CN115436623A - 一种肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法 - Google Patents
一种肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于组织荧光染色技术领域，公开了一种肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法包括：对肾石蜡病理切片进行烤片、脱蜡、水化、抗原修复、标记、封闭、滴加一抗与二抗、复染核、封片处理。本发明能够解决既往大部分使用冰冻组织切片进行荧光染色的弊端，因石蜡切片能够长期永久保存，本发明提供了一种关于肾石蜡切片的抗原修复方法，此方法抗原定位效果佳、稳定、安全系数相对较高，可以对多年前的肾活检标本进行相关免疫荧光染色，从而进行既往病例的回顾性研究，避免了病人再次进行肾活检检查，减少了病人的创伤性操作及减轻了操作中产生的痛苦。
Description
技术领域
本发明属于组织荧光染色技术领域，尤其涉及一种肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法。
背景技术
肾小球基底膜(GBM)将足细胞和内皮细胞分开，有助于肾小球过滤屏障的大小和电荷选择性，使水和小分子进入尿空间，将大分子和细胞保留在循环中，是肾小球滤过屏障的重要组成部分。
肾小球基底膜(GBM)的主要成分是层粘连蛋白、硫酸乙酰肝素蛋白多糖、巢蛋白和IV型胶原蛋白，后者是最丰富的。IV型胶原蛋白家族由6个α链，即α1-α6链组成，由2、13和X染色体上的三对基因编码，它们组装形成空间相容性异源三聚体的三种组合：α1α1α2、α3α4α5和α5α5α6。α1α1α2异源三聚体是胚胎发育过程中身体所有基底膜的特征。在发育过程中，基底膜会改变其组成，在GBM、耳蜗、眼睛、睾丸和肺中用α3α4α5代替α1α1α2异三聚体。因此，COL4A3、COL4A4或COL4A5中的任何一个发生突变将引起α3α4α5异源三聚体的缺失或功能失调，以及α1α1α2异源三聚体的持续存在，从而导致Alport综合征(表现为进行性肾功能丧失、感音神经性听力损失和各种眼部异常等)等等。
最近，由COL4A3或COL4A4杂合突变引起的IV型胶原肾病的范围不断扩大。大约40％的薄基底膜肾病患者由COL4A3或COL4A4杂合突变引起；大约15％的Alport综合征是COL4A3或COL4A4基因突变引起的常染色体遗传，其中以常染色体隐性遗传最为常见，有极少数为常染色体显性遗传。
因此，采用抗Ⅳ型胶原α3、α4链单克隆/多克隆抗体，对肾活检组织进行免疫荧光染色，对于常染色体隐性或显性的Alport综合征患者的诊断、基因携带者的筛查以及遗传型的判断具有重要价值。另外，肾组织的免疫组织学研究也有助于鉴别Alport综合征和薄基底膜肾病，因为后者未显示GBM中IV型胶原链分布的任何异常。
目前的肾脏组织免疫荧光检查常用冰冻组织切片，有时冰冻组织荧光染色时没有肾小球，或患者因素致冰冻组织只有硬化球，无法进行免疫荧光检查等局限；另外冰冻切片机价格昂贵，基层单位开展困难，且组织不易保存，不能对既往病例进行回顾性诊断及研究；运送组织标本条件要求苛刻，稍不慎温度过高抗原遭破坏会导致假阴性结果；更关键的是冰冻组织细胞结构不清晰、完整性差，有时结果很难判断。
而多聚甲醛或者福尔马林固定的石蜡包埋组织切片比冰冻切片显示出保存更好的组织结构和细胞形态，可以进行准确的抗原定位；荧光猝灭时间明显长于冰冻切片，更利于判读；且切片薄，无褶皱，能大大节省标本；另外石蜡切片易于保存，可在常温下保存多年。因此，这类切片可广泛用于诊断和研究目的。
但是，肾活检标本制成石蜡切片后，即使应用低温石蜡包埋，其中的抗原决定簇必然与甲醛结合而被覆盖，影响组织抗原性。因此，在进行免疫组化或者免疫荧光检查前，需要进行抗原修复技术来断开固定过程中产生的蛋白交联，显著提高免疫病理抗原检测的敏感性。
现在国内外对遗传性疾病比如Alport综合征的关注度越来越高，因COL4A3或COL4A4基因不同突变位点致病的患者越来越多，目前对新发现的突变位点的研究也越来越多。因此，诊断疾病及研究过程中，进行IV型胶原α3、α4链的免疫荧光染色的需求越来越多。
曾有日本学者报道对于采用高压釜锅加热法对肾脏组织石蜡切片进行抗原修复，并对修复后的肾组织进行IV型胶原链免疫荧光染色用于诊断Alport综合征，荧光图效果不错；但是抗原修复过程中需要高压釜锅以及HCL等危险液体，实验危险系数较高。也曾有国内学者报道关于微波加热法结合胃蛋白酶消化法、蛋白酶XXV消化修复抗原，但是目前文献中使用的相关抗体已停产；现有抗体使用既往的抗原修复方法暴露出的抗原与相关抗体结合能力不足或出现非特异性染色。近几年也未见有关人的肾石蜡组织切片的IV型胶原α3链及α4链免疫荧光染色或免疫组化染色的文献报道。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：
(1)现有的IV型胶原α3链及α4链的免疫荧光染色方法采用冰冻组织切片，冰冻组织不能长时间保存、不能应用于既往病例的回顾性分析中；冰冻组织细胞结构不清晰、完整性差，有时结果很难判断。
(2)现有技术没有针对人的肾石蜡组织切片的IV型胶原α3链及α4链免疫荧光染色或免疫组化染色的方法或文献报道。
(3)现有的抗原修复方法暴露出的抗原与相关抗体结合能力不足或出现非特异性染色。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法。
本发明是这样实现的，一种肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法包括：
首先，对肾组织石蜡切片进行烤片、脱蜡、阶梯式水化以及PBS浸泡处理；
其次，利用沸腾的柠檬酸修复液对浸泡后的切片进行初次抗原修复处理，缓慢冷却至室温，然后利用PBS缓冲液洗涤，甩干；
然后，将胃蛋白酶消化液滴至切片组织处，37℃孵育5分钟进行二次抗原修复处理；并利用PBS缓冲液对修复后的切片进行冲洗；
最后，进行封闭、滴加一抗与二抗、复染核、封片处理。
进一步，所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法包括以下步骤：
步骤一，获取肾组织石蜡切片，进行烘烤、脱蜡处理以及阶梯式水化处理，然后利用自来水冲洗2min，再利用PBS磷酸盐缓冲液浸泡；
步骤二，将浸泡后的切片放入加热沸腾的柠檬酸修复液中，并利用微波炉再次加热进行初次抗原修复；利用扎有多个小洞口的保鲜膜将加热后的柠檬酸修复液进行封口处理，缓慢冷却至室温，再利用PBS磷酸盐缓冲液洗涤组织切片，甩干；
步骤三，利用胃蛋白酶消化液对所述石蜡切片组织进行二次抗原修复；并利用PBS缓冲液对修复后的组织切片进行洗涤，甩干；
步骤四，利用山羊血清封闭液对切片组织进行封闭处理，封闭结束后再向切片组织处滴加稀释后的COL4A3或COL4A4抗体，4℃孵育过夜；
步骤五，第二天，取出抗体孵育结束的组织切片，室温下复温30min，利用PBS缓冲液对所述组织切片进行洗涤，甩干；向所述切片组织滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中室温下避光孵育1h；孵育结束后，避光环境下，利用PBS磷酸盐缓冲液对所述组织切片进行洗涤，甩干；
步骤六，向所述切片组织滴加稀释后的DAPI，避光孵育10min，对标本进行染核；然后再利用PBS缓冲液对所述组织切片进行洗涤，甩干；
步骤七，滴加含抗荧光淬灭剂的封片液，封片；在激光共聚焦显微镜下采集图像。
进一步，所述步骤一中，将获取的肾石蜡组织切片进行烘烤、脱蜡处理包括：
所述烘烤处理包括：
将获取的肾组织石蜡切片(切片组织厚度3-3.5μm均可)放置于60℃恒温箱中烘烤30min；
所述脱蜡处理包括：
利用二甲苯液体将烘烤后的肾组织石蜡切片浸泡10min；另一个二甲苯液体将初次浸泡后的肾组织石蜡切片再浸泡10min。
进一步，所述步骤一中，阶梯式水化处理包括：
首先，利用100％的酒精对切片组织水化5min；
其次，利用95％的酒精对切片组织水化5min；
然后，利用80％的酒精对切片组织水化5min；
最后，利用75％的酒精对切片组织水化5min。
进一步，所述步骤二中，沸腾的柠檬酸修复液由微波炉在100W火力下加热得到。
进一步，所述步骤二中，利用微波炉加热放置有肾组织石蜡切片的柠檬酸修复液包括：将微波炉火力调整为40W，加热放置有组织切片的柠檬酸修复液10min。
进一步，所述利用PBS磷酸盐缓冲液对所述切片组织进行洗涤包括：利用PBS磷酸盐缓冲液对组织切片洗涤3次，每次5min。
进一步，所述步骤三中，利用胃蛋白酶消化液对所述石蜡切片组织进行二次抗原修复包括：将胃蛋白酶消化液滴至切片组织处，37℃孵育5分钟进行二次抗原修复。
进一步，所述步骤四中，封闭包括：于常温下封闭1.5h。
进一步，所述步骤五中，荧光二抗利用通用型抗体稀释液按照1:400进行稀释。
结合上述的技术方案和解决的技术问题，请从以下几方面分析本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：
第一、针对上述现有技术存在的技术问题以及解决该问题的难度，紧密结合本发明的所要保护的技术方案以及研发过程中结果和数据等，详细、深刻地分析本发明技术方案如何解决的技术问题，解决问题之后带来的一些具备创造性的技术效果。具体描述如下：
本发明首先进行肾组织石蜡切片的脱蜡、水化处理，能够令组织恢复到固定后的状态，暴露抗原以便与一抗结合，避免了脱蜡和水化不完全会引起染色不均匀，产生非特异性背景着色等问题。
本发明通过将肾组织石蜡切片进行烘烤、脱蜡处理以及阶梯式水化处理，并将阶梯式水化处理后的切片利用自来水冲洗2min，再利用PBS磷酸盐缓冲液中浸泡，让切片组织能够脱蜡和水化完全，为之后抗原修复和染色提供良好基础。
本发明通过结合了柠檬酸钠液体微波加热的物理解聚法和胃蛋白酶消化法，使得石蜡切片上的肾小球基底膜主要结构，即IV型胶原α3链及α4链抗原，能够尽可能完好及稳定的被暴露出来，与相应抗体进行抗原抗体反应。避免了现有技术因抗原修复方法不恰当，导致暴露的抗原不完全或者出现其他的非特异的抗原暴露，从而引起染色不全或者出现非特异染色，影响实验结果判断的问题与缺陷。
本发明使用的抗原修复方法是使用柠檬酸钠液体进行微波炉加热，待冷却至室温后改为胃蛋白酶消化液在37℃下加热5min，该过程所花时间较短，且使用的微波炉加热法较高压加热法等相对安全一些，也较好控制火力，过程中抗原暴露效果稳定，后续激光共聚焦呈现出来的荧光图效果佳，有助于相关疾病的诊断和实验研究。
本发明利用山羊血清封闭液进行封闭处理后，再向每个组织处滴加稀释后的COL4A3或COL4A4抗体进行孵育，能够有效的的封闭组织上能与抗体非特异结合的位点，从而减少实验过程中的非特异染色，显著的降低背景染色；封闭结束后，滴加特异性抗体与暴露出的相应抗原结合；避免了因封闭时间不够导致背景染色较多，拍照效果不佳的问题。
本发明于抗体孵育结束后，洗去未结合的抗体，再用荧光素标记的抗特异性抗体(即荧光二抗)与特异性抗体相结合，形成抗原—特异性抗体—间接荧光抗体的复合物，在形成的复合物上带有一定量的荧光素，在激光共聚焦显微镜下可以看见发出荧光的抗原抗体结合部位，检测出抗原或抗体。
本发明荧光二抗孵育结束后，用PBS磷酸盐缓冲液洗去未结合的抗体；DAPI用于固定的细胞核的染色。
本发明封片前滴加抗荧光猝灭剂，能够减缓荧光的衰减，延长荧光存在时间。
第二，把技术方案看做一个整体或者从产品的角度，本发明所要保护的技术方案具备的技术效果和优点，具体描述如下：
本发明提供了一种能够使用肾组织石蜡切片进行对肾小球基底膜的主要结构，即IV型胶原α3链及α4链，进行免疫荧光染色的方法，对于诊断因COL4A3或COL4A4基因突变所致的Alport综合征等疾病提供有力证据。
本发明提供了一种抗原定位效果较佳、稳定、安全系数相对较高的抗原修复方法，结合了柠檬酸钠液体微波加热的物理解聚法和胃蛋白酶消化法，使得石蜡切片上的肾小球基底膜主要结构，即IV型胶原α3链及α4链抗原，能够尽可能完好及稳定的暴露出来，与相应抗体进行抗原抗体反应，再通过与相应的荧光二抗反应，利用激光共聚焦显微镜可以看见荧光所在的组织，有助于确定抗原的性质及定位。
本发明能够解决既往大部分使用冰冻组织切片进行荧光染色的弊端，且石蜡组织切片能够长期永久保存，可以对多年前的肾活检标本行相关免疫荧光检查，从而进行既往病例的回顾性研究，也避免了病人再次进行肾活检检查，减少了病人因创伤性操作带来的害怕和痛苦。
第三，作为本发明的权利要求的创造性辅助证据，还体现在以下几个重要方面：
(1)本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：
本发明技术能够帮助既往行肾活检穿刺、现仅有肾脏石蜡组织、且基因报告有COL4A3或COL4A4基因突变的患者进行免疫荧光染色，为疾病的诊断提供有力证据，能够指导临床医生为患者制定后续的治疗方案。
(2)本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：本发明提供了一种肾石蜡组织切片对IV型胶原α3链及α4链进行免疫荧光染色的方法。
(3)本发明的技术方案克服了技术偏见：因既往少有文献报道肾石蜡组织切片进行IV型胶原α3、α4链免疫组化或免疫荧光，或使用石蜡组织切片荧光染色效果欠佳，或在实验过程中石蜡组织切片抗原修复条件摸索时间长，因此大部分发表的文献多使用冰冻组织进行IV型胶原染色；但本发明通过改进了抗原修复方法，克服了既往大多研究选用肾冰冻组织切片进行IV型胶原α3、α4链免疫荧光染色的偏见；对于以后关于对肾石蜡组织进行免疫荧光检测成为了可能。
附图说明
图1是本发明实施例提供的肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法流程图；
图2是本发明实施例提供的人癌旁肾脏石蜡组织切片进行免疫荧光检查示意图；
图2中的(A)是本发明实施例提供的肾小球基底膜中细胞核免疫荧光染色图；
图2中的(B)是本发明实施例提供的为肾小球基底膜中IV型胶原α3链免疫荧光染色图；
图2中的(C)是本发明实施例提供的肾小球基底膜中IV型胶原α3链和细胞核免疫荧光染色的Merge图；
图2中的(D)是本发明实施例提供的C图方框局部放大的肾小球基底膜中IV型胶原α3链和细胞核免疫荧光染色的Merge图；
图2中的(E)是本发明实施例提供的为肾小球中细胞核免疫荧光染色图；
图2中的(F)是本发明实施例提供的为肾小球基底膜中IV型胶原α4链免疫荧光染色图；
图2中的(G)是本发明实施例提供的为肾小球基底膜中IV型胶原α4链和细胞核免疫荧光染色的Merge图；
图2中的(H)是本发明实施例提供的G图中方框局部放大的肾小球基底膜中IV型胶原α3链和细胞核免疫荧光染色的Merge图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
一、解释说明实施例。为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。
如图1所示，本发明实施例提供的肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法包括以下步骤：
S101，获取肾组织石蜡切片，进行烘烤、脱蜡处理以及阶梯式水化处理，然后利用自来水冲洗2min，再利用PBS磷酸盐缓冲液浸泡；
S102，将浸泡后的切片放入加热沸腾的柠檬酸修复液中，并利用微波炉再次加热进行初次抗原修复；利用扎有多个小洞口的保鲜膜将加热后的柠檬酸修复液进行封口处理，缓慢冷却至室温，再利用PBS磷酸盐缓冲液洗涤组织切片，甩干；
S103，利用胃蛋白酶消化液对所述石蜡切片组织进行二次抗原修复；并利用PBS缓冲液对修复后的组织切片进行洗涤，甩干；
S104，利用山羊血清封闭液对切片组织进行封闭处理，封闭结束后再向切片组织处滴加稀释后的COL4A3或COL4A4抗体，4℃孵育过夜；
S105，第二天，取出抗体孵育结束的组织切片，室温下复温30min，利用PBS缓冲液对所述组织切片进行洗涤，甩干；向所述切片组织滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中室温下避光孵育1h；孵育结束后，避光环境下，利用PBS磷酸盐缓冲液对所述组织切片进行洗涤，甩干；
S106，向所述切片组织滴加稀释后的DAPI，避光孵育10min，对标本进行染核；然后再利用PBS缓冲液对所述组织切片进行洗涤，甩干；
S107，滴加含抗荧光淬灭剂的封片液，封片；在激光共聚焦显微镜下采集图像。
本发明实施例提供的烘烤处理包括：将获取的肾组织石蜡切片放置于60℃恒温箱中烘烤30min。
本发明实施例提供的脱蜡处理包括：利用二甲苯将烘烤后的肾组织石蜡切片浸泡10min；再利用二甲苯将初次浸泡后的切片再浸泡10min。
本发明实施例提供的阶梯式水化处理包括：
首先，利用100％的酒精对切片组织水化5min；
其次，利用95％的酒精对切片组织水化5min；
然后，利用80％的酒精对切片组织水化5min；
最后，利用75％的酒精对切片组织水化5min。
本发明实施例提供的沸腾的柠檬酸修复液由微波炉在100W下加热得到。
本发明实施例提供的利用微波炉加热放置有肾石蜡病理切片的柠檬酸修复液包括：于40W下加热10min。
本发明实施例提供的利用PBS磷酸盐缓冲液对切片组织进行洗涤包括：利用PBS磷酸盐缓冲液洗涤3次，每次5min。
步骤S103中，本发明实施例提供的利用胃蛋白酶消化液对所述石蜡切片组织进行二次抗原修复包括：将胃蛋白酶消化液滴至切片组织处，37℃孵育5分钟进行二次抗原修复。
步骤S104中，本发明实施例提供的封闭包括：于常温下封闭1.5h。
步骤S105中，本发明实施例提供的荧光二抗利用通用型抗体稀释液按照1:400进行稀释。
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明。
组织标本：肾组织石蜡切片(3.5μm)
第1天：
1)烤片：将石蜡切片放在60℃恒温箱中烘烤30min；
2)脱蜡：二甲苯(Ⅰ)浸泡10min、二甲苯(Ⅱ)浸泡10min；
水化：100％酒精5min、95％酒精5min、80％酒精5min、75％酒精5min；
自来水冲洗2min，PBS浸泡；
3)初次抗原修复：1)将装有柠檬酸修复液的烧杯放入微波炉内；2)火力调为100W加热至沸腾，取出烧杯，将组织切片放入沸腾的柠檬酸修复液里，再次放入微波炉内，减小火力为40W，加热10min；3)取出烧杯，保鲜膜封口(上面扎一些小洞洞)，缓慢冷却至室温；PBS磷酸盐缓冲液洗涤5min×3次；
4)二次抗原修复：将胃蛋白酶消化液滴至切片组织处，37℃孵育5分钟；PBS磷酸盐缓冲液洗涤5min×3次；
5)封闭：山羊血清封闭液，常温下封闭1.5h；
6)滴加一抗：不洗，每张切片组织处滴加足够量的稀释好的COL4A3或C0L4A4抗体，放入湿盒，4℃孵育过夜(16-18h)；
第2天：
7)切片取出，室温下复温30min；PBS磷酸盐缓冲液洗涤5min×3次；甩干；滴加稀释好的荧光二抗(稀释比例1:400)，室温下避光孵育1h；PBS磷酸盐缓冲液洗涤5min×3次(避光)，甩干；
(注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都需避光进行)；
8)复染核：滴加稀释好的DAPI(稀释比例1:1000)避光孵育10min，对标本进行染核；PBS磷酸盐缓冲液洗涤5min×3次(避光)，甩干；
9)滴加含抗荧光淬灭剂的封片液，然后盖玻片封片，在激光共聚焦显微镜下观察采集图像。
图2是本发明实施例提供的人癌旁肾脏组织切片进行免疫荧光检查示意图；
图2中的(A)是本发明实施例提供的肾小球基底膜中细胞核免疫荧光染色图；
图2中的(B)是本发明实施例提供的为肾小球基底膜中IV型胶原α3链免疫荧光染色图；
图2中的(C)是本发明实施例提供的肾小球基底膜中IV型胶原α3链和细胞核免疫荧光染色的Merge图；
图2中的(D)是本发明实施例提供的C图方框局部放大的肾小球基底膜中IV型胶原α3链和细胞核免疫荧光染色的Merge图；
图2中的(E)是本发明实施例提供的为肾小球中细胞核免疫荧光染色图；
图2中的(F)是本发明实施例提供的为肾小球基底膜中IV型胶原α4链免疫荧光染色图；
图2中的(G)是本发明实施例提供的为肾小球基底膜中IV型胶原α4链和细胞核免疫荧光染色的Merge图；
图2中的(H)是本发明实施例提供的G图中方框局部放大的肾小球基底膜中IV型胶原α3链和细胞核免疫荧光染色的Merge图。
二、应用实施例。为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。
本发明的应用实施例提供了一种肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，能够用于对多年前的肾活检标本行相关免疫荧光检查，开展既往病例的回顾性研究。
本发明的应用实施例提供了一种肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，能够为COL4A3或COL4A4基因突变的患者诊断提供有力证据，指导下一步治疗方案。
三、实施例相关效果的证据。本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据、图表等进行描述。
如图2所示，本发明特异性高、较好且稳定的暴露出相应的IV型胶原α3及α4链抗原，并与相应抗体结合；与既往所发表文献中的冰冻切片及石蜡切片所做出的免疫荧光图相比较，本发明所出激光共聚焦图中基底膜结构清晰，非特异性染色较少；可为相关研究和疾病诊断提供有力证据。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本发明领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种关于肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，其特征在于，所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法包括：
首先，对肾组织石蜡切片进行烤片、脱蜡、阶梯式水化以及PBS浸泡处理；
其次，利用沸腾的柠檬酸修复液对浸泡后的切片进行初次抗原修复处理，缓慢冷却至室温，然后利用PBS缓冲液洗涤，甩干；
然后，将胃蛋白酶消化液滴至切片组织处，37℃孵育5分钟进行二次抗原修复处理；并利用PBS缓冲液对修复后的切片进行冲洗；
最后，进行封闭、滴加一抗与二抗、复染核、封片处理。
2.如权利要求1所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，其特征在于，所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法包括以下步骤：
步骤一，获取肾组织石蜡切片，进行烘烤、脱蜡处理以及阶梯式水化处理，然后利用自来水冲洗2min，再利用PBS磷酸盐缓冲液浸泡；
步骤二，将浸泡后的切片放入加热沸腾的柠檬酸修复液中，并利用微波炉再次加热进行初次抗原修复；利用扎有多个小洞口的保鲜膜将加热后的柠檬酸修复液进行封口处理，缓慢冷却至室温，再利用PBS磷酸盐缓冲液洗涤组织切片，甩干；
步骤三，利用胃蛋白酶消化液对所述石蜡切片组织进行二次抗原修复；并利用PBS缓冲液对修复后的组织切片进行洗涤，甩干；
步骤四，利用山羊血清封闭液对切片组织进行封闭处理，封闭结束后再向切片组织处滴加稀释后的COL4A3或COL4A4抗体，4℃孵育过夜；
步骤五，第二天，取出抗体孵育结束的组织切片，室温下复温30min，利用PBS缓冲液对所述组织切片进行洗涤，甩干；向所述切片组织滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中室温下避光孵育1h；孵育结束后，避光环境下，利用PBS磷酸盐缓冲液对所述组织切片进行洗涤，甩干；
步骤六，向所述切片组织滴加稀释后的DAPI，避光孵育10min，对标本进行染核；然后再利用PBS缓冲液对所述组织切片进行洗涤，甩干；
步骤七，滴加含抗荧光淬灭剂的封片液，封片；在激光共聚焦显微镜下采集图像。
3.如权利要求2所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，其特征在于，所述步骤一中，将获取的肾石蜡组织切片进行烘烤、脱蜡处理包括：
所述烘烤处理包括：
将获取的肾组织石蜡切片(切片组织厚度3-3.5μm均可)放置于60℃恒温箱中烘烤30min；
所述脱蜡处理包括：
利用二甲苯液体将烘烤后的肾组织石蜡切片浸泡10min；另一个二甲苯液体将初次浸泡后的肾组织石蜡切片再浸泡10min。
4.如权利要求2所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，其特征在于，所述步骤一中，阶梯式水化处理包括：
首先，利用100％的酒精对切片组织水化5min；
其次，利用95％的酒精对切片组织水化5min；
然后，利用80％的酒精对切片组织水化5min；
最后，利用75％的酒精对切片组织水化5min。
5.如权利要求2所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，其特征在于，所述步骤二中，沸腾的柠檬酸修复液由微波炉在100W火力下加热得到。
6.如权利要求2所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，其特征在于，所述步骤二中，利用微波炉加热放置有肾组织石蜡切片的柠檬酸修复液包括：将微波炉火力调整为40W，加热放置有组织切片的柠檬酸修复液10min。
7.如权利要求2所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，其特征在于，所述利用PBS磷酸盐缓冲液对所述切片组织进行洗涤包括：利用PBS磷酸盐缓冲液对组织切片洗涤3次，每次5min。
8.如权利要求2所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，其特征在于，所述步骤三中，利用胃蛋白酶消化液对所述石蜡切片组织进行二次抗原修复包括：将胃蛋白酶消化液滴至切片组织处，37℃孵育5分钟进行二次抗原修复。
9.如权利要求2所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，其特征在于，所述步骤四中，封闭包括：于常温下封闭1.5h。
10.如权利要求2所述肾组织石蜡切片IV型胶原α3、α4链免疫荧光方法，其特征在于，所述步骤五中，荧光二抗利用通用型抗体稀释液按照1:400进行稀释。
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Cited By (2)
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2022
- 2022-07-12 CN CN202210812765.XA patent/CN115436623A/zh active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116558929A (zh) * | 2023-07-07 | 2023-08-08 | 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) | 一种足细胞免疫荧光染色的方法及其应用 |
| CN116558929B (zh) * | 2023-07-07 | 2023-09-19 | 中日友好医院(中日友好临床医学研究所) | 一种足细胞免疫荧光染色的方法及其应用 |
| CN116990101A (zh) * | 2023-09-27 | 2023-11-03 | 四川大学华西医院 | 一种易掉片组织的预处理方法及其多重免疫荧光染色方法 |
| CN116990101B (zh) * | 2023-09-27 | 2023-12-15 | 四川大学华西医院 | 一种易掉片组织的预处理方法及其多重免疫荧光染色方法 |
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