CN113567677A - 一种新型免疫荧光信号放大技术标记方法 - Google Patents
一种新型免疫荧光信号放大技术标记方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN113567677A CN113567677A CN202110836515.5A CN202110836515A CN113567677A CN 113567677 A CN113567677 A CN 113567677A CN 202110836515 A CN202110836515 A CN 202110836515A CN 113567677 A CN113567677 A CN 113567677A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- tissue
- repairing
- antibody
- solution
- buffer solution
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 230000003321 amplification Effects 0.000 title claims abstract description 71
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 title claims abstract description 71
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 title claims abstract description 18
- 238000002372 labelling Methods 0.000 title claims description 22
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 46
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 14
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 claims description 47
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 42
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 37
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 29
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 29
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 29
- GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N fluorescein Chemical compound O1C(=O)C2=CC=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 GNBHRKFJIUUOQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 26
- 238000002791 soaking Methods 0.000 claims description 23
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims description 18
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims description 18
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 16
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 claims description 16
- 238000007789 sealing Methods 0.000 claims description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims description 12
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 9
- 238000001215 fluorescent labelling Methods 0.000 claims description 9
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 claims description 8
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 claims description 8
- 238000011010 flushing procedure Methods 0.000 claims description 8
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 8
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 claims description 8
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 8
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 claims description 7
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 claims description 7
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000000700 radioactive tracer Substances 0.000 claims description 7
- 239000008399 tap water Substances 0.000 claims description 7
- 235000020679 tap water Nutrition 0.000 claims description 7
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000001816 cooling Methods 0.000 claims description 6
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 6
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 claims description 6
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims description 5
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 4
- 238000007865 diluting Methods 0.000 claims description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 4
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 claims description 2
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 claims description 2
- 239000003086 colorant Substances 0.000 claims description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 2
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims description 2
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 2
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 claims description 2
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 claims description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 abstract description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 11
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 abstract description 2
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 abstract 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 80
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 26
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 26
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 26
- 238000003125 immunofluorescent labeling Methods 0.000 description 22
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 102100024616 Platelet endothelial cell adhesion molecule Human genes 0.000 description 10
- 208000005718 Stomach Neoplasms Diseases 0.000 description 10
- 206010017758 gastric cancer Diseases 0.000 description 10
- 201000011549 stomach cancer Diseases 0.000 description 10
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 9
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 9
- 206010038389 Renal cancer Diseases 0.000 description 8
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 8
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 7
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 7
- 210000005048 vimentin Anatomy 0.000 description 6
- 208000008839 Kidney Neoplasms Diseases 0.000 description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 5
- 201000010982 kidney cancer Diseases 0.000 description 5
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000003364 immunohistochemistry Methods 0.000 description 4
- 208000006265 Renal cell carcinoma Diseases 0.000 description 3
- DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-N Tyramine Natural products NCCC1=CC=C(O)C=C1 DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 3
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 3
- 201000010174 renal carcinoma Diseases 0.000 description 3
- 229960003732 tyramine Drugs 0.000 description 3
- DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-O tyraminium Chemical group [NH3+]CCC1=CC=C(O)C=C1 DZGWFCGJZKJUFP-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 3
- 238000000116 DAPI staining Methods 0.000 description 2
- 102100027581 Forkhead box protein P3 Human genes 0.000 description 2
- 101000861452 Homo sapiens Forkhead box protein P3 Proteins 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 150000001345 alkine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 150000001540 azides Chemical class 0.000 description 2
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 2
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 108090001008 Avidin Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 102000013127 Vimentin Human genes 0.000 description 1
- 108010065472 Vimentin Proteins 0.000 description 1
- IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N azide group Chemical group [N-]=[N+]=[N-] IVRMZWNICZWHMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 238000009509 drug development Methods 0.000 description 1
- 238000007877 drug screening Methods 0.000 description 1
- 125000002534 ethynyl group Chemical group [H]C#C* 0.000 description 1
- 238000003234 fluorescent labeling method Methods 0.000 description 1
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 1
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000003365 immunocytochemistry Methods 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000013115 immunohistochemical detection Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 238000012151 immunohistochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000012308 immunohistochemistry method Methods 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000005462 in vivo assay Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
- G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/5306—Improving reaction conditions, e.g. reduction of non-specific binding, promotion of specific binding
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/531—Production of immunochemical test materials
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明提供的一种新型免疫荧光信号放大技术标记方法，结合了点击化学和TSA信号放大法，发挥了两种方法的优势，根据实验需要可进行多轮循环放大，不会给切片组织带来更多的背景，不会影响标记的检测效果，用荧光检测技术时，曝光值低，可避免自发荧光干扰，检测荧光信号可以更灵敏，尤其对于弱表达蛋白质靶点具有很好的检测效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药应用技术领域，具体涉及一种新型免疫荧光信号放大技术标记方法。
背景技术
免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。免疫组化技术近年来得到迅速发展。
传统免疫组织化学一般采用生物素-亲和素法，多聚增强的DAB两步或者一步法等。生物素-亲和素法(又称抗生物素)系统(biotinavidin system,BAS)标记抗体的技术是20世纪70年代后期发展起来的一种新的免疫检测方法，由于亲和素与生物素间的亲和力极强，结合迅速，且极其稳定，生物素标记抗体和酶的标记率高，又不影响蛋白的活性，使BAS标记技术比常规酶联免疫、放射免疫及荧光免疫技术有着更高的灵敏度，为微量抗原、抗体的检测开辟了新的途径。一步法是将酶等标记物直接标记在特异性的第一抗体上，然后用该被标记的第一抗体与组织细胞中的抗原结合即可以用显色剂显色。二部法是将酶标记物标记在第二抗体或第三抗体(复合物)上，其方法是先将特异性第一抗体与组织细胞中的抗原结合，再将酶标记的第二抗体与第一抗体结合，然后用显色剂显色。
传统免疫组织化学所用标记方法一般有点击化学，酪胺信号放大技术等。点击化学就是利用碳-杂原子成键反应快速实现分子多样性，一般由叠氮化物(azide)和炔烃(alkyne)作用形共价键，具有高效稳定，高特异性等优点。反应不受PH影响，能在常温条件下的水中进行,甚至能在活细胞中进行，已被广泛用于药物筛选、药物开发、聚合及其它生物体外和体内分析。酪胺信号放大技术(TSA)基于信号分子沉淀原理，在H2O2存在时，通过探针固定的辣根过氧化物酶将标记的底物酪胺转化为具有短暂活性的中间状态，然后被激活的底物分子迅速与相接蛋白分子的富含电子区域(酪氨酸残基)进行稳定的共价结合；由于相接蛋白(抗原、HRP等)都含有大量的酪氨酸结合位点，所以会富集大量信号，使信号被有效放大。
以上方法都只是单一的某一种放大方法，放大效果存在一定局限性，传统免疫组化方法会要求第一抗体是不同来源或者第一抗体的表达检测效果很差或者呈现阴性结果，单独的TSA信号放大技术遇到弱表达蛋白质需要反复三轮以上的放大，费时耗力，同时易形成非特异性背景染色或者高背景、待检组织本身自发荧光干扰检测结果等缺点；尤其对于弱表达蛋白质靶点检测放大效果不理想，亟待解决。
发明内容
为解决现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种新型免疫荧光信号放大技术标记方法，结合了TSA信号放大技术和点击化学放大技术两者的优点，在一种检测方法中只需要两步信号放大即可实现对单个或者多个待检靶蛋白进行检测，信号强度和灵敏度同比信号放大轮数远远高于优于传统的免疫组化方法或者单一免疫组化的新型的信号放大技术，可以极大程度减少非特着色和显著降低了背景，对于荧光染色观测时的曝光值甚至可以降低到几十微秒的时间，同时对组织本底的自发荧光可以通过显著降低曝光值屏蔽掉自发荧光，基本上可以避免掉绝大部分的自发荧光对检测结果的干扰，特别是对于弱表达蛋白质靶点检测具有优秀性能。为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种新型免疫荧光信号放大技术标记方法，其特征在于包括如下步骤：
S1.石蜡切片脱蜡，脱蜡后置于水中准备修复；
S2.抗原修复：根据不同组织不同抗体选择适合的修复方式进行抗原修复；
S3.阻断内源性过氧化物酶：配置好适量3％H2O2，将修复冷却好的切片置于放入3％H2O2浸泡10-30min，去除内源性过氧化物酶，然后取出切片，将切片置于缓冲液内浸泡冲洗三次，每次3-7min；
S4.封闭：用组化笔在组织周围画好圈，避免画到组织或避免画得太近引起边缘效应，画好圈的切片应置于加过吐温的缓冲液中浸泡，后配置与第二抗体来源一致的血清进行封闭，不洗；
S5.加第一种第一抗体：取出组织载玻片，甩掉切片上血清，置于湿盒中，将第一抗体滴加到组织上并完全覆盖，根据抗体稀释比例用缓冲液稀释抗体，阴性对照组织加抗体稀释液代替第一抗体，37℃孵育1-2h，或4℃孵育8-12h；
S6.复温：步骤S5采用4℃孵育8-12h时需用此步，将湿盒从冰箱取出，分散依次摊开进行复温，计时10-30min后用缓冲液冲洗，后将切片置于铁架上，用自来水冲洗切片2-3次后，将切片置于加过吐温20的缓冲液中浸泡冲洗3次，每次3-7min；
S7.加HRP标记的第二抗体：擦干组织周围缓冲液，滴加第二抗体后室温孵育25-35min，后用缓冲液洗3次，每次3-7min；
S8.信号放大：滴加TSA-Alkyne试剂，完全覆盖待检组织，进行第一轮信号放大，反应时间需要5-15min，缓冲液浸泡冲洗3次,每次3-7min。滴加第一Azide-示踪标记物和TSA-Alkyne试剂，完全覆盖待检组织，进行信号放大，反应时间需要5-15min；
S9.洗片子：缓冲液洗3次，每次3-7min；
S10.重复2-9步骤，做第二种第一抗体，具体地，重复S8步骤时，滴加第二Azide-示踪标记物，该示踪标记物(荧光素)可根据需要选择不同显色颜色的荧光素；
S11.复染DAPI：滴加DAPI染液染色10min，缓冲液充分冲洗冲洗3次,每次3-7min；
S12.封片采图：滴加防荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜或者数字切片扫描仪下观察并摄像。
S13.以此类推：可以重复2-9步骤做第三种、第四种、第五种乃至第六种、第七种抗体，理论上可以做八种以上的抗体。
进一步地，所述石蜡切片脱蜡步骤为：将组织载玻片依次放入透明剂10min、透明剂10min、透明剂10min、无水乙醇5min、95％乙醇5min、75％乙醇5min,后用自来水冲洗干净。
进一步地，所述步骤S2还包括修复液，所述抗原修复方式包括高温高压修复或酶修复，所述修复液为抗原修复液或酶修复液。
进一步地，所述抗原修复液为PH5.0-7.0柠檬酸或者PH8.0-9.0 EDTA。
进一步地，所述步骤S2中抗原修复使用高温高压修复，其步骤为：在高压锅中加入抗原修复液柠檬酸，将脱蜡水化后的组织切片放入高压锅的缓冲液中，高压锅喷气后计时，然后停火；冷水冲淋高压锅，气压下降后打开锅盖，待修复液自然冷却至室温后，将切片从修复液中取出，用缓冲液冲洗3次，每次3-7min。
进一步地，所述步骤S2中抗原修复使用高温高压修复，其步骤为：在高压锅中加入抗原修复液PH8.0 EDTA，将脱蜡水化后的组织切片放入高压锅的缓冲液中，高压锅喷气后计时，然后停火；冷水冲淋高压锅，气压下降后打开锅盖，待修复液自然冷却至室温后，将切片从修复液中取出，用缓冲液冲洗3次，每次3-7min。
进一步地，所述步骤S2中，使用柠檬酸修复液时，高压锅喷气后计时时间为1-3min；使用PH8.0 EDTA修复液时，高压锅喷气后计时时间为1-2min。
进一步地，所述步骤S2中抗原修复使用酶修复，具体步骤为：将切片用组化笔在组织周围画好圈后，再将配置好的酶修复液滴加到组织上并完全覆盖组织，将切片依次摆放在湿盒内，湿盒中装有适量水和甘油，置于温箱37℃10-30min。
进一步地，所述缓冲液为PH5.0-7.0 PBS缓冲液或者加入了少量吐温20的PH5.0-7.0 PBST缓冲液，所述酶修复液为胃蛋白酶液或者胰蛋白酶液，所述荧光标记试剂包括Azide-FITC或者CY3或者CY5。
进一步地，在石蜡切片脱蜡步骤之前，还包括步骤S0：烤片。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果是：
结合了点击化学和TSA信号放大法，发挥了两种方法的优势，先使用TSA-Alkyne标记第二抗体，进行一步TSA放大，后加入Azide-FITC/CY3/CY5等荧光标记及TSA-Alkyne试剂，TSA-Alkyne试剂的乙炔基团和Azide-FITC/CY3/CY5等荧光标记中的叠氮基团能发生点击化学反应，使两种试剂发生结合，从而利用点击化学再次放大，产生大量的可标记结合部位，表达信号被成倍放大，还根据实验需要可以进行多轮循环放大。用TSA-Alkyne试剂和Azide-FITC/CY3/CY5等荧光标记试剂(不限于这三种)的结合代替了生物素-亲和素放大方法，不会给切片组织带来更多的背景，从而影响标记检测效果，尤其对于弱表达蛋白质靶点具有优秀的检测效果。总之，TSA法与点击化学放大信号的结合，检测信号可成倍放大，使信号更灵敏，曝光时间更短，可有效避免非特异性背景染色问题，实现更高效的免疫组织化学检测分析。
附图说明
图1-9为普通荧光标记法FITC，Cy3，Cy5单标染色结果图；
图1为人胃癌组织CD31，常规方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：1000，荧光素FITC，50ms曝光，看不见清晰的荧光信号；
图2为人肾癌组织CD31常规方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：1000，荧光素FITC，50ms曝光，看不见清晰的荧光信号；
图3为人肝癌组织CD31常规方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：1000，荧光素FITC，50ms曝光，看不见清晰的荧光信号；
图4为人肾癌组织ki67常规方法免疫荧光染色，稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：200，荧光素CY3，50ms曝光，看不见清晰的荧光信号；
图5为人肝癌组织ki67常规方法免疫荧光染色，稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：200，荧光素CY3，50ms曝光，看不见清晰的荧光信号；
图6为人胃癌组织ki67常规方法免疫荧光染色，稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：200，荧光素CY3，50ms曝光，看不见清晰的荧光信号；
图7为人肝癌组织Vimentin常规方法免疫荧光染色，稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：200，荧光素CY5，20ms曝光，看不见清晰的荧光信号；
图8为人胃癌组织Vimentin,常规方法免疫荧光染色，稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：200，荧光素CY5，20ms曝光，看不见清晰的荧光信号；
图9为人胃癌组织ki67常规方法免疫荧光染色，稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：200，荧光素CY5，20ms曝光，看不见清晰的荧光信号；
图10-18为本发明新型信号放大荧光标记法Cy3，Cy5，FITC单标染色结果图；
图10为人肝癌组织ki67新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：2000，荧光素CY3，50ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
图11为人肝癌组织ki67新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：2000，荧光素CY3，100ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
图12为人胃癌组织ki67新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：2000，荧光素CY3，50ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
图13为人胃癌组织ki67新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：2000，荧光素CY3，100ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
图14为人肾癌组织ki67新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：2000，荧光素CY3，50ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
图15为人肾癌组织ki67新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：2000，荧光素CY3，100ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
图16为人肝癌组织Vimentin新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：4000，荧光素CY5，40ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
图17为人胃癌组织Vimentin新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：4000，荧光素CY5，40ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
图18为人肾癌组织Vimentin新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：4000，荧光素CY5，40ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
图19为人肝癌组织CD31新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：8000，荧光素FITC，20ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
图20为人肝癌组织CD31新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：8000，荧光素FITC，50ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
图21为人肾癌组织CD31新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：8000，荧光素FITC，20ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
图22为人肾癌组织CD31新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：8000，荧光素FITC，50ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
图23为人胃癌组织CD31新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：8000，荧光素FITC，20ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
图24为人胃癌组织CD31新型放大方法免疫荧光染色,稀释浓度为第一抗体：缓冲液＝1：8000，荧光素FITC，50ms曝光，看见清晰的荧光信号，背景干净；
图25为小鼠肺组织横切，使用新型放大方法进行三种同来源第一抗体同时荧光染色，CD4 FITC(绿色)浓度1：8000，曝光时间10ms；CD8 CY3(红色)浓度1：5000，曝光时间15ms；FOXP3 CY5(灰白色)，浓度1：1000，曝光时间8ms,采图倍数36.4倍(荧光病理切片扫描仪3DHISTECH)；其中浓度定义为第一抗体：缓冲液；
图中25-1为绿色荧光，25-2为红色荧光，25-3为灰白色荧光；
图26为小鼠肿瘤组织横切，使用新型放大方法进行三种同来源第一抗体同时荧光染色，CD4 FITC(绿色)浓度1：8000，曝光时间10ms；CD8 CY3(红色)浓度1：5000，曝光时间15ms；FOXP3 CY5(灰白色)，浓度1：1000，曝光时间8ms,采图倍数36.4倍(荧光病理切片扫描仪3DHISTECH)；其中浓度定义为第一抗体：缓冲液；
图中26-1为绿色荧光，26-2为红色荧光，26-3为灰白色荧光。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，多属于本发明保护的范围。
实施例1
一种新型免疫荧光信号放大技术标记方法，包括如下步骤：
S0.烤片：将组织载玻片置于烤片机中，设定温度58℃，时间2小时。
S1.脱蜡：将组织载玻片依次放入透明剂10min，透明剂10min，透明剂10min，无水乙醇I 5min，95％乙醇5min，75％乙醇5min，然后用自来水冲洗干净，置于水中准备修复。
S2.抗原修复：在高压锅中加入抗原修复液PH5.0的柠檬酸，另一实施例中为PH6.0的柠檬酸，再另一实施例中为PH7.0的柠檬酸；将脱蜡水化后的组织切片放入高压锅的缓冲液PH5.0 PBS中，另一实施例中为PH6.0 PBS，再另一实施例中为PH7.0 PBS；高压锅喷气后计时2min，停火；冷水冲淋高压锅，气压下降后打开锅盖，待修复液自然冷却至室温后，将切片从修复液PH5.0的柠檬酸中取出，用缓冲液PH5.0 PBS浸泡冲洗3次，每次5min，另一实施例中为3min，再另一实施例中为7min，。
S3.阻断内源性过氧化物酶：配置好适量3％的H2O2，将修复冷却好的切片置于3％H2O2浸泡30min，去除内源性过氧化物酶，然后取出切片，将切片置于缓冲液PH5.0 PBS内浸泡冲洗3次，每次3min。
S4.封闭：用组化笔在组织周围画好圈，避免画到组织或避免画得太近引起边缘效应。画好圈的切片置于加过吐温20的PH5.0 PBST中浸泡，然后配置与第二抗体来源一致的血清进行封闭，以减少背景染色，此步骤不冲洗。
S5.加第一种第一抗体：取出组织载玻片，甩掉切片上血清，置于湿盒中，将第一抗体滴加到组织上并完全覆盖，根据抗体稀释比例用缓冲液PH5.0 PBS稀释抗体，阴性对照组织加抗体稀释液代替第一抗体，37℃孵育1h。
S6.滴加带有HRP标记的第二抗体，擦干组织周围PBS，滴加第二抗体后室温孵育30min，然后用PH5.0 PBS冲洗3次，每次3min。
S7.信号放大：滴加TSA-Alkyne试剂，完全覆盖待检组织(第一轮信号放大，反应时间需要5min)，PH5.0 PBS浸泡冲洗3次，每次3min；滴加Azide-FITC/CY3/CY5荧光标记试剂中的一种和TSA-Alkyne试剂，进行第二轮信号放大，反应时间需要5min。
S8.洗片子：PH5.0 PBS冲洗3次，每次3min。
S9.复染DAPI：滴加DAPI染液染色10min，PH5.0 PBS缓冲液充分冲洗冲洗3次,每次3min。
S10.封片采图：滴加防荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜或者数字切片扫描仪下观察并摄像。
实施例2
一种新型免疫荧光信号放大技术标记方法，包括如下步骤：
S0.烤片：将组织载玻片置于烤片机中，设定温度60℃，时间1.5小时。
S1.脱蜡：将组织载玻片依次放入透明剂10min，透明剂10min，透明剂10min，无水乙醇I 5min，95％乙醇5min，75％乙醇5min，然后用自来水冲洗干净，置于水中准备修复。
S2.抗原修复：在高压锅中加入抗原修复液PH8.0 EDTA，另一实施例为PH9.0EDTA；将脱蜡水化后的组织切片放入高压锅的缓冲液PH5.0 PBS中，高压锅喷气后计时2min，停火；冷水冲淋高压锅，气压下降后打开锅盖，待修复液自然冷却至室温后，将切片从修复液PH8.0 EDTA中取出，用缓冲液PH5.0 PBS浸泡冲洗3次，每次5min。
S3.阻断内源性过氧化物酶：配置好适量3％的H2O2，将修复冷却好的切片置于3％H2O2浸泡30min，去除内源性过氧化物酶，然后取出切片，将切片置于缓冲液PH5.0 PBS内浸泡冲洗3次，每次5min。
S4.封闭：用组化笔在组织周围画好圈，避免画到组织或避免画得太近引起边缘效应。画好圈的切片置于加过吐温20的PH5.0 PBST中浸泡，然后配置与第二抗体来源一致的血清进行封闭，以减少背景染色，此步骤不冲洗。
S5.加抗体：取出组织载玻片，甩掉切片上血清，置于湿盒中，将第一抗体滴加到组织上并完全覆盖，根据抗体稀释比例用缓冲液PH5.0 PBS稀释抗体，阴性对照组织加抗体稀释液代替第一抗体，4℃孵育12h。
S6.复温：将湿盒从冰箱取出，分散依次摊开进行复温，计时15min后用PH5.0 PBS冲洗，后将切片置于铁架上，用自来水冲洗切片3次后，将切片置于加过的吐温20的PH5.0PBST中浸泡冲洗3次，每次5min。
S7.滴加带有HRP标记的第二抗体，擦干组织周围PBS，滴加第二抗体后室温孵育25min，然后用PH5.0 PBS冲洗3次，每次5min。
S8.信号放大：滴加TSA-Alkyne试剂，完全覆盖待检组织(第一轮信号放大，反应时间需要10min)，PH5.0 PBS浸泡冲洗3次，每次5min；滴加Azide-FITC荧光标记试剂(也可以称第一Azide-示踪标记物)和TSA-Alkyne试剂(进行第二轮信号放大，反应时间需要10min)。
S9.洗片子：PH5.0 PBS冲洗3次，每次3min。
S10.重复2-9步骤，做第二种抗体；具体地，重复S8步骤时，第二种抗体检测的信号放大：滴加TSA-Alkyne试剂，完全覆盖待检组织(第一轮信号放大，反应时间需要10min)，用PH5.0 PBS浸泡冲洗3次，每次5min；滴加Azide-CY3荧光标记试剂(也可以称第二Azide-示踪标记物)和TSA-Alkyne试剂(进行第二轮信号放大，反应时间需要10min)，用PH5.0 PBST浸泡冲洗3次，每次5min。
S11.重复2-9步骤，做第三种抗体；具体地，重复S8步骤时，第三种抗体检测的信号放大：滴加TSA-Alkyne试剂，完全覆盖待检组织(第一轮信号放大，反应时间需要10min)，用PH5.0 PBS浸泡冲洗3次，每次5min；滴加Azide-CY5荧光标记试剂(也可以称第三Azide-示踪标记物)和TSA-Alkyne试剂(进行第二轮信号放大，反应时间需要10min)，用PH5.0 PBST浸泡冲洗3次，每次5min。
S12.复染DAPI：滴加DAPI染液染色10min，PH5.0 PBS缓冲液充分冲洗冲洗3次,每次3-7min。
S13.封片采图：滴加防荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜或者数字切片扫描仪下观察并摄像。
本发明实施例可选用的组织切片有：人肝癌组织，人肾癌，人胃癌组织，小鼠的肺组织、肿瘤组织，包括但不限于此；可选用第一抗体有CD31、Ki67、Vimentin、CD4、CD8、FOXP3。
普通荧光标记(现有技术)的第一抗体稀释浓度和本发明的ALK-TSA放大技术荧光标记的第一抗体稀释浓度对比示例，如表1所示：
表1
缓冲液为PH5.0-7.0的PBS或PBST。
普通荧光标记常规第一抗体效价一般在1：50-500范围内，本方法经过放大后，第一抗体稀释了几倍甚至10倍以上，可以节省昂贵的科研抗体，极大降低了抗体的使用成本，并且本发明方法中虽然抗体经过稀释，但仍然可以达到相应的检测效果，乃至超过普通荧光标记的效果，甚至更好的效果，亮度要高一些。
本发明还提供点击化学试剂配比示例，如表2所示：
表2
从上到下依次按照顺序加入试剂，现配现用，并加入孵育液，混匀室温放置20min。
Claims (10)
1.一种新型免疫荧光信号放大技术标记方法，其特征在于包括如下步骤：
S1.石蜡切片脱蜡，脱蜡后置于水中准备修复；
S2.抗原修复：根据不同组织不同抗体选择适合的修复方式进行抗原修复；
S3.阻断内源性过氧化物酶：配置好适量3％H2O2，将修复冷却好的切片置于放入3％H2O2浸泡10-30min，去除内源性过氧化物酶，然后取出切片，将切片置于缓冲液内浸泡冲洗三次，每次3-7min；
S4.封闭：用组化笔在组织周围画好圈，避免画到组织或避免画得太近引起边缘效应，画好圈的切片置于加过吐温的缓冲液中浸泡，后配置与第二抗体来源一致的血清进行封闭，不洗；
S5.加第一种第一抗体：取出组织载玻片，甩掉切片上血清，置于湿盒中，将第一抗体滴加到组织上并完全覆盖，根据抗体稀释比例用缓冲液稀释抗体，阴性对照组织加抗体稀释液代替第一抗体，37℃孵育1-2h，或4℃孵育8-12h；
S6.复温：步骤S5采用4℃孵育8-12h时需用此步，将湿盒从冰箱取出，分散依次摊开进行复温，计时10-30min后用缓冲液冲洗，后将切片置于铁架上，用自来水冲洗切片2-3次后，将切片置于加过吐温20的缓冲液中浸泡冲洗3次，每次3-7min；
S7.加HRP标记的第二抗体：擦干组织周围缓冲液，滴加第二抗体后室温孵育25-35min，后用缓冲液洗3次，每次3-7min；
S8.信号放大：滴加TSA-Alkyne试剂，完全覆盖待检组织，进行第一轮信号放大，反应时间需要5-15min，缓冲液浸泡冲洗3次,每次3-7min。滴加第一Azide-示踪标记物和TSA-Alkyne试剂，完全覆盖待检组织，进行信号放大，反应时间需要5-15min。
S9.洗片子：缓冲液洗3次，每次3-7min；
S10.重复2-9步骤，做第二种抗体；具体地，重复S8步骤时，滴加第二Azide-示踪标记物，该示踪标记物(荧光素)可根据需要选择不同显色颜色的荧光素；
S11.复染DAPI：滴加DAPI染液染色10min，缓冲液充分冲洗冲洗3次,每次3-7min；
S12.封片采图：滴加防荧光淬灭剂封片，在荧光显微镜或者数字切片扫描仪下观察并摄像；
S13.以此类推：可以重复2-9步骤做第三种、第四种、第五种乃至第六种、第七种抗体，理论上可以做八种以上的抗体。
2.根据权利要求1所述的新型免疫荧光信号放大技术标记方法，其特征在于所述步骤S1中石蜡切片脱蜡步骤为：将组织载玻片依次放入透明剂10min、透明剂10min、透明剂10min、无水乙醇5min、95％乙醇5min、75％乙醇5min,后用自来水冲洗干净。
3.根据权利要求1所述的新型免疫荧光信号放大技术标记方法，其特征在于：所述步骤S2还包括修复液，所述抗原修复方式包括高温高压修复或酶修复，所述修复液为抗原修复液或酶修复液。
4.根据权利要求3所述的新型免疫荧光信号放大技术标记方法，其特征在于：所述抗原修复液为PH5.0-7.0柠檬酸或者PH8.0-9.0EDTA。
5.根据权利要求1所述的新型免疫荧光信号放大技术标记方法，其特征在于：所述步骤S2中抗原修复使用高温高压修复，其步骤为：在高压锅中加入抗原修复液柠檬酸，将脱蜡水化后的组织切片放入高压锅的缓冲液中，高压锅喷气后计时，然后停火；冷水冲淋高压锅，气压下降后打开锅盖，待修复液自然冷却至室温后，将切片从修复液中取出，用缓冲液冲洗3次，每次3-7min。
6.根据权利要求1所述的新型免疫荧光信号放大技术标记方法，其特征在于：所述步骤S2中抗原修复使用高温高压修复，其步骤为：在高压锅中加入抗原修复液EDTA，将脱蜡水化后的组织切片放入高压锅的缓冲液中，高压锅喷气后计时，然后停火；冷水冲淋高压锅，气压下降后打开锅盖，待修复液自然冷却至室温后，将切片从修复液中取出，用缓冲液冲洗3次，每次3-7min。
7.根据权利要求5-6任一项所述的新型免疫荧光信号放大技术标记方法，其特征在于：所述步骤S2中，使用柠檬酸修复液时，高压锅喷气后计时时间为1-3min；使用EDTA修复液时，高压锅喷气后计时时间为1-2min。
8.根据权利要求1所述的新型免疫荧光信号放大技术标记方法，其特征在于：所述步骤S2中抗原修复使用酶修复，具体步骤为：将切片用组化笔在组织周围画好圈后，再将配置好的酶修复液滴加到组织上并完全覆盖组织，将切片依次摆放在湿盒内，湿盒中装有适量水和甘油，置于温箱37℃10-30min。
9.根据权利要求1所述的新型免疫荧光信号放大技术标记方法，其特征在于：所述缓冲液为PH5.0-7.0PBS缓冲液或者加入了少量吐温20的PH5.0-7.0PBST缓冲液，所述酶修复液为胃蛋白酶液或者胰蛋白酶液，所述荧光标记试剂包括Azide-FITC或者CY3或者CY5。
10.根据权利要1所述的新型免疫荧光信号放大技术标记方法，其特征在于：在石蜡切片脱蜡步骤之前，还包括步骤S0：烤片。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110836515.5A CN113567677B (zh) | 2021-07-23 | 2021-07-23 | 一种免疫荧光信号放大技术标记方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110836515.5A CN113567677B (zh) | 2021-07-23 | 2021-07-23 | 一种免疫荧光信号放大技术标记方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN113567677A true CN113567677A (zh) | 2021-10-29 |
| CN113567677B CN113567677B (zh) | 2024-04-12 |
Family
ID=78166728
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202110836515.5A Active CN113567677B (zh) | 2021-07-23 | 2021-07-23 | 一种免疫荧光信号放大技术标记方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN113567677B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113552362A (zh) * | 2021-07-23 | 2021-10-26 | 湖北百奥斯生物科技有限公司 | 一种新型信号放大的免疫荧光试剂盒 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050069962A1 (en) * | 2001-10-12 | 2005-03-31 | Archer Robert M | Antibody complexes and methods for immunolabeling |
| CN103513033A (zh) * | 2013-10-11 | 2014-01-15 | 江南大学 | 一种基于酪胺信号放大技术和适配体识别的金黄色葡萄球菌可视化检测方法 |
| CN109641922A (zh) * | 2016-06-28 | 2019-04-16 | 文塔纳医疗系统公司 | 点击化学用于ihc和ish测定中的信号扩增的应用 |
| CN110632292A (zh) * | 2019-06-12 | 2019-12-31 | 江苏莱尔生物医药科技有限公司 | 一种检测pd-l1和cd8抗原的免疫荧光试剂盒及应用方法 |
| CN111830256A (zh) * | 2020-07-01 | 2020-10-27 | 北京基谱生物科技有限公司 | 一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒及使用方法 |
-
2021
- 2021-07-23 CN CN202110836515.5A patent/CN113567677B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20050069962A1 (en) * | 2001-10-12 | 2005-03-31 | Archer Robert M | Antibody complexes and methods for immunolabeling |
| CN103513033A (zh) * | 2013-10-11 | 2014-01-15 | 江南大学 | 一种基于酪胺信号放大技术和适配体识别的金黄色葡萄球菌可视化检测方法 |
| CN109641922A (zh) * | 2016-06-28 | 2019-04-16 | 文塔纳医疗系统公司 | 点击化学用于ihc和ish测定中的信号扩增的应用 |
| CN110632292A (zh) * | 2019-06-12 | 2019-12-31 | 江苏莱尔生物医药科技有限公司 | 一种检测pd-l1和cd8抗原的免疫荧光试剂盒及应用方法 |
| CN111830256A (zh) * | 2020-07-01 | 2020-10-27 | 北京基谱生物科技有限公司 | 一种石蜡切片免疫荧光多重染色试剂盒及使用方法 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 张奇;王彬;黎霞;侯洁;白芳;孙丹;白钢;: "基于点击化学反应的免疫荧光检测方法的建立和应用", 高等学校化学学报, no. 02, 10 February 2011 (2011-02-10) * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN113552362A (zh) * | 2021-07-23 | 2021-10-26 | 湖北百奥斯生物科技有限公司 | 一种新型信号放大的免疫荧光试剂盒 |
| CN113552362B (zh) * | 2021-07-23 | 2024-08-09 | 湖北百奥斯生物科技有限公司 | 一种新型信号放大的免疫荧光试剂盒 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN113567677B (zh) | 2024-04-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP3555622B1 (en) | Methods and systems for quantitative immunohistochemistry | |
| Sanderson et al. | 19—Immunohistochemical and immunofluorescent techniques | |
| EP1934607B1 (en) | Multiplex in situ immunohistochemical analysis | |
| DK1733437T3 (en) | Immunoassay reagents and methods of use thereof | |
| Taylor | Immunocytochemical methods in the study of lymphoma and related conditions. | |
| CN113762379B (zh) | 一种基于免疫组化生成训练数据的方法和存储设备 | |
| CN110850094A (zh) | 一种免疫组化双标单染试剂盒及其使用方法和应用 | |
| CN112649601B (zh) | 一种酶标偶联二抗及其制备方法 | |
| CN111077302A (zh) | 一种基于葡聚糖信号放大ki67和p16INK4a检测试剂盒 | |
| CN113567677B (zh) | 一种免疫荧光信号放大技术标记方法 | |
| CN101294903B (zh) | 在同一标本上检测同一抗原表达的方法 | |
| CN111363789B (zh) | 一种同时检测蛋白质和rna的试剂盒和方法 | |
| CN115754281B (zh) | 一种荧光纳米粒子在免疫荧光组化染色中的应用 | |
| CN113552362B (zh) | 一种新型信号放大的免疫荧光试剂盒 | |
| CN109709333B (zh) | H4k20、h3k9及h3k36三甲基化量检测试剂在食管癌预后评估中的应用 | |
| CN117269472B (zh) | 一种通用型免疫组化辅助试剂盒 | |
| CN111551705A (zh) | 一种提高免疫组化效率的方法 | |
| CN113607534B (zh) | 一种染色方法、试剂盒及应用 | |
| Denk | Immunohistochemical methods for the demonstration of tumor markers | |
| CN116444424B (zh) | 一种基于聚集诱导发光的酪酰胺荧光材料、免疫组化染色试剂盒及其应用 | |
| Milios et al. | Avidin-biotin-peroxidase complex reagents for routine histological application: a comparison of four commercial kits | |
| CN116879557A (zh) | 肺癌组织学分型多重荧光组化检测方法及其试剂盒和应用 | |
| CN116068189A (zh) | 早期癌检测试剂及其应用 | |
| WO2024145053A1 (en) | Tyramide and tyramide analog conjugates and uses thereof for biological target staining procedures | |
| Elias | Immunohistochemistry: a brief historical perspective |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |