CN111551705A - 一种提高免疫组化效率的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种提高免疫组化效率的方法，包括如下步骤：步骤一，切片的制备；步骤二，脱蜡和水化；步骤三，抗原修复；步骤四，冲洗；步骤五，加入一抗；步骤六，封闭；步骤七，加入二抗；步骤八，显色；其中，以上步骤均在电场环境下进行。该方法的特点在于整个免疫组化过程在电场环境下进行，从而实现低环境负荷型微量液滴无损搅拌，进而大幅度降低抗体的使用量，节约成本，更重要的是能大幅度缩短组织免疫诊断的反应时间，甚至可将组织免疫诊断的反应时间由现今177min的水平缩短到19 min，另外该方法还可以用在核酸快速诊断上，将反应时间由现今720min的水平缩短到30 min，极大地提高诊断效率。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种提高免疫组化效率的方法。
背景技术
免疫组织化学（IHC）是通过化学反应标记抗体的显色剂，利用抗原与抗体特异性结合的原理，定性定量的研究组织或细胞中的未知抗原。近年来，随着免疫组化技术的发展，许多疑难肿瘤得到了明确的诊断。免疫组化技术用于临床切片诊断肿瘤细胞上处于非常重要的地位。我国免疫组化技术是从上个世纪60年代发展起来的，然而，现阶段我国免疫组化用于临床诊断仍然存在许多技术瓶颈，例如，免疫组化所耗费的时间很长，通常情况下，免疫诊断反应需过夜，时间超过24小时，无法达到现场快速检测的目的。
因此大大缩短反应时间尤为重要，如何在不损坏抗原抗体蛋白活性的前提下，提高其反应结合率，减少反应所需时间，依然是现阶段免疫组化技术面临的挑战。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是对以上不足进行了深度改良和机理分析，提供一种提高免疫组化效率的方法，该方法的特点在于整个免疫组化过程在电场环境下进行，从而实现低环境负荷型微量液滴无损搅拌，进而大幅度降低抗体的使用量，节约成本，更重要的是能大幅度缩短组织免疫诊断的反应时间，甚至可将组织免疫诊断的反应时间由现今177min的水平缩短到19 min，另外该方法还可以用在核酸快速诊断上，将反应时间由现今720min的水平缩短到30 min，极大地提高诊断效率。具体技术方案如下：
一种提高免疫组化效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，切片的制备：取组织切片，展片、捞片后固定2min,于低温下保存；
步骤二，脱蜡和水化：将蜡片置于二甲苯中浸泡后，甩去多余液体置于无水乙醇中浸泡，再依次由自来水，PBS溶液冲洗；
步骤三，抗原修复：取配置好的抗原修复液放入抗原修复盒中，液体超过组织切片上边缘0.5cm，盖上盖子锡箔纸外围封盖2min；
步骤四，冲洗：将步骤三中的组织切片用PBS溶液冲洗1min;
步骤五，加入一抗：甩去多余液体后，加入1mg/mL的一抗试剂50uL，室温孵育5min；
步骤六，封闭：加入封闭液封闭1min；
步骤七，加入二抗：甩去多余液体后，加入1mg/mL 的二抗酶标聚合物50μL，室温孵育5min；
步骤八，显色：甩去多余的液体后，加入50uL DAB显色液，室温孵育1min，显微镜下观察染色结果，防止过染，自来水冲洗；
其中，以上步骤均在电场环境下进行。
进一步，步骤一中切片取4um，在45℃展片，于67℃固定2min，保存温度为-20℃。
进一步，步骤二中，于二甲苯中浸泡5s，于无水乙醇中浸泡5s×1次，自来水冲洗30min，PBS溶液冲洗5s×1次，其中PBS溶液为10mM PBS，pH为7.2 。
进一步，步骤三中的抗原修复的温度范围为102-120℃。
进一步，步骤四中的PBS溶液为pH 7.0 的10mM PBS 溶液加0.8%NaCl和0.02%KCl。
进一步，步骤五后需用PBS溶液冲洗15s。
进一步，步骤六后需用PBS溶液冲洗15s。
进一步，步骤七后需用PBS溶液冲洗15s。
本发明附加的方面和优点将在下面的描述中进一步给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
图1为结肠癌生物切片相同时间现有方法和本方法免疫组化对比图，其中左图为现有技术染色后效果图，右图为本方法染色后效果图；
图2为是否加磁珠的抗体残留量示意图。
具体实施方式
以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变型。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。
本发明的提高免疫组化效率的方法，均在电场环境下进行，其具体包括如下步骤：
步骤一，切片的制备：
取结肠癌组织切片，在组织切片机上4um切片，45℃展片，粘附载玻片捞片，67℃电场环境下固定2min，保存于-20℃。
步骤二，脱蜡和水化：
将蜡片置于二甲苯中浸泡5s；甩去多余的液体后，置于无水乙醇中浸泡5s×1次，自来水冲洗30min后，PBS溶液（pH7.2 10mM PBS）冲洗5s×1次。
步骤三，抗原修复：
取配置好的抗原修复液放入抗原修复盒中，液体以超过组织上边缘0.5cm为宜，盖上盖子后，102-120℃，锡箔纸外围封盖2min。
步骤四，清洗：
将步骤三中的组织切片用PBS溶液冲洗1min;其中PBS溶液为pH 7.0 的10mM PBS 溶液＋0.8%NaCl和0.02% KCl。
步骤五，加入一抗：
甩去多余液体后，切片上加入1mg/mL 50uL一抗试剂，室温孵育5min，后用PBS溶液冲洗15s。
步骤六，封闭：
将切片放于电场环境下，切片上加入封闭液封闭1min，之后PBS溶液冲洗15s。
步骤七，加入二抗：
甩去多余液体后，切片上加入1mg/mL 50μL二抗酶标聚合物，室温孵育5min，之后PBS冲洗15s次。
步骤八，显色：
甩去多余的液体后，切片上加入50uL DAB显色液，室温孵育1min，显微镜下观察染色结果，防止过染，自来水冲洗。
在本申请的另一实施例中，一抗与切片抗原结合过程中加入磁珠，可降低抗体的使用量，节约成本，如图2所示。
以下为现有方法完成免疫诊断的反应时间和本发明方法完成免疫诊断的反应时间的对比:
结合图1本方法的免疫组化染色效果更明显，明显可以看出，使用本方法可在不损坏抗原抗体蛋白活性的前提下，极大的提高抗原抗体的反应结合率，减少反应时间。
本领域的技术人员应理解，上述描述及附图中所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明，在没有背离所述原理下，本发明的实施方式可以有任何变形或修改。
Claims (8)
1.一种提高免疫组化效率的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤一，切片的制备：取组织切片，展片、捞片后固定2min,于低温下保存；
步骤二，脱蜡和水化：将蜡片置于二甲苯中浸泡后，甩去多余液体置于无水乙醇中浸泡，再依次由自来水，PBS溶液冲洗；
步骤三，抗原修复：取配置好的抗原修复液放入抗原修复盒中，液体超过组织切片上边缘0.5cm，盖上盖子锡箔纸外围封盖2min；
步骤四，冲洗：将步骤三中的组织切片用PBS溶液冲洗1min;
步骤五，加入一抗：甩去多余液体后，加入1mg/mL的一抗试剂50uL，室温孵育5min；
步骤六，封闭：加入封闭液封闭1min；
步骤七，加入二抗：甩去多余液体后，加入1mg/mL 的二抗酶标聚合物50μL，室温孵育5min；
步骤八，显色：甩去多余的液体后，加入50uL DAB显色液，室温孵育1min，显微镜下观察染色结果，防止过染，自来水冲洗；
其中，以上步骤均在电场环境下进行。
2.根据权利要求1所述的提高免疫组化效率的方法，其特征在于，步骤一中切片取4um，在45℃展片，于67℃固定2min，保存温度为-20℃。
3.根据权利要求1所述的提高免疫组化效率的方法，其特征在于，步骤二中，于二甲苯中浸泡5s，于无水乙醇中浸泡5s×1次，自来水冲洗30min，PBS溶液冲洗5s×1次，其中PBS溶液为10mM PBS，pH为7.2 。
4.根据权利要求1所述的提高免疫组化效率的方法，其特征在于，步骤三中的抗原修复的温度范围为102-120℃。
5.根据权利要求1所述的提高免疫组化效率的方法，其特征在于，步骤四中的PBS溶液为pH 7.0 的10mM PBS 溶液加0.8%NaCl和0.02% KCl。
6.根据权利要求1所述的提高免疫组化效率的方法，其特征在于，步骤五后需用PBS溶液冲洗15s。
7.根据权利要求1所述的提高免疫组化效率的方法，其特征在于，步骤六后需用PBS溶液冲洗15s。
8.根据权利要求1所述的提高免疫组化效率的方法，其特征在于，步骤七后需用PBS溶液冲洗15s。
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