CN112680523B

CN112680523B - 用于判断卵巢癌患者预后的分子模型及应用

Info

Publication number: CN112680523B
Application number: CN202110095994.XA
Authority: CN
Inventors: 张凌云; 刘天舒; 王妍; 李倩
Original assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Current assignee: Zhongshan Hospital Fudan University
Priority date: 2021-01-25
Filing date: 2021-01-25
Publication date: 2022-07-29
Anticipated expiration: 2041-01-25
Also published as: CN112680523A

Abstract

本发明提供了一种用于判断卵巢癌患者预后的分子模型及应用，该分子模型包括比较卵巢癌样本的数据和正常卵巢癌样本的数据，得到具有差异的代谢基因，通过回归模型缩小代谢基因的范围，得到七基因组合模型，并进行检测、校验和分析，最后得出风险评分与生存期相关，风险评分高的患者生存期短预后差；故本发明通过构建七个基因的分子组合模型，对卵巢癌患者的预后进行评估，能够区分并甄选出预后差的卵巢癌患者，即将卵巢癌人群进行分层，挑选高风险预后差的卵巢癌患者，指导临床医生对这些患者提供更积极的治疗方案，同时也能指导临床医生避免对低风险的卵巢癌患者进行过度治疗。

Description

用于判断卵巢癌患者预后的分子模型及应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，具体涉及一种用于判断卵巢癌患者预后的分子模型及应用。

背景技术

卵巢癌是致死率最高的妇科恶性肿瘤。卵巢癌致死率位于女性全部恶性肿瘤的第七位，死亡率高达60%以上，致死率远高于其他妇科肿瘤。卵巢癌患者初治效果好，但容易复发或耐药，导致卵巢癌患者5年内生存率很低。其中主要原因之一就是缺少有效的判断卵巢癌患者预后的标志物，不能将卵巢癌患者进行风险分层，无法指导临床医生对高风险卵巢癌患者进行早干预早治疗。

发明内容

针对现有技术中的不足，本发明从分子层面评估卵巢癌患者的预后，帮助临床医生筛选高风险卵巢癌患者，故首要目的提出了用于判断卵巢癌患者预后的分子模型。

本发明的第二个目的是提出上述分子模型的应用。

为达到上述首要目的，本发明的解决方案是：

一种用于判断卵巢癌患者预后的分子模型，其包括如下步骤：

（1）、先从TCGA数据库中下载卵巢癌组织样本的数据，从GTEX数据库中下载正常卵巢组织样本的数据，比较卵巢癌组织样本的数据和正常卵巢组织样本的数据中的代谢相关基因，设定cut-off值为| logFC|＞1 and P-value＜0.05，并通过单因素Cox比例风险回归模型分析得到具有显著差异的代谢基因；

（2）、通过LASSO-Cox回归模型进一步缩小差异的代谢基因范围，得到一个七基因组合，构建出一个基于包含GFPT2、DGKD、ACACB、ACSM3、IDO1、TPMT和PGP七个基因为标志物的卵巢癌预后预测风险评分模型；

（3）、对卵巢癌预后预测风险评分模型中的标志物进行检测；

（4）、校验卵巢癌预后预测风险评分模型；

（5）、将TCGA数据库作为训练集，GEO数据库作为验证集，对卵巢癌预后预测风险评分模型的风险评分进行分析；

（6）、利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析卵巢癌预后预测风险评分模型中的七个基因对卵巢癌患者的生存预后的影响。

作为本发明的一种优选实施例，步骤（3）中，GFPT2、DGKD、ACACB和ACSM3 在卵巢癌组织中低表达，IDO1、TPMT和PGP在卵巢癌组织中高表达。

作为本发明的一种优选实施例，步骤（4）中，风险评分模型的公式为0.1432×GFPT2+0.1410×DGKD+0.1426×ACACB+（-0.1943）×ACSM3+（-0.1002）×IDO1+（-0.2008）×TPMT+（-0.1058）×PGP。

作为本发明的一种优选实施例，步骤（5）中，风险评分与生存期相关，风险评分高的患者生存期短预后差。

为达到上述第二个目的，本发明的解决方案是：

一种用于判断卵巢癌患者预后的分子模型可以在评估卵巢癌预后中得以应用。

由于采用上述方案，本发明的有益效果是：

本发明构建了七个基因的分子组合模型，对卵巢癌患者的预后进行评估，能够区分并甄选出预后差的卵巢癌患者，即将卵巢癌人群进行分层，挑选高风险预后差的卵巢癌患者，指导临床医生对这些患者提供更积极的治疗方案，同时也能指导临床医生避免对低风险的卵巢癌患者进行过度治疗。

附图说明

图1为本发明的分子模型的差异基因热图（N代表正常卵巢组织，T代表卵巢癌组织）。

图2为本发明的分子模型的七基因的组合模型图。

图3为本发明的分子模型的七个基因在人卵巢癌患者组织标本中的表达图。

图4为本发明的分子模型的风险校验图（4A：训练集中卵巢癌患者的风险评分分布图（横坐标Patients（increasing risk score）为患者（风险评分），纵坐标Risk score为风险评分）；4B：验证集中卵巢癌患者的风险评分分布图（横坐标Patients（increasing riskscore）为患者（风险评分），纵坐标Risk score为风险评分）；4C：训练集中卵巢癌患者的生存期分布图（横坐标Patients（increasing risk score）为患者（风险评分），纵坐标Survival time为生存时间）；4D：验证集中卵巢癌患者的生存期分布图（横坐标Patients（increasing risk score）为患者（风险评分），纵坐标Survival time为生存时间）；4E：训练集中基因的表达热图；4F：验证集中基因的表达热图）。

图5为本发明的分子模型中卵巢癌患者预后与生存期的关系图（5A：训练集中七基因模型与卵巢癌患者预后（上面黑色线是低风险，下面灰色线是高风险）（横坐标Time为时间，纵坐标Survival probability为生存概率）；5B：验证集中七基因模型与卵巢癌患者预后（上面黑色线是低风险，下面灰色线是高风险）（横坐标Time为时间，纵坐标Survivalprobability为生存概率）；5C：单因素COX回归分析七基因模型与临床资料相关性；5D：多因素COX回归分析七基因模型与临床资料相关性）。

图6为本发明的分子模型中七基因与卵巢癌患者的总生存期的分析图（横坐标Time为时间，纵坐标Probability为可能性；6A为GFPT2基因；6B为DGKD基因；6C为ACACB 基因；6D为ACSM3基因；6E为IDO1基因；6F为TPMT基因；6G为PGP基因；6H为七基因组合）。

具体实施方式

本发明提供了一种用于判断卵巢癌患者预后的分子模型及应用。即针对卵巢癌患者的代谢基因，利用数据库和统计学建立卵巢癌预后的风险模型，并通过进一步临床标本验证，能够作为预测卵巢癌患者预后的分子模型。

本发明的用于判断卵巢癌患者预后的分子模型包括如下步骤：

（1）、先从TCGA数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/)中下载379例卵巢癌组织样本的数据，从GTEX数据库（https://www.gtexportal.org)中下载88例正常卵巢组织样本的数据，比较TCGA数据库卵巢癌组织样本的数据与GTEX 数据库正常卵巢组织样本中的代谢相关基因，设定cut-off值为| logFC|＞1 and P-value＜0.05，并通过单因素Cox比例风险回归模型分析得到具有显著差异的代谢基因（见图1）。

（2）、通过LASSO-Cox回归模型进一步缩小差异的代谢基因范围，得到一个七基因组合，构建出一个基于包含GFPT2、DGKD、ACACB、ACSM3、IDO1、TPMT和PGP七个基因为标志物的卵巢癌预后预测风险评分模型（见图2）。

（3）、人组织标本对七基因的表达进行检测（见图3）；

比较GFPT2、DGKD、ACACB、ACSM3、IDO1、TPMT和PGP在卵巢组织标本中的表达，包括5例卵巢恶性肿瘤、5例卵巢正常组织及5例输卵管正常组织。

1 实验方法

1）脱蜡和复水：把病人石蜡切片放在切片架上置于60℃烘箱中进行烘烤30min后，将放置好组织片的切片架放入二甲苯溶液脱蜡中和梯度乙醇溶液中复水。

2）抗原修复：抗原修复使用柠檬酸钠微波抗原法。在抗原修复盒中加满0.1 mol/L，pH=6.0 的柠檬酸钠抗原修复液，置入微波炉中加热3min至沸腾，然后将切片连同切片架迅速放入沸腾的柠檬酸钠溶液中，并注意确保液平面超过切片，盖紧盖子，迅速放回微波炉中，用中高火持续加热12min。

3）灭活内源性过氧化物酶：滴加0.3%过氧化氢于标本上并确保组织被完全覆盖，用以灭活内源性过氧化物酶，室温静置15min后，再用 PBS洗片5min×3次。

4）破膜：将冷却至室温的切片取出后用PBS洗片5min，然后平铺置于免疫组化专用的避光湿盒内。配制破膜液（0.01 M PBS：tritonX-100，配制比例为300：3），将破膜液滴加在切片组织上，室温静置15min后，PBS冲洗5min×3次。

5）封闭：吸水纸拭去组织外周的PBS，切片平铺于湿盒内。配制封闭液（0.01M PBS：10%牛血清：tritonX-100，配制比例为 270：30：1），将破膜液滴加在切片组织上，整体置于37℃水浴锅中封闭1h。

6）一抗孵育：倒去切片上的封闭液，分别滴加一定稀释比例的一抗孵育过夜。具体地，体积比为1：100的一抗：ACSM3 (#10168-2-AP, ProteinTech Group, Chicago, IL,USA)，体积比为1：100的一抗：TPMT (#10682-1-AP, ProteinTech Group, Chicago, IL,USA)，体积比为1：200的一抗：IDO1(#13268-1-AP, ProteinTech Group, Chicago, IL,USA)，体积比为1：200的一抗：ACACB (#21923-1-AP, ProteinTech Group, Chicago, IL,USA)，体积比为1：150的一抗：PGP (#25081-1-AP, ProteinTech Group, Chicago, IL,USA)，体积比为1：50的一抗：DGKD (#abs111548, Absin Bioscience Inc, Shanghai,China)，体积比为1：100的一抗：GFPT2 (#abs111910, Absin Bioscience Inc, Shanghai,China)。

7）二抗孵育：将湿盒从4℃冰箱取出，用0.01M PBS冲洗5min×3次，吸水纸擦去切片周边的PBS。滴加50μL二抗（免疫显色剂，购于上海杰浩生物技术有限公司，鼠兔通用）室温孵育30min（已被链霉素标记，可亲和过氧化物酶），PBS洗5min×3次。

8）DAB染色：取50μL DAB染色液（购于上海杰浩生物技术有限公司）滴加在组织上，确保溶液覆盖组织。

9）苏木素染核：切片放在切片架上，整体放入苏木素染缸中，等待2-3min，取出后用自来水冲洗2-3min，放入稀盐酸中酸化5s，再在自来水下冲洗2-3min。

10）脱水及透明：在梯度乙醇中脱水各8min（乙醇梯度依次为75%、85%、95%、100%），然后在二甲苯溶液中透明约10min（二甲苯溶液分为 2个缸，依次为二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ）。

11）封片及拍照：取出切片，待二甲苯挥发后，滴加中性树胶，盖上盖玻片后固定盖玻片，然后在光学显微镜（BH-2，Olympus，日本）下观察及拍照。

2 实验结果

GFPT2、DGKD、ACACB和ACSM3 在卵巢癌组织中低表达，IDO1、TPMT和PGP在卵巢癌组织中高表达。

（4）、该七基因的组合风险评估模型的校验（见图4）。

该风险评分模型的公式=0.1432×GFPT2+0.1410×DGKD+0.1426×ACACB+（-0.1943）×ACSM3+（-0.1002）×IDO1+（-0.2008）×TPMT+（-0.1058）×PGP；将TCGA数据库作为训练集，GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）作为验证集，根据风险评分模型的公式，分别将训练集和验证集中的卵巢癌患者，取评分的中位数作为截断值将其分为高风险组和低风险组。4A和4B为风险评分图，4C和4D为卵巢癌患者生存时间散点分布图，4E和4F为该七个基因的表达热图。

（5）、TCGA数据库作为训练集，把卵巢癌患者按七基因的风险评分平均值分为两组，高风险分值组的卵巢癌患者的生存期短，预后较低风险组患者差；用GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）GSE26193 中107例卵巢癌组织的数据作为验证集进行验证，结果与TCGA数据库中结果一致，风险评分高的患者生存期短预后差。进一步通过Cox回归分析发现风险评分与生存期相关，可以作为评估卵巢癌患者预后风险的独立危险因素，而临床常用的年龄、分期并不能对卵巢癌患者的预后进行区分（见图5）。

（6）、用Kaplan-Meier Plotter（www.kmplot.com）数据库进一步验证各基因对卵巢癌患者的生存预后的影响，可见单个基因不如七基因组合模型对卵巢癌患者的生存期的预测效果佳（见图6（黑色线为低风险，灰色线为高风险）），这与TCGA数据库和GEO数据库中得到结果一致（图5）。使用Kaplan-Meier Plotter在线数据库评价GFPT2、DGKD、ACACB、ACSM3、IDO1、TPMT和PGP对卵巢癌患者的生存预后的影响。对于GFPT2使用205100_at探针，高低表达临界值为123；对于DGKD使用208072_at探针，高低表达临界值为368；对于ACACB使用49452_at探针，高低表达临界值为163；对于ACSM3，使用205942_at探针，高低表达临界值为161；对于IDO1使用210029_at探针，高低表达临界值为837；对于TPMT，使用203672_x_at探针，高低表达临界值为331；对于PGP使用222622_at探针，高低表达临界值为456；七基因联合预测生存的高低表达临界值为265。可见，单个基因对卵巢癌患者的预后分析中，DGKD、ACACB和TPMT不能区分卵巢癌患者的预后（P>0.05）。GFPT2、ACSM3、IDO1和PGP能够在一定程度（P<0.05）上对卵巢癌患者的预后进行区分，但是不如七基因联合模型对卵巢癌患者的预后区分显著，且该七基因模型对远期预后的评估更有差异。Kaplan-Meier Plotter中的数据分析结果支持TCGA和GEO数据库中该七基因联合模型对卵巢癌患者预后的判断。

上述对实施例的描述是为了便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用本发明。熟悉本领域技术人员显然可以容易的对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中，而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例。本领域技术人员根据本发明的原理，不脱离本发明的范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种检测七基因组合的试剂在制备判断卵巢癌预后产品中的应用，其特征在于：所述七基因包括GFPT2、DGKD、ACACB、ACSM3、IDO1、TPMT和PGP，该应用包括如下步骤：

（1）、先从TCGA数据库中下载卵巢癌组织样本的数据，从GTEX数据库中下载正常卵巢组织样本的数据，比较卵巢癌组织样本的数据和正常卵巢组织样本的数据中的代谢基因，设定cut-off值为| logFC|＞1 and P-value＜0.05，并通过单因素Cox比例风险回归模型分析得到具有显著差异的代谢基因；

（4）、校验卵巢癌预后预测风险评分模型；

（6）、利用Kaplan-Meier Plotter数据库分析卵巢癌预后预测风险评分模型中的七个基因对卵巢癌患者的生存预后的影响；

步骤（4）中，风险评分模型的公式为0.1432×GFPT2+0.1410×DGKD+0.1426×ACACB+（-0.1943）×ACSM3+（-0.1002）×IDO1+（-0.2008）×TPMT+（-0.1058）×PGP。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（3）中，GFPT2、DGKD、ACACB和ACSM3 在卵巢癌组织中低表达，IDO1、TPMT和PGP在卵巢癌组织中高表达。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：步骤（5）中，风险评分与生存期相关，风险评分高的患者生存期短预后差。