酮、亚胺、肼和酰肼。在一些实施方案中，合成细胞因子或其衍生物包含与Fc区的缀合手柄互补的反应性基团。在一些实施方案中，缀合手柄和互补缀合手柄包括“点击”化学试剂。点击化学残基的示例性基团在Hein等人,“Click Chemistry,A Powerful Tool for Pharmaceutical Sciences,”Pharmaceutical Research,第25卷,第2216-2230页(2008)；Thirumurugan等人,“ClickChemistry for Drug Development and Diverse Chemical-Biology Applications,”Chem.Rev.2013,113,7,4905-4979；US20160107999A1；US10266502B2；和US20190204330A1中示出，其中每一个通过引用以其整体并入。

接头结构

在一些实施方案中，用于附接抗体或抗原结合片段及合成细胞因子或其衍生物的接头在两个部分处包含附接点。附接点可以是如本文提供的用于促进附接的残基中的任何一个。接头结构可以是用于在两个部分之间产生空间附接的任何合适的结构。在一些实施方案中，接头提供两个部分的共价附接。在一些实施方案中，接头是化学接头(例如，不是作为以融合蛋白的表达的多肽)。

在一些实施方案中，接头包括聚合物。在一些实施方案中，接头包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，接头包括聚(环氧烷)(poly(alkylene oxide)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，接头包括聚(环氧烷)。在一些实施方案中，聚(环氧烷)是聚乙二醇或聚丙二醇或其组合。在一些实施方案中，聚(环氧烷)是聚乙二醇。

在一些实施方案中，接头是双官能接头。在一些实施方案中，双官能接头包括酰胺基团、酯基团、醚基团、硫醚基团或羰基基团。在一些实施方案中，接头包括非聚合物接头。在一些实施方案中，接头包括非聚合物双官能接头。在一些实施方案中，非聚合物双官能接头包括琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯；马来酰亚胺己酰基；缬氨酸-瓜氨酸；烯丙基(4-甲氧基苯基)二甲基甲硅烷；6-(烯丙基氧基羰基氨基)-1-己醇；4-氨基丁醛二乙基缩醛；或(E)-N-(2-氨基乙基)-4-{2-[4-(3-叠氮丙氧基)苯基]二氮烯基}苯甲酰胺盐酸盐。

在一些实施方案中，接头的一部分由已经与附接至抗体或其他蛋白(例如，重组蛋白或合成蛋白)的适当基团反应的双官能连接试剂构成。在一些实施方案中，双官能连接试剂具有式A-B-C，其中A是第一缀合手柄，B是连接基团，并且C是第二缀合手柄。在一些实施方案中，第一缀合手柄首先与附接至最终缀合前体(例如，期望转化为缀合物的抗体)的第一部分的合适基团反应。在一些实施方案中，然后第二缀合手柄与附接至最终缀合物(例如，蛋白，诸如合成细胞因子)的第二部分的第二合适基团反应。在一些实施方案中，本公开内容的双官能连接试剂包含巯基特异性缀合手柄(例如，马来酰亚胺、α-卤代羰基等)并且第二缀合手柄是炔烃(例如，DBCO试剂)。

接头可以是支链的或线性的。在一些实施方案中，接头是线性的。在一些实施方案中，接头是支链的。在一些实施方案中，接头包括至少10、20、50、100、500、1000、2000、3000或5000个原子的链的线性部分(例如，在第一附接点和第二附接点之间)。在一些实施方案中，接头包括至少10、20、30、40或50个原子的链的线性部分。在一些实施方案中，接头包括至少10个原子的线性部分。在一些实施方案中，接头包括至多20、30、40、50、60、70、80、90或100个原子的线性部分。在一些实施方案中，接头是支链的，并且包括至少10、20、50、100、500、1000、2000、3000或5000个原子的链的线性部分。在一些实施方案中，接头是支链的，并且包括至多约40、50、60、70、80、90或100个原子的链。

在一些实施方案中，接头具有约200道尔顿至约2000道尔顿的分子量。在一些实施方案中，接头具有以下的分子量：至少约1,000道尔顿、至少约5,000道尔顿、至少约10,000道尔顿、至少约15,000道尔顿、至少约20,000道尔顿、至少约25,000道尔顿或至少约30,000道尔顿。在一些实施方案中，接头具有以下的分子量：至多约100,000道尔顿、至多约50,000道尔顿、至多约40,000道尔顿、至多约30,000道尔顿、至多约25,000道尔顿、至多约20,000道尔顿、至多约15,000道尔顿、至多约10,000道尔顿或至多约5,000道尔顿。

在一些实施方案中，接头包括一对或更多对缀合手柄及其互补的缀合手柄的反应产物。在一些实施方案中，反应产物包括三唑、腙、哒嗪、硫化物、二硫化物、酰胺、酯、醚、肟、烯烃或其任何组合。在一些实施方案中，反应产物包括三唑。反应产物可以通过接头的任何部分与第一附接点和第二附接点分开。在一些实施方案中，反应产物实质上位于接头的中心。在一些实施方案中，反应产物实质上比另一个附接点更靠近一个附接点。

在一些实施方案中，接头包括式(X)的结构

其中L¹、L²、L³、L⁴、L⁵、L⁶、L⁸和L⁹各自独立地是-O-、-NR^L-、-N(R^L)₂ ⁺-、-OP(＝O)(OR^L)O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)₂-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NR^L-、-NR^LC(＝O)-、-OC(＝O)NR^L-、-NR^LC(＝O)O-、-NR^LC(＝O)NR^L-、-NR^LC(＝S)NR^L-、-CR^L＝N-、-N＝CR^L、-NR^LS(＝O)₂-、-S(＝O)₂NR^L-、-C(＝O)NR^LS(＝O)₂-、-S(＝O)₂NR^LC(＝O)-、取代或未取代的C₁-C₆亚烷基(C₁-C₆ alkylene)、取代或未取代的C₁-C₆亚杂烃基、取代或未取代的C₂-C₆亚烯基、取代或未取代的C₂-C₆亚炔基、取代或未取代的C₆-C₂₀亚芳基、取代或未取代的C₂-C₂₀亚杂芳基、-(CH₂-CH₂-O)_qa-、-(O-CH₂-CH₂)_qb-、-(CH₂-CH(CH₃)-O)_qc-、-(O-CH(CH₃)-CH₂)_qd-、缀合手柄和互补缀合手柄的反应产物，或不存在；

每个R^L独立地是氢、取代或未取代的C₁-C₄烷基、取代或未取代的C₁-C₄杂烃基、取代或未取代的C₂-C₆烯基、取代或未取代的C₂-C₅炔基、取代或未取代的C₃-C₈环烃基、取代或未取代的C₂-C₇杂环烃基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；并且

qa、qb、qc和qd各自独立地是1-100的整数，

其中每个是针对与抗体或抗原结合片段或与合成细胞因子或其衍生物选择性结合的多肽的附接点。

在一些实施方案中，接头包括式(X’)的结构：

其中每个L’独立地是-O-、-NR^L-、-(C1-C₆亚烃基)NR^L-(-(C1-C₆ alkylene)NR^L-)、-NR^L(C₁-C₆亚烃基)-、-N(R^L)₂ ⁺-、-(C₁-C₆亚烃基)N(R^L)₂ ⁺-、-N(R^L)₂ ⁺-(C₁-C₆亚烃基)-、-OP(＝O)(OR^L)O-、-S-、-(C₁-C₆亚烃基)S-、-S(C₁-C₆亚烃基)-、-S(＝O)-、-S(＝O)₂-、-C(＝O)-、-(C₁-C₆亚烃基)C(＝O)-、-C(＝O)(C₁-C₆亚烃基)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NR^L-、-C(＝O)NR^L(C₁-C₆亚烃基)-、-(C₁-C₆亚烃基)C(＝O)NR^L-、-NR^LC(＝O)-、-(C₁-C₆亚烃基)NR^LC(＝O)-、-NR^LC(＝O)(C₁-C₆亚烃基)-、-OC(＝O)NR^L-、-NR^LC(＝O)O-、-NR^LC(＝O)NR^L-、-NR^LC(＝S)NR^L-、-CR^L＝N-、-N＝CR^L、-NR^LS(＝O)₂-、-S(＝O)₂NR^L-、-C(＝O)NR^LS(＝O)₂-、-S(＝O)₂NR^LC(＝O)-、取代或未取代的C₁-C₆亚烷基、取代或未取代的C₁-C₆亚杂烃基、取代或未取代的C₂-C₆亚烯基、取代或未取代的C₂-C₆亚炔基、取代或未取代的C₆-C₂₀亚芳基、取代或未取代的C₂-C₂₀亚杂芳基、-(CH₂-CH₂-O)_qa-、-(O-CH₂-CH₂)_qb-、-(CH₂-CH(CH₃)-O)_qc-、-(O-CH(CH₃)-CH₂)_qd-、缀合手柄和互补缀合手柄的反应产物，或不存在；(C₁-C₆亚烃基)；

每个R^L独立地是氢、取代或未取代的C₁-C₄烷基、取代或未取代的C₁-C₄杂烃基、取代或未取代的C₂-C₆烯基、取代或未取代的C₂-C₅炔基、取代或未取代的C₃-C₈环烃基、取代或未取代的C₂-C₇杂环烃基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；

qa、qb、qc和qd各自独立地是1-100的整数；并且

g是1-100的整数；

其中每个是针对修饰的IL-2多肽或抗体或抗原结合片段的附接点。

在一些实施方案中，式(X)或式(X^a)或式(X’)的接头包括以下结构：

其中

是针对所述与CD20选择性结合的多肽的赖氨酸残基的第一附接点；

L是连接基团；并且

是针对连接至蛋白(例如，重组蛋白、合成蛋白、细胞因子、合成细胞因子或本文提供的其他蛋白)的第一附接点的连接基团的附接点，

或其位置异构体。

在一些实施方案中，L具有结构其中，每个n独立地是1-6的整数，并且每个m是1-30的整数。在一些实施方案中，每个m独立地是2或3。在一些实施方案中，每个m是1-24、1-18、1-12或1-6的整数。

其中

是针对抗体的赖氨酸残基的第一附接点；

L”是连接基团；并且

是针对连接至蛋白(例如，附接至抗体的蛋白)的第一附接点的连接基团的附接点，

或其位置异构体。

在一些实施方案中，L”具有结构其中，每个n独立地是1-6的整数，并且每个m独立地是1-30的整数。在一些实施方案中，每个m独立地是2或3。在一些实施方案中，每个m是1-24、1-18、1-12或1-6的整数。

在一些实施方案中，L或L”包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30或更多个亚单位，该亚单位各自独立地选自/> 其中，每个n独立地是1-30的整数。在一些实施方案中，每个n独立地是1-6的整数。在一些实施方案中，L或L”包括1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个亚单位。

在一些实施方案中，L或L”是式(X”)的结构

其中L^1a、L^2a、L^3a、L^4a、L^5a各自独立地是-O-、-NR^La-、-(C₁-C₆亚烃基)NR^La-、-NR^La(C₁-C₆亚烃基)-、-N(R^L)₂ ⁺-、-(C₁-C₆亚烃基)N(R^La)₂ ⁺(C₁-C₆亚烃基)-、-N(R^La)₂ ⁺-、-OP(＝O)(OR^La)O-、-S-、-(C₁-C₆亚烃基)S-、-S(C₁-C₆亚烃基)-、-S(＝O)-、-S(＝O)₂-、-C(＝O)-、-(C₁-C₆亚烃基)C(＝O)-、-C(＝O)(C₁-C₆亚烃基)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NR^La-、-C(＝O)NR^La(C₁-C₆亚烃基)-、-(C₁-C₆亚烃基)C(＝O)NR^La-、-NR^LaC(＝O)-、-(C₁-C₆亚烃基)NR^LaC(＝O)-、-NR^LaC(＝O)(C₁-C₆亚烃基)-、-OC(＝O)NR^La-、-NR^LaC(＝O)O-、-NR^LaC(＝O)NR^La-、-NR^LaC(＝S)NR^La-、-CR^La＝N-、-N＝CR^La、-NR^LaS(＝O)₂-、-S(＝O)₂NR^La-、-C(＝O)NR^LaS(＝O)₂-、-S(＝O)₂NR^LaC(＝O)-、取代或未取代的C₁-C₆亚烷基、取代或未取代的C₁-C₆亚杂烃基、取代或未取代的C₂-C₆亚烯基、取代或未取代的C₂-C₆亚炔基、取代或未取代的C₆-C₂₀亚芳基、取代或未取代的C₂-C₂₀亚杂芳基、-(CH₂-CH₂-O)_qe-、-(O-CH₂-CH₂)_qf-、-(CH₂-CH(CH₃)-O)_qg-、-(O-CH(CH₃)-CH₂)_qh-、缀合手柄和互补缀合手柄的反应产物，或不存在；

每个R^La独立地是氢、取代或未取代的C₁-C₄烷基、取代或未取代的C₁-C₄杂烃基、取代或未取代的C₂-C₆烯基、取代或未取代的C₂-C₅炔基、取代或未取代的C₃-C₈环烃基、取代或未取代的C₂-C₇杂环烃基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；并且

qe、qf、qg和qh各自独立地是1-100的整数。

在一些实施方案中，L或L”包括2至10、2至15、2至20、2至25或2至30个原子的线性链。在一些实施方案中，线性链包括一个或更多个烃基基团(例如，低级烃基(C₁-C₄))、一个或更多个芳族基团(例如，苯基)、一个或更多个酰胺基团、一个或更多个醚基团、一个或更多个酯基团或其任何组合。

在一些实施方案中，与第一附接点(例如，针对细胞因子的附接点)连接的连接基团包括聚(乙二醇)。在一些实施方案中，连接基团包括约2至约30个聚(乙二醇)单元。在一些实施方案中，与第一附接点(例如，针对细胞因子的附接点)连接的连接基团是附接至本文提供的包含叠氮化物(例如，三唑是叠氮化物的反应产物)的细胞因子的官能团。

在一些实施方案中，L是-O-、-NR^L-、-N(R^L)₂ ⁺-、-OP(＝O)(OR^L)O-、-S-、-S(＝O)-、-S(＝O)₂-、-C(＝O)-、-C(＝O)O-、-OC(＝O)-、-OC(＝O)O-、-C(＝O)NR^L-、-NR^LC(＝O)-、-OC(＝O)NR^L-、-NR^LC(＝O)O-、-NR^LC(＝O)NR^L-、-NR^LC(＝S)NR^L-、-CR^L＝N-、-N＝CR^L、-NR^LS(＝O)₂-、-S(＝O)₂NR^L-、-C(＝O)NR^LS(＝O)₂-、-S(＝O)₂NR^LC(＝O)-、取代或未取代的C₁-C₆亚烷基、取代或未取代的C₁-C₆亚杂烃基、取代或未取代的C₂-C₆亚烯基、取代或未取代的C₂-C₆亚炔基、取代或未取代的C₆-C₂₀亚芳基、取代或未取代的C₂-C₂₀亚杂芳基、-(CH₂-CH₂-O)_qa-、-(O-CH₂-CH₂)_qb-、-(CH₂-CH(CH₃)-O)_qc-、-(O-CH(CH₃)-CH₂)_qd-，其中R^L是氢、取代或未取代的C₁-C₄烷基、取代或未取代的C₁-C₄杂烃基、取代或未取代的C₂-C₆烯基、取代或未取代的C₂-C₅炔基、取代或未取代的C₃-C₈环烃基、取代或未取代的C₂-C₇杂环烃基、取代或未取代的芳基或取代或未取代的杂芳基；并且qa、qb、qc和qd各自独立地是1-100的整数。

在一些实施方案中，缀合手柄和互补缀合手柄的每个反应产物包括三唑、腙、哒嗪、硫化物、二硫化物、酰胺、酯、醚、肟或烯烃。在一些实施方案中，缀合手柄和互补缀合手柄的每个反应产物包括三唑。在一些实施方案中，缀合手柄和互补缀合手柄的每个反应产物包括以下结构：

或其位置异构体或衍生物。

在一些实施方案中，接头是可裂解接头。在一些实施方案中，可裂解接头在肿瘤微环境处、肿瘤微环境附近或肿瘤微环境中被裂解。在一些实施方案中，肿瘤在肿瘤微环境处、肿瘤微环境附近或肿瘤微环境中被机械或物理裂解。在一些实施方案中，肿瘤在肿瘤微环境处、肿瘤微环境附近或肿瘤微环境中被化学裂解。在一些实施方案中，可裂解接头是还原敏感接头。在一些实施方案中，可裂解接头是氧化敏感接头。在一些实施方案中，可裂解接头由于肿瘤微环境处、肿瘤微环境附近或肿瘤微环境中的pH而被裂解。在一些实施方案中，接头在肿瘤微环境处、肿瘤微环境附近或肿瘤微环境中被肿瘤代谢物裂解。在一些实施方案中，可裂解接头在肿瘤微环境处、肿瘤微环境附近或肿瘤微环境中被蛋白酶裂解。

附接至抗体的蛋白

本文提供的缀合物组合物包含通过接头附接至另一种蛋白(例如，重组蛋白、合成蛋白、细胞因子、合成细胞因子等)的抗体。在一些实施方案中，蛋白可以是任何蛋白。在一些实施方案中，蛋白包含与蛋白关联的确定的二级或三级结构(例如，蛋白以特定方式折叠)。在一些实施方案中，完全折叠的蛋白能够与抗体缀合，以便当附接至抗体时保留蛋白的功能。在一些实施方案中，缀合物在附接至抗体之后保留蛋白的功能。在一些实施方案中，存在最适于附接至抗体以保留缀合物的活性、稳定性的蛋白尺寸范围以及其他因素。在一些实施方案中，接头位置的选择以期望的方式影响蛋白的活性(例如，使蛋白偏向不同的活性，或减少附接的蛋白的活性)。

在一些实施方案中，蛋白是合成蛋白(例如，从一种或更多种合成制备的片段肽制备)。在一些实施方案中，合成蛋白包含约50至约300个氨基酸残基、约50至约250个氨基酸残基、约50至约200个氨基酸残基、约75至约300个氨基酸残基、约75至约250个氨基酸残基、约75至约200个氨基酸残基、约100至约300个氨基酸残基、约100至约250个氨基酸残基或约100至约200个氨基酸残基。在一些实施方案中，合成蛋白包含约100至约300个氨基酸残基。在一些实施方案中，合成蛋白包含约100至约250个氨基酸残基。在一些实施方案中，合成蛋白包含约100至约200个氨基酸残基。在一些实施方案中，合成蛋白是合成细胞因子。

如本文提供的合成细胞因子可以是任何细胞因子。可以潜在合成的细胞因子的非限制性实例包括白细胞介素(例如，IL-2、IL-18、IL-7、IL-17)、TNF家族细胞因子(例如，TNFa、CD70、TNFSF14)、干扰素(例如，IFNγ、IFNα、IFNβ)、TGF-β家族细胞因子(例如，TGFB1、TGFB2、TGFB3)、趋化因子(例如，CCL2、CCL3、CXCL9、CXCL10)以及其他。在一些实施方案中，可以合成的细胞因子是白细胞介素。在一些实施方案中，白细胞介素是IL-1家族细胞因子(例如，IL-18、IL-1β、IL-33)、IL-2家族细胞因子(例如，IL-2、IL-4、IL-7、IL-15、IL-21)、IL-6家族白细胞介素(例如，IL-6、IL-11、IL-31)、IL-10家族细胞因子(例如，IL-10、IL-19、IL-20、IL-22)、IL-12家族细胞因子(例如，IL-12、IL-23、IL-27、IL-35)和IL-17家族细胞因子(例如，IL-17、IL-17F、IL-25)。

在一些实施方案中，蛋白是重组蛋白。在一些实施方案中，重组蛋白包含约50至约300个氨基酸残基、约50至约250个氨基酸残基、约50至约200个氨基酸残基、约75至约300个氨基酸残基、约75至约250个氨基酸残基、约75至约200个氨基酸残基、约100至约300个氨基酸残基、约100至约250个氨基酸残基或约100至约200个氨基酸残基。在一些实施方案中，重组蛋白包含约100至约300个氨基酸残基。在一些实施方案中，重组蛋白包含约100至约250个氨基酸残基。在一些实施方案中，重组蛋白包含约100至约200个氨基酸残基。在一些实施方案中，重组蛋白是细胞因子。

如本文提供的重组细胞因子可以是任何细胞因子。可以重组制备的细胞因子的非限制性实例包括白细胞介素(例如，IL-2、IL-18、IL-7、IL-17)、TNF家族细胞因子(例如，TNFa、CD70、TNFSF14)、干扰素(例如，IFNγ、IFNα、IFNβ)、TGF-β家族细胞因子(例如，TGFB1、TGFB2、TGFB3)、趋化因子(例如，CCL2、CCL3、CXCL9、CXCL10)以及其他。在一些实施方案中，重组细胞因子是白细胞介素。在一些实施方案中，重组细胞因子选自IL-1家族细胞因子(例如，IL-18、IL-1β、IL-33)、IL-2家族细胞因子(例如，IL-2、IL-4、IL-7、IL-15、IL-21)、IL-6家族白细胞介素(例如，IL-6、IL-11、IL-31)、IL-10家族细胞因子(例如，IL-10、IL-19、IL-20、IL-22)、IL-12家族细胞因子(例如，IL-12、IL-23、IL-27、IL-35)和IL-17家族细胞因子(例如，IL-17、IL-17F、IL-25)。

细胞因子及其衍生物

细胞因子是体内产生的在细胞信号传导中重要的蛋白。细胞因子可以调节免疫系统，并且细胞因子疗法利用分子的免疫调节特性来增强受试者的免疫系统。本文公开了与抗体或抗原结合片段(例如，以上描述的抗体或抗原结合片段)缀合的可以表现出增强的生物活性的细胞因子(例如，修饰的细胞因子和/或合成细胞因子)。

对本文描述的多肽的修饰包括突变、各种官能团的添加、氨基酸的缺失、氨基酸的添加、或者蛋白或蛋白片段的野生型形式的任何其他改变。可以添加至多肽的官能团包括聚合物、接头、烃基基团、可检测的分子诸如生色团或荧光团、反应性官能团或其任何组合。在一些实施方案中，官能团被添加至多肽的个体氨基酸。在一些实施方案中，官能团被位点特异性地添加至多肽。

在一方面，本文提供了包含天然氨基酸取代的修饰的细胞因子。在一些实施方案中，修饰的细胞因子包含至多七个天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的细胞因子包含至多六个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的细胞因子包含至多五个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的细胞因子包含至多四个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的细胞因子包含至多三个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的细胞因子包含三至七个、三至六个、三至五个、三至四个、四至七个、四至六个、四至五个、五至七个、五至六个或六至七个天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的细胞因子包含至少一个、至少两个、至少三个、至少四个、至少五个或至少六个氨基酸取代。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的细胞因子包含至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个或至少9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的细胞因子包含3个至9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的细胞因子包含3个或4个氨基酸取代、3个至5个氨基酸取代、3个至6个氨基酸取代、3个至7个氨基酸取代、3个至9个氨基酸取代、4个或5个氨基酸取代、4个至6个氨基酸取代、4个至7个氨基酸取代、4个至9个氨基酸取代、5个或6个氨基酸取代、5个至7个氨基酸取代、5个至9个氨基酸取代、6个或7个氨基酸取代、6个至9个氨基酸取代或7个至9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的细胞因子包含3个氨基酸取代、4个氨基酸取代、5个氨基酸取代、6个氨基酸取代、7个氨基酸取代或9个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的细胞因子包含至多4个氨基酸取代、5个氨基酸取代、6个氨基酸取代、7个氨基酸取代或9个氨基酸取代。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的细胞因子(例如，修饰的IL-2多肽、修饰的IL-7多肽、修饰的IL-18多肽等)包含在一个或更多个氨基酸残基处的一个或更多个修饰。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的残基位置编号基于野生型人类IL-2多肽作为参考序列。在一些情况下，与表8B中提供的参考IL-7氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:165-169、186或187中的任何一个(优选地186))相比，修饰的IL-7多肽被修饰。在一些情况下，与表8C中提供的参考IL-18氨基酸序列(例如，SEQ ID NO:170-175中的任何一个)相比，修饰的IL-18多肽被修饰。

本文描述的附接至抗体的蛋白的修饰包括突变、各种官能团的添加、氨基酸的缺失、氨基酸的添加、或者蛋白或蛋白片段的野生型形式的任何其他改变。可以向多肽添加的官能团包括聚合物、接头、烃基基团、可检测的分子诸如生色团或荧光团、反应性官能团或其任何组合。在一些实施方案中，向多肽的个体氨基酸添加官能团。在一些实施方案中，向多肽位点特异性添加官能团。在一些实施方案中，官能团包括用于将细胞因子附接至抗体或抗原结合片段的接头的至少一部分。

如本文描述的修饰的蛋白(例如，修饰的细胞因子)可以包含一个或更多个非典型氨基酸。非典型氨基酸包括但不限于N-α-(9-芴甲基氧羰基)-L-联苯丙氨酸(Fmoc-L-Bip-OH)和N-α-(9-芴甲基氧羰基)-O-苄基-L-酪氨酸(Fmoc-L-Tyr(Bzl)-OH)。示例性非典型氨基酸包括对乙酰基-L-苯丙氨酸、对碘-L-苯丙氨酸、对甲氧基苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、对炔丙基氧基苯丙氨酸、对炔丙基苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对硼苯丙氨酸、O-炔丙基酪氨酸、L-磷酸丝氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、对溴苯丙氨酸、硒半胱氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、叠氮基-赖氨酸(AzK)、酪氨酸氨基酸的类似物；谷氨酰胺氨基酸的类似物；苯丙氨酸氨基酸的类似物；丝氨酸氨基酸的类似物；苏氨酸氨基酸的类似物；烷基(alkyl)、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸(borate)、硼酸酯(boronate)、磷酸、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮基或氨基取代的氨基酸、β-氨基酸；除了脯氨酸或组氨酸之外的环状氨基酸；除了苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸之外的芳族氨基酸；或其组合。在一些实施方案中，非典型氨基酸选自β-氨基酸、高氨基酸、环状氨基酸和具有衍生化侧链的氨基酸。在一些实施方案中，非典型氨基酸包括β-丙氨酸、β-氨基丙酸、哌啶酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基庚二酸、锁链素、二氨基庚二酸、N^α-乙基甘氨酸、N^α-乙基天冬氨酸、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、ω-甲基精氨酸、N^α-甲基甘氨酸、Nα-甲基异亮氨酸、N^α-甲基缬氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N^α-乙酰丝氨酸、N^α-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸和/或其他类似氨基酸。

在一些实施方案中，如本文提供的附接至抗体的细胞因子是充当前药的无活性掩蔽形式的细胞因子。示例性细胞因子缀合物在图15中示出。在一些实施方案中，这样的细胞因子通过裂解肿瘤微环境中的掩蔽基团而被选择性激活，以产生完全功能性免疫细胞因子。

接头针对细胞因子的附接点

本文提供了包含通过接头连接至修饰的或合成的细胞因子的抗体或抗原结合片段(其与靶抗原选择性结合)的组合物。如同上讨论的，接头可以在第一附接点处附接至抗体或抗原结合片段。接头的第二附接点附接至如本文提供的修饰的或合成的细胞因子。在一些情况下，修饰或合成的细胞因子是修饰的IL-2多肽。在其他情况下，修饰或合成的细胞因子是修饰的IL-7多肽。可以选择针对IL-7多肽的附接点，使得IL-7多肽与至少一个IL-7受体的相互作用被降低或阻断。在其他情况下，修饰或合成的细胞因子是修饰的IL-18多肽。可以选择针对IL-18多肽的附接点，使得IL-18多肽与至少一个IL-18受体的相互作用被降低或阻断。

接头可以附接至是本文描述的细胞因子的天然氨基酸残基的氨基酸残基。在一些实施方案中，接头附接至是如SEQ ID NO:1-23或176-185中的任何一个中列出的IL-2多肽，如SEQ ID NO:165-169、186或187中的任何一个中列出的IL-7多肽，如SEQ ID NO:170-175中列出的IL-18多肽的天然氨基酸残基的修饰形式的氨基酸残基。

这样的修饰的非限制性实例包括将缀合手柄掺入或附接至天然氨基酸残基(包括通过接头)，或使用任何相容的方法将接头附接至天然氨基酸。在一些实施方案中，接头附接至与SEQ ID NO:1-23或176-185中的任何一个的IL-2多肽，如SEQ ID NO:165-169、186或187中的任何一个中列出的IL-7多肽，如SEQ ID NO:170-175中列出的IL-18多肽相比是取代的氨基酸残基的氨基酸残基。取代可以是更易于另外官能团的附接的天然存在的氨基酸(例如，天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酸、赖氨酸、丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸)、任何天然存在的氨基酸的修饰形式的衍生物、或任何非天然氨基酸(例如，包含期望的反应性基团(诸如点击化学试剂，诸如叠氮化物、炔烃等)的氨基酸)。可以被取代的氨基酸的非限制性实例包括但不限于-α-(9-芴甲氧羰基)-L-联苯丙氨酸(Fmoc-L-Bip-OH)和N-α-(9-芴甲氧羰基)-O-苄基-L-酪氨酸(Fmoc-L-Tyr(Bzl)-OH)。示例性非典型氨基酸包括对乙酰基-L-苯丙氨酸、对碘-L-苯丙氨酸、对甲氧基苯丙氨酸、O-甲基-L-酪氨酸、对炔丙基氧基苯丙氨酸、对炔丙基苯丙氨酸、L-3-(2-萘基)丙氨酸、3-甲基-苯丙氨酸、O-4-烯丙基-L-酪氨酸、4-丙基-L-酪氨酸、三-O-乙酰基-GlcNAcp-丝氨酸、L-多巴、氟化苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、对叠氮基-L-苯丙氨酸、对酰基-L-苯丙氨酸、对苯甲酰基-L-苯丙氨酸、对硼苯丙氨酸、O-炔丙基酪氨酸、L-磷酸丝氨酸、磷酸丝氨酸、磷酸酪氨酸、对溴苯丙氨酸、硒半胱氨酸、对氨基-L-苯丙氨酸、异丙基-L-苯丙氨酸、叠氮基-赖氨酸(AzK)、酪氨酸氨基酸的类似物；谷氨酰胺氨基酸的类似物；苯丙氨酸氨基酸的类似物；丝氨酸氨基酸的类似物；苏氨酸氨基酸的类似物；烷基(alkyl)、芳基、酰基、叠氮基、氰基、卤素、肼、酰肼、羟基、烯基、炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸(borate)、硼酸酯(boronate)、磷酸、膦酰基、膦、杂环、烯酮、亚胺、醛、羟胺、酮基或氨基取代的氨基酸、β-氨基酸；除了脯氨酸或组氨酸之外的环状氨基酸；除了苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸之外的芳族氨基酸；或其组合。在一些实施方案中，非典型氨基酸选自β-氨基酸、高氨基酸、环状氨基酸和具有衍生化侧链的氨基酸。在一些实施方案中，非典型氨基酸包括β-丙氨酸、β-氨基丙酸、哌啶酸、氨基己酸、氨基庚酸、氨基庚二酸、锁链素、二氨基庚二酸、N^α-乙基甘氨酸、N^α-乙基天冬氨酸、羟赖氨酸、别羟赖氨酸、异锁链素、别异亮氨酸、ω-甲基精氨酸、N^α-甲基甘氨酸、Nα-甲基异亮氨酸、N^α-甲基缬氨酸、γ-羧基谷氨酸、ε-N,N,N-三甲基赖氨酸、ε-N-乙酰赖氨酸、O-磷酸丝氨酸、N^α-乙酰丝氨酸、N^α-甲酰甲硫氨酸、3-甲基组氨酸、5-羟基赖氨酸和/或其他类似氨基酸。

在一些实施方案中，接头附接在非天然氨基酸残基处。在一些实施方案中，非天然氨基酸残基组成缀合手柄。在一些实施方案中，缀合手柄促进接头向修饰的IL-2多肽的添加。缀合手柄可以是本文提供的缀合手柄中的任何一个。在一些实施方案中，接头位点特异性地共价附接至非天然氨基酸。组成缀合手柄的氨基酸残基的非限制性实例可以见于例如PCT公布第WO2015054658A1号、第WO2014036492A1号及第WO2021133839A1号、第WO2006069246A2和第WO2007079130A2号，其中每个通过引用并入，如同以其整体列出一样。

在一些实施方案中，接头附接至已被天然氨基酸取代的氨基酸残基。在一些实施方案中，接头附接至已被半胱氨酸残基、赖氨酸残基或酪氨酸残基取代的氨基酸残基。在一些实施方案中，接头附接至已被半胱氨酸残基取代的残基。在一些实施方案中，接头附接至已被赖氨酸残基取代的氨基酸残基。在一些实施方案中，接头附接至已被酪氨酸残基取代的氨基酸残基。

在一些实施方案中，蛋白(例如，化学合成的细胞因子)包含附接至一个或更多个残基的缀合手柄，以促进接头与抗体或抗原结合片段的附接。缀合手柄可以是本文提供的任何这样的缀合手柄，并且可以附接在接头可以被附接的任何残基处。在一些实施方案中，缀合手柄附接至例如蛋白的残基1(例如，N-末端胺)。在一些实施方案中，缀合手柄包括叠氮化物或炔烃。可选地，在一些实施方案中，缀合手柄被掺入到重组蛋白的非天然或修饰的天然氨基酸中。具有非天然氨基酸的重组蛋白可以使用如例如，专利合作条约公布第WO2016115168号、第WO2002085923号、第WO2005019415号和第WO2005003294号中描述的方法制备。

IL-2多肽

白细胞介素-2(IL-2)是在调节免疫系统中重要的细胞因子信号传导分子。IL-2参与帮助免疫系统区分外来与内源细胞类型，从而防止免疫系统攻击受试者自己的细胞。IL-2通过与由淋巴细胞表达的IL-2受体(IL-2R)相互作用而实现其活性。通过这些结合相互作用，IL-2可以调节受试者的T-效应(T_eff)细胞、自然杀伤(NK)细胞和调节性T细胞(T_reg)的群体。

IL-2已被单独的及与其他疗法组合用于治疗癌症。然而，使用IL-2作为治疗受到IL-2的毒性、不期望的副作用诸如血管渗漏综合征和IL-2半衰期短的限制。IL-2与本公开内容的抗体或抗原结合片段的缀合可以改进IL-2多肽的选择性，增强IL-2的治疗潜力，并且使施用IL-2疗法的副作用风险最小化。本公开内容描述了与修饰的和/或合成的白细胞介素-2(IL-2)多肽缀合的抗体或抗原结合片段以及缀合物作为治疗剂的用途。本文提供的修饰的IL-2多肽可以用作免疫疗法或作为其他免疫疗法方案的部分。这样的修饰的IL-2多肽可以对IL-2受体(IL-2R)展示出与野生型IL-2不同的结合特征。在一方面，本文描述的修饰的IL-2多肽对IL-2Rαβγ复合物(IL-2Rα)具有降低的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβγ复合物(IL-2Rβ)具有增加的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽和IL-2Rβ之间的结合亲和力等于或低于野生型IL-2与IL-2Rβ之间的结合亲和力。在本文描述的实施方案中利用的IL-2氨基酸序列的非限制性实例在下文的表8A中提供。在本文描述的缀合物中利用的IL-2多肽可以具有例如与表8A中的序列的任何一个(例如，SEQ IDNO:1-23中的任何一个或SEQ ID NO:176-185中的任何一个)至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，接头在氨基酸残基处附接至修饰的或合成的IL-2多肽。在一些实施方案中，接头附接在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-133中的任何一个的氨基酸残基处。在一些实施方案中，接头附接在非末端氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸残基2-132中的任何一个，或SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-133中的任何一个，其中N-末端或C-末端已经被一个或更多个氨基酸残基延伸)处。在一些实施方案中，接头附接在IL-2多肽的非末端氨基酸残基处，其中IL-2多肽包含相对于SEQ ID NO:1的N-末端截短或C-末端截短。

在一些实施方案中，接头在与IL-2受体(IL-2R)蛋白或亚单位相互作用的氨基酸残基处附接至IL-2多肽。在一些实施方案中，接头附接在与IL-2Rα亚单位(IL-2Rα)、IL-2Rβ亚单位(IL-2Rβ)或IL-2Rγ亚单位(IL-2Rγ)相互作用的氨基酸残基处。在一些实施方案中，接头附接在与IL-2Rα亚单位(IL-2Rα)相互作用的氨基酸残基处。在一些实施方案中，接头附接在与IL-2Rβ亚单位(IL-2Rβ)相互作用的氨基酸残基处。在一些实施方案中，接头附接在与IL-2Rγ亚单位(IL-2Rγ)相互作用的氨基酸残基处。在一些实施方案中，选择针对IL-2多肽的附接点，使得IL-2多肽与至少一个IL-2受体亚单位的相互作用被降低或阻断。在一些实施方案中，选择附接点，使得IL-2多肽与IL-2Rα的相互作用被减少或阻断。在一些实施方案中，选择附接点，使得IL-2多肽与IL-2Rβ的相互作用被减少或阻断。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽展示出不同于野生型IL-2的活性。在一些实施方案中，本文下文提供的这些修饰的生物活性适用于单独的IL-2多肽(例如，未与结合抗原或抗原结合片段的多肽缀合或以其他方式附接)，以及当IL-2多肽与结合抗原或抗原结合片段的多肽缀合或以其他方式附接时(例如，修饰的生物活性在缀合或附接后被保留)。因此，当本文将修饰的IL-2多肽描述为具有指示的活性时，还可以设想本文提供的免疫细胞因子组合物(例如，附接至结合抗原或抗原结合片段的多肽的IL-2多肽)具有相同的活性。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含在一个或更多个氨基酸残基处的一个或更多个修饰。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于野生型人类IL-2多肽作为参考序列。在一些情况下，本文描述的修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:1-23中的任何一个的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含N-末端缺失。在一些实施方案中，N-末端缺失具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸。在一些实施方案中，N-末端缺失具有至少1个氨基酸。在一些实施方案中，N-末端缺失具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在一些实施方案中，N-末端缺失是1至15个氨基酸。在一些实施方案中，N-末端缺失是单个氨基酸的缺失。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽是合成的。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于氨基酸残基35-45中的任何一个中的高丝氨酸(Hse)残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于氨基酸残基61-81中的任何一个中的Hse残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于氨基酸残基94-114中的任何一个中的Hse残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含1、2、3或更多个Hse残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41、Hse71、Hse104或其组合。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41、Hse71和Hse104。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至少两个氨基酸取代，其中所述至少两个氨基酸取代选自(a)位于氨基酸残基35-45中的任何一个中的高丝氨酸(Hse)残基；(b)位于氨基酸残基61-81中的任何一个中的高丝氨酸残基；和(c)位于氨基酸残基94-114中的任何一个中的高丝氨酸残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41和Hse71。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41和Hse104。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse71和Hse104。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse41。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse71。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Hse104。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含1、2、3或更多个正亮氨酸(Nle)残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于残基18-28的任何一个中的Nle残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于氨基酸残基34-50中的任何一个中的一个或更多个Nle残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含位于氨基酸残基20-60中的任何一个中的Nle残基。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含三个Nle取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Nle23、Nle39和Nle46。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽相对于WT IL-2(SEQ ID NO:1)包含SEQ ID NO:3中的取代的每一个，以及如本文提供的其他取代或修饰中的任何一个。

偏向于IL-2受体β亚单位的IL-2多肽

在本公开内容的一些实施方案中，与野生型IL-2相比，优选的是IL-2多肽偏向有利于通过IL-2受体β亚单位的信号传导。在一些实施方案中，这通过以下的一项或两项来实现：a)抑制或减少IL-2多肽与IL-2受体α亚单位的结合(例如，在接触α亚单位的残基处具有突变，向接触α亚单位的残基添加聚合物，或通过接头将抗体附接至接触α亚单位的残基)和/或b)增强IL-2多肽与IL-2受体的β亚单位的结合(例如，在接触β亚单位的残基处具有增强结合的突变)。在一些实施方案中，与野生型IL-2相比，本文提供的免疫细胞因子组合物的IL-2多肽偏向于IL-2受体β亚单位。具有偏向于IL-2受体β信号传导的修饰的IL-2多肽的非限制性实例在例如PCT公布第WO2021140416A2号、第WO2012065086A1号、第WO2019028419A1号、第WO2012107417A1号、第WO2018119114A1号、第WO2012062228A2号、第WO2019104092A1号、第WO2012088446A1号和第WO2015164815A1号中描述，其中每个特此通过引用并入，如同以其整体在本文中列出一样。

在一些实施方案中，接头在破坏IL-2多肽与IL-2受体α亚单位(IL-2Rα)结合的残基处附接至IL-2多肽。这些残基的实例包括残基3、5、34、35、36、37、38、40、41、42、43、44、45、60、61、62、63、64、65、67、68、69、71、72、103、104、105和107，如在例如PCT公布第WO2019028419A1号、第WO2020056066A1号、第WO2021140416A2号和第WO2021216478A1号中描述的，其中每个特此通过引用并入，如同以其整体列出一样。

在一些实施方案中，接头在位置30-110中的任何一个的氨基酸残基处附接至IL-2多肽，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，接头在位置30-50、30-70、30-100、40-50、40-70、40-100或40-110中的任何一个的氨基酸残基处附接至IL-2多肽。在一些实施方案中，接头在位置35、37、38、41、42、43、44、45、60、61、62、64、65、68、69、71、72、104、105和107中的任何一个的氨基酸残基处附接至IL-2多肽，其中修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，接头在位置35、37、38、41、43、44、45、60、61、62、64、65、68、69、71、72、104、105和107中的任何一个的氨基酸残基处附接至IL-2多肽，其中修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，接头在位置35、37、38、41、42、43、44、60、61、62、64、65、68、69、71、72、104、105和107中的任何一个的氨基酸残基处附接至IL-2多肽，其中修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，接头在位置35、37、38、41、43、44、60、61、62、64、65、68、69、71、72、104、105和107中的任何一个的氨基酸残基处附接至IL-2多肽，其中修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，接头在位置35、37、38、39、40、41、42、43、44、45或46中的任何一个的氨基酸残基处附接至IL-2多肽。在一些实施方案中，接头在位置41、42、43、44和45中的任何一个的氨基酸残基处附接至IL-2多肽，其中修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，接头附接在氨基酸残基42或45处。在一些实施方案中，接头附接在氨基酸残基42处。在一些实施方案中，接头附接在氨基酸残基45处。

在一些实施方案中，接头附接至已被天然氨基酸取代的氨基酸残基。在一些实施方案中，接头附接至已被半胱氨酸残基、赖氨酸残基或酪氨酸残基取代的氨基酸残基。在一些实施方案中，接头附接至已被半胱氨酸残基取代的残基。在一些实施方案中，接头附接至已被赖氨酸残基取代的氨基酸残基。在一些实施方案中，接头附接至已被酪氨酸残基取代的氨基酸残基。在其中细胞因子包括IL-2多肽的一些实施方案中，接头附接至氨基酸残基K35、F42Y、K43、F44Y或Y45。在其中细胞因子包括IL-2多肽的一些实施方案中，接头附接至氨基酸残基F42Y或Y45。在其中细胞因子包括IL-2多肽的一些实施方案中，接头附接至氨基酸残基F42Y。在一些实施方案中，接头附接至氨基酸残基Y45。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的细胞因子包含一个或更多个修饰的氨基酸残基。这样的修饰可以采取以下形式：野生型IL-2多肽诸如SEQ ID NO:1的氨基酸序列的突变，从SEQ ID NO:1的序列中添加和/或缺失氨基酸或向氨基酸残基添加部分。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含从SEQ ID NO:1序列的第一氨基酸的缺失。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含C125S突变，使用SEQ ID NO:1的序列作为参考序列。可以向氨基酸残基添加的部分包括但不限于聚合物、接头、间隔物及其组合。当向某些氨基酸残基添加时，这些部分可以调节修饰的IL-2多肽与野生型IL-2相比的活性或其他特性。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含氨基酸残基35-46范围内的两个修饰。在一些实施方案中，一个修饰位于氨基酸残基40-43的范围内。在一些实施方案中，一个修饰位于氨基酸残基42处。在一些实施方案中，一个修饰位于氨基酸残基44-46的范围内。在一些实施方案中，一个修饰位于氨基酸残基45处。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含表8中提供的SEQ ID NO:3-23中的任何一个的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:3-23中的任何一个的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:3的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:4的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:9的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQID NO:10的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:10的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:11的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQID NO:11的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:12的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:12的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:13的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:13的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:14的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:14的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ IDNO:15的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:15的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:17的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ IDNO:17的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:18的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:18的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:19的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:19的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:20的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:21的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:22的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与SEQ ID NO:23的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含一种或更多种聚合物。例如，向某些氨基酸残基添加聚合物可以具有破坏修饰的IL-2多肽与IL-2R(特别是αβγ复合物)的结合相互作用的效果。在一些实施方案中，添加聚合物以破坏这种相互作用的残基包括F42和Y45。在一些实施方案中，向残基42或45添加的聚合物还充当IL-2多肽和与癌症抗原、免疫细胞靶分子、自身抗原或其任何组合结合的多肽之间的接头。

在一些实施方案中，聚合物是水溶性聚合物，诸如聚乙二醇(PEG)聚合物。F42残基可以突变为另一残基，以促进PEG聚合物(或接头)的添加，例如向酪氨酸残基的添加。可以向残基F42和Y45或其突变体中的任一个或两个添加聚合物。这些聚合物可以呈IL-2多肽和与TNFα选择性结合的多肽之间的接头的形式，或者可以是除了接头以外的另外的聚合物。另外，可以向修饰的IL-2多肽添加聚合物，以便增加多肽的半衰期。在一些实施方案中，IL-2多肽和与TNFα选择性结合的多肽之间的接头具有增加多肽缀合物半衰期的作用。可选地，可以向修饰的IL-2多肽的N-末端或本文提供的另一个残基添加这样的半衰期延长性聚合物。半衰期延长性聚合物可以具有任何尺寸，包括至多约6kDa、至多约25kDa或至多约50kDa。在一些实施方案中，半衰期延长性聚合物是PEG聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含选自表2的一个或更多个氨基酸突变。

表2

*残基位置编号基于SEQ ID NO:1作为参考序列。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含选自表3的一个或更多个氨基酸突变。

表3

*残基位置编号基于SEQ ID NO:1作为参考序列。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含一种或更多种选自表4的聚合物。

表4

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含表5中提供的突变和聚合物。

表5

*残基位置编号基于SEQ ID NO:1作为参考序列。

在一些情况下，本文描述的修饰的细胞因子可以是重组的。本文描述的修饰的IL-2细胞因子也可以化学合成而不是以重组多肽表达。例如，合成的IL-2多肽已经至少在美国专利申请公布第US20190023760A1号和Asahina等人，Angew.Chem.Int.Ed.2015,54,8226-8230中描述，其中每个通过引用并入，如同以其整体在本文中列出一样。修饰的细胞因子可以通过合成全长的修饰的细胞因子的一种或更多种片段、将片段连接在一起、并使所连接的全长多肽折叠来制备。在一些实施方案中，其中细胞因子包括修饰的IL-2多肽，并且修饰的IL-2多肽包含氨基酸序列中的F42Y突变、共价附接至氨基酸残基F42Y的约500Da的第一PEG聚合物、共价附接至氨基酸残基Y45的约500Da的第二PEG聚合物、以及共价附接至修饰的IL-2多肽N-末端的约6kDa的任选的第三PEG聚合物。在一些实施方案中，PEG聚合物包含将IL-2多肽附接至与抗体或抗原结合片段结合的多肽的接头的一部分。在一些情况下，细胞因子包括修饰的IL-7多肽。在一些情况下，细胞因子包括修饰的IL-18多肽。

在一些实施方案中，例如，化学合成的细胞因子包含附接至一个或更多个残基的缀合手柄，以促进接头与抗体或抗原结合片段的附接。缀合手柄可以是本文提供的任何这样的缀合手柄，并且可以附接在接头可以被附接的任何残基处。在其中细胞因子是修饰的IL-2多肽的一些实施方案中，缀合手柄附接至例如IL-2多肽的残基42或45。在一些实施方案中，缀合手柄包括叠氮化物或炔烃。可选地，在一些实施方案中，缀合手柄被掺入到重组IL-2多肽的非天然或修饰的天然氨基酸中。具有非天然氨基酸的重组IL-2多肽可以使用如例如，专利合作条约公布第WO2016115168号、第WO2002085923号、第WO2005019415号和第WO2005003294号中描述的方法制备。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含在来自残基35-46区域的氨基酸残基处的修饰，其中残基编号是基于SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，修饰位于K35、L46、T37、R38、M39、L40、T41、F42、K43、F44、Y45或M46处。在一些实施方案中，修饰位于F42处。在一些实施方案中，修饰位于Y45处。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在N末端残基处的修饰。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含C125S突变。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含A1缺失。在一些实施方案中，修饰包括将IL-2多肽附接至抗体或抗原结合片段的接头的附接。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽包含共价附接在残基35-46的任何一个中的氨基酸残基处的第一聚合物，其中修饰的IL-2多肽的氨基酸残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含共价附接在残基39-43中的任何一个中的氨基酸残基处的第一聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含共价附接在氨基酸残基F42处的第一聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含共价附接在氨基酸残基F42Y处的第一聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含共价附接在残基44-46中的任何一个中的氨基酸残基处的第一聚合物。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含共价附接在氨基酸残基Y45处的第一聚合物。在一些实施方案中，第一聚合物是将IL-2多肽附接至抗体或抗原结合片段的接头的一部分。在一些实施方案中，第一聚合物是与将IL-2多肽附接至抗体或抗原结合片段的接头不同的修饰。

在一些实施方案中，本文描述的修饰IL-2多肽包含位于氨基酸残基35至氨基酸残基45区域中的氨基酸残基处的一个或更多个PEG化酪氨酸。在一些实施方案中，一个或更多个PEG化酪氨酸位于氨基酸残基42、氨基酸残基45或二者处。在一些实施方案中，一个或更多个PEG化酪氨酸位于氨基酸残基42处。在一些实施方案中，一个或更多个PEG化酪氨酸位于氨基酸残基45处。在一些实施方案中，一个或更多个PEG化酪氨酸位于氨基酸残基42和氨基酸残基45二者处。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含两个PEG化酪氨酸，每个PEG化酪氨酸独立地具有式(I)的结构。本文提供的具有如本文提供的各种接头附接点和聚合物的修饰的IL-2多肽的非限制性集合在下文表9中示出。

表9

IL-2构建体	接头附接点	聚合物1附接点	聚合物2附接点
				A	N-末端	残基42	残基45
B	N-末端	残基42	无
				C	N-末端	残基45	无
D	残基42	残基45	无
				E	残基42	N-末端	残基45
F	残基42	N-末端	无
				G	残基45	残基42	无
H	残基45	N-末端	残基42
				I	残基45	N-末端	无
J	N-末端	残基65	无
				K	残基65	N-末端	无

*残基位置编号基于SEQ ID No:1作为参考序列

在一方面，本文公开了一种修饰的IL-2多肽，所述修饰的IL-2多肽包含一个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含F42Y和Y45。

在一方面，本文描述了一种修饰的多肽，所述修饰的多肽包含修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，其中修饰的IL-2多肽包含共价附接的第一聚合物。本文描述了一种修饰的多肽，该修饰的多肽包含修饰的白细胞介素-2(IL-2)多肽，其中修饰的IL-2多肽包含共价附接在残基F42Y处的第一聚合物，并且其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ IDNO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第一聚合物与将IL-2多肽附接至抗体或抗原结合片段的接头相同。在一些实施方案中，第一聚合物是不同于接头的另外的聚合物。

在一些情况下，在其中修饰的细胞因子是IL-2多肽的一些实施方案中，Tyr 45和/或Phe42被非典型氨基酸取代。在一些实施方案中，位于表2和/或表3中提供的位置处的一个或更多个氨基酸被一个或更多个非典型氨基酸取代。在一些实施方案中，Tyr 45和/或Phe 42被修饰的酪氨酸残基取代。在一些实施方案中，修饰的酪氨酸残基包含氨基、叠氮化物、烯丙基、酯和/或酰胺官能团。在一些实施方案中，位置42或45处的修饰的酪氨酸残基用作将IL-2多肽附接至抗体或抗原结合片段的接头的附接点。在一些实施方案中，位置42和/或45处的修饰的酪氨酸残基具有从前体结构1、结构2、结构3、结构4或结构5构建的结构，其中结构1是

结构2是：

结构3是：

结构4是：

并且结构5是：

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽当向受试者施用时增强和/或激活T-效应(T_eff)细胞或自然杀伤(NK)细胞增殖。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽当向受试者施用时增强和/或激活T_eff细胞或NK细胞增殖而不损害(sparing)调节性T细胞(T_reg)。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽当施用至受试者时增加CD8+T细胞和NK细胞而不增加CD4+调节性T细胞。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽当向受试者施用时产生接近1的T_eff/T_reg比。在一些情况下，修饰的IL-2多肽是本文描述的修饰的IL-2多肽、表8A(特别是SEQ ID NO:1-23)或表5中提供的修饰的IL-2多肽、具有表2或表3中提供的突变的修饰的IL-2多肽和/或具有表4中提供的聚合物的修饰的IL-2多肽。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽扩增效应T细胞(T_eff细胞)的细胞群体。在一些实施方案中，当修饰的细胞因子与T_eff细胞的细胞群体接触时，修饰的细胞因子使该群体扩增至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％。在一些实施方案中，当修饰的细胞因子与T_eff细胞的细胞群体接触时，修饰的细胞因子使该细胞群体扩增至少20％。在一些实施方案中，修饰的细胞因子将T_eff细胞的细胞群体在修饰的细胞因子与群体接触时扩增至少30％。在一些实施方案中，当修饰的细胞因子与T_eff细胞的细胞群体接触时，修饰的细胞因子使该细胞群体扩增至少40％。在一些实施方案中，当修饰的细胞因子与T_eff细胞的细胞群体接触时，修饰的细胞因子使该细胞群体扩增至少50％。在一些实施方案中，修饰的细胞因子将T_eff细胞的细胞群体在修饰的细胞因子与群体接触时扩增至少100％。在一些实施方案中，当修饰的细胞因子与T_eff细胞的细胞群体接触时，修饰的细胞因子使该细胞群体扩增至少200％。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的细胞因子扩增效应T细胞(T_eff细胞)的细胞群体。在一些实施方案中，当修饰的细胞因子与T_eff细胞的细胞群体接触时，修饰的细胞因子使该细胞群体扩增至多5％、至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多75％、至多100％或至多500％。在一些实施方案中，当修饰的细胞因子与T_eff细胞的细胞群体接触时，修饰的细胞因子使该细胞群体扩增至多5％。在一些实施方案中，当修饰的细胞因子与T_eff细胞的细胞群体接触时，修饰的细胞因子使该细胞群体扩增至多20％。在一些实施方案中，当修饰的细胞因子与T_eff细胞的细胞群体接触时，修饰的细胞因子使该细胞群体扩增至多50％。在一些实施方案中，当修饰的细胞因子与T_eff细胞的细胞群体接触时，修饰的细胞因子使该细胞群体扩增至多100％。在一些实施方案中，当修饰的细胞因子与T_eff细胞的细胞群体接触时，修饰的细胞因子使该细胞群体扩增至多500％。

在一些实施方案中，由本文描述的修饰的IL-2多肽扩增的T_eff细胞的细胞群体扩增相比于T_reg细胞的细胞群体扩增的比是约0.1至约15、约0.5至约10、约0.75至约5或约1至约2。在一些实施方案中，由修饰的细胞因子扩增的T_eff细胞的细胞群体扩增相比于T_reg细胞的细胞群体扩增的比是0.1至15。在一些实施方案中，由修饰的细胞因子扩增的T_eff细胞的细胞群体扩增相比于T_reg细胞的细胞群体扩增的比是0.1至0.5、0.1至0.75、0.1至1、0.1至2、0.1至5、0.1至10、0.1至15、0.5至0.75、0.5至1、0.5至2、0.5至5、0.5至10、0.5至15、0.75至1、0.75至2、0.75至5、0.75至10、0.75至15、1至2、1至5、1至10、1至15、2至5、2至10、2至15、5至10、5至15、10至15或其间的任何数字或范围。在一些实施方案中，由修饰的IL-2多肽扩增的T_eff细胞的细胞群体扩增相比于T_reg细胞的细胞群体扩增的比是约0.1、0.5、0.75、1、2、5、10或15。在一些实施方案中，由修饰的IL-2多肽扩增的T_eff细胞的细胞群体扩增相比于T_reg细胞的细胞群体扩增的比是至少0.1、0.5、0.75、1、2、5或10。在一些实施方案中，由修饰的IL-2多肽扩增的T_eff细胞的细胞群体扩增相比于T_reg细胞的细胞群体扩增的比是至多0.5、0.75、1、2、5、10或15。

在一些实施方案中，由本文提供的修饰的细胞因子扩增的细胞群体是体外细胞群体、体内细胞群体或离体细胞群体。在一些实施方案中，细胞群体是体外细胞群体。在一些实施方案中，细胞群体是体内细胞群体。在一些实施方案中，细胞群体是离体细胞群体。细胞群体可以是CD4+辅助性细胞、CD8+中央记忆性细胞、CD8+效应记忆性细胞、幼稚CD8+细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞或其组合的群体。可选地，细胞群体可以是调节性T细胞群体。

在一些实施方案中，在注射修饰的IL细胞因子之后1小时测量细胞水平。在一些实施方案中，在注射修饰的细胞因子之后2小时测量细胞水平。在一些实施方案中，在注射修饰的细胞因子之后4小时测量细胞水平。在一些实施方案中，在注射修饰的细胞因子之后30分钟测量细胞水平。

附接至偏向于IL-2受体β亚单位的IL-2多肽的聚合物

在一些实施方案中，本文描述的修饰的细胞因子包含共价附接至细胞因子的N-末端的第一聚合物。在一些实施方案中，修饰的细胞因子包含共价附接至其的第二聚合物。在一些实施方案中，修饰的细胞因子包含共价附接至其的第二聚合物和第三聚合物。在其中细胞因子包括IL-2的一些实施方案中，第二聚合物共价附接至氨基酸残基42或45，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第二聚合物共价附接至氨基酸残基F42Y或Y45，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第二聚合物和第三聚合物共价附接至氨基酸残基42和45，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第二聚合物和第三聚合物共价附接至氨基酸残基F42Y和Y45，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，第一聚合物、第二聚合物或第三聚合物中的至少一种包含用于将IL-2多肽附接至抗体或抗原结合片段的接头的至少一部分。

在一些实施方案中，附接的聚合物诸如第一聚合物具有约120道尔顿至约1,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有以下的平均分子量：约120道尔顿至约250道尔顿、约120道尔顿至约300道尔顿、约120道尔顿至约400道尔顿、约120道尔顿至约500道尔顿、约120道尔顿至约1,000道尔顿、约250道尔顿至约300道尔顿、约250道尔顿至约400道尔顿、约250道尔顿至约500道尔顿、约250道尔顿至约1,000道尔顿、约300道尔顿至约400道尔顿、约300道尔顿至约500道尔顿、约300道尔顿至约1,000道尔顿、约400道尔顿至约500道尔顿、约400道尔顿至约1,000道尔顿或约500道尔顿至约1,000道尔顿。在一些实施方案中，聚合物具有约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有至少约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿或约500道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，聚合物具有至多约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的平均分子量。

在一些实施方案中，附接的聚合物诸如第一聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧烷)，诸如聚乙二醇(例如，聚环氧乙烷)。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚乙二醇。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括改性的聚(环氧烷)。在一些实施方案中，改性的聚(环氧烷)包含一个或更多个接头基团。在一些实施方案中，一个或更多个接头基团包括双官能接头，诸如酰胺基团、酯基团、醚基团、硫醚基团、羰基基团等。在一些实施方案中，一个或更多个接头基团包括酰胺接头基团。在一些实施方案中，改性的聚(环氧烷)包含一个或更多个间隔物基团。在一些实施方案中，间隔物基团包括被取代或未被取代的C₁-C₆亚烃基基团。在一些实施方案中，间隔物基团包括-CH₂-、-CH₂CH₂-或-CH₂CH₂CH₂-。在一些实施方案中，接头基团是双正交反应(例如，生物相容性和选择性反应)的产物。在一些实施方案中，生物正交反应是Cu(I)催化或“无铜”的炔-叠氮三唑形成反应、Staudinger连接、逆电子需求Diels-Alder(IEDDA)反应、“光点击”化学或金属介导的过程，诸如烯烃复分解和Suzuki-Miyaura或Sonogashira交叉偶联。在一些实施方案中，第一聚合物经由点击化学与IL-2多肽附接。在一些实施方案中，第一聚合物包含将细胞因子附接至抗体或抗原结合片段的接头的至少一部分。

在一些实施方案中，水溶性聚合物包含1个至10个聚乙二醇链。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽还包含与修饰的IL-2多肽共价附接的第二聚合物。在一些实施方案中，第二聚合物在残基40至残基50的氨基酸残基区域处共价附接。在一些实施方案中，第二聚合物在残基Y45处共价附接。在一些实施方案中，第二聚合物与修饰的IL-2多肽的N末端共价附接。在一些实施方案中，第二聚合物包含将IL-2多肽附接至与抗原选择性结合的多肽(例如，抗体或其抗原结合片段)的接头的至少一部分。

在一些实施方案中，第二聚合物具有约120道尔顿至约1,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，第二聚合物具有以下的平均分子量：约120道尔顿至约250道尔顿、约120道尔顿至约300道尔顿、约120道尔顿至约400道尔顿、约120道尔顿至约500道尔顿、约120道尔顿至约1,000道尔顿、约250道尔顿至约300道尔顿、约250道尔顿至约400道尔顿、约250道尔顿至约500道尔顿、约250道尔顿至约1,000道尔顿、约300道尔顿至约400道尔顿、约300道尔顿至约500道尔顿、约300道尔顿至约1,000道尔顿、约400道尔顿至约500道尔顿、约400道尔顿至约1,000道尔顿或约500道尔顿至约1,000道尔顿。在一些实施方案中，第二聚合物具有约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，第二聚合物具有至少约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿或约500道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，第二聚合物具有至多约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的平均分子量。

在一些实施方案中，第二聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧烷)。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧乙烷)。在一些实施方案中，第二聚合物经由点击化学与IL-2多肽附接。在一些实施方案中，第二聚合物包含将IL-2多肽附接至抗体的接头的至少一部分。

在一些实施方案中，第二水溶性聚合物包含1个至10个聚乙二醇链。在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种独立地包含具有3个至25个乙二醇单元的一个聚乙二醇链。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地是线性的或支链的。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链是线性聚乙二醇。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链是支链聚乙二醇。例如，在一些实施方案中，第一聚合物和第二聚合物的每一种都包含线性聚乙二醇链。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽还包含与修饰的IL-2多肽共价附接的第三聚合物。在一些实施方案中，第三聚合物共价附接在氨基酸残基40至氨基酸残基50的氨基酸残基区域。在一些实施方案中，第三聚合物共价附接在氨基酸残基Y45处。在一些实施方案中，第三聚合物共价附接在修饰的IL-2多肽的N-末端。

在一些实施方案中，第三聚合物具有约120道尔顿至约1,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，第三聚合物具有以下的平均分子量：约120道尔顿至约250道尔顿、约120道尔顿至约300道尔顿、约120道尔顿至约400道尔顿、约120道尔顿至约500道尔顿、约120道尔顿至约1,000道尔顿、约250道尔顿至约300道尔顿、约250道尔顿至约400道尔顿、约250道尔顿至约500道尔顿、约250道尔顿至约1,000道尔顿、约300道尔顿至约400道尔顿、约300道尔顿至约500道尔顿、约300道尔顿至约1,000道尔顿、约400道尔顿至约500道尔顿、约400道尔顿至约1,000道尔顿或约500道尔顿至约1,000道尔顿。在一些实施方案中，第三聚合物具有约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，第三聚合物具有至少约120道尔顿、约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿或约500道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，第三聚合物具有至多约250道尔顿、约300道尔顿、约400道尔顿、约500道尔顿或约1,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含与其共价附接的第三聚合物，所述第三聚合物具有约1000道尔顿至约10,000道尔顿的平均分子量。在一些实施方案中，第三聚合物包含将细胞因子附接至抗体或抗原结合片段的接头的至少一部分。

在一些实施方案中，第三聚合物包括水溶性聚合物。在一些实施方案中，水溶性聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚(环氧烷)。在一些实施方案中，水溶性聚合物是聚乙二醇。在一些实施方案中，第三聚合物经由点击化学附接至细胞因子。在一些实施方案中，第三聚合物包含将细胞因子附接至抗体或抗原结合片段的接头的至少一部分

在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用羟基、烃基、烃氧基、酰胺基或氨基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用氨基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用酰胺基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用烃氧基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用烃基基团末端封端。在一些实施方案中，每个聚乙二醇链独立地用羟基基团末端封端。

在一些实施方案中，可以与修饰的IL-2多肽附接的水溶性聚合物包含式(D)的结构：

在一些实施方案中，聚合物从合适的前体物质合成。在一些实施方案中，聚合物从结构6、结构7、结构8或结构9的前体物质合成，其中结构6是

结构7是：

结构8是：

并且结构9是：

偏向于IL-2受体α亚单位的IL-2多肽

在一方面，本文提供了一种修饰的IL-2多肽，所述修饰的IL-2多肽包含一个或更多个氨基酸取代。在一些实施方案中，氨基酸取代影响修饰的IL-2多肽与IL-2受体亚单位(例如α、β或γ亚单位)或与IL-2受体复合物(例如IL-2受体αβγ复合物或βγ复合物)的结合特性。在一些实施方案中，氨基酸取代位于修饰的IL-2多肽和IL-2受体亚单位或IL-2受体复合物之间结合相互作用的界面上的位置处。在一些实施方案中，氨基酸取代引起对IL-2受体αβγ复合物或α亚单位的亲和力增加。在一些实施方案中，氨基酸取代引起对IL-2受体βγ复合物或β亚单位的亲和力降低。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽对IL-2Rαβγ复合物具有增加的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβγ复合物具有减少的亲和力。在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽可以包含增强对IL-2Rα受体亚单位的结合亲和力的氨基酸取代。在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含降低修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ受体亚单位的亲和力的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽当体内施用时与野生型IL-2或阿地白介素相比具有诱导或激活更多调节性T(T_reg)细胞的生物活性。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽当体内施用时与野生型IL-2或阿地白介素相比具有诱导或激活更少T效应(T_eff)细胞的生物活性。在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽当体内施用时与野生型IL-2或阿地白介素相比具有实质上减少的诱导或激活效应T细胞的能力(例如，降低至少100倍的能力)。

在一些实施方案中，选择IL-2多肽中的取代的残基，使得IL-2多肽与至少一个IL-2受体亚单位的相互作用被降低或阻断。在一些实施方案中，选择取代的残基，使得IL-2多肽与含有IL-2Rα亚单位的IL-2受体的相互作用不受影响或仅被略微减少。在一些实施方案中，选择取代的残基，使得IL-2多肽与IL-2Rβ亚单位的相互作用被实质上减少或阻断。

使IL-2多肽偏向有利于IL-2受体α亚单位的氨基酸取代和其他修饰的实例在以下中描述：例如Rao等人,Protein Eng.2003Dec；16(12):1081-7；Cassell等人,Curr PharmDes.2002；8(24):2171-83；Rao等人,Biochemistry.2005Aug 9；44(31)10696-701；Mitra等人,Immunity.2015May 19；42(5)826-38；美国专利第US9732134号和美国专利公布第US2020/0231644A1号，其中每个通过引用并入，如同以其整体在本文中列出一样。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含其中提供的氨基酸取代之一。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含选自表6的一个或更多个氨基酸取代。

表6

*残基位置编号基于SEQ ID NO:1作为参考序列

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含选自表7的一个或更多个氨基酸取代。

表7

*残基位置编号基于SEQ ID NO:1作为参考序列

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在选自18、22、23、29、31、35、37、39、42、46、48、69、71、74、80、81、85、86、88、89、92和126的一个或更多个残基处的一个或更多个取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在选自18、22、23、29、31、35、37、39、42、46、48、69、71、74、80、81、85、86、88、89、92和126的残基处的1、2、3、4、5、6、7或8个取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含选自L18R、Q22E、M23A、N29S、Y31H、K35R、T37A、M39A、F42(4-NH₂)-Phe、M46A、K48E、V69A、N71R、Q74P、L80F、R81D、L85V、I86V、N88D、I89V、I92F和Q126T的一个或更多个取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含选自L18R、Q22E、M23A、N29S、Y31H、K35R、T37A、M39A、F42(4-NH₂)-Phe、M46A、K48E、V69A、N71R、Q74P、L80F、R81D、L85V、I86V、N88D、I89V、I92F和Q126T的1、2、3、4、5、6、7或8个取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含L18R。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Q22E。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含M23A。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含N29S。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Y31H。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含K35R。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含T37A。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含M39A。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含F42(4-NH₂)-Phe。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含M46A。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含K48E。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含V69A。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含N71R。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Q74P。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含L80F。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含R81D。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含L85V。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含I86V。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含N88D。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含I89V。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含I92F。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Q126T。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含在Y31、K35、Q74和N88D中的至少一个处的氨基酸取代，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在Y31、K35、Q74和N88中的至少两个处的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在Y31、K35、Q74和N88中的至少三个处的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在Y31、K35、Q74和N88中的每一个处的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含氨基酸取代Y31H、K35R、Q74P和N88D。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽还包含任选的C125取代(例如，C125S或C125A)。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽还包含任选的A1缺失或残基A1的取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽还包含任选的A1缺失。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含Y31、K35或Q74中的至少一个处的天然氨基酸取代，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含Y31、K35或Q74中的至少两个的天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在Y31、K35和Q74中的每一个处的天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含氨基酸取代Y31H、K35R和Q74P。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽还包含任选的C125突变。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含Y31突变，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，Y31突变针对芳族氨基酸。在一些实施方案中，Y31突变针对碱性氨基酸。在一些实施方案中，碱性氨基酸是弱碱性的。在一些实施方案中，Y31突变选自Y31F、Y31H、Y31W、Y31R和Y31K。在一些实施方案中，Y31突变是Y31H。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含K35突变，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，K35突变针对碱性氨基酸。在一些实施方案中，K35突变针对带正电荷的氨基酸。在一些实施方案中，K35突变是K35R、K35E、K35D或K35Q。在一些实施方案中，K35突变是K35R。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含Q74突变，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，Q74突变是环状氨基酸。在一些实施方案中，环状氨基酸包含共价附接至α碳原子的环状基团和附接至α碳原子的氮原子。在一些实施方案中，Q74突变是Q74P。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含N88取代，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，N88取代是带电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，N88取代是带负电荷的氨基酸残基。在一些实施方案中，N88取代是N88D或N88E。在一些实施方案中，N88取代是N88D或N88E。在一些实施方案中，N88取代是N88D。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含C125突变，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，C125突变稳定修饰的IL-2多肽。在一些实施方案中，C125突变不实质上改变修饰的IL-2多肽的活性。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含C125S突变。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含C125A取代。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在残基A1处的修饰，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，修饰是A1缺失。在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含N-末端缺失。在一些实施方案中，N-末端缺失具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或更多个氨基酸。在一些实施方案中，N-末端缺失具有至少1个氨基酸。在一些实施方案中，N-末端缺失具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸。在一些实施方案中，N-末端缺失是1至15个氨基酸。在一些实施方案中，N-末端缺失是单个氨基酸的缺失(例如，SEQ ID NO:1的A1缺失)。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含对与IL-2受体α亚单位或αβγ复合物的结合具有作用的另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含对与IL-2受体β亚单位或βγ复合物的结合具有作用的另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至少一个选自表6的另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在残基E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、N88、I89或I92处的至少一个氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在选自E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、N88、I89或I92的残基处的1、2、3或4个天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在选自E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、N88、I89或I92的残基处的1个天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含2个。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在选自E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、N88、I89或I92的残基处的至多2个天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在选自E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、N88、I89或I92的残基处的至多3个天然氨基酸取代。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包括E15A、E15G或E15S。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包括N29S。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包括N30S。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包括T37A或T37R。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包括K48E。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包括V69A。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包括N71R。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包括N88A、N88D、N88E、N88F、N88G、N88H、N88I、N88M、N88Q、N88R、N88S、N88T、N88V或N88W。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包括N88D。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包括I89V。在一些实施方案中，另外的氨基酸取代包括I92K或I92R。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含在Y31、K35、Q74处的突变和任选的C125S。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含实质上影响与IL-2受体α亚单位或αβγ复合物的结合的任何另外的突变。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含对与IL-2受体β亚单位或βγ复合物的结合具有作用的另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含选自表6中鉴定的位置的任何另外的天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含选自表7中鉴定的位置的任何另外的天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含选自表6的任何另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含选自表7的任何另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含在残基E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、N88、I89或I92处的任何另外的天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含在残基E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、N88、I89或I92处的任何另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不具有V69突变。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不具有V69A突变。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不具有K48突变。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不具有K48E突变。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含在V69或K48处的突变。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含在V69或K48的任一个处的突变。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含V69A或K48E突变。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含V69A或K48E突变中的任一个。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽包含在Y31、K35、Q74、N88处的取代和任选的C125S。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含实质上影响与IL-2受体α亚单位或αβγ复合物的结合的任何另外的取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含对与IL-2受体β亚单位或βγ复合物的结合具有作用的另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含选自表6中鉴定的位置的任何另外的天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含选自表7的任何另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含在残基E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、I89或I92处的任何另外的天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含在残基E15、N29、N30、T37、K48、V69、N71、I89或I92处的任何另外的氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不具有V69取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不具有V69A取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不具有K48取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不具有K48E取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含在V69或K48处的取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含在V69或K48的任一个处的取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含V69A或K48E取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽不包含V69A或K48E取代中的任一个。

在一方面，本文公开了一种修饰的IL-2多肽，所述修饰的IL-2多肽包含一个或更多个非天然氨基酸取代(例如，合成IL-2多肽)。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含至少两个非天然氨基酸取代。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽包含在选自Y31、K35和Q74的残基处的至少一个氨基酸取代，其中修饰的IL-2多肽的残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。

在一些实施方案中，IL-2多肽可以包含破坏修饰的IL-2多肽和IL-2受体β亚单位之间的结合或者以其他方式使修饰的IL-2多肽偏向有利于通过α亚单位的信号传导的聚合物(例如，除了接头)。在一些实施方案中，选择聚合物的附接点，使得IL-2多肽与含有IL-2Rα受体亚单位的IL-2受体的相互作用不受影响或仅被略微减少。在一些实施方案中，选择聚合物的附接点，使得IL-2多肽与IL-2β受体亚单位的相互作用被实质上减少。这样的残基的实例在美国公布第US2020/0231644A1号中提供，该公布特此通过引用并入，如同以其整体列出一样。在一些实施方案中，聚合物附接至IL-2多肽的位置8、9、11、12、15、16、18、19、20、22、23、26、81、84、87、88、91、92、94、95、116、119、120、123、125、126、127、130、131、132或133处的残基，其中残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，聚合物附接至IL-2多肽的位置8、9、12、15、16、19、20、22、23、26、84、88、95或126处的残基。在一些实施方案中，聚合物附接至位置8、9或16处的残基。在一些实施方案中，聚合物附接至IL-2多肽的位置22、26、88或126处的残基。在一些实施方案中，聚合物附接至IL-2多肽的位置15、20、84或95处的残基。在一些实施方案中，聚合物附接至IL-2多肽的位置12、19或23处的残基。在一些实施方案中，聚合物附接至位置22或26处的残基。在一些实施方案中，聚合物附接至IL-2多肽的位置35处的残基。在一些实施方案中，聚合物附接在残基88处。在一些实施方案中，聚合物附接在残基N88D处。在一些实施方案中，附接在残基88处的聚合物附接至氨基酸a修饰的天冬氨酸残基，其中附接至残基的聚合物具有以下结构

其中n是1-30的整数，并且其中X是NH₂、-OCH₃、OH、-NH(C＝O)CH₃或缀合手柄(例如，叠氮化物)。在一些实施方案中，n是8-10的整数。在一些实施方案中，X是-NH₂。当X是NH₂并且n是9时，对应的氨基酸在本文中任选地称为Dgp(具有O-(2-氨基乙基)-O’-(2-氨基乙基)八乙二醇的D)。为了序列同一性的目的，本文意图这样的氨基酸(也可以在更一般的意义上称为“修饰的D”、“用聚合物修饰的D”或类似的语言)将视作最终结构从其衍生的基础氨基酸(例如，这样的残基将视作序列鉴定目的的D)。

在一些实施方案中，接头在氨基酸残基处附接至IL-2多肽。在一些实施方案中，接头附接在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-133中的任何一个的氨基酸残基处。在一些实施方案中，接头附接至IL-2多肽的N-末端氨基酸残基。在一些实施方案中，接头附接至IL-2多肽的N-末端氨基基团。在一些实施方案中，通过与附接至具有以下结构的N-末端氨基基团的加合物反应，接头附接至修饰的IL-2多肽的N-末端氨基基团

其中每个n独立地是1-30的整数(例如，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30)，并且其中X是缀合手柄(例如，本文提供的叠氮化物或其他缀合手柄，诸如DBCO基团)。在一些实施方案中，加合物具有以下结构

在一些实施方案中，接头附接在非末端氨基酸残基(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸残基2-132中的任何一个，或SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-133中的任何一个，其中N-末端或C-末端已经被一个或更多个氨基酸残基延伸)处。在一些实施方案中，化学接头附接在IL-2多肽的非末端氨基酸残基处，其中IL-2多肽包含相对于SEQ ID NO:1的N-末端截短或C-末端截短。在一些实施方案中，化学接头附接至非末端氨基酸残基的侧链。

在一些实施方案中，接头在与IL-2受体(IL-2R)蛋白或亚单位相互作用的氨基酸残基处附接至IL-2多肽。在一些实施方案中，接头附接在与IL-2Rα亚单位(IL-2Rα)、IL-2Rβ亚单位(IL-2Rβ)或IL-2Rγ亚单位(IL-2Rγ)相互作用的氨基酸残基处。在一些实施方案中，化学接头附接在与IL-2Rα亚单位相互作用的氨基酸残基处。在一些实施方案中，化学接头附接在与IL-2Rβ亚单位相互作用的氨基酸残基处。在一些实施方案中，化学接头附接在与IL-2Rγ亚单位相互作用的氨基酸残基处。

在一些实施方案中，选择针对IL-2多肽的附接点，使得IL-2多肽与至少一个IL-2受体亚单位的相互作用被降低或阻断。在一些实施方案中，选择附接点，使得IL-2多肽与含有IL-2Rα受体亚单位的IL-2受体的相互作用不受影响或仅被略微减少。在一些实施方案中，选择附接点，使得IL-2多肽与IL-2β受体亚单位的相互作用被实质上减少。这样的残基的实例在美国公布第US2020/0231644A1号中提供，该公布特此通过引用并入，如同以其整体列出一样。在一些实施方案中，接头附接至IL-2多肽的位置8、9、11、12、15、16、18、19、20、22、23、26、81、84、87、88、91、92、94、95、116、119、120、123、125、126、127、130、131、132或133处的残基，其中残基位置编号是基于SEQ ID NO:1作为参考序列。在一些实施方案中，接头附接至IL-2多肽的位置8、9、12、15、16、19、20、22、23、26、84、88、95或126处的残基。在一些实施方案中，接头附接至位置8、9或16处的残基。在一些实施方案中，接头附接至IL-2多肽的位置22、26、88或126处的残基。在一些实施方案中，接头附接至IL-2多肽的位置15、20、84或95处的残基。在一些实施方案中，接头附接至IL-2多肽的位置12、19或23处的残基。在一些实施方案中，接头附接至位置22或26处的残基。在一些实施方案中，接头附接至IL-2多肽的位置35处的残基。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽能够扩增调节性T细胞(T_reg)、CD4+辅助性细胞、CD8+中央记忆性细胞、CD8+效应记忆性细胞、幼稚CD8+细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞群体或其组合。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽能够扩增调节性T细胞(T_reg)细胞群体。在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽不损害效应T细胞(T_eff)的扩增。

在一方面，本文描述了一种修饰的IL-2多肽，所述修饰的IL-2多肽对IL-2受体α亚单位比对SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽表现出更大的亲和力。在一些实施方案中，对IL-2受体a亚单位的亲和力通过解离常数(K_d)测量。如本文使用的，措辞“修饰的IL-2多肽/IL-2Rα亚单位的K_d”意指修饰的IL-2多肽与CD25结合相互作用的解离常数。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2受体α亚单位的K_d小于10nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2受体α亚单位的K_d小于10nM、小于7.5nM、小于5nM、小于4nM或小于3nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2受体α亚单位的K_d在约1nM和0.1nM之间。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2受体α亚单位的K_d在约10nM和约0.1nM之间。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2受体α亚单位的K_d在约10nM和约1nM之间。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2受体α亚单位的K_d在约7.5nM和约0.1nM之间。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2受体α亚单位的K_d在约7.5nM和约1nM之间。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2受体α亚单位的K_d在约5nM和约0.1nM之间。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽/IL-2受体α亚单位的K_d在约1nM和约1nM之间。在一些实施方案中，K_d通过表面等离子体共振测量。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2受体α亚单位比对SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽表现出至少约10％、50％、100％、250％或500％大的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2受体α亚单位比对SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽表现出至多约500％、750％或1000％大的亲和力。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2受体α亚单位比对SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽表现出约1.5倍至约10倍大的亲和力。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rα与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比表现出实质上相同的结合亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽表现出对IL-2Rα的K_d在对SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽和IL-2Rα之间的K_d的约2倍、约4倍、约6倍、约8倍或约10倍内。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2R受体β亚单位(IL-2Rβ)与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比表现出减少的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ表现出低至少约10倍、至少约25倍、至少约50倍、至少约100倍或至少约500倍的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ表现出低至少约100倍的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ没有表现出实质上的亲和力。在一些实施方案中，亲和力被测量为解离常数K_d(例如，较低亲和力与较高离解常数相关)。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rβ表现出为至少500nM、至少1000nM、至少5000nM、至少10000nM、至少50000nM或至少100000nM的结合亲和力。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Ra比其对IL-2Rb表现出更大的亲和力(例如，修饰的IL-2对IL-2Rα的k_d低于修饰的IL-2对IL-2Rβ的k_d)。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rα比其对IL-2Rβ表现出大至少约30倍、大至少约50倍、大至少约75倍、大至少约100倍、大至少约500倍或大至少约1000倍的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rα比其对IL-2Rβ表现出大至少约100倍的亲和力。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对IL-2Rα比其对IL-2Rβ表现出大至少约1000倍的亲和力。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相当(例如，大约相同)的半最大有效浓度(EC₅₀)。在一些实施方案中，T_reg细胞的激活通过评价与修饰的IL-2多肽接触时T细胞群体中STAT5磷酸化的改变来测量。在一些实施方案中，T_reg细胞通过是CD4⁺和FoxP3⁺来鉴定。在一些实施方案中，T_reg细胞还可通过显示CD25的表达升高(CD25^Hi)来鉴定。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有以下的EC₅₀：至多约100nM、至多约75nM、至多约50nM、至多约40nM、至多约35nM、至多约30nM或至多约25nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有以下的EC₅₀：至多约50nM、至多约40nM、至多约35nM、至多约30nM或至多约25nM、至多约20nM、至多约15nM、至多约10nM或至多约5nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有至多约100nM的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有至多约50nM的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有至多约25nM的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有以下的EC₅₀：约0.1nM至约100nM、约1nM至约100nM、约0.1nM至约50nM、约1nM至约50nM、约0.1nM至约25nM、约1nM至约25nM、约0.1nM至约10nM或约1nM至约10nM。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比大至多2倍、至多5倍、至多10倍、至多20倍、至多50倍、至多100倍、至多200倍、至多500倍或至多1000倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有大至多2倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有大至多5倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有大至多10倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有大至多50倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有大至多100倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有大至多200倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有大至多500倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有大至多1000倍的EC₅₀。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比实质上更大的半最大有效浓度(EC₅₀)。在一些实施方案中，T_eff细胞是CD8 T_eff细胞(例如，CD8⁺)、幼稚CD8细胞(例如，CD8⁺、CD45RA⁺)或CD4 Conv细胞(例如，CD4⁺、FoxP3^-)中的1、2或3种或其任何组合。在一些实施方案中，细胞的激活通过评价与修饰的IL-2多肽接触时T细胞群体中STAT5磷酸化的改变来测量。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有以下的EC₅₀：至少约10nM、至少约50nM、至少约100nM、至少约500nM、至少约1000nM、至少约2000nM、至少约3000nM、至少约4000nM或至少约5000nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有至少约100nM的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有至少约500nM的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有至少约1000nM的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有至少约5000nM的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比大至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有大至少10倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有大至少50倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有大至少100倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有大至少500倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有大至少1000倍的EC₅₀。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽表现出实质上更大的激活T_reg细胞(与T_eff细胞相比)的能力。在一些实施方案中，用于T_eff细胞类型的激活的EC50相比于用于T_reg细胞类型的激活的EC50的比是至少10、至少20、至少50、至少100、至少150、至少200、至少250或至少300。在一些实施方案中，用于T_eff细胞类型的激活的EC50相比于用于T_reg细胞类型的激活的EC50的比是至少100。在一些实施方案中，用于T_eff细胞类型的激活的EC50相比于用于T_reg细胞类型的激活的EC50的比是至少200。在一些实施方案中，用于T_eff细胞类型的激活的EC50相比于用于T_reg细胞类型的激活的EC50的比是至少300。在一些实施方案中，用于T_eff细胞类型的激活的EC50相比于用于T_reg细胞类型的激活的EC50的比是至少500。在一些实施方案中，用于T_eff细胞类型的激活的EC50相比于用于T_reg细胞类型的激活的EC50的比是至少1000。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽扩增调节性T细胞(T_reg细胞)的细胞群体。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_reg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_reg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少20％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_reg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少30％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_reg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少40％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_reg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少50％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_reg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少100％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_reg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少200％。在一些实施方案中，测量与未经Il-2多肽处理的样品或受试者相比的T_reg细胞的扩增。在一些实施方案中，测量与用SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽处理的样品或受试者相比的T_reg细胞的扩增。在一些实施方案中，测量与用SEQ ID NO:1和/或SEQ IDNO:2的IL-2多肽以与修饰的IL-2多肽相同剂量的IL-2多肽处理的样品或受试者相比的T_reg细胞的扩增。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相当的半最大有效浓度(EC₅₀)。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有以下的EC₅₀：至多约0.01nM、至多约0.05nM、至多约0.1nM、至多约0.5nM、至多约1nM、至多约5nM、至多约10nM、至多约50nM或至多约100nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有至多约0.01nM的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有至多约0.05nM的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有至多约0.1nM的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有至多约0.5nM的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有至多约1nM的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有以下的EC₅₀：约0.01nM至约100nM、约0.01nM至约50nM、0.01nM至约10nM、0.01nM至约5nM、0.01nM至约1nM、约0.01nM至约0.5nM或约0.01nM至约0.1nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_reg细胞的激活具有以下的EC₅₀：约0.05nM至约100nM、约0.05nM至约50nM、0.05nM至约10nM、0.05nM至约5nM、0.05nM至约1nM、约0.05nM至约0.5nM或约0.05nM至约0.1nM。

在一些实施方案中，本文提供的修饰的IL-2多肽不损害效应T细胞(T_eff细胞)群体的扩增。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_eff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至多1％、至多2％、至多5％、至多10％、至多15％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多100％或至多200％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽使T_eff细胞的细胞群体扩增了至多1％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽使T_eff细胞的细胞群体扩增了至多2％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽使T_eff细胞的细胞群体扩增了至多5％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽使T_eff细胞的细胞群体扩增了至多10％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽使T_eff细胞的细胞群体扩增了至多15％。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽使T_eff细胞的细胞群体扩增了至多20％。在一些实施方案中，测量与未经Il-2多肽处理的样品或受试者相比的T_eff细胞的扩增。在一些实施方案中，测量与用SEQ IDNO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽处理的样品或受试者相比的T_eff细胞的扩增。在一些实施方案中，测量与用SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽以与修饰的IL-2多肽相同剂量的IL-2多肽处理的样品或受试者相比的T_eff细胞的扩增。

在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比实质上更大的半最大有效浓度(EC₅₀)。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有以下的EC₅₀：至少约10nM、至少约50nM、至少约100nM、至少约500nM、至少约1000nM、至少约5000nM、至少约10000nM、至少约50000nM或至少约100000nM。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有至少约100000nM的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有至少约50000nM的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有至少约10000nM的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有至少约5000nM的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有至少约1000nM的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有与SEQ ID NO:1和/或SEQ ID NO:2的IL-2多肽相比大至少10倍、至少20倍、至少50倍、至少100倍、至少500倍或至少1000倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有大至少10倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有大至少50倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有大至少100倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有大至少500倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有大至少1000倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有大至少10000倍的EC₅₀。在一些实施方案中，修饰的IL-2多肽对于T_eff细胞的激活具有大至少100000倍的EC₅₀。

在一些实施方案中，由本文提供的修饰的IL-2多肽扩增的细胞群体是体外细胞群体、体内细胞群体或离体细胞群体。在一些实施方案中，细胞群体是体外细胞群体。在一些实施方案中，细胞群体是体内细胞群体。在一些实施方案中，细胞群体是离体细胞群体。细胞群体可以是CD4+辅助性细胞、CD8+中央记忆性细胞、CD8+效应记忆性细胞、幼稚CD8+细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞或其组合的群体。

在一些实施方案中，在注射修饰的IL-2多肽之后1小时测量细胞水平。在一些实施方案中，在注射修饰的IL-2多肽之后2小时测量细胞水平。在一些实施方案中，在注射修饰的IL-2多肽之后4小时测量细胞水平。在一些实施方案中，在注射修饰的IL-2多肽之后30分钟测量细胞水平。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽扩增调节性T细胞(T_reg细胞)的细胞群体。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_reg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少1％、至少2％、至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少100％或至少200％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_reg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少20％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_reg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少30％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_reg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少40％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_reg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少50％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_reg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少100％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_reg细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至少200％。

在一些实施方案中，本文描述的修饰的IL-2多肽扩增效应T细胞(T_eff细胞)的细胞群体。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_eff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至多5％、至多10％、至多20％、至多30％、至多40％、至多50％、至多75％、至多100％或至多500％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_eff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至多5％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_eff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至多20％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_eff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至多50％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_eff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至多100％。在一些实施方案中，当修饰的IL-2多肽与T_eff细胞的细胞群体接触时，修饰的IL-2多肽使该群体扩增了至多500％。

IL-7多肽

白细胞介素-7或具有与其类似活性的多肽(以下简称“IL-7”或“IL7”)是指能够促进由B细胞和T细胞介导的免疫应答的免疫刺激细胞因子。特别是，IL-7在适应性免疫系统中起着重要作用。IL-7主要由骨髓和胸腺中的基质细胞分泌，但其还由角质形成细胞、树突状细胞、肝细胞、神经元和上皮细胞产生。IL-7通过T细胞和B细胞的存活、发育和分化、淋巴细胞的存活、自然杀伤(NK)细胞的活性的刺激等激活免疫功能。IL-7可以通过淋巴组织诱导(LTi)细胞来调节淋巴结的发育，促进幼稚T细胞或记忆性T细胞的存活和分裂，维持幼稚T细胞或记忆性T细胞，并且通过诱导IL-2和干扰素-γ的分泌来增强人类的免疫应答。当生产用于药用目的的重组IL-7时，在与一般重组蛋白相比杂质增加、IL-7降解量以及可能不容易实现大规模生产方面存在问题。然而，由于合成IL-7的生产需要复杂的变性过程，制造过程并不容易。在本文描述的实施方案中利用的IL-7氨基酸序列的非限制性实例在下文的表8B中提供。在本文描述的缀合物中利用的IL-7多肽可以具有例如与表8B中的序列的任何一个(例如，SEQ ID NO:165-169或SEQ ID NO:186或SEQ ID NO:187中的任何一个)至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。SEQ ID NO:186是成熟人类IL-7的序列。除非另外说明，否则本文对IL-7残基位置的修饰(例如，聚合物或缀合手柄的取代或添加)的任何提及是指SEQ ID NO:186作为参考序列。

附接至抗体或抗原结合片段的IL-7多肽可以是本文描述的IL-7多肽中的任何一个(包括本文描述的合成IL-7多肽中的任何一个)。在一些实施方案中，本文提供的连接至抗体或抗原结合片段的IL-7多肽包含与SEQ ID NO:186中列出的序列具有至少约80％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-7多肽包含与SEQ ID NO:186中列出的序列具有至少约85％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-7多肽包含与SEQ ID NO:186中列出的序列具有至少约90％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，IL-7多肽包含与SEQ ID NO:186中列出的序列具有至少约95％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的IL-7多肽包含与SEQ ID NO:186中列出的序列具有至少约96％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的IL-7多肽包含与SEQ ID NO:186中列出的序列具有至少约97％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的IL-7多肽包含与SEQ ID NO:186中列出的序列具有至少约98％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的IL-7多肽包含与SEQ ID NO:186中列出的序列具有至少约99％序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本文提供的IL-7多肽包含与SEQ ID NO:186中列出的序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，IL-7多肽是合成IL-7多肽。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含位于氨基酸残基31-41中的任何一个中的高丝氨酸(Hse)残基，基于SEQ ID NO:186作为参考序列。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含位于氨基酸残基71-81中的任何一个中的Hse残基。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含位于氨基酸残基109-119中的任何一个中的Hse残基。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含1、2、3或更多个Hse残基。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含Hse36、Hse76、Hse114或其组合。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含Hse36、Hse76和Hse114。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含至少两个氨基酸取代，其中所述至少两个氨基酸取代选自(a)位于氨基酸残基31-41中的任何一个中的高丝氨酸(Hse)残基；(b)位于氨基酸残基71-81中的任何一个中的高丝氨酸残基；和(c)位于氨基酸残基109-119中的任何一个中的高丝氨酸残基。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含Hse36和Hse76。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含Hse36和Hse114。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含Hse76和Hse114。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含Hse36。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含Hse76。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含Hse114。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含1、2、3、4、5或更多个正亮氨酸(Nle)残基。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含位于残基12-22中的任何一个中的Nle残基。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含位于氨基酸残基22-32中的任何一个中的一个或更多个Nle残基。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含位于氨基酸残基49-59中的任何一个中的Nle残基。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含位于氨基酸残基64-74中的任何一个中的Nle残基。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含位于氨基酸残基142-152中的任何一个中的Nle残基。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含五个Nle取代。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含Nle17、Nle27、Nle54、Nle69和Nle147。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含SEQ ID NO:187。

在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含与SEQ ID NO:187至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成IL-7多肽由与SEQ ID NO:187的序列至少80％、85％、90％、95％、99％或100％相同的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含与SEQ ID NO:187的氨基酸序列至少约75％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含与SEQ ID NO:187的氨基酸序列至少约80％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含与SEQ ID NO:187的氨基酸序列至少约85％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含与SEQ ID NO:187的氨基酸序列至少约90％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含与SEQ ID NO:187的氨基酸序列至少约95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含与SEQ ID NO:187的氨基酸序列至少约96％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含与SEQ ID NO:187的氨基酸序列至少约97％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含与SEQ ID NO:187的氨基酸序列至少约98％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含与SEQ ID NO:187的氨基酸序列至少约99％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含与SEQ ID NO:187的氨基酸序列相同的氨基酸序列。

在一些实施方案中，合成IL-7多肽包含与SEQ ID NO:186至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列。在一些实施方案中，合成IL-7多肽由与SEQ ID NO:186的序列至少80％、85％、90％或95％相同的氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，接头在氨基酸残基处附接至IL-7多肽。在一些实施方案中，化学接头附接在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-152中的任何一个(例如，SEQ ID NO:1的氨基酸残基1-152中的任何一个)的氨基酸残基处。

在一些实施方案中，接头附接至IL-7多肽的末端氨基酸残基。在一些实施方案中，接头附接至IL-7多肽的N-末端残基或C-末端残基。在一些实施方案中，接头附接至IL-7多肽的N-末端氨基基团或IL-7多肽的C-末端羧基基团。在一些实施方案中，N-末端残基是对应于SEQ ID NO:1的位置1的残基。在一些实施方案中，IL-7多肽包含来自SEQ ID NO:1的N-末端的一个或更多个氨基酸残基的截短(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸残基的缺失)，并且接头附接至现在包含N-末端的残基(例如，对于一个氨基酸的截短，接头附接至对应于SEQ ID NO:1的残基2的位置处的残基)。在一些实施方案中，IL-7多肽包含来自SEQ ID NO:1的C-末端的一个或更多个氨基酸残基的截短(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个氨基酸残基的缺失)，并且接头附接至现在包含C-末端的残基(例如，对于一个氨基酸的截短，接头附接至对应于SEQ ID NO:1的残基151的位置处的残基)。

在一些实施方案中，接头附接至IL-7多肽的N-末端氨基酸残基。在一些实施方案中，接头附接至IL-7多肽的N-末端氨基基团。在一些实施方案中，通过与附接至具有以下结构的N-末端氨基基团的加合物反应，接头附接至IL-7多肽的N-末端氨基基团

在一些实施方案中，IL-7多肽包含附接至一个或更多个残基的缀合手柄，以促进接头至与PD-1选择性结合的多肽的附接。缀合手柄可以是本文提供的任何这样的缀合手柄，并且可以附接在接头可以被附接的任何残基处。在一些实施方案中，缀合手柄附接至多肽的N-末端残基。在一些实施方案中，缀合手柄包括叠氮化物或炔烃。

在一些实施方案中，本文描述的IL-7多肽能够扩增CD4+辅助性细胞、CD8+中央记忆性细胞、CD8+效应记忆性细胞、幼稚CD8+细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞群体或其组合。在一些实施方案中，如本文描述的合成IL-7多肽能够扩增CD4+辅助性细胞、CD8+中央记忆性细胞、CD8+效应记忆性细胞、幼稚CD8+细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞群体或其组合。在一些实施方案中，本文描述的IL-7多肽能够扩增或诱导CD8幼稚细胞、CD4幼稚细胞、CD8记忆性细胞、CD4记忆性细胞或CD4 Treg细胞或其任何组合中的STAT5磷酸化。在一些实施方案中，如本文提供的合成IL-7多肽能够以与重组或野生型IL-7多肽类似或实质上相同的方式扩增或激活一种或更多种T细胞亚型(例如，表现出比对应的重组IL-7多肽大不多于100倍(no more than 100-fold greater than)的EC50，或大不多于10倍的EC50)。

在一些实施方案中，合成IL-7多肽对于在至少一种T细胞亚型中诱导STAT5磷酸化表现出与对应的野生型或重组IL-7相当的半最大有效浓度(EC50)。在一些实施方案中，合成IL-7对于在至少一种T细胞亚型中诱导STAT5磷酸化的EC50比对应的重组IL-7的EC50大不多于2倍、大不多于3倍、大不多于4倍、大不多于5倍、大不多于6倍、大不多于7倍、大不多于8倍、大不多于9倍、大不多于10倍、大不多于20倍、大不多于50倍或大不多于100倍。在一些实施方案中，T细胞亚型是CD8幼稚细胞、CD4幼稚细胞、CD8记忆性细胞、CD4记忆性细胞或CD4 Treg细胞。在一些实施方案中，T细胞亚型是CD8幼稚细胞、CD4幼稚细胞、CD8记忆性细胞、CD4记忆性细胞和CD4 Treg细胞中的每一种。

在一些实施方案中，缀合至与PD-1特异性结合的多肽的IL-7多肽对于在至少一种T细胞亚型中诱导STAT5磷酸化表现出与当附接至与PD-1特异性结合的多肽时的野生型IL-7相当的半最大有效浓度(EC50)。在一些实施方案中，IL-7对于在至少一种T细胞亚型中诱导STAT5磷酸化的EC50比野生型IL-7的EC50大不多于2倍、大不多于3倍、大不多于4倍、大不多于5倍、大不多于6倍、大不多于7倍、大不多于8倍、大不多于9倍、大不多于10倍、大不多于20倍、大不多于50倍或大不多于100倍。在一些实施方案中，T细胞亚型是CD8幼稚细胞、CD4幼稚细胞、CD8记忆性细胞、CD4记忆性细胞或CD4 Treg细胞。在一些实施方案中，T细胞亚型是CD8幼稚细胞、CD4幼稚细胞、CD8记忆性细胞、CD4记忆性细胞和CD4 Treg细胞中的每一种。

在一些实施方案中，缀合至与PD-1特异性结合的多肽的IL-7多肽对于在至少一种T细胞亚型中诱导STAT5磷酸化表现出未缀合的IL-7多肽的半最大有效浓度(EC50)(例如，将IL-7多肽附接至与PD-1特异性结合的多肽不会实质上降低IL-7多肽的活性)。在一些实施方案中，IL-7对于在至少一种T细胞亚型中诱导STAT5磷酸化的EC50比未缀合的IL-7的EC50大不多于2倍、大不多于3倍、大不多于4倍、大不多于5倍、大不多于6倍、大不多于7倍、大不多于8倍、大不多于9倍、大不多于10倍、大不多于20倍、大不多于50倍或大不多于100倍。在一些实施方案中，T细胞亚型是CD8幼稚细胞、CD4幼稚细胞、CD8记忆性细胞、CD4记忆性细胞或CD4 Treg细胞。在一些实施方案中，T细胞亚型是CD8幼稚细胞、CD4幼稚细胞、CD8记忆性细胞、CD4记忆性细胞和CD4 Treg细胞中的每一种。

IL-18多肽

在用抗原加IL-12刺激之后，幼稚T细胞发育为表达IL-18受体(IL-18R)的Th1细胞，这些细胞响应于IL-18刺激增加IFN-γ的产生。IL-18是促进1型应答的促炎性细胞因子。在没有IL-12但有IL-2的情况下，IL-18刺激NK细胞、CD4⁺NKT细胞和已建立的Th1细胞产生IL-3、IL-9和IL-13。伴随着IL-3，IL-18刺激肥大细胞和嗜碱性粒细胞产生IL-4、IL-13和化学介质(例如，组胺)。IL-18是细胞因子IL-1家族的成员。鼠和人类IL-18蛋白分别由192和193个氨基酸组成。IL-18作为无生物活性的前体pro-IL-18产生，它缺乏信号肽并且需要蛋白水解加工才能变得有活性。pro-IL-18或pro-IL-1β的裂解主要依赖于NLRP3炎性体中细胞内半胱氨酸蛋白酶胱天蛋白酶-1的作用。IL-18受体(IL-18R)由诱导型组分IL-18Rα(IL-1受体相关蛋白[IL-1Rrp])和组成型表达组分IL-18Rβ(IL-1R辅助蛋白样[IL-1RAcPL])组成。IL-18Rα和IL-18Rβ的细胞质结构域含有称为Toll样受体(TLR)/IL-1R(TIR)结构域的共同的结构域。在用IL-18刺激后，IL-18Rα与IL-18Rβ形成高亲和力的异二聚体复合物，其介导细胞内信号转导。受体复合物的细胞质TIR结构域经由TIR-TIR相互作用与含有TIR结构域的信号衔接子髓系分化初级应答蛋白88(myeloid differentiation primaryresponse 88，MyD88)相互作用。然后，MyD88诱导的事件导致核因子(NF)-κB和丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)经由分别与信号衔接子IL-1R相关激酶(IRAK)1-4和肿瘤坏死因子(TNF)受体激活因子(TRAF)6关联而激活，这最终导致适当的基因表达，诸如Ifng、Tnfa、Cd40l和FasL。在本文描述的实施方案中利用的IL-18氨基酸序列的非限制性实例在下文的表8C中提供。在本文描述的缀合物中利用的IL-18多肽可以具有例如与表8C中的序列的任何一个至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

抗体活性的保留

在一些实施方案中，本文提供的免疫缀合物组合物(例如，通过接头附接至IL-2多肽的与抗原或抗原结合片段结合的多肽(例如，抗CD20抗体，诸如利妥昔单抗))在两个基团之间形成连键之后维持与组分中的至少一种关联的结合亲和力。在一些实施方案中，例如，在包含与IL-2多肽连接的抗体或抗原结合片段的免疫缀合物组合物中，抗体或其抗原结合片段保留与一种或更多种Fc受体的结合。在一些实施方案中，与未缀合的抗体相比，组合物展示出与一种或更多种Fc受体的结合减少不多于约5倍、不多于约10倍、不多于约15倍或不多于约20倍。在一些实施方案中，一种或更多种Fc受体是FcRn受体、CD16a、FcγRI受体(CD64)、FcγRIIa受体(CD32α)、FcγRIIβ受体(CD32β)或其任何组合。在一些实施方案中，与未缀合的抗体相比，组合物与FcRn受体、CD16a、FcγRI受体(CD64)、FcγRIIa受体(CD32α)和FcγRIIβ受体(CD32β)中每一种的结合减少不多于约10倍。

在一些实施方案中，与抗原或抗原结合片段结合的多肽(例如，抗体)的结合实质上不受与蛋白(例如，细胞因子)缀合的影响。在一些实施方案中，与未缀合的抗体相比，抗体或抗原结合片段与抗原的结合减少不多于约5％。在一些实施方案中，与未缀合的抗体或抗原结合片段相比，抗体或抗原结合片段与抗原或的结合亲和力减少不多于约1.1倍、1.2倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍或10倍。

正交有效载荷

本公开内容的抗原/抗原结合片段-蛋白(例如，细胞因子)免疫缀合物可以包含双重正交有效载荷。用于制备具有双重正交有效载荷的免疫缀合物的示例性方法在图16中示出。与本文提供的免疫缀合物相容的多于一个示例性双重正交有效载荷在图17中示出。在一种非限制性情况下，抗原/抗原结合片段-细胞因子免疫缀合物可以包含一个抗原或抗原结合片段、一个修饰的细胞因子和一个通过正交连接基团与抗原或抗原结合片段连接的有效载荷。正交有效载荷可以是氨基酸、氨基酸衍生物、肽、蛋白、细胞因子、烃基基团、芳基或杂芳基基团、治疗性小分子药物、聚乙二醇(PEG)部分、脂质、糖、生物素、生物素衍生物、脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)或肽核酸(PNA)，其中任何一种是取代的、未取代的、修饰的或未修饰的。在一些实施方案中，正交有效载荷是治疗性小分子。在一些实施方案中，正交有效载荷是PEG部分。在一些实施方案中，正交有效载荷是另外的细胞因子，诸如，例如，IL-7或IL-18。

组合物

在一方面，本文描述了一种药物组合物，所述药物组合物包含：连接至本文描述的修饰的细胞因子的抗体或抗原结合片段；和药学上可接受的载体或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物还包含一种或更多种赋形剂，其中一种或更多种赋形剂包括但不限于，选自糖类、无机盐、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂或其任何组合。在一些实施方案中，药物组合物还包含一种、两种、三种、四种、五种、六种、七种、八种、九种、十种或更多种赋形剂，其中一种或更多种赋形剂包括但不限于糖类、无机盐、抗氧化剂、表面活性剂、缓冲剂或其任何组合。

在一些实施方案中，药物组合物还包含糖类。在某些实施方案中，糖类选自由以下组成的组：果糖、麦芽糖、半乳糖、葡萄糖、D-甘露糖、山梨糖、乳糖、蔗糖、海藻糖、纤维二糖、棉子糖、松三糖、麦芽糖糊精、右旋糖酐、淀粉、甘露醇、木糖醇、麦芽糖醇、乳糖醇、木糖醇、山梨醇(葡糖醇)、吡喃糖山梨醇、肌醇、环糊精及其组合。

可选地或另外地，药物组合物还包含无机盐。在某些实施方案中，无机盐选自由以下组成的组：氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、磷酸钠、磷酸钾、硫酸钠或其组合。

可选地或另外地，药物组合物还包含抗氧化剂。在某些实施方案中，抗氧化剂选自由以下组成的组：抗坏血酸棕榈酸酯、丁基羟基茴香醚、丁基羟基甲苯、焦亚硫酸钾、没食子酸丙酯、焦亚硫酸钠、硫代硫酸钠、维生素E、3,4-二羟基苯甲酸及其组合。

可选地或另外地，药物组合物还包含表面活性剂。在某些实施方案中，表面活性剂选自由以下组成的组：聚山梨醇酯、失水山梨醇酯、脂质、磷脂、磷脂酰乙醇胺、脂肪酸、脂肪酸酯、类固醇、EDTA、锌及其组合。

可选地或另外地，药物组合物还包含缓冲剂。在某些实施方案中，缓冲剂选自由以下组成的组：柠檬酸、磷酸钠、磷酸钾、乙酸、乙醇胺、组氨酸、氨基酸、酒石酸、琥珀酸、富马酸、乳酸、tris、HEPES或其组合。

在一些实施方案中，药物组合物被配制为用于肠胃外或肠内施用。在一些实施方案中，药物组合物被配制为用于静脉内(IV)或皮下施用。在一些实施方案中，药物组合物呈冻干形式。

在一方面，本文描述了一种液体或冻干组合物，所述液体或冻干组合物包含连接至修饰的细胞因子的抗原或抗原结合片段。在一些实施方案中，连接至修饰的细胞因子的抗原或抗原结合片段是冻干粉末。在一些实施方案中，将冻干粉末重悬于缓冲溶液中。在一些实施方案中，缓冲溶液包含缓冲剂、糖、盐、表面活性剂或其任何组合。在一些实施方案中，缓冲溶液包含磷酸盐。在一些实施方案中，磷酸盐是Na₂HPO₄。在一些实施方案中，盐是氯化钠。在一些实施方案中，缓冲溶液包括磷酸盐缓冲盐水。在一些实施方案中，缓冲溶液包含甘露醇。在一些实施方案中，将冻干粉末悬浮于包含约10mM Na₂HPO₄缓冲剂、约0.022％SDS和约50mg/mL甘露醇并具有约7.5的pH的溶液中。

剂型

连接至本文描述的修饰的细胞因子的抗原或抗原结合片段可以呈多种剂型。在一些实施方案中，连接至细胞因子的抗原或抗原结合片段作为重构的冻干粉末给药。在一些实施方案中，连接至修饰的细胞因子的抗原或抗原结合片段作为悬浮液给药。在一些实施方案中，连接至修饰的细胞因子的抗原或抗原结合片段作为溶液给药。在一些实施方案中，连接至修饰的细胞因子的抗原或抗原结合片段作为可注射溶液给药。在一些实施方案中，连接至修饰的细胞因子的抗原或抗原结合片段作为IV溶液给药。

治疗方法

本文设想了用缀合物治疗受试者的癌症或其转移或炎性紊乱的方法。缀合物可以是本文描述的缀合物。在这样的缀合物中，抗体或抗原结合片段与例如癌症抗原、免疫细胞靶分子、自身抗原或其组合选择性结合。

癌症抗原可以是，例如，细胞程序性死亡1(PD1)、细胞程序性死亡配体1(PDL1)、CD5、CD20、CD19、CD22、CD30、CD33、CD40、CD44、CD52、CD74、CD103、CD137、CD123、CD152、癌胚抗原(CEA)、整联蛋白、表皮生长因子(EGF)受体家族成员、血管表皮生长因子(VEGF)、蛋白聚糖、二唾液酸神经节苷脂、B7-H3、癌症抗原125(CA-125)、上皮细胞黏附分子(EpCAM)、血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2、肿瘤相关糖蛋白、黏蛋白1(MUC1)、肿瘤坏死因子受体、胰岛素样生长因子受体、叶酸受体α、跨膜糖蛋白NMB、C-C趋化因子受体、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体型酪氨酸蛋白激酶(recepteur d'origine nantais，RON)受体、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、结肠癌抗原19.9、胃癌黏蛋白抗原4.2、结直肠上皮癌抗原A33、ADAM-9、AFP癌胎抗原-甲胎蛋白、ALCAM、BAGE、β-连环蛋白、羧肽酶M、B1、CD23、CD25、CD27、CD28、CD36、CD45、CD46、CD52、CD56、CD79a/CD79b、CD317、CDK4、CO-43(血型Le^b)、CO-514(血型Le^a)、CTLA-1、细胞角蛋白8、DR5、E1系列(B血型)、Ephrin受体A2(EphA2)、Erb(ErbB1、ErbB3、ErbB4)、肺腺癌抗原F3、抗原FC10.2、GAGE-1、GAGE-2、GD2/GD3/GD49/GM2/GM3、GICA19-9、gp37、gp75、gp100、HER-2/neu、人类乳脂球抗原、人类乳头瘤病毒-E6/人类乳头瘤病毒-E7、高分子量黑素瘤抗原(HMW-MAA)、分化抗原(I抗原)、存在于胃腺癌中的I(Ma)、整联蛋白α-V-β-6、整联蛋白β6(ITGβ6)、白细胞介素-13受体α2(IL13Rα2)、JAM-3、KID3、KID31、KS1/4泛上皮癌抗原、KSA(17-1A)、人类肺上皮癌抗原L6、人类肺上皮癌抗原L20、LEA、LUCA-2、M1:22:25:8、M18、M39、MAGE-1、MAGE-3、MART、Myl、MUM-1、N-乙酰葡糖胺基转移酶、新糖蛋白、NS-10、OFA-1和OFA-2、制瘤素M(制瘤素受体β)、rho15、前列腺特异性抗原(PSA)、PSMA、多态性上皮黏蛋白抗原(PEMA)、PIPA、前列腺酸性磷酸酯、R24、ROR1、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、sTn、T细胞受体衍生肽、T5A7、组织抗原37、TAG-72、TL5(血型A)、TNF-α受体(TNFαR)、TNFβR、TNFγR、TRA-1-85(血型H)、转铁蛋白受体、TSTA肿瘤特异性移植抗原、VEGF-R、Y半抗原、Le^y、5T4或其组合。

免疫细胞靶分子可以是，例如，PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、CD28、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、ICOS配体、ICOS、B7-H3、B7-H4、VISTA、B7-H7(HHLA2)、TMIGD2、4-1BBL、4-1BB、HVEM、BTLA、CD160、LIGHT、MHC I类、MHC II类、LAG3、OX40L、OX40、CD70、CD27、CD40、CD40L、GITRL、GITR、CD155、DNAM-1、TIGIT、CD96、CD48、2B4、半乳凝素-9、TIM-3、腺苷、腺苷A2a受体、IDO、TDO、CEACAM1、CD47、SIRPα、BTN2A1、DC-SIGN、CD200、CD200R、TL1A、DR3或其组合。

自身抗原可以是，例如，肿瘤坏死因子α(TNFα)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白(PLP)、II型胶原(CII)、波形蛋白、α-烯醇酶、簇集素、组蛋白、肽基精氨酸脱亚胺酶-4、转谷氨酰胺酶2(TG2、TGM2)、CD318、肽聚糖识别蛋白1(PGLYRP1)或其组合。

在一方面，本文描述了一种治疗有相应需要的受试者的癌症或其转移的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的连接至如本文描述的修饰的细胞因子的抗原或抗原结合片段(例如，与PD-1、PD-L1、CD20等选择性结合的多肽)或药物组合物。

在一方面，本文描述了一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的如本文描述的抗体/抗原结合片段修饰的细胞因子缀合物或药物组合物。在一些实施方案中，癌症是实体癌症。癌症或肿瘤可以是例如原发性癌症或肿瘤或转移性癌症或肿瘤。待治疗的癌症和肿瘤包括但不限于黑素瘤、肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)等)、上皮癌(例如，皮肤鳞状细胞上皮癌(CSCC)、尿路上皮癌(UC)、肾细胞上皮癌(RCC)、肝细胞上皮癌(HCC)、头颈部鳞状细胞上皮癌(HNSCC)、食管鳞状细胞上皮癌(ESCC)、胃食管接合部(GEJ)上皮癌、子宫内膜上皮癌(EC)、Merkel细胞上皮癌(MCC)等)、膀胱癌(BC)、微卫星不稳定性高(MSI-H)/错配修复缺陷(dMMR)实体瘤(例如，结肠直肠癌(CRC))、肿瘤突变负荷高(TMB-H)实体瘤、三阴性乳腺癌(TNBC)、胃癌(GC)、宫颈癌(CC)、胸膜间皮瘤(PM)、经典霍奇金淋巴瘤(cHL)或原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。

在另一方面，本文描述了一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的如本文描述的抗体/抗原结合片段修饰的细胞因子缀合物或药物组合物。在一些实施方案中，癌症是实体癌症。癌症或肿瘤可以是例如原发性癌症或肿瘤或转移性癌症或肿瘤。待治疗的癌症和肿瘤包括但不限于黑素瘤、肺癌(例如，非小细胞肺癌(NSCLC)、小细胞肺癌(SCLC)等)、上皮癌(例如，皮肤鳞状细胞上皮癌(CSCC)、尿路上皮癌(UC)、肾细胞上皮癌(RCC)、肝细胞上皮癌(HCC)、头颈部鳞状细胞上皮癌(HNSCC)、食管鳞状细胞上皮癌(ESCC)、胃食管接合部(GEJ)上皮癌、子宫内膜上皮癌(EC)、Merkel细胞上皮癌(MCC)等)、膀胱癌(BC)、微卫星不稳定性高(MSI-H)/错配修复缺陷(dMMR)实体瘤(例如，结肠直肠癌(CRC))、肿瘤突变负荷高(TMB-H)实体瘤、三阴性乳腺癌(TNBC)、胃癌(GC)、宫颈癌(CC)、胸膜间皮瘤(PM)、经典霍奇金淋巴瘤(cHL)或原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)。

可选地或另外地，本文描述了一种治疗有相应需要的受试者的癌症的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的如本文描述的抗体/抗原结合片段修饰的细胞因子缀合物或药物组合物。癌症可以是原发性癌症或转移性癌症。在一些实施方案中，癌症是实体癌症或血液癌症。在一些情况下，待治疗的癌症包括CD20阳性淋巴瘤。待治疗的淋巴瘤包括但不限于霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤或其组合。可选地或另外地，待治疗的癌症包括CD20阳性白血病。待治疗的白血病包括但不限于慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)或其组合。可选地或另外地，待治疗的癌症包括CD20阳性骨髓瘤。骨髓瘤包括但不限于多发性骨髓瘤。可选地或另外地，待治疗的癌症包括CD20阳性胸腺瘤。可选地或另外地，待治疗的癌症包括CD20阳性黑素瘤。

可选地或另外地，本文描述了一种治疗有相应需要的受试者的自身免疫性疾病的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的如本文描述的抗体/抗原结合片段修饰的细胞因子缀合物或药物组合物。在一些实施方案中，自身免疫性疾病包括多发性硬化(MS)、类风湿性关节炎(RA)、肉芽肿性多血管炎(GPA)、(韦格纳肉芽肿病)、显微镜下多血管炎(MPA)、寻常性天疱疮(PV)或其组合。

可选地或另外地，本文描述了一种治疗有相应需要的受试者的炎性紊乱的方法，所述方法包括：向所述受试者施用有效量的如本文描述的抗体/抗原结合片段修饰的细胞因子缀合物或药物组合物。在一些实施方案中，炎性紊乱包括炎症(例如，软骨炎症)、自身免疫性疾病、特应性疾病、副肿瘤性自身免疫性疾病、关节炎、类风湿性关节炎(例如，活动性)、幼年型关节炎、幼年型特发性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、少关节类风湿性关节炎(pauciarticular rheumatoid arthritis)、少关节幼年型类风湿性关节炎、多关节幼年型类风湿性关节炎(polyarticular juvenile rheumatoid arthritis)、全身性发作幼年型类风湿性关节炎、幼年型银屑病关节炎、银屑病关节炎、多关节类风湿性关节炎、全身性发作类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、幼年型强直性脊柱炎、幼年型肠病性关节炎、反应性关节炎、幼年型反应性关节炎、Reiter综合征、幼年型Reiter综合征、幼年型皮肌炎、幼年型硬皮病、幼年型血管炎、肠病性关节炎、SEA综合征(血清阴性、肌腱端病(Enthesopathy)、关节病综合征)、皮肌炎、银屑病关节炎、硬皮病、血管炎、肌炎、多肌炎、皮肌炎、结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿病、动脉炎、风湿性多肌痛、结节病、硬化、原发性胆汁性硬化、硬化性胆管炎、干燥综合征、银屑病、斑块状银屑病、滴状银屑病、反转型银屑病、脓疱性银屑病、红皮病银屑病、皮炎、特应性皮炎、疱疹样皮炎、白塞氏病、脱发、斑秃、全秃、动脉粥样硬化、狼疮、斯蒂尔病、重症肌无力、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、哮喘、COPD、鼻窦炎、鼻窦炎伴鼻息肉、嗜酸性粒细胞食道炎、嗜酸性粒细胞支气管炎、格林-巴利病、甲状腺炎(例如，格雷夫斯病)、艾迪生氏病、雷诺现象、自身免疫性肝炎、移植物抗宿主病、类固醇难治性慢性移植物抗宿主病、移植排斥反应(例如，肾、肺、心脏、皮肤等)、肾损伤、丙型肝炎诱导的血管炎、自发流产、白癜风、局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、微小病变疾病、膜性肾病、ANCA相关肾小球肾病、膜增生性肾小球肾炎、IgA肾病、狼疮性肾炎或其组合。

本文描述的缀合物可以以一种或更多种剂量向受试者施用。在一些实施方案中，缀合物以有效量的修饰的蛋白(例如，修饰的细胞因子)的单剂量施用，包括另外的实施方案，其中(i)缀合物被每天一次施用；或(ii)缀合物在一天跨度内向受试者施用多于一次。在一些实施方案中，缀合物被每天一次、每隔一天一次、每周3次、每周一次、每2周一次、每3周一次、每4周一次、每5周一次、每3天一次、每4天一次、每5天一次、每6天一次、每周两次、每周3次、每周4次、每周5次、每周6次、每月一次、每月两次、每月3次、每2个月一次、每3个月一次、每4个月一次、每5个月一次或每6个月一次施用。施用包括但不限于通过任何合适的途径注射(例如，肠胃外、肠内、静脉内、皮下等)。

当受试者经历疾病的病征或症状的部分或全部缓解或减轻并特别地包括但不限于存活期的延长时，实现了有效响应。取决于包括复发次数、疾病分期和其他因素的预后因素，预期的无进展存活时间可以以数月至数年测量。延长存活期包括但不限于至少1个月(mo)、约至少2个月、约至少3个月、约至少4个月、约至少6个月、约至少1年、约至少2年、约至少3年、约至少4年、约至少5年等的时间。总存活期或无进展存活期也可以以数月至数年来测量。可选地，有效响应可以是受试者的症状保持不变，且不恶化。治疗适应症的进一步指示在下文更详细地描述。在一些情况下，癌症或肿瘤被减少至少2％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％。

本文设想了与一种或更多种另外的活性剂的组合疗法。例如，缀合物可以与以下一种或更多种药物组合施用：改变疾病的抗风湿药物(DMARD)、非甾体抗炎药(NSAID)、氨基水杨酸类(含有5-氨基水杨酸(5-ASA)的化合物)、皮质类固醇、抗IL12抗体或Janus激酶(JAK)抑制剂。在一些情况下，DMARD是甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、羟化氯喹、来氟米特、硫唑嘌呤等。在一些情况下，5-ASA药物是柳氮磺胺吡啶美沙拉嗪(例如，HD、/>LIALDA^TM、/>DELZICOL^Tw等)、奥沙拉嗪巴柳氮/>等。在一些情况下，JAK抑制剂是Janus激酶1(JAK1)抑制剂、Janus激酶2(JAK2)抑制剂、Janus激酶3(JAK3)抑制剂或其组合。在一些情况下，抗IL12抗体包括乌司奴单抗(ustekinumab)(/>；抗IL12/IL23)。在一些情况下，皮质类固醇包括糖皮质激素，诸如，例如，氢化可的松/>可的松、ethamethasoneb(Celestone Soluspan(倍他米松磷酸钠和醋酸倍他米松)、泼尼松(Prednisone Intensol)、泼尼松龙(/>、Prelone)、曲安西龙(AristospanIntra-Articular、Aristospan Intralesional、Kenalog)、乙基泼尼松龙(Medrol、Depo-Medrol、Solu-Medrol)、地塞米松等。在一些情况下，NSAID是阿司匹林、塞来考昔(等)、双氯芬酸(/>、/>、/>-XR、/>、等)、布洛芬(/>、/>等)、吲哚美辛(/>等)、萘普生(等)、奥沙普嗪(/>等)、吡罗昔康(/>等)或其组合。其他适当的组合，诸如手术、化疗、放疗、物理疗法、心理疗法等包括在本文中。

制备方法

在一方面，本文描述了一种制备组合物的方法，所述方法包括提供抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含反应性基团(例如，缀合手柄)，使所述反应性基团与附接至细胞因子的互补反应性基团接触，并且形成组合物。所得组合物是本文提供的组合物中的任何一种。

在一些实施方案中，提供包含反应性基团的抗体或抗原结合片段包括将反应性基团附接至抗体或抗原结合片段。在一些实施方案中，反应性基团被位点特异性添加。在一些实施方案中，将反应性基团附接至抗体或抗原结合片段包括使抗体或抗原结合片段与包含与抗体或抗原结合片段的特定残基形成键的反应性官能团的亲和基团接触。在一些实施方案中，将反应性基团附接至抗体或抗原结合片段包括使抗体或抗原结合片段与酶接触。在一些实施方案中，酶被配置为将反应性基团位点特异性附接至抗体或抗原结合片段的特异性残基。在一些实施方案中，酶是糖基化酶或转谷氨酰胺酶。

在一些实施方案中，方法还包括将互补反应性基团附接至细胞因子。在一些实施方案中，将互补反应性基团附接至细胞因子包括化学合成细胞因子。

在一些实施方案中，方法包括制备修饰的细胞因子。在一些实施方案中，制备修饰的细胞因子的方法包括合成修饰的细胞因子的两种或更多种片段并连接所述片段。在一些实施方案中，制备修饰的细胞因子的方法包括a.合成修饰的细胞因子的两种或更多种片段，b.连接所述片段；并且c.使所连接的片段折叠。

在一些实施方案中，修饰的细胞因子的两种或更多种片段被化学合成。在一些实施方案中，修饰的IL细胞因子的两种或更多种片段通过固相肽合成来合成。在一些实施方案中，修饰的IL细胞因子的两种或更多种片段在自动化肽合成仪上合成。

在一些实施方案中，修饰的细胞因子从2种、3种、4种、5种、6种、7种、8种、9种、10种或更多种肽片段连接。在一些实施方案中，修饰的细胞因子从2种肽片段连接。在一些实施方案中，修饰的细胞因子从3种肽片段连接。在一些实施方案中，修饰的IL细胞因子从4种肽片段连接。在一些实施方案中，修饰的IL细胞因子从2至10种肽片段连接。

在一些实施方案中，修饰的细胞因子的两种或更多种片段被连接在一起。在一些实施方案中，修饰的细胞因子的三种或更多种片段以顺序方式连接。在一些实施方案中，修饰的IL细胞因子的三种或更多种片段以一锅反应连接。

在一些实施方案中，使连接的片段折叠。在一些实施方案中，折叠包括在修饰的细胞因子内形成一个或更多个二硫键。在一些实施方案中，连接的片段经历折叠过程。在一些实施方案中，连接的片段使用本领域熟知的方法折叠。在一些实施方案中，连接的多肽或折叠的多肽通过在其上附接一种或更多种聚合物来进一步修饰。在一些实施方案中，连接的多肽或折叠的多肽通过PEG化来进一步修饰。在一些实施方案中，修饰的IL细胞因子是合成的。在一些实施方案中，修饰的IL细胞因子是重组的。

示例性细胞因子的序列(SEQ ID NO)

表8A(IL-2多肽)

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在以上表8A中，Nle是正亮氨酸残基，并且Hse是高丝氨酸残基。另外地，以上表8A提及几种IL-2变体，它们含有“具有戊二酸和0.5kDa叠氮基PEG的N-末端”。为了清楚起见，意图当对应的分子被与SEQ ID NO关联的CMP号提及时，该修饰被包括在内，但是该修饰不被认为是氨基酸序列的一部分。

表8B(IL-7多肽)

表8C(IL-18多肽)

尽管已经详细描述了本公开内容及其优点，但应当理解，本文可以进行各种变化、替代和改变，而不偏离如所附权利要求书中限定的本公开内容的精神和范围。

本公开内容在以下实施例中进一步说明，这些实施例仅为了说明目的而提供，并不意图以任何方式限制本公开内容。

实施例

实施例1：抗体/蛋白缀合物的制备。

与蛋白(包括化学合成的蛋白，诸如本文提供的细胞因子)缀合的抗体利用衍生自AJICAP^TM技术(Ajinomoto Bio-Pharma Services)的修改的方法制备。AJICAP^TM技术至少在以下中描述：PCT公布第WO2018199337A1号、PCT公布第WO2019240288A1号、PCT公布第WO2019240287A1号、PCT公布第WO2020090979A1号，Matsuda等人，Mol.Pharmaceutics2021,18,4058-4066，和Yamada等人,AJICAP:Affinity Peptide MediatedRegiodivergent Functionalization of Native Antibodies.Angew.Chem.,Int.Ed.2019,58,5592-5597，并且特别地美国专利公布第US20200190165A1号的实施例2-4中。其中公开的用于制备用于与蛋白或合成蛋白缀合的修饰的抗体的方法的简要概述如下：

包含DBCO缀合手柄的修饰的抗体(例如，单克隆抗体诸如帕博利珠单抗、LZM-009、度伐利尤单抗、利妥昔单抗等)利用例如美国专利申请第US20200190165A1号的实施例2-4中描述并且由其衍生的方法制备。

简言之，具有附接至Fc区赖氨酸残基侧链的游离巯基的抗体通过使抗体与被配置为将受保护形式的巯基基团(例如，硫酯或可还原的二硫化物)递送至赖氨酸残基的亲和肽接触来制备。能够进行该反应的示例性肽如下文所示，如在Matsuda等人，Mol.Pharmaceutics 2021,18,4058-4066中报道的，该肽经由NHS酯将巯基基团选择性附接在抗体的Fc区的残基K248处：

靶向Fc区的可选残基的可选亲和肽在以上引用的关于AJICAP^TM技术的参考文献中描述，并且这样的亲和肽可以用于将期望的官能团附接至Fc区的可选残基(例如，K246、K288等)。例如，以上亲和肽的二硫化物基团可以被硫酯代替以提供巯基保护基团(例如，亲和肽的相关部分将具有以下结构：)。

然后去除保护基团，露出游离巯基(例如，通过硫酯水解或用TCEP还原二硫化物)。然后使游离巯基与包含通过连接基团连接至DBCO缀合手柄的溴乙酰胺基团的双官能试剂(例如，溴乙酰氨基--酰氨基-DBCO)反应。该方法可以用于产生这样的抗体，该抗体具有一个DBCO基团存在(DAR1)和/或两个DBCO基团附接至抗体(DAR2，抗体的每个Fc与一个DBCO基团连接)。

在另一种实施方案中，包含单个DBCO缀合手柄的抗体通过首先使过量的抗PD-L1抗体与适当负载的亲和肽反应以在适当去除保护基团(例如，二硫键还原或硫酯裂解)之后引入单个巯基来制备。然后使具有巯基反应性缀合手柄和DBCO缀合手柄的双官能连接基团(例如，溴乙酰氨基- ₄-酰氨基-DBCO)与单个巯基反应，以产生包含单个DBCO的抗体。然后将包含单个DBCO的抗体与合适的含叠氮化物的IL-2(例如，CMP-003)缀合以获得DAR为1的抗PD-L1-IL-2免疫缀合物。

然后将期望的含叠氮化物的修饰的蛋白或合成蛋白(例如，叠氮化物修饰的IL-2(CMP-003、CMP-086)、叠氮化物修饰的IL-7(CMP-095)或其他期望的蛋白)与DBCO修饰的抗体反应以产生免疫细胞因子。然后粗制抗体/蛋白使用疏水相互作用色谱、离子交换色谱、尺寸排阻色谱、DBCO-PEG捕获、蛋白A色谱或DBCO树脂柱纯化来分离。

图2A示出了通过化学修饰技术对抗体进行位点选择性修饰，以引入如本文提供的一个或两个缀合手柄。图2B示出了未修饰的帕博利珠单抗和带有DBCO缀合手柄的缀合的帕博利珠单抗作为实例的Q-TOF质谱。图2C示出了IL2细胞因子的位点选择性缀合，以产生具有DAR1、DAR2或介于1和2之间的混合DAR的PD1-IL2。图2D示出了粗制帕博利珠单抗-IL2(CMP-003)缀合反应的TIC色谱图(上图)和完整的RP-HPLC图(下图)。图2E示出了粗制帕博利珠单抗-IL2(CMP-003)缀合反应的Q-TOF质谱图，示出了DAR1和DAR 2物质的形成。图2F示出了纯化的帕博利珠单抗-IL2缀合物的SEC色谱图，其中IL-2是CMP-003。图2G示出了纯化的DAR～2帕博利珠单抗-IL2缀合物的质谱图。图2H示出了纯化的帕博利珠单抗-IL-2缀合物的分析型HPLC迹线。

下文表10总结了根据描述的方法制备的免疫缀合物。下文定义了每种免疫缀合物的在本文提及的CMP数。

表10-示例性免疫缀合物

实施例2：免疫缀合物中抗体抗原结合的表征。

未修饰的和缀合的抗体与其抗原的相互作用通过ELISA测定测量。

对于这些PD-1ELISA，将Corning高结合半面积板(Fisher Scientific,Reinach,Switzerland)用25μL在PBS中的5μg/ml的未修饰的和缀合的抗PD1抗体在4℃包被过夜。然后将板用100μl PBS-0.02％ Tween20洗涤四次。将板表面用25μL PBS-0.02％ Tween20-1％ BSA在37℃封闭1h。然后将板用100μl PBS-0.02％ Tween20洗涤四次。将25微升来自AcroBiosystems(PD1-H82E4,Fisher Scientific,Reinach,Switzerland)的重组生物素化抗原(PD1/CD279蛋白)以从134nM开始降至0.002nM的5倍连续稀释液添加在PBS-0.02％Tween20-0.1％ BSA中，并且在2h期间在37℃孵育。然后将板用100μl PBS-0.02％ Tween20洗涤四次。将25微升在PBS-0.02％ Tween20-0.1％ BSA中以1:500稀释的链霉抗生物素蛋白-辣根过氧化物酶(#RABHRP3，Merck，Buchs，Switzerland)添加到每个孔，并在室温孵育30min。然后用100μl PBS-0.02％ Tween20洗涤板四次。向每个孔添加50微升TMB底物试剂(#CL07,Merck,Buchs,Switzerland)，并且在5min期间在37℃孵育。在37℃5min之后，通过添加50μl/孔的0.5M H₂SO₄终止溶液来终止辣根过氧化物酶反应。然后在来自Perkin Elmer(Schwerzenbach,Switzerland)的EnSpire读板器上在450nm处测量ELISA信号。其他抗体/抗原对的ELISA使用类似的方法进行。下文表11示出了所示构建体的结果。

表11-抗原结合

图3A示出了测量未修饰的和缀合的抗PD1抗体与PD1/CD279配体结合的能力的图，该图在y轴上示出了归一化的ELISA信号，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD1抗体的剂量。该图中测试的组合物分别是组合物帕博利珠单抗(CMP-004)、CMP-005、CMP-007和CMP-001。

图3B示出了未修饰的(CMP-033，度伐利尤单抗)和缀合的(CMP-034)抗PD-L1抗体及其结合PD-L1的能力的类似图。

图3C示出了未修饰的(CMP-091，生物仿制药阿达木单抗)和缀合的(CMP-089)抗TNFα抗体及其结合TNFα的能力的类似图。

实施例3-选择的免疫缀合物的抗原阻断测定

对于本文提供的一些免疫缀合物，测试未修饰的抗体和缀合的抗体阻断抗原与抗原结合配偶体结合的能力(例如，测试抗PD-1抗体或对应的免疫缀合物破坏PD-1和PD-L1之间结合的能力)。

PD-1/PD-L1阻断生物测定：PD-1/PD-L1阻断生物测定用于确定帕博利珠单抗-(IL-2syntein)免疫缀合物或抗PD-L1-(IL-2syntein)免疫缀合物阻断PD-1/PD-L1相互作用的能力。

未修饰的和缀合的抗PD1抗体干扰PD1/PDL1途径的能力使用来自Promega(目录号J1250,Madison,WI,USA)的PD-1/PD-L1阻断生物测定来测量。PD-1/PD-L1阻断生物测定是基于生物发光细胞的测定，基于效应细胞与模拟免疫突触的靶细胞的共培养。表达人类PD-1和由NFAT响应元件(NFAT-RE)驱动的萤光素酶报告物的Jurkat T细胞被表达人类PD-L1的CHO-K1细胞和设计用于激活Jurkat的同源TCR的工程化细胞表面蛋白激活。同时相互作用PD-1/PD-L1抑制TCR信号传导并抑制NFAT-RE-介导的发光。添加阻断PD-1/PD-L1相互作用的抗PD-1或抗PD-L1抗体释放抑制信号，恢复TCR激活并导致NFAT-RE发光报告物信号的获得。

简言之，将PD-L1 aAPC/CHO-K1靶细胞铺板在白色组织培养96孔板中，并且在37℃/5％CO₂培养过夜。在从1uM开始降至0.002nM的四倍连续稀释液中测量测试分子，并且在靶细胞上预孵育10min，然后添加新鲜解冻的PD-1Jurkat效应细胞。在37℃/5％ CO₂ 6h之后，NFAT-RE发光报告物的活性通过添加Bio-Glo试剂来评价，并且在Perkin Elmer(Schwerzenbach,Switzerland)的EnSpire读板器(1秒/孔)上测量。

图4A示出了测量未修饰的和缀合的抗PD1抗体干扰PD1/PDL1途径的能力的图，该图在y轴上示出了效应细胞NFAT-RE报告物的平均发光强度，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD1抗体的剂量。该图中测试的组合物是组合物帕博利珠单抗(CMP-004)和CMP-005。该图中测试的修饰的IL-2多肽是Proleukin和组合物CMP-002。

图4B示出了CMP-034和亲本抗PD-L1抗体度伐利尤单抗的类似图。

实施例4-免疫缀合物对FcRn受体的结合

如下文描述的，抗体及对应的免疫缀合物与人类FcRn受体结合的能力通过alphaLISA确定。

未修饰的和缀合的抗PD1抗体与人类新生儿Fc受体(FcRn)在pH 6的相互作用使用来自Perkin Elmer(Schwerzenbach,Switzerland)的AlphaLISA人类FcRn结合试剂盒(AL3095C)来测量。FcRn和IgG结合的AlphaLISA检测使用IgG包被的受体珠来与链霉抗生物素蛋白包被的供体珠上捕获的生物素化人类FcRn相互作用。当参考IgG与FcRn结合时，供体珠和受体珠接近，使得单线态氧转移，触发受体珠中的级联能量转移反应，导致在615nm的光发射的尖锐峰值。向alphaLISA混合物中添加游离IgG抗体产生FcRn与参考抗体结合的竞争，导致信号丢失。

简言之，在从5uM开始降至64pM并且与AlphaLISA反应混合物在pH 6MES缓冲液中一起孵育的连续稀释液中测量测试分子，该反应混合物由800nM重组生物素化人类FcRn、40μg/ml人类IgG缀合的受体珠和40μg/ml链霉抗生物素蛋白包被的供体珠组成。在黑暗中在23℃90min之后，在来自Perkin Elmer(Schwerzenbach,Switzerland)的EnSpire读板器上测量AlphaLISA信号(在680nm激发，在615nm发射)。

其他抗体(例如，抗CD20、抗PD-L1、抗TNFα等)对FcRn的结合通过类似的方法测量。

图5A示出了测量未修饰的和缀合的抗PD1抗体与人类新生儿Fc受体(FcRn)在pH 6结合的能力的图，该图在y轴上示出了平均AlphaLISAFcRn-IgG信号，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD1抗体的剂量。该图中的组合物是帕博利珠单抗(CMP-004)和CMP-005、CMP-007以及CMP-001。

图5B示出了测量未修饰的和缀合的抗PD-L1抗体与人类FcRn在pH 6结合的能力的图，该图在y轴上示出了平均AlphaLISAFcRn-IgG信号，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD-L1抗体的剂量。该图中示出的构建体是CMP-033和CMP-034。

图5C示出了类似于图5A和图5B但是用于未缀合的和缀合的抗TNFa抗体的图。该图中示出的构建体是CMP-091(未修饰的抗体)、CMP-089(DAR1)以及CMP-090(DAR2)。

下文表12提供了本文提供的多种免疫缀合物和亲本抗体对FcRn的结合。

表12-FcRn结合

NT-未测试。以上表中的值是在不同日期进行的不同实验的综合结果。

实施例5：免疫缀合物对人类FcRg的结合测定(图6A-图6E)

未修饰的和缀合的抗体与人类Fcγ受体I(FcγRI/CD64)、与人类Fcγ受体II(FcγRIIa/CD32)和与低亲和力人类Fcγ受体III FcγR3a/CD16 V158的相互作用分别使用人类FcγR1/CD64(AL3081C)、FcγRIIa/CD32a 167H(AL3086C)和FcγRIII/CD16 176P/F158(AL347HV)结合试剂盒(Perkin Elmer,Schwerzenbach,Switzerland)来测量。

Fcγ受体和IgG结合的AlphaLISA检测使用人类IgG Fc区包被的AlphaLISA受体珠来与链霉抗生物素蛋白包被的供体珠上捕获的生物素化人类FcγRI、FcγRIIa或FcγRIIIa相互作用。当参考IgG与Fcγ受体结合时，供体珠和受体珠接近，使得单线态氧转移，触发受体珠中的级联能量转移反应，导致在615nm的光发射的尖锐峰值。将游离IgG抗体添加到alphaLISA混合物中产生Fcγ受体与参考IgG Fc区结合的竞争，导致信号丢失。

简言之，在从5uM开始降至4pM并且与反应混合物一起孵育的连续稀释液中测量测试分子，该反应混合物由40ug/ml人类IgG Fc缀合的受体珠和40ug/ml链霉抗生物素蛋白包被的供体珠以及重组生物素化人类FcγRI(200nM)、FcγRIIa(120nM)或FcγRIIIa(8nM)组成。在黑暗中在23℃90min之后，在来自Perkin Elmer(Schwerzenbach,Switzerland)的EnSpire读板器上测量/>信号(在680nm激发，在615nm发射)。

图6A示出了测量未修饰的和缀合的抗PD1抗体与人类Fcγ受体I(CD64)结合的能力的图，该图在y轴上示出了平均FcγRI-IgG信号，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD1抗体的剂量。该图中测试的组合物是帕博利珠单抗(CMP-004)和CMP-005、CMP-007、CMP-001。

图6B示出了测量未修饰的和缀合的抗PD1抗体与人类Fcγ受体IIa(CD32a)结合的能力的图，该图在y轴上示出了平均FcγRIIa-IgG信号，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD1抗体的剂量。该图中测试的组合物是帕博利珠单抗(CMP-004)、CMP-005、CMP-007和CMP-001。

图6C示出了测量未修饰的和缀合的抗PD1抗体与人类Fcγ受体IIIa(CD16)结合的能力的图，该图在y轴上示出了平均FcγRIIIa-IgG信号，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD1抗体的剂量。该图中测试的组合物是帕博利珠单抗、CMP-005、CMP-007和CMP-001。

图6D示出了测量未修饰的和缀合的抗PD-L1抗体与人类Fcγ受体CD64(左)、CD32a(中)和CD16(右)结合的能力的图，每个图在y轴上示出了平均信号，并且在x轴上示出了未修饰的和缀合的抗PD-L1抗体的剂量。该图中测试的构建体是CMP-033(度伐利尤单抗)和CMP-034。

图6E示出了测量未修饰的和缀合的抗TNFα抗体与人类Fcγ受体FcRI(左上)、FcRIIa(右上)、FcRIIb(左下)和FcRIIIa(右下)结合能力的图，每个图在y轴上示出了平均信号，并且在x轴上示出了未修饰和缀合的抗TNFa抗体的剂量。该图中测试的构建体是CMP-091(生物仿制药阿达木单抗)、CMP-089以及CMP-090。

本文提供的多种免疫缀合物及对应的亲本抗体结合测试的Fcg受体的能力在下文表13中示出。这些值表示亲和常数(k_d)，如根据以上或类似的测定测量的。

表13-Fcγ受体结合

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NT＝未测试。以上表13中的值是在不同日期进行的不同实验的综合结果。

实施例6：IL2 pStat5激活(图7-图9)

进行实验以确定不同的IL-2多肽对人类T细胞群体的影响。原代泛T细胞(CD4+T细胞、CD8+T细胞和Treg T细胞)通过使用ficoll梯度离心进行外周血单个核细胞(PBMC)纯化，随后用磁珠负分离，从健康供者血沉棕黄层(buffy coat)中获得，并且然后冷冻保存直至使用。将泛T细胞解冻，允许它们在T细胞培养基(RPMI 10％ FCS、1％谷氨酰胺、1％NEAA、25μMβMeoH、1％丙酮酸钠(Napyrovate))中恢复过夜，并在用PBS的两个洗涤步骤之后，将细胞重悬于PBS中。当指定时，将细胞与100nM未缀合的抗PD1抗体帕博利珠单抗(CMP-004)在20min期间在37℃预孵育。然后将细胞以每孔200,000个细胞进行分配，并且在37℃/5％ CO₂用未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽的316nM开始浓度降至3pM的3.16倍连续稀释液刺激40min。孵育之后，将细胞使用转录因子磷酸缓冲液试剂盒固定并透化，随后对CD4、CD8、CD25、FoxP3、CD45RA和pStat5进行表面和细胞内免疫染色，以能够实现细胞亚群鉴定和测量Stat5(信号转导及转录激活因子5)磷酸化水平。FACS(荧光激活细胞分选)测量用来自Acea的NovoCyte或Quanteon流式细胞仪进行。

将以下T细胞亚群的pStat5 MFI(中位荧光强度)信号与野生型或修饰的IL-2多肽的浓度作图。半最大有效浓度(EC₅₀)使用GraphPad PRISM软件基于可变斜率四参数分析进行计算。

T细胞亚群鉴定的门控策略

T-Reg	CD4+、CD25^Hi、FoxP3+
		CD8 Teff	CD8+
幼稚CD8 Teff	CD8+、CD45RA+
		记忆性CD8 Teff	CD8+、CD45RA-
CD4 conv	CD4+、FoxP3-

表14：人类原代泛T细胞中STAT5磷酸化测定的EC₅₀值

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NT：未测试。以上表14中提供的数据从在不同日期进行的不同实验中产生。

图7A示出了测量未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽对体外人类T细胞样品中T_eff和T_reg细胞诱导的作用的图，该图在y轴上示出了磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均荧光强度，并且在x轴上示出了修饰的IL-2多肽和免疫细胞因子的剂量。该图中测试的修饰的IL-2多肽是CMP-002。该图中测试的免疫细胞因子是CMP-005、CMP-007、CMP-001。

图7B示出了测量合成IL-7(CMP-095)和IL-7/抗PD1抗体缀合物(CMP-039、CMP-041)对CD8幼稚细胞和CD8记忆性细胞中STAT5磷酸化的作用的图。

图8A示出了测量PD-1/CD279在从健康供体的外周血中新鲜分离的静息记忆性(CD45RA-)和幼稚(CD45RA+)CD8+T_eff细胞上的表面表达水平的图。

图8B示出了在存在或不存在过量未缀合的抗PD1抗体的情况下，测量未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽对体外人类T细胞样品中静息CD8+T_eff细胞诱导的作用的图，该图在y轴上示出了磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均荧光强度，并且在x轴上示出了修饰的IL-2多肽和免疫细胞因子的剂量。该图中测试的修饰的IL-2多肽是CMP-002，并且该图中测试的免疫细胞因子是CMP-005和作为对照的CMP-006。

图9A示出了在存在或不存在过量未缀合的抗PD1抗体CMP-004的情况下，测量未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽对体外人类T细胞样品中静息幼稚(CD45RA+)CD8+T_eff细胞诱导的作用的图，该图在y轴上示出了磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均荧光强度，并且在x轴上示出了修饰的IL-2多肽和免疫细胞因子的剂量。该图中测试的修饰的IL-2多肽是CMP-002，并且该图中测试的免疫细胞因子是CMP-005和作为对照的CMP-006。

图9B示出了在存在或不存在过量未缀合的抗PD1抗体CMP-004(帕博利珠单抗)的情况下，测量未缀合的和与抗PD1抗体缀合的修饰的IL-2多肽对体外人类T细胞样品中静息记忆性(CD45RA-)CD8+T_eff细胞诱导的作用的图，该图在y轴上示出了磷酸化信号转导及转录激活因子5(pSTAT5)的平均荧光强度，并且在x轴上示出了修饰的IL-2多肽和免疫细胞因子的剂量。该图中测试的修饰的IL-2多肽是CMP-002，并且该图中测试的免疫细胞因子是CMP-005和作为对照的CMP-006。

实施例7：免疫缀合物展示与抗体和缀合的蛋白二者关联的体内活性

本文提供的多种免疫缀合物在下文提供的体内实验进行评价，该体内实验显示了缀合物的一种或两种组分的活性，或两种组分作为缀合物组合的协同作用。

实施例7A-抗PD-1抗体/IL-2缀合物的体内效力研究

在小鼠中进行体内PK/PD研究。将初始6-8周龄的BALB/c-hPD1雌性小鼠(GemPharmatech Co,Ltd,Nanjing,China)用在0.1mL PBS中的野生型CT26肿瘤细胞(3×10⁵)在左侧腹皮下接种，用于肿瘤发展。将动物随机化(使用基于Excel的随机化软件，根据肿瘤体积进行分层随机化)，并且当平均肿瘤体积达到大约186mm³时开始治疗。用组合物A治疗的动物接受单次10mL/kg团注静脉内(i.v.)注射1和2.5mg/kg与修饰的IL-2多肽缀合的PD-1抗体。用对照Her2靶向的免疫细胞因子组合物O(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)治疗的动物接受单次10mL/kg团注静脉内(i.v.)注射2.5mg/kg与修饰的IL-2多肽缀合的抗Her2抗体。接种之后，每天检查动物的发病率和死亡率。在那时，检查对动物的肿瘤生长和正常行为的影响，诸如活动能力、食物和水的消耗、体重增加/损失(每周两次测量体重)、眼睛/毛发缠结(hair matting)和任何其他异常影响。每周三次使用卡尺在两个维度测量肿瘤尺寸，并且体积使用以下式以mm³表示：V＝0.5a×b²，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。死亡和观察到的临床体征基于每个亚群内的动物数量进行记录。

药代动力学研究包括9个时间点(5min、1h、6h、12h、24h、72h、96h、120h、168h)，每个时间点取样3只小鼠。在指定的时间点，在存在EDTA的情况下，经由尾静脉取样或经由心脏穿刺(终点)收集血液样品。另外地，注射之后72h、96h、120h、168h每组处死3只小鼠，并且收集肿瘤样品。

图10B示出了描述治疗之后7天hPD1人源化BALB/c小鼠中PD-1靶向的和非靶向的免疫细胞因子对CT26同系结肠上皮癌肿瘤生长的作用的柱状图。该图中测试的免疫细胞因子是组合物A，在单次注射方案之后作为单一剂以1和2.5mg/kg进行测试。对照Her2靶向的免疫细胞因子组合物O(与IL-2多肽缀合的曲妥珠单抗抗体)也以2.5mg/kg进行测试。(平均值±SEM；**单因素ANOVAP值<0.001)。

实施例7B：CMP-089抑制KLH诱导的迟发型超敏反应

在小鼠迟发型超敏反应(DTH)模型中测试CMP-089抑制抗原驱动的耳部炎症的能力。DTH表示对先前遇到的抗原的局部T效应子回忆应答。这里，小鼠首先通过s.c.(皮下)免疫接种钥孔血蓝素(KLH)对KLH致敏，并且然后几天后用相同的抗原向耳朵中的皮内注射再次攻击，导致局部组织炎症和肿胀。

为了显示CMP-089在该模型中可以抑制抗原驱动的耳部炎症(对于与30kDa PEG基团缀合的IL-2syntein CMP-086观察到的功能(数据未示出)，当与生物仿制药阿达木单抗缀合时)，将hTNF/hTNFR2 KI小鼠(12-13周龄)随机分配至实验组(n＝8/组)。在第0天，将小鼠在尾部基部附近的两侧腹通过s.c.注射施用在CFA中的100μg KLH的乳液。在第6天和第9天，将媒介物Humira^TM或CMP-089以3mg/kg s.c.施用。在第7天对爪厚度(右爪和左爪)进行基线测量后，所有动物用在左足垫皮内注射在盐水中的20μg/20μl KLH来攻击，同时右足垫皮下注射20μl盐水作为对照。攻击后24h(d8)、48h(d9)和72h(d10)进行左爪和右爪厚度测量。实验方案的示意图在图11A中示出。与媒介物相比，CMP-089在所有时间点显著抑制爪炎症，而生物仿制药阿达木单抗没有显著作用(参见图11B对于在攻击后24小时的爪厚度数据的变化，图11C对于在攻击后48小时的爪厚度数据的变化，以及图11D对于在攻击后72小时的爪厚度数据的变化)，因此显示当与Humira^TM缀合时，IL-2syntein在体内抑制DTH方面是有功能的。

实施例7C-PD1:IL-7免疫细胞因子的抗肿瘤效力——体内肿瘤生长抑制

如下文描述进行实验以便评价本文提供的免疫细胞因子(例如，CMP-041)的药代动力学(PK)和药效学(PD)特性，以及评价抗肿瘤效力。

将用如由GemPharmatech出售的人类PD-1(目录号T002726)敲入遗传修饰的转基因BALBc-hPD1小鼠(BALB/cJGpt-Pdcd1em1Cin(hPDCD1)/Gpt)植入用多种剂量组合的免疫细胞因子处理的同系CT26肿瘤模型，使用流式细胞术和相对肿瘤体积读取。

根据下文表15，在治疗研究中使用六组七只小鼠。

表15-研究设计

QWx2给药＝每周一次给药，施用总计两次剂量。

对于血液样品的流式细胞术和细胞因子分析，将血液用乙二胺四乙酸二钾(K2-EDTA)处理。将用于细胞因子分析的样品离心两次，以确保去除所有细胞碎片；以300g 5分钟，然后转移到新鲜管中，并且以2000g再次离心5分钟。

对于肿瘤样品的分析，首先对肿瘤进行称重，将用于PK分析和细胞因子测量的样品快速冷冻用于分析。将意图用于在细胞因子分析中使用的血浆离心两次，以确保去除所有细胞碎片；以300g 5分钟，然后转移到新鲜管中，并且以2000g再次离心5分钟。新鲜样品用于流式细胞术。

使用如下两组(A或B)抗体作为细胞标志物进行流式细胞术。

组A(其中m前缀指示鼠特异性抗体)：mCD3epsilon-FITC(BD 553062)、mCD45-AF700(Biolegend 103127)、mCD44-APC/Cy7(Biolegend 103028)、mCD4-eF450(ThermoFisher 48-0042-82)、mCD69-BV 605(Biolegend 104530)、mCD8-BV650(Biolegend100742)、mCD25-PE(BD 553866)、mCD127-PE-Cy7(Biolegend 121120)、mKI67-PerCp/Cy5.5(Biolegend 652423)、mFoxP3-APC(eBioscience 17-5772-B2)、活的/死亡的Aqua Zombie(Biolegend 423102)。

组B(其中m前缀指示鼠特异性抗体)：mCD3epsilon-FITC(BD 553062)、mLy6-PerCp/Cy5.5(Biolegend 127615)、mCD45-AF700(Biolegend 103127)、mCD11b-APC/Cy7、mF4/80-BV421(Biolegend 123137)、mLy6-BV605(BD 563011)、mCD206-APC(Thermo Fisher17-2061-82)、活的/死亡的Aqua Zombie(Biolegend 423102)。

在研究过程中测量小鼠的体重，并且对于每组，动物的体重保持相对恒定指示每种构建体在施用的剂量耐受性良好。

研究过程期间的各组的相对肿瘤体积在图12中示出，它示出了媒介物LZM-009和三种剂量的CMP-041(1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg，每周一次，持续两周)的比较。观察到CMP-041展示出在减少肿瘤体积方面剂量依赖性效力，以及即使在较低剂量也比单独的未修饰的抗体更大的效力。

实施例7D：抗CD20抗体缀合物对C57BL/6小鼠肿瘤生长抑制作用的研究

为了评价CMP-030免疫细胞因子的抗肿瘤作用，根据下文提供的参数，在携带EL4-hCD20 SQ肿瘤的C57BL/6小鼠中进行体内研究。

细胞培养：EL4鼠胸腺淋巴瘤细胞系购自ATCC。细胞作为单层培养物在37℃在5％CO₂的潮湿气氛中体外维持在补充有10％热灭活FBS的DMEM中。经遗传修饰以在EL4细胞中过表达人类CD20编码序列的B-hCD20 EL4细胞由Biocytogen Pharmaceuticals(Beijing)有限公司提供。为了测试CD20免疫细胞因子的体内效力，将C57BL/6小鼠在右后侧腹皮下注射在0.1mL PBS中的B-hCD20 EL4肿瘤细胞(2×10⁵个)用于肿瘤发展。当平均肿瘤尺寸达到大约50-100mm³时，将48只荷瘤动物随机纳入6个研究组。测试的每组由8只小鼠组成。组别如下：G1-媒介物；G2-生物仿制药利妥昔单抗，以10mg/kg每周两次施用；G3-CMP-030以1.25mg/kg每周一次施用；G4-CMP-030以2.5mg/kg每周一次施用；G5-CMP-030以1.25mg/kg每周两次施用；和G6-CMP-030以5mg/kg每周一次施用。G5和G6中的给药耐受不佳，并且这些组的研究停止。所有给药经由腹膜内施用进行。

在施用后的不同时间点(第0天、第2天、第3天、第7天(生物仿制药利妥昔单抗的第二次施用)和第10天)测量每组小鼠的体重。施用CMP-030的小鼠在第一次剂量之后显示体重最初中度下降(在第3天～10％)，几天后(到第7天)表现为恢复。

图13示出了在施用后不同时间点指定组的肿瘤体积。CMP-030以1.25mg/kg的每周一次给药与生物仿制药利妥昔单抗以10mg/kg的每周两次表现相当。值得注意的是，2.5mg/kg的CMP-030每周一次的组在该模型中的所有时间点都显示出优异的肿瘤生长抑制作用。该数据支持缀合物组合物的协同效应。

实施例8-IL-7的合成

IL-7合成的一般方法

一般策略：合成IL-7多肽通过连接通过固相肽合成(SPPS)制备的单独的肽区段来合成。简言之，肽区段(Seg1、Seg2、Seg3和Seg4)使用SPPS制备，并且对野生型IL-7的氨基酸序列(SEQ ID NO:186)的任何期望的修饰在合成期间掺入。纯化单独的片段之后，将IL-7-Seg1和IL-7-Seg2连接在一起以及将IL-7-Seg3和IL-7-Seg4连接在一起。将所得IL-7-Seg12和IL-7-Seg34纯化并连接在一起，以提供具有Acm基团保护的半胱氨酸的IL-7-Seg1234(IL-7-Seg1234-Acm)。然后对IL-7-Seg1234-Acm的Acm基团进行普遍脱保护和纯化，以提供合成IL-7线性蛋白。然后将所得合成IL-7线性蛋白重排并折叠。单独的肽使用下文描述的方法在自动化肽合成仪上合成。

材料和溶剂：具有适合Fmoc-SPPS的侧链保护基团的Fmoc-氨基酸、用于肽官能化的树脂聚乙二醇衍生物和试剂是商购可得的，并且在不进一步纯化的情况下使用。HPLC级CH₃CN用于分析型和制备型RP-HPLC纯化。

保护的酮酸衍生物(区段1-3)在胺基树脂上的装载：将5g Rink-酰胺MBHA或ChemMatrix树脂(1.8mmol规模)在DMF中溶胀30min。通过用在DMF中的20％哌啶(v/v)在室温处理树脂两次持续10min，随后用DMF洗涤几次，进行Fmoc脱保护。将Fmoc-AA-保护的-α-酮酸(1.8mmol，1.00当量)溶解在20mL DMF中，并用HATU(650mg，1.71mmol，0.95当量)和DIPEA(396μL，3.6mmol，2.00当量)预活化。向溶胀的树脂添加反应混合物。让其在室温在温和搅拌下反应6h。用DMF彻底冲洗树脂。通过添加在DMF(20mL)中的乙酸酐(1.17mL)和DIPEA(2.34mL)的溶液来进行对树脂上未反应的胺的封端。让其在室温在温和搅拌下反应15min。树脂用DCM随后用乙醚彻底冲洗，并干燥。按照M.Gude等人(2003)Lett.Pept.Sci.,9,203描述的方法测量树脂的载量(0.25mmol/g)。

使用的保护的酮酸

固相肽合成(SPPS)：使用Fmoc-SPPS化学在自动化肽合成仪上合成肽区段。使用以下具有侧链保护基团的Fmoc-氨基酸：Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Acm)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Nle-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Val-OH和Fmoc或Boc-Opr-OH(Opr＝5-(S)-氧杂脯氨酸)。在必要时将Fmoc-假脯氨酸二肽(Fmoc-pseudoproline dipeptides)掺入合成。用在含有0.1MCl-HOBt的DMF或NMP中的20％哌啶进行Fmoc脱保护反应(2×2min)。在室温，用Fmoc-氨基酸(3.0-8.0当量，相对于树脂取代)、HCTU或HATU(2.9-8当量)作为偶联试剂和DIPEA或NMM(6-16当量)在DMF或NMP中进行偶联反应。向树脂添加含有试剂的溶液，并且根据氨基酸允许其反应15min、30min或2h。根据需要进行双偶联反应。未反应的游离胺使用在DMF或NMP中的20％乙酸酐和在DMF或NMP中的0.8M NMM封端。

树脂裂解和侧链脱保护。在肽合成完成后，在室温使用裂解混合物将肽从树脂裂解2h。滤去树脂，并浓缩滤液，并用冷乙醚处理，研磨并离心。仔细地倾析乙醚层，将剩余物再次悬浮于乙醚中，研磨并离心。重复乙醚洗涤两次。将所得粗制肽在真空下干燥并储存在-20℃。将获得的固体的等分试样溶解在含有0.1％ TFA(v/v)的1:1CH₃CN/H₂O中，并且在60℃使用C18柱(3.6μm，150×4.6mm)通过分析型RP-HPLC进行分析。使用MALDI-TOF或LC-MS鉴定产物的分子量。

肽的纯化：通过RP-HPLC纯化肽区段、连接的肽和线性蛋白。对不同的肽应用不同的梯度。流动相是含有0.1％ TFA(v/v)的MilliQ-H₂O(缓冲液A)和含有0.1％ TFA(v/v)的HPLC级CH₃CN(缓冲液B)。在40℃或60℃，以40mL/min的流量在(50×250mm)或C18柱(50×250mm)上进行制备型HPLC。

纯化：在标准制备型HPLC仪器上进行肽片段纯化。以40mL/min的流量在C18柱(5μm，50×250mm)上，在C18柱(5μm，/>20×250mm)上，或以10mL/min的流量在C4柱(5μm，/>20.0×250mm)上，进行制备型HPLC。对于两个色谱柱，在纯化期间使用室温、40℃或60℃。流动相是含有0.1％ TFA(v/v)的MilliQ-H₂O(缓冲液A)和含有0.1％ TFA(v/v)的HPLC级CH₃CN(缓冲液B)。

肽的表征：使用4-羟基-α-氰基肉桂酸(HCCA)作为基质，使用配有双ESI/MALDI-FTICR源的SolariX(9.4T磁体)质谱仪(Bruker,Billerica,USA)通过高分辨率傅立叶变换质谱(FTMS)表征肽和蛋白。在室温使用标准C4柱(3.6μm，150×4.6mm)或在50℃以1mL/min的流量使用标准C18柱(3.6μm，150×4.6mm)，使用分析型HPLC仪器，通过RP-HPLC分析肽区段、连接的肽和线性蛋白。在12min内使用20％ B至95％ B的梯度(方法A)，在12min内使用10％ B至85％ B的梯度(方法B)或在12min内使用10％ B至95％ B的梯度(方法C)分析肽片段。

SEQ ID NO:187的合成IL-7多肽的制备。

区段1：IL-7(1-34)-Leu-α-酮酸

区段1以0.2mmol规模在预先装载具有～0.25mmol/g的取代量的Fmoc-Leu-保护的-α-酮酸(一般方法中的描述)(0.8g)的Rink酰胺MBHA树脂上合成。

区段1的自动化Fmoc-SPPS：肽延伸循环包括氨基酸偶联、封端和Fmoc脱保护，如一般方法中描述进行。

肽延伸之后，用DCM洗涤树脂并在真空下干燥。干燥的肽基树脂的质量是1.6g。在室温使用95:2.5:2.5 TFA:DODT:H₂O(10mL/g树脂)的混合物将肽从树脂裂解，持续2.0h。如一般方法中描述沉淀化合物。获得702mg粗制肽。

粗制区段1的纯化通过制备型HPLC进行，使用C18柱(5μm，250×50mm)，以40mL/min的流量，在60℃，以在25min内30％ B-80％ B的梯度。将含有纯化的产物的级分汇集并冻干，以获得作为白色固体的94％纯度的区段1。基于树脂载量的分离收率是17％(135mg)。MS(ESI)：C₁₇₁H₂₈₁N₄₃O₆₃S₂；平均同位素计算的1337.9940Da[M+H]³⁺；实测的：1337.9933Da[M+H]³⁺。保留时间(分析方法A)：5.66min。

区段2：Opr-IL-7(37-74)-Phe-光保护的-α-酮酸

区段2.Opr-IL-7(37-74)-Phe-光保护的-α-酮酸

区段2以0.2mmol规模在预先装载具有0.25mmol/g的取代量的Fmoc-Phe-光保护的-α-酮酸(一般方法中的描述)的Rink酰胺MBHA树脂上合成。

肽延伸循环包括氨基酸偶联、封端和Fmoc脱保护，如一般方法中描述进行。

肽延伸之后，用DCM和乙醚洗涤树脂，并在真空下干燥。干燥的肽基树脂的质量是2.2g。在室温使用95:2.5:2.5 TFA/DODT/H₂O(15mL/g树脂)的混合物将肽从树脂裂解，持续2.0h。如一般方法中描述沉淀化合物。获得1.2g粗制肽。

粗制区段2的纯化通过制备型HPLC进行，使用C18柱(5μm，250×50mm)，以40mL/min的流量，在40℃，使用CH₃CN/H₂O，以在30min内10％ B-80％ B的梯度。将含有纯化的产物的级分汇集并冻干，以获得作为白色固体的97％纯度的区段2。基于树脂载量的分离收率是20％(203mg)。RMS(ESI)：C₂₃₄H₃₅₂N₆₅O₆₂S；计算的m/z：5098.6114Da[M+H]⁺；实测的m/z：5098.6026Da[M+H]⁺。保留时间(分析方法A)：6.30min。

区段3：Fmoc-Opr-IL-7(77-112)-Leu-α-酮酸

区段3.Fmoc-Opr-IL-7(77-112)-Leu-α-酮酸

区段3以0.1mmol规模在预先装载具有～0.29mmol/g的取代量的Fmoc-Leu-保护的-α-酮酸(一般方法中的描述)的Rink酰胺树脂上合成。345mg树脂在DMF中溶胀15min。

区段3的自动化Fmoc-SPPS：肽延伸循环包括氨基酸偶联、封端和Fmoc脱保护，如一般方法中描述进行。

肽延伸之后，用DCM洗涤树脂并在真空下干燥。干燥的肽基树脂的质量是0.94g。在室温使用95:2.5:2.5 TFA:DODT:H₂O(10mL/g树脂)的混合物将肽从树脂裂解，持续2.0h。如一般方法中描述沉淀化合物。获得473mg粗制肽。

粗制区段3的纯化通过制备型HPLC进行，使用C18柱(5μm，50×250mm)，以40mL/min的流量，在40℃，以在40min内10％ B-50％ B的梯度。将含有纯化的产物的级分汇集并冻干，以获得作为白色固体的98％纯度的区段3。基于树脂载量的分离收率是25％(107mg)。HRMS(ESI)：C₁₉₃H₃₁₅N₅₁O₅₇S；平均同位素计算的4294.0030Da[M+H]；实测的：4293.2962Da。保留时间(分析方法B)：6.29min。

区段4：Opr-IL-7(115-152)

区段4Opr-IL-7(115-152)

区段4以0.1mmol规模在具有～0.34mmol/g取代量的Rink酰胺MBHA树脂上合成。294mg树脂在DMF中溶胀15min。

区段4的自动化Fmoc-SPPS：肽延伸循环包括氨基酸偶联、封端和Fmoc脱保护，如一般方法中描述进行。

用DCM洗涤树脂并在真空下干燥。干燥的肽基树脂的质量是725mg。在室温使用92.5:2.5:2.5:2.5 TFA:TIPS:DODT:H₂O(10mL/g树脂)的混合物将肽从树脂裂解，持续2.0h。如一般方法中描述沉淀化合物。获得145mg粗制肽。

粗制区段4的纯化通过制备型HPLC进行，使用Gemini NX-C18柱(5μm，50×250mm)，以40mL/min的流量，在40℃，以在40min内10％ B-50％ B的梯度。将含有纯化的产物的级分汇集并冻干，以获得作为白色固体的98％纯度的区段4。基于树脂载量的分离收率是8％(40mg)。HRMS(ESI)：C₂₁₅H₃₆₁N₆₁O₆₀S₂；平均同位素计算的4823.6568Da[M]；实测的：4823.6542Da。保留时间(分析方法B)：6.15min。

区段12：IL-7-Seg12制备

将区段1(17.5mg；4.36μmol；1.1当量)酮酸和区段2(20mg；3.92μmol；1.0当量)溶解在含有0.1M草酸的15mM DMSO:H₂O(9.5:0.5)(241μL)中。获得了非常均匀的液体溶液。将小瓶避光，并且将混合物在60℃加热过夜。连接完成之后，将混合物用含有0.1％ TFA(v/v)的1:1CH₃CN:H₂O(4mL)稀释，并且将混合物以365nm的波长辐照1.5h，以允许C-末端酮酸的光脱保护。将反应混合物用含有TFA(0.1％,v/v)的1:1CH₃CN/H₂O(适量至10mL)进一步稀释。

将稀释的混合物过滤并注入到制备型HPLC中。粗制连接的肽通过制备型HPLC纯化，使用C18柱(5μm，50×250mm)以40mL/min的流量在60℃，以2步梯度：在5min内10％B至40％ B，然后在30min内40％ B至70％ B。将含有纯化的产物的级分汇集并冻干，以获得98％纯度的白色固体区段12。分离收率是38％(13.1mg)。MS(ESI)：C₃₉₃H₆₁₉N₁₀₇O₁₂₀S₃；计算的m/z：8858.4917Da[M+H]⁺；实测的m/z：8858.4928Da[M+H]⁺。保留时间(分析方法B)：5.41min。

区段34：IL-7-Seg34制备

将肽酮酸区段3(55.0mg；12.8μmol；1.2当量)和羟胺肽区段4(51.5mg；10.6μmol；1.0当量)溶解在含有0.1M草酸的9:1DMSO/H₂O(530μL)中。获得了非常均匀的液体溶液。让其反应，将反应在60℃加热过夜。连接反应完成之后，将混合物用DMSO(1060μL)稀释。通过在室温添加二乙胺(80μL,5％,v/v)起动进行Fmoc脱保护，持续15min。向反应混合物添加在DMSO(1590μL)中的第二份二乙胺(80μL)，并且使所得混合物反应，在室温搅拌另外15min。

添加三氟乙酸(160μL)以便中和反应混合物。获得了非常均匀且无色的液体溶液。将所得混合物用含有TFA(0.1％,v/v)的1:1CH₃CN/H₂O(适量至15mL)进一步稀释。将稀释的混合物过滤并通过制备型HPLC纯化，使用C18柱(5μm，250×50mm)以40mL/min的流量在40℃，以在40min内10％ B至50％ B的梯度。将含有纯化的产物的级分汇集并冻干，以获得作为白色固体的92％纯度的区段34。分离收率为51.5mg(55％)。HRMS(ESI)：C₃₉₂H₆₆₆N₁₁₂O₁₁₃S₃；平均同位素计算的8851.9104Da[M]；实测的：8851.8897Da。保留时间(分析方法B)：6.08min。

具有Acm(SEQ ID NO:187)的SEQ ID NO:187-Seg1234的制备

区段1234。

将肽酮酸区段12(17.4mg；1.96μmol；1.2当量)和羟胺肽区段13(14.5mg；1.64μmol；1.0当量)溶解在含0.1M草酸的DMSO:H₂O(9.5:0.5)(110μL，15mM肽浓度)中。获得均匀的液体溶液，并且将该溶液在60℃加热过夜。

连接完成之后，将混合物用含有TFA(0.1％，v/v)的1:1H₂O/CH₃CN(适量至8mL)稀释。将稀释的混合物过滤并注入到制备型HPLC中。粗制连接的肽通过制备型HPLC纯化，使用C18柱(5μm，250×50mm)以40mL/min的流量在60℃，使用以在30min内30％ B至80％ B的梯度。将含有纯化的产物的级分汇集并冻干以获得作为白色固体的99％纯度的具有Acm的SEQID NO:187(三缩酚肽，tri-depsipeptide)。分离收率是28％(8mg)。HRMS(ESI)：C₇₈₄H₁₂₈₅N₂₁₉O₂₃₁S₆；平均同位素计算的17666.4121Da[M]；实测的：17666.4233Da。保留时间(分析方法C)：5.33min。

用于制备SEQ ID NO:187-线性肽的Acm脱保护：IL-7-线性蛋白(SEQ ID NO:187)

SEQ ID NO:187-线性蛋白(SEQ ID NO:187)

将SEQ ID NO:187(5.8mg；0.33μmol)溶解在AcOH:H₂O(1:1)(1.3mL，0.25mM蛋白浓度)中并且向该溶液添加乙酸银(13mg,1％,m/v)。将混合物在50℃避光振荡2.5h。

反应完成之后，将样品用含有0.1％ TFA(v/v)的1:1CH₃CN:H₂O稀释。样品通过制备型HPLC纯化，在C18柱(5μm，250×20mm)上以10mL/min的流量在室温，使用含有0.1％TFA(v/v)的CH₃CN/H₂O作为流动相，以两步梯度：在5min内10％至30％ CH₃CN，并且在20min内30％至95％ CH₃CN。将含有纯化的产物的级分汇集并冻干，以获得作为白色粉末的98％纯度的2.8mg SEQ ID NO:187-线性蛋白。(对于Acm脱保护和纯化步骤的收率为49％)。MS(ESI)：C₇₆₆H₁₂₅₅N₂₁₃O₂₂₅S₆；计算的m/z：17240.1893Da[M+H]+；实测的：17240.1636Da[M+H]。

SEQ ID NO:187-折叠的蛋白：IL-7线性蛋白的重排和折叠。

将2.3mg(0.133μmol)线性IL-7蛋白溶解在含有6M GnHCl、50mM NaCl、1mM EDTA和2mM CysHCl的7.5mL 50mM Tris缓冲液(18μM蛋白浓度)中，通过加入6M HCl水溶液将其调节至pH 8.0。将混合物在室温轻轻振荡2h。通过分析型反相HPLC监测重排。

将含有重排的蛋白的溶液冷却至4℃，并用含有50mM NaCl和0.1M Arg的15mL50mM Tris缓冲液稀释(×3)，通过添加6M HCl水溶液将其调节至pH 8.0。允许折叠在4℃继续进行48h。根据重排监测条件监测折叠。

折叠反应完成(如通过HPLC确定)之后，将样品用TFA酸化至pH＝3，并且通过制备型HPLC纯化，使用C4柱(5μm，20×250mm)以10mL/min的流量在室温以在50min内30％ B至85％ B的梯度。将含有纯化的产物的级分汇集并冻干，以获得作为白色粉末的0.8mg折叠的IL-7多肽(35％收率)。纯的折叠的蛋白的纯度和身份通过分析型HPLC和ESI-MS进一步确认。MS(ESI)：C₇₆₆H₁₂₄₉N₂₁₃O₂₂₅S₆；计算的m/z：17235.0Da[M+H]⁺；实测的m/z：17235.0Da[M+H]⁺。图3B示出了折叠的SEQ ID NO:187IL-7蛋白的表征数据。

在N-末端具有叠氮化物缀合手柄的N-末端修饰的合成IL-7(SEQ ID NO:187)(CMP-095)。

改进用于根据以上方案合成IL-7的方法，以制备在N-末端具有叠氮化物缀合手柄的构建体SEQ ID No:187(组合物AA)。组合物AA与以上制备的SEQ ID NO:187的IL-7多肽(即SEQ ID NO:187)的不同在于，CMP-095含有具有以下结构的修饰的N-末端胺

该形式类似于以上实施例2A中的SEQ ID NO:187的IL-7地制备，其中在N-末端残基的最终Fmoc脱保护之后进行以下修饰。手动偶联反应通过向树脂添加在DMF中的戊二酸酐(CAS RN 108-55-4,114.10mg,5当量)和DIPEA(242μL，7当量)在室温进行2h。其次，在DMF中与商购可得的O-(2-氨基乙基)-O’-(2-叠氮基乙基)九乙二醇(化合物2，421mg，4当量)的偶联通过向树脂添加在DMF中的DIPEA(276μL，8当量)和HATU(300.4mg，3.95当量)在室温进行3小时。

O-(2-氨基乙基)-O’-(2-叠氮基乙基)九乙二醇。

然后按照常规方案洗涤和裂解树脂，并如同上描述的在剩余连接步骤中使用修饰的N-末端片段。

虽然本文已经示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员将明显的是，此类实施方案仅通过示例的方式提供。本领域技术人员现在将想到不偏离本发明的许多变化、改变和替换。应当理解，可以在实践本发明时采用本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案。所附权利要求意图限定本发明的范围，并且从而涵盖在这些权利要求范围内的方法和结构及其等同物。

Claims

1.一种缀合物，所述缀合物包含：(a)抗体或抗原结合片段；(b)长度为约50至约500个氨基酸残基的重组蛋白或合成蛋白；和(c)将所述抗体或所述抗原结合片段连接至所述合成蛋白的一个或更多个接头。

2.根据权利要求1所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头在预先选择的位点处附接至所述抗体或所述抗原结合片段。

3.根据权利要求1或2所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头在所述预先选择的位点处附接至所述重组蛋白或所述合成蛋白。

4.根据权利要求3所述的缀合物，其中所述预先选择的位点不是所述抗体或所述抗原结合片段的抗原结合结构域。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头在(a)一个或更多个非末端氨基酸处附接至所述重组蛋白或所述合成蛋白、所述抗体或所述抗原结合片段。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头包括化学聚合物、双官能接头或其组合。

7.根据权利要求6所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头包括所述双官能接头，并且所述双官能接头包括4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯；马来酰亚胺己酰酯；缬氨酸-瓜氨酸；烯丙基(4-甲氧基苯基)二甲基甲硅烷；6-(烯丙基氧基羰基氨基)-1-己醇；4-氨基丁醛二乙基缩醛；或(E)-N-(2-氨基乙基)-4-{2-[4-(3-叠氮丙氧基)苯基]二氮烯基}苯甲酰胺盐酸盐。

8.根据权利要求6或7所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头包括所述双官能接头，并且所述双官能接头包括酰胺基团、酯基团、醚基团、硫醚基团、羰基基团或其组合。

9.根据权利要求6所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头包括所述化学聚合物，并且所述化学聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。

10.根据权利要求1-9中任一项所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头是可裂解的。

11.根据权利要求1-10中任一项所述的缀合物，其中所述缀合物包含所述合成蛋白。

12.根据权利要求11所述的缀合物，其中所述合成蛋白包含约50至约300个氨基酸残基、约50至约250个氨基酸残基、约50至约200个氨基酸残基、约75至约300个氨基酸残基、约75至约250个氨基酸残基、约75至约200个氨基酸残基、约100至约300个氨基酸残基、约100至约250个氨基酸残基或约100至约200个氨基酸残基。

13.根据权利要求11或12所述的缀合物，其中所述合成蛋白包含含有蛋白缀合手柄的氨基酸残基。

14.根据权利要求13所述的缀合物，其中所述含有蛋白缀合手柄的氨基酸残基在所述合成蛋白的合成期间被掺入。

15.根据权利要求13或14所述的缀合物，其中所述含有蛋白缀合手柄的氨基酸残基是修饰的天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基。

16.根据权利要求13-15中任一项所述的缀合物，其中所述蛋白缀合手柄包含炔烃、叠氮化物、硝酮、异氰化物、四嗪、反式环辛烯、醛、酮、肼、肟、氧杂降冰片二烯、烯烃、四唑、巯基、二硫化物、α-酮酸、环羟胺、O,N-取代的羟胺、酰基硼酸酯或其任何组合。

17.根据权利要求13-16中任一项所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头的至少一部分通过所述蛋白缀合手柄和附接至所述抗体或所述抗原结合片段的抗体缀合手柄之间的缀合反应形成。

18.根据权利要求1-17中任一项所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头的至少一部分通过所述蛋白缀合手柄和附接有双官能试剂的第一试剂缀合手柄之间的缀合反应形成。

19.根据权利要求18所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头的至少一部分通过附接至所述双官能试剂的第二试剂缀合手柄和附接至所述抗体或所述抗原结合片段的抗体缀合手柄之间的第二缀合反应形成。

20.根据权利要求1-19中任一项所述的缀合物，其中所述抗体或所述抗原结合片段包括IgA、IgD、IgE、IgG、IgM，或者由其衍生。

21.根据权利要求20所述的缀合物，其中所述抗体或所述抗原结合片段包括所述IgG，或者由其衍生。

22.根据权利要求21所述的缀合物，其中所述IgG包括IgG1、IgG2a、IgG4，或者由其衍生。

23.根据权利要求1-22中任一项所述的缀合物，其中所述抗体或所述抗原结合片段是人源化的、人类的、嵌合的、接枝的、去免疫的或其组合。

24.根据权利要求1-23中任一项所述的缀合物，所述缀合物包含所述抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含Fc区的至少一部分。

25.根据权利要求1-24中任一项所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头在所述抗体或所述抗原结合片段的Fc区的氨基酸残基处连接至所述抗体或所述抗原结合片段。

26.根据权利要求24或25所述的缀合物，其中所述抗体或所述抗原结合片段的Fc区包含与SEQ ID NO:151中列出的序列至少约80％、85％、90％、95％或更多相同的氨基酸序列。

27.根据权利要求26所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头在对应于SEQ ID NO:151的氨基酸序列的氨基酸残基20-110的Fc区中的氨基酸残基处连接至所述抗体或抗原结合片段。

28.根据权利要求26或27所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头在对应于SEQ IDNO:151的氨基酸序列的位置25至35、位置70至80或位置95至105之一位置处的氨基酸残基处连接至所述抗体或所述抗原结合片段。

29.根据权利要求1-28中任一项所述的组合物，其中接头在所述Fc区处K248氨基酸残基、K288氨基酸残基、K317氨基酸残基或其组合(Eu编号)的位置处附接至所述抗体。

30.根据权利要求29所述的组合物，其中所述第二附接点位于所述K248氨基酸残基处。

31.根据权利要求1-30中任一项所述的缀合物，其中所述抗体或所述抗原结合片段与癌症抗原、免疫细胞靶分子、自身抗原或其组合选择性结合。

32.根据权利要求31所述的缀合物，其中所述抗体或所述抗原结合片段与所述癌症抗原选择性结合，并且所述癌症抗原是细胞程序性死亡1(PD1)、细胞程序性死亡配体1(PDL1)、CD5、CD20、CD19、CD22、CD30、CD33、CD40、CD44、CD52、CD74、CD103、CD137、CD123、CD152、癌胚抗原(CEA)、整联蛋白、表皮生长因子(EGF)受体家族成员、血管表皮生长因子(VEGF)、蛋白聚糖、二唾液酸神经节苷脂、B7-H3、癌症抗原125(CA-125)、上皮细胞黏附分子(EpCAM)、血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2、肿瘤相关糖蛋白、黏蛋白1(MUC1)、肿瘤坏死因子受体、胰岛素样生长因子受体、叶酸受体α、跨膜糖蛋白NMB、C-C趋化因子受体、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体型酪氨酸蛋白激酶(RON)受体、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、结肠癌抗原19.9、胃癌黏蛋白抗原4.2、结直肠上皮癌抗原A33、ADAM-9、AFP癌胎抗原-甲胎蛋白、ALCAM、BAGE、β-连环蛋白、羧肽酶M、B1、CD23、CD25、CD27、CD28、CD36、CD45、CD46、CD52、CD56、CD79a/CD79b、CD317、CDK4、CO-43(血型Le^b)、CO-514(血型Le^a)、CTLA-1、细胞角蛋白8、DR5、E1系列(B血型)、Ephrin受体A2(EphA2)、Erb(ErbB1、ErbB3、ErbB4)、肺腺癌抗原F3、抗原FC10.2、GAGE-1、GAGE-2、GD2/GD3/GD49/GM2/GM3、GICA19-9、gp37、gp75、gp100、HER-2/neu、人类乳脂球抗原、人类乳头瘤病毒-E6/人类乳头瘤病毒-E7、高分子量黑素瘤抗原(HMW-MAA)、分化抗原(I抗原)、存在于胃腺癌中的I(Ma)、整联蛋白α-V-β-6、整联蛋白β6(ITGβ6)、白细胞介素-13受体α2(IL13Rα2)、JAM-3、KID3、KID31、KS1/4泛上皮癌抗原、KSA(17-1A)、人类肺上皮癌抗原L6、人类肺上皮癌抗原L20、LEA、LUCA-2、M1:22:25:8、M18、M39、MAGE-1、MAGE-3、MART、Myl、MUM-1、N-乙酰葡糖胺基转移酶、新糖蛋白、NS-10、OFA-1和OFA-2、制瘤素M(制瘤素受体β)、rho15、前列腺特异性抗原(PSA)、PSMA、多态性上皮黏蛋白抗原(PEMA)、PIPA、前列腺酸性磷酸酯、R24、ROR1、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、sTn、T细胞受体衍生肽、T5A7、组织抗原37、TAG-72、TL5(血型A)、TNF-α受体(TNFαR)、TNFβR、TNFγR、TRA-1-85(血型H)、转铁蛋白受体、TSTA肿瘤特异性移植抗原、VEGF-R、Y半抗原、Le^y、5T4或其组合。

33.根据权利要求31所述的缀合物，其中所述抗体或所述抗原结合片段与所述自身抗原选择性结合，并且所述自身抗原是肿瘤坏死因子α(TNFα)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白(PLP)、II型胶原(CII)、波形蛋白、α-烯醇酶、簇集素、组蛋白、肽基精氨酸脱亚胺酶-4、转谷氨酰胺酶2(TG2、TGM2)、CD318、肽聚糖识别蛋白1(PGLYRP1)或其组合。

34.根据权利要求31所述的缀合物，其中所述抗体或所述抗原结合片段与所述免疫细胞靶分子选择性结合，并且所述免疫细胞靶分子是PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、CD28、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、ICOS配体、ICOS、B7-H3、B7-H4、VISTA、B7-H7(HHLA2)、TMIGD2、4-1BBL、4-1BB、HVEM、BTLA、CD160、LIGHT、MHC I类、MHC II类、LAG3、OX40L、OX40、CD70、CD27、CD40、CD40L、GITRL、GITR、CD155、DNAM-1、TIGIT、CD96、CD48、2B4、半乳凝素-9、TIM-3、腺苷、腺苷A2a受体、CEACAM1、CD47、SIRPα、BTN2A1、DC-SIGN、CD200、CD200R、TL1A、DR3或其组合。

35.根据权利要求1-34中任一项所述的缀合物，其中所述合成蛋白包括治疗性蛋白。

36.根据权利要求1-35中任一项所述的缀合物，其中所述合成蛋白包括细胞因子。

37.根据权利要求36所述的缀合物，其中所述细胞因子包括修饰的白细胞介素2(IL2)、修饰的IL7、修饰的IL18或其组合。

38.根据权利要求37所述的缀合物，其中所述细胞因子包括所述修饰的IL2。

39.根据权利要求35所述的缀合物，其中所述修饰的IL2具有与SEQ ID NO:1-23或SEQID NO:176-185中的任何一个至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列。

40.根据权利要求37所述的缀合物，其中所述细胞因子包括所述修饰的IL7。

41.根据权利要求37所述的缀合物，其中所述修饰的IL7包含与SEQ ID NO:165-169或SEQ ID NO:186或187中的任何一个至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且包含含有蛋白缀合手柄的氨基酸残基。

42.根据权利要求37所述的缀合物，其中所述细胞因子包括所述修饰的IL18。

43.根据权利要求42所述的缀合物，其中所述修饰的IL18包含与SEQ ID NO:170-175中的任何一个至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％相同的氨基酸序列，并且包含含有蛋白缀合手柄的氨基酸残基。

44.根据权利要求38、40和42中任一项所述的缀合物，其中所述含有蛋白缀合手柄的氨基酸残基在所述细胞因子的合成期间被掺入。

45.根据权利要求44所述的缀合物，其中所述含有蛋白缀合手柄的氨基酸残基是修饰的天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基。

46.根据权利要求38、40、42、44和45中任一项所述的缀合物，其中所述蛋白缀合手柄包含炔烃、叠氮化物、硝酮、异氰化物、四嗪、反式环辛烯、醛、酮、肼、肟、氧杂降冰片二烯、烯烃、四唑、巯基、二硫化物、α-酮酸、环羟胺、硫酯、O,N-取代的羟胺、酰基硼酸酯或其任何组合。

47.一种缀合物，所述缀合物包含：(a)抗体或抗原结合片段；(b)第一重组蛋白或合成蛋白和第二重组蛋白或合成蛋白，每种蛋白的长度是约50个氨基酸残基至约500个氨基酸残基；和(c)第一接头和第二接头，每个接头将所述抗体或所述抗原结合片段连接至所述第一合成蛋白或所述第二合成蛋白。

48.根据权利要求47所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头在预先选择的位点处附接至所述抗体或所述抗原结合片段。

49.根据权利要求47或48所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头在预先选择的位点处附接至所述重组蛋白或所述合成蛋白。

50.根据权利要求49所述的缀合物，其中所述预先选择的位点不是所述抗体或所述抗原结合片段的抗原结合结构域。

51.根据权利要求47-50中任一项所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头在非末端氨基酸处附接至所述重组蛋白或所述合成蛋白、所述抗体或所述抗原结合片段。

52.根据权利要求47-50中任一项所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头包括化学聚合物、双官能接头或其组合。

53.根据权利要求52所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头包括所述双官能接头，并且其中所述双官能接头包括4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯；马来酰亚胺己酰酯；缬氨酸-瓜氨酸；烯丙基(4-甲氧基苯基)二甲基甲硅烷；6-(烯丙基氧基羰基氨基)-1-己醇；4-氨基丁醛二乙基缩醛；或(E)-N-(2-氨基乙基)-4-{2-[4-(3-叠氮丙氧基)苯基]二氮烯基}苯甲酰胺盐酸盐。

54.根据权利要求52或53所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头包括所述双官能接头，并且其中所述双官能接头包括酰胺基团、酯基团、醚基团、硫醚基团、羰基基团或其组合。

55.根据权利要求52所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头包括所述化学聚合物，其中所述化学聚合物包括聚(环氧烷)、多糖、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙烯醇)、聚噁唑啉、聚(丙烯酰吗啉)或其组合。

56.根据权利要求47-55中任一项所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头是可裂解的。

57.根据权利要求47-56中任一项所述的缀合物，其中所述重组蛋白或所述合成蛋白包含约50至约300个氨基酸残基、约50至约250个氨基酸残基、约50至约200个氨基酸残基、约75至约300个氨基酸残基、约75至约250个氨基酸残基、约75至约200个氨基酸残基、约100至约300个氨基酸残基、约100至约250个氨基酸残基或约100至约200个氨基酸残基。

58.根据权利要求47-57中任一项所述的缀合物，其中所述合成蛋白包含含有蛋白缀合手柄的氨基酸残基。

59.根据权利要求58所述的缀合物，其中所述含有蛋白缀合手柄的氨基酸残基在所述重组蛋白或所述合成蛋白的合成期间被掺入。

60.根据权利要求58或59所述的缀合物，其中所述含有蛋白缀合手柄的氨基酸残基是修饰的天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基。

61.根据权利要求58-60中任一项所述的缀合物，其中所述蛋白缀合手柄包含炔烃、叠氮化物、硝酮、异氰化物、四嗪、反式环辛烯、醛、酮、肼、肟、氧杂降冰片二烯、烯烃、四唑、巯基、二硫化物、α酮酸、环羟胺、硫酯、O,N-取代的羟胺、酰基硼酸酯或其任何组合。

62.根据权利要求58-61中任一项所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头的至少一部分通过所述蛋白缀合手柄和附接至所述抗体或所述抗原结合片段的抗体缀合手柄之间的缀合反应形成。

63.根据权利要求47-62中任一项所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头的至少一部分通过所述蛋白缀合手柄和附接有双官能试剂的第一试剂缀合手柄之间的缀合反应形成。

64.根据权利要求63所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头的至少一部分通过附接至所述双官能试剂的第二试剂缀合手柄和附接至所述抗体或所述抗原结合片段的抗体缀合手柄之间的第二缀合反应形成。

65.根据权利要求47-64中任一项所述的缀合物，其中所述抗体或抗原结合片段包括IgA、IgD、IgE、IgG、IgM，或者由其衍生。

66.根据权利要求65所述的缀合物，其中所述抗体或所述抗原结合片段包括所述IgG，或者由其衍生。

67.根据权利要求66所述的缀合物，其中所述IgG包括IgG1、IgG2a、IgG4，或者由其衍生。

68.根据权利要求47-67中任一项所述的缀合物，其中所述抗体或所述抗原结合片段是人源化的、人类的、嵌合的、接枝的、去免疫的或其组合。

69.根据权利要求47-68中任一项所述的缀合物，所述缀合物包含所述抗原结合片段，其中所述抗原结合片段包含Fc区的至少一部分。

70.根据权利要求47-69中任一项所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头在所述抗体或所述抗原结合片段的Fc区的氨基酸残基处连接至所述抗体或所述抗原结合片段。

71.根据权利要求69或70所述的缀合物，其中所述抗体或所述抗原结合片段的Fc区包含与SEQ ID NO:151中列出的序列至少约80％、85％、90％、95％或更多相同的氨基酸序列。

72.根据权利要求71所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头在对应于SEQ ID NO:151的氨基酸序列的氨基酸残基10-90的Fc区中的氨基酸残基处连接至所述抗体或所述抗原结合片段。

73.根据权利要求71或72所述的缀合物，其中所述一个或更多个接头在对应于SEQ IDNO:151的氨基酸序列的氨基酸残基25至35、氨基酸残基70至80或氨基酸残基95至105之一位置处的氨基酸残基处连接至所述抗体或所述抗原结合片段。

74.根据权利要求47-73中任一项所述的缀合物，其中所述抗体或所述抗原结合片段与癌症抗原、免疫细胞靶分子、自身抗原或其组合选择性结合。

75.根据权利要求74所述的缀合物，其中所述抗体或所述抗原结合片段与所述癌症抗原选择性结合，并且所述癌症抗原是细胞程序性死亡1(PD1)、细胞程序性死亡配体1(PDL1)、CD5、CD20、CD19、CD22、CD30、CD33、CD40、CD44、CD52、CD74、CD103、CD137、CD123、CD152、癌胚抗原(CEA)、整联蛋白、表皮生长因子(EGF)受体家族成员、血管表皮生长因子(VEGF)、蛋白聚糖、二唾液酸神经节苷脂、B7-H3、癌症抗原125(CA-125)、上皮细胞黏附分子(EpCAM)、血管内皮生长因子受体1、血管内皮生长因子受体2、肿瘤相关糖蛋白、黏蛋白1(MUC1)、肿瘤坏死因子受体、胰岛素样生长因子受体、叶酸受体α、跨膜糖蛋白NMB、C-C趋化因子受体、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、受体型酪氨酸蛋白激酶(RON)受体、细胞毒性T淋巴细胞抗原4(CTLA4)、结肠癌抗原19.9、胃癌黏蛋白抗原4.2、结直肠上皮癌抗原A33、ADAM-9、AFP癌胎抗原-甲胎蛋白、ALCAM、BAGE、β-连环蛋白、羧肽酶M、B1、CD23、CD25、CD27、CD28、CD36、CD45、CD46、CD52、CD56、CD79a/CD79b、CD317、CDK4、CO-43(血型Le^b)、CO-514(血型Le^a)、CTLA-1、细胞角蛋白8、DR5、E1系列(B血型)、Ephrin受体A2(EphA2)、Erb(ErbB1、ErbB3、ErbB4)、肺腺癌抗原F3、抗原FC10.2、GAGE-1、GAGE-2、GD2/GD3/GD49/GM2/GM3、GICA19-9、gp37、gp75、gp100、HER-2/neu、人类乳脂球抗原、人类乳头瘤病毒-E6/人类乳头瘤病毒-E7、高分子量黑素瘤抗原(HMW-MAA)、分化抗原(I抗原)、存在于胃腺癌中的I(Ma)、整联蛋白α-V-β-6、整联蛋白β6(ITGβ6)、白细胞介素-13受体α2(IL13Rα2)、JAM-3、KID3、KID31、KS1/4泛上皮癌抗原、KSA(17-1A)、人类肺上皮癌抗原L6、人类肺上皮癌抗原L20、LEA、LUCA-2、M1:22:25:8、M18、M39、MAGE-1、MAGE-3、MART、Myl、MUM-1、N-乙酰葡糖胺基转移酶、新糖蛋白、NS-10、OFA-1和OFA-2、制瘤素M(制瘤素受体β)、rho15、前列腺特异性抗原(PSA)、PSMA、多态性上皮黏蛋白抗原(PEMA)、PIPA、前列腺酸性磷酸酯、R24、ROR1、SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、sTn、T细胞受体衍生肽、T5A7、组织抗原37、TAG-72、TL5(血型A)、TNF-α受体(TNFαR)、TNFβR、TNFγR、TRA-1-85(血型H)、转铁蛋白受体、TSTA肿瘤特异性移植抗原、VEGF-R、Y半抗原、Le^y、5T4或其组合。

76.根据权利要求74所述的缀合物，其中所述抗体或所述抗原结合片段与所述自身抗原选择性结合，并且所述自身抗原是肿瘤坏死因子α(TNFα)、髓鞘碱性蛋白(MBP)、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)、蛋白脂质蛋白(PLP)、II型胶原(CII)、波形蛋白、α-烯醇酶、簇集素、组蛋白、肽基精氨酸脱亚胺酶-4、转谷氨酰胺酶2(TG2、TGM2)、CD318、肽聚糖识别蛋白1(PGLYRP1)或其组合。

77.根据权利要求74所述的缀合物，其中所述抗体或所述抗原结合片段与所述免疫细胞靶分子选择性结合，所述免疫细胞靶分子是PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、CD28、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、ICOS配体、ICOS、B7-H3、B7-H4、VISTA、B7-H7(HHLA2)、TMIGD2、4-1BBL、4-1BB、HVEM、BTLA、CD160、LIGHT、MHC I类、MHC II类、LAG3、OX40L、OX40、CD70、CD27、CD40、CD40L、GITRL、GITR、CD155、DNAM-1、TIGIT、CD96、CD48、2B4、半乳凝素-9、TIM-3、腺苷、腺苷A2a受体、CEACAM1、CD47、SIRPα、BTN2A1、DC-SIGN、CD200、CD200R、TL1A、DR3或其组合。

78.根据权利要求47-77中任一项所述的缀合物，其中所述合成蛋白包括治疗性蛋白。

79.根据权利要求47-78中任一项所述的缀合物，其中所述合成蛋白包括细胞因子。

80.根据权利要求79所述的缀合物，其中所述细胞因子包括修饰的白细胞介素2(IL2)、修饰的IL7、修饰的IL18或其组合。

81.根据权利要求80所述的缀合物，其中所述细胞因子包括所述修饰的IL2。

82.根据权利要求81所述的缀合物，其中所述修饰的IL2具有与SEQ ID NO:1-23或SEQID NO:176-185中的任何一个至少80％相同的氨基酸序列。

83.根据权利要求80所述的缀合物，其中所述细胞因子包括所述修饰的IL7。

84.根据权利要求83所述的缀合物，其中所述修饰的IL7包含与SEQ ID NO:165-169或SEQ ID NO:186或187中的任何一个至少80％相同的氨基酸序列，并且包含含有蛋白缀合手柄的氨基酸残基。

85.根据权利要求80所述的缀合物，其中所述细胞因子包括所述修饰的IL18。

86.根据权利要求85所述的缀合物，其中所述修饰的IL18包含与SEQ ID NO:170-175中的任何一个至少80％相同的氨基酸序列，并且包含含有蛋白缀合手柄的氨基酸残基。

87.根据权利要求81、83和85中任一项所述的缀合物，其中所述含有蛋白缀合手柄的氨基酸残基在所述合成蛋白的合成期间被掺入。

88.根据权利要求87所述的缀合物，其中所述含有蛋白缀合手柄的氨基酸残基是修饰的天然氨基酸残基或非天然氨基酸残基。

89.根据权利要求81、83、85、87和88中任一项所述的缀合物，其中所述蛋白缀合手柄包含炔烃、叠氮化物、硝酮、异氰化物、四嗪、反式环辛烯、醛、酮、肼、肟、氧杂降冰片二烯、烯烃、四唑、巯基、二硫化物、α-酮酸、环羟胺、硫酯、O,N-取代的羟胺、酰基硼酸酯或其任何组合。

90.根据权利要求47-89中任一项所述的缀合物，其中所述第一合成蛋白和所述第二合成蛋白包含相同的氨基酸序列。

91.根据权利要求47-89中任一项所述的缀合物，其中所述合成蛋白是不同的合成蛋白。

92.根据权利要求47-91中任一项所述的缀合物，其中所述第一接头和所述第二接头相同。

93.根据权利要求47-91中任一项所述的缀合物，其中所述第一接头和所述第二接头彼此不同。

94.根据权利要求1-93中任一项所述的缀合物，其中所述抗体或所述抗原结合片段与PD1、PDL1、TNFα、CD20、VEGF或其组合选择性结合。

95.一种根据权利要求1-94中任一项所述的缀合物的群体，其中所述缀合物的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％中的每一个的接头附接至每种重组蛋白或每种合成蛋白的相同氨基酸残基位置。

96.根据权利要求95所述的缀合物的群体，其中所述缀合物的至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％或至少约99％中的每一个的接头附接至每种抗体或抗原结合片段的氨基酸残基位置的相同子集。

97.根据权利要求95或96所述的缀合物的群体，其中所述氨基酸残基位置的子集包括至多1、至多2、至多3、至多4、至多5或至多6个氨基酸残基位置。

98.根据权利要求95-97中任一项所述的缀合物的群体，包括1至约1×10¹⁵个缀合物。

99.根据权利要求95-98中任一项所述的缀合物的群体，其中所述抗体或所述抗原结合片段与PD1、PDL1、TNFα、CD20、VEGF或其组合选择性结合。

100.一种制备缀合物的方法，所述方法包括：

a)化学合成合成蛋白或制备重组蛋白，其中所述蛋白包含蛋白缀合手柄；

b)提供抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含抗体缀合手柄，所述抗体缀合手柄与所述蛋白缀合手柄互补；并且

c)在所述蛋白缀合手柄和所述抗体缀合手柄之间形成共价键。

101.一种制备缀合物的方法，所述方法包括：

b)提供抗体或抗原结合片段，其中所述抗体或抗原结合片段包含抗体缀合手柄；

c)提供具有第一试剂缀合手柄和第二试剂缀合手柄的双官能试剂，

其中所述第一试剂缀合手柄与所述蛋白缀合手柄互补，并且

其中所述第二试剂缀合手柄与所述抗体缀合手柄互补；

d)在所述蛋白缀合手柄和所述第一试剂缀合手柄之间形成第一共价键；并且

e)在所述抗体缀合手柄和所述第二试剂缀合手柄之间形成第二共价键。

102.根据权利要求100或101所述的方法，其中所述缀合物包含所述合成蛋白，并且化学合成所述合成蛋白包括连接两个或更多个片段肽。

103.根据权利要求102所述的方法，其中连接所述两个或更多个片段肽包括天然化学连接(NCL)反应及其变体、α-酮酸-羟胺(KAHA)连接反应、双(2-硫烷基乙基)酰胺(SEA)连接反应、Staudinger连接反应、丝氨酸/苏氨酸连接反应、酰基三氟硼酸钾(KAT)连接或其任何组合。

104.根据权利要求102或103所述的方法，其中所述两个或更多个片段肽中的一个或全部包含含有所述蛋白缀合手柄或所述蛋白缀合手柄的受保护形式的氨基酸残基。

105.根据权利要求100-104中任一项所述的方法，其中所述合成蛋白或所述重组蛋白与所述蛋白的天然形式或野生型蛋白氨基酸序列至少约80％、至少约85％或至少约90％相同。

106.根据权利要求100-105所述的方法，其中所述缀合物包含所述重组蛋白。

107.根据权利要求100-106中任一项所述的方法，其中提供包含所述抗体缀合手柄的抗体或抗原结合片段包括将所述抗体缀合手柄共价附接至所述抗体或所述抗原结合片段。

108.根据权利要求100-107中任一项所述的方法，其中所述缀合手柄包括可裂解接头。

109.根据权利要求108所述的方法，其中所述可裂解接头包括腙和酰肼部分；含有二硫化物的接头，诸如N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫基)戊酸酯(SPP)和N-琥珀酰亚胺基-4-(2-吡啶基二硫代)丁酸酯(SPDB)；4-(E4’-乙酰基苯氧基)丁酸(AcBut)接头；二肽缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)或苯丙氨酸-赖氨酸(Phe-Lys)。

110.根据权利要求109所述的方法，其中所述可裂解接头在肿瘤微环境附近、肿瘤微环境处或肿瘤微环境中被有条件地裂解。

111.根据权利要求100-110中任一项所述的方法，其中所述缀合手柄包括不可裂解接头。

112.根据权利要求111所述的方法，其中所述不可裂解接头包括酰胺部分；SMCC(4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯)，或马来酰亚胺己酰基(mc)部分、硫醚、二苯并环辛炔叠氮化物环加合物。

113.根据权利要求100-112中任一项所述的方法，其中所述缀合手柄包括在肿瘤微环境附近、肿瘤微环境处或肿瘤微环境中被物理裂解的接头。

114.根据权利要求100-113中任一项所述的方法，其中所述缀合手柄包含炔烃、叠氮化物、硝酮、异氰化物、四嗪、反式环辛烯、醛、酮、肼、肟、氧杂降冰片二烯、烯烃、四唑、巯基、二硫化物、α-酮酸、环羟胺、硫酯、O,N-取代的羟胺、酰基硼酸酯或其任何组合。

115.根据权利要求100-114中任一项所述的方法，其中所述抗体缀合手柄附接至所述抗体或所述抗原结合片段上的预先选择的位点。

116.根据权利要求100-115中任一项所述的方法，其中将所述抗体缀合手柄共价附接至所述抗体或所述抗原结合片段包括使所述抗体或所述抗原结合片段与亲和肽接触，使所述抗体或所述抗原结合片段与酶接触，使所述抗体或所述抗原结合片段与还原剂接触，或其任何组合。

117.根据权利要求116所述的方法，其中所述亲和肽与所述抗体或所述抗原结合片段的一部分选择性结合。

118.根据权利要求116所述的方法，其中所述酶是转谷氨酰胺酶或糖苷酶。

119.根据权利要求116所述的方法，其中所述还原剂还原所述抗体或所述抗原结合片段的一个或更多个二硫键。

120.一种治疗有相应需要的受试者的疾病或紊乱的方法，所述方法包括向所述受试者施用权利要求1-94中任一项所述的缀合物或权利要求95-99中任一项所述的缀合物的群体。

121.根据权利要求120所述的方法，其中所述疾病或紊乱包括癌症。

122.根据权利要求121所述的方法，其中所述癌症包括原发性肿瘤或其转移。

123.根据权利要求121或122所述的方法，其中所述癌症包括上皮癌、肉瘤、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤、胸腺瘤、黑素瘤或其组合。

124.根据权利要求123所述的方法，其中所述癌症包括所述上皮癌，并且其中所述上皮癌包括皮肤鳞状细胞癌(CSCC)、尿路上皮癌(UC)、肾细胞癌(RCC)、肝细胞癌(HCC)、头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、食管鳞状细胞癌(ESCC)、胃食管结合部(GEJ)癌、子宫内膜癌(EC)、Merkel细胞癌(MCC)或其组合。

125.根据权利要求121-124中任一项所述的方法，其中所述癌症包括肺癌、膀胱癌(BC)、微卫星不稳定性高(MSI-H)/错配修复缺陷(dMMR)实体瘤、肿瘤突变负荷高(TMB-H)实体瘤、三阴性乳腺癌(TNBC)、胃癌(GC)、宫颈癌(CC)、胸膜间皮瘤(PM)、霍奇金淋巴瘤(HL)、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤、经典霍奇金淋巴瘤(cHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBCL)、套细胞淋巴瘤、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、毛细胞白血病(HCL)、多发性骨髓瘤、胸腺瘤、黑素瘤或其组合。

126.根据权利要求120所述的方法，其中所述疾病或紊乱包括自身免疫性疾病。

127.根据权利要求126所述的方法，其中所述自身免疫性疾病包括多发性硬化(MS)、类风湿性关节炎(RA)、肉芽肿性多血管炎(GPA)、(韦格纳肉芽肿病)、显微镜下多血管炎(MPA)、寻常性天疱疮(PV)或其组合。

128.根据权利要求120所述的方法，其中所述疾病或紊乱包括炎性紊乱。

129.根据权利要求128所述的方法，其中所述炎性紊乱包括炎症(例如，软骨炎症)、自身免疫性疾病、特应性疾病、副肿瘤性自身免疫性疾病、关节炎、类风湿性关节炎(例如，活动性)、幼年型关节炎、幼年型特发性关节炎、幼年型类风湿性关节炎、少关节类风湿性关节炎、少关节幼年型类风湿性关节炎、多关节幼年型类风湿性关节炎、全身性发作幼年型类风湿性关节炎、幼年型银屑病关节炎、银屑病关节炎、多关节类风湿性关节炎、全身性发作类风湿性关节炎、强直性脊柱炎、幼年型强直性脊柱炎、幼年型肠病性关节炎、反应性关节炎、幼年型反应性关节炎、Reiter综合征、幼年型Reiter综合征、幼年型皮肌炎、幼年型硬皮病、幼年型血管炎、肠病性关节炎、SEA综合征(血清阴性、肌腱端病、关节病综合征)、皮肌炎、银屑病关节炎、硬皮病、血管炎、肌炎、多肌炎、皮肌炎、结节性多动脉炎、韦格纳肉芽肿病、动脉炎、风湿性多肌痛、结节病、硬化、原发性胆汁性硬化、硬化性胆管炎、干燥综合征、银屑病、斑块状银屑病、滴状银屑病、反转型银屑病、脓疱性银屑病、红皮病银屑病、皮炎、特应性皮炎、疱疹样皮炎、白塞氏病、脱发、斑秃、全秃、动脉粥样硬化、狼疮、斯蒂尔病、重症肌无力、炎性肠病(IBD)、克罗恩病、溃疡性结肠炎、乳糜泻、哮喘、COPD、鼻窦炎、鼻窦炎伴鼻息肉、嗜酸性粒细胞食道炎、嗜酸性粒细胞支气管炎、格林-巴利病、甲状腺炎(例如，格雷夫斯病)、艾迪生氏病、雷诺现象、自身免疫性肝炎、移植物抗宿主病、类固醇难治性慢性移植物抗宿主病、移植排斥反应(例如，肾、肺、心脏、皮肤等)、肾损伤、丙型肝炎诱导的血管炎、自发流产、白癜风、局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)、微小病变疾病、膜性肾病、ANCA相关肾小球肾病、膜增生性肾小球肾炎、IgA肾病、狼疮性肾炎或其组合。

130.根据权利要求120-129中任一项所述的方法，其中所述缀合物抑制或中和靶抗原的活性。

131.根据权利要求130所述的方法，其中所述缀合物靶向癌症内的T细胞。

132.根据权利要求120-129中任一项所述的方法，其中所述缀合物经由与IL2Rβγ复合物的相互作用激活T细胞、自然杀伤(NK)细胞或其组合。

133.根据权利要求132所述的方法，其中所述缀合物的药代动力学由于IgG的偶联而增强。