JP2023538422A - 修飾ｉｌ－１８ポリペプチドおよびその使用 - Google Patents

修飾ｉｌ－１８ポリペプチドおよびその使用 Download PDF

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キャラロット，ジャン－フィリップ
ボーデ，ジェフリー，ウィリアム
アレヴァロ－ルイス，マチルデ
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Abstract

本開示は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む組成物、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを作製する方法、および疾患の処置のために修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを使用する方法に関する。一態様では、本開示は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを用いた癌の処置に関する。いくつかの実施形態では、本開示のＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＦＮγの産生を誘導する。いくつかの実施形態では、本開示のＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８結合タンパク質により中和されることなくＩＦＮγの産生を誘導する。【選択図】図４

Description

相互参照
本出願は２０２０年８月１９日出願の米国仮特許出願第６３／０６７，６５８号に基づく利益を主張し、当該仮出願はその全体を参照することで本明細書に援用される。
配列表
本出願は、ＡＳＣＩＩフォーマットで電子的に提出され、参照により本明細書で援用される配列表を含んでいる。２０２１年８月１６日作製の当該ＡＳＣＩＩのコピーは、ファイル名９４９１７＿０００９＿７０７６０１ＷＯ＿ＳＬ．ｔｘｔであり、サイズは１８５，３７６バイトである。
免疫療法は、病気の処置を補助するのに対象の免疫系を利用する。免疫療法は、処置されている疾患の性質に応じて免疫系を活性化または抑制するように設計できる。癌の処置における免疫療法は、免疫系が腫瘍または他の癌組織を認識して破壊するように免疫系を刺激することを目標としている。免疫系を活性化して対象の身体中の癌細胞を攻撃する方法の１つは、サイトカイン療法である。サイトカインは、細胞シグナル伝達と免疫系の調節に重要な、体内で産生されるタンパク質である。一部のサイトカイン療法は、対象の免疫系を増強して癌細胞を死滅させるために、かかるサイトカイン特性を利用する。
本明細書中の一態様では、Ｅ０６ＫとＫ５３Ａとを含む修飾インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）ポリペプチドを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドであって、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに基づく、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが記載される。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドはＴ６３Ａをさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｙ０１Ｘ、Ｆ０２Ｘ、Ｃ３８Ｘ、Ｄ５４Ｘ、Ｓ５５Ｘ、Ｃ６８Ｘ、Ｋ７０Ｘ、Ｃ７６Ｘ、またはＣ１２７Ｘのうち少なくとも１つをさらに含み、Ｘはアミノ酸またはアミノ酸誘導体である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｙ０１Ｇ、Ｆ０２Ａ、Ｃ３８Ｓ、Ｄ５４Ａ、Ｓ５５Ａ、Ｃ６８Ｓ、Ｋ７０Ｃ、Ｃ７６Ｓ、またはＣ１２７Ｓのうち少なくとも１つをさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｙ０１Ｘ、Ｆ０２Ｘ、Ｃ３８Ｘ、Ｄ５４Ｘ、Ｓ５５Ｘ、Ｃ６８Ｘ、Ｅ６９Ｘ、もしくはＫ７０Ｘ、Ｃ７６Ｘ、またはＣ１２７Ｘのうち少なくとも１つを含み、Ｘはアミノ酸またはアミノ酸誘導体である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｙ０１Ｇ、Ｆ０２Ａ、Ｃ３８Ｓ、Ｃ３８Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｓ５５Ａ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ６８Ａ、Ｅ６９Ｃ、Ｋ７０ＣＣ７６Ｓ、Ｃ７６Ａ、Ｃ１２７Ａ、またはＣ１２７Ｓのうち少なくとも１つをさらに含む。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基６５、残基６６、残基６７、残基６８、残基６９、残基７０、残基７１、残基７２、残基７３、残基７４、または残基７５にて共有結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基Ｃ６８にて共有結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基６９にて共有結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基Ｅ６９にて共有結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基Ｅ６９Ｃにて共有結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基７０にて共有結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基Ｋ７０にて共有結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基Ｋ７０Ｃにて共有結合されたポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、ポリマーの重量平均分子量は、最大約５０，０００ダルトン、最大約２５，０００ダルトン、最大約１０，０００ダルトン、または最大約６，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、ポリマーの重量平均分子量は、最低約１２０ダルトン、最低約２５０ダルトン、最低約３００ダルトン、最低約４００ダルトン、または最低約５００ダルトンである。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、コンジュゲーションハンドル、またはコンジュゲーションハンドルと相補的コンジュゲーションハンドルとの反応生成物を含む。いくつかの実施形態では、ポリマーは、アジド部分、アルキン部分、またはアジド－アルキン付加環化反応の反応生成物を含む。いくつかの実施形態では、ポリマーはアジド部分を含む。いくつかの実施形態では、ポリマーは水溶性ポリマーである。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）含む。いくつかの実施形態では、ポリ（アルキレンオキシド）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコールの重量平均分子量は、約１０ｋＤａ～約５０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコールの重量平均分子量は、約１０ｋＤａ、約２０ｋＤａ、または約３０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコールの重量平均分子量は、約３０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコールの重量平均分子量は、約１ｋＤａ～約１０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコールの重量平均分子量は、約１ｋＤａ、約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約７．５ｋＤａ、または約１０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの半減期は、対応する野生型ＩＬ－１８ポリペプチドの半減期より少なくとも１０％長い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの半減期は、対応する野生型ＩＬ－１８ポリペプチドの半減期より少なくとも３０％長い。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｎ末端伸長部を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｎ末端トランケーションを含む。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号２～５８に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号２～８３に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号２～５８に対して少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２または配列番号１８に対して少なくとも約８０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２に対して少なくとも約８０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２に対して少なくとも約９０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２に対して少なくとも約９５％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号１８に対して少なくとも約８０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号１８に対して少なくとも約９０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号１８に対して少なくとも約９５％同一である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは組換え型である。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、（ａ）残基２６～３６のいずれか１つに位置するホモセリン残基、（ｂ）残基６０～８０のいずれか１つに位置するホモセリン残基、（ｃ）残基１１０～１２０のいずれか１つに位置するホモセリン残基、（ｄ）残基２８～３８のいずれか１つに位置するノルロイシン残基、（ｄ）残基４６～５６のいずれか１つに位置するノルロイシン残基、（ｅ）残基５４～６４のいずれか１つに位置するノルロイシン残基、（ｆ）残基８０～９０のいずれか１つに位置するノルロイシン残基、（ｇ）残基１０８～１１８のいずれか１つに位置するノルロイシン残基、および（ｈ）残基１４５～１５５のいずれか１つに位置するノルロイシン残基から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、（ａ）残基２６～３６のいずれか１つに位置するホモセリン残基、（ｂ）残基６０～８０のいずれか１つに位置するホモセリン残基、（ｃ）残基１１０～１２０のいずれか１つに位置するホモセリン残基、（ｄ）残基２８～３８のいずれか１つに位置するノルロイシンまたはＯ－メチル－ホモセリン残基、（ｄ）残基４６～５６のいずれか１つに位置するノルロイシンまたはＯ－メチル－ホモセリン残基、（ｅ）残基５４～６４のいずれか１つに位置するノルロイシンまたはＯ－メチル－ホモセリン残基、（ｆ）残基８０～９０のいずれか１つに位置するノルロイシンまたはＯ－メチル－ホモセリン残基、（ｇ）残基１０８～１１８のいずれか１つに位置するノルロイシンまたはＯ－メチル－ホモセリン残基、および（ｈ）残基１４５～１５５のいずれか１つに位置するノルロイシンまたはＯ－メチル－ホモセリン残基から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、（ａ）残基２６～３６のいずれか１つに位置するホモセリン残基、（ｂ）残基６０～８０のいずれか１つに位置するホモセリン残基、（ｃ）残基１１０～１２０のいずれか１つに位置するホモセリン残基、（ｄ）残基２８～３８のいずれか１つに位置するＯ－メチル－ホモセリン残基、（ｄ）残基４６～５６のいずれか１つに位置するＯ－メチル－ホモセリン残基、（ｅ）残基５４～６４のいずれか１つに位置するＯ－メチル－ホモセリン残基、（ｆ）残基８０～９０のいずれか１つに位置するＯ－メチル－ホモセリン残基、（ｇ）残基１０８～１１８のいずれか１つに位置するＯ－メチル－ホモセリン残基、および（ｈ）残基１４５～１５５のいずれか１つに位置するＯ－メチル－ホモセリン残基から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ホモセリン（Ｈｓｅ）３１、ノルロイシン（Ｎｌｅ）３３、Ｎｌｅ５１、Ｎｌｅ５９、Ｈｓｅ７５、Ｎｌｅ８６、Ｎｌｅ１１３、Ｈｓｅ１１６、およびＮｌｅ１５０から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ホモセリン（Ｈｓｅ）３１、ノルロイシン（Ｎｌｅ）３３、Ｏ－メチル－ホモセリン（Ｏｍｈ）３３、Ｎｌｅ５１、Ｏｍｈ５１、Ｎｌｅ６０、Ｏｍｈ６０、Ｈｓｅ７５、Ｎｌｅ８６、Ｏｍｈ８６、Ｈｓｅ１１６、Ｎｌｅ１１３、Ｏｍｈ１１３、Ｎｌｅ１５０、およびＯｍｈ１５０から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは、Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリンとのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは、位置Ｍｅｔ３３、Ｍｅｔ５１、Ｍｅｔ６０、Ｍｅｔ８６、Ｍｅｔ１１３、またはＭｅｔ１５０にてＯ－メチル－Ｌ－ホモセリンとのアミノ酸置換を含む。
本明細書中の一態様では、修飾インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）ポリペプチド集団であって、ａ）複数の修飾インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）ポリペプチドと、ｂ）修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合されるとともに、残基６５、残基６６、残基６７、残基６８、残基６９、残基７０、残基７１、残基７２、残基７３、残基７４、または残基７５にて結合される少なくとも１つのポリマー部分であって、アミノ酸残基の位置は参照配列として配列番号１に基づく、ポリマー部分とを含み、修飾ＩＬ－１８の少なくとも９０％が、高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＨＲＭＳ）により判定したときに、複数の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのピーク分子量の±５００Ｄａ内にある分子量を有する、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団が記載される。
本明細書中の一態様では、修飾インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）ポリペプチド集団であって、ａ）複数の修飾インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）ポリペプチドと、ｂ）修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合されるとともに、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基６５、残基６６、残基６７、残基６８、残基６９、残基７０、残基７１、残基７２、残基７３、残基７４、または残基７５にて結合される複数のポリマー部分であって、アミノ酸残基の位置は参照配列として配列番号１に基づく、ポリマー部分とを含み、複数のポリマー部分の少なくとも９０％が、高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＨＲＭＳ）により判定したときに、複数の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのピーク分子量の±５００Ｄａ内にある分子量を有する、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団が記載される。
いくつかの実施形態では、複数のポリマーの少なくとも７５％は、高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＨＲＭＳ）により判定したときに、複数のポリマーのピーク分子量の±１０％内にある分子量を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリマーまたは複数のポリマー部分は、アミノ酸残基６８にて修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合され、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリマーまたは複数のポリマー部分は、アミノ酸残基６９にて修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合され、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリマーまたは複数のポリマー部分は、アミノ酸残基７０にて修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合され、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリマーまたは複数のポリマー部分は、Ｃ６８にて修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合され、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリマーまたは複数のポリマー部分は、Ｅ６９にて修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合され、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリマーまたは複数のポリマー部分は、Ｅ６９Ｃにて修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合され、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリマーまたは複数のポリマー部分は、Ｋ７０にて修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合され、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリマーまたは複数のポリマー部分は、Ｋ７０Ｃにて修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合され、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。
いくつかの実施形態では、複数の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの各修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１つまたは複数の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、Ｅ０６、Ｋ５３、Ｙ０１、Ｓ５５、Ｆ０２、Ｄ５４、Ｃ３８、Ｔ６３、Ｃ６８、Ｃ７６、Ｃ１２７、およびＫ７０から選択される残基位置にあり、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、Ｅ０６、Ｋ５３、Ｙ０１、Ｓ５５、Ｆ０２、Ｄ５４、Ｃ３８、Ｔ６３、Ｃ６８、Ｅ６９、Ｃ７６、Ｃ１２７、およびＫ７０から選択される残基位置にあり、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、Ｅ０６Ｋ、Ｋ５３Ａ、Ｙ０１Ｇ、Ｓ５５Ａ、Ｆ０２Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｃ３８Ｓ、Ｔ６３Ａ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ１２７Ｓ、およびＫ７０Ｃから選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、Ｅ０６Ｋ、Ｋ５３Ａ、Ｙ０１Ｇ、Ｓ５５Ａ、Ｆ０２Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｃ３８Ｓ、Ｔ６３Ａ、Ｃ６８Ｓ、Ｅ６９Ｃ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ１２７Ｓ、およびＫ７０Ｃから選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、Ｅ０６ＫおよびＫ５３Ａである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、Ｅ０６Ｋ、Ｋ５３Ａ、およびＴ６３Ａである。
いくつかの実施形態では、集団は、最低１μｇ、最低１０μｇ、または最低１ｍｇの修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、集団は、最低１００個、最低１０００個、または最低１０００個の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団における重量平均分子量と数平均分子量との比は、最大１．１である。
いくつかの実施形態では、複数のポリマーのそれぞれは、水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールを含む。
いくつかの実施形態では、複数のポリマーの重量平均分子量は、約２００Ｄａ～約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、複数のポリマーの重量平均分子量は、約１０，０００Ｄａ～約３０，０００Ｄａである。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドはＩＦＮγの産生を調節し、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドによるＩＦＮγ誘導能のＥＣ５０（ｎＭ）は、配列番号１のＩＬ－１８ポリペプチドのＥＣ５０（ｎＭ）より１０倍未満高いか、５倍未満高いか、またはそれよりも低い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドによるＩＦＮγ誘導能のＥＣ５０（ｎＭ）は、配列番号１のＥＣ５０（ｎＭ）より１０倍未満高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドによるＩＦＮγ誘導能のＥＣ５０（ｎＭ）は、配列番号１のＩＬ－１８ポリペプチドのＥＣ５０（ｎＭ）よりも低い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドによるＩＦＮγ誘導能のＥＣ５０（ｎＭ）は、配列番号１のＩＬ－１８ポリペプチドのＥＣ５０（ｎＭ）よりも少なくとも約１０倍低い。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドはＩＦＮγ産生を調節し、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＩＦＮγに対するＥＣ５０（ｎＭ）は、配列番号１のＩＬ－１８ポリペプチドのＥＣ５０（ｎＭ）未満である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＩＦＮγに対するＥＣ５０（ｎＭ）は、配列番号１のＩＬ－１８ポリペプチドのＥＣ５０（ｎＭ）よりも少なくとも１０倍低い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＩＦＮγに対するＥＣ５０（ｎＭ）は、配列番号１のＩＬ－１８ポリペプチドのＥＣ５０（ｎＭ）よりも約１０倍低い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＩＦＮγに対するＥＣ５０（ｎＭ）は、配列番号１のＩＬ－１８ポリペプチドのＥＣ５０（ｎＭ）よりも約１５倍低い。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号２～５８に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号２～８３に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２または配列番号１８に対して少なくとも約８０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２に対して少なくとも約８０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２に対して少なくとも約９０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２に対して少なくとも約９５％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号１８に対して少なくとも約８０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号１８に対して少なくとも約９０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号１８に対して少なくとも約９５％同一である。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＫＤにより測定したとき、ＩＬ－１８受容体αサブユニット（ＩＬ－１８Ｒα）に対する親和性がＩＬ－１８結合タンパク質（ＩＬ－１８ＢＰ）に対する親和性よりも１０倍未満低いか、５倍未満低いか、またはそれよりも高く、［ＫＤＩＬ－１８Ｒα］／［ＫＤＩＬ－１８ＢＰ］は０．１を超える。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８受容体α（ＩＬ－１８Ｒα）に結合する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒαに結合する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、約１０ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒαに結合する。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＫＤにより測定したときに、ＩＬ－１８結合タンパク質（ＩＬ－１８ＢＰ）に対する親和性よりも高いＩＬ－１８受容体（ＩＬ－１８Ｒ）に対する親和性を呈し、［ＫＤＩＬ－１８Ｒ］／［ＫＤＩＬ－１８ＢＰ］は１未満である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８受容体α（ＩＬ－１８Ｒα）に結合する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、約５０ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒαに結合する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、約１０ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒαに結合する。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８受容体α／β（ＩＬ－１８Ｒα／β）ヘテロ二量体に結合する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、約１０ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体に結合する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、約２ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体に結合する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、さらなるペプチドにコンジュゲートされる。
本明細書中の一態様では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドをする宿主細胞が記載される。
本明細書中の一態様では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを産生する方法であって、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを宿主細胞中で発現する工程を含む方法が記載される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、鳥類細胞、真菌細胞、または昆虫細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、または酵母菌細胞である。
本明細書中の一態様では、医薬組成物であって、ａ）修飾ＩＬ－１８ポリペプチドまたは修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団と、ｂ）薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む医薬組成物が記載される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は凍結乾燥形態にある。
本明細書中の一態様では、癌の処置を必要とする対象の癌を処置する方法であって、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド、または修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む医薬組成物を薬学的有効量で対象に投与する工程を含む方法が、記載される。
いくつかの実施形態では、癌は固形癌である。いくつかの実施形態では、固形癌は、腎臓癌、皮膚癌、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、大腸癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、または前立腺癌である。いくつかの実施形態では、固形癌は、転移性腎細胞癌または黒色腫である。いくつかの実施形態では、固形癌は、癌腫または肉腫である。
いくつかの実施形態では、癌は血液癌である。いくつかの実施形態では、血液癌は、白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、または多発性骨髄腫である。
いくつかの実施形態では、上記方法は、凍結乾燥形態にある修飾ＩＬ－１８ポリペプチドまたは医薬組成物を再構成する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ペプチドにコンジュゲートされる。
本明細書中の一態様では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドであって、残基２１～４１、残基６０～８０、および残基１０６～１２６の領域から選択される位置にホモセリン（Ｈｓｅ）残基を含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに対する残基位置の番号付けは参照配列として配列番号１に基づく、合成ＩＬ－１８ポリペプチドが提供される。
いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基２１～４１、残基６０～８０、および残基１０６～１２６の領域のそれぞれにＨｓｅ残基を含む。
いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、３１位にＨｓｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、６３位または７５位にＨｓｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、６３位にＨｓｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、７５位にＨｓｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、１１６位にＨｓｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、３１位、１１６位、および６３位と７５位の少なくとも１つにＨｓｅ残基を含む。
いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号１に少なくとも１つのメチオニン残基のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１における少なくとも１つのメチオニン残基のアミノ酸置換は、Ｍ３３、Ｍ５１、Ｍ６０、Ｍ８６、Ｍ１１３、またはＭ１５０に置換を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、少なくとも３つのメチオニン残基の置換を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、少なくとも５つのメチオニン残基の置換を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、少なくとも６つのメチオニン残基の置換を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのメチオニン残基が、Ｏ－メチル－ホモセリン（Ｏｍｈ）残基に置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも３つのメチオニン残基が、Ｏｍｈ残基に置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのメチオニン残基が、Ｏｍｈ残基に置換される。いくつかの実施形態では、各メチオニン置換は、ノルロイシンまたはＯｍｈ残基に対するものである。いくつかの実施形態では、各メチオニン置換はＯｍｈ残基に対するものである。いくつかの実施形態では、配列番号１の各メチオニン残基は、Ｏｍｈ残基に置換される。
いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号１に対するさらなる突然変異を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、合成ＩＬ－１８ポリペプチドの残基に共有結合されるポリマーを含む。
本明細書中の一態様では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを作製する方法であって、ａ）修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの２つ以上のフラグメントを合成する工程と、ｂ）フラグメントをライゲートする工程と、ｃ）ライゲートされた前記フラグメントをフォールディングする工程とを含む方法が記載される。いくつかの実施形態では、上記方法は、水溶性ポリマーをフォールディングされライゲートされたフラグメントに結合する工程をさらに含む。
本開示の付加的な態様と利点は、以下の詳細な説明から当業者に容易に対して明白となり、その中では本開示の例示的実施形態のみが示されるとともに、記載される。以下の記載から分かるように、本開示は、他の実施形態や異なる実施形態を可能とし、そのいくつかの詳細は、すべて本開示から逸脱することなく様々な明白な点で改変可能である。したがって、図面と説明は、事実上例示的とみなされるが、限定的とはみなされない。
参照による援用
本明細書で言及される刊行物、特許、および特許出願はすべて、あたかも個々の刊行物、特許、または特許出願がそれぞれ参照により援用されるように具体的かつ個々に示されるのと同じ程度にまで、参照により本明細書に援用される。参照により援用される刊行物および特許または特許出願が本明細書中にある開示に対し相反する程度にまで、本明細書は、このような相反する題材に取って代わる、および／またはそれに先行するように意図される。
本開示の新規な特徴は、とりわけ添付の特許請求の範囲により説明される。本開示の特徴と利点は、本開示の原理が利用される例示的実施形態および添付の図面を説明する、以下の詳細な説明を参照することによりさらに良く理解されるであろう。
ＩＦＮγおよびＩＬ－１８ＢＰ産生でのＩＬ－１８の作用機序、およびＩＬ－１８ＢＰによるＩＬ－１８阻害活性を例示する図である。 合成の野生型ＩＬ－１８ポリペプチドを例示する図である。 ２つの修飾アミノ酸残基（黒い円で示す）を有する修飾された合成ＩＬ－１８ポリペプチドを例示する図である。 ポリマー部分を含む修飾された合成ＩＬ－１８ポリペプチドを例示する図である。 ジベンゾシクロオクチン（ＤＢＣＯ）ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と、アジドを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドとのカップリングを例示する図である。 ポリマーを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドとＩＬ－１８Ｒαとの結合を例示する図である。 修飾ＩＬ－１８ポリペプチドフラグメントを用いて、アジド部分を含む配列番号２６の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを調製するための合成スキームを示す図である。 本開示の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドと野生型ＩＬ－１８ポリペプチドとのＩＦＮγ誘導能の比較を示す図である。 本開示の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドと野生型ＩＬ－１８ポリペプチドとのＩＬ－１８ＢＰ阻害の比較を示す図である。 対照（塗りつぶしの円、実線）、対照＋ＩＬ－１８ＢＰ（半白抜きの円、破線）、配列番号１のＩＬ－１８ポリペプチド（塗りつぶしの三角形、実線）、配列番号１のＩＬ－１８ポリペプチド＋ＩＬ－１８ＢＰ（白抜きの三角形、破線）、配列番号２の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド（塗りつぶしの菱形、実線）、および配列番号２の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド＋ＩＬ－１８ＢＰ（半白抜きの三角形、破線）のＥＣ５０値を比較する図である。 ＩＬ－１８フラグメントを用いて配列番号２４の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを合成する合成スキームを示す図である。 ＩＬ－１８フラグメントを用いて修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを合成する合成スキームを示す図である。 ＩＬ－１８フラグメントを用いて配列番号２５の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを合成する合成スキームを示す図である。 ＩＬ－１８フラグメントを用いて配列番号３１の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを合成する合成スキームを示す図である。 修飾ＩＬ－１８ポリペプチドフラグメントを用いて、アジド部分を含む配列番号３２の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを調製する合成スキームを示す図である。 ＩＬ－１８フラグメントを用いて配列番号３３の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを調製する合成スキームを示す図である。 修飾ＩＬ－１８ポリペプチドフラグメントを用いて、アジド部分を含む配列番号３４の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを調製する合成スキームを示す図である。 修飾ＩＬ－１８ポリペプチドフラグメントを用いて、アスパルテート残基に置換された残基７０にて共有結合されたＰＥＧアジド部分を含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを調製する合成スキームを示す図である。 修飾ＩＬ－１８ポリペプチドフラグメントを用いて、アジド部分を含む配列番号６２の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを調製するための合成スキームを示す図である。 様々なアミノ酸残基に共有結合されたＰＥＧアジド基を含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを調製するのに使用できる一般的な合成スキームを示す図である。 本明細書で提供するＩＬ－１８ポリペプチドに対する二官能性プローブのカップリングの概略図を示す図である。 二官能性プローブで活性化されたＩＬ－１８ポリペプチドに対するポリ（エチレングリコール）部分のカップリングの概略図を示す図である。 示されたＩＬ－１８ポリペプチドをマウスモデルに投与後、様々な時点でのインターフェロンγ（ＩＦＮγ）レベルを示す図である。 示されたＩＬ－１８ポリペプチドをマウスモデルに投与後、様々な時点でのＣ－Ｘ－Ｃモチーフケモカインリガンド１０（ＣＸＣＬ１０）レベルを示す図である。 ヒトＩＬ－１８および示された変異体でＰＢＭＣを２４時間刺激した後のＩＦＮγ、ＩＬ１β、ＴＮＦα、ＩＬ－６、ＩＬ－１０、およびＩＬ－１２ｐ７０のｉｎ ｖｉｔｒｏ誘導を示す図である。 ヒトＩＬ－１８および示された変異体で７２時間刺激した後のヒトＣＤ３－／ＣＤ５６＋ＮＫ細胞におけるＣＤ１６の表面発現を示す図である。
Ｔヘルパー１型（Ｔｈ１）リンパ球の主な機能は、腫瘍への免疫応答である。Ｔｈ１応答として、サイトカインＩＬ－２、ＩＬ－１２、ＩＬ－１８、ＩＦＮγの分泌、および特異的な腫瘍抗原を認識する特異的細胞毒性Ｔリンパ球の生成が挙げられる。Ｔｈ１応答は、多くの微生物に対する宿主防御で極めて重要なもの（ｖｉｔａｌ ａｒｍ）である。しかし、Ｔｈ１応答は自己免疫疾患および移植臓器拒絶にも関連する。
インターロイキン１８（ＩＬ－１８）は、感染症または損傷の後に宿主防御および炎症を開始するか促進させる生物活性を誘発する炎症促進性サイトカインである。ＩＬ－１８は、自己免疫疾患、心筋機能、肺気腫、メタボリック症候群、乾癬、炎症性腸疾患、食血細胞症候群、マクロファージ活性化症候群、敗血症、および急性腎傷害に関与する。疾患の一部のモデルでは、ＩＬ－１８は保護的な役割を果たす。
ＩＬ－１８は、Ｔ細胞およびナチュラルキラー細胞からのＩＦＮγ産生にも主要な役割を果たす。ＩＦＮγは、主にＴ細胞、ＮＫ細胞、およびマクロファージが産生するＴｈ１サイトカインであり、先天免疫および適応免疫、ウイルス感染症、一部の細菌感染症、ならびに原虫感染症に重要である。ＩＦＮγは、マクロファージの重要な活性化物質、かつクラスＩＩ主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）分子発現の誘導物質でもある。
ＩＬ－１８は、ＩＬ－１８α鎖（ＩＬ－１８Ｒα）に結合することにより、成熟ＩＬ－１８に対するリガンド結合鎖であるシグナル伝達複合体を形成する。しかし、ＩＬ－１８Ｒαに対するＩＬ－１８の結合親和性は低い。共受容体であるＩＬ－１８受容体β鎖（ＩＬ－１８Ｒβ）を発現する細胞では、高親和性ヘテロ二量体複合体が形成されて、細胞シグナル伝達を活性化する。
ＩＬ－１８の活性は、高親和性で自然発生のＩＬ－１８結合タンパク質（ＩＬ－１８ＢＰ）の存在により平衡を保たれる。ＩＬ－１８ＢＰはＩＬ－１８を結合し、ＩＬ－１８の生体活性を中和する。細胞表面ＩＬ－１８Ｒαは、ＩＬ－１８結合においてＩＬ－１８ＢＰと競合する。疾患重症度の上昇はＩＬ－１８ＢＰに対するＩＬ－１８の平衡異常に関連する可能性があり、その結果、遊離ＩＬ－１８のレベルが循環中に上昇する。図１は、ＩＬ－１８の作用機序、ＩＦＮγ産生、およびＩＬ－１８ＢＰによるＩＬ－１８活性の阻害活性を例示する図である。ＩＬ－１８はＩＦＮγ産生を誘導して、ＩＬ－１８ＢＰ産生を誘導する。その後、ＩＬ－１８ＢＰはＩＬ－１８Ｒαと競争し、ＩＬ－１８活性を阻害する。
以下の説明と例は、本開示の実施形態を詳細に例示するものである。本開示は、本明細書に記載される特定の実施形態に限定されず、そのため変動する可能性があることを理解されたい。当業者は、本開示の多数の変形および改変が存在し、これらは本開示の範囲内に包含されることを認識するであろう。
本開示の様々な特徴が、１つの実施形態の観点から記載される場合があるが、この特徴は、個別に、またはあらゆる好適な組合せで提供されてもよい。反対に、本開示は明確性について別個の実施形態の観点から本明細書に記載される場合があるが、本開示は１つの実施形態で実施されてもよい。
本明細書で使用されるセクションの見出しは、構成上の目的のみのために付したものであり、記載される発明特定事項を限定するものと解釈されるべきではない。
Ｉ．定義
用語はすべて、当業者が理解するように理解されることを意図している。別段の定めのない限り、本明細書に記載される技術用語と科学用語はすべて、本開示が属する技術分野の当業者が共通して理解するのと同じ意味を有する。
以下の定義は、当該技術分野における定義を補足するとともに現行の出願に関するものであるが、関連するまたは無関連の事例、例えば共通して所有されている特許または出願に帰するものではない。本明細書に記載のものと類似または同等の方法と材料はいずれも本開示の試験の実施に使用できるが、好ましい材料と方法が本明細書に記載される。したがって、本明細書で使用される用語は、特定の実施形態のみを記述することを目的とし、限定を意図されていない。
本明細書で使用される用語は、特定の事例のみを記載することを目的とし、本発明を制限することを意図していない。本出願では、単数形の使用は、特に明記されない限り複数形を含む。本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上明らかに別の意味を示していると判断されない限り、同様に複数形を含むように意図される。
本出願では、「または」の使用は、特に明記しない限り「および／または」を意味する。「および／または」や「それらのあらゆる組合せ」という用語、ならびにそれらの文法上の等価物は、本明細書で使用するとき、互換的に使用可能である。これらの用語は、いかなる組合せも特異的に企図されることを伝えることができる。単に例示目的のために、次の「Ａ、Ｂ、および／またはＣ」あるいは「Ａ、Ｂ、Ｃ、またはそれらのあらゆる組合せ」という句は、「Ａ個別、Ｂ個別、Ｃ個別、ＡとＢ、ＢとＣ、ＡとＣ、ならびにＡ、Ｂ、およびＣ」を意味し得る。「または」という用語は、文脈が特異的に選言的な使用を指すものでない限り、接続詞として、または選言的に使用できる。
「約（ａｂｏｕｔ）」または「およそ（ａｐｐｒｏｘｉｍａｔｅｌｙ）」という用語は、当業者が判定したときに特定の値の許容可能な誤差範囲内であることを意味する可能性があり、その値がどのように測定または判定されるか、すなわち測定システムの制限に部分的に依存する。例えば、「約」とは、当該技術分野での実施ごとに１または１を超える標準偏差を意味し得る。代替的に、「約」とは、所与の値の最大２０％、最大１５％、最大１０％、最大５％、または最大１％の範囲を意味し得る。代替的に、特に生物学的システムまたはプロセスに関して、この用語は、ある値の１桁以内、５倍または２倍以内を意味し得る。特定の値が本出願と請求項に記載されている場合、別段の定めのない限り、特定の値の許容可能な誤差範囲内を意味する「約」という用語が、仮定されねばならない。
本明細書および特許請求の範囲で使用するとき、「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」（および「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅ）」や「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」などの「含んでいる」のあらゆる形態）、「有している（ｈａｖｉｎｇ）」（および「有する（ｈａｖｅ）」や「有する（ｈａｓ）」などの「有している」のあらゆる形態）、「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」（および「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」や「含む（ｉｎｃｌｕｄｅ）」などの「含んでいる」のあらゆる形態）、または「含有している（ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇ）」（および「含有する（ｃｏｎｔａｉｎｓ）」や「含有する（ｃｏｎｔａｉｎ）」などの「含有している」のあらゆる形態）は、包括的またはオープンエンド（ｏｐｅｎ－ｅｎｄｅｄ）であり、追加の列記されていない要素または方法の工程を除外するものではない。本明細書で論じられるあらゆる実施形態が、本開示の方法または組成物に対して実施可能であり、その逆もあることが企図される。さらに、本開示の組成物は、本開示の方法を達成するために使用することができる。
本明細書中での「いくつかの実施形態」、「実施形態」、「一実施形態」、または「他の実施形態」への言及は、実施形態と関連して記載される特定の特徴、構造、または特性が、本開示の少なくともいくつかの実施形態に含まれるが、必ずしもすべての実施形態には含まれないことを意味する。本開示の理解を促すために、いくつかの用語と句を以下に定義する。
本明細書で使用するとき、「アルファ－ケト－アミノ酸」、またはアミノ酸の名称の前にある「アルファ－ケト」という句は、アミノ基を持つ炭素とアミノ酸のカルボン酸との間にケトン官能基を有するアミノ酸またはアミノ酸誘導体をいう。本開示のアルファ－ケトアミノ酸は、以下の式：
に明記される構造を有し、
式中、Ｒはいずれかの天然または非天然アミノ酸の側鎖である。Ｒ機能は、標準アミノ酸命名法に従いＬ配向またはＤ配向のいずれかとすることができる。好ましい実施形態では、アルファ－ケトアミノ酸はＬ配向にある。「アルファ－ケト」という句を従来の天然アミノ酸の名称の前（例えば、アルファ－ケトロイシン、アルファ－ケトフェニルアラニンなど）または一般的な非天然アミノ酸の名称の前（例えば、アルファ－ケトノルロイシン、アルファ－ケトＯ－メチル－ホモセリンなど）に使用するとき、言及されるアルファ－ケトアミノ酸が、上記の式を、アミノ酸に対し言及されたものの側鎖と一致させることが意図される。アルファ－ケトアミノ酸残基が本明細書中のペプチドまたはポリペプチド配列に明記されるとき、保護された形の関連アミノ酸も包含される（例えば、Ｃ末端のアルファ－ケトアミノ酸が終端となる配列では、末端カルボン酸残基がｔｅｒｔ－ブチル基などの保護基により適宜キャッピングされる場合がある）ことが意図される。
「薬学的に許容可能な」という用語は、連邦政府もしくは州政府の規制当局により承認されているか承認可能であること、または、米国薬局方もしくはヒトを含む動物への使用において一般に認可された他の薬局方に列記されていることを表す。
「薬学的に許容可能な賦形剤、担体、または希釈剤は、薬剤と一緒に対象へと投与可能であるとともに、薬剤の薬理活性を破壊せず、治療量の薬剤を送達するのに十分な用量で投与したときに無毒である賦形剤、担体、または希釈剤をいう。
本開示に適した「薬学的に許容可能な塩」は、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を生じさせることなく人間または動物に接触させて使用するのに適した、当該技術分野で一般的に考慮される酸塩または塩基塩であってよい。かかる塩として、アミンなどの塩基性残基の無機塩または有機酸塩のほか、カルボン酸などの酸性残基のアルカリ塩または有機塩が挙げられる。具体的な医薬品塩として、塩化水素酸、リン酸、臭化水素酸、リンゴ酸、グリコール酸、フマル酸、硫酸、スルファミン酸、スルファニル酸、ギ酸、トルエンスルホン酸、メタンスルホン酸、ベンゼンスルホン酸、エタンジスルホン酸、２－ヒドロキシエチルスルホン酸、硝酸、安息香酸、２－アセトキシ安息香酸、クエン酸、酒石酸、乳酸、ステアリン酸、サリチル酸、アスコルビン酸、パモ酸、コハク酸、フマル酸、マレイン酸、プロピオン酸、ヒドロキシマレイン酸、ヨウ化水素酸、フェニル酢酸、酢酸などのアルカノン酸、ｎが０、２、３、４、もしくは４であるＨＯＯＣ－（ＣＨ２）ｎ－ＣＯＯＨなどが挙げられるが、これらに限定されない。同様に、薬学的に許容可能なカチオンとして、ナトリウム、カリウム、カルシウム、アルミニウム、リチウム、アンモニウムが挙げられるが、これらに限定されない。当業者は、本開示および当該技術分野での知識から、薬学的に許容可能な塩は「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，１７ｔｈ ｅｄ．，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏｍｐａｎｙ，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｐ．１４１８（１９８５）」に列記されるものをさらに含むことを認識するであろう。一般に、薬学的に許容可能な酸塩または塩基塩は、あらゆる従来の化学的方法により、塩基性部分または酸性部分を含有する親化合物から合成できる。簡潔に説明すると、このような塩は、これら化合物の遊離酸形態または遊離塩基形態を、適切な溶媒中で化学量の適切な塩基または酸と反応させることにより調製できる。
本明細書で提供される範囲は、この範囲内の値がすべて省略される（ｓｈｏｒｔｈａｎｄ）と理解される。例えば、１～５０の範囲は、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３２、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、４０、４１、４２、４３、４４、４５、４６、４７、４８、４９、または５０からなる群のうちいずれかの数、数の組合せ、または部分範囲を含むほか、例えば１．１、１．２、１．３、１．４、１．５、１．６、１．７、１．８、１．９などの前述の整数間に介在する１０進値すべてを含むものと理解される。部分範囲に関して、範囲のいずれかのエンドポイントから広がる「ネスト化部分範囲（ｎｅｓｔｅｄ ｓｕｂ－ｒａｎｇｅｓ）」が具体的に企図される。例えば、１～５０の例示的な範囲のネスト化部分範囲は、一方向に１～１０、１～２０、１～３０、および１～４０を含み、または他の方向に５０～４０、５０～３０、５０～２０、および５０～１０を含む場合がある。
「対象」という用語は、処置、観察、または実験の対象である動物を表す。対象のほんの一例として、ヒト、または非ヒト霊長類、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ、ネコなどの非ヒト哺乳動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物が挙げられるが、これに限定されない。
「任意選択の」または「任意選択で」という用語は、後に記載される事象または状況が必ずしも生じることがないこと、および、この記載が、先の事象または状況が生じる例と、それらが生じない例とを含むことを意味する。
「部分」という用語は、分子の特定の区域または官能基を指す。化学部分は、分子に埋め込まれるか分子に付加される化学実態として認識されることが多い。
本明細書で使用するとき、「数平均分子量」（Ｍｎ）という用語は、試料中すべての単位個別の統計的平均分子量を意味し、式（１）：
により定められ、
式中、Ｍｉは１単位の分子量であり、Ｎｉはその分子量の単位数である。
本明細書で使用するとき、「重量平均分子量」（Ｍｗ）という用語は、式（２）：
により定めた数を意味し、
式中、Ｍｉは１単位の分子量であり、Ｎｉはその分子量の単位数である。
本明細書で使用するとき、「ピーク分子量」（Ｍｐ）は、所与の解析法（例えば質量分析法、サイズ排除クロマトグラフィー法、動的光散乱法、分析用遠心法など）において最高ピークの分子量を意味する。
ＩＩ．修飾ＩＬ－１８ポリペプチド
本開示は、治療剤として有用な修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに関する。本明細書で提供される修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、免疫療法、または他の免疫療法レジメンの一部として使用できる。かかる修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、野生型ＩＬ－１８とは異なるＩＬ－１８受容体（ＩＬ－１８Ｒ）の結合特性を示す場合がある。
一態様では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８ＲαまたはＩＬ－１８Ｒβに対する親和性が上昇している。一態様では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８ＲαまたはＩＬ－１８Ｒβに対する親和性が低下している。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体に対する親和性が上昇している。一態様では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体に対する親和性が低下している。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドとＩＬ－１８Ｒαとの結合親和性は、野生型のＩＬ－１８およびＩＬ－１８Ｒαとの結合親和性以下である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドとＩＬ－１８Ｒαとの結合親和性は、野生型のＩＬ－１８およびＩＬ－１８Ｒαとの結合親和性以上である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドとＩＬ－１８Ｒβとの結合親和性は、野生型のＩＬ－１８およびＩＬ－１８Ｒβとの結合親和性以下である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドとＩＬ－１８Ｒβとの結合親和性は、野生型のＩＬ－１８およびＩＬ－ＩＬ－１８Ｒβとの結合親和性以下である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドとＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体との結合親和性は、野生型のＩＬ－１８およびＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体との結合親和性以下である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドとＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体との結合親和性は、野生型のＩＬ－１８およびＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体との結合親和性以上である。図２Ａは、合成の野生型ＩＬ－１８ポリペプチドを例示する図である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、対象への投与後、インターフェロンγ（ＩＦＮγ）産生の誘導能を呈する。いくつかの実施形態では、ＩＦＮγ誘導能は、野生型ＩＬ－１８のものと同等である（例えば、野生型ＩＬ－１８の約１０倍以内にある、ＩＦＮγ誘導におけるＥＣ５０を呈する）。この特性を呈する本明細書で提供される例示的なＩＬ－１８ポリペプチドは図６Ａに示され、ＩＦＮγ産生（ｎｇ／ｍＬ、Ｙ軸）と、野生型対修飾ＩＬ－１８ポリペプチド（突然変異タンパク質）の濃度（ｎＭ、Ｘ軸）との比較が示されている。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－１８ポリペプチド、ＩＬ－１８結合タンパク質（ＩＬ－１８ＢＰ）への結合の低下も示す。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８ＢＰの存在下でもＩＦＮγを誘導できる（例えば、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＩＦＮγ誘導能は、ＩＬ－１８ＢＰの存在により実質的に阻害されない）（ｎＭ、ｘ軸）。野生型ＩＬ－１８と比較したこの特性を有するＩＬ－１８ポリペプチドの例は図６Ｂに示され、同レベルの野生型ＩＬ－１８（円）または本明細書で提供される修飾ＩＬ－１８ポリペプチド（逆三角形）を用いて処置した試料におけるＩＬ－１８ＢＰ濃度（ｎＭ、ｘ軸）に応じたＩＦＮγ産生（ｎｇ／ｍＬ、ｙ軸）が示される。顕著なことに、本明細書で提供される修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８ＢＰの存在下でそのＩＦＮγ誘導能に対する阻害を示さなかったが、野生型ＩＬ－１８は、ＩＬ－１８ＢＰ濃度が上昇するにつれその能力の大幅な低下を示した。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、野生型ＩＬ－１８と比較して同様の、またはわずかに低いＩＦＮγ産生の誘導能を呈する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－１８ポリペプチドがＩＬ－１８ＢＰの存在下で呈するＩＦＮγ産生の誘導能の阻害は、野生型ＩＬ－１８と比較して大幅に低い。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、野生型ＩＬ－１８と比較して同様の、またはわずかに低いＩＦＮγ産生の誘導能を呈し、かつ、ＩＬ－１８ＢＰの存在下でのＩＦＮγ産生の誘導能の阻害が野生型ＩＬ－１８と比較して大幅に低い。
本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１つまたは複数の非正準アミノ酸を含むことができる。「非正準」アミノ酸とは、概して自然発生のタンパク質へ組み込まれる２０個の標準アミノ酸に含まれない、Ｄ型またはＬ型のアミノ酸残基を指し得る。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸の１つまたは複数は、１つまたは複数の非正準アミノ酸で置換される。非正準アミノ酸として、Ｎ－α－（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル）－Ｌ－アジドリシン（Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｌｙｓ（Ｎ３）－ＯＨ）、Ｎ－α－（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル）－Ｌ－ビフェニルアラニン（Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｂｉｐ－ＯＨ）、Ｎ－α－（９－フルオレニルメチルオキシカルボニル）－Ｏ－ベンジル－Ｌ－チロシン（ＦｍｏｃＬ－Ｔｙｒ（Ｂｚｌ）－ＯＨ）が挙げられるが、これらに限定されない。
例示的な非正準アミノ酸として、アジド－リシン（ＡｚＫ）、ヒドロキシリジン、アロ－ヒドロキシリシン、ε－Ｎ，Ｎ，Ｎ－トリメチルリシン、ε－Ｎ－アセチルリシン、５－ヒドロキシリシン、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｅ、Ｂｏｃ）、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｍｅ）３、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（パルミトイル）、Ｆｍｏｃ－Ｌ－ｐｈｏｔｏ－リシン、ＤＬ－５－ヒドロキシリシン、Ｈ－Ｌ－ｐｈｏｔｏ－リシン、および／または他の同様のアミノ酸が挙げられる。例示的な非正準アミノ酸には、Ｄ－メチオニン、セレノシステイン、および／または他の同様のアミノ酸も挙げられる。
例示的な非正準アミノ酸として、ｐ－アセチル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ヨード－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－メトキシフェニルアラニン、Ｏ－メチル－Ｌ－チロシン、ｐ－プロパルギルオキシフェニルアラニン、ｐ－プロパルギル－フェニルアラニン、Ｌ－３－（２－ナフチル）アラニン、３－メチル－フェニルアラニン、Ｏ－４－アリル－Ｌ－チロシン、４－プロピル－Ｌ－チロシン、トリ－Ｏ－アセチル－ＧｌｃＮＡｃｐ－セリン、Ｌ－Ｄｏｐａ、フッ化フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アジド－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－アシル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ベンゾイル－Ｌ－フェニルアラニン、ｐ－ボロノフェニルアラニン、Ｏ－プロパルギルチロシン、Ｌ－ホスホセリン、ホスホノセリン、ホスホノチロシン、ｐ－ブロモフェニルアラニン、ｐ－アミノ－Ｌ－フェニルアラニン、イソプロピル－Ｌ－フェニルアラニン、アミノ酸のアナログ；グルタミン（アミノ酸）のアナログ；フェニルアラニン（アミノ酸）のアナログ；セリン（アミノ酸）のアナログ；トレオニン（アミノ酸）のアナログ；アルキル、アリール、アシル、アジド、シアノ、ハロ、ヒドラジン、ヒドラジド、ヒドロキシル、アルケニル、アルキニル、エーテル、チオール、スルホニル、セレノ、エステル、チオ酸、ボレート、ボロネート、ホスホ、ホスホノ、ホスフィン、複素環式、エノン、イミン、アルデヒド、ヒドロキシルアミン、ケト、またはアミノ置換されたアミノ酸、β－アミノ酸；プロリンやヒスチジン以外の環状アミノ酸；フェニルアラニン、チロシン、もしくはトリプトファン以外の芳香族アミノ酸；またはそれらの組合せも挙げられる。いくつかの実施形態では、非正準アミノ酸は、β－アミノ酸、ホモアミノ酸、環状アミノ酸、および誘導体化側鎖を有するアミノ酸から選択される。いくつかの実施形態では、非正準アミノ酸は、β－アラニン、β－アミノプロピオン酸、ピペリジン酸、アミノカプロン酸（ａｍｉｎｏｃａｐｒｉｏｉｃ）、アミノヘプタン酸、アミノピメリン酸、デスモシン、ジアミノピメリン酸、Ｎα－エチルグリシン、Ｎα－エチルアスパルギン（ｅｔｈｙｌａｓｐａｒｇｉｎｅ）、イソデスモシン、アロ－イソロイシン、ω－メチルアルギニン、Ｎα－メチルグリシン、Ｎα－メチルイソロイシン、Ｎα－メチルバリン、γ－カルボキシグルタメート、Ｏ－ホスホセリン、Ｎα－アセチルセリン、Ｎα－ホルミルメチオニン、３－メチルヒスチジン、および／または他の同様のアミノ酸を含む。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基は、修飾リシン残基で置換される。いくつかの実施形態では、修飾リシン残基は、アミノ、アジド、アリル、エステル、および／またはアミドの官能基を含む。いくつかの実施形態では、修飾リシン残基は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに追加の部分を結合させるため有用な固着点として機能できるコンジュゲーションハンドルを含有する。いくつかの実施形態では、修飾リシン残基は、前駆体構造１、構造２、構造３、または構造４：
から構築される構造を有する。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、コンジュゲーション反応を容易にするために使用できる追加の官能基の結合、または修飾ＩＬ－１８ポリペプチド（例えばポリマー）への様々なペイロードの結合に使用できる、修飾アミノ酸残基に対する置換を含有する。この置換は、追加の官能基の結合にさらに適した自然発生のアミノ酸（例えば、アスパラギン酸、システイン、グルタミン酸、リシン、セリン、トレオニン、またはチロシン）、いずれかの自然発生のアミノ酸の修飾型の誘導体、またはいずれかの非天然アミノ酸（例えば、アジドやアルキンなどのＣＬＩＣＫ化学試薬といった、所望の反応基を含有するアミノ酸）に対するものであり得る。このような修飾アミノ酸残基の非限定的な例として、以下：
に提供される修飾されたリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸、ならびにシステインが挙げられ、式中、各ｎは１～３０の整数である。これら修飾アミノ酸残基の非限定的な例は、さらなる機能（例えば、ポリマー）を修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに加えることが望ましい位置にて使用できる。
部位特異的修飾
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１つまたは複数のアミノ酸残基に１つまたは複数の修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として野生型ヒトＩＬ－１８ポリペプチドに基づく。
本明細書に記載のポリペプチドに対する修飾は、突然変異、様々な官能性の付加、アミノ酸の欠失、アミノ酸の付加、またはタンパク質もしくはタンパク質フラグメントの野生型における他のあらゆる改質を包含する。ポリペプチドに付加され得る官能性は、ポリマー、リンカー、アルキル基、発色団やフルオロフォアなどの検出可能分子、反応性官能基、またはそれらのあらゆる組合せが挙げられる。いくつかの実施形態では、官能性は、ポリペプチドのアミノ酸個別に付加される。いくつかの実施形態では、官能性は、ポリペプチドに対し部位特異的に付加される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載される修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０個の修飾アミノ酸残基を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１個の修飾アミノ酸残基を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、２個の修飾アミノ酸残基を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、３個の修飾アミノ酸残基を含有する。図２Ｂは、２個の修飾アミノ酸残基を有する修飾された合成ＩＬ－１８ポリペプチドを例示する図である。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、本明細書で提供される配列番号２～５８のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号２～５８のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、本明細書で提供される配列番号２～８３のいずれか１つのアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号２～８３のいずれか１つに対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号２のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号２の配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号７の配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号１８の配列に対して少なくとも８５％同一であるアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、配列同一性は、Ｍａｔｒｉｘ ＢＬＯＳＵＭ６２、Ｇａｐ Ｃｏｓｔｓ Ｅｘｉｓｔｅｎｃｅ：１１、Ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ：１、およびＣｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔｓ Ｃｏｎｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｏｍｐｏｓｉｔｉｏｎａｌ Ｓｃｏｒｅ Ｍａｔｒｉｘ Ａｄｊｕｓｔｍｅｎｔのパラメータを用いたタンパク質間ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより測定される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、最低２個、最低３個、最低４個、最低５個、最低６個、最低７個、または最低９個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、３～９個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、３～４個のアミノ酸置換、３～５個のアミノ酸置換、３～６個のアミノ酸置換、３～７個のアミノ酸置換、３～９個のアミノ酸置換、４もしくは５個のアミノ酸置換、４～６個のアミノ酸置換、４～７個のアミノ酸置換、４～９個のアミノ酸置換。５もしくは６個のアミノ酸置換、５～７個のアミノ酸置換、５～９個のアミノ酸置換、６もしくは７個のアミノ酸置換、６～９個のアミノ酸置換、または７～９個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、３個のアミノ酸置換、４個のアミノ酸置換、５個のアミノ酸置換、６個のアミノ酸置換、７個のアミノ酸置換、または９個のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、最大で４個のアミノ酸置換、５個のアミノ酸置換、６個のアミノ酸置換、７個のアミノ酸置換、または９個のアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、第２の修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、第３の修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、第２および第３の修飾を含む。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ヒトＩＬ－１８３７－１９３の配列（配列番号１）に基づき、アミノ酸残基１～１２７の範囲で２つの修飾を含む。配列番号１は、ＩＬ－１８の生物活性の形態を反映する。内因的にＩＬ－１８は、カスパーゼにより切断されることで生体活性を媒介する追加の３６個のアミノ酸セグメントによりＮ末端において最初に発現される。いくつかの実施形態では、１つの修飾は、配列番号１に基づきアミノ酸残基６～６３の範囲にある。いくつかの実施形態では、１つの修飾は、アミノ酸残基６にある。いくつかの実施形態では、１つの修飾は、アミノ酸残基５３～６３の範囲にある。いくつかの実施形態では、１つの修飾は、アミノ酸残基５３にある。いくつかの実施形態では、１つの修飾は、アミノ酸残基６３にある。
本明細書中の一態様では、Ｅ０６ＫとＫ５３Ａとを含む修飾インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）ポリペプチドを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドであって、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１のＩＬ－１８に基づく、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが記載される。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドはＴ６３Ａをさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｙ０１Ｘ、Ｓ５５Ｘ、Ｆ０２Ｘ、Ｄ５４Ｘ、Ｃ３８Ｘ、Ｃ６８Ｘ、Ｃ７６Ｘ、Ｃ１２７Ｘ、またはＫ７０Ｘのうち少なくとも１つをさらに含み、Ｘはアミノ酸またはアミノ酸誘導体である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｙ０１Ｘ、Ｓ５５Ｘ、Ｆ０２Ｘ、Ｄ５４Ｘ、Ｃ３８Ｘ、Ｃ６８Ｘ、Ｅ６９Ｘ、Ｃ７６Ｘ、Ｃ１２７Ｘ、またはＫ７０Ｘのうち少なくとも１つをさらに含み、Ｘはそれぞれ独立してアミノ酸またはアミノ酸誘導体である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｙ０１Ｇ、Ｓ５５Ａ、Ｆ０２Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ１２７Ｓ、またはＫ７０Ｃのうち少なくとも１つをさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｙ０１Ｇ、Ｓ５５Ａ、Ｆ０２Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｃ３８Ｓ、Ｃ３８Ａ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ６８Ａ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ７６Ａ、Ｃ１２７Ｓ、Ｃ１２７Ａ、またはＫ７０Ｃのうち少なくとも１つをさらに含む。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｙ０１Ｘ、Ｆ０２Ｘ、Ｅ０６Ｘ、Ｓ１０Ｘ、Ｖ１１Ｘ、Ｄ１７Ｘ、Ｃ３８Ｘ、Ｍ５１Ｘ、Ｋ５３Ｘ、Ｄ５４Ｘ、Ｓ５５Ｘ、Ｔ６３Ｘ、Ｃ６８Ｘ、Ｋ７０Ｘ、Ｃ７６Ｘ、ＡＮＤ Ｃ１２７Ｘから選択される、配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つの修飾を含み、Ｘは、天然または非天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｙ０１Ｘ、Ｆ０２Ｘ、Ｅ０６Ｘ、Ｓ１０Ｘ、Ｖ１１Ｘ、Ｄ１７Ｘ、Ｃ３８Ｘ、Ｍ５１Ｘ、Ｋ５３Ｘ、Ｄ５４Ｘ、Ｓ５５Ｘ、Ｔ６３Ｘ、Ｃ６８Ｘ、Ｅ６９Ｘ、Ｋ７０Ｘ、Ｃ７６Ｘ、ＡＮＤ Ｃ１２７Ｘから選択される、配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つの修飾を含み、Ｘは、天然または非天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｙ０１Ｘ、Ｆ０２Ｘ、Ｅ０６Ｘ、Ｓ１０Ｘ、Ｖ１１Ｘ、Ｄ１７Ｘ、Ｃ３８Ｘ、Ｍ５１Ｘ、Ｋ５３Ｘ、Ｄ５４Ｘ、Ｓ５５Ｘ、Ｔ６３Ｘ、Ｃ６８Ｘ、Ｋ７０Ｘ、Ｃ７６Ｘ、ＡＮＤ Ｃ１２７Ｘから選択される、配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つの修飾を含み、Ｘは、天然または非天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｙ０１Ｇ、Ｆ０２Ａ、Ｅ０６Ｋ、Ｓ１０Ｔ、Ｖ１１Ｉ、Ｄ１７Ｎ、Ｃ３８Ｓ、Ｍ５１Ｇ、Ｋ５３Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｓ５５Ａ、Ｔ６３Ａ、Ｃ６８Ｓ、Ｋ７０Ｃ、Ｃ７６Ｓ、およびＣ１２７Ｓから選択される、配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｙ０１Ｇ、Ｆ０２Ａ、Ｅ０６Ｋ、Ｓ１０Ｔ、Ｖ１１Ｉ、Ｄ１７Ｎ、Ｃ３８Ｓ、Ｃ３８Ａ、Ｍ５１Ｇ、Ｋ５３Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｓ５５Ａ、Ｔ６３Ａ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ６８Ａ、Ｋ７０Ｃ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ７６Ａ、Ｃ１２７Ａ、およびＣ１２７Ｓから選択される、配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つの修飾を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｙ０１Ｇ、Ｆ０２Ａ、Ｅ０６Ｋ、Ｓ１０Ｔ、Ｖ１１Ｉ、Ｄ１７Ｎ、Ｃ３８Ｓ、Ｃ３８Ａ、Ｍ５１Ｇ、Ｋ５３Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｓ５５Ａ、Ｔ６３Ａ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ６８Ａ、Ｅ６９Ｃ、Ｋ７０Ｃ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ７６Ａ、Ｃ１２７Ａ、およびＣ１２７Ｓから選択される、配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも１つの修飾を含む。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する１つの修飾を含み、修飾はＥ０６Ｘ、Ｋ５３Ｘ、Ｓ５５Ｘ、またはＴ６３Ｘであり、Ｘは、天然または非天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する１つの修飾を含み、修飾はＥ０６Ｘ、Ｋ５３Ｘ、Ｓ５５Ｘ、またはＴ６３Ｘであり、Ｘはそれぞれ独立して天然または非天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する２つの修飾を含み、修飾は、Ｅ０６ＸとＫ５３Ｘ、Ｅ０６ＸとＳ５５Ｘ、Ｋ５３ＸとＳ５５Ｘ、Ｅ０６ＸとＴ６３Ｘ、またはＫ５３ＸとＴ６３Ｘであり、Ｘは、天然または非天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する３つの修飾を含み、修飾は、Ｅ０６ＸとＫ５３ＸとＳ５５Ｘ、またはＥ０６ＸとＫ５３ＸとＴ６３Ｘであり、Ｘは、天然または非天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する４つの修飾を含み、修飾は、Ｅ０６ＸとＫ５３ＸとＳ５５ＸとＴ６３Ｘ、Ｅ０６ＸとＫ５３ＸとＳ５５ＸとＹ０１Ｘ、Ｅ０６ＸとＫ５３ＸとＳ５５ＸとＦ０２Ｘ、Ｅ０６ＸとＫ５３ＸとＳ５５ＸとＤ５４Ｘ、Ｅ０６ＸとＫ５３ＸとＳ５５ＸとＭ５１Ｘ、またはＣ３８ＸとＣ６８ＸとＣ７６ＸとＣ１２７Ｘであり、Ｘは、天然または非天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する４つの修飾を含み、修飾は、Ｅ０６ＸとＫ５３ＸとＳ５５ＸとＴ６３Ｘ、Ｅ０６ＸとＫ５３ＸとＳ５５ＸとＹ０１Ｘ、Ｅ０６ＸとＫ５３ＸとＳ５５ＸとＦ０２Ｘ、Ｅ０６ＸとＫ５３ＸとＳ５５ＸとＤ５４Ｘ、Ｅ０６ＸとＫ５３ＸとＳ５５ＸとＭ５１Ｘ、Ｃ３８ＸとＥ６９ＸとＣ７６ＸとＣ１２７Ｘ、またはＣ３８ＸとＥ７０ＸとＣ７６ＸとＣ１２７Ｘであり、Ｘは、天然または非天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する少なくとも４つの修飾を含み、少なくとも４つの修飾は、Ｅ０６ＸとＫ５３ＸとＣ６８ＸとＥ６９Ｘ、Ｅ０６ＸとＫ５３ＸとＣ６８ＸとＫ７０Ｘ、Ｅ０６ＸとＫ５３ＸとＴ６３ＸとＥ６９Ｘ、またはＥ０６ＸとＫ５３ＸとＴ６３ＸとＫ７０Ｘである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する５つの修飾を含み、修飾は、Ｃ３８Ｘ、Ｃ６８Ｘ、Ｃ７６Ｘ、Ｃ１２７Ｘ、およびＫ７０Ｘであり、Ｘは、天然または非天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する５つの修飾を含み、修飾は、Ｃ３８Ｘ、Ｃ６８Ｘ、Ｃ７６Ｘ、Ｃ１２７Ｘ、およびＥ６９Ｘであり、Ｘは、天然または非天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する７つの修飾を含み、修飾は、Ｅ０６Ｘ、Ｋ５３Ｘ、Ｃ３８Ｘ、Ｃ６８Ｘ、Ｃ７６Ｘ、Ｃ１２７Ｘ、およびＫ７０Ｘ、またはＫ５３Ｘ、Ｔ６３Ｘ、Ｃ３８Ｘ、Ｃ７６Ｘ、Ｃ１２７Ｘ、およびＫ７０Ｋであり、Ｘは、天然または非天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する７つの修飾を含み、修飾は、Ｅ０６Ｘ、Ｋ５３Ｘ、Ｃ３８Ｘ、Ｃ６８Ｘ、Ｃ７６Ｘ、Ｃ１２７Ｘ、およびＥ６９Ｘ、またはＫ５３Ｘ、Ｔ６３Ｘ、Ｃ３８Ｘ、Ｃ７６Ｘ、Ｃ１２７Ｘ、およびＥ６９Ｋであり、Ｘは、天然または非天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する８つの修飾を含み、修飾は、Ｙ０１Ｘ、Ｆ０２Ｘ、Ｅ０６Ｘ、Ｍ５１Ｘ、Ｋ５３Ｘ、Ｄ５４Ｘ、Ｓ５５Ｘ、およびＴ６３Ｘ、またはＥ０６Ｘ、Ｋ５３Ｘ、Ｓ５５Ｘ、Ｃ３８Ｘ、Ｃ６８Ｘ、Ｃ７６Ｘ、Ｃ１２７Ｘ、およびＫ７０Ｋであり、Ｘは、天然または非天然のアミノ酸である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する８つの修飾を含み、修飾は、Ｅ０６Ｘ、Ｋ５３Ｘ、Ｓ５５Ｘ、Ｃ３８Ｘ、Ｃ６８Ｘ、Ｃ７６Ｘ、Ｃ１２７Ｘ、およびＥ６９Ｘである。いくつかの実施形態では、複数のアミノ酸が、天然または非天然のアミノ酸Ｘと置き換えられ、Ｘはそれぞれ独立して同じまたは異なるアミノ酸である。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する１つの修飾を含み、修飾は、Ｅ０６Ｋ、Ｋ５３Ａ、Ｓ５５Ａ、またはＴ６３Ａである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する２つの修飾を含み、修飾は、Ｅ０６ＸとＫ５３Ａ、Ｅ０６ＫとＳ５５Ａ、Ｋ５３ＡとＳ５５Ａ、Ｅ０６ＫとＴ６３Ａ、またはＫ５３ＡとＴ６３Ａである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する３つの修飾を含み、修飾は、Ｅ０６ＫとＫ５３ＡとＳ５５Ａ、またはＥ０６ＫとＫ５３ＡとＴ６３Ａである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する４つの修飾を含み、修飾は、Ｅ０６ＸとＫ５３ＡとＳ５５ＡとＴ６３Ａ、Ｅ０６ＫとＫ５３ＡとＳ５５ＡとＹ０１Ｇ、Ｅ０６ＫとＫ５３ＡとＳ５５ＡとＦ０２Ａ、Ｅ０６ＫとＫ５３ＡとＳ５５ＡとＤ５４Ａ、Ｅ０６ＫとＫ５３ＡとＳ５５ＡとＭ５１Ｇ、またはＣ３８ＳとＣ６８ＳとＣ７６ＳとＣ１２７Ｓである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する５つの修飾を含み、修飾は、Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ１２７Ｓ、およびＫ７０Ｃである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する５つの修飾を含み、修飾は、Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ１２７Ｓ、およびＥ６９Ｃである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する７つの修飾を含み、修飾は、Ｅ０６Ｋ、Ｋ５３Ａ、Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ１２７Ｓ、およびＫ７０Ｃ、またはＫ５３Ａ、Ｔ６３Ａ、Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ１２７Ｓ、およびＫ７０Ｃである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する７つの修飾を含み、修飾は、Ｅ０６Ｋ、Ｋ５３Ａ、Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ１２７Ｓ、およびＥ６９Ｃ、またはＫ５３Ａ、Ｔ６３Ａ、Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ１２７Ｓ、およびＥ６９Ｃである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する８つの修飾を含み、修飾は、Ｙ０１Ｇ、Ｆ０２Ａ、Ｅ０６Ｋ、Ｍ５１Ｇ、Ｋ５３Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｓ５５Ａ、およびＴ６３Ａ、またはＥ０６Ｋ、Ｋ５３Ａ、Ｓ５５Ａ、Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ１２７Ｓ、およびＫ７０Ｃである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは配列番号１のアミノ酸配列に対する８つの修飾を含み、修飾は、Ｙ０１Ｇ、Ｆ０２Ａ、Ｅ０６Ｋ、Ｍ５１Ｇ、Ｋ５３Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｓ５５Ａ、およびＴ６３Ａ、またはＥ０６Ｋ、Ｋ５３Ａ、Ｓ５５Ａ、Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ１２７Ｓ、およびＥ６９Ｃである。
本明細書中の一態様では、Ｅ０６ＫとＫ５３Ａとを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドであって、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１つまたは複数のシステイン残基にてアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、セリンまたはアラニンのいずれかで置換された１つまたは複数のシステインを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド、各システイン残基にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、各システイン残基は、セリンまたはアラニンで置換される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基６８、６９、または７０にて結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１、２、３、４、５、または６個のメチオニン残基にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、メチオニン残基での各置換は、Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリン残基に対するものである。いくつかの実施形態では、各メチオニン残基は、Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリン残基で置換される。
本明細書中の一態様では、Ｅ０６ＫとＳ５５Ａとを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドであって、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１つまたは複数のシステイン残基にてアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、セリンまたはアラニンのいずれかで置換された１つまたは複数のシステインを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド、各システイン残基にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、各システイン残基は、セリンまたはアラニンで置換される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基６８、６９、または７０にて結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１、２、３、４、５、または６個のメチオニン残基にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、メチオニン残基での各置換は、Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリン残基に対するものである。いくつかの実施形態では、各メチオニン残基は、Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリン残基で置換される。
本明細書中の一態様では、Ｅ０６Ｋ、Ｋ５３Ａ、Ｓ５５Ａ、およびＴ６３Ａを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドであって、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号１０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１つまたは複数のシステイン残基にてアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、セリンまたはアラニンのいずれかで置換された１つまたは複数のシステインを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド、各システイン残基にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、各システイン残基は、セリンまたはアラニンで置換される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基６８、６９、または７０にて結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１、２、３、４、５、または６個のメチオニン残基にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、メチオニン残基での各置換は、Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリン残基に対するものである。いくつかの実施形態では、各メチオニン残基は、Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリン残基で置換される。
本明細書中の一態様では、Ｅ０６Ｋ、Ｋ５３Ａ、およびＴ６３Ａを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドであって、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号１８のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１つまたは複数のシステイン残基にてアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、セリンまたはアラニンのいずれかで置換された１つまたは複数のシステインを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド、各システイン残基にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、各システイン残基は、セリンまたはアラニンで置換される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基６８、６９、または７０にて結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１、２、３、４、５、または６個のメチオニン残基にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、メチオニン残基での各置換は、Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリン残基に対するものである。いくつかの実施形態では、各メチオニン残基は、Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリン残基で置換される。
本明細書中の一態様では、Ｔ６３Ａを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドであって、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号１９のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１つまたは複数のシステイン残基にてアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、セリンまたはアラニンのいずれかで置換された１つまたは複数のシステインを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド、各システイン残基にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、各システイン残基は、セリンまたはアラニンで置換される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基６８、６９、または７０にて結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１、２、３、４、５、または６個のメチオニン残基にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、メチオニン残基での各置換は、Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリン残基に対するものである。いくつかの実施形態では、各メチオニン残基は、Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリン残基で置換される。
本明細書中の一態様では、Ｅ０６ＫとＴ６３Ａとを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドであって、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号２０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１つまたは複数のシステイン残基にてアミノ酸置換をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、セリンまたはアラニンのいずれかで置換された１つまたは複数のシステインを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド、各システイン残基にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、各システイン残基は、セリンまたはアラニンで置換される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基６８、６９、または７０にて結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１、２、３、４、５、または６個のメチオニン残基にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、メチオニン残基での各置換は、Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリン残基に対するものである。いくつかの実施形態では、各メチオニン残基は、Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリン残基で置換される。
本明細書中の一態様では、Ｅ０６Ｋ、Ｋ５３Ａ、Ｃ３８Ｓ、Ｃ７６Ｓ、およびＣ１２７Ｓを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドであって、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号７０のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基６８、６９、または７０にて結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１、２、３、４、５、または６個のメチオニン残基にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、メチオニン残基での各置換は、Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリン残基に対するものである。いくつかの実施形態では、各メチオニン残基は、Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリン残基で置換される。
本明細書中の一態様では、Ｅ０６Ｋ、Ｃ３８Ｓ、およびＫ５３Ａを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドであって、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号７１のアミノ酸配列に対して少なくとも８０％、少なくとも８５％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、または少なくとも９８％同一のアミノ酸配列を有する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基６８、６９、または７０にて結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基６８にて結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１、２、３、４、５、または６個のメチオニン残基にアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、メチオニン残基での各置換は、Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリン残基に対するものである。いくつかの実施形態では、各メチオニン残基は、Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリン残基で置換される。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号２～５８に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号２～８３に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２または配列番号１８に対して少なくとも約８０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２に対して少なくとも約８０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２に対して少なくとも約９０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２に対して少なくとも約９５％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号１８に対して少なくとも約８０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号１８に対して少なくとも約９０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号１８に対して少なくとも約９５％同一である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは組換え型である。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、（ａ）残基２６～３６のいずれか１つに位置するホモセリン残基、（ｂ）残基６０～８０のいずれか１つに位置するホモセリン残基、（ｃ）残基１１０～１２０のいずれか１つに位置するホモセリン残基、（ｄ）残基２８～３８のいずれか１つに位置するノルロイシン残基、（ｄ）残基４６～５６のいずれか１つに位置するノルロイシン残基、（ｅ）残基５４～６４のいずれか１つに位置するノルロイシン残基、（ｆ）残基８０～９０のいずれか１つに位置するノルロイシン残基、（ｇ）残基１０８～１１８のいずれか１つに位置するノルロイシン残基、および（ｈ）残基１４５～１５５のいずれか１つに位置するノルロイシン残基から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、（ａ）残基２６～３６のいずれか１つに位置するホモセリン残基、（ｂ）残基６０～８０のいずれか１つに位置するホモセリン残基、（ｃ）残基１１０～１２０のいずれか１つに位置するホモセリン残基、（ｄ）残基２８～３８のいずれか１つに位置するノルロイシンまたはＯ－メチル－ホモセリン残基、（ｅ）残基４６～５６のいずれか１つに位置するノルロイシンまたはＯ－メチル－ホモセリン残基、（ｆ）残基５４～６４のいずれか１つに位置するノルロイシンまたはＯ－メチル－ホモセリン残基、（ｇ）残基８０～９０のいずれか１つに位置するノルロイシンまたはＯ－メチル－ホモセリン残基、（ｈ）残基１０８～１１８のいずれか１つに位置するノルロイシンまたはＯ－メチル－ホモセリン残基、および（ｉ）残基１４５～１５５のいずれか１つに位置するノルロイシンまたはＯ－メチル－ホモセリン残基から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、（ａ）残基２６～３６のいずれか１つに位置するホモセリン残基、（ｂ）残基６０～８０のいずれか１つに位置するホモセリン残基、（ｃ）残基１１０～１２０のいずれか１つに位置するホモセリン残基、（ｄ）残基２８～３８のいずれか１つに位置するＯ－メチル－ホモセリン残基、（ｅ）残基４６～５６のいずれか１つに位置するＯ－メチル－ホモセリン残基、（ｆ）残基５４～６４のいずれか１つに位置するＯ－メチル－ホモセリン残基、（ｇ）残基８０～９０のいずれか１つに位置するＯ－メチル－ホモセリン残基、（ｈ）残基１０８～１１８のいずれか１つに位置するＯ－メチル－ホモセリン残基、および（ｉ）残基１４５～１５５のいずれか１つに位置するＯ－メチル－ホモセリン残基から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ホモセリン（Ｈｓｅ）３１、ノルロイシン（Ｎｌｅ）３３、Ｎｌｅ５１、Ｎｌｅ５９、Ｈｓｅ７５、Ｎｌｅ８６、Ｎｌｅ１１３、Ｈｓｅ１１６、およびＮｌｅ１５０から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは、Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリンとのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ペプチドは、位置Ｍｅｔ３３、Ｍｅｔ５１、Ｍｅｔ６０、Ｍｅｔ８６、Ｍｅｔ１１３、またはＭｅｔ１５０にてＯ－メチル－Ｌ－ホモセリンとのアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ホモセリン（Ｈｓｅ）３１、ノルロイシン（Ｎｌｅ）３３、Ｏ－メチル－ホモセリン（Ｏｍｈ）３３、Ｎｌｅ５１、Ｏｍｈ５１、Ｎｌｅ６０、Ｏｍｈ６０、Ｈｓｅ７５、Ｎｌｅ８６、Ｏｍｈ８６、Ｈｓｅ１１６、Ｎｌｅ１１３、Ｏｍｈ１１３、Ｎｌｅ１５０、およびＯｍｈ１５０から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、リンカー部分を含む。いくつかの実施形態では、リンカー部分として、ポリマー、リンカー、スペーサ、またはそれらの組合せが挙げられるが、これらに限定されない。リンカー部分は、特定のアミノ酸残基に付加されると、野生型ＩＬ－１８と比較して修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの活性または他の特性を調節することができる。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、追加のポリペプチドに連結される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドと追加のポリペプチドは、融合ポリペプチドを形成する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドと追加のポリペプチドは、一体的にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、追加のポリペプチドは、抗体またはその結合フラグメントを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、ヒト化抗体、マウス抗体、キメラ抗体、二重特異性抗体、それらのフラグメント、またはそれらのあらゆる組合せを含む。いくつかの実施形態では、抗体は、モノクローナル抗体またはそのフラグメントである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、サイトカインにコンジュゲートされる。
ＩＩＩ．ポリマー部分を含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチド
本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１つまたは複数のポリマーを含有できる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１つのポリマー部分にコンジュゲートされる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、２つのポリマー部分にコンジュゲートされる。特定のアミノ酸残基にポリマーを付加することで、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドとＩＬ－１８ＢＰとの結合相互作用を妨害できる。図２Ｃは、ポリマー部分を含む修飾された合成ＩＬ－１８ポリペプチドを例示する図である。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のポリマー部分にコンジュゲートされる修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８Ｒαに対する結合を保持することができ、ＩＬ－１８ＢＰとの結合相互作用が低下し得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のポリマー部分にコンジュゲートされる修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８Ｒαに対する結合が上昇し、ＩＬ－１８ＢＰとの結合相互作用が低下し得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のポリマー部分にコンジュゲートされる修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体に対する結合を保持することができ、ＩＬ－１８ＢＰとの結合相互作用が低下し得る。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のポリマー部分にコンジュゲートされる修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体に対する結合が上昇し、ＩＬ－１８ＢＰとの結合相互作用が低下し得る。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基６５、残基６６、残基６７、残基６８、残基６９、残基７０、残基７１、残基７２、残基７３、残基７４、または残基７５にて共有結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基Ｃ６８にて共有結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基６８にて共有結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基７０にて共有結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基Ｋ７０にて共有結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基６９にて共有結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基Ｅ６９にて共有結合されたポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、修飾アミノ酸αを介して共有結合される。いくつかの実施形態では、修飾アミノ酸αは、アミノ－酸－ＰＥＧアジド基である。いくつかの実施形態では、修飾アミノ酸αは、ＰＥＧスペーサを介してアミノ酸に連結されるアジドを組み込むように修飾されたグルタメート、アスパルテート、リシン、システイン、またはチロシンである。いくつかの実施形態では、修飾アミノ酸αは、
から選択される構造を有し、式中、各ｎは独立して１～３０の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、１～２０、１～１０、２～３０、２～２０、２～１０、５～３０、５～２０、または５～１０の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０である。いくつかの実施形態では、ｎは１０である。いくつかの実施形態では、ｎは８である。いくつかの実施形態では、ｎは６である。いくつかの実施形態では、ｎは１２である。
いくつかの実施形態では、修飾アミノ酸αは、残基６５、残基６６、残基６７、残基６８、残基６９、残基７０、残基７１、残基７２、残基７３、残基７４、および残基７５から選択される、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド上の位置にある。いくつかの実施形態では、修飾アミノ酸αは、残基６８、残基６９、および残基７０から選択される、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド上の位置にある。いくつかの実施形態では、修飾アミノ酸αは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基６８に位置する。いくつかの実施形態では、修飾アミノ酸αは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基６９に位置する。いくつかの実施形態では、修飾アミノ酸αは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基７０に位置する。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、修飾リシン残基に共有結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾リシン残基は、コンジュゲーションハンドルを含む。いくつかの実施形態では、修飾リシン残基はアジドを含む。いくつかの実施形態では、修飾リシン残基は構造Ｂの構造を有し、構造Ｂは、
であり、式中、各ｎは独立して１～３０の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、１～２０、１～１０、２～３０、２～２０、２～１０、５～３０、５～２０、または５～１０の整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、または３０である。いくつかの実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、または８である。いくつかの実施形態では、ｎは３である。いくつかの実施形態では、ｎは４である。いくつかの実施形態では、ｎは５である。いくつかの実施形態では、ｎは６である。いくつかの実施形態では、ｎは８である。いくつかの実施形態では、ｎは１０である。いくつかの実施形態では、ｎは１２である。
いくつかの実施形態では、構造Ｂの修飾リシン残基は、残基６５、残基６６、残基６７、残基６８、残基６９、残基７０、残基７１、残基７２、残基７３、残基７４、および残基７５から選択される、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド上の位置にある。いくつかの実施形態では、構造Ｂの修飾リシン残基は、残基６８、残基６９、および残基７０から選択される、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド上の位置にある。いくつかの実施形態では、構造Ｂの修飾リシン残基は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基６８に位置する。いくつかの実施形態では、構造Ｂの修飾リシン残基は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基６９に位置する。いくつかの実施形態では、構造Ｂの修飾リシン残基は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基７０に位置する。
本明細書中の一態様では、修飾インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）ポリペプチド集団であって、ａ）複数の修飾インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）ポリペプチドと、ｂ）修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合されるとともに、残基６５、残基６６、残基６７、残基６８、残基６９、残基７０、残基７１、残基７２、残基７３、残基７４、または残基７５にて結合される少なくとも１つのポリマー部分であって、アミノ酸残基の位置は参照配列として配列番号１に基づく、ポリマー部分とを含み、修飾ＩＬ－１８の少なくとも９０％が、高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＨＲＭＳ）により判定したときに、複数の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのピーク分子量の±５００Ｄａ内にある分子量を有する、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団が記載される。いくつかの実施形態では、集団における修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのそれぞれは、それに共有結合されるポリマー部分のうち少なくとも１つを含む。
本明細書中の一態様では、修飾インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）ポリペプチド集団であって、ａ）複数の修飾インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）ポリペプチドと、ｂ）修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合されるとともに、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基６５、残基６６、残基６７、残基６８、残基６９、残基７０、残基７１、残基７２、残基７３、残基７４、または残基７５にて結合される複数のポリマー部分であって、アミノ酸残基の位置は参照配列として配列番号１に基づく、ポリマー部分とを含み、複数のポリマー部分の少なくとも９０％が、高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＨＲＭＳ）により判定したときに、複数の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのピーク分子量の±５００Ｄａ内にある分子量を有する、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団が記載される。
いくつかの実施形態では、複数のポリマーの少なくとも７５％は、高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＨＲＭＳ）により判定したときに、複数のポリマーのピーク分子量の±１０％内にある分子量を有する。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリマーまたは複数のポリマー部分は、アミノ酸残基６８にて修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合され、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリマーまたは複数のポリマー部分は、アミノ酸残基６９にて修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合され、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリマーまたは複数のポリマー部分は、アミノ酸残基７０にて修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合され、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリマーまたは複数のポリマー部分は、Ｃ６８にて修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合され、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、少なくとも１つのポリマーまたは複数のポリマー部分は、Ｋ７０にて修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合され、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。
いくつかの実施形態では、複数の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの各修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１つまたは複数の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、Ｅ０６、Ｋ５３、Ｙ０１、Ｓ５５、Ｆ０２、Ｄ５４、Ｃ３８、Ｔ６３Ａ、Ｃ６８、Ｃ７６、Ｃ１２７、およびＫ７０から選択される残基位置にあり、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、複数の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの各修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１つまたは複数の突然変異を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、Ｅ０６、Ｋ５３、Ｙ０１、Ｓ５５、Ｆ０２、Ｄ５４、Ｃ３８、Ｔ６３Ａ、Ｃ６８、Ｃ７６、Ｃ１２７、およびＥ６９から選択される残基位置にあり、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、Ｅ０６Ｋ、Ｋ５３Ａ、Ｙ０１Ｇ、Ｓ５５Ａ、Ｆ０２Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｃ３８Ｓ、Ｔ６３Ａ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ１２７Ｓ、およびＫ７０Ｃから選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、Ｅ０６ＫおよびＫ５３Ａである。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、Ｅ０６Ｋ、Ｋ５３Ａ、Ｙ０１Ｇ、Ｓ５５Ａ、Ｆ０２Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｃ３８Ｓ、Ｔ６３Ａ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ１２７Ｓ、およびＥ６９Ｃから選択される。いくつかの実施形態では、１つまたは複数の突然変異は、Ｅ０６Ｋ、Ｋ５３Ａ、およびＴ６３Ａである。
いくつかの実施形態では、ポリマーの重量平均分子量は、最大約５０，０００ダルトン、最大約２５，０００ダルトン、最大約１０，０００ダルトン、または最大約６，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、ポリマーの重量平均分子量は、最低約１２０ダルトン、最低約２５０ダルトン、最低約３００ダルトン、最低約４００ダルトン、または最低約５００ダルトンである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｃ６８またはＫ７０にて共有結合された第１のポリマーを含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｃ６８、Ｅ６９、またはＫ７０にて共有結合された第１のポリマーを含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｃ６８にて共有結合された第１のポリマーを含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｅ６９にて共有結合された第１のポリマーを含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、Ｋ７０にて共有結合された第１のポリマーを含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドにコンジュゲートされるポリマーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの水溶性ポリマーである。ポリマーは、ＩＬ－１８ポリペプチドの残基Ｃ６８もしくはＫ７０のうち１つもしくは両方、またはそれらの突然変異体に付加される場合がある。ポリマーは、ＩＬ－１８ポリペプチドの残基Ｃ６８、Ｅ６９、およびＫ７０のうちいずれか１つ、２つ、もしくは３つすべて、またはそれらの突然変異体にも付加される場合がある。加えて、ポリマーは、ポリペプチドの半減期を延ばすために修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに付加される場合がある。
いくつかの実施形態では、１つまたは複数のポリマー部分にコンジュゲートされる修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８Ｒαに対する結合を保持し、ＩＬ－１８ＢＰとの結合相互作用が低下し、半減期（ｔ１／２）の増加を呈する可能性がある。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のポリマー部分にコンジュゲートされる修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８Ｒαに対する結合が上昇し、ＩＬ－１８ＢＰとの結合相互作用が低下し、半減期（ｔ１／２）の増加を呈する可能性がある。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のポリマー部分にコンジュゲートされる修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８Ｒαβヘテロ二量体に対する結合を保持し、ＩＬ－１８ＢＰとの結合相互作用が低下し、半減期（ｔ１／２）の増加を呈する可能性がある。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のポリマー部分にコンジュゲートされる修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８Ｒαβヘテロ二量体に対する結合が上昇し、ＩＬ－１８ＢＰとの結合相互作用が低下し、半減期（ｔ１／２）の増加を呈する可能性がある。いくつかの実施形態では、半減期は対象の血液中のｉｎ ｖｉｖｏ半減期である。
半減期を延ばすポリマーは、最大約６ｋＤａ、最大約２５ｋＤａ、最大約５０ｋＤａを含むいかなるサイズであってもよい。いくつかの実施形態では、半減期を延ばすポリマーは、ＰＥＧポリマーである。いくつかの実施形態では、半減期を伸ばすポリマーの平均分子量は、約２００～約２０，０００、例えばＰＥＧ２００、ＰＥＧ４００、ＰＥＧ６００、ＰＥＧ１０００、ＰＥＧ１４５０、ＰＥＧ１５００、ＰＥＧ４０００、ＰＥＧ４６００、ＰＥＧ８０００である。
ＩＩＩａ．ポリマー
本明細書中の一態様では、共有結合されたポリマーを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、その上に共有結合された１つまたは複数のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、記載された修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合された１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０個、またはそれより多くのポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、さらに追加の部分を修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに結合させるのに使用できるコンジュゲーションハンドルを含む。別の部分に結合される相補的反応基と反応可能であるあらゆる適切な反応基が、コンジュゲーションハンドルとして使用できる。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドルは、Ｃｕ（Ｉ）触媒型もしくは「銅触媒を含まない」アルキン－アジドトリアゾール形成反応（例えば、歪み促進型付加環化）、シュタウディンガーライゲーション、逆電子要請型ディールス・アルダー（ＩＥＤＤＡ）反応、「フォトクリック」ケミストリー、トランス－シクロオクテンでのテトラジン付加環化、またはオレフィンメタセシスや鈴木・宮浦反応もしくは薗頭クロスカップリング反応などの金属媒介型プロセスにおける試薬を含む。
いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドルは、「銅を含まない」アルキンアジドトリアゾール形成反応の試薬を含む。当該アルキンアジドトリアゾール形成反応におけるアルキンの非限定的な例として、シクロオクチン試薬（例えば、（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）－ビシクロ［６．１．０］ノナ－４－イン－９－イルメタノール含有試薬、ジベンゾシクロオクチン－アミン試薬、ジフルオロシクロオクチン、またはそれらの誘導体）が挙げられる。
いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドルは、アジド、アルキン、テトラジン、ハロゲン化物、スルフヒドリル、ジスルフィド、マレイミド、活性化エステル、アルケン、アルデヒド、ケトン、イミン、ヒドラジン、アシルトリフルオロボレート、ヒドロキシルアミン、ホスフィン、トランス－シクロオクテン、およびヒドラジドから選択される反応基を含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドルおよび相補的コンジュゲーションハンドルは、「ＣＬＩＣＫ」ケミストリー試薬を含む。クリックケミストリー残基の例示的な基は、Ｈｅｉｎらによる「Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，Ａ Ｐｏｗｅｒｆｕｌ Ｔｏｏｌ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，ｖｏｌｕｍｅ ２５，ｐａｇｅｓ ２２１６－２２３０（２００８）；Ｔｈｉｒｕｍｕｒｕｇａｎらによる「Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ｄｉｖｅｒｓｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ－Ｂｉｏｌｏｇｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ」，Ｃｈｅｍ．Ｒｅｖ．２０１３，１１３，７，４９０５－４９７９；米国特許出願第２０１６０１０７９９９号明細書；米国特許第１０２６６５０２号明細書；および米国特許出願第２０１９０２０４３３０号に示されており、これら文献は全体を参照することで援用される。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、コンジュゲーションハンドル、またはコンジュゲーションハンドルと相補的コンジュゲーションハンドルとの反応生成物を含む。いくつかの実施形態では、コンジュゲーションハンドルと相補的コンジュゲーションハンドルとの反応生成物は、ＫＡＴライゲーション（カリウムアシルトリフルオロボレート（ｐｏｔａｓｓｉｕｍ ａｃｙｌｔｒｉｆｌｕｏｒｏｂｏｒａｔｅ）とヒドロキシルアミンとの反応）、シュタウディンガーライゲーション（アジドとホスフィンとの反応）、テトラジン付加環化（テトラジンとトランス－シクロオクテンとの反応）、またはヒュスゲン付加環化（アルキンとアジドとンの反応）から生じる。いくつかの実施形態では、ポリマーは、ポリマーを修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに結合させるために使用された、コンジュゲーションハンドルと相補的コンジュゲーションハンドルとの反応生成物を含む。
いくつかの実施形態では、ポリマーはアジド部分を含む。いくつかの実施形態では、ポリマーは、アジド部分、アルキン部分、またはアジド－アルキン付加環化反応の反応生成物を含む。いくつかの実施形態では、アジド－アルキン付加環化反応の反応生成物は、１，２，３－トリアゾールである。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、二官能性リンカーの使用により修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに結合される。いくつかの実施形態では、二官能性リンカーは、共有結合を形成するために修飾ＩＬ－１８ポリペプチド上でアミノ酸残基の反応基（例えば、システインスルフヒドリル）と反応する。いくつかの実施形態では、第２の工程で、二官能性リンカー（例えば、アジドやアルキンなどのコンジュゲーションハンドル）の第２の反応基が、ポリマーなどの第２の部分を結合するために使用される。
いくつかの実施形態では、ポリマーは水溶性ポリマーである。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）含む。いくつかの実施形態では、ポリ（アルキレンオキシド）は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である。
いくつかの実施形態では、ポリマーは第１のポリマーである。いくつかの実施形態では、第１のポリマーは、水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）である。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリサッカライドである。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレンオキシド）である。
いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコールの重量平均分子量は、約１０ｋＤａ～約５０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコールの重量平均分子量は、約１０ｋＤａ、約２０ｋＤａ、または約３０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコールの重量平均分子量は、約３０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの半減期は、対応する野生型ＩＬ－１８ポリペプチドの半減期より少なくとも１０％長い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの半減期は、対応する野生型ＩＬ－１８ポリペプチドの半減期より少なくとも３０％長い。
いくつかの実施形態では、結合されたポリマーの重量平均分子量は、約６，０００ダルトン～約５０，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、ポリマーの重量平均分子量は、約６，０００ダルトン～約１０，０００ダルトン、約６，０００ダルトン～約２５，０００ダルトン、約６，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン～約２５，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、または約２５，０００ダルトン～約５０，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、ポリマーの重量平均分子量は、約６，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約２５，０００ダルトン、または約５０，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、ポリマーの重量平均分子量は、最低約６，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、または約２５，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、ポリマーの重量平均分子量は、最大約１０，０００ダルトン、約２５，０００ダルトン、または約５０，０００ダルトンである。
いくつかの実施形態では、第１のポリマーなどの結合されたポリマーの重量平均分子量は、約１２０ダルトン～約１，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、ポリマーの重量平均分子量は、約１２０ダルトン～約２５０ダルトン、約１２０ダルトン～約３００ダルトン、約１２０ダルトン～約４００ダルトン、約１２０ダルトン～約５００ダルトン、約１２０ダルトン～約１，０００ダルトン、約２５０ダルトン～約３００ダルトン、約２５０ダルトン～約４００ダルトン、約２５０ダルトン～約５００ダルトン、約２５０ダルトン～約１，０００ダルトン、約３００ダルトン～約４００ダルトン、約３００ダルトン～約５００ダルトン、約３００ダルトン～約１，０００ダルトン、約４００ダルトン～約５００ダルトン、約４００ダルトン～約１，０００ダルトン、または約５００ダルトン～約１，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、ポリマーの重量平均分子量は、約１２０ダルトン、約２５０ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、または約１，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、ポリマーの重量平均分子量は、最低約１２０ダルトン、約２５０ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、または約５００ダルトンである。いくつかの実施形態では、ポリマーの重量平均分子量は、最大約２５０ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、または約１，０００ダルトンである。
いくつかの実施形態では、第１のポリマーなどの結合されたポリマーは、水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコール（すなわちポリエチレンオキシド）などのポリ（アルキレンオキシド）である。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、修飾ポリ（アルキレンオキシド）含む。いくつかの実施形態では、修飾ポリ（アルキレンオキシド）は、１つまたは複数のリンカー基を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のリンカー基は、アミド基、エステル基、エーテル基、チオエテール基、カルボニル基などの二官能性リンカーを含むいくつかの実施形態では、１つまたは複数のリンカー基は、アミドリンカー基を含む。いくつかの実施形態では、修飾ポリ（アルキレンオキシド）は、１つまたは複数のスペーサ基を含む。いくつかの実施形態では、スペーサ基は、置換または非置換のＣ１－Ｃ６アルキレン基を含む。いくつかの実施形態では、スペーサ基は、－ＣＨ２－、－ＣＨ２ＣＨ２－、または－ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－を含む。いくつかの実施形態では、リンカー基は、双直交反応（例えば生体適合反応や選択反応）の産物である。いくつかの実施形態では、双直交反応は、Ｃｕ（Ｉ）触媒型もしくは「銅触媒を含まない」アルキン－アジドトリアゾール形成反応、シュタウディンガーライゲーション、逆電子要請型ディールス・アルダー（ＩＥＤＤＡ）反応、アルキン－ニトロン付加環化化学反応、またはオレフィンメタセシス反応や鈴木・宮浦もしくは薗頭クロスカップリング反応などの金属媒介型プロセスである。いくつかの実施形態では、第１のポリマーは、クリックケミストリーを介してＩＬ－１８ポリペプチドに結合される。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、表１から選択される１つまたは複数のポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、抗体やポリマーなどの誘導体化分子または部分に対する修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのコンジュゲーションを容易にする反応基を含む。いくつかの実施形態では、反応基は、カルボン酸誘導体化活性エステル、混合無水物、ハロゲン化アシル、アジ化アシル、ハロゲン化アルキル、Ｎ－マレイミド、イミノエステル、イソシアネート、およびイソチオシアネートのうち１つまたは複数を含む。いくつかの実施形態では、反応基はアジドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基に共有結合される化学試薬を含む。いくつかの実施形態では、化学試薬は双直交試薬を含む。いくつかの実施形態では、化学試薬はアジドを含む。いくつかの実施形態では、化学試薬はアルキンを含む。いくつかの実施形態では、化学試薬は、残基Ｃ６８またはＫ７０にて結合され、残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、化学試薬は、残基Ｃ６８、Ｅ６９、またはＫ７０にて結合され、残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、化学試薬は、Ｃ６８からの残基にて結合され、残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、化学試薬は、Ｅ６９からの残基にて結合され、残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、化学試薬は、残基Ｋ７０にて結合され、残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく。
いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、１～１０個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の水溶性ポリマーは、１個のポリエチレングリコール鎖～１０個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の水溶性ポリマーは、１個のポリエチレングリコール鎖～２個のポリエチレングリコール鎖、１個のポリエチレングリコール鎖～４個のポリエチレングリコール鎖、１個のポリエチレングリコール鎖～６個のポリエチレングリコール鎖、１個のポリエチレングリコール鎖～１０個のポリエチレングリコール鎖、２個のポリエチレングリコール鎖～４個のポリエチレングリコール鎖、２個のポリエチレングリコール鎖～６個のポリエチレングリコール鎖、２個のポリエチレングリコール鎖～１０個のポリエチレングリコール鎖、４個のポリエチレングリコール鎖～６個のポリエチレングリコール鎖、４個のポリエチレングリコール鎖～１０個のポリエチレングリコール鎖、または６個のポリエチレングリコール鎖～１０個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の水溶性ポリマーは、１個のポリエチレングリコール鎖、２個のポリエチレングリコール鎖、４個のポリエチレングリコール鎖、６個のポリエチレングリコール鎖、または１０個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の水溶性ポリマーは、最低１個のポリエチレングリコール鎖、２個のポリエチレングリコール鎖、４個のポリエチレングリコール鎖、または６個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の水溶性ポリマーは、最大２個のポリエチレングリコール鎖、４個のポリエチレングリコール鎖、６個のポリエチレングリコール鎖、または１０個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の水溶性ポリマーは、４個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の水溶性ポリマーは、式（ＩＩ）：
の構造を含み、式中、各ｍは、独立して４～３０から選択される整数である。いくつかの実施形態では、第１の水溶性ポリマーの少なくとも１個のポリエチレングリコール鎖は、式（ＩＩＩ）：
の構造を含み、式中、各ｍは、独立して４～３０から選択される整数であり、各ｎは、独立して１～１０から選択される整数である。いくつかの実施形態では、第１の水溶性ポリマーの各ポリエチレングリコール鎖は、式（ＩＩＩ）の構造を含む。式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｍは、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、２６、２７、２８、２９、３０、３１、３３、３４、３５、３６、３７、３８、３９、または４０である。式（ＩＩＩ）のいくつかの実施形態では、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、または１０である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合される第２のポリマーをさらに含む。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、残基６８～残基７０のアミノ酸残基領域にて共有結合される。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、残基Ｃ６８にて共有結合される。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＮ末端に共有結合される。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、残基Ｋ７０にて共有結合される。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＮ末端に共有結合される。
いくつかの実施形態では、第２のポリマーの重量平均分子量は、約６，０００ダルトン～約５０，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、第２のポリマーの重量平均分子量は、約６，０００ダルトン～約１０，０００ダルトン、約６，０００ダルトン～約２５，０００ダルトン、約６，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン～約２５，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、または約２５，０００ダルトン～約５０，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、第２のポリマーの重量平均分子量は、約６，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約２５，０００ダルトン、または約５０，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、第２のポリマーの重量平均分子量は、最低約６，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、または約２５，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、第２のポリマーの重量平均分子量は、最大約１０，０００ダルトン、約２５，０００ダルトン、または約５０，０００ダルトンである。
いくつかの実施形態では、第２のポリマーの重量平均分子量は、約１２０ダルトン～約１，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、第２のポリマーの重量平均分子量は、約１２０ダルトン～約２５０ダルトン、約１２０ダルトン～約３００ダルトン、約１２０ダルトン～約４００ダルトン、約１２０ダルトン～約５００ダルトン、約１２０ダルトン～約１，０００ダルトン、約２５０ダルトン～約３００ダルトン、約２５０ダルトン～約４００ダルトン、約２５０ダルトン～約５００ダルトン、約２５０ダルトン～約１，０００ダルトン、約３００ダルトン～約４００ダルトン、約３００ダルトン～約５００ダルトン、約３００ダルトン～約１，０００ダルトン、約４００ダルトン～約５００ダルトン、約４００ダルトン～約１，０００ダルトン、または約５００ダルトン～約１，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、第２のポリマーの重量平均分子量は、約１２０ダルトン、約２５０ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、または約１，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、第２のポリマーの重量平均分子量は、最低約１２０ダルトン、約２５０ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、または約５００ダルトンである。いくつかの実施形態では、第２のポリマーの重量平均分子量は、最大約２５０ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、または約１，０００ダルトンである。
いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）である。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（エチレンオキシド）である。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、クリックケミストリーを介してＩＬ－１８ポリペプチドに結合される。
いくつかの実施形態では、第２の水溶性ポリマーは、１～１０個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の水溶性ポリマーは、２個のポリエチレングリコール鎖～１０個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の水溶性ポリマーは、１個のポリエチレングリコール鎖～２個のポリエチレングリコール鎖、１個のポリエチレングリコール鎖～４個のポリエチレングリコール鎖、１個のポリエチレングリコール鎖～６個のポリエチレングリコール鎖、１個のポリエチレングリコール鎖～１０個のポリエチレングリコール鎖、２個のポリエチレングリコール鎖～４個のポリエチレングリコール鎖、２個のポリエチレングリコール鎖～６個のポリエチレングリコール鎖、２個のポリエチレングリコール鎖～１０個のポリエチレングリコール鎖、４個のポリエチレングリコール鎖～６個のポリエチレングリコール鎖、４個のポリエチレングリコール鎖～１０個のポリエチレングリコール鎖、または６個のポリエチレングリコール鎖～１０個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の水溶性ポリマーは、１個のポリエチレングリコール鎖、２個のポリエチレングリコール鎖、４個のポリエチレングリコール鎖、６個のポリエチレングリコール鎖、または１０個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の水溶性ポリマーは、最低１個のポリエチレングリコール鎖、２個のポリエチレングリコール鎖、４個のポリエチレングリコール鎖、または６個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の水溶性ポリマーは、最大２個のポリエチレングリコール鎖、４個のポリエチレングリコール鎖、６個のポリエチレングリコール鎖、または１０個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１の水溶性ポリマーは、４個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第２の水溶性ポリマーは、式（ＩＩ）：
の構造を含み、式中、各ｍは、独立して４～３０から選択される整数である。いくつかの実施形態では、第２の水溶性ポリマーの少なくとも１個のポリエチレングリコール鎖は、式（ＩＩＩ）：
の構造を含み、式中、各ｍは、独立して４～３０から選択される整数であり、各ｎは、独立して１～１０から選択される整数である。いくつかの実施形態では、第２の水溶性ポリマーの各ポリエチレングリコール鎖は、式（ＩＩＩ）の構造を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合される第３のポリマーをさらに含む。いくつかの実施形態では、第３のポリマーの重量平均分子量は、約６，０００ダルトン～約５０，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、第３のポリマーの重量平均分子量は、約６，０００ダルトン～約１０，０００ダルトン、約６，０００ダルトン～約２５，０００ダルトン、約６，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン～約２５，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン～約５０，０００ダルトン、または約２５，０００ダルトン～約５０，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、第３のポリマーの重量平均分子量は、約６，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、約２５，０００ダルトン、または約５０，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、第３のポリマーの重量平均分子量は、最低約６，０００ダルトン、約１０，０００ダルトン、または約２５，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、第３のポリマーの重量平均分子量は、最大約１０，０００ダルトン、約２５，０００ダルトン、または約５０，０００ダルトンである。
いくつかの実施形態では、第３のポリマーの重量平均分子量は、約１２０ダルトン～約１，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、第３のポリマーの重量平均分子量は、約１２０ダルトン～約２５０ダルトン、約１２０ダルトン～約３００ダルトン、約１２０ダルトン～約４００ダルトン、約１２０ダルトン～約５００ダルトン、約１２０ダルトン～約１，０００ダルトン、約２５０ダルトン～約３００ダルトン、約２５０ダルトン～約４００ダルトン、約２５０ダルトン～約５００ダルトン、約２５０ダルトン～約１，０００ダルトン、約３００ダルトン～約４００ダルトン、約３００ダルトン～約５００ダルトン、約３００ダルトン～約１，０００ダルトン、約４００ダルトン～約５００ダルトン、約４００ダルトン～約１，０００ダルトン、または約５００ダルトン～約１，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、第３のポリマーの重量平均分子量は、約１２０ダルトン、約２５０ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、または約１，０００ダルトンである。いくつかの実施形態では、第３のポリマーの重量平均分子量は、最低約１２０ダルトン、約２５０ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、または約５００ダルトンである。いくつかの実施形態では、第３のポリマーの重量平均分子量は、最大約２５０ダルトン、約３００ダルトン、約４００ダルトン、約５００ダルトン、または約１，０００ダルトンである。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、重量平均分子量が約２５０ダルトン～約５０，０００ダルトンであるとともに修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合される第３のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、重量平均分子量が約５００ダルトン～約２５，０００ダルトンであるとともに修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合される第３のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、重量平均分子量が約１，０００ダルトン～約１０，０００ダルトンであるとともに修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合される第３のポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、第３のポリマーは、水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）である。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、第３のポリマーは、クリックケミストリーを介してＩＬ－１８ポリペプチドに結合される。
本明細書中の別の態様では、（ａ）重量平均分子量が最大約６，０００ダルトンであるとともに第１のアミノ酸残基に共有結合される第１のポリマーと、（ｂ）重量平均分子量が最大約６，０００ダルトンであるとともに第２のアミノ酸残基に共有結合される第２のポリマーとを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドであって、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが記載される。本明細書中の別の態様では、（ａ）第１のアミノ酸残基に共有結合される第１のポリマーと、（ｂ）第２のアミノ酸残基に共有結合される第２のポリマーとを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドであって、第１のポリマーと第２のポリマーのうち一方の重量平均分子量は、約２００Ｄａ、３００Ｄａ、または４００Ｄａ～約６００Ｄａ、１０００Ｄａ、または６０００Ｄａの範囲内にあり、第１のポリマーと第２のポリマーのうち他方の重量平均分子量は、約５０００Ｄａ、１０，０００Ｄａ、または２０，０００Ｄａ～約３０，０００Ｄａ、４０，０００Ｄａ、または５０，０００Ｄａの範囲内にあり、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが記載される。いくつかの実施形態では、第１のポリマーと第２のポリマーは、それぞれ独立して水溶性ポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、各ポリマーは、水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、各水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）である。いくつかの実施形態では、各水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールである。
いくつかの実施形態では、第１のポリマーと第２のポリマーは、それぞれ独立して１～５個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリマーと第２のポリマーは、それぞれ独立して１個のポリエチレングリコール鎖を含む。
いくつかの実施形態では、第１のポリマーと第２のポリマーは、それぞれ独立して３～２５個のエチレングリコールユニットを有する１個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリマーと第２のポリマーは、それぞれ独立して３個のエチレングリコールユニット～２５個のエチレングリコールユニットを有する１個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリマーと第２のポリマーは、それぞれ独立して３個のエチレングリコールユニット～５個のエチレングリコールユニット、３個のエチレングリコールユニット～７個のエチレングリコールユニット、３個のエチレングリコールユニット～１０個のエチレングリコールユニット、３個のエチレングリコールユニット～１５個のエチレングリコールユニット、３個のエチレングリコールユニット～２５個のエチレングリコールユニット、５個のエチレングリコールユニット～７個のエチレングリコールユニット、５個のエチレングリコールユニット～１０個のエチレングリコールユニット、５個のエチレングリコールユニット～１５個のエチレングリコールユニット、５個のエチレングリコールユニット～２５個のエチレングリコールユニット、７個のエチレングリコールユニット～１０個のエチレングリコールユニット、７個のエチレングリコールユニット～１５個のエチレングリコールユニット、７個のエチレングリコールユニット～２５個のエチレングリコールユニット、１０個のエチレングリコールユニット～１５個のエチレングリコールユニット、１０個のエチレングリコールユニット～２５個のエチレングリコールユニット、または１５個のエチレングリコールユニット～２５個のエチレングリコールユニットを有する１個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリマーと第２のポリマーは、それぞれ独立して３個のエチレングリコールユニット、５個のエチレングリコールユニット、７個のエチレングリコールユニット、１０個のエチレングリコールユニット、１５個のエチレングリコールユニット、または２５個のエチレングリコールユニットを有する１個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリマーと第２のポリマーは、それぞれ独立して最低３個のエチレングリコールユニット、５個のエチレングリコールユニット、７個のエチレングリコールユニット、１０個のエチレングリコールユニット、または１５個のエチレングリコールユニットを有する１個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第１のポリマーと第２のポリマーは、それぞれ独立して最大５個のエチレングリコールユニット、７個のエチレングリコールユニット、１０個のエチレングリコールユニット、１５個のエチレングリコールユニット、または２５個のエチレングリコールユニットを有する１個のポリエチレングリコール鎖を含む。
いくつかの実施形態では、第３の水溶性ポリマーは、１～１０個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第３の水溶性ポリマーは、３個のポリエチレングリコール鎖～１０個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第３の水溶性ポリマーは、１個のポリエチレングリコール鎖～２個のポリエチレングリコール鎖、１個のポリエチレングリコール鎖～４個のポリエチレングリコール鎖、１個のポリエチレングリコール鎖～６個のポリエチレングリコール鎖、１個のポリエチレングリコール鎖～１０個のポリエチレングリコール鎖、２個のポリエチレングリコール鎖～４個のポリエチレングリコール鎖、２個のポリエチレングリコール鎖～６個のポリエチレングリコール鎖、２個のポリエチレングリコール鎖～１０個のポリエチレングリコール鎖、４個のポリエチレングリコール鎖～６個のポリエチレングリコール鎖、４個のポリエチレングリコール鎖～１０個のポリエチレングリコール鎖、または６個のポリエチレングリコール鎖～１０個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第３の水溶性ポリマーは、１個のポリエチレングリコール鎖、２個のポリエチレングリコール鎖、４個のポリエチレングリコール鎖、６個のポリエチレングリコール鎖、または１０個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第３の水溶性ポリマーは、最低１個のポリエチレングリコール鎖、２個のポリエチレングリコール鎖、４個のポリエチレングリコール鎖、または６個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第３の水溶性ポリマーは、最大２個のポリエチレングリコール鎖、４個のポリエチレングリコール鎖、６個のポリエチレングリコール鎖、または１０個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第３の水溶性ポリマーは、４個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、第３の水溶性ポリマーは、式（ＩＩ）：
の構造を含み、式中、各ｍは、独立して４～３０から選択される整数である。いくつかの実施形態では、第３の水溶性ポリマーの各ポリエチレングリコール鎖は、式（ＩＩＩ）：
の構造を含み、式中、各ｍは、独立して４～３０から選択される整数であり、各ｎは、独立して１～１０から選択される整数である。
いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、それぞれ独立して約５～約３００個、約１０～約２００個、約２０～約１００個、または約２５～約５０個のエチレングリコールユニットを含む。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、それぞれ独立して５個のエチレングリコールユニット～３００個のエチレングリコールユニットを含む。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、それぞれ独立して５個のエチレングリコールユニット～１０個のエチレングリコールユニット、５個のエチレングリコールユニット～２０個のエチレングリコールユニット、５個のエチレングリコールユニット～２５個のエチレングリコールユニット、５個のエチレングリコールユニット～５０個のエチレングリコールユニット、５個のエチレングリコールユニット～１００個のエチレングリコールユニット、５個のエチレングリコールユニット～２００個のエチレングリコールユニット、５個のエチレングリコールユニット～３００個のエチレングリコールユニット、１０個のエチレングリコールユニット～２０個のエチレングリコールユニット、１０個のエチレングリコールユニット～２５個のエチレングリコールユニット、１０個のエチレングリコールユニット～５０個のエチレングリコールユニット、１０個のエチレングリコールユニット～１００個のエチレングリコールユニット、１０個のエチレングリコールユニット～２００個のエチレングリコールユニット、１０個のエチレングリコールユニット～３００個のエチレングリコールユニット、２０個のエチレングリコールユニット～２５個のエチレングリコールユニット、２０個のエチレングリコールユニット～５０個のエチレングリコールユニット、２０個のエチレングリコールユニット～１００個のエチレングリコールユニット、２０個のエチレングリコールユニット～２００個のエチレングリコールユニット、２０個のエチレングリコールユニット～３００個のエチレングリコールユニット、２５個のエチレングリコールユニット～５０個のエチレングリコールユニット、２５個のエチレングリコールユニット～１００個のエチレングリコールユニット、２５個のエチレングリコールユニット～２００個のエチレングリコールユニット、２５個のエチレングリコールユニット～３００個のエチレングリコールユニット、５０個のエチレングリコールユニット～１００個のエチレングリコールユニット、５０個のエチレングリコールユニット～２００個のエチレングリコールユニット、５０個のエチレングリコールユニット～３００個のエチレングリコールユニット、１００個のエチレングリコールユニット～２００個のエチレングリコールユニット、１００個のエチレングリコールユニット～３００個のエチレングリコールユニット、または２００個のエチレングリコールユニット～３００個のエチレングリコールユニットを有する１個のポリエチレングリコール鎖を含む。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、それぞれ独立して５個のエチレングリコールユニット、１０個のエチレングリコールユニット、２０個のエチレングリコールユニット、２５個のエチレングリコールユニット、５０個のエチレングリコールユニット、１００個のエチレングリコールユニット、２００個のエチレングリコールユニット、または３００個のエチレングリコールユニットを含む。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、それぞれ独立して最低５個のエチレングリコールユニット、１０個のエチレングリコールユニット、２０個のエチレングリコールユニット、２５個のエチレングリコールユニット、５０個のエチレングリコールユニット、１００個のエチレングリコールユニット、または２００個のエチレングリコールユニットを含む。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、それぞれ独立して最大１０個のエチレングリコールユニット、２０個のエチレングリコールユニット、２５個のエチレングリコールユニット、５０個のエチレングリコールユニット、１００個のエチレングリコールユニット、２００個のエチレングリコールユニット、または３００個のエチレングリコールユニットを含む。
いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、それぞれ独立して直鎖または分枝鎖である。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、それぞれ直鎖ポリエチレングリコールである。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、それぞれ分枝鎖ポリエチレングリコールである。例えば、いくつかの実施形態では、第１のポリマーおよび第２ポリマーは、それぞれ直鎖ポリエチレングリコール鎖を含む。
いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、それぞれ独立してヒドロキシ基、アルキル基、アルコキシ基、アミド基、またはアミノ基により末端をキャッピングされる。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、それぞれ独立してアミノ基により末端をキャッピングされる。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、それぞれ独立してアミド基により末端をキャッピングされる。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、それぞれ独立してアルコキシ基により末端をキャッピングされる。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、それぞれ独立してアルキル基により末端をキャッピングされる。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖は、それぞれ独立してヒドロキシ基により末端をキャッピングされる。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の１つまたは複数は、独立して構造：
を有し、式中、ｎは４～３０から選択される整数である。いくつかの実施形態では、ポリエチレングリコール鎖の１つまたは複数は、独立して構造：
を有し、式中、ｍは４～３０から選択される整数である。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１～１０個の共有結合された水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１～１０個の共有結合された水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１もしくは２個の共有結合された水溶性ポリマー、１～３個の共有結合された水溶性ポリマー、１～４個の共有結合された水溶性ポリマー、１～６個の共有結合された水溶性ポリマー、１～８個の共有結合された水溶性ポリマー、１～１０個の共有結合された水溶性ポリマー、２もしくは３個の共有結合された水溶性ポリマー、２～４個の共有結合された水溶性ポリマー、２～６個の共有結合された水溶性ポリマー、２～８個の共有結合された水溶性ポリマー、２～１０個の共有結合された水溶性ポリマー、３もしくは４個の共有結合された水溶性ポリマー、３～６個の共有結合された水溶性ポリマー、３～８個の共有結合された水溶性ポリマー、３～１０個の共有結合された水溶性ポリマー、４～６個の共有結合された水溶性ポリマー、４～８個の共有結合された水溶性ポリマー、４～１０個の共有結合された水溶性ポリマー、６～８個の共有結合された水溶性ポリマー、６～１０個の共有結合された水溶性ポリマー、または８～１０個の共有結合された水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１個の共有結合された水溶性ポリマー、２個の共有結合された水溶性ポリマー、３個の共有結合された水溶性ポリマー、４個の共有結合された水溶性ポリマー、６個の共有結合された水溶性ポリマー、８個の共有結合された水溶性ポリマー、または１０個の共有結合された水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、最低１個の共有結合された水溶性ポリマー、２個の共有結合された水溶性ポリマー、３個の共有結合された水溶性ポリマー、４個の共有結合された水溶性ポリマー、６個の共有結合された水溶性ポリマー、または８個の共有結合された水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、最大２個の共有結合された水溶性ポリマー、３個の共有結合された水溶性ポリマー、４個の共有結合された水溶性ポリマー、６個の共有結合された水溶性ポリマー、８個の共有結合された水溶性ポリマー、または１０個の共有結合された水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、２～６個の共有結合された水溶性ポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、共有結合されたポリマーの１つまたは複数は、リンカーを含む。いくつかの実施形態では、第３のポリマーなどの共有結合されたポリマーの１つまたは複数は、１つまたは複数のリンカーを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、１つまたは複数のリシンを含む。いくつかの実施形態では、リンカーはスペーサを含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、反応性官能基、またはアミドなどの官能基を含む。いくつかの実施形態では、リンカーは、式（ＩＶ）：
の構造を有し、式中、Ａ、Ｂ、Ｃ、およびＤは、それぞれ独立してポリマーである。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、式（Ｉ）：
の構造を有する１つまたは複数のＰＥＧ化リシンを含み、式中、ｎは４～３０から選択される整数である。いくつかの実施形態では、ｎは、４～６、４～８、４～１０、４～１５、４～２０、４～２５、４～３０、６～８、６～１０、６～１５、６～２０、６～２５、６～３０、８～１０、８～１５、８～２０、８～２５、８～３０、１０～１５、１０～２０、１０～２５、１０～３０、１５～２０、１５～２５、１５～３０、２０～２５、２０～３０、または２５～３０である。いくつかの実施形態では、ｎは、４、６、８、１０、１５、２０、２５、または３０である。いくつかの実施形態では、ｎは、最低４、６、８、１０、１５、２０、または２５である。いくつかの実施形態では、ｎは、最大６、８、１０、１５、２０、２５、または３０である。一態様では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、１または２個のアミノ酸残基にて共有結合される１または２個の水溶性ポリマーを含む。例えば、いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、表２に示されるような特徴と結合部位を有する１または２個の水溶性ポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに結合可能な水溶性ポリマーは、式（Ａ）：
の構造を含む。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに結合可能な水溶性ポリマーは、式（Ｂ）：
の構造を含む。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに結合可能な水溶性ポリマーは、式（Ｃ）：
の構造を含む。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに結合可能な水溶性ポリマーは、式（Ｄ）：
の構造を含む。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに結合可能な水溶性ポリマーは、式（Ｅ）：
の構造を含む。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、表３に示されるような構造と結合部位を有する１または２個の水溶性ポリマーを含む。
いくつかの実施形態では、残基６８または７０にて結合された水溶性ポリマーは、１つもしくは複数のリンカーおよび／またはスペーサを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のリンカーは、１つまたは複数のアミド基を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のリンカーは、１つまたは複数のリシンを含む。いくつかの実施形態では、残基６８または７０にて結合された水溶性ポリマーは、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）、またはそれらの組合せの構造を含む。いくつかの実施形態では、残基６８または７０にて結合された水溶性ポリマーは、式（Ａ）、式（Ｂ）、式（Ｃ）、式（Ｄ）、またはそれらの組合せの構造を含む。いくつかの実施形態では、残基６８または７０にて結合された水溶性ポリマーは、
の構造を含む。いくつかの実施形態では、残基６８または７０にて結合された水溶性ポリマーは、１つもしくは複数のリンカーおよび／またはスペーサを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のリンカーは、１つまたは複数のアミド基を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のリンカーは、１つまたは複数のリシンを含む。いくつかの実施形態では、残基６８にて結合された水溶性ポリマーは、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）、またはそれらの組合せの構造を含む。いくつかの実施形態では、残基７０にて結合された水溶性ポリマーは、式（Ａ）、式（Ｂ）、式（Ｃ）、式（Ｄ）、またはそれらの組合せの構造を含む。いくつかの実施形態では、残基６８または７０にて結合された水溶性ポリマーは、
の構造を含む。
いくつかの実施形態では、残基６８、６９、または７０にて結合された水溶性ポリマーは、１つもしくは複数のリンカーおよび／またはスペーサを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のリンカーは、１つまたは複数のアミド基を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のリンカーは、１つまたは複数のリシンを含む。いくつかの実施形態では、残基６８、６９、または７０にて結合された水溶性ポリマーは、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）、またはそれらの組合せの構造を含む。いくつかの実施形態では、残基６８、６９、または７０にて結合された水溶性ポリマーは、式（Ａ）、式（Ｂ）、式（Ｃ）、式（Ｄ）、またはそれらの組合せの構造を含む。いくつかの実施形態では、残基６８、６９、または７０にて結合された水溶性ポリマーは、
の構造を含む。いくつかの実施形態では、残基６８、６９、または７０にて結合された水溶性ポリマーは、１つもしくは複数のリンカーおよび／またはスペーサを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のリンカーは、１つまたは複数のアミド基を含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のリンカーは、１つまたは複数のリシンを含む。いくつかの実施形態では、残基６９にて結合された水溶性ポリマーは、式（ＩＩ）、式（ＩＩＩ）、式（ＩＶ）、またはそれらの組合せの構造を含む。いくつかの実施形態では、残基６９にて結合された水溶性ポリマーは、式（Ａ）、式（Ｂ）、式（Ｃ）、式（Ｄ）、またはそれらの組合せの構造を含む。
いくつかの実施形態では、ポリマーは、好適な前駆体物質から合成される。いくつかの実施形態では、ポリマーは、構造６、構造７、構造８、または構造９の前駆体物質から合成され、構造６は、
であり、構造７は、
であり、構造８は、
であり、構造９は、
である。
また本明細書には、複数の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団であって、複数の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ポリペプチドの残基にて結合された複数の水溶性ポリマーを含む、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団が記載される。いくつかの実施形態では、ポリペプチドの残基にて結合される複数の水溶性ポリマーの最低７５％、最低８０％、最低８５％、最低９０％、または最低９５％の分子量は、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化質量分光法（ＭＡＬＤＩ－ＭＳ）により判定したときに、結合された複数の水溶性ポリマーのピーク分子量の±１０％以内にある。いくつかの実施形態では、ポリペプチドに結合される複数の水溶性ポリマーの最大５０％、最大６０％、最大７５％、最大８０％、最大８５％、最大９０％、または最大９５％の分子量は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳにより判定したときに、ポリペプチドに結合される複数の水溶性ポリマーのピーク分子量の±１０％以内にある。いくつかの実施形態では、ポリペプチドに結合される複数の水溶性ポリマーにおける重量平均分子量と数平均分子量との比は、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのクロマトグラフィー、またはＭＡＬＤＩ－ＭＳなどの質量分析法により判定したときに、約１．０～約１．５、約１．０～約１．１、約１．０～約１．２、約１．０～約１．３、約１．０～約１．２５、約１．０５～約１．１、約１．０５～約１．２、約１．０５～約１．５、約１．１～約１．２、約１．１～約１．５、または約１．２～約１．５である。
いくつかの実施形態では、集団は、最低１μｇ、最低１０μｇ、または最低１ｍｇの修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、集団は、最低１００個、最低１０００個、または最低１０００個の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団における重量平均分子量と数平均分子量との比は、最大１．１である。
いくつかの実施形態では、複数のポリマーのそれぞれは、水溶性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、またはそれらの組合せを含む。いくつかの実施形態では、水溶性ポリマーは、ポリエチレングリコールを含む。
いくつかの実施形態では、複数のポリマーの重量平均分子量は、約２００Ｄａ～約５０，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、複数のポリマーの重量平均分子量は、約１０，０００Ｄａ～約３０，０００Ｄａである。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号２～５８に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号２～８３に対して少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、または約１００％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２または配列番号１８に対して少なくとも約８０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２に対して少なくとも約８０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２に対して少なくとも約９０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号２に対して少なくとも約９５％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号１８に対して少なくとも約８０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号１８に対して少なくとも約９０％同一である。いくつかの実施形態では、ポリペプチド配列は、配列番号１８に対して少なくとも約９５％同一である。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドに結合される複数の水溶性ポリマーにおける重量平均分子量と数平均分子量との比は、ＧＰＣやＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー、またはＭＡＬＤＩ－ＭＳなどの質量分析法により判定したときに、最低１．１、最低１．２、最低１．３、最低１．５、最低１．６，最低１．７，最低１．８、最低１．９、最低２．０、最低２．５、または最低３．０である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドに結合される複数の水溶性ポリマーの最低７５％、最低８０％、最低８５％、最低９０％、または最低９５％の分子量は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳにより判定したときに、ポリペプチドに結合される複数の水溶性ポリマーのピーク分子量の±１０％以内にある。いくつかの実施形態では、ポリペプチドに結合される複数の水溶性ポリマーの最大５０％、最大６０％、最大７５％、最大８０％、最大８５％、最大９０％、または最大９５％の分子量は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳにより判定したときに、ポリペプチドに結合される複数の水溶性ポリマーのピーク分子量の±１０％以内にある。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドに結合される複数の水溶性ポリマーにおける重量平均分子量と数平均分子量との比は、ＧＰＣやＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー、またはＭＡＬＤＩ－ＭＳなどの質量分析法により判定したときに、約１．０～約１．５、約１．０～約１．１、約１．０～約１．２、約１．０～約１．３、約１．０～約１．２５、約１．０５～約１．１、約１．０５～約１．２、約１．０５～約１．５、約１．１～約１．２、約１．１～約１．５、または約１．２～約１．５である。いくつかの実施形態では、ポリペプチドに結合される複数の水溶性ポリマーにおける重量平均分子量と数平均分子量との比は、ＧＰＣやＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー、またはＭＡＬＤＩ－ＭＳなどの質量分析法により判定したときに、最低１．１、最低１．２、最低１．３、最低１．５、最低１．６，最低１．７，最低１．８、最低１．９、最低２．０、最低２．５、または最低３．０である。
ＩＩＩｂ．単分散性
本明細書中の一態様では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団が記載される。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団は、単分散性である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団は、単分散性ポリマーを含む。いくつかの実施形態では、単分散性ポリマーは、Ｎ末端またはポリペプチドの残基に結合される。いくつかの実施形態では、単分散性ポリマーは、本開示の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に結合される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、それぞれ修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ポリマーは、単分散性ポリマーである。いくつかの実施形態では、ポリマーは、残基６８または７０に共有結合され、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、ポリマーは、残基６８、６９、または７０に共有結合され、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、ポリマーは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＮ末端領域に共有結合される。いくつかの実施形態では、ポリマーは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＮ末端に共有結合される。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団は、ＩＬ－２修飾ポリペプチドに共有結合された第２のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、第２のポリマーは、単分散性ポリマーである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合された第３のポリマーを含む。いくつかの実施形態では、第３のポリマーは、単分散性ポリマーである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団は、単分散性である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団における重量平均分子量と数平均分子量との比は、最大１．５、最大１．２、最大１．１、または最大１．０５である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団を含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団における重量平均分子量と数平均分子量との比は、１．０５～１．５である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団を含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団における重量平均分子量と数平均分子量との比は、約１．０～約１．５、約１．０～約１．１、約１．０～約１．２、約１．０～約１．３、約１．０～約１．４、約１．０５～約１．１、約１．０５～約１．２、約１．０５～約１．５、約１．１～約１．２、約１．１～約１．５、または約１．２～約１．５である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団を含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団における重量平均分子量と数平均分子量との比は、約１．０５、１．１、約１．２、または約１．５である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団を含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団における重量平均分子量と数平均分子量との比は、最低１．０５、１．１、または１．２である。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団を含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団における重量平均分子量と数平均分子量との比は、最大１．１、１．２、または１．５である。いくつかの実施形態では、比は、ゲル透過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）や高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などのクロマトグラフィーにより判定される。いくつかの実施形態では、比は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳやＥＳＩ－ＨＲＭＳなどの質量スペクトル分析により判定される。
本明細書に記載される修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％、最低８５％、最低９０％、最低９５％、または最低９９％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１０％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１０％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８５％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１０％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９０％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１０％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９５％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１０％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９９％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１０％以内にある。いくつかの実施形態では、質量スペクトル分析は、ＭＡＬＤＩ－質量分析法である。いくつかの実施形態では、質量スペクトル分析は、高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＭＳまたはＥＳＩ－ＨＲＭＳ）である。
本明細書に記載される修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％、最低８５％、最低９０％、最低９５％、または最低９９％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±５％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±５％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８５％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±５％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９０％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±５％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９５％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±５％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９９％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±５％以内にある。
本明細書に記載される修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％、最低８５％、最低９０％、最低９５％、または最低９９％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±２％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±２％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８５％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±２％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９０％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±２％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９５％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±２％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９９％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±２％以内にある。
本明細書に記載される修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％、最低８５％、最低９０％、最低９５％、または最低９９％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８５％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９０％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９５％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１％以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９９％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１％以内にある。
本明細書に記載される修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％、最低８５％、最低９０％、最低９５％、または最低９９％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１，０００ダルトン以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１，０００ダルトン以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８５％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１，０００ダルトン以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９０％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１，０００ダルトン以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９５％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１，０００ダルトン以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９９％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１，０００ダルトン以内にある。
本明細書に記載される修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％、最低８５％、最低９０％、最低９５％、または最低９９％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±５００ダルトン以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±５００ダルトン以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８５％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±５００ダルトン以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９０％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±５００ダルトン以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９５％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±５００ダルトン以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９９％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±５００ダルトン以内にある。
本明細書に記載される修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％、最低８５％、最低９０％、最低９５％、または最低９９％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１００ダルトン以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１００ダルトン以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８５％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１００ダルトン以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９０％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１００ダルトン以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９５％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１００ダルトン以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９９％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±１００ダルトン以内にある。
修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９０％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±２０Ｄａ、±１０Ｄａ、または±５Ｄａ以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９５％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±２０Ｄａ、±１０Ｄａ、または±５Ｄａ以内にある。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９９％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、ピーク分子量の±２０Ｄａ、±１０Ｄａ、または±５Ｄａ以内にある。いくつかの実施形態では、質量スペクトル分析は、ＭＡＬＤＩ－質量分析法である。いくつかの実施形態では、質量スペクトル分析は、ＥＳＩ－ＨＲＭＳである。
本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％、最低８５％、最低９０％、または最低９５％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときと同じ分子量である。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％の分子量は、質量スペクトルにより測定したときと同じ分子量である。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８５％の分子量は、質量スペクトルにより測定したときと同じ分子量である。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９０％の分子量は、質量スペクトルにより測定したときと同じ分子量である。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団のいくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低９５％の分子量は、質量スペクトルにより測定したときと同じ分子量である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団は、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、動的光散乱法、ＥＳＩ－ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ、または分析用超遠心法により精査したときに、１つの明らかな分子量で実質的に存在する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団は、例えばサイズ排除クロマトグラフィー、動的光散乱法、ＥＳＩ－ＭＳ、ＭＡＬＤＩ－ＭＳ、または分析用超遠心法により精査したときに、１つの明らかな分子量で最低約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、またはそれより多くが存在する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団は、サイズ排除クロマトグラフィーにより精査したときに、１つの明らかな分子量で実質的に存在する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団は、動的光散乱法により精査したときに、１つの明らかな分子量で実質的に存在する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳまたはＥＳＩ－ＭＳにより精査したときに、１つの明らかな分子量で実質的に存在する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団は、分析用超遠心法により精査したときに、１つの明らかな分子量で実質的に存在する。
本明細書中の一態様では、複数の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団であって、複数の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、複数のポリマー（すなわち、複数の第１のポリマー）を含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、それぞれ修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合される複数のポリマーを含む、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団が記載される。いくつかの実施形態では、複数のポリマーの最低９５％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、複数のポリマーのピーク分子量の±１０％以内にある。いくつかの実施形態では、複数のポリマーの最低７５％、最低８０％、最低８５％、最低９０％、または最低９５％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、複数のポリマーのピーク分子量の±１０％以内にある。いくつかの実施形態では、複数のポリマーの最低７５％、最低８０％、最低８５％、最低９０％、または最低９５％の分子量は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳにより判定したときに、複数のポリマーのピーク分子量の±５％以内にある。いくつかの実施形態では、複数のポリマーの最大５０％、最大６０％、最大７５％、最大８０％、最大８５％、最大９０％、または最大９５％は、質量スペクトル分析により判定したときに、複数のポリマーのピーク分子量の±１０％以内にあり、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％、最低８５％、最低９０％、最低９５％、または最低９９％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときにピーク分子量の±１０％以内にある。いくつかの実施形態では、複数のポリマーの最大５０％、最大６０％、最大７５％、最大８０％、最大８５％、最大９０％、または最大９５％は、質量スペクトル分析により判定したときに、複数のポリマーのピーク分子量の±５％以内にある。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％、最低８５％、最低９０％、最低９５％、または最低９９％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときにピーク分子量の±１％以内にある。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％、最低８５％、最低９０％、最低９５％、または最低９９％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときにピーク分子量の±０．５％以内にある。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団の最低８０％、最低８５％、最低９０％、最低９５％、または最低９９％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときにピーク分子量の±０．１％以内にある。いくつかの実施形態では、複数のポリマーにおける重量平均分子量と数平均分子量との比は、ＧＰＣやＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー、またはＭＡＬＤＩ－ＭＳなどの質量分析法により判定したときに、約１．０～約１．５、約１．０～約１．１、約１．０～約１．２、約１．０～約１．３、約１．０～約１．２５、約１．０５～約１．１、約１．０５～約１．２、約１．０５～約１．５、約１．１～約１．２、約１．１～約１．５、または約１．２～約１．５である。いくつかの実施形態では、複数のポリマーにおける重量平均分子量と数平均分子量との比は、ＧＰＣやＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー、またはＭＡＬＤＩ－ＭＳなどの質量分析法により判定したときに、最低１．１、最低１．２、最低１．３、最低１．５、最低１．６，最低１．７，最低１．８、最低１．９、最低２．０、最低２．５、または最低３．０である。
いくつかの実施形態では、ポリマーの重量平均分子量は、最低約１，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの重量平均分子量は、最低約３，０００Ｄａ、最低約６，０００Ｄａ、最低約１２，０００Ｄａ、または最低約２４，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの重量平均分子量は、最低約３，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの重量平均分子量は、最低約６，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの重量平均分子量は、最低約１２，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、ポリマーの重量平均分子量は、最低約２４，０００Ｄａである。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の複数の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、複数の第２のポリマーを含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、それぞれ修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合された複数の第２のポリマーのうち１つを含む。いくつかの実施形態では、複数の第２のポリマーの最低７５％、最低８０％、最低８５％、最低９０％、または最低９５％の分子量は、ＭＡＬＤＩ－ＭＳやＥＳＩ－ＭＳなどの質量スペクトル分析により判定したときに、複数の第２ポリマーのピーク分子量の±１０％以内にある。いくつかの実施形態では、複数の第２のポリマーの最低７５％、最低８０％、最低８５％、最低９０％、または最低９５％の分子量は、質量スペクトル分析により判定したときに、複数の第２のポリマーのピーク分子量の±５％以内にある。いくつかの実施形態では、複数の第２のポリマーの最大５０％、最大６０％、最大７５％、最大８０％、最大８５％、最大９０％、または最大９５％は、質量スペクトル分析により判定したときに、複数の第２のポリマーのピーク分子量の±１０％以内にある。いくつかの実施形態では、複数の第２のポリマーの最大５０％、最大６０％、最大７５％、最大８０％、最大８５％、最大９０％、または最大９５％は、質量スペクトル分析により判定したときに、複数の第２のポリマーのピーク分子量の±５％以内にある。いくつかの実施形態では、複数の第２のポリマーにおける重量平均分子量と数平均分子量との比は、ＧＰＣやＨＰＬＣなどのクロマトグラフィー、または質量スペクトル分析などの質量分析法により判定したときに、約１．０～約１．５、約１．０～約１．１、約１．０～約１．２、約１．０～約１．３、約１．０～約１．２５、約１．０５～約１．１、約１．０５～約１．２、約１．０５～約１．５、約１．１～約１．２、約１．１～約１．５、または約１．２～約１．５である。いくつかの実施形態では、複数の第２のポリマーにおける重量平均分子量と数平均分子量との比は、ＧＰＣやＨＰＬＣなどのクロマトグラフィーにより判定したときに、最低１．１、最低１．２、最低１．３、最低１．５、最低１．６，最低１．７，最低１．８、最低１．９、最低２．０、最低２．５、または最低３．０である。
いくつかの実施形態では、第２のポリマーの重量平均分子量は、最低約３，０００Ｄａ、最低約６，０００Ｄａ、最低約１２，０００Ｄａ、または最低約２４，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、第２のポリマーの重量平均分子量は、最低約３，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、第２のポリマーの重量平均分子量は、最低約６，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、第２のポリマーの重量平均分子量は、最低約１２，０００Ｄａである。いくつかの実施形態では、第２のポリマーの重量平均分子量は、最低約２４，０００Ｄａである。
いくつかの実施形態では、複数は、最低１００個、最低１，０００個、最低１０，０００個、最低１００，０００個、最低１，０００，０００個、最低１０，０００，０００個の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、最低１００個の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、最低１，０００個の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、最低１０，０００個の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、最低１００，０００個の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、最低１，０００，０００個の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、最低１０，０００，０００個の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、最低１００，０００，０００個の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、複数は、約１００個、約１，０００個、約１０，０００個、約１００，０００個、約１，０００，０００個、約１０，０００，０００個の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、約１００個の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、約１，０００個の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、約１０，０００個の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、約１００，０００個の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、約１，０００，０００個の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、約１０，０００，０００個の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、約１００，０００，０００個の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、複数は、最低１μｇ、最低１０μｇ、最低１００μｇ、最低１ｍｇ、最低１０ｍｇ、または最低１００ｍｇの修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、最低１μｇの修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、最低１０μｇの修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、最低１００μｇの修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、最低１ｍｇの修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、最低１０ｍｇの修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、約１００ｍｇの修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、複数は、約１μｇ、約１０μｇ、約１００μｇ、約１ｍｇ、約１０ｍｇ、または約１００ｍｇの修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、約１μｇの修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、約１０μｇの修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、約１００μｇの修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、約１ｍｇの修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、約１０ｍｇの修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、複数は、約１００ｍｇの修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、直鎖ポリペプチドである。いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、フォールディングされる。いくつかの実施形態では、修飾ポリペプチドは、１つまたは複数のジスルフィド結合を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、半減期延長のために共有結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、本開示の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、血漿半減期延長または血清半減期延長のために共有結合されたポリマーを含む。いくつかの実施形態では、本開示の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期は、野生型ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期の最低１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍である。いくつかの実施形態では、本開示の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期は、野生型ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期の１．５倍～１０倍である。いくつかの実施形態では、本開示の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期は、野生型ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期の１．５倍～２倍、１．５倍～４倍、１．５倍～６倍、１．５倍～８倍、１．５倍～１０倍、２倍～４倍、２倍～６倍、２倍～８倍、２倍～１０倍、４倍～６倍、４倍～８倍、４倍～１０倍、６倍～８倍、６倍～１０倍、または８倍～１０倍である。いくつかの実施形態では、本開示の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期は、野生型ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期の１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、または１０倍である。いくつかの実施形態では、本開示の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期は、最低１．５倍、２倍、４倍、６倍、または８倍である。いくつかの実施形態では、本開示の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期は、野生型ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期の最大２倍、４倍、６倍、８倍、または１０倍である。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期は、半減期を延長するポリマーを有していない修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期の最低１．５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、または１０倍である。いくつかの実施形態では、本開示の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期は、半減期を延長するポリマーを有していない修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期の１．５倍～１０倍である。いくつかの実施形態では、本開示の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期は、半減期を延長するポリマーを有していない修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期の１．５倍～２倍、１．５倍～４倍、１．５倍～６倍、１．５倍～８倍、１．５倍～１０倍、２倍～４倍、２倍～６倍、２倍～８倍、２倍～１０倍、４倍～６倍、４倍～８倍、４倍～１０倍、６倍～８倍、６倍～１０倍、または８倍～１０倍である。いくつかの実施形態では、本開示の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期は、半減期を延長するポリマーを有していない修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期の１．５倍、２倍、４倍、６倍、８倍、または１０倍である。いくつかの実施形態では、本開示の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期は、最低１．５倍、２倍、４倍、６倍、または８倍である。いくつかの実施形態では、本開示の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期は、半減期を延長するポリマーを有していない修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの血漿半減期または血清半減期の最大２倍、４倍、６倍、８倍、または１０倍である。
ＩＶ．医薬組成物
一態様では、本明細書には、医薬組成物であって、本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体または賦形剤とを含む医薬組成物が記載される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、複数の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、炭水化物、無機塩、抗酸化剤、界面活性剤、または緩衝液から選択される１つまたは複数の賦形剤をさらに含む。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、炭水化物をさらに含む。ある実施形態では、炭水化物は、フルクトース、マルトース、ガラクトース、グルコース、Ｄ－マンノース、ソルボース、ラクトース、スクロース、トレハロース、セロビオース、ラフィノース、メレジトース、マルトデキストリン、デキストラン、デンプン、マンニトール、キシリトール、マルチトール、ラクチトール、キシリトール、ソルビトール（グルシトール）、ピラノシルソルビトール、ミオイノシトール、シクロデキストリン、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は無機塩を含む。ある実施形態では、無機塩は、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、塩化カルシウム、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、硫酸ナトリウム、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
ある実施形態では、医薬組成物は、抗酸化剤を含む。ある実施形態では、抗酸化剤は、パルミチン酸アスコルビル、ブチル化ヒドロキシアニソール、ブチル化ヒドロキシトルエン、メタ重亜硫酸カリウム、没食子酸プロピル、メタ重亜硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、ビタミンＥ、３，４－ジヒドロキシ安息香酸、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
ある実施形態では、医薬組成物は、界面活性剤を含む。ある実施形態では、界面活性剤は、ポリソルベート、ソルビタンエステル、脂質、リン脂質、ホスファチジルエタノールアミン、脂肪酸、脂肪酸エステル、ステロイド、ＥＤＴＡ、亜鉛、およびそれらの組合せからなる群から選択される。
ある実施形態では、医薬組成物は、緩衝液を含む。ある実施形態では、緩衝液は、クエン酸、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸、エタノールアミン、ヒスチジン、アミノ酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、乳酸、トリス、ＨＥＰＥＳ、またはそれらの組合せからなる群から選択される。ある実施形態では、緩衝液は、クエン酸、リン酸ナトリウム、リン酸カリウム、酢酸、エタノールアミン、ヒスチジン、アミノ酸、酒石酸、コハク酸、フマル酸、乳酸、トリス、ＨＥＰＥＳ、ＣＨＡＰＳ、またはそれらの組合せからなる群から選択される。
いくつかの実施形態では、医薬組成物は、非経口投与または経腸投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、静脈内投与または皮下投与用に製剤化される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は凍結乾燥形態にある。
本明細書中の一態様では、記載された修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む液体組成物または凍結乾燥組成物が記載される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、凍結乾燥粉末である。いくつかの実施形態では、凍結乾燥粉末は、緩衝溶液中で再懸濁される。いくつかの実施形態では、緩衝溶液は、緩衝液、糖、塩、界面活性剤、またはそれらのあらゆる組合せを含む。いくつかの実施形態では、緩衝溶液は、リン酸塩を含む。いくつかの実施形態では、リン酸塩は、ナトリウムＮａ２ＨＰＯ４である。いくつかの実施形態では、塩は塩化ナトリウムである。いくつかの実施形態では、緩衝溶液は、リン酸緩衝生理食塩水を含む。いくつかの実施形態では、緩衝溶液は、マンニトールを含む。いくつかの実施形態では、凍結乾燥粉末は、５０ｍｇ／ｍＬのマンニトールとともにリン酸緩衝生理食塩水溶液（ｐＨ７．４）を含む溶液中で懸濁される。いくつかの実施形態では、医薬組成物は、対象への投与直前に再構成される凍結乾燥組成物である。
本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、様々な剤形とすることができる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、凍結乾燥粉末として投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、懸濁液として投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、溶液として投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ１８ポリペプチドは、注射用溶液として投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＶ溶液として投与される。
Ｖ．修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの合成
本明細書に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、組換えポリペプチドとして発現されるのではなく化学的に合成することができる。修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、完全長の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの１つまたは複数のフラグメントを合成し、これらフラグメントをまとめてライゲートし、ライゲートした完全長のポリペプチドをフォールディングすることにより、作製可能である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、アミノ酸配列中の少なくとも１つの突然変異、およびポリペプチドの残基Ｃ６８またはＫ７０にて共有結合されるＰＥＧポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、アミノ酸配列中の少なくとも１つの突然変異、およびポリペプチドの残基Ｃ６８、Ｅ６９、またはＫ７０に共有結合されるＰＥＧポリマーを含む。いくつかの実施形態では、ＰＥＧは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの６８位、６９位、または７０位にてシステイン残基に結合される。いくつかの実施形態では、ＰＥＧポリマーの分子量は、最低約１ｋＤａ、最低約２ｋＤａ、最低約５ｋＤａ、最低約１０ｋＤａ、最低約１５ｋＤａ、または最低約２０ｋＤａである。いくつかの実施形態では、ＰＥＧポリマーの分子量は、約１ｋＤａ、約２ｋＤａ、約５ｋＤａ、約１０ｋＤａ、約１５ｋＤａ、約２０ｋＤａ、約２５ｋＤａ、または約３０ｋＤａである。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、アミノ酸配列中の少なくとも１つの突然変異、およびポリペプチドの残基Ｃ６８またはＫ７０にて共有結合される約３０ｋＤａのＰＥＧポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、アミノ酸配列中の少なくとも１つの突然変異、およびポリペプチドの残基Ｃ６８、Ｅ６９、またはＫ７０に共有結合される約３０ｋＤａのＰＥＧポリマーを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、対象に投与されるとＩＦＮγ誘導を増強する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、対象に投与されるとＩＬ－１８ＢＰ中和に耐性を呈しつつＩＦＮγ誘導を増強する。
ＩＶ．宿主細胞
本明細書中の一態様では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドをする宿主細胞が記載される。
本明細書中の一態様では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを産生する方法であって、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを宿主細胞中で発現する工程を含む方法が記載される。
いくつかの実施形態では、宿主細胞は、原核細胞または真核細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、鳥類細胞、または昆虫細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、哺乳動物細胞、鳥類細胞、真菌細胞、または昆虫細胞である。いくつかの実施形態では、宿主細胞は、ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、または酵母菌細胞である。
ＶＩＩ．修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの生物活性
ＶＩＩａ．結合親和性
本明細書中の一態様では、ＩＬ－１８Ｒαに対する親和性がＩＬ－１８ＢＰに対する親和性よりも高い修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが記載される。いくつかの実施形態では、ＩＬ－１８Ｒα、ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体、またはＩＬ－１８ＢＰに対する親和性は、解離定数（ＫＤ）により測定される。本明細書で使用するとき、「修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＲαのＫＤ」という句は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドとＩＬ－１８Ｒαとの結合相互作用の解離定数を意味する。「修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８Ｒα／βのＫＤ」という句は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドとＩＬ－１８Ｒα／βとの結合相互作用の解離定数を意味する。同様に、「修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤ」という句は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドとＩＬ－１８ＢＰとの結合相互作用の解離定数を意味する。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＫＤにより測定したときに、ＩＬ－１８受容体（ＩＬ－１８Ｒ）に対する親和性がＩＬ－１８結合タンパク質（ＩＬ－１８ＢＰ）に対する親和性よりも高く、［ＫＤＩＬ－１８Ｒ］／［ＫＤＩＬ－１８ＢＰ］は１未満である。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＫＤにより測定したとき、ＩＬ－１８受容体αサブユニット（ＩＬ－１８Ｒα）に対する親和性がＩＬ－１８結合タンパク質（ＩＬ－１８ＢＰ）に対する親和性よりも１０倍未満低いか、５倍未満低いか、またはそれよりも高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＫＤにより測定したとき、ＩＬ－１８受容体αサブユニット（ＩＬ－１８Ｒα）に対する親和性がＩＬ－１８結合タンパク質（ＩＬ－１８ＢＰ）に対する親和性よりも１０倍未満低い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＫＤにより測定したとき、ＩＬ－１８受容体αサブユニット（ＩＬ－１８Ｒα）に対する親和性がＩＬ－１８結合タンパク質（ＩＬ－１８ＢＰ）に対する親和性よりも５倍未満低い。いくつかの実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定される（例えば実施例８、実施例１０、実施例１２を参照）。いくつかの実施形態では、ＫＤは、ａｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにより判定される（例えば実施例９を参照）。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＫＤにより測定したとき、ＩＬ－１８受容体αサブユニット（ＩＬ－１８Ｒα）に対する親和性がＩＬ－１８結合タンパク質（ＩＬ－１８ＢＰ）に対する親和性よりも１０倍未満低いか、５倍未満低いか、またはそれより高く、［ＫＤＩＬ－１８Ｒα］／［ＫＤＩＬ－１８ＢＰ］は０．１を超える。いくつかの実施形態では、［ＫＤＩＬ－１８Ｒα］／［ＫＤＩＬ－１８ＢＰ］は、約０．１、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、または１を超える。いくつかの実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定される（例えば実施例８、実施例１０、実施例１２を参照）。いくつかの実施形態では、ＫＤは、ａｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにより判定される（例えば実施例９を参照）。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８受容体α（ＩＬ－１８Ｒα）に結合する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒαに結合する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、約２００ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒαに結合する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、約１００ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒαに結合する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、約５０ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒαに結合する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、約１０ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒαに結合する。いくつかの実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定される（例えば実施例８と実施例１０を参照）。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８受容体α／β（ＩＬ－１８Ｒα／β）ヘテロ二量体に結合する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、約１００ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体に結合する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、約５００ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体に結合する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、約２０ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体に結合する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、約１０ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体に結合する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、約５ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体に結合する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、約２ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体に結合する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号１のＩＬ－１８ポリペプチドと同様のＫＤをもってＩＬ－１８α／βに結合する。いくつかの実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定される（例えば実施例８と実施例１１を参照）。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＲαのＫＤは、１，０００ｎＭ未満、７５０ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、４５０ｎＭ未満、４００ｎＭ未満、３５０ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、２５０ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１５０ｎＭ未満、１４０ｎＭ未満、１３０ｎＭ未満、１２５ｎＭ未満、１２０ｎＭ未満、１００ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＲαのＫＤは、１５０ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、または１０ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＲαのＫＤは、５０ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＲαのＫＤは、１０ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定される（例えば実施例８と実施例１０を参照）。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体のＫＤは、１，０００ｎＭ未満、７５０ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、４５０ｎＭ未満、４００ｎＭ未満、３５０ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、２５０ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１５０ｎＭ未満、１４０ｎＭ未満、１３０ｎＭ未満、１２５ｎＭ未満、１２０ｎＭ未満、１００ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体のＫＤは、１５０ｎＭ未満、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１０ｎＭ未満、５ｎＭ未満、または２ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体のＫＤは、５０ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体のＫＤは、１０ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体のＫＤは、５ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定される（例えば実施例８と実施例１１を参照）。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤは、１，０００ｎＭ未満、７５０ｎＭ未満、５００ｎＭ未満、４５０ｎＭ未満、４００ｎＭ未満、３５０ｎＭ未満、３００ｎＭ未満、２５０ｎＭ未満、２００ｎＭ未満、１５０ｎＭ未満、１４０ｎＭ未満、１３０ｎＭ未満、１２５ｎＭ未満、１２０ｎＭ未満、１００ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤは、５０ｎＭ未満、２５ｎＭ未満、１ｎＭ未満、または０．５ｎＭ未満である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤは、約１０ｎＭである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤは、約２．５ｎＭである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤは、約１ｎＭである。いくつかの実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定される（例えば実施例８と実施例１２を参照）。いくつかの実施形態では、ＫＤは、ａｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにより判定される（例えば実施例９を参照）。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＲαのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＲαのＫＤと実質的に同じである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＲαのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＲαのＫＤより高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＲαのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＲαのＫＤより低い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＲαのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＲαのＫＤより最大１０％、最大２０％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、最大７０％、最大８０％、最大８５％、または最大９０％高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＲαのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＲαのＫＤより最低２０％高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＲαのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＲαのＫＤより最低２５％高い。いくつかの実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定される（例えば実施例８と実施例１０を参照）。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＲαのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＲαのＫＤより最大１００％、最大２００％、最大３００％、最大４００％、最大５００％、または最大６００％高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＲαのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＲαのＫＤより最大５００％高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＲαのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＲαのＫＤより約５００％高い。いくつかの実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定される（例えば実施例８と実施例１０を参照）。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体のＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８Ｒα／βのＫＤと実質的に同じである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体のＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体のＫＤより高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体のＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体のＫＤより最大１０％、最大２０％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、最大７０％、最大８０％、または最大９０％高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体のＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体のＫＤより最大２５％高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体のＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体のＫＤより約２５％高い。いくつかの実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定される（例えば実施例８と実施例１１を参照）。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体のＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体のＫＤより最大１００％、最大２００％、最大３００％、最大４００％、最大５００％、または高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体のＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体のＫＤより最大３５０％高い。いくつかの実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定される（例えば実施例８と実施例１１を参照）。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤと実質的に同じである。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤより高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤより最低１０％、最低２０％、最低３０％、最低４０％、最低５０％、最低６０％、最低７０％、最低８０％、または最低９０％高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤより最低２５％高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤより約２５％高い。いくつかの実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定される（例えば実施例８と実施例１２を参照）。いくつかの実施形態では、ＫＤは、ａｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにより判定される（例えば実施例９を参照）。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤより高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤより最低２倍、３倍、５倍、１０倍、１５倍、２０倍、３０倍、４０倍、または５０倍高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤより最低５倍高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤより最低３０倍高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤより約８倍高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤより約３５倍高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤは、野生型ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＢＰのＫＤより約４０倍高い。いくつかの実施形態では、ＫＤは、表面プラズモン共鳴アッセイにより判定される（例えば実施例８と実施例１２を参照）。いくつかの実施形態では、ＫＤは、ａｌｐｈａＬＩＳＡアッセイにより判定される（例えば実施例９を参照）。
ＶＩＩｂ．半数有効濃度（ＥＣ５０）
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＦＮ・産生を調節する。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドによるＩＦＮγ誘導能のＥＣ５０（ｎＭ）は、配列番号１のＩＬ－１８のＥＣ５０（ｎＭ）より１０倍未満高いか、５倍未満高いか、またはそれよりも低い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドによるＩＦＮγ誘導能のＥＣ５０は、配列番号１のＩＬ－１８のＥＣ５０（ｎＭ）より１０倍未満高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドによるＩＦＮγ誘導能のＥＣ５０は、配列番号１のＩＬ－１８のＥＣ５０（ｎＭ）より５倍未満高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドによるＩＦＮγ誘導能のＥＣ５０は、配列番号１のＩＬ－１８のＥＣ５０（ｎＭ）より低い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドによるＩＦＮγ誘導能のＥＣ５０は、配列番号１のＩＬ－１８のＥＣ５０（ｎＭ）より１０倍未満、８倍未満、６倍未満、５倍未満、４倍未満、３倍未満、または２倍未満高い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドによるＩＦＮγ誘導能のＥＣ５０は、ＩＦＮγ誘導細胞アッセイにより測定される（例えば実施例１３を参照）。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドはＩＦＮγ産生を調節し、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＩＦＮγに対するＥＣ５０（ｎＭ）は、配列番号１のＩＬ－１８ポリペプチドのＥＣ５０（ｎＭ）未満である。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＩＦＮγに対するＥＣ５０（ｎＭ）は、配列番号１のＩＬ－１８ポリペプチドのＥＣ５０（ｎＭ）よりも少なくとも１０倍低い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＩＦＮγに対するＥＣ５０（ｎＭ）は、配列番号１のＩＬ－１８ポリペプチドのＥＣ５０（ｎＭ）よりも約１０倍低い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＩＦＮγに対するＥＣ５０（ｎＭ）は、配列番号１のｎＩＬ－１８ポリペプチドのＥＣ５０（ｎＭ）よりも約１５倍低い。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドによるＩＦＮγ誘導能のＥＣ５０は、ＩＦＮγ誘導細胞アッセイにより測定される（例えば実施例１３を参照）。
ＸＶＩＩ．処置方法
本明細書中の一態様では、癌の処置を必要とする対象の癌を処置する方法であって、本明細書に記載される修飾ＩＬ－１８ポリペプチドまたは医薬組成物を有効量で対象に投与する工程を含む方法が記載される。
本明細書中の別の態様では、癌の処置を必要とする対象の癌を処置するのに使用される、本明細書で提供される修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが記載される。本明細書中の別の態様では、癌の処置を必要とする対象の癌を処置するための薬剤の製造のための、本明細書で提供される修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが記載される。
いくつかの実施形態では、癌は固形癌である。いくつかの実施形態では、固形癌は、腎臓癌、皮膚癌、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、大腸癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、または前立腺癌である。いくつかの実施形態では、固形癌は、転移性腎細胞癌（転移性ＲＣＣ）または黒色腫である。いくつかの実施形態では、癌は固形癌である。いくつかの実施形態では、固形癌は、癌腫または肉腫である。
いくつかの実施形態では、癌は液体癌（ｌｉｑｕｉｄ ｃａｎｃｅｒ）である。いくつかの実施形態では、癌は血液癌である。いくつかの実施形態では、液体癌は、骨髄腫または白血病である。いくつかの実施形態では、液体癌は、白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、または多発性骨髄腫である。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの有効量の単回用量で投与され、（ｉ）修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが１日１回投与されるか、または（ｉｉ）修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが１日にわたり対象に複数回投与される、さらなる実施形態が含まれる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、毎日、隔日、週３回、週１回、２週間毎、３週間毎、４週間毎、５週間毎、３日毎、４日毎、５日毎、６日毎、隔週、週３回、週４回、週５回、週６回、月１回、月２回、月３回、２か月に１回、３か月に１回、４か月に１回、５か月に１回、または６か月に１回投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、毎日投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、隔日で投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、隔日で投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、週３回投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、週１回投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、２週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、３週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、４週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、５週間毎に投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、３日毎に投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、４日毎に投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、５日毎に投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、６日毎に投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、隔週で投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、週３回投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、週４回投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、週５回投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、週６回投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、月１回投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、月２回投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、月３回投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、２か月に１回に投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、３か月に１回に投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、４か月に１回に投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、５か月に１回に投与される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、６か月に１回に投与される。
いくつかの実施形態では、対象は、５～７５歳である。いくつかの実施形態では、対象は、５～１０歳、５～１５歳、５～１８歳、５～２５歳、５～３５歳、５～４５歳、５～５５歳、５～６５歳、５～７５歳、１０～１５歳、１０～１８歳、１０～２５歳、１０～３５歳、１０～４５歳、１０～５５歳、１０～６５歳、１０～７５歳、１５～１８歳、１５～２５歳、１５～３５歳、１５～４５歳、１５～５５歳、１５～６５歳、１５～７５歳、１８～２５歳、１８～３５歳、１８～４５歳、１８～５５歳、１８～６５歳、１８～７５歳、２５～３５歳、２５～４５歳、２５～５５歳、２５～６５歳、２５～７５歳、３５～４５歳、３５～５５歳、３５～６５歳、３５～７５歳、４５～５５歳、４５～６５歳、４５～７５歳、５５～６５歳、５５～７５歳、または６５～７５歳である。いくつかの実施形態では、対象は、最低５、１０、１５、１８、２５、３５、４５、５５、または６５歳である。いくつかの実施形態では、対象は、最高１０、１５、１８、２５、３５、４５、５５、６５、または７５歳である。
いくつかの実施形態では、上記方法は、凍結乾燥形態にある修飾ＩＬ－１８ポリペプチドまたは医薬組成物を再構成する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドまたは医薬組成物は、投与前に再構成される。いくつかの実施形態では、組成物は、投与直前、投与の最大約５分前、投与の最大約２０分前、投与の最大約４０分前、投与の最大約１時間前、または投与の最大約４時間前に再構成される。
ＩＸ．製造（合成）方法
また本明細書には、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを合成する方法も提供される。場合により、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、組換え発現ではなく化学的に合成される。いくつかの例では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのいくつかのフラグメントペプチド前駆体が合成され、後に好適なライゲーション法（例えば、アルファ－ケトヒドロキシルアミン（ＫＡＨＡ）ライゲーション）を用いて一体的にライゲートされる。場合により、ライゲーション後に生じる修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、組換えまたは野生型ＩＬ－１８ポリペプチドのものと実質的に同一の二次構造と三次構造を有する修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを産生するためにフォールディングされる。
いくつかの例では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのメチオニン残基は、安定性を目的として、かつ最終の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを産生するべく直鎖修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのフォールディングを補助するために置換される。メチオニンの側鎖は合成プロセス（例えば、ペプチド合成およびタンパク質フォールディング）中に酸化する傾向があり、その結果、場合により均一性を欠くことで特定の使用に対して品質が不十分の最終ＩＬ－１８ポリペプチドが生じる。
場合により、これらの制限に対処するために、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのメチオニン残基すべてがノルロイシン残基と置き換えられた。場合により、直鎖ペプチドの合成は成功したが、おそらく修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの二次／三次構造が野生型または組換えＩＬ－１８と比して改質されたことによるミスフォールディングが原因で、疎水性の増加や沈殿傾向（ｐｒｏｐｅｎｓｉｔｙ ｔｏ ｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｅ）などの不安定性、および生物活性の低下の徴候が認められた。
場合により、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、部分的なメチオニン酸化の複合混合物を生じさせることなく均一な直鎖タンパク質を作製しようとして、前駆体ペプチドの合成中に酸化したメチオニンを直接組み込むために合成された。場合により、修飾直鎖ＩＬ－１８ポリペプチドの合成は成功したが、メチオニンを非酸化形態へと還元するのに困難が生じた。
これらの難題に対処するために、メチオニン残基をＯ－メチル－Ｌ－ホモセリン（Ｏｍｈ）残基に置き換えた新たな修飾ＩＬ－１８ポリペプチド変異体をデザインした。Ｏｍｈは、メチオニンの硫黄原子が酸素と置き換えられた天然メチオニンの構造的類似体である。硫黄原子を欠いているため、Ｏｍｈ残基が酸化する傾向は少なくなるため、安定性がさらに高く、合成／精製が容易な修飾ＩＬ－１８ポリペプチドをもたらすことが予測される。加えて、Ｏｍｈ残基の親水性はノルロイシン残基に比して増加しているとともに、Ｏｍｈの生来のメチオニン残基に対する構造的相同性が高くなっていることから、メチオニンの代わりにノルロイシン残基を有する変異体と比較して適切で安定性が高い、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのフォールディングを容易にすると予測される。このため、メチオニン残基をＯｍｈ残基と置き換える化学的に合成された修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、他に合成された修飾ＩＬ－１８ポリペプチドより優れた利点をいくつか提供すると予測される。
本明細書中の一態様では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを作製する方法が記載される。本明細書中の別の態様では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを作製する方法であって、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの２つ以上のフラグメントを合成する工程と、フラグメントをライゲートする工程とを含む方法が記載される。本明細書中の別の態様では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを作製する方法であって、ａ．修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの２つ以上のフラグメントを合成する工程と、ｂ．フラグメントをライゲートする工程と、ｃ．ライゲートされたフラグメントをフォールディングする工程とを含む方法が、記載される。本明細書中の別の態様では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを作製する方法であって、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの２つ以上のフラグメントを提供する工程と、フラグメントをライゲートする工程とを含む方法が記載される。本明細書中の別の態様では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを作製する方法であって、ａ．修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの２つ以上のフラグメントを提供する工程と、ｂ．フラグメントをライゲートする工程と、ｃ．ライゲートされたフラグメントをフォールディングする工程とを含む方法が、記載される。本明細書中の別の態様では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを作製する方法であって、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの２つ以上のフラグメントをライゲートする工程であって、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの２つ以上のフラグメントの少なくとも１つは合成される、工程と、ライゲートされたフラグメントをフォールディングする工程とを含む方法が、記載される。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの２つ以上のフラグメントは、化学的に合成される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの２つ以上のフラグメントは、固相ペプチド合成により合成される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの２つ以上のフラグメントは、自動ペプチド合成機で合成される。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、またはそれより多くのペプチドフラグメントである。いくつかの実施形態では、修飾ペプチドは、２個のペプチドフラグメントからライゲートされる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、３個のペプチドフラグメントからライゲートされる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、４個のペプチドフラグメントからライゲートされる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、２～１０個のペプチドフラグメントからライゲートされる。
いくつかの実施形態では、２つ以上のフラグメントは、Ｎ末端フラグメント、Ｃ末端フラグメント、および任意選択で１つまたは複数の内部フラグメントを含み、Ｎ末端フラグメントは修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＮ末端を含み、Ｃ末端フラグメントは修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＣ末端を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端フラグメントおよび１つまたは複数の内部フラグメントのそれぞれが、各フラグメントのＣ末端残基としてアルファ－ケトアミノ酸を含む。いくつかの実施形態では、各アルファ－ケトアミノ酸は、アルファ－ケト－フェニルアラニン、アルファ－ケト－チロシン、アルファ－ケト－バリン、アルファ－ケト－ロイシン、アルファ－ケト－イソロイシン、アルファ－ケト－ノルロイシン、およびアルファ－ケト－Ｏ－メチルホモセリンから選択される。
いくつかの実施形態では、Ｃ末端フラグメントおよび１つまたは複数の内部フラグメントのそれぞれが、各フラグメントのＮ末端残基として、ヒドロキシルアミンまたは環状ヒドロキシルアミン機能を有する残基を含む。いくつかの実施形態では、ヒドロキシルアミンまたは環状ヒドロキシルアミン機能を有する残基はそれぞれ５－オキサプロリン残基である。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの２つ以上のフラグメントは、一体的にライゲートされる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの３つ以上のフラグメントは、連続的にライゲートされる。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの３つ以上のフラグメントは、ワンポット反応においてライゲートされる。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの２つ以上のフラグメントを合成することは、４つのフラグメントを合成することを含む。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの２つ以上のフラグメントを提供することは、４つのフラグメントを提供することを含む。いくつかの実施形態では、４つのフラグメントは、表１３に提供されるものから独立に選択されるいずれかの配列に対して少なくとも約８０％の配列同一性をそれぞれが有する４つのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、４つのフラグメントは、表１３に提供されるものに対して少なくとも約８５％の配列同一性を有する４つのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、４つのフラグメントは、表１３に提供されるものに対して少なくとも約９０％の配列同一性を有する４つのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、４つのフラグメントは、表１３に提供されるものに対して少なくとも約９５％の配列同一性を有する４つのフラグメントを含む。いくつかの実施形態では、４つのフラグメントは、表１３に提供される４つのフラグメントを含む。
いくつかの実施形態では、４つのフラグメントは、Ｎ末端フラグメント、第１の内部フラグメント、第２の内部フラグメント、およびＣ末端フラグメントを含む。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端フラグメントは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸１～３０に対応する残基を含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、Ｎ末端フラグメントは、配列番号１の配列と比較してＮ末端伸長部を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端フラグメントは、配列番号２０１に明記されるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｎ末端フラグメントは、配列番号２０１～２０９のいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の内部フラグメントは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸３１～６２に対応する残基を含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、第１の内部フラグメントは、配列番号２１０に明記されるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の内部フラグメントは、配列番号２１０～２１７のいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第２の内部フラグメントは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸６３～１１５に対応する残基を含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、第２の内部フラグメントは、配列番号２２７に明記されるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の内部フラグメントは、配列番号２２７～２３６のいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第１の内部フラグメントは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸３１～７４に対応する残基を含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、第１の内部フラグメントは、配列番号２１８に明記されるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第１の内部フラグメントは、配列番号２１８～２２６のいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、第２の内部フラグメントは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸７５～１１５に対応する残基を含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、第２の内部フラグメントは、配列番号２３７に明記されるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、第２の内部フラグメントは、配列番号２３７～２４２のいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｃ末端フラグメントは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸１１６～１５７に対応する残基を含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく。いくつかの実施形態では、Ｃ末端フラグメントは、配列番号２４３に明記されるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、Ｃ末端フラグメントは、配列番号２４３～２４８のいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む。
いくつかの実施形態では、Ｎ末端フラグメント、第１の内部フラグメント、第２の内部フラグメント、およびＣ末端フラグメントは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド中のそれぞれＮ末端からＣ末端まで配される。
いくつかの実施形態では、上記方法は、ライゲートされたフラグメントを再配置する工程をさらに含む。いくつかの実施形態では、ライゲートされたフラグメントを再配置する工程は、直鎖ＩＬ－１８ポリペプチドの１つまたは複数のデプシペプチド結合を再配置することを含む。いくつかの実施形態では、１つまたは複数のデプシペプチド結合は、１または複数のアミド結合を形成するために再配置される。いくつかの実施形態では、デプシペプチド結合は、フラグメントのライゲーションの結果として生じる。いくつかの実施形態では、デプシペプチド結合は、ホモセリン残基のヒドロキシル部分とホモセリン残基に隣接するアミノ酸と間にある。いくつかの実施形態では、ライゲートされたフラグメントを再配置する工程は、フラグメントのそれぞれがライゲートされた後に行われる。
いくつかの実施形態では、ライゲートされたフラグメントは、フォールディングされる。いくつかの実施形態では、フォールディングは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド内に１つまたは複数のジスルフィド結合を形成することを含む。いくつかの実施形態では、ライゲートされたフラグメントは、フォールディングプロセスにかけられる。いくつかの実施形態では、ライゲートされたフラグメントは、当該技術分野で周知の方法を用いてフォールディングされる。いくつかの実施形態では、ライゲートされたポリペプチドまたはフォールディングされたポリペプチドは、それに１つまたは複数のポリマーを結合させることによりさらに修飾される。いくつかの実施形態では、ライゲートされたポリペプチドまたはフォールディングされたポリペプチドは、ＰＥＧ化によりさらに修飾される。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、合成である。
本明細書で提供される特定の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの例示的で非限定的な合成スキームを、図５および図９～図１７に示す。概して、いくつかの実施形態では、配列番号１に明記されるアミノ酸配列と比較して、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基番号１～３０に対応するアミノ酸またはアミノ酸前駆体を含有する第１のフラグメント（「セグメント１」）が調製される（例えば、固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）により）。これは、いくつかの実施形態では単一フラグメント（「セグメント１２」）をもたらすために修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基番号３１～７４または残基番号３１～６２のいずれかに対応するアミノ酸またはアミノ前駆体を含有する第２のフラグメント（「セグメント２」）に結合される。この第２のフラグメントは、いくつかの実施形態ではＳＰＰＳによっても調製される。同様に、いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基番号６３～１１５または７５～１１５のいずれかに対応するアミノ酸またはアミノ酸前駆体を有する第３のフラグメントが、ＳＰＰＳにより調製される。この第３のフラグメントは、いくつかの実施形態ではＳＰＰＳにより調製されるとともに、単一フラグメント（「セグメント３４」）をもたらすために修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基番号１１６～１５７に対応するアミノ酸またはアミノ酸前駆体を含有する、第４のフラグメント（「セグメント４」）に結合される。その後、セグメント１２とセグメント３４が結合されると、完全長のフラグメント（「セグメント１２３４」）が得られる。フラグメントをライゲートするためにＫＡＨＡライゲーションが使用される実施形態では、部位残基は後にライゲーション点にてアミド結合をもたらすために再配列される（例えば、アミド結合へのデプシペプチドホモセリン再配列）。最終的に、完全長の線形フラグメントがフォールディングされて、合成ＩＬ－１８ポリペプチドが得られる。
図５は、配列番号２６に明記されるアミノ酸配列を有する修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの合成に関する例示的な合成スキームを示す図である。この修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、フラグメント２の合成においてＰＥＧリンカーを介して残基Ｋ７０に付随するアジド官能性を組み込む。このアジド官能性は、より大きなＰＥＧを結合させるコンジュゲーションハンドルとして作用する。
図９は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの合成に関する例示的な合成スキームを示す図である。この図で描かれる合成は、図５と同様に、アジドを有するＰＥＧリシン残基を７０位にて組み込む。
図１０は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの合成に関するさらに例示的な合成スキームを示す図である。修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号２５に明記されるアミノ酸配列を有する。描かれるＩＬ－１８ポリペプチドはシステイン残基を含有しておらず、コンジュゲーションハンドルを組み込むように修飾されていないため、本明細書で提供される技法を用いて部位特異的なＰＥＧ化を行うことができない。
図１１は、配列番号３１に明記されるアミノ酸配列を有する修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの合成に関する例示的な合成スキームを示す図である。図５、図９、図１０に明記される合成と比較して、修飾ＩＬ－１８は、７４／７５位ではなく６２／６３位にてライゲートされる。
図１２は、配列番号３２に明記されるアミノ酸配列を有する修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの合成に関する例示的な合成スキームを示す図である。修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、アジド官能性を有する修飾リシン残基を含む。
図１３は、配列番号３３に明記されるアミノ酸配列を有する修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの合成に関する例示的な合成スキームを示す図である。描かれるＩＬ－１８ポリペプチドはシステイン残基を含有しておらず、コンジュゲーションハンドルを組み込むように修飾されていないため、本明細書で提供される技法を用いて部位特異的なＰＥＧ化を行うことができない。
図１４は、配列番号３４に明記されるアミノ酸配列を有する修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの合成に関する例示的な合成スキームを示す図である。修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、アジド官能性を有する修飾リシン残基を含む。
図１５は、ＰＥＧを介してアジド部分が結合される修飾アスパルテート残基を含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの合成に関する例示的な合成スキームを示す図である。修飾アスパルテート残基は、あらゆる所望の位置（例えば、残基６８、６９、または７０）に配することができる。
図１６は、ＰＥＧを介してアジド部分が結合される修飾グルタメート残基を含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの合成に関する例示的な合成スキームを示す図である。修飾グルタメート残基は、あらゆる所望の位置（例えば、残基６８、６９、または７０）に配することができる。
図１７は、セグメント３上のアミノ酸残基（例えば、、残基６８、６９、または７０）に付随するアジド基を含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの調製に使用される一般的な合成スキームを示す図である。示されるＲ基は、システイン、リシン、アスパルテート、およびグルタメートを含む様々な修飾残基を介してアジド官能性を結合できることを示している。
いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、組換えポリペプチドとして発現される。いくつかの実施形態では、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、大腸菌を用いて発現される。
本開示とその利点が詳細に記述されてきたが、添付の特許請求の範囲に定義されるような本開示の趣旨と範囲から逸脱することなく、様々な変更、置換え、および改変を本開示中で行うことができることを理解されたい。
Ｘ．合成ＩＬ－１８
本明細書にはまた、化学合成されたＩＬ－１８が提供される。いくつかの実施形態では、化学合成されたＩＬ－１８は、配列番号１の組換えＩＬ－１８と実質的に同一の生物活性を呈する。いくつかの実施形態では、化学合成されたＩＬ－１８は、本明細書で提供される修飾を含有する。いくつかの実施形態では、本明細書で提供される修飾は、本明細書で提供される修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの生物活性を調節する。
化学合成されたＩＬ－１８は、部位特異的に容易となるいずれかの所望の修飾を含むように合成できることから組換えＩＬ－１８より優れた利点をもたらし、生物活性の容易な調節が可能となる。
本明細書中の一態様では、残基２１～４１、残基６０～８０、および残基１０６～１２６の領域から選択される位置にホモセリン（Ｈｓｅ）残基を含む合成ＩＬ－１８ポリペプチドを含む合成ＩＬ－１８ポリペプチドであって、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく、合成ＩＬ－１８ポリペプチドが提供される。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、残基２１～４１、残基６０～８０、および残基１０６～１２６の領域のそれぞれにＨｓｅ残基を含む。
いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、３１位にＨｓｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、６３位または７５位にＨｓｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、６３位にＨｓｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、７５位にＨｓｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、１１６位にＨｓｅ残基を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、３１位、１１６位、および６３位と７５位の少なくとも１つにＨｓｅ残基を含む。
いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号１に少なくとも１つのメチオニン残基のアミノ酸置換を含む。いくつかの実施形態では、配列番号１における少なくとも１つのメチオニン残基のアミノ酸置換は、Ｍ３３、Ｍ５１、Ｍ６０、Ｍ８６、Ｍ１１３、またはＭ１５０に置換を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、少なくとも３つのメチオニン残基の置換を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、少なくとも５つのメチオニン残基の置換を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、少なくとも６つのメチオニン残基の置換を含む。
いくつかの実施形態では、少なくとも１つのメチオニン残基が、Ｏ－メチル－ホモセリン（Ｏｍｈ）残基に置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも３つのメチオニン残基が、Ｏｍｈ残基に置換される。いくつかの実施形態では、少なくとも５つのメチオニン残基が、Ｏｍｈ残基に置換される。いくつかの実施形態では、各メチオニン置換は、ノルロイシンまたはＯｍｈ残基に対するものである。いくつかの実施形態では、各メチオニン置換はＯｍｈ残基に対するものである。いくつかの実施形態では、配列番号１の各メチオニン残基は、Ｏｍｈ残基に置換される。
いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号１に対するさらなる突然変異を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列を含む。いくつかの実施形態では、合成ＩＬ－１８ポリペプチドは、合成ＩＬ－１８ポリペプチドの残基に共有結合されるポリマーを含む。
本開示は、さらに以下の実施例で例示されるが、この実施例は単に例示目的のために提供されるものであり、いかなる方法でも本開示を制限するようには意図されていない。
実施例１ － 修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの合成
固相ペプチド合成（ＳＰＰＳ）を用いて合成した個々のペプチドをライゲートすることにより、配列番号７のアミノ酸配列を有する修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを合成した。個々のペプチドは、後述の方法を用いて自動ペプチド合成機で合成した。
市販の試薬をＳｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ、Ａｃｒｏｓ、Ｍｅｒｃｋ、またはＴＣＩ Ｅｕｒｏｐｅから購入し、さらに精製を行うことなく使用した。固相ペプチド合成に適した側鎖保護基を有するフルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）アミノ酸をＮｏｖａｂｉｏｃｈｅｍ、Ｃｈｒｉｓｔｏｆ Ｓｅｎｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＡＧ、またはＰｅｐｔＡＲＴから購入し、そのまま使用した。ペプチド合成に使用したポリエチレングリコール誘導体は、Ｐｏｌｙｐｕｒｅから購入した。Ｓｉｇｍａ ＡｌｄｒｉｃｈのＨＰＬＣグレードのＣＨ３ＣＮを、分析および分取ＨＰＬＣ精製に使用した。
４－ヒドロキシ－α－シアノケイ皮酸（ＨＣＣＡ）をマトリックスとして使用して、二重ＥＳＩ／ＭＡＬＤＩ－ＦＴＩＣＲソースを搭載したＢｒｕｋｅｒ ｓｏｌａｒｉＸ（９．４Ｔ磁石）分光計を用いた高分解能フーリエ変換質量分析（ＦＴＭＳ）により、ペプチドとタンパク質に対し特徴解析を行った。ＣＤスペクトルは、１．０ｍｍ経路長のセルを有するＪａｓｃｏ Ｊ－７１５光度計で記録した。ＣＤスペクトルを、標準感度（１００ｍｄｅｇ）、データピッチ０．５ｎｍ、スキャン速度５０ｎｍ／分、および帯域幅１ｎｍの連続スキャンモードにおいて、２５℃で集めた。５つのスキャンを平均化し、バックグラウンド信号を控除することで、ＣＤ曲線を得た。
ペプチドセグメント、ライゲートしたペプチド、および直鎖タンパク質を解析し、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）により精製した。ペプチドの解析と反応のモニタリングは、デュアルポンプ、ミキサおよびインラインデガッサ、オートサンプラ、可変波長ＵＶ検出器（２２０ｎｍおよび２５４ｎｍで溶離液を同時にモニタリング）、ならびに１００μＬ注射ループを取り付けた注射器を備える、解析用Ｊａｓｃｏ器機で実施した。ペプチドセグメントの精製は、１０～２０ｍＬの注射ループを備えたＧｉｌｓｏｎ分取器機またはＪａｓｃｏ半分取器機で実施した。いずれの場合も、移動相は、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＭｉｌｌｉＱ－Ｈ２Ｏ（緩衝液Ａ）、および０．１％ＴＦＡを有するＨＰＬＣグレードのＣＨ３ＣＮ（緩衝液Ｂ）であった。分析ＨＰＬＣは、ｂｉｏＺｅｎ（商標）Ｉｎｔａｃｔ Ｃ４カラム（３．６μｍ、１５０×４．６ｍｍ）上、室温で、またはＡｅｒｉｓ ＷＩＤＥＰＯＲＥ ＸＢ－Ｃ１８カラム（３．６μｍ、１５０×４．６ｍｍ）上、流速１ｍＬ／分、６０℃で実施した。分取ＨＰＬＣは、Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ－Ｃ１８ １１０ Ａカラム（５μｍ、２５０×５０ｍｍ）上で、またはＳｈｉｓｅｉｄｏ ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ ＵＧ８０ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×５０ｍｍ）上、流速４０ｍＬ／分、４０℃もしくは６０℃で実施した。半分取ＨＰＬＣは、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ ＵＧ８０ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）上、流速１０ｍＬ／分、６０℃で実施した。
ペプチドセグメントを、Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ化学作用を用いて自動ペプチド合成機で合成した。側鎖保護基を有するＦｍｏｃ－アミノ酸として、Ｆｍｏｃ－Ａｌａ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｒｇ（Ｐｂｆ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＢｎｏ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯＡｌｌ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｎ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｇｌｙ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｉｓ（Ｔｒｔ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｉｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ａｌｌｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｍｅｔ（Ｏ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｈｓｅ（Ｍｅ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｎｌｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｐｒｏ－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｓｅｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｈｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｒｐ（Ｂｏｃ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｔｙｒ（ｔＢｕ）－ＯＨ、Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－ＯＨを使用した。必要な場合、Ｆｍｏｃ－偽プロリンジペプチドを合成に組み込んだ。Ｆｍｏｃ脱保護は、２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（８分を２回）、０．１Ｍ Ｃｌ－ＨＯＢｔを含有する２５％ピペリジンのＤＭＦ溶液（８分を２回）、または０．１Ｍ Ｃｌ－ＨＯＢｔを含有する２０％ピペリジンのＤＭＦ溶液（８分を２回）で実施し、３０４ｎｍのＵＶによりフィードバックループでモニタリングすることで、完全なＦｍｏｃ除去を確保した。Ｆｍｏｃ－アミノ酸（レジン置換の３．０～５．０当量）、ＨＣＴＵ、またはＨＡＴＵ（２．９～４．９当量）をカップリング試薬として使用し、ＤＩＰＥＡまたはＮＭＭ（６～１０当量）のＤＭＦ溶液を使用し、室温または５０℃でカップリングを行った。予め３分間の活性化を行った後、溶液をレジンに添加し、アミノ酸に応じて１５分、３０分、または２時間反応させた。場合により、二重カップリングを必要とした。場合により、レジンを２０％無水酢酸のＤＭＦ溶液で処理し、未反応の遊離アミンをキャッピングした。必要な場合にＬｉＣｌ洗浄を実施した。アリルオキシカルボニル（Ａｌｌｏｃ）脱保護を、窒素下、窒素により室温で３０分間パージしたジクロロメタン中、フェニルシラン（２４当量）およびテトラキス（トリフェニルホスフィン）パラジウム（０）（０．５当量）を用いて実施した。
次のサンプルプロトコルを使用して、ＳＰＰＳによるペプチドセグメントの合成を微量切断（ｍｉｃｒｏｃｌｅａｖａｇｅ）によりモニタリングした。ペプチジルレジン１０ｍｇを切断カクテル（２００μＬ）により室温で１．５時間処理した。レジンを濾過して取り除き、濾液を濃縮し、冷ジエチルエーテルで処理し、トリチュレートして遠心分離を行った。エーテル層を慎重にデカントし、残渣を再びジエチルエーテル中で懸濁し、トリチュレートして遠心分離を行った。エーテル洗浄を２回繰り返した。得られたペーストを、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１：１のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ中で再び可溶化し、６０℃のＡｅｒｉｓ ＷＩＤＥＰＯＲＥ ＸＢ－Ｃ１８カラム（３．６μｍ、１５０×４．６ｍｍ）およびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦを用いた分析ＨＰＬＣにより解析した。
ペプチド合成の完了後、切断カクテルにより室温で２時間かけてペプチドをレジンから切断した。レジンを濾過して取り除き、濾液を濃縮し、冷ジエチルエーテルで処理し、トリチュレートして遠心分離を行った。エーテル層を慎重にデカントし、残渣を再びジエチルエーテル中で懸濁し、トリチュレートして遠心分離を行った。エーテル洗浄を２回繰り返した。得られた粗製ペプチドを真空下で乾燥し、－２０℃で保管した。
本明細書で提供される修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを産生するために使用される一般合成スキームを図８に示す。簡潔に説明すると、線形ペプチドフラグメント（図８に示すフラグメント１～４）を、ＳＰＰＳを用いて調製し、野生型ＩＬ－１８のアミノ酸配列（配列番号１）に対する所望の修飾を合成中に組み込んだ。個々のセグメントを精製した後、それぞれセグメント１と２を一体的にライゲートし、セグメント３と４を一体的にライゲートした。次いで、得られたセグメント１－２と３－４を一体的にライゲートし、普遍的に脱保護することで、粗製の合成ＩＬ－１８ポリペプチドを得る。
その後、ＩＬ－１８－Ｓｅｇ１２３４－ＡｃｍのＡｃｍ基を普遍的に脱保護し、精製することで、合成ＩＬ－１８直鎖タンパク質を得た。
１．１ ＩＬ－１８フラグメントの合成の一般手順
１．１．１．セグメント１：ＩＬ１８（１－２９）－Ｌｅｕ－α－ケト酸。
ＩＬ１８（１－２９）－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメントを、置換容量が０．２５ｍｍｏｌ／ｇの保護Ｆｍｏｃ－α－Ｐｈｅ－ケト酸を事前に充填したリンクアミドＭＢＨＡレジン上で合成する。この合成は、一般法セクションに記載の手順を用いて自動Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳにより、Ｔｙｒ１にまで実施する。
セグメント１の変異体：場合により、Ｇｌｕ６をＬｙｓで置換した。
ペプチド合成の進行状況を、一般法セクションに記載される微量切断分析の実行によりモニタリングする。切断カクテルには９５：２．５：２．５のＴＦＡ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏ混合物が含まれる。
合成の完了後、一般法に記載されるように、レジンを９５：２．５：２．５のＴＦＡ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏ混合物（１０ｍＬ／ｇのレジン）中、室温で２時間撹拌することにより、ペプチドをレジンから切断する。Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ ＵＧ８０ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×５０ｍｍ）を用いて、流速４０ｍＬ／分、６０℃で、勾配は２５分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～６０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製ＩＬ１８（１－２９）－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメントの精製を実施した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、ＩＬ１８（１－２９）－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメント（ＩＬ１８－Ｓｅｇ１）を得る。分析ＨＰＬＣとＥＳＩ－ＨＲＭＳを使用し、生成物の純度と質量を確認した。
１．１．２ セグメント２：Ｏｐｒ－ＩＬ１８（３２－６１）－光保護－Ｖａｌ－α－ケト酸およびＯｐｒ－ＩＬ１８（３２－７３）－光保護－Ｌｅｕ－α－ケト酸
１．１．２．１ Ｏｐｒ－ＩＬ１８（３２－６１）－光保護－Ｖａｌ－α－ケト酸
Ｏｐｒ－ＩＬ１８（３２－６１）－Ｖａｌ－光保護－α－ケト酸セグメントを、置換容量が０．２４ｍｍｏｌ／ｇのＦｍｏｃ－Ｖａｌ－光保護－α－ケト酸を事前に充填したリンクアミドＭＢＨＡレジン上、０．２ｍｍｏｌスケールで合成する。この合成は、一般法セクションに記載の手順を用いて自動Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳにより、Ａｓｐ３２にまで実施する。このセグメントの合成には偽プロリンジペプチドが必要であり、５４～５５位、４９～５０位、および３５～３６位にて人為的にカップリングした。Ｂｏｃ－５－（Ｓ）オキサプロリンを配列の末端で人為的にカップリングする。非従来的な側鎖保護基を有するアスパラギン酸残基を３２位、３７位、および４０位にて人為的に付加する。場合により、これらの保護基には、レジンからペプチドを切断した後の追加の脱保護工程が必要であった。
セグメント２の変異体：場合により、Ｌｙｓ５３をＡｌａで置換する。場合により、Ｃｙｓ（Ａｃｍ）３８をＳｅｒで置換する。場合により、Ｍｅｔ３３、Ｍｅｔ５１、Ｍｅｔ６０を、ＮｌｅまたはＯ－メチル－Ｌ－ホモセリンで置換する。
ペプチド合成の進行状況を、一般法セクションに記載される微量切断の実行によりモニタリングする。切断カクテルには９５：２．５：２．５のＴＦＡ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏ混合物が含まれる。合成の完了後、９５：２．５：２．５のＴＦＡ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏ混合物（１５ｍＬ／ｇのレジン）を用いて、室温で２時間かけて、ペプチドをレジンから切断する。粗製Ｏｐｒ－ＩＬ１８（３２－６１）－光保護－Ｖａｌ－α－ケト酸セグメントを、Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ－Ｃ１８ １１０Åカラム（５μｍ、２５０×５０ｍｍ）を用いて、流速４０ｍＬ／分、４０℃で、勾配は３０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～６０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより精製する。精製された産物を有する画分をプールして凍結乾燥することで、Ｏｐｒ－ＩＬ１８（３２－６１）－光保護－Ｖａｌ－α－ケト酸（ＩＬ１８－Ｓｅｇ２）を得る。分析ＨＰＬＣとＥＳＩ－ＨＲＭＳを使用し、生成物の純度と質量を確認した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、Ｏｐｒ－ＩＬ１８（３２－６１）－光保護－Ｖａｌ－α－ケト酸（ＩＬ１８－Ｓｅｇ２）を純度９８％超の白色固形物として得る。
１．１．２．１ Ｏｐｒ－ＩＬ１８（３２－７３）－光保護－Ｌｅｕ－α－ケト酸
セグメント２の長さの変異：場合により、ＩＬ－１８のセグメント２の配列は少数のアミノ酸によりさらに長くなり、３１位から７４位までＩＬ－１８配列を含むことになる。
セグメントＯｐｒ－ＩＬ１８（３２－７３）－光保護－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメントを、置換容量が０．２１ｍｍｏｌ／ｇのＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－光保護－α－ケト酸を事前に充填したリンクアミドＭＢＨＡレジン上で調製する。この合成は、一般法セクションに記載の手順を用いて自動Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳにより、Ａｓｐ３２にまで実施する。Ｂｏｃ－５－（Ｓ）オキサプロリンを、人為的に配列にカップリングする。
セグメント２の変異体：場合により、Ｌｙｓ５３をＡｌａで置換し、Ｌｙｓ７０を非標準Ｎ－α－（９－フルオレニルメトキシカルボニル）－ε－アジドＬ－リシン（Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｎ３）－ＯＨ）で置換した。場合により、Ｌｙｓ７０の側鎖をａｌｌｏｃ基で保護する。次いで、ａｌｌｏｃ基をレジン脱保護工程中に除去し、得られた遊離アミンをグルタル酸無水物とカップリングさせる。次いで、得られた遊離酸を対応する所望の基、例えば、ＰＥＧ基や、アジド官能性を有するＰＥＧにカップリングさせる。場合により、Ｃｙｓ（Ａｃｍ）３８およびＣｙｓ（Ａｃｍ）６８をＳｅｒで置換する。場合により、Ｍｅｔ３３、Ｍｅｔ５１、Ｍｅｔ６０を、ＮｌｅまたはＯ－メチル－Ｌ－ホモセリンで置換する。
１．１．３ セグメント３：Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（６４－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸およびＦｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（７６－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸。
１．１．３．１ Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（６４－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸
Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（６４－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメントを、置換容量が０．４７ｍｍｏｌ／ｇのＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－光保護－α－ケト酸を事前に充填したリンクアミドＣｈｅｍＭａｔｒｉｘｃ（著作権）レジン上、０．１ｍｍｏｌスケールで合成する。この合成は、一般法セクションに記載の手順を用いて自動Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳにより、Ｉｌｅ６４にまで実施する。このセグメントの合成には偽プロリンジペプチドが必要であり、８１～８２位および７１～７２位にて人為的にカップリングする。Ｆｍｏｃ－５－（Ｓ）オキサプロリンを配列の末端で人為的にカップリングする。
ペプチド合成の進行状況を、一般法セクションに記載される微量切断の実行によりモニタリングする。切断カクテルには９５：２．５：２．５のＴＦＡ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏ混合物が含まれる。合成の完了後、９５：２．５：２．５のＴＦＡ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏ混合物（１５ｍＬ／ｇのレジン）を用いて２時間かけて、ペプチドをレジンから切断した。粗製Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（７６－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメントを、Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ－Ｃ１８ １１０Åカラム（５μｍ、２５０×５０ｍｍ）を用いて、流速４０ｍＬ／分、４０℃で、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～５０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより精製する。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（７６－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸（ＩＬ１８－Ｓｅｇ３）を得る。分析ＨＰＬＣとＥＳＩ－ＨＲＭＳを使用し、生成物の純度と質量を確認した。
セグメント３の変異体：場合により、Ｃｙｓ（Ａｃｍ）６８およびＣｙｓ（Ａｃｍ）７６をＳｅｒで置換する。場合により、Ｍｅｔ８６およびＭｅｔ１１３を、ＮｌｅまたはＯ－メチル－Ｌ－ホモセリンで置換する。場合により、Ｌｙｓ７０を非標準Ｎ－α－（９－フルオレニルメトキシカルボニル）－ε－アジドＬ－リシン（Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（Ｎ３）－ＯＨ）で置換する。場合により、Ｌｙｓ７０の側鎖をａｌｌｏｃ基で保護する。次いで、ａｌｌｏｃ基をレジン脱保護工程中に除去し、得られた遊離アミンをグルタル酸無水物とカップリングさせる。次いで、得られた遊離酸を対応する所望の基、例えば、ＰＥＧ基や、アジド官能性を有するＰＥＧにカップリングさせる。
１．１．３．２ Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（７６－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸。
セグメント３の長さの変異：場合により、ＩＬ－１８のセグメント３の配列は少数のアミノ酸によりさらに短くなり、７５位から１１５位までＩＬ－１８配列を含むことになる。次いで、セグメントＦｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（７４－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸を、置換容量が０．４７ｍｍｏｌ／ｇのＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－光保護－α－ケト酸を事前に充填したリンクアミドＣｈｅｍＭａｔｒｉｘ（登録商標）レジン上で合成する。一般法セクションに記載の手順を用いて、自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳをＣｙｓ（Ａｃｍ）７６にまで行う。Ｆｍｏｃ－５－（Ｓ）オキサプロリンを、人為的に配列にカップリングさせる。
セグメント３の変異体：場合により、Ｃｙｓ（Ａｃｍ）７６をＳｅｒで置換する。場合により、Ｍｅｔ８６およびＭｅｔ１１３を、ＮｌｅまたはＯ－メチル－Ｌ－ホモセリンで置換する。
１．１．４ セグメント４：Ｏｐｒ－ＩＬ１８（１１７－１５７）。
Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨの事前充填を、Ｆｍｏｃ－リンク－アミドＭＢＨＡレジンで実施する。レジン４ｇ（充填：０．５６ｍｍｏｌ／ｇ、２．２４ｍｍｏｌのスケール）をＤＭＦ中、１５分かけて膨張させる。レジンを２０％ＤＭＦ（ｖ／ｖ）溶液により、室温で２０分間処理する。レジンをＤＭＦで数回洗浄する。Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（６９１ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ、０．７５当量）およびＨＡＴＵ（６３８ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ、０．７５当量）をＤＭＦ（１２ｍＬ）に溶解する。ＤＩＰＥＡ（５８５μＬ、３．３６ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加して、事前活性化を室温で３分間実施する。反応混合物を膨張したレジンに添加する。これを室温で一晩、優しく撹拌しながら反応させる。レジンをＤＭＦで徹底的にすすぐ。無水酢酸（１．１７ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（２．３４ｍＬ）のＤＭＦ（１２ｍＬ）溶液を添加することで、レジン上で未反応のアミンのキャッピングを開始する。これを室温で１５分間、優しく撹拌しながら反応させる。レジンをＤＣＭで徹底的にすすぎ、乾燥する。レジンの充填量を測定する（０．３４ｍｍｏｌ／ｇ）。
Ｏｐｒ－ＩＬ１８（１１７－１５７）セグメントを、置換容量が０．３４ｍｍｏｌ／ｇのＦｍｏｃＡｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨを事前に充填したリンクアミドＭＢＨＡレジン上で合成する。一般法セクションに記載の手順を用いて、Ｓｅｒ１１７にまで自動Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳを行う。Ｂｏｃ－５－（Ｓ）オキサプロリンを、人為的に配列にカップリングする。
ペプチド合成の進行状況を、一般法セクションに記載される微量切断の実行によりモニタリングする。切断カクテルには９２．５：２．５：２．５：２．５のＴＦＡ／ＴＩＰＳ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏ混合物が含まれる。合成の完了後、９２．５：２．５：２．５：２．５のＴＦＡ／ＴＩＰＳ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏ混合物（１０ｍＬ／ｇのレジン）を用いて２時間かけて、ペプチドをレジンから切断する。粗製Ｏｐｒ－ＩＬ１８（１１７－１５７）セグメントを、Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ－Ｃ１８ １１０Åカラム（５μｍ、２５０×５０ｍｍ）を用いて、流速４０ｍＬ／分、４０℃で、勾配は４５分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～５５％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより精製する。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、Ｏｐｒ－ＩＬ１８（１１７－１５７）（ＩＬ１８－Ｓｅｇ４）を得る。分析ＨＰＬＣとＥＳＩ－ＨＲＭＳを使用し、生成物の純度と質量を確認した。
セグメント４の変異体：場合により、Ｃｙｓ（Ａｃｍ）１２７をＳｅｒで置換する。場合により、Ｍｅｔ１５０を、ＮｌｅまたはＯ－メチル－Ｌ－ホモセリンで置換する。
１．２ ＩＬ１８直鎖タンパク質の調製におけるＫＡＨＡライゲーション。
１．２．１．セグメント１２（ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２）の合成におけるＫＡＨＡライゲーション
ライゲーション：ＩＬ１８－Ｓｅｇ１（１．２当量）およびＩＬ１８－Ｓｅｇ２（１当量）を、０．１Ｍシュウ酸（限定的な薬剤で２０ｍＭのペプチド濃度）を含有する９：１のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏに溶解し、６０℃で１５時間反応させた。ライゲーションバイアルをアルミホイルで巻くことで光を遮る。ＫＡＨＡライゲーションの進行状況を、Ａｅｒｉｓ ＷＩＤＥＰＯＲＥ ＸＢ－Ｃ１８カラム（３．６μｍ、１５０×４．６ｍｍ）を用いて、流速１ｍＬ／分、６０℃で、勾配は７分で２０～９５％ＣＨ３ＣＮとしたＨＰＬＣによりモニタリングする。
光脱保護：ライゲーションの完了後、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１：１のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏで混合物を希釈し、３６５ｎｍ波長を１．５時間照射する。光分解反応の完了をＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳ解析により確認した。
精製：６０℃に保ったＳｈｉｓｅｉｄｏ ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ ＵＧ８０ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×５０ｍｍ）を用いて、２工程勾配は２５分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～６０％ＣＨ３ＣＮ、次いで６０％ＣＨ３ＣＮを５分間保持するものとし、流速４０ｍＬ／分で分取ＨＰＬＣにより、光脱保護した試料を精製した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２を得る。セグメントの純度と同一性を、ＨＰＬＣおよびＥＳＩ－ＨＲＭＳ解析により確認する。
１．２．２．セグメント３４（ＩＬ１８－Ｓｅｇ３４）の合成におけるＫＡＨＡライゲーション
ライゲーション：ＩＬ１８－Ｓｅｇ３（１当量）およびＩＬ１８－Ｓｅｇ４（１．２当量）を、０．１Ｍシュウ酸（限定的な薬剤で２０ｍＭのペプチド濃度）を含有する９７．５：２．５のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏに溶解し、６０℃で１６時間かけて反応させた。ＫＡＨＡライゲーションの進行状況を、Ａｅｒｉｓ ＷＩＤＥＰＯＲＥ（３．６μｍ、１５０×４．６ｍｍ）カラムを用いて、流速１ｍＬ／分、６０℃で、勾配は７分で５～６５％ＣＨ３ＣＮとしたＨＰＬＣによりモニタリングする。
Ｆｍｏｃ脱保護：ライゲーションの完了後、反応混合物をＤＭＳＯ（ペプチド濃度６．７ｍＭ）で希釈する。ジエチルアミンを添加し（５％、ｖ／ｖ）、反応混合物を室温で１５分間振盪する。反応混合物をＤＭＳＯ（ペプチド濃度３．３ｍＭ）で再度希釈する。ジエチルアミンを添加し（２．５％、ｖ／ｖ）、反応混合物を室温でさらに１５分間振盪する。次いで、反応混合物を、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１：１のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏで希釈する。
精製：Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ－Ｃ１８ １１０Åカラム（５μｍ、２５０×５０ｍｍ）上、流速４０ｍＬ／分、４０℃で、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～５０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、試料を精製する。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、ＩＬ１８－Ｓｅｇ３４（Ｓｅｇ３４）を得る。分析ＨＰＬＣとＥＳＩ－ＨＲＭＳを使用し、生成物の純度と質量を確認した。
１．２．３ ＩＬ１８セグメント１２３４（ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４－Ａｃｍ）の合成におけるＫＡＨＡライゲーション。
ライゲーション：ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２（１．２当量）およびＩＬ１８－Ｓｅｇ３４（１．０当量）を、０．１Ｍシュウ酸（ペプチド濃度１５ｍＭ）を含有する９：１のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏに溶解し、反応物を６０℃で２４時間撹拌する。Ａｅｒｉｓ ＷＩＤＥＰＯＲＥ（３．６μｍ、１５０×４．６ｍｍ）カラムを使用し、流速１ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は７分で２０～９５％ＣＨ３ＣＮとした分析ＨＰＬＣにより、ＫＡＨＡライゲーションの進行状況をモニタリングする。ライゲーションの完了後、反応混合物をＤＭＳＯで希釈し、続いて、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１：１のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏでさらに希釈する。
精製：Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ－Ｃ１８ １１０Åカラム（５μｍ、２５０×５０ｍｍ）上、流速４０ｍＬ／分、６０℃で、勾配は３０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～６０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、試料を精製する。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、Ａｃｍ基で保護されたシステイン残基を有するＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４（ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４－Ａｃｍ）を得る。分析ＨＰＬＣとＥＳＩ－ＨＲＭＳを使用し、生成物の純度と質量を確認した。
１．２．４ ＩＬ１８直鎖タンパク質合成における再配列およびＡｃｍ脱保護
再配列：ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４－Ａｃｍを、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（ｐＨ８．１）（１．５ｍＬ、タンパク濃度０．１３ｍＭ）を含有する６Ｍ Ｇｕ・ＨＣｌに溶解する。ｐＨを８．０に調整する。これを５０℃で２時間反応させる。反応の完了後、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ、１０ｍＬ）を含有する６Ｍ Ｇｕ・ＨＣｌで試料を希釈し、Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉ Ｓ５カラム（２５０×２０ｍｍ）を使用して、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として使用して、勾配は０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）とともに２０～４０％（１９分で）および４０～５０％（１１分で）とした分取ＨＰＬＣにより、精製する。生成物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、Ａｃｍを有するＩＬ１８直鎖タンパク質を得る。分析ＨＰＬＣとＥＳＩ－ＨＲＭＳを使用し、生成物の純度と質量を確認した。
Ａｃｍ脱保護：Ａｃｍを有するＩＬ１８直鎖タンパク質を１：１のＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（タンパク濃度０．２５ｍＭ）に溶解し、酢酸銀（１％、ｍ／ｖ）を溶液に添加する。混合物を５０℃で２．５時間振盪させ、光を遮る。Ａｅｒｉｓ ＷＩＤＥＰＯＲＥ（３．６μｍ、１５０×４．６ｍｍ）カラムを使用し、流速１ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は７分で２０～９５％ＣＨ３ＣＮとした分析ＨＰＬＣにより、Ａｃｍ脱保護反応の進行状況をモニタリングする。反応の完了後、試料を、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１：１のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏで希釈する。
精製：Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ ＵＧ８０ Ｃ１８カラム（２５０×２０ｍｍ）を使用し、流速１０ｍＬ／分、室温で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、２工程勾配は５分で１０～３０％ＣＨ３ＣＮ、２０分で３０～９５％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、試料を精製する。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、所望のＩＬ１８直鎖タンパク質を得る。分析ＨＰＬＣとＨＲＭＳを使用し、生成物の純度と質量を確認する。
実施例２ － 修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのフォールディング
合成された修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを緩衝液に溶解し、特定の緩衝液・ｐＨ条件にさらして、ポリペプチドのフォールディングを促進する。フォールディングされたタンパク質を、ＨＰＬＣ、ＥＳＩ－ＭＳ、および／またはＭＡＬＤＩ－ＴＯＦなどの分析技法を用いて確認する。いくつかの条件をスクリーニングし、フォールディング緩衝液（緩衝液ＡとＢ）および製剤化緩衝液の組成物を変動させることで検査する。例示的なフォールディング条件と緩衝液組成物を、下記の表１４に示す。修飾ＩＬ－１８ポリペプチドについて所望の分析特性と生化学的特性をもたらす１つまたは複数の条件を選択し、フォールディングプロトコルをスケールアップする。
工程１：直鎖タンパク質を緩衝液Ａ（タンパク濃度２～４ｍｇ／ｍＬ）に溶解する。タンパク質溶液を２０℃で最大１時間、優しく振盪する。
工程２：タンパク質溶液を、滴加しながら緩衝液Ｂで徐々に希釈する。濃度０．２～０．４ｍｇ／ｍＬで得た透明溶液を、４℃、１０℃、または２０℃で１８～４８時間インキュベートする。
工程３：溶液を１００００ＲＰＭ、１０℃で１０分間遠心分離する。次いで、０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０および５～６％スクロースを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して室温で２時間透析する。この工程を再度繰り返す。次いで、同じ緩衝液を用いて室温で１８時間、３回目の透析を行う。
分析ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦにより、フォールディングされた純粋タンパク質の純度と同一性をさらに確認した。
実施例３ － フォールディングされたＩＬ－１８のさらなる修飾
フォールディングされたＩＬ－１８をポリエチレングリコールポリマーと反応させることでさらに修飾し、適切な緩衝液中で製剤化する。
実施例４ － 配列番号２４における修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの合成
配列番号２４の直鎖ペプチドを後述のプロトコルに従い調製した。
セグメント１（ＩＬ－１８（１－２９）－Ｐｈｅ－α－ケト酸）：Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－保護－α－ケト酸１の事前充填を、Ｆｍｏｃ－リンクアミドＭＢＨＡレジンで実施した。レジン５ｇ（充填：０．５６ｍｍｏｌ／ｇ、１．８ｍｍｏｌのスケール）をＤＭＦ中、２０分かけて膨張させた。レジンを２０％ピペリジンのＤＭＦ（ｖ／ｖ）溶液により室温で１０分間、２回処理し、ＤＭＦで数回洗浄した。ケト酸１（１．４６ｇ、１．８ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＨＡＴＵ（６５０ｍｇ、１．７１ｍｍｏｌ、０．９５当量）をＤＭＦ（２０ｍＬ）に溶解した。ＮＭＭ（３９６μＬ、３．６ｍｍｏｌ、２当量）を添加することで、事前活性化を室温で３分間実施した。反応混合物を膨張されたレジンに添加し、室温で２．５時間優しく撹拌した。レジンをＤＭＦで徹底的にすすいだ。無水酢酸（１．１７ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（２．３４ｍＬ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液を添加し、反応物を室温で１５分間優しく撹拌することで、レジン上の未反応アミンのキャッピングを開始した。レジンをＤＣＭ、続いてジエチルエーテルで徹底的にすすぎ、乾燥した。レジンの充填量を測定した（０．３０ｍｍｏｌ／ｇ）。
ＩＬ１８（１－２９）－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメントを、置換容量が約０．３０ｍｍｏｌ／ｇのＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－光保護－α－ケト酸（１．５ｇ）を事前に充填したリンクアミドＭＢＨＡレジン上、０．４５ｍｍｏｌスケールで合成した。
ＩＬ１８（１－２９）－Ｐｈｅ－α－ケト酸の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：Ｆｍｏｃアミノ酸のＤＭＦ（１０．０ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液、ＨＣＴＵのＤＭＦ（１０．０ｍＬ、０．３８Ｍ、３．８当量）溶液、およびＮＭＭのＤＭＦ（１０．０ｍＬ、０．８Ｍ、８当量）溶液をレジンに添加することで、カップリング反応を室温で３０分間実施した。１４位から１位では、二重カップリングが必要であった。塩化リチウム（０．８Ｍ）のＤＭＦ溶液での洗浄を５つのアミノ酸ごとに実施してから、Ｆｍｏｃ脱保護反応を行った。必要な場合、２０％（ｖ／ｖ）無水酢酸のＤＭＦ（１０．０ｍＬ）溶液およびＮＭＭのＤＭＦ（０．８Ｍ、１０．０ｍＬ）溶液を添加することで、キャッピングを室温で１０分間実施した。Ｃｌ－ＨＯＢｔ（０．１Ｍ）を含有する２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護反応を室温で８分間実施した。
レジンをＤＣＭで洗浄し、真空下で乾燥した。乾燥したペプチジルレジンの質量は４．６ｇであった。ＴＦＡ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏの９５：２．５：２．５混合物（１０ｍＬ／ｇレジン）を使用し、レジンからペプチドを室温で２．０時間かけて切断した。レジンを切断カクテルから濾過して取り除き、濾液を濃縮し、冷ジエチルエーテル（２０℃）で２０倍希釈し、ペプチドを沈殿させた。遠心分離後、エーテル層を慎重にデカントし、ペプチド沈殿物をジエチルエーテル中で再懸濁し、トリチュレートし、遠心分離した。エーテル洗浄を２回繰り返し、得られたペプチド沈殿物を乾燥した。粗製ペプチドの質量は１．８ｇであった。Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ ＵＧ８０ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×５０ｍｍ）を用いて、流速４０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は２５分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～６０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製ＩＬ１８（１－２９）－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメントの精製を実施した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、ＩＬ１８（１－２９）－Ｐｈｅ－α－ケト酸（ＩＬ１８－Ｓｅｇ１）を純度９８％超の白色固形物として得た。レジンの充填に基づく単離収率は４７２ｍｇ（２８％）であった。ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ２３３Ｈ３４８Ｎ５８Ｏ６９Ｓ；算出した平均同位体３５５０．８９３６Ｄａ［Ｍ］；ｆｏｕｎｄ：３５５０．８９４８Ｄａ。
セグメント２（Ｏｐｒ－ＩＬ１８（３２－７３）－Ｌｅｕ－光保護－α－ケト酸）：Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－光保護－α－ケト酸２の事前充填を、Ｆｍｏｃ－リンク－アミドＭＢＨＡレジンで実施した。レジン５ｇ（充填：０．５６ｍｍｏｌ／ｇ、２．２５ｍｍｏｌのスケール）をＤＭＦ中、２０分かけて膨張させた。ケト酸２（１．７９ｇ、２．２５ｍｍｏｌ、１当量）およびＨＡＴＵ（８１３ｍｇ、２．１４ｍｍｏｌ、０．９５当量）をＤＭＦ（２５ｍＬ）に溶解した。ＮＭＭ（４９５μＬ、４．５ｍｍｏｌ、２当量）を添加することで、事前活性化を室温で２分間実施した。反応混合物を膨潤されたレジンに添加し、室温で６時間優しく撹拌した。レジンをＤＭＦで徹底的にすすいだ。無水酢酸（２．０ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（２．０ｍＬ）のＤＭＦ（２０ｍＬ）溶液を添加し、混合物を室温で１５分間優しく撹拌することで、レジン上の未反応アミンのキャッピングを開始した。レジンをＤＣＭとジエチルエーテルで徹底的にすすぎ、乾燥した。レジンの充填量を測定した（０．３４ｍｍｏｌ／ｇ）。
Ｏｐｒ－ＩＬ１８（３２－７３）－Ｐｈｅ－光保護－α－ケト酸セグメントを、置換容量が約０．３４ｍｍｏｌ／ｇのＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－Ｌｅｕ－光保護－α－ケト酸を事前に充填したリンクアミドＭＢＨＡレジン上、０．２ｍｍｏｌスケールで合成した。
７３位から６６位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：Ｆｍｏｃアミノ酸のＤＭＦ（２．０ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液、ＨＣＴＵのＤＭＦ（２．０ｍＬ、０．３８Ｍ、３．８当量）溶液、およびＮＭＭのＤＭＦ（２．０ｍＬ、０．８Ｍ、８当量）をレジンに添加することで、カップリング反応を室温で３０分間実施した。Ｃｌ－ＨＯＢｔ（０．１Ｍ）を含有する２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンのＤＭＦ溶液を用いた各カップリングサイクルにおいて、Ｆｍｏｃ脱保護反応を室温で７分間、２回実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｉｌｅ－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｉｌｅ－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨ（３８４ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ、４当量）、ＨＡＴＵ（２９０ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ、３．８当量）、およびＮＭＭ（１７６μＬ、１．６ｍｍｏｌ、８当量）の３ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温の３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で１時間優しく撹拌した。
６３位での自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：上述の条件を用いてカップリング反応を実施した。６３位では３倍のカップリングが必要であった。
６４位から５６位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：上述の条件を用いてカップリング反応を実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨ（４３０ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ、４当量）、ＨＡＴＵ（２９０ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ、３．８当量）、およびＮＭＭ（１７６μＬ、１．６ｍｍｏｌ、８当量）の３ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温の３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で１時間優しく撹拌した。
５３位から５１位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ： 配列の始めに対して上記で言及したのと同じ条件を用いて、カップリング反応を実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｉｌｅ－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｉｌｅ－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨ（３８４ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ、４当量）、ＨＡＴＵ（２９０ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ、３．８当量）、およびＮＭＭ（１７６μＬ、１．６ｍｍｏｌ、８当量）の３ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温の３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で１時間優しく撹拌した。
４８位から３７位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：上述の条件を用いてカップリング反応を実施した。各位置には二重カップリングが必要であった。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨ（４３０ｍｇ、０．８ｍｍｏｌ、４当量）、ＨＡＴＵ（２９０ｍｇ、０．７６ｍｍｏｌ、３．８当量）、およびＮＭＭ（１７６μＬ、１．６ｍｍｏｌ、８当量）の３ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温の３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で１時間優しく撹拌した。
３４位から３２位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：上述の条件を用いてカップリング反応を実施した。各位置には二重カップリングが必要であった。２０％（ｖ／ｖ）無水酢酸のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液およびＮＭＭのＤＭＦ（０．８Ｍ、２ｍＬ）溶液を添加することで、各位置におけるキャッピングを室温で１０分間実施した。Ｃｌ－ＨＯＢｔ（０．１Ｍ）を含有する２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護を室温で７分間実施した。
次いで、Ｂｏｃ－５－（Ｓ）－オキサプロリンの手動カップリングを実施した。Ｂｏｃ－５－（Ｓ）－オキサプロリン（２１７ｍｇ、１．０ｍｍｏｌ、５当量）、ＨＡＴＵ（３６１ｍｇ、０．９５ｍｍｏｌ、４．８当量）、およびＮＭＭ（２２０μＬ、２．０ｍｍｏｌ、１０当量）の７ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温で３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２．５時間優しく撹拌した。レジンをＤＣＭとジエチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥した。乾燥したペプチジルレジンの質量は１．８ｇであった。
ＴＦＡ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏの９５：２．５：２．５混合物（１５ｍＬ／ｇレジン）を使用し、室温で２．０時間優しく撹拌して、レジンからペプチドを切断した。レジンを切断カクテルから濾過して取り除き、濾液を濃縮し、冷ジエチルエーテル（２０℃）で２０倍希釈し、ペプチドを沈殿させた。遠心分離後、エーテル層を慎重にデカントし、ペプチド沈殿物をジエチルエーテル中で再懸濁し、トリチュレートし、遠心分離した。エーテル洗浄を２回繰り返し、得られたペプチド沈殿物を乾燥した。粗製ペプチドの質量は１．２ｇであった。Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ－Ｃ１８ １１０Åカラム（５μｍ、２５０×５０ｍｍ）を用いて、流速４０ｍＬ／分、４０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は３０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～６０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製Ｏｐｒ－ＩＬ１８（３２－７３）－Ｐｈｅ－光保護－α－ケト酸セグメントの精製を実施した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、Ｏｐｒ－ＩＬ１８（３２－７３）－Ｐｈｅ－光保護－α－ケト酸（ＩＬ１８－Ｓｅｇ２）を純度９８％超の白色固形物として得た。レジンの充填に基づく単離収率は１４８ｍｇ（１４％）であった。ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）：４．８８分；Ｃ２３３Ｈ３４８Ｎ５８Ｏ６９Ｓ；算出したｍ／ｚ：１３１５．４２３３Ｄａ［Ｍ＋４Ｈ］；ｆｏｕｎｄ：１３１５．４２３１Ｄａ［Ｍ＋４Ｈ］。
セグメント３（Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（７６－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸）：レジン２２２ｍｇ（充填：０．４７ｍｍｏｌ／ｇ、０．１ｍｍｏｌのスケール）をＤＭＦ中、１５分かけて膨張させた。ケト酸３（１６３ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、２当量）およびＨＡＴＵ（７６ｍｇ、０．２ｍｍｏｌ、２当量）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。ＤＩＰＥＡ（１００μＬ、０．６ｍｍｏｌ、６当量）を添加することで、事前活性化を室温で２分間実施した。反応混合物を膨張したレジンに添加した。反応物を室温で一晩かけて優しく撹拌した。レジンをＤＭＦで徹底的にすすいだ。無水酢酸（１００μＬ）とＤＩＰＥＡ（１００μＬ）のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液を添加することで、レジン上で未反応のアミンのキャッピングを開始した。反応物を室温で１５分間優しく撹拌した。レジンをＤＭＦで徹底的にすすいだ。レジンの最終充填は算出せず、変化なし（０．４７ｍｍｏｌ／ｇ）と推定した。
Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（７６－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメントを、置換容量が約０．４７ｍｍｏｌ／ｇのＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－保護－α－ケト酸を事前に充填したリンクアミドＣｈｅｍＭａｔｒｉｘｃ（著作権）レジン上、０．１ｍｍｏｌスケールで合成した。
９６位から１１４位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：Ｆｍｏｃアミノ酸のＤＭＦ（１．０ｍＬ、０．５Ｍ、５当量）溶液、ＨＣＴＵのＤＭＦ（１．０ｍＬ、０．４８Ｍ、４．８当量）溶液、およびＤＩＰＥＡのＮＭＰ（０．４ｍＬ、０．２Ｍ、８当量）をレジンに添加することで、カップリング反応を室温で３０分間実施した。２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護を室温で１５分間実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｔｈｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｔｈｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨ（１６６ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（１１４ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（１００μＬ、０．６ｍｍｏｌ、６当量）の３ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温の３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。
７６位から９３位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：上述の条件を用いてカップリング反応を実施した。各位置には二重カップリングが必要であった。２０％（ｖ／ｖ）無水酢酸のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液およびＤＩＰＥＡのＤＭＦ（０．２Ｍ、１ｍＬ）溶液を添加することで、各位置におけるキャッピングを室温で１０分間実施した。Ｃｌ－ＨＯＢｔ（０．１Ｍ）を含有する２５％（ｖ／ｖ）ピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護反応を室温で１５分間実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－５－（Ｓ）－オキサプロリンの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－５－（Ｓ）－オキサプロリン（１０２ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（１１４ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（１００μＬ、０．６ｍｍｏｌ、６当量）の３ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温で３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。レジンをＤＣＭで洗浄し、真空下で乾燥した。乾燥したペプチジルレジンの質量は１．０ｇであった。
ＴＦＡ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏの９５：２．５：２．５混合物（１５ｍＬ／ｇレジン）中、レジンを室温で２．０時間撹拌することで、レジンからペプチドを切断した。レジンを切断カクテルから濾過して取り除き、濾液を濃縮し、冷ジエチルエーテル（２０℃）で２０倍希釈し、ペプチドを沈殿させた。遠心分離後、エーテル層を慎重にデカントし、ペプチド沈殿物をジエチルエーテル中で再懸濁し、トリチュレートし、遠心分離した。エーテル洗浄を２回繰り返し、得られたペプチド沈殿物を乾燥した。粗製ペプチドの質量は５４０ｍｇであった。Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ－Ｃ１８ １１０Åカラム（５μｍ、２５０×２５０ｍｍ）を用いて、流速４０ｍＬ／分、４０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～５０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（７６－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメントの精製を実施した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（７６－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸（ＩＬ１８－Ｓｅｇ３）を白色固形物として得た。レジンの充填に基づく単離収率は１２８ｍｇ（２５％）であった。ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ２３３Ｈ３４８Ｎ５８Ｏ６９Ｓ；算出した平均同位体５０９４．５２２６Ｄａ［Ｍ］；ｆｏｕｎｄ：５０９４．５２２４Ｄａ。
セグメント４（Ｏｐｒ－ＩＬ１８（１１７－１５７））：Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨの事前充填を、Ｆｍｏｃ－リンク－アミドＭＢＨＡレジンで実施した。レジン４ｇ（充填：０．５６ｍｍｏｌ／ｇ、２．２４ｍｍｏｌのスケール）をＤＭＦ中、１５分かけて膨張させた。レジンを２０％ＤＭＦ（ｖ／ｖ）溶液により、室温で２０分間処理した。レジンをＤＭＦで数回洗浄した。Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（６９１ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ、０．７５当量）およびＨＡＴＵ（６３８ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ、０．７５当量）をＤＭＦ（１２ｍＬ）に溶解した。ＤＩＰＥＡ（５８５μＬ、４．４８ｍｍｏｌ、２当量）を添加することで、事前活性化を室温で３分間実施した。反応混合物を膨張されたレジンに添加し、室温で一晩かけて優しく撹拌した。レジンをＤＭＦで徹底的にすすいだ。無水酢酸（１．１７ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（２．３４ｍＬ）のＤＭＦ（１２ｍＬ）溶液を添加し、混合物を室温で１５分間優しく撹拌することで、レジン上の未反応アミンのキャッピングを開始した。レジンをＤＣＭで徹底的にすすぎ、乾燥した。レジンの充填量を測定した（０．３４ｍｍｏｌ／ｇ）。
Ｏｐｒ－ＩＬ１８（１１７－１５７）セグメントを、置換容量が約０．３４ｍｍｏｌ／ｇのＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨを事前に充填したリンクアミドＭＢＨＡレジン上で合成した。レジン２９４ｍｇをＤＭＦ中で１５分間かけて膨張させた。
１４７位から１５７位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：Ｆｍｏｃアミノ酸のＤＭＦ（１．０ｍＬ、０．５Ｍ、５当量）溶液、ＨＣＴＵのＤＭＦ（１．０ｍＬ、０．４８Ｍ、４．８当量）溶液、およびＤＩＰＥＡのＮＭＰ（０．４ｍＬ、０．２Ｍ、８当量）をレジンに添加することで、カップリング反応を室温で３０分間実施した。２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護を室温で１５分間実施した。１１７位から１４６位では二重カップリング、ならびにキャッピング工程が必要であった。２０％（ｖ／ｖ）無水酢酸のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液およびＤＩＰＥＡのＤＭＦ（０．２Ｍ、１ｍＬ）溶液を添加することで、各位置におけるキャッピングを室温で１０分間実施した。
次いで、Ｂｏｃ－５－（Ｓ）－オキサプロリンの手動カップリングを実施した。Ｂｏｃ－５－（Ｓ）－オキサプロリン（６５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（１１４ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（１００μＬ、０．６ｍｍｏｌ、６当量）の３ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温で３分間の事前活性化）、レジンに添加した。混合物を室温で２時間反応させた。
レジンをＤＣＭで洗浄し、真空下で乾燥した。乾燥したペプチジルレジンの質量は１．２ｇであった。ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏの９２．５：２．５：２．５：２．５混合物（１０ｍＬ／ｇレジン）を使用し、レジンからペプチドを室温で２時間かけて切断した。レジンを切断カクテルから濾過して取り除き、濾液を濃縮し、冷ジエチルエーテル（２０℃）で２０倍希釈し、ペプチドを沈殿させた。遠心分離後、エーテル層を慎重にデカントし、ペプチド沈殿物をジエチルエーテル中で再懸濁し、トリチュレートし、遠心分離した。エーテル洗浄を２回繰り返し、得られたペプチド沈殿物を乾燥した。粗製ペプチドの質量は７７０ｍｇであった。Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ－Ｃ１８ １１０Åカラム（５μｍ、２５０×５０ｍｍ）を用いて、流速４０ｍＬ／分、４０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～５０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（１１７－１５７）セグメントの精製を実施した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、Ｏｐｒ－ＩＬ１８（１１７－１５７）（ＩＬ１８－Ｓｅｇ４）を白色固形物として得た。レジンの充填に基づく単離収率は１０６ｍｇ（２１％）であった。ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ２２２Ｈ３４６Ｎ５６Ｏ７３Ｓ；算出した平均同位体１２５０．９０５１Ｄａ［Ｍ＋４Ｈ＋］；ｆｏｕｎｄ：１２５０．６２９３Ｄａ。
ペプチド光保護ケト酸ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２（２８．４ｍｇ、７．９８μｍｏｌ、１．２当量）およびヒドロキシルアミンペプチドＩＬ１８－Ｓｅｇ２（２５．９ｍｇ、６．６５μｍｏｌ、１．０当量）を、０．１Ｍシュウ酸（３３３μＬ）を含有する９：１のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏに溶解した。均質な液体溶液を得た。ライゲーションバイアルをアルミホイルで包んで光を遮り、反応物を６０℃で一晩放置した。ライゲーションの完了後、混合物を、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）（１７８０μＬ）を有する１：１のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏで希釈し、３６５ｎｍ波長で１．５時間照射することで、Ｃ末端ケト酸の光脱保護を可能とした。反応混合物を、ＴＦＡ（０．１％、ｖ／ｖ）を有する１：１のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｑ．ｓ．１０ｍＬ）でさらに希釈した。反応混合物を濾過し、分取ＨＰＬＣに注入した。Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ－Ｃ１８ １１０Åカラム（５μｍ、２５０×２５０ｍｍ）を使用し、流速４０ｍＬ／分、６０℃で、勾配は３０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～６０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製のライゲートされたペプチドを精製する。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２を純度９８％超の白色固形物として得た。単離収率は２３．９ｍｇ（５０％）であった。
ＬＣ－ＭＳ（ＥＳＩ）：５．６３分；Ｃ３２２Ｈ５１５Ｎ８９Ｏ９６Ｓ；算出したｍ／ｚ：７１９６．７８７４Ｄａ［Ｍ］；ｆｏｕｎｄ：７１９６．７４７６Ｄａ［Ｍ］。
ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２の調製：ペプチド光保護ケト酸ＩＬ１８－Ｓｅｇ１（１８．１ｍｇ、５．０９μｍｏｌ、１．２当量）およびヒドロキシルアミンペプチドＩＬ１８－Ｓｅｇ２（２２．３ｍｇ、４．２４μｍｏｌ、１．０当量）を、０．１Ｍシュウ酸（２２０μＬ）を含有する９：１のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ溶液に溶解した。均質な液体溶液を得た。ライゲーションバイアルをアルミホイルで包んで光を遮り、６０℃で一晩優しく撹拌した。ライゲーションの完了後、混合物を、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）（１７８０μＬ）を有する１：１のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏで希釈し、３６５ｎｍ波長で１．５時間照射することで、Ｃ末端ケト酸の光脱保護を可能とした。混合物を、ＴＦＡ（０．１％、ｖ／ｖ）を有する１：１のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｑ．ｓ．１０ｍＬ）でさらに希釈した。反応混合物を濾過し、分取ＨＰＬＣに注入した。Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ－Ｃ１８ １１０Åカラム（５μｍ、２５０×２５０ｍｍ）を使用し、流速４０ｍＬ／分、６０℃で、勾配は２５分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０％～６０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製のライゲートされたペプチドを精製する。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２を純度９８％超の白色固形物として得た。単離収率は１６．９ｍｇ（４７％）であった。
ＩＬ１８－Ｓｅｇ３４の調製：ペプチドケト酸ＩＬ１８－Ｓｅｇ３（５４．６ｍｇ、１０．９μｍｏｌ、１．０当量）およびヒドロキシルアミンペプチドＩＬ１８－Ｓｅｇ４（６６．８ｍｇ、１３．１μｍｏｌ、１．２当量）を、０．１Ｍシュウ酸（５４６μＬ）を含有する９：１のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏに溶解した。非常に均質な液体溶液を得て、６０℃で一晩優しく撹拌した。ライゲーション反応の完了後、混合物をＤＭＳＯ（１０９２μＬ）で希釈した。ジエチルアミン（８２μＬ、５％、ｖ／ｖ）の添加によりＦｍｏｃ脱保護を開始し、室温で１５分間優しく撹拌した。ジエチルアミン（８２μＬ）の第２ＤＭＳＯ（１６３８μＬ）溶液を反応混合物に添加し、室温でさらに１５分間優しく撹拌した。ゲルが生じることを予想した。トリフルオロ酢酸（２００μＬ）を添加して反応混合物を中和した。均質で無色の液体溶液を得て、これをさらに、ＴＦＡ（０．１％、ｖ／ｖ）を有する１：１のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｑ．ｓ．１７ｍＬ）で希釈した。反応混合物を分取ＨＰＬＣに直接注入した。粗製のライゲートされたペプチド溶液を濾過した後、Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ－Ｃ１８ １１０Åカラム（５μｍ、２５０×５０ｍｍ）を用いて、流速４０ｍＬ／分、４０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０％～５０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、精製した。反応混合物を分取ＨＰＬＣに直接注入した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、ＩＬ１８－Ｓｅｇ３４を白色固形物として得た。単離収率は６０．１ｍｇ（５６％）であった。ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ４３９Ｈ６８４Ｎ１１４Ｏ１３８Ｓ２；算出した平均同位体９８３１．０８１０Ｄａ［Ｍ］；ｆｏｕｎｄ：９８３０．９４３９Ｄａ。
Ａｃｍを有するＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４の調製：ペプチドケト酸ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２（１６．１ｍｇ、１．９７μｍｏｌ、１．２当量）およびヒドロキシルアミンペプチドＩＬ１８－Ｓｅｇ３４（１６．１ｍｇ、１．６４μｍｏｌ、１．０当量）を、０．１Ｍシュウ酸（１１０μＬ）を含有する９：１のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏに溶解した。均質な液体溶液を得て、６０℃で一晩反応させた。ライゲーション反応の完了後、混合物を先ずＤＭＳＯ（１８９０μＬ）で希釈した。混合物を、ＴＦＡ（０．１％、ｖ／ｖ）を含有する１：１のＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ（ｑ．ｓ．８ｍＬ）でさらに希釈した。反応混合物を濾過し、分取ＨＰＬＣに注入した。Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ－Ｃ１８ １１０Åカラム（５μｍ、２５０×５０ｍｍ）を用いて、流速４０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は３０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～６０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製のライゲートされたペプチドを精製した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２を純度９８％超の白色固形物として得た。単離収率は１０．０ｍｇ（３３％）であった。
表４に、本明細書で提供される方法により調製され得る修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを示す。
実施例４Ａ － 配列番号４２における修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの合成
配列番号４２の修飾直鎖ＩＬ－１８ポリペプチドを後述のプロトコルに従い調製した。
セグメント１Ａ（ＩＬ１８（１－２９）－Ｐｈｅ－α－ケト酸：Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－保護－α－ケト酸１の事前充填を、Ｆｍｏｃ－リンクアミドＭＢＨＡレジンで実施した。レジン５ｇ（充填：０．５６ｍｍｏｌ／ｇ、２．８ｍｍｏｌのスケール）をＤＭＦ中、２０分かけて膨張させた。レジンを２０％４－メチルピペリジンのＤＭＦ（ｖ／ｖ）溶液により室温で１０分間、２回処理し、ＤＭＦで数回洗浄した。ケト酸１（１．７ｇ、２．１ｍｍｏｌ、０．７５当量）およびＨＡＴＵ（８００ｍｇ、２．１ｍｍｏｌ、０．７５当量）をＤＭＦ（１５ｍＬ）に溶解した。ＤＩＰＥＡ（７３０μＬ、４．２ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加することで、事前活性化を室温で３分間実施した。反応混合物を膨張されたレジンに添加し、室温で３時間優しく撹拌した。レジンをＤＭＦで徹底的にすすいだ。無水酢酸（２．１ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（３．９ｍＬ）のＤＭＦ（１５ｍＬ）溶液を添加し、反応物を室温で１５分間優しく撹拌することで、レジン上の未反応アミンのキャッピングを開始した。レジンをＤＣＭ、続いてジエチルエーテルで徹底的にすすぎ、乾燥した。レジンの充填量を測定した（０．２７ｍｍｏｌ／ｇ）。
ＩＬ１８（１－２９）－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメントを、置換容量が約０．２７ｍｍｏｌ／ｇのＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－光保護－α－ケト酸（７４１ｍｇ）を事前に充填したリンクアミドＭＢＨＡレジン上、０．２ｍｍｏｌスケールで合成した。
ＩＬ１８（１－２９）－Ｐｈｅ－α－ケト酸の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：Ｆｍｏｃアミノ酸のＤＭＦ（２．０ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液、ＯｘｙｍａＰｕｒｅのＤＭＦ（２ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液、およびＤＩＣのＤＭＦ（２ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液をレジンに添加することで、カップリング反応を室温で３０分間実施した。１４位から１位では、二重カップリングが必要であった。２０％（ｖ／ｖ）無水酢酸のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液およびＮＭＭのＤＭＦ（０．８Ｍ、２．０ｍＬ）溶液を添加することで、各アミノ酸に対してキャッピングを室温で６分間実施した。Ｃｌ－ＨＯＢｔ（０．１Ｍ）を含有する２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護反応を室温で８分間実施した。
レジンをＤＣＭで洗浄し、真空下で乾燥した。乾燥したペプチジルレジンの質量は３．４ｇであった。ＴＦＡ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏの９５：２．５：２．５混合物（１０ｍＬ／ｇレジン）を使用し、レジンからペプチドを室温で２．０時間かけて切断した。レジンを切断カクテルから濾過して取り除き、濾液を濃縮し、冷ジエチルエーテル（２０℃）で２０倍希釈し、ペプチドを沈殿させた。遠心分離後、エーテル層を慎重にデカントし、ペプチド沈殿物をジエチルエーテル中で再懸濁し、トリチュレートし、遠心分離した。エーテル洗浄を２回繰り返し、得られたペプチド沈殿物を乾燥した。粗製ペプチドの質量は１．０７ｇであった。Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ ＵＧ８０ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）を用いて、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～６０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製ＩＬ１８（１－２９）－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメント１Ａの精製を実施した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、ＩＬ１８（１－２９）－Ｐｈｅ－α－ケト酸（ＩＬ１８－Ｓｅｇ１）を純度９０％超の白色固形物として得た。レジンの充填に基づく単離収率は３４８ｍｇ（２９％）であった。ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ１６４Ｈ２６０Ｎ４４Ｏ４４；算出した平均同位体３５５１．９５１７Ｄａ［Ｍ］；ｆｏｕｎｄ：３５５１．９６４４Ｄａ［Ｍ］。
セグメント２Ａ（Ｏｐｒ－ＩＬ１８（３２－６１）－Ｖａｌ－光保護－α－ケト酸）：Ｆｍｏｃ－Ｖａｌ－光保護－α－ケト酸２の事前充填を、Ｆｍｏｃ－リンク－アミドＭＢＨＡレジンで実施した。レジン３．０５ｇ（充填：０．５６ｍｍｏｌ／ｇ、１．７１ｍｍｏｌのスケール）をＤＭＦ中、２０分かけて膨張させた。ケト酸２（１．０ｇ、１．２８ｍｍｏｌ、０．７５当量）およびＨＡＴＵ（４８７ｍｇ、１．２８ｍｍｏｌ、０．７５当量）をＤＭＦ（１０ｍＬ）に溶解した。ＮＭＭ（２８０μＬ、２．５６ｍｍｏｌ、１．５当量）を添加することで、事前活性化を室温で２分間実施した。反応混合物を膨潤されたレジンに添加し、室温で１５時間優しく撹拌した。レジンをＤＭＦで徹底的にすすいだ。無水酢酸（１．２９ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（２．３８ｍＬ）のＤＭＦ（１０ｍＬ）溶液を添加し、混合物を室温で１５分間優しく撹拌することで、レジン上の未反応アミンのキャッピングを開始した。レジンをＤＣＭとジエチルエーテルで徹底的にすすぎ、乾燥した。レジンの充填量を測定した（０．３０７ｍｍｏｌ／ｇ）。
Ｏｐｒ－ＩＬ１８（３２－６１）－Ｖａｌ－光保護－α－ケト酸セグメントを、置換容量が約０．３０７ｍｍｏｌ／ｇのＦｍｏｃ－Ｖａｌ－光保護－α－ケト酸を事前に充填したリンクアミドＭＢＨＡレジン上、０．２ｍｍｏｌスケールで合成した。
６１位から５６位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：Ｆｍｏｃアミノ酸のＤＭＦ（２．０ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液、ＯｘｙｍａＰｕｒｅのＤＭＦ（２ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液、およびＤＩＣのＤＭＦ（２ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液をレジンに添加することで、カップリング反応を室温で３０分間実施した。２０％（ｖ／ｖ）無水酢酸のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液およびＮＭＭのＤＭＦ（０．８Ｍ、２．０ｍＬ）溶液を添加することで、各アミノ酸に対してキャッピングを室温で６分間実施した。２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護反応を室温で８分間実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨ（３２２ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、１．２ｍｍｏｌ、６当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温の３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。
５３位から５１位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：配列の始めに対して上記で言及したのと同じ条件を用いて、カップリング反応を実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｉｌｅ－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｉｌｅ－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨ（２８８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、１．２ｍｍｏｌ、６当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温の３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。
４８位から３７位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：上述の条件を用いてカップリング反応を実施した。各位置には二重カップリングが必要であった。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨ（３２２ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、１．２ｍｍｏｌ、６当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温の３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。
３４位から３２位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：上述の条件を用いてカップリング反応を実施した。各位置には二重カップリングが必要であった。
次いで、Ｂｏｃ－５－（Ｓ）－オキサプロリンの手動カップリングを実施した。Ｂｏｃ－５－（Ｓ）－オキサプロリン（１３０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、１．２ｍｍｏｌ、６当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温で３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。レジンをＤＣＭとジエチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥した。乾燥したペプチジルレジンの質量は１．２ｇであった。
ＴＦＡ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏの９５：２．５：２．５混合物（１０ｍＬ／ｇレジン）を使用し、室温で２．０時間優しく撹拌して、レジンからペプチドを切断した。レジンを切断カクテルから濾過して取り除き、濾液を濃縮し、冷ジエチルエーテル（２０℃）で２０倍希釈し、ペプチドを沈殿させた。遠心分離後、エーテル層を慎重にデカントし、ペプチド沈殿物をジエチルエーテル中で再懸濁し、トリチュレートし、遠心分離した。エーテル洗浄を２回繰り返し、得られたペプチド沈殿物を乾燥した。粗製ペプチドの質量は５２０ｍｇであった。Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ ＵＧ８０ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）を用いて、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～７０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製Ｏｐｒ－ＩＬ１８（３２－６１）－Ｖａｌ－光保護－α－ケト酸セグメント２Ａの精製を実施した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、Ｏｐｒ－ＩＬ１８（３２－６１）－Ｖａｌ－光保護－α－ケト酸（ＩＬ１８－Ｓｅｇ２）を純度９５％超の白色固形物として得た。レジンの充填に基づく単離収率は２００ｍｇ（２４％）であった。Ｃ１６６Ｈ２５９Ｎ４５Ｏ５７Ｓ；算出した平均同位体：３８２８．８５２７Ｄａ［Ｍ］；ｆｏｕｎｄ：３８２９．１１１６Ｄａ［Ｍ］。
セグメント３Ａ（Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（６４－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸）：レジン４８８ｍｇ（充填：０．４０ｍｍｏｌ／ｇ、０．２ｍｍｏｌのスケール）をＤＭＦ中、１５分かけて膨張させた。ケト酸１（３２６ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ、２当量）およびＨＡＴＵ（１５２ｍｇ、０．４ｍｍｏｌ、６当量）をＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解した。ＤＩＰＥＡ（１７４μＬ、１ｍｍｏｌ、５当量）を添加することで、事前活性化を室温で２分間実施した。反応混合物を膨張したレジンに添加した。反応物を室温で３時間かけて優しく撹拌した。レジンをＤＭＦで徹底的にすすいだ。無水酢酸（２００μＬ）とＤＩＰＥＡ（２００μＬ）のＤＭＦ（５ｍＬ）溶液を添加することで、レジン上で未反応のアミンのキャッピングを開始した。反応物を室温で１５分間優しく撹拌した。レジンをＤＭＦで徹底的にすすいだ。レジンの最終充填は算出せず、変化なし（０．４０ｍｍｏｌ／ｇ）と推定した。
Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（６４－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメントを、置換容量が約０．４０ｍｍｏｌ／ｇのＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－保護－α－ケト酸を事前に充填したリンクアミドＣｈｅｍＭａｔｒｉｘｃ（著作権）レジン上、０．２ｍｍｏｌスケールで合成した。
９６位から１１４位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：Ｆｍｏｃアミノ酸のＤＭＦ（２．０ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液、ＯｘｙｍａＰｕｒｅのＤＭＦ（２ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液、およびＤＩＣのＤＭＦ（２ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液をレジンに添加することで、カップリング反応を室温で３０分間実施した。各位置には二重カップリングが必要であった。２０％（ｖ／ｖ）無水酢酸のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液およびＮＭＭのＤＭＦ（０．８Ｍ、２．０ｍＬ）溶液を添加することで、各アミノ酸に対してキャッピングを室温で６分間実施した。２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護反応を室温で８分間実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｔｈｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｔｈｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨ（３３２ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、１．２ｍｍｏｌ、６当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温の３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。
７３位から９３位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：上述の条件を用いてカップリング反応を実施した。各位置には二重カップリングが必要であった。Ｃｌ－ＨＯＢｔ（０．１Ｍ）を含有する２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護反応を室温で８分間実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｉｌｅ－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｉｌｅ－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨ（２８８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、１．２ｍｍｏｌ、６当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温の３分間の事前活性化）、レジンに添加した。これを室温で２時間反応させた。
６４位から７０位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：７３位から９３位に使用したのと同じ条件を用いてカップリング反応を実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－５－（Ｓ）－オキサプロリンの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－５－（Ｓ）－オキサプロリン（２０４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、０．６ｍｍｏｌ、６当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温で３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。レジンをＤＣＭで洗浄し、真空下で乾燥した。乾燥したペプチジルレジンの質量は２．０ｇであった。ＴＦＡ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏの９５：２．５：２．５混合物（１０ｍＬ／ｇレジン）中、レジンを室温で２．０時間撹拌することで、レジンからペプチドを切断した。レジンを切断カクテルから濾過して取り除き、濾液を濃縮し、冷ジエチルエーテル（２０℃）で２０倍希釈し、ペプチドを沈殿させた。遠心分離後、エーテル層を慎重にデカントし、ペプチド沈殿物をジエチルエーテル中で再懸濁し、トリチュレートし、遠心分離した。エーテル洗浄を２回繰り返し、得られたペプチド沈殿物を乾燥した。粗製ペプチドの質量は１．０５ｇであった。Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）を用いて、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～４５％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（６４－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメント３Ａの精製を実施した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（６４－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸（ＩＬ１８－Ｓｅｇ３）を純度９５％超の白色固形物として得た。レジンの充填に基づく単離収率は３５０ｍｇ（２７．１％）であった。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）：Ｃ２９２Ｈ４５３Ｎ７３Ｏ８８Ｓ２；算出した平均同位体：６４５８．３７９０Ｄａ［Ｍ］；ｆｏｕｎｄ：６４５９．４７６Ｄａ［Ｍ＋Ｈ＋］。
セグメント４Ａ（Ｏｐｒ－ＩＬ１８（１１７－１５７））：Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨの事前充填を、Ｆｍｏｃ－リンク－アミドＭＢＨＡレジンで実施した。レジン４ｇ（充填：０．５６ｍｍｏｌ／ｇ、２．２４ｍｍｏｌのスケール）をＤＭＦ中、１５分かけて膨張させた。レジンを２０％ＤＭＦ（ｖ／ｖ）溶液により、室温で２０分間処理した。レジンをＤＭＦで数回洗浄した。Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨ（６９１ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ、０．７５当量）およびＨＡＴＵ（６３８ｍｇ、１．６８ｍｍｏｌ、０．７５当量）をＤＭＦ（１２ｍＬ）に溶解した。ＤＩＰＥＡ（５８５μＬ、４．４８ｍｍｏｌ、２当量）を添加することで、事前活性化を室温で３分間実施した。反応混合物を膨張されたレジンに添加し、室温で一晩かけて優しく撹拌した。レジンをＤＭＦで徹底的にすすいだ。無水酢酸（１．１７ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（２．３４ｍＬ）のＤＭＦ（１２ｍＬ）溶液を添加し、混合物を室温で１５分間優しく撹拌することで、レジン上の未反応アミンのキャッピングを開始した。レジンをＤＣＭで徹底的にすすぎ、乾燥した。レジンの充填量を測定した（０．３４ｍｍｏｌ／ｇ）。
Ｏｐｒ－ＩＬ１８（１１７－１５７）セグメントを、置換容量が約０．３４ｍｍｏｌ／ｇのＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨを事前に充填したリンクアミドＭＢＨＡレジン上で合成した。レジン２９４ｍｇをＤＭＦ中で１５分間かけて膨張させた。
１４７位から１５７位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：Ｆｍｏｃアミノ酸のＤＭＦ（１．０ｍＬ、０．５Ｍ、５当量）溶液、ＨＣＴＵのＤＭＦ（１．０ｍＬ、０．４８Ｍ、４．８当量）溶液、およびＤＩＰＥＡのＮＭＰ（０．４ｍＬ、０．２Ｍ、８当量）をレジンに添加することで、カップリング反応を室温で３０分間実施した。２０％（ｖ／ｖ）ピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護を室温で１５分間実施した。１１７位から１４６位では二重カップリング、ならびにキャッピング工程が必要であった。２０％（ｖ／ｖ）無水酢酸のＤＭＦ（１ｍＬ）溶液およびＤＩＰＥＡのＤＭＦ（０．２Ｍ、１ｍＬ）溶液を添加することで、各位置におけるキャッピングを室温で１０分間実施した。
次いで、Ｂｏｃ－５－（Ｓ）－オキサプロリンの手動カップリングを実施した。Ｂｏｃ－５－（Ｓ）－オキサプロリン（６５ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（１１４ｍｇ、０．３ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（１００μＬ、０．６ｍｍｏｌ、６当量）の３ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温で３分間の事前活性化）、レジンに添加した。混合物を室温で２時間反応させた。
レジンをＤＣＭで洗浄し、真空下で乾燥した。乾燥したペプチジルレジンの質量は１．２ｇであった。ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏの９２．５：２．５：２．５：２．５混合物（１０ｍＬ／ｇレジン）を使用し、レジンからペプチドを室温で２時間かけて切断した。レジンを切断カクテルから濾過して取り除き、濾液を濃縮し、冷ジエチルエーテル（２０℃）で２０倍希釈し、ペプチドを沈殿させた。遠心分離後、エーテル層を慎重にデカントし、ペプチド沈殿物をジエチルエーテル中で再懸濁し、トリチュレートし、遠心分離した。エーテル洗浄を２回繰り返し、得られたペプチド沈殿物を乾燥した。粗製ペプチドの質量は７７０ｍｇであった。Ｇｅｍｉｎｉ ＮＸ－Ｃ１８ １１０Åカラム（５μｍ、２５０×５０ｍｍ）を用いて、流速４０ｍＬ／分、４０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～５０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（１１７－１５７）セグメント４Ａの精製を実施した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、Ｏｐｒ－ＩＬ１８（１１７－１５７）（ＩＬ１８－Ｓｅｇ４）を白色固形物として得た。レジンの充填に基づく単離収率は１０６ｍｇ（２１％）であった。ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ２２２Ｈ３４６Ｎ５６Ｏ７３Ｓ；算出した平均同位体４９９８．４８６１Ｄａ［Ｍ］；ｆｏｕｎｄ：４９９９．５１２６Ｄａ［Ｍ］。
ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２Ａの調製：ペプチドケト酸ＩＬ１８－Ｓｅｇ１（８０．８ｍｇ、２２．８μｍｏｌ、１．２当量）およびヒドロキシルアミンペプチドＩＬ１８－Ｓｅｇ２（７２．６ｍｇ、１９μｍｏｌ、１．０当量）を、０．１Ｍシュウ酸（９５０μＬ）を含有する９．７５：０．２５のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ溶液に溶解した。均質な液体溶液を得た。ライゲーションバイアルをアルミホイルで包んで光を遮り、６０℃で一晩優しく撹拌した。ライゲーションの完了後、混合物をＤＭＳＯ（３５５０μＬ）で希釈し、３６５ｎｍの波長を３時間照射することで、Ｃ末端ケト酸の光脱保護を可能とした。混合物を、ＴＦＡ（０．１％、ｖ／ｖ）を有する１：１のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｑ．ｓ．１０ｍＬ）でさらに希釈した。反応混合物を濾過し、分取ＨＰＬＣに注入した。Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ ＵＧ８０ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×５０ｍｍ）を使用し、流速４０ｍＬ／分、６０℃で、勾配は３０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する２０％～５０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製のライゲートされたペプチドを精製した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２Ａを純度９８％超の白色固形物として得た。単離収率は６６．１ｍｇ（４８％）であった。ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ３２１Ｈ５０６Ｎ８８Ｏ９６Ｓ；算出したｍ／ｚ：７１２９．７２４８Ｄａ［Ｍ］；ｆｏｕｎｄ ７１２９．７１７７Ｄａ［Ｍ］。
ＩＬ１８－Ｓｅｇ３４Ａの調製：ペプチドケト酸ＩＬ１８－Ｓｅｇ３（２８ｍｇ、４．４μｍｏｌ、１．１当量）およびヒドロキシルアミンペプチドＩＬ１８－Ｓｅｇ４（２０ｍｇ、４μｍｏｌ、１当量）を、０．１Ｍシュウ酸（２００μＬ）を含有する９７．５２．５のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏに溶解した。非常に均質な液体溶液を得て、６０℃で一晩優しく撹拌した。ライゲーション反応の完了後、混合物をＤＭＳＯ（４００μＬ）で希釈した。ジエチルアミン（３０μＬ、５％、ｖ／ｖ）の添加によりＦｍｏｃ脱保護を開始し、室温で１５分間優しく撹拌した。ジエチルアミン（３０μＬ）の第２ＤＭＳＯ（６００μＬ）溶液を反応混合物に添加し、室温でさらに１５分間優しく撹拌した。ゲルが生じることを予想した。トリフルオロ酢酸（１００μＬ）を添加して反応混合物を中和した。均質で無色の液体溶液を得て、これをさらに、ＴＦＡ（０．１％、ｖ／ｖ）を有する１：２のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｑ．ｓ．１０ｍＬ）で希釈した。反応混合物を分取ＨＰＬＣに直接注入した。粗製のライゲートされたペプチド溶液を濾過した後、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）を用いて、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～４５％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、精製した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、ＩＬ１８－Ｓｅｇ３４Ａを純度９７％超の白色固形物として得た。単離収率は２０ｍｇ（４５％）であった。ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ４９８Ｈ７８９Ｎ１２９Ｏ１５７Ｓ３；算出した平均同位体１１１９０．７０４４Ｄａ［Ｍ］；ｆｏｕｎｄ：１１１９０．７３４１Ｄａ［Ｍ］。
ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４Ａ－Ａｃｍの調製：ペプチドケト酸ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２（７．５ｍｇ、１．１μｍｏｌ、１．０当量）およびヒドロキシルアミンペプチドＩＬ１８－Ｓｅｇ３４（１３ｍｇ、１．２μｍｏｌ、１．１当量）を、０．１Ｍシュウ酸（６９μＬ）を含有する９７．５：２．５のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏに溶解した。均質な液体溶液を得て、６０℃で一晩反応させた。ライゲーション反応の完了後、混合物を先ずＤＭＳＯ（１４０μＬ）で希釈した。混合物を、ＴＦＡ（０．１％、ｖ／ｖ）を含有する１：１のＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ（ｑ．ｓ．１０ｍＬ）でさらに希釈した。反応混合物を濾過し、分取ＨＰＬＣに注入した。Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）を用いて、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～４５％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製のライゲートされたペプチドを精製した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４Ａ－Ａｃｍを純度９２％超の白色固形物として得た。単離収率は５．４５ｍｇ（２６％）であった。ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ８１５Ｈ７８９Ｎ１２９Ｏ１５７Ｓ３；算出した平均同位体：１８２７７．４４１８Ｄａ［Ｍ］；ｆｏｕｎｄ：１８２７８．５３９４Ｄａ。
ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４Ａ直鎖タンパク質の調製：直鎖タンパク質の転位：ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４Ａ－Ａｃｍ（３．６１ｍｇ、０．１９８μｍｏｌ）を、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（１．４ｍＬ、タンパク濃度１５μＭ）を含有する６Ｍ Ｇｕ・ＨＣｌ水溶液に溶解し、混合物を５０℃で２．５時間かけて優しく振盪した。転位反応の完了後、ＴＦＡ（０．１％、ｖ／ｖ）を含有する６Ｍ Ｇｕ・ＨＣｌ（ｑ．ｓ．１０ｍＬ）溶液で混合物を希釈した。反応混合物を濾過し、分取ＨＰＬＣに注入した。Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）を用いて、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～４５％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製の転位されたペプチドを精製した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４Ａ－Ａｃｍ－転位を純度９７％超の白色固形物として得た。単離収率は１．４１ｍｇ（３８％）であり、この材料はさらに特徴解析を行うことなくＡｃｍ脱保護工程に直接使用した。
Ａｃｍ脱保護：ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４Ａ－Ａｃｍ－転位（１．４１ｍｇ、０．０７７μｍｏｌ）を０．２５ｍＭ ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）（タンパク濃度３１０μＬ）に溶解し、この溶液に酢酸銀（３．１ｍｇ、１％、ｍ／ｖ）を添加した。混合物を５０℃で２．５時間振盪させ、光を遮った。反応の完了後、試料を、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１：２のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ混合物６ｍＬで希釈する。Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ ＵＧ８０ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）上、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～４５％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、試料を精製した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、０．７ｍｇのＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４Ａ直鎖タンパク質を純度９７％（収率５０％）の白色粉末として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ８０３Ｈ１２７５Ｎ２１３Ｏ２４７Ｓ４；算出した平均同位体：１７９９２．２９０８Ｄａ［Ｍ］；ｆｏｕｎｄ：１７９９３．３３４９Ｄａ［Ｍ］。
実施例４Ｂ － 配列番号２８における修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの合成
この変異体では、セグメント３を除くその他すべてのセグメントが、実施例４Ａに使用したものと同じである。
セグメント３Ｂ（Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（６４－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸）：Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（６４－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメントを、置換容量が約０．４０ｍｍｏｌ／ｇのＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－保護－α－ケト酸を事前に充填したリンクアミドＣｈｅｍＭａｔｒｉｘｃ（著作権）レジン上、０．２ｍｍｏｌスケールで合成した。
９６位から１１４位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：Ｆｍｏｃアミノ酸のＤＭＦ（２．０ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液、ＯｘｙｍａＰｕｒｅのＤＭＦ（２ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液、およびＤＩＣのＤＭＦ（２ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液をレジンに添加することで、カップリング反応を室温で３０分間実施した。各位置には二重カップリングが必要であった。２０％（ｖ／ｖ）無水酢酸のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液およびＮＭＭのＤＭＦ（０．８Ｍ、２．０ｍＬ）溶液を添加することで、各アミノ酸に対してキャッピングを室温で６分間実施した。２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護反応を室温で８分間実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｔｈｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｔｈｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨ（３３２ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、１．２ｍｍｏｌ、６当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温の３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。
７３位から９３位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：上述の条件を用いてカップリング反応を実施した。各位置には二重カップリングが必要であった。Ｃｌ－ＨＯＢｔ（０．１Ｍ）を含有する２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護反応を室温で８分間実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｉｌｅ－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｉｌｅ－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨ（２８８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、１．２ｍｍｏｌ、６当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温の３分間の事前活性化）、レジンに添加した。これを室温で２時間反応させた。２０％（ｖ／ｖ）無水酢酸のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液およびＮＭＭのＤＭＦ（０．８Ｍ、２．０ｍＬ）溶液を添加することで、キャッピングを室温で１０分間実施した。Ｃｌ－ＨＯＢｔ（０．１Ｍ）を含有する２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護反応を室温で１０分間実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ａｌｌｏｃ）－ＯＨの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｌｙｓ（ａｌｌｏｃ）－ＯＨ（２７２ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、１．２ｍｍｏｌ、６当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温で３分間の事前活性化）、レジンに添加した。これを室温で２時間反応させた。
６４位から６９位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：７３位から９３位に使用したのと同じ条件を用いてカップリング反応を実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－５－（Ｓ）－オキサプロリンの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－５－（Ｓ）－オキサプロリン（２０４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、０．６ｍｍｏｌ、６当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温で３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間撹拌した。
Ａｌｌｏｃ脱保護：レジンを乾燥ＤＣＭ中で１５分かけて膨張させた。Ｎ２でパージされた３ｍＬの乾燥ＤＣＭ中のフェニルシラン（５９５μＬ、４．８０ｍｍｏｌ、２４当量）の溶液、続いてＮ２でパージされた３ｍＬの乾燥ＤＣＭ中のパラジウム－テトラキス（トリフェニルホスフィン（１１６ｍｇ、１００μｍｏｌ、０．５当量）の溶液をレジンに添加し、これを室温で３０分間撹拌して放置した。レジンをＤＣＭとＤＭＦで数回洗浄した。
次いで、グルタル酸無水物の手動カップリングを実施した。グルタル酸無水物（１７２μＬ、２ｍｍｏｌ、１０当量）とＮＭＭ（２２０μＬ、２ｍｍｏｌ、１０当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液をレジンに添加し、これを室温で３０分間撹拌して放置した。レジンをＤＣＭとＤＭＦで数回洗浄した。
次いで、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ノナエチレングリコールの手動カップリングを実施した。ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）の３ｍＬ ＤＭＦ溶液をレジンに添加し、続いて市販で入手可能なＯ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ノナエチレングリコール（３３８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）の２ｍＬ ＤＭＦ溶液、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、０．６ｍｍｏｌ、６当量）の１ｍＬ ＤＭＦ溶液を添加した。次いで、レジンを室温で２時間撹拌した。
レジンをＤＣＭで洗浄し、真空下で乾燥した。乾燥したペプチジルレジンの質量は１．８１ｇであった。ＴＦＡ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏの９５：２．５：２．５混合物（１０ｍＬ／ｇレジン）中、レジンを室温で２時間撹拌することで、レジンからペプチドを切断した。レジンを切断カクテルから濾過して取り除き、濾液を濃縮し、冷ジエチルエーテル（２０℃）で２０倍希釈し、ペプチドを沈殿させた。遠心分離後、エーテル層を慎重にデカントし、ペプチド沈殿物をジエチルエーテル中で再懸濁し、トリチュレートし、遠心分離した。エーテル洗浄を２回繰り返し、得られたペプチド沈殿物を乾燥した。粗製ペプチドの質量は１．０８ｇであった。Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）を用いて、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～４５％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（６４－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメント３Ｂの精製を実施した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（６４－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸（ＩＬ１８－Ｓｅｇ３Ｂ）を純度９８％超の白色固形物として得た。レジンの充填に基づく単離収率は１２０ｍｇ（８．５％）であった。ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ３１９Ｈ５０３Ｎ７７Ｏ１００Ｓ２；ｆｏｕｎｄ：７０８１．０Ｄａ［Ｍ］。
ＩＬ１８－Ｓｅｇ３４Ｂの調製：ペプチドケト酸ＩＬ１８－Ｓｅｇ３Ｂ（３１ｍｇ、４．４μｍｏｌ、１．１当量）およびヒドロキシルアミンペプチドＩＬ１８－Ｓｅｇ４Ａ（２０ｍｇ、４μｍｏｌ、１当量）を、０．１Ｍシュウ酸（２００μＬ）を含有する９７．５：２．５のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏに溶解した。非常に均質な液体溶液を得て、６０℃で一晩優しく撹拌した。ライゲーション反応の完了後、混合物をＤＭＳＯ（２００μＬ）で希釈し、ＴＦＡ（０．１％、ｖ／ｖ）を有する１：１のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｑ．ｓ．１０ｍＬ）でさらに希釈した。反応混合物を分取ＨＰＬＣに直接注入した。粗製のライゲートされたペプチド溶液を濾過した後、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）を用いて、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～４５％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、精製した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、３０．３ｍｇのＦｍｏｃ保護ＩＬ１８－Ｓｅｇ３４Ｂを純度９８％超の白色固形物として得た。
Ｆｍｏｃ保護ＩＬ１８－Ｓｅｇ３４Ｂを３００μＬのＤＭＳＯに溶解した。ジエチルアミン（１５μＬ、５％、ｖ／ｖ）を添加することでＦｍｏｃ脱保護を開始し、室温で１５分間優しく撹拌した。ジエチルアミン（１５μＬ）の第２ＤＭＳＯ（３００μＬ）溶液を反応混合物に添加し、室温でさらに１５分間優しく撹拌した。ゲルが生じることを予想した。トリフルオロ酢酸（５０μＬ）を添加して反応混合物を中和した。均質で無色の液体溶液を得て、これをさらに、ＴＦＡ（０．１％、ｖ／ｖ）を有する１：１のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｑ．ｓ．１０ｍＬ）で希釈した。反応混合物を分取ＨＰＬＣに直接注入した。粗製のライゲートされたペプチド溶液を濾過した後、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）を用いて、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～４５％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、精製した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、ＩＬ１８－Ｓｅｇ３４Ｂを純度９４％超の白色固形物として得た。単離収率は１２．５ｍｇ（２６％）であった。ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ５２５Ｈ８３９Ｎ１３３Ｏ１６９Ｓ３；ｆｏｕｎｄ：１１８１５．０Ｄａ［Ｍ］。
ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４Ｂ－Ａｃｍの調製：ペプチドケト酸ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２Ａ（７．２ｍｇ、１．０１μｍｏｌ、１．０当量）およびヒドロキシルアミンペプチドＩＬ１８－Ｓｅｇ３４Ｂ（１２．５ｍｇ、１．０６μｍｏｌ、１．０５当量）を、０．１Ｍシュウ酸（６８μＬ）を含有する９７．５：２．５のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏに溶解した。均質な液体溶液を得て、６０℃で一晩反応させた。ライゲーション反応の完了後、混合物を先ずＤＭＳＯ（１５０μＬ）で希釈した。混合物を、ＴＦＡ（０．１％、ｖ／ｖ）を含有する２：１のＨ２Ｏ／ＣＨ３ＣＮ（ｑ．ｓ．１０ｍＬ）でさらに希釈した。反応混合物を濾過し、分取ＨＰＬＣに注入した。Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）を用いて、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～４５％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製のライゲートされたペプチドを精製した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４Ｂ－Ａｃｍを純度９８％超の白色固形物として得た。単離収率は５．８ｍｇ（３０．４％）であった。この材料はさらに特徴解析を行うことなく、転位工程に直接使用した。
ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４Ｂ直鎖タンパク質の調製： 直鎖タンパク質の転位：ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４Ｂ－Ａｃｍ（５．８１ｍｇ、０．３０７μｍｏｌ）を、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（２．２ｍＬ、タンパク濃度１５μＭ）を含有する６Ｍ Ｇｕ・ＨＣｌ水溶液に溶解し、混合物を５０℃で２．５時間かけて優しく振盪した。転位反応の完了後、ＴＦＡ（０．１％、ｖ／ｖ）を含有する６Ｍ Ｇｕ・ＨＣｌ（ｑ．ｓ．１０ｍＬ）溶液で混合物を希釈した。反応混合物を濾過し、分取ＨＰＬＣに注入した。Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）を用いて、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～４５％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製の転位されたペプチドを精製した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４Ｂ－Ａｃｍ－転位を純度９０％超の白色固形物として得た。単離収率は１．２ｍｇ（２１％）であった。この材料はさらに特徴解析を行うことなく、Ａｃｍ脱保護工程に直接使用した。
Ａｃｍ脱保護：ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４Ｂ－Ａｃｍ－転位（１．２ｍｇ、０．０６３μｍｏｌ）を０．２０ｍＭ ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）（タンパク濃度３２０μＬ）に溶解し、この溶液に酢酸銀（３．２ｍｇ、１％、ｍ／ｖ）を添加した。混合物を５０℃で２．５時間振盪させ、光を遮った。反応の完了後、試料を、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１：２のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ混合物６ｍＬで希釈する。Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ ＵＧ８０ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）上、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～４５％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、試料を精製した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、０．２ｍｇのＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４Ｂ直鎖タンパク質を純度８６％（収率２０％）の白色粉末として得た。ＭＳ（ＥＳＩ）：Ｃ８３０Ｈ１３２５Ｎ２１７Ｏ２５９Ｓ４；Ｍａｓｓ ｆｏｕｎｄ：１８６１７．００Ｄａ［Ｍ＋Ｈ＋］。
実施例４Ｃ － 配列番号６３における修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの合成
以下のプロトコルを使用して配列番号６３における修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを調製し、残基６８は、アジド官能性を含むように修飾されたアスパルテート残基を含む。この変異体では、セグメント１Ａは実施例４Ａで使用したものと同じである。
セグメント２Ｂ（Ｏｐｒ－ＩＬ１８（３２－６１）－Ｖａｌ－光保護－α－ケト酸）：Ｏｐｒ－ＩＬ１８（３２－６１）－Ｖａｌ－光保護－α－ケト酸セグメントＢを、置換容量が約０．３０７ｍｍｏｌ／ｇのＦｍｏｃ－Ｖａｌ－光保護－α－ケト酸を事前に充填したリンクアミドＭＢＨＡレジン上、０．２ｍｍｏｌスケールで合成した。
６１位での自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：Ｆｍｏｃアミノ酸のＤＭＦ（２．０ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液、ＯｘｙｍａＰｕｒｅのＤＭＦ（２ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液、およびＤＩＣのＤＭＦ（２ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液をレジンに添加することで、カップリング反応を室温で３０分間実施した。２０％（ｖ／ｖ）無水酢酸のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液およびＮＭＭのＤＭＦ（０．８Ｍ、２．０ｍＬ）溶液を添加することで、キャッピングを室温で６分間実施した。２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護反応を室温で８分間実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリンの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリン（１７７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、２．５当量）、ＨＡＴＵ（１９０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、２．５当量）、およびＤＩＰＥＡ（１７４μＬ、１．０ｍｍｏｌ、５当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温で３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。無水酢酸（１５０μＬ、１．６ｍｍｏｌ、８当量）とＤＩＰＥＡ（２７８μＬ、１．６ｍｍｏｌ、８当量）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液を室温で１０分かけて添加することで、キャッピングを室温で実施した。２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護反応を室温で１０分間実施した。
５９位から５６位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：Ｆｍｏｃアミノ酸のＤＭＦ（２．０ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液、ＯｘｙｍａＰｕｒｅのＤＭＦ（２ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液、およびＤＩＣのＤＭＦ（２ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液をレジンに添加することで、カップリング反応を室温で３０分間実施した。２０％（ｖ／ｖ）無水酢酸のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液およびＮＭＭのＤＭＦ（０．８Ｍ、２．０ｍＬ）溶液を添加することで、各アミノ酸に対してキャッピングを室温で６分間実施した。２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護反応を室温で８分間実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨ（３２２ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、１．２ｍｍｏｌ、６当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温の３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。
５３位から５２位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：配列の始めに対して上記で言及したのと同じ条件を用いて、カップリング反応を実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリンの手動カップリングを実施した。前述と同じ条件を用いて、Ｆｍｏｃ－Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリンの手動カップリングを実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｉｌｅ－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｉｌｅ－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨ（２８８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、１．２ｍｍｏｌ、６当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温で３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。
４８位から３７位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：上述の条件を用いてカップリング反応を実施した。各位置には二重カップリングが必要であった。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨ（３２２ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、１．２ｍｍｏｌ、６当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温の３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。
３４位での自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：上述の条件を用いてカップリング反応を実施した。二重カップリングが必要であった。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリンの手動カップリングを実施した。前述と同じ条件を用いて、Ｆｍｏｃ－Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリンの手動カップリング反応を実施した。
３２位での自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：上述の条件を用いてカップリング反応を実施した。二重カップリングが必要であった。
次いで、Ｂｏｃ－５－（Ｓ）－オキサプロリンの手動カップリングを実施した。Ｂｏｃ－５－（Ｓ）－オキサプロリン（１３０ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、１．２ｍｍｏｌ、６当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温で３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。レジンをＤＣＭとジエチルエーテルで洗浄し、真空下で乾燥した。乾燥したペプチジルレジンの質量は１．４ｇであった。
ＴＦＡ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏの９５：２．５：２．５混合物（１０ｍＬ／ｇレジン）を使用し、室温で２．０時間優しく撹拌して、レジンからペプチドを切断した。レジンを切断カクテルから濾過して取り除き、濾液を濃縮し、冷ジエチルエーテル（２０℃）で２０倍希釈し、ペプチドを沈殿させた。遠心分離後、エーテル層を慎重にデカントし、ペプチド沈殿物をジエチルエーテル中で再懸濁し、トリチュレートし、遠心分離した。エーテル洗浄を２回繰り返し、得られたペプチド沈殿物を乾燥した。粗製ペプチドの質量は９４０ｍｇであった。Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ ＵＧ８０ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）を用いて、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～７０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製Ｏｐｒ－ＩＬ１８（３２－６１）－Ｖａｌ－光保護－α－ケト酸セグメント２Ｃの精製を実施した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、Ｏｐｒ－ＩＬ１８（３２－６１）－Ｖａｌ－光保護－α－ケト酸（ＩＬ１８－Ｓｅｇ２）を純度９０％超の白色固形物として得た。レジンの充填に基づく単離収率は３４０ｍｇ（４０％）であった。Ｃ１６３Ｈ２５３Ｎ４５Ｏ６０Ｓ；算出した平均同位体：１２７８．６０２３Ｄａ［Ｍ＋３Ｈ＋］；ｆｏｕｎｄ：１２７８．６０２０Ｄａ［Ｍ＋３Ｈ＋］。
セグメント３Ｃ（Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（６４－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸）：Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（６４－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメントを、置換容量が約０．４０ｍｍｏｌ／ｇのＦｍｏｃ－Ｐｈｅ－保護－α－ケト酸を事前に充填したリンクアミドＣｈｅｍＭａｔｒｉｘｃ（著作権）レジン上、０．２ｍｍｏｌスケールで合成した。
１１４位での自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：Ｆｍｏｃアミノ酸のＤＭＦ（２．０ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液、ＯｘｙｍａＰｕｒｅのＤＭＦ（２ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液、およびＤＩＣのＤＭＦ（２ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液をレジンに添加することで、カップリング反応を室温で３０分間実施した。二重カップリングが必要であった。２０％（ｖ／ｖ）無水酢酸のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液およびＮＭＭのＤＭＦ（０．８Ｍ、２．０ｍＬ）溶液を添加することで、キャッピングを室温で６分間実施した。２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護反応を室温で８分間実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリンの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリン（１７７ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、２．５当量）、ＨＡＴＵ（１９０ｍｇ、０．５ｍｍｏｌ、２．５当量）、およびＤＩＰＥＡ（１７４μＬ、１．０ｍｍｏｌ、５当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温で３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。無水酢酸（１５０μＬ、１．６ｍｍｏｌ、８当量）とＤＩＰＥＡ（２７８μＬ、１．６ｍｍｏｌ、８当量）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液を室温で１０分かけて添加することで、キャッピングを室温で実施した。２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護反応を室温で１０分間実施した。
９６位から１１２位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：Ｆｍｏｃアミノ酸のＤＭＦ（２．０ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液、ＯｘｙｍａＰｕｒｅのＤＭＦ（２ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液、およびＤＩＣのＤＭＦ（２ｍＬ、０．４Ｍ、４当量）溶液をレジンに添加することで、カップリング反応を室温で３０分間実施した。各位置には二重カップリングが必要であった。２０％（ｖ／ｖ）無水酢酸のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液およびＮＭＭのＤＭＦ（０．８Ｍ、２．０ｍＬ）溶液を添加することで、各アミノ酸に対してキャッピングを室温で６分間実施した。２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護反応を室温で８分間実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｔｈｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ａｓｐ（ｔＢｕ）－Ｌ－Ｔｈｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨ（３３２ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、１．２ｍｍｏｌ、６当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温で３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。
８７位から９３位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：上述の条件を用いてカップリング反応を実施した。各位置には二重カップリングが必要であった。Ｃｌ－ＨＯＢｔ（０．１Ｍ）を含有する２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護反応を室温で８分間実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリンの手動カップリングを実施した。前述と同じ条件を用いて、Ｆｍｏｃ－Ｏ－メチル－Ｌ－ホモセリンの手動カップリング反応を実施した。
７３位から８５位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：８７位から９３位に使用したのと同じ条件を用いてカップリング反応を実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｉｌｅ－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ｌ－Ｉｌｅ－Ｌ－Ｓｅｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨ（２８８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、１．２ｍｍｏｌ、６当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温で３分間の事前活性化）、レジンに添加した。これを室温で２時間反応させた。
６９位から７０位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：７３位から８５位に使用したのと同じ条件を用いてカップリング反応を実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ａｌｌｏｃ）－ＯＨの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－Ａｓｐ（ａｌｌｏｃ）－ＯＨ（２３７ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、１．２ｍｍｏｌ、６当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温で３分間の事前活性化）、レジンに添加した。これを室温で２時間反応させた。
６４位から６７位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：６９位から７０位に使用したのと同じ条件を用いてカップリング反応を実施した。
次いで、Ｆｍｏｃ－５－（Ｓ）－オキサプロリンの手動カップリングを実施した。Ｆｍｏｃ－５－（Ｓ）－オキサプロリン（２０４ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、０．６ｍｍｏｌ、６当量）の６ｍＬ ＤＭＦ溶液を調製し（室温で３分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。
Ａｌｌｏｃ脱保護：レジンを乾燥ＤＣＭ中で１５分かけて膨張させた。Ｎ２でパージされた３ｍＬの乾燥ＤＣＭ中のフェニルシラン（５９５μＬ、４．８０ｍｍｏｌ、２４当量）の溶液、続いてＮ２でパージされた３ｍＬの乾燥ＤＣＭ中のパラジウム－テトラキス（トリフェニルホスフィン（１１６ｍｇ、１００μｍｏｌ、０．５当量）の溶液をレジンに添加し、これを室温で３０分間撹拌して放置した。レジンをＤＣＭとＤＭＦで数回洗浄した。
次いで、Ｏ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ノナエチレングリコールの手動カップリングを実施した。ＨＡＴＵ（２２８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）の３ｍＬ ＤＭＦ溶液をレジンに添加し、続いて市販で入手可能なＯ－（２－アミノエチル）－Ｏ’－（２－アジドエチル）ノナエチレングリコール（３３８ｍｇ、０．６ｍｍｏｌ、３当量）の２ｍＬ ＤＭＦ溶液、およびＤＩＰＥＡ（２０９μＬ、０．６ｍｍｏｌ、６当量）の１ｍＬ ＤＭＦ溶液を添加した。次いで、レジンを室温で２時間撹拌した。
レジンをＤＣＭで洗浄し、真空下で乾燥した。乾燥したペプチジルレジンの質量は２ｇであった。ＴＦＡ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏの９５：２．５：２．５混合物（１０ｍＬ／ｇレジン）中、レジンを室温で２．０時間撹拌することで、レジンからペプチドを切断した。レジンを切断カクテルから濾過して取り除き、濾液を濃縮し、冷ジエチルエーテル（２０℃）で２０倍希釈し、ペプチドを沈殿させた。遠心分離後、エーテル層を慎重にデカントし、ペプチド沈殿物をジエチルエーテル中で再懸濁し、トリチュレートし、遠心分離した。エーテル洗浄を２回繰り返し、得られたペプチド沈殿物を乾燥した。粗製ペプチドの質量は１．５ｇであった。Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）を用いて、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～５０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（６４－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸セグメント３Ｃの精製を実施した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、Ｆｍｏｃ－Ｏｐｒ－ＩＬ１８（６４－１１４）－Ｐｈｅ－α－ケト酸（ＩＬ１８－Ｓｅｇ３Ｃ）を純度８０％超の白色固形物として得た。レジンの充填に基づく単離収率は１０４ｍｇ（６％）であった。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）：Ｃ３１０Ｈ４８８Ｎ７６Ｏ１００Ｓ；算出６９０７．５１５７Ｄａ［Ｍ］；ｆｏｕｎｄ：６９０２．４９８０Ｄａ。
セグメント４Ｃ（Ｏｐｒ－ＩＬ１８（１１７－１５７））：配列番号６３－Ｓｅｇ４におけるＯｐｒ－ＩＬ１８（１１７－１５７）合成を、置換容量が約０．３５ｍｍｏｌ／ｇ（１．４３ｇ）のＦｍｏｃ－Ａｓｐ（ＯｔＢｕ）－ＯＨを事前に充填したリンクアミドＭＢＨＡレジン上、０．５ｍｍｏｌスケールで開始した。
１５３位から１５６位の手動Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：Ｆｍｏｃ保護アミノ酸（５．０当量、２．５ｍｍｏｌ）とＨＣＴＵ（４．８当量、２．４ｍｍｏｌ）をＮＭＰ（６．０ｍＬ）に溶解した。ＤＩＰＥＡ（０．５ｍＬ、２．２ｍｍｏｌ）を添加することで事前活性化を２分間実施した。反応混合物をレジンに注ぎ、人為的に優しく撹拌しながら４５分間反応させた。レジンをＤＭＦとＤＣＭで徹底的にすすいだ。無水酢酸（０．５ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（０．５ｍＬ）のＤＭＦ（６ｍＬ）溶液を添加することで、各位置においてキャッピングを室温で６分間実施した。Ｆｍｏｃ脱保護のため、レジンを２０％４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液で１回すすいだ。レジンを同じ溶液で１５分間、人為的に優しく撹拌しながら処理した。レジンをＤＭＦとＤＣＭで徹底的にすすいだ。
Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨの手動カップリング：Ｆｍｏｃ－Ｐｈｅ－Ｔｈｒ［Ψ（Ｍｅ，Ｍｅ）Ｐｒｏ］－ＯＨ（７９３ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、３．０当量）、ＨＡＴＵ（５７０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、３当量）、およびＤＩＰＥＡ（５００μ、２．９ｍｍｏｌ、５．８当量）の６ｍＬ ＮＭＰ溶液を調製し（室温で３．０分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。無水酢酸（０．５ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（０．５ｍＬ）のＤＭＦ（６ｍＬ）溶液を添加することで、各位置においてキャッピングを室温で６分間実施した。Ｆｍｏｃ脱保護のため、レジンを２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液で１回すすいだ。レジンを同じ溶液で１５分間、人為的に優しく撹拌しながら処理した。レジンをＤＭＦとＤＣＭで徹底的にすすいだ。
Ｆｍｏｃ－Ｏ－メチルホモセリンの手動カップリング：Ｆｍｏｃ－Ｈｓｅ（Ｍｅ）－ＯＨ（５３３ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、３．０当量）、ＨＡＴＵ（５７０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、３．０当量）、およびＤＩＰＥＡ（５００μＬ、２．９ｍｍｏｌ、５．８当量）の６ｍＬ ＮＭＰ溶液を調製し（室温で３．０分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。無水酢酸（０．５ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（０．５ｍＬ）のＤＭＦ（６ｍＬ）溶液を添加することで、各位置においてキャッピングを室温で６分間実施した。Ｆｍｏｃ脱保護のため、レジンを２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液で１回すすいだ。レジンを同じ溶液で１５分間、人為的に優しく撹拌しながら処理した。レジンをＤＭＦとＤＣＭで徹底的にすすいだ。
１４６位から１４９位の手動Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：１５１位から１５６位に使用したのと同じ条件を用いて、カップリング、アセチル化、および脱保護の反応を実施した。
Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－（Ｄｍｂ）Ｇｌｙ－ＯＨの手動カップリング：Ｆｍｏｃ－Ｌｅｕ－（Ｄｍｂ）Ｇｌｙ－ＯＨ（８４２ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、３．０当量）、ＨＡＴＵ（５７０ｍｇ、１．５ｍｍｏｌ、３．０当量）、およびＤＩＰＥＡ（５００μＬ、２．９ｍｍｏｌ、５．８当量）の６ｍＬ ＮＭＰ溶液を調製し（室温で３．０分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。無水酢酸（０．５ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（０．５ｍＬ）のＤＭＦ（６ｍＬ）溶液を添加することで、各位置においてキャッピングを室温で６分間実施した。Ｆｍｏｃ脱保護のため、レジンを２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液で１回すすいだ。レジンを同じ溶液で１５分間、人為的に優しく撹拌しながら処理した。レジンをＤＭＦとＤＣＭで徹底的にすすいだ。
配列番号６３ Ｓｅｇ４の合成を０．１５ｍｍｏｌスケールで継続した。
１２８位から１４３位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：Ｆｍｏｃアミノ酸のＤＭＦ（２．０ｍＬ、０．４Ｍ、５．３当量）溶液、ＨＣＴＵ（２ｍＬ、０．４Ｍ、５．３当量）、およびＮＭＭのＤＭＦ（２ｍＬ、０．８Ｍ、１０．７当量）溶液をレジンに添加することで、カップリング反応を室温で３０分間実施した。すべての位置で二重カップリングを実施した。２０％（ｖ／ｖ）無水酢酸のＤＭＦ（２ｍＬ）溶液およびＮＭＭのＤＭＦ（０．８Ｍ、２．０ｍＬ）溶液を添加することで、各アミノ酸に対してキャッピングを室温で６分間実施した。２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液を用いて、Ｆｍｏｃ脱保護反応を室温で１０分間実施した。
Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ－ＮＨａｌｌｏｃ）－ＯＨ３の手動カップリング：Ｆｍｏｃ－Ｃｙｓ（Ａｃｍ－ＮＨａｌｌｏｃ）－ＯＨ（３０８ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、５．０当量）、ＨＡＴＵ（２８５ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、５．０当量）、およびＤＩＰＥＡ（２１０μＬ、１．２ｍｍｏｌ、８当量）の４ｍＬ ＮＭＰ溶液を調製し（室温で５．０分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。無水酢酸（０．２ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（０．２ｍＬ）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液を添加することで、各位置においてキャッピングを室温で６分間実施した。Ｆｍｏｃ脱保護のため、レジンを２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液で１回すすいだ。レジンを同じ溶液で１５分間、人為的に優しく撹拌しながら処理した。レジンをＤＭＦとＤＣＭで徹底的にすすいだ。
１２３位から１２６位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：１２３位から１４３位に使用したのと同じ条件を用いて、カップリング、アセチル化、および脱保護の反応を実施した。
Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－（Ｄｍｂ）Ｇｌｙ－ＯＨの手動カップリング：Ｆｍｏｃ－Ｇｌｕ（ＯｔＢｕ）－（Ｄｍｂ）Ｇｌｙ－ＯＨ（４７５ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、５．０当量）、ＨＡＴＵ（３４２ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、５．０当量）、およびＤＩＰＥＡ（２１０μＬ、１．２ｍｍｏｌ、８当量）の４ｍＬ ＮＭＰ溶液を調製し（室温で５．０分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。無水酢酸（０．２ｍＬ）とＤＩＰＥＡ（０．２ｍＬ）のＤＭＦ（４ｍＬ）溶液を添加することで、各位置においてキャッピングを室温で６分間実施した。Ｆｍｏｃ脱保護のため、レジンを２０％（ｖ／ｖ）４－メチルピペリジンのＤＭＦ溶液で１回すすいだ。レジンを同じ溶液で１５分間、人為的に優しく撹拌しながら処理した。レジンをＤＭＦとＤＣＭで徹底的にすすいだ。
１１７位から１２０位の自動化Ｆｍｏｃ－ＳＰＰＳ：１２３位から１４３位に使用したのと同じ条件を用いて、カップリング、アセチル化、および脱保護の反応を実施した。
Ｂｏｃ－Ｏｐｒ－ＯＨの手動カップリング：Ｂｏｃ－Ｏｐｒ－ＯＨ（１６３ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、５．０当量）、ＨＡＴＵ（３４２ｍｇ、０．７５ｍｍｏｌ、５．０当量）、およびＤＩＰＥＡ（２１０μＬ、１．２ｍｍｏｌ、８当量）の４ｍＬ ＮＭＰ溶液を調製し（室温で５．０分間の事前活性化）、レジンに添加した。反応物を室温で２時間優しく撹拌した。レジンをＤＭＦとＤＣＭで徹底的にすすいだ。
残基１２７のＡｌｌｏｃ脱保護：窒素でパージしたＤＣＭ中、レジンを膨張させた。窒素でパージしたＤＣＭ（３ｍＬ）中のフェニルシラン（４４４μＬ、３．６ｍｍｏｌ、２４当量）の溶液をレジンに添加した。窒素でパージしたＤＣＭ（２ｍＬ）中のＰｄ（ＰＰｈ３）４（５８ｍｇ、０．０７５ｍｍｏｌ、０．５当量）の溶液を添加後、Ａｌｌｏｃ脱保護を行った。これを人為的に撹拌しながら室温で３０分間反応させた。次いで、３つのアルギニン残基で構成される可溶化Ｔａｇにより側鎖を官能化した。これらに対し、１２３位から１４３位で使用したのと同じ条件を用いて自動的にカップリングを行った。
ＴＦＡ／ＴＩＰＳ／ＤＯＤＴ／Ｈ２Ｏの９２．５：２．５：２．５：２．５混合物（１０ｍＬ／ｇレジン）を使用し、レジンからペプチドを室温で２時間かけて切断した。レジンを切断カクテルから濾過して取り除き、濾液を濃縮し、冷ジエチルエーテル（－２０℃）で２０倍希釈し、ペプチドを沈殿させた。遠心分離後、エーテル層を慎重にデカントし、ペプチド沈殿物をジエチルエーテル中で再懸濁し、トリチュレートし、遠心分離した。エーテル洗浄を２回繰り返し、得られたペプチド沈殿物を乾燥した。Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｐｒｏｔｅｏｎａｖｉカラム（５μｍ、２５０×５０ｍｍ）を用いて、流速４０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４５分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する５～５０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製セグメント４Ｃの精製を実施した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、セグメント４Ｃを白色固形物として得た。レジンの充填に基づく単離収率は１１６ｍｇ（１４％）であった。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）：Ｃ２３９Ｈ３８１Ｎ６９Ｏ７７Ｓ；算出した平均同位体５４８５．１４Ｄａ［Ｍ］；ｆｏｕｎｄ：５４８１．２８
ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２Ｃの調製：ペプチドケト酸ＩＬ１８－Ｓｅｇ１Ａ（５６．２ｍｇ、１５．８μｍｏｌ、１．２当量）およびヒドロキシルアミンペプチドＩＬ１８－Ｓｅｇ２Ｃ（５０．６ｍｇ、１３．２μｍｏｌ、１．０当量）を、０．１Ｍシュウ酸（６６０μＬ）を含有する９．７５：０．２５のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏ溶液に溶解した。非常に均質な液体溶液を得た。ライゲーションバイアルをアルミホイルで包んで光を遮り、６０℃で一晩優しく撹拌した。ライゲーションの完了後、混合物をＤＭＳＯ（１９２０μＬ）で希釈し、３６５ｎｍの波長を２時間照射することで、Ｃ末端ケト酸の光脱保護を可能とした。混合物を、ＴＦＡ（０．１％、ｖ／ｖ）を有する１：１のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｑ．ｓ．２０ｍＬ）でさらに希釈した。反応混合物を濾過し、分取ＨＰＬＣに注入した。Ｓｈｉｓｅｉｄｏ ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×５０ｍｍ）を使用し、流速４０ｍＬ／分、６０℃で、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０％～７０％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製のライゲートされたペプチドを精製した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２Ｃを純度９８％超の白色固形物として得た。単離収率は４０ｍｇ（４２％）であった。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）：Ｃ３２１Ｈ５０６Ｎ８８Ｏ９６Ｓ；算出した平均７１３１．６５１６Ｄａ［Ｍ］；ｆｏｕｎｄ：７１２５．８３４０。
ＩＬ１８－Ｓｅｇ３４Ｃの調製：ペプチドケト酸ＩＬ１８－Ｓｅｇ３Ｃ（２５ｍｇ、３．６μｍｏｌ、１．０当量）およびヒドロキシルアミンペプチドＩＬ１８－Ｓｅｇ４Ｃ（２２ｍｇ、４μｍｏｌ、１．１当量）を、０．１Ｍシュウ酸（１８０μＬ）を含有する９７．５：２．５のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏに溶解した。非常に均質な液体溶液を得て、６０℃で一晩優しく撹拌した。ライゲーション反応の完了後、混合物をＤＭＳＯ（３２０μＬ）で希釈し、ＴＦＡ（０．１％、ｖ／ｖ）を有する１：２のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｑ．ｓ．１０ｍＬ）でさらに希釈した。反応混合物を分取ＨＰＬＣに直接注入した。粗製のライゲートされたペプチド溶液を濾過した後、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）を用いて、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～４５％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、精製した。生成物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、８ｍｇのＦｍｏｃ保護ＩＬ１８－Ｓｅｇ３４Ｃを白色固形物として得た。
Ｆｍｏｃ保護ＩＬ１８－Ｓｅｇ３４ＣをＤＭＳＯ（２００μＬ）に溶解した。ジエチルアミン（１０μＬ、５％、ｖ／ｖ）の添加によりＦｍｏｃ脱保護を開始し、室温で１５分間優しく撹拌した。ジエチルアミン（１０μＬ）の第２ＤＭＳＯ（２００μＬ）溶液を反応混合物に添加し、室温でさらに１５分間優しく撹拌した。ゲルが生じることを予想した。トリフルオロ酢酸（４０μＬ）を添加して反応混合物を中和した。均質で無色の液体溶液を得て、これをさらに、ＴＦＡ（０．１％、ｖ／ｖ）を有する１：２のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ（ｑ．ｓ．１０ｍＬ）で希釈した。反応混合物を分取ＨＰＬＣに直接注入した。粗製のライゲートされたペプチド溶液を濾過した後、Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）を用いて、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～４５％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、精製した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、ＩＬ１８－Ｓｅｇ３４Ｃを純度９７％超の白色固形物として得た。単離収率は５．５ｍｇ（２６％）であった。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）：Ｃ５３０Ｈ８５４Ｎ１４４Ｏ１７２Ｓ２；算出した平均１２０５９．６２Ｄａ［Ｍ］；ｆｏｕｎｄ：１２１１９．５６［Ｍ＋付加物］。
ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４Ｃ直鎖タンパク質の調製：
最終ペプチドライゲーション：ペプチドケト酸ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２Ｃ（３．６ｍｇ、０．５μｍｏｌ、１．１当量）およびヒドロキシルアミンペプチドＩＬ１８－Ｓｅｇ３４Ｃ（５．５ｍｇ、０．４６μｍｏｌ、１．０当量）を、０．１Ｍシュウ酸（２３μＬ）を含有する９７．５：２．５のＤＭＳＯ／Ｈ２Ｏに溶解した。均質な液体溶液を得て、６５℃で一晩反応させた。ライゲーション反応の完了後、混合物を先ずＤＭＳＯ（０．９５ｍＬ）で希釈した。
転位：混合物をさらに、０．１Ｍ Ｔｒｉｓ（１．０ｍＬ）を含有する６Ｍ Ｇｕ・ＨＣｌで希釈し、５０℃で２時間優しく振盪させた。転位反応の完了後、ＴＦＡ（０．１％、ｖ／ｖ）を含有する６Ｍ Ｇｕ・ＨＣｌ（ｑ．ｓ．１０．０ｍＬ）溶液で混合物を希釈した。反応混合物を濾過し、分取ＨＰＬＣに注入した。Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）を用いて、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～４５％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、粗製の転位されたペプチドを精製した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４Ｃ－Ａｃｍ－転位を純度９７％超の白色固形物として得た。単離収率は１．９ｍｇ（２２％）であった。この材料はさらに特徴解析を行うことなく、Ａｃｍ脱保護工程に直接使用した。
Ａｃｍ脱保護：ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４Ｃ－Ａｃｍ－転位（１．９ｍｇ、０．０９９μｍｏｌ）を０．２０ｍＭ ＡｃＯＨ／Ｈ２Ｏ（１：１）（５００μＬ）に溶解し、この溶液に酢酸銀（５．０ｍｇ、１％、ｍ／ｖ）を添加した。混合物を５０℃で３時間振盪させ、光を遮った。反応の完了後、試料を、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１：２のＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏ混合物９．５ｍＬで希釈する。Ｓｈｉｓｅｉｄｏ Ｃａｐｃｅｌｌ Ｐａｋ ＵＧ８０ Ｃ１８カラム（５μｍ、２５０×２０ｍｍ）上、流速１０ｍＬ／分、６０℃で、０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有するＣＨ３ＣＮ／Ｈ２Ｏを移動相として用いて、勾配は４０分で０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する１０～４５％ＣＨ３ＣＮとした分取ＨＰＬＣにより、試料を精製した。精製された産物を含有する画分をプールして凍結乾燥することで、０．５ｍｇのＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４Ｃ直鎖タンパク質を純度９７％（収率３０％）の白色粉末として得た。ＭＳ（ＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ）：Ｃ８１９Ｈ１３０５Ｎ２１７Ｏ２６４Ｓ３；算出した平均１８５１１．８８；ｆｏｕｎｄ：１８５１３．３２７０Ｄａ。
ＩＬ１８－Ｓｅｇ１２３４Ｃ直鎖タンパク質のフォールディングと製剤化：
タンパク質粉末（０．２２ｍｇ、ＴＦＡ塩として凍結乾燥）を、８Ｍ尿素、２ｍＭ ＤＴＴ、および０．０２％（ｍ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有する緩衝液Ａトリス緩衝液１１０μＬ（５０ｍＭ、ｐＨ８．０）中で可溶化する。２ｍｇ／ｍＬの透明溶液を得る。これを室温で３０分間インキュベートする。タンパク質溶液を、２０℃で滴加しながら、２ｍＭ ＥＤＴＡ、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、４００ｍＭアルギニン・ＨＣｌ、２ｍＭ ＤＴＴ、および０．０２％（ｍ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ８０を含有するトリス緩衝液（５０ｍＭ、ｐＨ７．８）（緩衝液Ｂ）により徐々に希釈する。混合物を優しく振盪することで（４００ＲＰＭ）、効率的な拡散を可能にする。０．２ｍｇ／ｍＬの透明溶液を得る。これを２０℃で２０時間インキュベートする。次いで、１００００ＲＰＭ、室温で５分間の遠心分離を行う。タンパク質溶液を、６％スクロースと０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０を含有する６５０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して、室温で２時間透析する。この工程を再度繰り返す。次いでタンパク質溶液を、６％スクロースと０．０２％Ｔｗｅｅｎ８０を含有する６５０ｍＬのＰＢＳ（ｐＨ７．４）に対して、室温で１８時間透析する。最後に１００００ＲＰＭ、室温で５分間の遠心分離を行い、－８０℃で保管する。
上述のフォールディングプロトコルでは、直鎖Ｓｅｇ１２３４ポリペプチド前駆体から適切にフォールディングされたＩＬ－１８ポリペプチドを調製するために試験可能である例示的なプロトコルを記述する。いくつかの実施形態では、上述のフォールディングプロトコルは、実施例２に概説されるように代替的な緩衝液ＡおよびＢを使用することにより改変される（表１４を参照）。所望のフォールディング成果が判定されるまで、これらのフォールディングプロトコルを試験することができる。
実施例５ － 組成物Ａおよび組成物Ｂの構造
図４は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドである組成物Ａの合成を示す図である。組成物Ａは、短いＰＥＧポリマーの端部上で残基Ｃ６８に結合される３０ｋＤａのＰＥＧ官能性を含む。任意選択で、この３０ｋＤＡのＰＥＧ官能性は、銅を用いないクリック化学反応により短いＰＥＧポリマーに共有結合される。
本明細書にはさらに、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドである組成物Ｂが提供される。組成物Ｂは、短いＰＥＧポリマーの端部上で残基Ｋ７０に結合される３０ｋＤａのＰＥＧ官能性を含む。任意選択で、この３０ｋＤＡのＰＥＧ官能性は、銅を用いないクリック化学反応により短いＰＥＧポリマーに共有結合される。
本明細書にはさらに、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドである組成物Ｂが提供される。組成物Ｃは、短いＰＥＧポリマーの端部上で残基Ｅ６９に結合される３０ｋＤａのＰＥＧ官能性を含む。任意選択で、この３０ｋＤＡのＰＥＧ官能性は、銅を用いないクリック化学反応により短いＰＥＧポリマーに共有結合される。
実施例６ － 組成物Ａおよび組成物Ｂの特徴解析
組成物Ａと組成物Ｂの特徴を解析するべく、両組成物を一連の解析実験にかけた。修飾ＩＬ－１８ポリペプチドをＨＰＬＣにより解析し、組成物中の均一性の程度を判定する。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド組成物をＭＡＬＤＩ－ＭＳによっても解析し、組成物の分子量のＭＷ、および分子量分布を判定する。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド組成物をさらに円偏光二色性により解析し、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド組成物と野生型ＩＬ－１８のフォールディングを比較する。
実施例７ － 修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの製剤化
凍結乾燥した修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを、５０ｍｇ／ｍＬマンニトールを有するＰＢＳ緩衝液（ｐＨ７．４）を含む溶液中で再懸濁させた。
実施例８ － ＩＬ－１８のＳＰＲ測定
野生型ＩＬ－１８ポリペプチドおよび修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのヒトＩＬ－１８受容体サブユニットに対する相互作用を、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）技法により測定した。捕捉前の３０分間、ＣＭ５チップ上へのアミン・カップリングにより抗ヒトＩｇＧ抗体を結合させて、６μｇ／ｍＬのＦｃ縮合ヒトＩＬ－１８Ｒα、６μｇ／ｍＬのＦｃ縮合ヒトＩＬ－１８Ｒβ、または２μｇ／ｍＬのＦｃ縮合ヒトＩＬ－１８ＢＰアイソフォームを捕捉した。他の環境では、６μｇ／ｍＬのＩＬ－１８受容体αおよびβを混合し、事前に３０分間インキュベートしてから、ヘテロ二量体ＩＬ－１８受容体α／βを捕捉した。
ＩＬ－１８分析物の動的結合を、Ｂｉａｃｏｒｅ ８Ｋ器機により、１μＭで開始して０．９８ｎＭにまで低下する二倍連続希釈で測定した。分析物の濃縮を終えるごとに、アミンが結合した抗ＩｇＧ抗体に戻り表面の再生を行った。受容体に対するタンパク質の会合を測定するために、試料を６０秒間、流速５０μＬ／分で注射し、続いて３００秒間緩衝液のみを注射して、解離を検出した。使用したランニングバッファは、０．０５％Ｔｗｅｅｎ２０を有する１倍ＰＢＳであった。相対的反応単位（ＲＵ、Ｙ軸）を時間（ｓ、Ｘ軸）に対してプロットし、単量体受容体結合に対する動的な１：１の結合モデルにおいて、ＩＬ－１８ＢＰへの結合を解析する。動的で不均質なリガンドの適合モデルを、α／βヘテロ二量体結合に適用した。
実施例９ － ＩＬ－１８ＢＰ結合αＬＩＳＡアッセイ
ヒトＩＬ－１８ＢＰαＬＩＳＡアッセイキットを使用し、ＩＬ－１８ＢＰに対する各ＩＬ－１８変異体の結合親和性を判定し、ＩＬ－１８ＢＰの遊離形態の存在を検出した。ＩＬ－１８分析物の３倍連続希釈を、５ｎｇ／ｍＬのＨｉｓタグ付きヒトＩＬ－１８ＢＰの存在下、２０％ＦＣＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、および２５μＭ β－メルカプトエタノールを補充したａＭＥＭ中で１６個調製した。最終のＩＬ－１８分析物の濃度範囲は２７７８ｎＭ～０．２ｐＭであった。
室温で１時間のインキュベーション後、遊離ＩＬ－１８ＢＰのレベルを、ヒトＩＦＮγ αＬＩＳＡアッセイキットを用いて測定した。３８４ウェルのＯＰＴＩｐｌａｔｅ中、５倍抗ＩＬ－１８ＢＰアクセプタビーズ５μＬを、ＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＢＰ混合物７．５μＬに添加した。振盪しながら室温で３０分間インキュベーションした後、ビオチン化された抗ＩＬ－１８ＢＰ抗体５μＬを各ウェルに添加した。プレートをさらに室温で１時間インキュベートした。光を抑制した条件下、２倍のストレプトアビジン（ＳＡ）ドナービーズ１２．５μＬをピペッティングして各ウェルに入れ、ウェルを振盪させながら室温でさらに３０分間インキュベートした。次いで、ＡｌｐｈａＬｉｓａシグナルをＥｎｓｐｉｒｅプレートリーダで測定し、励起波長と発光波長はそれぞれ６８０ｎｍと６１５ｎｍであった。可変勾配、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いた４つのパラメータ解析から、解離定数（ＫＤ）を求めた。
実施例１０ － ＩＬ－１８変異体のＩＬ－１８Ｒα単量体への結合
表５は、実施例８に明記されるプロトコルを用いて、ＩＬ－１８Ｒαに対して記述したＩＬ－１８変異体で観察された解離定数（ＫＤ）の結果を示す。この結果より、配列番号６、７、８、２０の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＫＤ値は、配列番号１のＷＴ ＩＬ－１８のＫＤ値以下であったことが認められる。配列修飾Ｅ０６Ｋ、Ｋ５３Ａ、Ｓ５５Ａ、およびＴ６３Ａを有する修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８Ｒαに対する結合親和性を維持した。
実施例１１ － ＩＬ－１８変異体のＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体への結合
表６は、実施例８に記載される実験を用いて、ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体に対して記述したＩＬ－１８変異体で観察された解離定数（ＫＤ）の結果を示す。この結果より、配列番号６、７、８、１８、１９、２０の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＫＤ値は、配列番号１の野生型ＩＬ－１８のＫＤ値と同様であったことが認められる。場合により、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＫＤ値は野生型ＩＬ－１８より低かった。配列修飾Ｅ０６Ｋ、Ｋ５３Ａ、Ｓ５５Ａ、およびＴ６３Ａを有する修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体に対する結合親和性を維持した。データにより、本開示のＩＬ－１８変異体の一部で解離定数が低下し、ＩＬ－１８／ＩＬ－１８Ｒ複合体の安定化が反映されていることが認められる。
実施例１２ － ＩＬ－１８ＢＰ単量体に対する結合アッセイ
表７は、実施例８に記載したものと類似するプロトコルを用いて、ＩＬ－１８ＢＰに対して記述したＩＬ－１８変異体で観察された解離定数（ＫＤ）の結果を示す。この結果より、配列番号４、５、６、７、８、１５、１６、１９、２０、２１の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＫＤ値は、配列番号１の野生型ＩＬ－１８のＫＤ値以上であったことが認められる。配列修飾Ｋ５３Ａ、Ｓ５５Ａ、Ｅ０６Ｋ、Ｃ３８Ｓ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ１２７Ｓ、および／またはＫ７０Ｃを有する修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＩＬ－１８ＢＰに対する結合親和性を維持した。
本開示の修飾ＩＬ－１８変異体の一部により観察された１０倍を超える解離定数が示すように、修飾ＩＬ－１８変異体の多くは、ＩＬ－１８ＢＰに対する会合（Ｋｏｎ）を実質的に改変せず、複合体を不安定にするだけであった。これら修飾ＩＬ－１８変異体では、ＩＬ－１８／ＩＬ－１８Ｒ複合体の安定化、およびＩＬ－１８／ＩＬ－１８ＢＰ複合体の不安定化により、ＩＬ－１８に対するＩＬ－１８ＲとＩＬ－１８ＢＰの競合において平衡がシフトした。変異体の多くにおいて、ＩＬ－１８ＢＰへの結合は消失しなかったが、これら変異体は、ＩＬ－１８ＢＰと比較して同様か僅かに改善された、ＩＬ１８Ｒに対する結合を呈した。
表８は、実施例９に記載のプロトコルを用いて測定したときに、ＩＬ－１８ＢＰに対して記述したＩＬ－１８変異体で観察された解離定数（ＫＤ）の結果を示す。この結果より、配列番号５、６、８、１５、１６の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＫＤ値は、配列番号１の野生型ＩＬ－１８のＫＤ値以上であったことが認められる。
実施例１３ － ＩＦＮγ誘導細胞アッセイ
本明細書で提供されるＩＬ－１８ポリペプチドによるＩＦＮγ誘導能を、下記プロトコルに従う細胞アッセイで評価する。
リンパ腫患者から得たＮＫ細胞株ＮＫ－９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２４０７（商標））を、２０％ＦＣＳ、Ｇｌｕｔａｍａｘ、２５μＭ Ｂ－メルカプトエタノール、および１００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２を補充したａＭＥＭ培地で培養した。実験当日、細胞を採取し、ＩＬ－２を含まないが１ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－１２を含有するａＭＥＭ培地で洗浄した。計数後、１つのウェルにつき１００，０００個の細胞を３８４ウェルの滴定プレートに蒔き、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。ＩＬ－１８分析物の４倍段階希釈１６個をａＭＥＭ培地に調製し、１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２をＮＫ－９２細胞に添加した。ＩＬ－１８分析物の最終濃度範囲は５６ｎＭ～５ｘ１０－５ｐＭであった。
細胞を３７℃／５％ＣＯ２で１６～２０時間インキュベートした後、上清５μＬを３８４マイクロウェルＯｐｔｉＰｌａｔｅへと慎重に移した。ヒトＩＦＮγ ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイキットを用いてＩＦＮγ値を測定した。簡潔に説明すると、２．５倍のＡｌｐｈａＬＩＳＡ抗ＩＦＮγアクセプタビーズ１０μＬとビオチン化抗体抗ＩＦＮγ混合物を、ＮＫ－９２上清５μＬに添加した。混合物を振盪させながら室温で１時間インキュベートした。光を抑制した条件下、２倍のストレプトアビジン（ＳＡ）ドナービーズ２．５μＬをピペッティングして各ウェルに入れ、ウェルを振盪させながら室温で３０分間インキュベートした。次いで、ＡｌｐｈａＬｉｓａシグナルをＥｎＳｐｉｒｅ（商標）プレートリーダで測定し、励起波長と発光波長はそれぞれ６８０ｎｍと６１５ｎｍであった。可変勾配、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いた４つのパラメータ解析から、半数効果濃度（ＥＣ５０）を求めた。
様々なＩＬ－１８ポリペプチドに対するこの実験の結果を、以下の表９に示す（ＥＣ５０データ）。
実施例１４ － ＩＬ－１８結合タンパク質阻害細胞アッセイ
リンパ腫患者から得たＮＫ細胞株ＮＫ－９２（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＲＬ－２４０７（商標））を、２０％ＦＣＳ－Ｇｌｕｔａｍａｘ、２５μＭ Ｂ－メルカプトエタノール、および１００ＩＵ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－２を補充したａＭＥＭ培地で培養した。
実験当日、細胞を採取し、ＩＬ－２を含まないが１ｎｇ／ｍＬの組換えヒトＩＬ－１２を含有するａＭＥＭ培地で洗浄した。計数後、１つのウェルにつき１００，０００個の細胞を３８４ウェルの滴定プレートに蒔き、３７℃／５％ＣＯ２でインキュベートした。Ｆｃ縮合ヒトＩＬ－１８結合タンパク質アイソフォームａ（ＩＬ－１８ＢＰａ）の２倍段階希釈１６個をａＭＥＭ培地に調製した。修飾ＩＬ－１８ポリペプチド変異体をそれぞれ２ｎＭ含有する１ｎｇ／ｍＬのＩＬ－１２をＮＫ－９２細胞に添加した。ＩＬ－１８分析物の最終濃度は１ｎＭ、ＩＬ－１８ＢＰａの最終濃度範囲は５６６ｎＭ～１７ｐＭであった。
細胞を３７℃／５％ＣＯ２で１６～２０時間インキュベートした後、上清５μＬを３８４マイクロウェルＯｐｔｉＰｌａｔｅへと慎重に移した。ヒトＩＦＮγ ＡｌｐｈａＬＩＳＡアッセイキットを用いてＩＦＮγ値を測定した。簡潔に説明すると、２．５倍のＡｌｐｈａＬＩＳＡ抗ＩＦＮγアクセプタビーズ１０μＬとビオチン化抗体抗ＩＦＮγ混合物を、ＮＫ－９２上清５μＬに添加した。混合物を振盪させながら室温で１時間インキュベートした。光を抑制した条件下、２倍のＳＡドナービーズ２．５μＬをピペッティングして各ウェルに入れ、を振盪させながら室温で３０分間インキュベートした。次いで、ＡｌｐｈａＬｉｓａシグナルをＥｎＳｐｉｒｅ（商標）プレートリーダで測定し、励起波長と発光波長はそれぞれ６８０ｎｍと６１５ｎｍであった。可変勾配、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いた４つのパラメータ解析から、半数阻害濃度（ＩＣ５０）を求めた。
本開示の修飾ＩＬ－１８変異体は活性であり、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＩＦＮγ分泌を誘導可能である。表９は試験対象のＩＬ－１８変異体の多くにおけるＩＦＮγ産生誘導能を示すが、一部のＩＬ－１８変異体は、それぞれＥＣ５０とＩＣ５０により測定したときにＩＬ－１８ＢＰによる阻害に対する感度が有意に低かった。
実施例１５ － ＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ１８Ｒレポーターアッセイ
ＩＬ－１８Ｒ陽性ＨＥＫ－Ｂｌｕｅレポーター細胞株を使用して、ＩＬ－１８変異体のＩＬ－１８Ｒへの結合、およびその後の下流シグナル伝達を判定した。プロトコル全体を以下に概説する。
５×１０４個細胞のＨＥＫ－Ｂｌｕｅ ＩＬ１８Ｒレポーター細胞（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ，＃ｈｋｂ－ｈｍｉｌ１８）を９６ウェルプレートの各ウェルに蒔き、０～１００ｎＭのＩＬ－１８ポリペプチド変異体を用いて３７℃、５％ＣＯ２で刺激した。２０時間のインキュベーション後、細胞培養上清２０μＬを各ウェルから取得し、１８０μＬのＱＵＡＮＴＩ－Ｂｌｕｅ培地と９６ウェルプレート中で混合し、３７℃、５％ＣＯ２で１時間インキュベートした。次いで、吸光度シグナルをＥｎｓｐｉｒｅプレートリーダで測定すると６２０ｎｍであり、励起波長と発光波長はそれぞれ６８０ｎｍと６１５ｎｍであった。可変勾配、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いた４つのパラメータ解析から、半数最大効果用量（ＥＣ５０）を求めた。
選択した変異体に対するこの実験の結果を下記の表１２に示す。
実施例１６Ａ － 修飾ＩＬ－１８ポリペプチド変異体の薬物動態特性と薬力学特性
選択したＩＬ－１８ポリペプチド変異体の薬物動態（ＰＫ）特性と薬力学（ＰＤ）特性を測定した。一群、および一時点につき、３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスを試験した。ＩＬ－１８変異体を単回静脈内注射により適用した。マウスを４つの用量群：０．５ｍｇ／ｋｇ、０．１ｍｇ／ｋｇ、０．０２ｍｇ／ｋｇ、０．００４ｍｇ／ｋｇ、および４つの時点群：５分、６時間、２４時間、４８時間に分けた。
免疫関連ＰＤ作用を、血漿中サイトカイン濃度の解析により判定した。血漿サイトカインとして、ＩＦＮγ、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＬ－１ａ、ＦａｓＬ、およびＩＬ－１８ＢＰを測定した。白血球の活性化状態は、表面マーカとしてＩＣＯＳ、ＰＤ－１、ＣＤ２５、ＣＤ６９、およびＦａｓをモニタリングすることで判定した。ＩＬ－１８変異体（遊離およびＩＬ－１８ＢＰ複合体、図７を参照）の総量を検出することにより、生物分析を実施した。Ｃｏｒｎｉｎｇ高結合ハーフエリアプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ ｈｉｇｈ－ｂｉｎｄｉｎｇ ｈａｌｆ－ａｒｅａ ｐｌａｔｅ）（Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｒｅｉｎａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を４℃で一晩かけ、２μｇ／ｍＬのＰＢＳ中、２５μＬの抗ＩＬ１８モノクローナル抗体（ＭＢＬ、カタログ番号Ｄ０４３－３、クローン２５－２Ｇ）で被覆した。次いで、プレートを１００μＬのＰＢＳ－０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。プレート表面は、２５μＬのＰＢＳ－０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０－１％ＢＳＡを用いて、３７℃で１時間塞いだ。次いで、プレートを１００μＬのＰＢＳ－０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。２５μＬのＩＬ－１８変異体（またはマウス血漿）を、５０ｎＭで開始し０．０２ｎＭにまで低下する８倍段階希釈中、ＰＢＳ－０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０－０．１％ＢＳＡへと添加し、３７℃で２時間インキュベートした。次いで、１００μＬのＰＢＳ－０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０および２５μＬのビオチン化抗ＩＬ－１８モノクローナル抗体（ＭＢＬ、カタログ番号Ｄ０４５－６、クローン１５９－１２Ｂ）を用いて、２μｇ／ｍＬのＰＢＳ中、プレートを４回洗浄した。プレートを３７℃で２時間インキュベートした後、１００μＬのＰＢＳ－０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。ＰＢＳ－０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０－０．１％ＢＳＡへと１：５００で希釈した２５μＬのストレプトアビジン－ホースラディッシュペルオキシダーゼ（＃ＲＡＢＨＲＰ３，Ｍｅｒｃｋ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を、各ウェルに添加し、室温で３０分間インキュベートした。次いで、プレートを１００μＬのＰＢＳ－０．０２％Ｔｗｅｅｎ２０で４回洗浄した。５０μＬのＴＭＢ基質試薬（＃ＣＬ０７，Ｍｅｒｃｋ，Ｂｕｃｈｓ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）を各ウェルに添加し、３７℃で５分間インキュベートした。３７℃で５分後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ反応を、０．５Ｍ Ｈ２ＳＯ４停止液を１つのウェルにつき５０μＬ添加することで停止した。次いで、ＥＬＩＳＡシグナルをＰｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｓｃｈｗｅｒｚｅｎｂａｃｈ，Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）のＥｎＳｐｉｒｅプレートリーダで測定すると、４５０ｎｍであった。
図７は、対照群、対照＋ＩＬ－１８ＢＰ群、ＷＴ ＩＬ－１８群、ＷＴ ＩＬ－１８＋ＩＬ－１８ＢＰ群、配列番号２の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド群、配列番号２の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド＋ＩＬ－１８ＢＰ群のＥＬＩＳＡ結果を示す図である。
実施例１６Ｂ － Ｅ６ＫおよびＫ５３Ａアミノ酸置換を持つ修飾ＩＬ－１８のＰＫ／ＰＤ
別の実験で、一群、および一時点につき、３匹のＣ５７ＢＬ／６マウスを試験した。ＷＴ ＩＬ－１８（配列番号１）を０．３ｍｇ／ｋｇで単回静脈内注射により適用した。Ｅ６Ｋ、Ｋ５３Ａ変異体ＩＬ－１８（配列番号７）を０．３ｍｇ／ｋｇで２回の静脈内注射により、ｔ＝０時間とｔ＝２４時間で適用した。マウスを７つの時点群：５分、１時間、２時間、４時間、８時間、２４時間、４８時間に分けた。
免疫関連ＰＤ作用を、血漿中サイトカイン濃度の解析により判定した。血漿サイトカインとして、ＧＭ－ＣＳＦ、ＩＦＮγ、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－１２、ＴＮＦａ、ＩＬ－２２、ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－３、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ、およびＣＸＣＬ１を測定した。白血球の活性化状態は、表面マーカとしてＰＤ－１とＣＤ２５をモニタリングすることで判定した。ＩＬ－１８変異体（遊離およびＩＬ－１８ＢＰ複合体）の総量を検出することにより、生物分析を実施した。
ヒトＩＬ－１８ポリペプチド変異体（配列番号７）のｉｎ ｖｉｖｏでのサイトカイン産生は、野生型ヒトＩＬ－１８と比較して増加した。図２０はＩＦＮγの血漿中濃度を示す図であり、図２１は、様々な時点で野生型または変異体ＩＬ－１８を静脈内注射した後のＣＸＣＬ１０の血漿中濃度を示す図である。ＩＦＮγ、－およびＭＣＰ－１、ＭＣＰ－３、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＰ－１ｂ ＣＸＣＬ１０ケモカインで最も堅調な応答を認め、注射後２時間～８時間の間に有意な増加を観察した（ＭＣＰ－１、ＭＣＰ－３、ＭＩＰ－１ａ、ＭＩＯ－１ｂに関するデータは示さず）。ヒトＩＬ－１８ポリペプチド変異体（配列番号７）を繰り返し静脈内注射することで、応答がさらに強くかつ迅速となり、血漿中サイトカイン濃度は投与後１時間～８時間の間で上昇した。
実施例１７ － ｒＩＬ１８の発現と精製
本明細書で提供される組換えＩＬ－１８変異体は、下記に提供するプロトコルに従い調製できる。
可溶性Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ－ＩＬ１８変異体
Ｎ－Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグを付けたＩＬ－１８変異体融合をコードするプラスミドを持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、３Ｌ ＬＢ培養培地に接種し、０．４ｍＭ ＩＰＴＧを用いて３０℃で６時間誘導した。細胞を小球状にし、溶解緩衝液：ｐＨ７．４のＰＢＳ中での音波粉砕により細胞溶解を行う。可溶性タンパク質をＮｉ－ＮＴＡビーズ６ＦＦ（ＰＢＳ、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で１回洗浄、ＰＢＳ、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で２回洗浄、ＰＢＳ、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で溶出）により精製する。
タンパク質含有画分をプールし、ｐＨ７．４のＰＢＳへと透析し、続いてＳＵＭＯ消化を行う。次いで、タンパク質に対し、Ｎｉ－ＮＴＡビーズ（フロースルーサンプルで継続）とゲル濾過による２工程の精製を行う。タンパク質含有画分をプールし、ＳＤＳ－ＰＡＧＥや分析ＳＥＣなどの分析技法を用いてＱＣを行う。
不溶性Ｈｉｓ－ＳＵＭＯ－ＩＬ１８変異体
Ｎ－Ｈｉｓ－ＳＵＭＯタグを付けたＩＬ－１８変異体融合をコードするプラスミドを持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、１０Ｌ ＬＢ培養培地に接種し、０．４ｍＭ ＩＰＴＧを用いて３０℃で６時間誘導する。細胞を小球状にし、溶解緩衝液：ＰＢＳ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．４の中での音波粉砕により細胞溶解を行う。可溶性タンパク質をＮｉ－ＮＴＡビーズ６ＦＦ（ＰＢＳ、８Ｍ尿素、２０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で１回洗浄、ＰＢＳ、８Ｍ尿素、５０ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で２回洗浄、ＰＢＳ、８Ｍ尿素、５００ｍＭイミダゾール、ｐＨ７．４で溶出）により精製する。
タンパク質含有画分をプールし、ｐＨ７．４のＰＢＳへと透析し、続いてＳＵＭＯ消化を行う。次いで、タンパク質をＮｉ－ＮＴＡビーズ（ＰＢＳ（ＰＢＳ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．４でカラムを平衡化、ＰＢＳ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．４で洗浄、ＰＢＳ、８Ｍ尿素、ｐＨ７．４で溶出）により精製する。タンパク質含有画分をプールし、ｐＨ７．４のＰＢＳへと透析し、ＳＤＳ－ＰＡＧＥや分析ＳＥＣなどの分析技法を用いてＱＣを行う。
不溶性でタグがないＩＬ１８変異体
ｍＩＬ－１８をコードするプラスミドを持つ大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、２Ｌ ＬＢ培養培地に接種し、０．４ｍＭ ＩＰＴＧを用いて３０℃で６時間誘導する。細胞を小球状にし、溶解緩衝液：１１０ｍＭ Ｔｒｉｓ、１．１ＭグアニジンＨＣｌ、５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ８．９の中での音波粉砕により細胞溶解を行う。タンパク質をＱセファロースＦＦ（平衡緩衝液２０ｍＭ ＭＥＳ、ｐＨ７．０、０～１Ｍ ＮａＣｌでの勾配上昇により溶出）により精製する。
バイシストロニックシステム
プラスミド（例えば、配列番号７１）を含有する大腸菌ＢＬ２１の単一コロニーを、２５μｇ／ｍＬの硫酸カナマイシンを含有する１０ｍＬのＬＢに対して接種物として使用し、３７℃、２００ｒｐｍで一晩インキュベートする。１ｍＬの前培養物を使用して、１００μｇ／ｍＬ硫酸カナマイシンを含有する１Ｌのａｕｔｏｉｎｄｕｃｉｎｇ ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈを接種させる。培養物を３７℃、１１０ｒｐｍで４時間インキュベートした後、１５℃に移してさらに１５時間インキュベートする。細胞を１０～１５ｍＬの溶解緩衝液（１００ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ、２０μｇ／ｍＬのリソザイム、０．１ｍｇ／ｍＬのＤＮａｓｅ Ｉ、１ｍＭ ＰＭＳＦ、ｐＨ７．５）に再懸濁し、４℃で１時間優しく振盪させる。次いで、細胞を音波粉砕で溶解し、可溶性タンパク質分画を遠心分離（１６’０００×ｇ、３０分、４℃）と濾過（０．２μｍ膜）により得る。
上清のｐＨを約７に調整し、５０ｍＬスーパーループを使用してタンデムカラムシステム（２×ＳＰ ＣＩＥＸ＋１×ＨｉＰｒｅｐ ＤＥＡＥ ＦＦ １６／１０、すべてｃｙｔｉｖａから入手）に充填した（１回につき３０ｍＬ未満の溶解物を充填）。このシステムを洗浄緩衝液（２５ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、５ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ７．０）で実行し、タンパク質（第２の主要ピーク）を含有する画分を採取してプールする。
タンデムカラムをそれぞれの種類へと分ける。ＤＥＡＥカラムを緩衝液Ｅ１とＥ２（それぞれ２５ｍＭビス－ＴｒｉｓプロパンＨＣｌ、ｐＨ９．５、および２５ｍＭビス－ＴｒｉｓプロパンＨＣｌ、１Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ９．５）で溶出し、勾配は段階的とした。先ず、１００％のＥ１を８ＣＶに対して実施し、続いて勾配を５ＣＶにわたり０％から１２％のＥ２とした後、さらに１０ＣＶに対して１２％を保った。この後に、勾配を５ＣＶにわたり１２％から４０％のＥ２とした後、他の５ＣＶに対して４０％を保つ。タンパク質（第２の主要ピーク）を含有する画分を採取し、先の画分とともにプールする。この溶出でタンパク質が認められない場合、ＳＰカラムを同じ方法で洗浄し、破棄する。
プールした試料のｐＨを９．５に調整し、Ｍｏｎｏ Ｑ（小規模）またはＨｉｔｒａｐ Ｑ（大規模）カラムに充填する。使用した緩衝液はＥ２とＥ３（２５ｍＭビス－ＴｒｉｓプロパンＨＣｌ、１．５Ｍ硫酸アンモニウム、ｐＨ９．５）である。段階的な溶出勾配を１５ＣＶに対して８％Ｅ３で開始し、５ＣＶにわたり１６％のＥ３に上昇させ、３ＣＶにわたり５０％のＥ３に上昇させる。タンパク質含有画分を第２の主要ピークで見出す。
標的タンパク質を含有する画分をプールし、ダイアフィルトレーション（１０ｋＤａのＭＷＣＯ、３５００×ｇ未満、４℃）で濃縮する。濃縮試料を、緩衝液（２０ｍＭリン酸カリウム、１５０ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＤＴＴ、ｐＨ６．０）で平衡化したＳｕｐｅｒｄｅｘ７５に充填する。標的タンパク質を含有する画分を採取し、プールし、濃縮する。
実施例１８ － 修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのコンジュゲーション
いくつかの例では、本明細書で提供される修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは、ＰＥＧ官能性へとコンジュゲートされる。場合により、ＰＥＧは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの所望の残基（例えば、Ｃ６８、もしくは他の好適な自然発生のシステイン、または残基６９や７０などの所望の部位にて組み込まれるシステイン残基）に最初に結合される二官能性のリンカーを介して結合される。ＩＬ－１８ポリペプチドに結合されると、二官能性リンカーの第２の官能性はＰＥＧ部分の結合に使用される。このようなプロセスの例示的な概略を図１８に示す。本明細書で提供される組換えＩＬ－１８変異体に関する例示的プロトコルを以下に記述する。
コンジュゲーション－ 組換えＩＬ－１８を、５０ｍＭ ＫＣｌおよび１ｍＭ ＤＴＴを含有するリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）中、２．４ｍｇ／ｍＬの濃度、－８０℃で保管した。試料を氷の上で解凍し、透明な溶液を得た。タンパク質溶液をｐＨ７．４のＰＢＳ中で希釈した。約０．４ｍｇ／ｍＬの濃度で透明な溶液を得た。
タンパク質溶液を、ｐＨ７．４のＰＢＳに対して透析した（６００ｍＬで２時間２回透析、８００ｍＬで１８時間１回透析）。透析後、沈降反応の兆候なしに透明な溶液を得た。ＵＶ吸光度２８０ｎｍを用いて、ＢＣＡタンパク質アッセイによりタンパク質濃度を得た。
両官能性プローブ（ブロモアセトアミド－ＰＥＧ５－アジド、ＣＡＳ：１４１５８００－３７－１）のストック水溶液を２０ｍＭの濃度で調製した。タンパク質溶液５００μＬをプローブ溶液２５μＬと混合した。ｐＨを７．５に調整し、溶液を２０℃で３時間反応させた。
０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する５～３０％（２．５分）と３０～７５％（７．５分）ＣＨ３ＣＮの勾配を用いて、Ａｅｒｉｓ ＷＩＤＥＰＯＲＥ Ｃ１８ ２００Åカラム（３．６μｍ、１５０×４．６ｍｍ）上、流速１ｍＬ／分、４０℃で逆相ＨＰＬＣにより、およびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳにより、合成の進行状況をモニタリングした。
精製－ 場合により、イオン交換クロマトグラフィーを用いて、コンジュゲートされたタンパク質を精製した。過剰量のプローブを除去するために、反応混合物（体積約５００μＬ）を、緩衝液として２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）を用いてＨｉ－Ｔｒａｐ－Ｇ－ＦＦ－１ｍＬカラムに流した。同じ緩衝液中、０～０．３５Ｍ ＮａＣｌの直線勾配を用いてカラムを溶出した。標的タンパク質を含有する画分を集めて緩衝液交換（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール）を行い、０．４ｍｇ／ｍＬで濃縮した。ＵＶ吸光度２８０ｎｍ、およびＢＣＡタンパク質アッセイにより、精製されたタンパク質の濃度を判定した。タンパク質溶液を－８０℃に維持した。
特徴解析－ 市販の供給源から得た組換えタンパク質およびコンジュゲートされたタンパク質の純度と同一性を、ａＳＥＣ、ＨＰＬＣ、およびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳにより確認した。
実施例１９ － 修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＰＥＧ化
実施例１９に記載され、図１８に示される二官能性リンカーのコンジュゲーション後、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドをＰＥＧ基と共有結合することができる。本プロセスの例示的な概略を図１９に示す。ＰＥＧと好適に活性化されたＩＬ－１８ポリペプチドとのコンジュゲーション反応の例示的プロトコルを以下に提供する。加えて、下記のプロトコルは、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの調製中（例えば、合成ＩＬ－１８ポリペプチドの合成中）にコンジュゲーションハンドルを直接組み込む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに所望のＰＥＧ基を共有結合させるのに使用できる。このようなプロセスの例示的な概略を図３に示す。
コンジュゲーション－ 配列番号７１の組換え修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを、７５ｍＭ ＮａＣｌおよび５％（ｖ／ｖ）グリセロールを含有するＰＢＳ（ｐＨ７．４）中、－８０℃で保管した。ＰＥＧ化反応の前、試料を氷の上で解凍し、透明な溶液を得た。２００μＬのタンパク質溶液（０．４ｍｇ／ｍＬ）を２．０ｍｇの３０ｋＤａ ＤＢＣＯ－ポリエチレングリコールポリマーと混合した。この混合物を２０℃で一晩反応させた。
０．１％ＴＦＡ（ｖ／ｖ）を有する５～３０％（２．５分）と３０～７５％（７．５分）ＣＨ３ＣＮの勾配を用いて、Ａｅｒｉｓ ＷＩＤＥＰＯＲＥ Ｃ４ ２００Åカラム（３．６μｍ、１５０×４．６ｍｍ）上、流速１ｍＬ／分、４０℃で逆相ＨＰＬＣにより、およびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳにより、合成の進行状況をモニタリングした。
精製－ 過剰量のＰＥＧを除去するために、反応混合物をトリス緩衝液（２５ｍＭ、ｐＨ７．４）で希釈し、緩衝液として２５ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．４）を用いてＨｉ－Ｔｒａｐ－Ｑ－ＦＦカラムに流した。同じ緩衝液中、０～０．３５Ｍ ＮａＣｌの直線勾配を用いてカラムを溶出した。標的タンパク質を含有する画分を集めて緩衝液交換（２５ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ７．４、７５ｍＭ ＮａＣｌ、５％グリセロール）を行い、０．０４ｍｇ／ｍＬで濃縮した。精製されたタンパク質の濃度をＢＣＡタンパク質アッセイにより判定した。タンパク質溶液を－８０℃に維持した。
特徴解析－ コンジュゲートされたタンパク質の純度と同一性を、ＨＰＬＣおよびＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ ＭＳにより確認した。
実施例２０ － ＰＢＭＣ刺激アッセイ
ＩＬ－１８変異体による末梢血単核球（ＰＢＭＣ）の刺激能を、以下のプロトコルに従い評価した。
リンパ球の単離：健康なボランティアのバフィーコートから得た血液を同等の体積のＰＢＳで希釈し、１５ｍＬ Ｈｉｓｔｏｐａｑｕｅ－１０７７を事前に充填したＳｅｐＭａｔｅチューブの上部に徐々に注いだ。チューブを１２００ｇで１０分間遠心分離し、上部の層を集め、２％ウシ胎仔血清を含有するＰＢＳで３回洗浄した。ＰＢＭＣを計数し、２０×１０６個の細胞のアリコートとして凍結保存した。
凍結保存したＰＢＭＣを解凍し、１０％ウシ胎仔血清を含有するＲＰＭＩ中、０．２ｐＭ～１μＭのヒトＩＬ－１８変異体の勾配で刺激した。
刺激の２４時間後のサイトカイン産生を、マルチカラーのフローサイトメータ上、Ｌｅｇｅｎｄｐｌｅｘ（Ｂｉｏｌｅｇｅｎｄ＃７４０９３０）により測定する。可変勾配、ＧｒａｐｈＰａｄ ＰＲＩＳＭソフトウェアを用いた４つのパラメータ解析から、培養上清中で放出されたＩＦＮγの半数効果濃度（ＥＣ５０）を求めた。
ＮＫ細胞上でのＦｃγＲＩＩＩの表面発現を、刺激の７２時間後にフローサイトメトリー（マウスＩｇＧ１クローン３Ｇ８）により測定する。
図２２は、野生型ＩＬ－１８（配列番号１）、および配列番号７と配列番号１０の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの投与後の、（左上から時計回りに）ヒトＩＦＮγ、ＩＬ－１β、ＩＬ－６、ＩＬ－１２ｐ７０、ＩＬ－１０、およびＴＮＦαの誘導を示す図である。個々のグラフで、ｘ軸は示されたＩＬ－１８ポリペプチド（ｎＭ）の濃度を表し、ｙ軸は示されたバイオマーカの平均蛍光強度（ＭＦＩ）を示す。グラフでは、野生型ＩＬ－１８は円形で表され、配列番号７の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは正方形で表され、配列番号１０の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドは三角形で表される。各バイオマーカにおいて、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが、示されたサイトカインの産生を、野生型よりも低い濃度で誘導した。配列番号７の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドと配列番号１０の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドとの間で、配列番号１０は各サイトカインにおいてさらに低濃度でサイトカイン産生を誘導した。
図２３は、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドで刺激したＰＢＭＣのＮＫ細胞集団におけるＣＤ１６＋細胞の割合を示す図である（ｙ軸は全集団の％として表される）。ｘ軸は、関連ＩＬ－１８ポリペプチドの濃度（ｎＭ）を表す。野生型ＩＬ－１８は黒塗りの円形で表され、配列番号は黒塗りの正方形で表され、配列番号１０は黒塗りの三角形で表され、配列番号７１は白抜きの円形で表され、３０ｋＤａのＰＥＧが残基Ｃ６８にて結合された配列番号７１は黒塗りの菱形で表される。配列番号７と１０は野生味と比較して低濃度で活性を呈したが、配列番号７１と、ＰＥＧを有する配列番号７１は、野生型と同様ではあるがわずかに高い濃度で活性を呈した。

Claims (151)

  1. Ｅ０６ＫとＫ５３Ａとを含む修飾インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）ポリペプチドを含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチドであって、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  2. Ｔ６３Ａをさらに含む、請求項１に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  3. 前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが、Ｙ０１Ｘ、Ｓ５５Ｘ、Ｆ０２Ｘ、Ｄ５４Ｘ、Ｃ３８Ｘ、Ｃ６８Ｘ、Ｅ６９Ｘ、Ｃ７６Ｘ、Ｃ１２７Ｘ、またはＫ７０Ｘのうち少なくとも１つをさらに含み、Ｘがアミノ酸またはアミノ酸誘導体である、請求項１に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  4. Ｙ０１Ｇ、Ｓ５５Ａ、Ｆ０２Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｃ３８Ｓ、Ｃ３８Ａ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ６８Ａ、Ｅ６９Ｃ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ７６Ａ、Ｃ１２７Ｓ、Ｃ１２７Ａ、またはＫ７０Ｃのうち少なくとも１つを含む、請求項３に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  5. 残基６５、残基６６、残基６７、残基６８、残基６９、残基７０、残基７１、残基７２、残基７３、残基７４、または残基７５にて共有結合されたポリマーを含む、請求項１から４のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  6. 残基Ｃ６８にて共有結合されたポリマーを含む、請求項１から５のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  7. 残基Ｅ６９またはＥ６９Ｃにて共有結合されたポリマーを含む、請求項１から６のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  8. 残基Ｋ７０またはＫ７０Ｃにて共有結合されたポリマーを含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  9. 前記ポリマーの重量平均分子量が、最大約５０，０００ダルトン、最大約２５，０００ダルトン、最大約１０，０００ダルトン、最大約６，０００ダルトン、または最大約２，０００ダルトンである、請求項５から８のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  10. 前記ポリマーの重量平均分子量が、最低約１２０ダルトン、最低約２５０ダルトン、最低約３００ダルトン、最低約４００ダルトン、または最低約５００ダルトンである、請求項５から９のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  11. 前記ポリマーが、コンジュゲーションハンドル、またはコンジュゲーションハンドルと相補的コンジュゲーションハンドルとの反応生成物を含む、請求項５から１０のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  12. 前記ポリマーが、アジド部分、アルキン部分、またはアジド－アルキン付加環化反応の反応生成物を含む、請求項５から１１のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  13. 前記ポリマーが水溶性ポリマーである、請求項５から１２のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  14. 前記水溶性ポリマーが、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、またはそれらの組合せを含む、請求項１３に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  15. 前記水溶性ポリマーがポリ（アルキレンオキシド）を含む、請求項１３に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  16. 前記ポリ（アルキレンオキシド）がポリエチレングリコール（ＰＥＧ）である、請求項１４または１５のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  17. 前記ポリエチレングリコールの重量平均分子量が約１０ｋＤａ～約５０ｋＤａである、請求項１６に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  18. 前記ポリエチレングリコールの重量平均分子量が、約１０ｋＤａ、約２０ｋＤａ、または約３０ｋＤａである、請求項１６に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  19. 前記ポリエチレングリコールの重量平均分子量が約３０ｋＤａである、請求項１６に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  20. 前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの半減期が、対応する野生型ＩＬ－１８ポリペプチドの半減期より少なくとも１０％長い、請求項５から１９のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  21. 前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの半減期が、前記対応する野生型ＩＬ－１８ポリペプチドの半減期より少なくとも３０％長い、請求項２０に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  22. Ｎ末端伸長部を含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  23. Ｎ末端トランケーションを含む、請求項１から２１のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  24. 配列番号２～８３のうちいずれか１つに対し少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、請求項１から２３のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  25. 前記ポリペプチド配列が、配列番号２または配列番号１８に対し少なくとも約８０％同一である、請求項２４に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  26. 前記ポリペプチド配列が、配列番号２に対し少なくとも約８０％同一である、請求項２５に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  27. 前記ポリペプチド配列が、配列番号２に対し少なくとも約９０％同一である、請求項２５に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  28. 前記ポリペプチド配列が、配列番号２に対し少なくとも約９５％同一である、請求項２５に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  29. 前記ポリペプチド配列が、配列番号１８に対し少なくとも約８０％同一である、請求項２５に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  30. 前記ポリペプチド配列が、配列番号１８に対し少なくとも約９０％同一である、請求項２５に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  31. 前記ポリペプチド配列が、配列番号１８に対し少なくとも約９５％同一である、請求項２５に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  32. 組換え型である、請求項１から３１のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  33. （ａ）残基２６～３６のいずれか１つに位置するホモセリン残基、
    （ｂ）残基６０～８０のいずれか１つに位置するホモセリン残基、
    （ｃ）残基１１０～１２０のいずれか１つに位置するホモセリン残基、
    （ｄ）残基２８～３８のいずれか１つに位置するノルロイシンまたはＯ－メチル－ホモセリン残基、
    （ｄ）残基４６～５６のいずれか１つに位置するノルロイシンまたはＯ－メチル－ホモセリン残基、
    （ｅ）残基５４～６４のいずれか１つに位置するノルロイシンまたはＯ－メチル－ホモセリン残基、
    （ｆ）残基８０～９０のいずれか１つに位置するノルロイシンまたはＯ－メチル－ホモセリン残基、
    （ｇ）残基１０８～１１８のいずれか１つに位置するノルロイシンまたはＯ－メチル－ホモセリン残基、および
    （ｈ）残基１４５～１５５のいずれか１つに位置するノルロイシンまたはＯ－メチル－ホモセリン残基
    から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含み、
    前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく、請求項１から３１のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  34. ホモセリン（Ｈｓｅ）３１、ノルロイシン（Ｎｌｅ）３３、Ｏ－メチル－ホモセリン（Ｏｍｈ）３３、Ｎｌｅ５１、Ｏｍｈ５１、Ｎｌｅ６０、Ｏｍｈ６０、Ｈｓｅ７５、Ｎｌｅ８６、Ｏｍｈ８６、Ｈｓｅ１０６、Ｎｌｅ１１３、Ｏｍｈ１１３、Ｎｌｅ１５０、およびＯｍｈ１５０から選択される１つまたは複数のアミノ酸置換を含む、請求項３３に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  35. 前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドがＩＦＮγの産生を調節し、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドによるＩＦＮγ誘導能のＥＣ５０（ｎＭ）が、配列番号１のＩＬ－１８ポリペプチドのＥＣ５０（ｎＭ）より１０倍未満高いか、５倍未満高いか、またはそれよりも低い、請求項１から３４のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  36. 前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドによるＩＦＮγ誘導能のＥＣ５０（ｎＭ）が、配列番号１のＥＣ５０（ｎＭ）より５倍未満高い、請求項３５に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  37. 前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドによるＩＦＮγ誘導能のＥＣ５０（ｎＭ）が、配列番号１のＩＬ－１８ポリペプチドのＥＣ５０（ｎＭ）よりも低い、請求項３５に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  38. 前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドによるＩＦＮγ誘導能のＥＣ５０（ｎＭ）が、配列番号１のＥＣ５０（ｎＭ）より少なくとも約１０倍低い、請求項３５に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  39. 配列番号２～８３のうちいずれか１つに対し少なくとも約８０％の配列同一性を有するポリペプチド配列を含む、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  40. 前記ポリペプチド配列が、配列番号２または配列番号１８に対し少なくとも約８０％同一である、請求項３９に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  41. 前記ポリペプチド配列が、配列番号２に対し少なくとも約８０％同一である、請求項３９に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  42. 前記ポリペプチド配列が、配列番号２に対し少なくとも約９０％同一である、請求項３９に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  43. 前記ポリペプチド配列が、配列番号２に対し少なくとも約９５％同一である、請求項３９に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  44. 前記ポリペプチド配列が、配列番号１８に対し少なくとも約８０％同一である、請求項３９に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  45. 前記ポリペプチド配列が、配列番号１８に対し少なくとも約９０％同一である、請求項３９に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  46. 前記ポリペプチド配列が、配列番号１８に対し少なくとも約９５％同一である、請求項３９に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  47. 前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが、ＫＤにより測定したとき、ＩＬ－１８受容体αサブユニット（ＩＬ－１８Ｒα）に対する親和性がＩＬ－１８結合タンパク質（ＩＬ－１８ＢＰ）に対する親和性よりも１０倍未満低いか、５倍未満低いか、またはそれよりも高く、［ＫＤＩＬ－１８Ｒα］／［ＫＤＩＬ－１８ＢＰ］は０．１を超える、請求項１から４６のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  48. ＩＬ－１８受容体α（ＩＬ－１８Ｒα）に結合する、請求項４７に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  49. 約２００ｎＭ未満、約１００ｎＭ未満、約８０ｎＭ未満、約７０ｎＭ未満、約６０ｎＭ未満、または約５０ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒαに結合する、請求項４７に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  50. 約５０ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒαに結合する、請求項４７に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  51. ＩＬ－１８受容体α／β（ＩＬ－１８Ｒα／β）ヘテロ二量体に結合する、請求項４７から５０のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  52. 約２５ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体に結合する、請求項５１に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  53. 約１０ｎＭ未満のＫＤをもってＩＬ－１８Ｒα／βヘテロ二量体に結合する、請求項５１に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  54. 追加のペプチドにコンジュゲートされる、請求項１から５３のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド。
  55. ａ）複数の修飾インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）ポリペプチドと、
    ｂ）前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合されるとともに、残基６５、残基６６、残基６７、残基６８、残基６９、残基７０、残基７１、残基７２、残基７３、残基７４、または残基７５にて結合される少なくとも１つのポリマー部分であって、アミノ酸残基の位置は参照配列として配列番号１に基づく、ポリマー部分と
    を含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団であって、
    前記修飾ＩＬ－１８の少なくとも９０％が、高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＨＲＭＳ）により判定したときに、前記複数の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのピーク分子量の±５００Ｄａ内にある分子量を有する、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  56. ａ）複数の修飾インターロイキン－１８（ＩＬ－１８）ポリペプチドと、
    ｂ）前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合されるとともに、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基６５、残基６６、残基６７、残基６８、残基６９、残基７０、残基７１、残基７２、残基７３、残基７４、または残基７５にて結合される複数のポリマー部分であって、アミノ酸残基の位置は参照配列として配列番号１に基づく、ポリマー部分と
    を含む修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団であって、
    前記複数のポリマー部分の少なくとも９０％が、高分解能エレクトロスプレーイオン化質量分析（ＥＳＩ－ＨＲＭＳ）により判定したときに、前記複数のポリマー部分のピーク分子量の±５００Ｄａ内にある分子量を有する、修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  57. 少なくとも１つのポリマー部分または前記複数のポリマー部分が、アミノ酸残基６８にて前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合され、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく、請求項５５または５６に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  58. 少なくとも１つのポリマー部分または前記複数のポリマー部分が、アミノ酸残基６９にて前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合され、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく、請求項５５または５６に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  59. 少なくとも１つのポリマー部分または前記複数のポリマー部分が、アミノ酸残基７０にて前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合され、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく、請求項５５または５６に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  60. 少なくとも１つのポリマー部分または前記複数のポリマー部分が、Ｃ６８にて前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合され、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく、請求項５５または５６に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  61. 少なくとも１つのポリマー部分または前記複数のポリマー部分が、Ｅ６９またはＥ６９Ｃにて前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合され、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく、請求項５５または５６に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  62. 少なくとも１つのポリマー部分または前記複数のポリマー部分が、Ｋ７０またはＫ７０Ｃにて前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドに共有結合され、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく、請求項５５または５６に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  63. 前記複数の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの各修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが、１つまたは複数の突然変異を含む、請求項５５から６２のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  64. 前記１つまたは複数の突然変異が、Ｅ０６、Ｋ５３、Ｙ０１、Ｓ５５、Ｆ０２、Ｄ５４、Ｃ３８、Ｔ６３、Ｃ６８、Ｅ６９、Ｃ７６、Ｃ１２７、およびＫ７０から選択される残基位置にあり、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸残基に対する番号付けは、参照配列として配列番号１に基づく、請求項６３に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  65. 前記１つまたは複数の突然変異が、Ｅ０６Ｋ、Ｋ５３Ａ、Ｙ０１Ｇ、Ｓ５５Ａ、Ｆ０２Ａ、Ｄ５４Ａ、Ｃ３８Ｓ、Ｃ３８Ａ、Ｔ６３Ａ、Ｃ６８Ｓ、Ｃ６８Ａ、Ｅ６９Ｃ、Ｃ７６Ｓ、Ｃ７６Ａ、Ｃ１２７Ｓ、Ｃ１２７Ａ、およびＫ７０Ｃから選択される、請求項６４に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  66. １つまたは複数の突然変異がＥ０６ＫおよびＫ５３Ａを含む、請求項６５に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  67. １つまたは複数の突然変異が、Ｅ０６Ｋ、Ｋ５３Ａ、およびＴ６３Ａを含む、請求項６５に記載のＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  68. 最低１μｇ、最低１０μｇ、または最低１ｍｇの前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む、請求項５５から６７のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  69. 最低１００個、最低１，０００個、または最低１０，０００個の前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む、請求項５５から６７のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  70. 前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団における重量平均分子量と数平均分子量との比が最大１．１である、請求項５５から６９のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  71. 前記複数のポリマーのそれぞれが水溶性ポリマーを含む、請求項５５から７０のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  72. 前記水溶性ポリマーが、ポリ（アルキレンオキシド）、ポリサッカライド、ポリ（ビニルピロリドン）、ポリ（ビニルアルコール）、ポリオキサゾリン、ポリ（アクリロイルモルホリン）、またはそれらの組合せを含む、請求項７１に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  73. 前記水溶性高分子がポリエチレングリコールを含む、請求項７１に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  74. 前記複数のポリマーの重量平均分子量が約２００Ｄａ～約５０，０００Ｄａである、請求項５５から７３のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  75. 前記複数のポリマーの重量平均分子量が約１０，０００Ｄａ～約３０，０００Ｄａである、請求項５５から７４のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団。
  76. 請求項１から５４のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む宿主細胞。
  77. 請求項１から５４のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを産生する方法であって、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを宿主細胞中で発現する工程を含む方法。
  78. 前記宿主細胞が原核細胞または真核細胞である、請求項７６または７７に記載の宿主細胞。
  79. 哺乳動物細胞、鳥類細胞、真菌細胞、または昆虫細胞である、請求項７６または７７に記載の宿主細胞。
  80. ＣＨＯ細胞、ＣＯＳ細胞、または酵母菌細胞である、請求項７９に記載の宿主細胞。
  81. ａ）請求項１から５４のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドまたは請求項５５から７５のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチド集団と、
    ｂ）薬学的に許容可能な担体または賦形剤と
    を含む医薬組成物。
  82. 凍結乾燥形態にある、請求項８１に記載の医薬組成物。
  83. 癌の処置を必要とする対象の癌を処置する方法であって、請求項１から５４のいずれか一項に記載の修飾ＩＬ－１８ポリペプチドまたは請求項８１もしくは８２に記載の医薬組成物を薬学的有効量で前記対象に投与する工程を含む方法。
  84. 前記癌が固形癌である、請求項８３に記載の方法。
  85. 前記固形癌が、腎臓癌、皮膚癌、膀胱癌、骨癌、脳癌、乳癌、大腸癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、肺癌、卵巣癌、膵臓癌、または前立腺癌である、請求項８４に記載の方法。
  86. 前記固形癌が、転移性腎細胞癌または黒色腫である、請求項８４に記載の方法。
  87. 前記固形癌が、癌腫または肉腫である、請求項８４に記載の方法。
  88. 前記癌が血液癌である、請求項８３に記載の方法。
  89. 前記血液癌が、白血病、非ホジキンリンパ腫、ホジキンリンパ腫、または多発性骨髄腫である、請求項８８に記載の方法。
  90. 前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドまたは前記医薬組成物の凍結乾燥形態を再構成する工程をさらに含む、請求項８３から８９のいずれか一項に記載の方法。
  91. 合成ＩＬ－１８ポリペプチドであって、残基２１～４１、残基６０～８０、および残基１０６～１２６の領域から選択される位置にホモセリン（Ｈｓｅ）残基を含む合成ＩＬ－１８ポリペプチドを含み、修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく、合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  92. 残基２１～４１、残基６０～８０、および残基１０６～１２６の領域のそれぞれにＨｓｅ残基を含む、請求項９１に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  93. ３１位にＨｓｅ残基を含む、請求項９１または９２に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  94. ６３位または７５位にＨｓｅ残基を含む、請求項９１から９３のいずれか一項に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  95. ６３位にＨｓｅ残基を含む、請求項９４に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  96. ７５位にＨｓｅ残基を含む、請求項９４に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  97. １１６位にＨｓｅ残基を含む、請求項９１から９６のいずれか一項に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  98. ３１位、１１６位、および６３位と７５位の少なくとも１つにＨｓｅ残基を含む、請求項９１から９７のいずれか一項に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  99. 配列番号１に少なくとも１つのメチオニン残基のアミノ酸置換を含む、請求項９１から９８のいずれか一項に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  100. 配列番号１における少なくとも１つのメチオニン残基の前記アミノ酸置換が、Ｍ３３、Ｍ５１、Ｍ６０、Ｍ８６、Ｍ１１３、またはＭ１５０に置換を含む、請求項９９に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  101. 少なくとも３つのメチオニン残基の置換を含む、請求項９９または１００に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  102. 少なくとも５つのメチオニン残基の置換を含む、請求項９９から１０１のいずれか一項に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  103. 少なくとも６つのメチオニン残基の置換を含む、請求項９９から１０２のいずれか一項に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  104. 少なくとも１つのメチオニン残基がＯ－メチル－ホモセリン（Ｏｍｈ）残基に置換される、請求項９９から１０３のいずれか一項に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  105. 少なくとも３つのメチオニン残基がＯｍｈ残基に置換される、請求項９９から１０４のいずれか一項に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  106. 少なくとも５つのメチオニン残基がＯｍｈ残基に置換される、請求項９９から１０５のいずれか一項に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  107. 各メチオニン置換がノルロイシンまたはＯｍｈ残基に対するものである、請求項９９から１０６のいずれか一項に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  108. 各メチオニン置換がＯｍｈ残基に対するものである、請求項９９から１０７のいずれか一項に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  109. 配列番号１の各メチオニン残基がＯｍｈ残基に置換される、請求項９９から１０８のいずれか一項に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  110. 配列番号１に対するさらなる突然変異を含む、請求項９１から１０９のいずれか一項に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  111. 配列番号１のアミノ酸配列に対し少なくとも約８０％同一のアミノ酸配列を含む、請求項９１から１１０のいずれか一項に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  112. 前記合成ＩＬ－１８ポリペプチドの残基に共有結合されるポリマーを含む、請求項９１から１１１のいずれか一項に記載の合成ＩＬ－１８ポリペプチド。
  113. 修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを作製する方法であって、
    ａ）前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの２つ以上のフラグメントを合成する工程と、
    ｂ）前記フラグメントをライゲートする工程と、
    ｃ）ライゲートされた前記フラグメントをフォールディングする工程と
    を含む方法。
  114. 前記２つ以上のフラグメントが、Ｎ末端フラグメント、Ｃ末端フラグメント、および任意選択で１つまたは複数の内部フラグメントを含み、前記Ｎ末端フラグメントは前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＮ末端を含み、前記Ｃ末端フラグメントは前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのＣ末端を含む、請求項１１３に記載の方法。
  115. 前記Ｎ末端フラグメントおよび前記１つまたは複数の内部フラグメントのそれぞれが、各フラグメントのＣ末端残基としてアルファ－ケトアミノ酸を含む、請求項１１４に記載の方法。
  116. 各アルファ－ケトアミノ酸が、アルファ－ケト－フェニルアラニン、アルファ－ケト－チロシン、アルファ－ケト－バリン、アルファ－ケト－ロイシン、アルファ－ケト－イソロイシン、アルファ－ケト－ノルロイシン、およびアルファ－ケト－Ｏ－メチルホモセリンから選択される、請求項１１５に記載の方法。
  117. 前記Ｃ末端フラグメントおよび前記１つまたは複数の内部フラグメントのそれぞれが、各フラグメントのＮ末端残基として、ヒドロキシルアミンまたは環状ヒドロキシルアミン機能を有する残基を含む、請求項１１４から１１６のいずれか一項に記載の方法。
  118. ヒドロキシルアミンまたは環状ヒドロキシルアミン機能を有する残基がそれぞれ５－オキサプロリン残基である、請求項１１７に記載の方法。
  119. 前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの２つ以上のフラグメントを合成する工程が、４つのフラグメントを合成することを含む、請求項１１３から１１８のいずれか一項に記載の方法。
  120. 前記４つのフラグメントが、Ｎ末端フラグメント、第１の内部フラグメント、第２の内部フラグメント、およびＣ末端フラグメントを含む、請求項１１９に記載の方法。
  121. 前記Ｎ末端フラグメントが、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸１～３０に対応する残基を含み、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく、請求項１２０に記載の方法。
  122. 前記Ｎ末端フラグメントが、配列番号１の配列と比較してＮ末端伸長部を含む、請求項１２０または１２１に記載の方法。
  123. 前記Ｎ末端フラグメントが、配列番号２０１に明記されるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２０から１２２のいずれか一項に記載の方法。
  124. 前記Ｎ末端フラグメントが、配列番号２０１～２０９のいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む、請求項１２０から１２３のいずれか一項に記載の方法。
  125. 前記第１の内部フラグメントが、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸３１～６２に対応する残基を含み、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく、請求項１２０から１２４のいずれか一項に記載の方法。
  126. 前記第１の内部フラグメントが、配列番号２１０に明記されるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２０から１２５のいずれか一項に記載の方法。
  127. 前記第１の内部フラグメントが、配列番号２１０～２１７のいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む、請求項１２０から１２６のいずれか一項に記載の方法。
  128. 前記第２の内部フラグメントが、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸６３～１１５に対応する残基を含み、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく、請求項１２０から１２７のいずれか一項に記載の方法。
  129. 前記第２の内部フラグメントが、配列番号２２７に明記されるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２０から１２８のいずれか一項に記載の方法。
  130. 前記第２の内部フラグメントが、配列番号２２７～２３６のいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む、請求項１２０から１２９のいずれか一項に記載の方法。
  131. 前記第１の内部フラグメントが、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸３１～７４に対応する残基を含み、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく、請求項１２０から１２４のいずれか一項に記載の方法。
  132. 前記第１の内部フラグメントが、配列番号２１８に明記されるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２０から１２４または１３１のいずれか一項に記載の方法。
  133. 前記第１の内部フラグメントが、配列番号２１８～２２６のいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む、請求項１２０から１２４、または１３１もしくは１３２のいずれか一項に記載の方法。
  134. 前記第２の内部フラグメントが、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸７５～１１５に対応する残基を含み、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく、請求項１２０から１２４、または１３１から１３３のいずれか一項に記載の方法。
  135. 前記第２の内部フラグメントが、配列番号２３７に明記されるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２０から１２４、または１３１から１３４のいずれか一項に記載の方法。
  136. 前記第２の内部フラグメントが、配列番号２３７～２４２のいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む、請求項１２０から１２４、または１３１から１３５のいずれか一項に記載の方法。
  137. 前記Ｃ末端フラグメントが、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドのアミノ酸１１６～１５７に対応する残基を含み、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドの残基位置に対する番号付けは参照配列として配列番号１に基づく、請求項１２０から１３６のいずれか一項に記載の方法。
  138. 前記Ｃ末端フラグメントが、配列番号２４３に明記されるアミノ酸配列に対し少なくとも８０％の配列同一性を有するアミノ酸配列を含む、請求項１２０から１３７のいずれか一項に記載の方法。
  139. 前記Ｃ末端フラグメントが、配列番号２４３～２４８のいずれか１つに明記されるアミノ酸配列を含む、請求項１２０から１３８のいずれか一項に記載の方法。
  140. 前記Ｎ末端フラグメント、前記第１の内部フラグメント、前記第２の内部フラグメント、および前記Ｃ末端フラグメントが、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチド中のそれぞれＮ末端からＣ末端まで配される、請求項１２０から１３９のいずれか一項に記載の方法。
  141. ライゲートされた前記フラグメントを再び配する工程をさらに含む、請求項１１３から１４０のいずれか一項に記載の方法。
  142. ＩＬ－１８ポリペプチドの前記フラグメントのうち少なくとも１つがコンジュゲーションハンドルを含む、請求項１１３から１４１のいずれか一項に記載の方法。
  143. 水溶性ポリマーを、フォールディングされライゲートされた前記フラグメントに結合させる工程をさらに含む、請求項１１３から１４２のいずれか一項に記載の方法。
  144. 修飾ＩＬ－１８ポリペプチドを含む融合タンパク質であって、前記修飾ＩＬ－１８ポリペプチドが、配列番号２～８３のいずれか１つに対し少なくとも約８０％同一の配列を含む、融合タンパク質。
  145. 前記配列が、配列番号２に対し少なくとも約８５％同一である、請求項１４４に記載の融合タンパク質。
  146. 前記配列が、配列番号２に対し少なくとも約９０％同一である、請求項１４４に記載の融合タンパク質。
  147. 前記配列が、配列番号２に対し少なくとも約９５％同一である、請求項１４４に記載の融合タンパク質。
  148. 前記配列が、配列番号１８に対し少なくとも約８５％同一である、請求項１４４に記載の融合タンパク質。
  149. 前記配列が、配列番号１８に対し少なくとも約９０％同一である、請求項１４４に記載の融合タンパク質。
  150. 前記配列が、配列番号１８に対し少なくとも約９５％同一である、請求項１４４に記載の融合タンパク質。
  151. 前記配列が配列番号１８と同一である、請求項１４４に記載の融合タンパク質。
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