CN106153922A - 一种结肠癌预后预测标志物及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种结肠癌预后预测标志物及其检测方法,其中,所述结肠癌预后预测标志物为PBRM1蛋白。本发明的PBRM1蛋白可以有效区分结肠癌病人术后生存期,从而为结肠癌预后诊断提供了新途径,为临床医生对于结肠癌病情分析提供了参考依据。本发明通过对样本组织进行免疫组织化学测定,当检测出样本组织的染色指数≥6时,判断为PBRM1蛋白高表达,提示结肠癌患者术后生存期长;反之,当检测出样本组织的染色指数<6时,判断PBRM1蛋白为低表达,提示结肠癌患者术后生存期短。
Description
技术领域
本发明涉及预测标志物技术领域,尤其涉及一种结肠癌预后预测标志物及其检测方法。
背景技术
结肠癌是最常见的恶性肿瘤之一,在世界范围内,疾病发生率在男性中排名第三位,病死率第四位,在女性疾病发病率中排名第二位,病死率达第三位。结肠癌的发生始于结肠组织细胞在异常的生物、物理、化学或其他环境因素的刺激下产生异常病变并最终产生癌变。在过去的几十年中,许多国家或地区结肠癌发病率呈逐年上升的趋势。目前针对结肠癌的治疗主要以手术为主,结合放疗化疗为辅的综合治疗方法。但目前结肠癌的预后情况很差,术后存在生存率低、耐药性高或复发转移的情况,对病人及其家人身体及经济上带来很大的负担,严重影响着人们的生活水平。
目前在临床实践中结肠癌的预后分级以病理学症状作为最重要和最可靠的预后指标,而分子标志物被认为是结肠癌预后生存诊断的新发展方向。目前,研究者发现包括CD166、CD44、CD29、lgr5和β-catenin等基因在结肠癌组织中存在异常表达的情况,对这些关键分子标志在患者中的表达量测量有望成为新的结肠癌的预后诊断方式。尽管如此,这些标志物仍未进入临床应用阶段,而许多更加特异的结肠癌分子标志物有待开发。
PBRM1(Polybromo-1),又名BAF180或PB1,其编码基因位于人类染色体3p21区段,蛋白编码长度为1689个氨基酸。PBRM1蛋白是SWI/SNF染色体重塑家族复合物核心成分之一,介导ATP依赖的染色质重塑过程。PBRM1基因广泛参与了如细胞增殖、DNA修复、细胞黏附等多种生物学过程。研究表明,PBRM1基因在多种癌症中扮演着抑癌基因的作用。肾癌中,PBRM1基因通过调节BCL-2家族及Caspase家族基因的表达水平来调控凋亡,最后引起癌变。子宫内膜癌中PBRM1基因的表达分析也发现PBRM1基因的表达量癌旁组织明显高于癌组织。但是,目前对于PBRM1基因在结肠癌发生中的作用机制尚不明确。
因此,现有技术有待于改进和发展。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足,本发明的目的在于提供一种结肠癌预后预测标志物及其检测方法,旨在解决现有技术中结肠癌预后标志物匮乏及特异性较低等问题。
本发明的技术方案如下:
一种结肠癌预后预测标志物,其中,所述结肠癌预后预测标志物为PBRM1蛋白。
所述结肠癌预后预测标志物的检测方法,其中,采用免疫组织化学法对样本组织中的PBRM1蛋白进行定量检测,确定样本组织中PBRM1蛋白的表达水平情况。
所述结肠癌预后预测标志物的检测方法,其中,具体包括:对样本组织进行免疫组织化学检测,检测样本组织中的染色指数,根据检测到的样本组织的染色指数确定样本组织中PBRM1蛋白的表达水平情况。
所述结肠癌预后预测标志物的检测方法,其中,根据检测到的样本组织的染色指数确定样本组织中PBRM1蛋白的表达水平情况的确定方法为:当检测到样本组织的染色指数≥6时,判断PBRM1蛋白为高表达;反之,当检测到样本组织的染色指数<6时,判断PBRM1蛋白为低表达。
所述结肠癌预后预测标志物的检测方法,其中,PBRM1蛋白定量检测时,使用到的定量检测试剂包括与PBRM1蛋白特异性结合的抗体。
所述结肠癌预后预测标志物的检测方法,其中,所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
所述结肠癌预后预测标志物的检测方法,其中,PBRM1蛋白定量检测时,使用到的定量检测试剂还包括检测缓冲液。
有益效果:本发明的PBRM1蛋白可以有效区分结肠癌病人术后生存期,从而为结肠癌预后诊断提供了新途径,为临床医生对于结肠癌病情分析提供了参考依据。
附图说明
图1为结肠癌组织免疫组织化学染色的显微图(100μm)。
图2为癌旁组织免疫组织化学染色的显微图(100μm)。
图3为结肠癌组织免疫组织化学染色的显微图(50μm)。
图4为癌旁组织免疫组织化学染色的显微图(50μm)。
图5为结肠癌组织经H&E染色后的显微图。
图6为癌旁组织经H&E染色后的显微图。
图7为结肠癌组织及癌旁组织的染色指数评分示意图。
图8为PBRM1蛋白表达水平与病人预后生存率的关系图。
具体实施方式
本发明提供一种结肠癌预后预测标志物及其检测方法,为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确,以下对本发明进一步详细说明。应当理解,此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明,并不用于限定本发明。
本发明结肠癌预后诊断是指对结肠癌病人的生存期进行预测或判断,其中,结肠癌患者为肿瘤切除术后患者。
本发明提供一种结肠癌预后预测标志物,其中,所述结肠癌预后预测标志物为PBRM1蛋白。本发明的PBRM1蛋白在结肠癌临床病理样本中存在异常表达的情况,并且其表达量与病人预后状况显著关联,可作为新的分子标志物用于结肠癌预后诊断。PBRM1蛋白为结肠癌预后诊断提供了新途径,为临床医生对于结肠癌病情分析提供了参考依据。
本发明还提供一种基于如上所述结肠癌预后预测标志物的检测方法,其中,采用免疫组织化学法对样本组织中的PBRM1蛋白进行定量检测,确定样本组织中PBRM1蛋白的表达水平情况。本发明的PBRM1蛋白的表达量与结肠癌病人预后状况显著关联,而结肠癌病人预后状况是指结肠癌病人的生存期长短情况,根据样本组织中PBRM1蛋白的表达水平情况,可预估结肠癌预后生存期长短。
本发明PBRM1蛋白的定量检测方法为本领域常见的蛋白定量检测方法,可以为电泳法、色谱法或免疫组织化学法。优选地,本发明采用免疫组织化学法对样本组织中的PBRM1蛋白进行定量检测。
本发明上述检测方法具体包括:对样本组织进行免疫组织化学检测,定量检测样本组织中的染色指数,根据检测到的样本组织的染色指数确定样本组织中PBRM1蛋白的表达水平情况。当检测到的样本组织的染色指数≥6时,判断PBRM1蛋白为高表达,表明结肠癌患者术后生存期长;反之,当检测到的样本组织的染色指数<6时,判断PBRM1蛋白为低表达,表明结肠癌患者术后生存期短。
本发明PBRM1蛋白定量检测时,使用到的定量检测试剂包括与PBRM1蛋白特异性结合的抗体。所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。例如,所述抗体为抗PBRM1的多克隆抗体,可购于美国Millipore公司,其货号为ABE70,稀释比例为1:4000。所述PBRM1蛋白的定量检测试剂还包括检测缓冲液。
下面通过实施例对本发明结肠癌预后预测标志物的检测方法进行详细说明。
先将组织切片在63℃烘箱中烘烤60分钟,然后二甲苯脱蜡2次,每次15分钟,无水乙醇清洗2次,每次7分钟,接着梯度乙醇水化(90%,80%,70%),每次5分钟,然后置于纯水中洗涤2次,每次1分钟。随后进行柠檬酸高压修复,柠檬酸修复液沸腾后,将组织切片放入高压锅中,盖上高压锅盖,待出气后开始计时5分钟。将高压锅盖打开,使其自然冷却30分钟,接着在组织切片上滴加商品化即用阻断剂,孵育10分钟,1×PBS洗涤3次,每次1分钟,加入兔源抗PBRM1多克隆抗体(抗体购于美国Millipore公司,货号ABE70,稀释比例1:4000),室温孵育30分钟,随后取出组织切片经1×PBS洗涤3次,每次1分钟,随后滴加抗兔二抗工作液(购于丹麦DAKO公司,试剂盒货号为DAKOK8000IHC)室温孵育30分钟,1×PBS洗涤3次,每次2分钟,在组织切片上滴加DAB试剂进行显色,观察显色强度,苏木素复染(购于美国Sigma公司)1分钟,再用0.25%的盐酸酒精中浸没2s,用自来水冲洗2分钟,室温晾干后封片,使用仪器DAKO AutostainerLink48进行镜检和染色指数评分。
根据现有标准,对样本组织切片进行免疫组织分析。随后对样本染色程度进行评估,具体方法为:显微镜下细胞被染成黄色或棕黄色,阳性细胞数得分为:0%,0分;1%~25%,1分;26%~50%,2分;51%~75%,3分;≥76%,4分;染色强度得分为:0(无染色),1(浅黄),2(棕黄),3(浅褐),4(深褐)。阳性细胞数得分和染色强度得分之和为样本的最终的染色指数。根据染色指数数值来评估PBRM1蛋白在结肠癌癌组织中的表达水平,染色指数<6视为低表达,染色指数≥6视为高表达。
本发明结肠癌病理样本根据AJCC(American Joint Committee on Cancer)分期系统第七版病理标准进行分级,具体地,原发肿瘤(T)分期,Tx:原发肿瘤无法评估;T0:没有原发肿瘤的证据;Tis:原位癌:上皮内癌或粘膜内癌未穿透粘膜肌层而达粘膜下层;T1:肿瘤侵及粘膜下层;T2:肿瘤侵及肠壁固有肌层;T3:肿瘤侵透固有肌层并侵达浆膜下,或原发病灶位于无浆膜层的结肠、直肠时、肿瘤已侵及结肠旁或直肠旁组织;T4:肿瘤已穿透腹膜或直接侵入其他脏器。淋巴结转移(N)分期,Nx:区域淋巴结无法评估;N0:区域淋巴结无转移;N1:1~3个区域淋巴结转移;N2:≥4个区域淋巴结转移。远处转移(M)分期,M0:无远处转移;M1:有远处转移。最终临床分期为I期:T1~2N0M0;IIA期:T3N0M0;IIB期:T4N0M0;IIIA期:T1~2N1M0;IIIB期:T3~4N1M0;IIIC期:任何TN2M0;IV期:任何T任何NM1。根据肿瘤组织镜检状态进行病理分级为:镜检清晰可视(I级),镜检中度可视(II级),镜检难以分辨(III级)。
下面通过实施例对PBRM1蛋白在结肠癌预后预测的应用进行详细说明。
试验一:免疫组织化学检测PBRM1基因的PBRM1蛋白在结肠癌组织中表达下调:
为了审查PBRM1蛋白在结肠癌病例组织中的表达模式,我们将90例结肠癌病理样本(每个病例包含癌组织和癌旁组织)进行免疫组织化学染色。
样本
1、患者都经由病理诊断和临床诊断后确诊;2、患者年龄均大于18周岁;3、患者癌组织样本和癌旁组织样本是在术中通过电切或全切获得;4、组织样本在收集后立即进行蜡封;5、经HE染色(hematoxylin-eosin staining,苏木精-伊红染色法)显示肿瘤组织超过80%。
表1、样本信息参照表
根据现有报道标准,对样本组织石蜡切片进行免疫组织化学分析,具体方法如上文所述。随后对样本染色程度进行评估,具体方法为:显微镜下细胞被染成黄色或棕黄色,阳性细胞数得分为:0%,0分;1%~25%,1分;26%~50%,2分;51%~75%,3分;≥76%,4分;染色强度得分为:0(无染色),1(浅黄),2(棕黄),3(浅褐),4(深褐)。阳性细胞数得分和染色强度得分之和为样本的最终染色指数。根据染色指数数值来评估PBRM1蛋白在结肠癌癌组织中的表达,染色指数<6视为低表达,染色指数≥6视为高表达。
如图1~4所示,图1~4为具有代表性的结肠癌组织及对应癌旁组织免疫组织化学染色的显微图。图5和图6分别为结肠癌组织及癌旁组织经H&E染色后的显微图。图7为结肠癌组织及癌旁组织的染色指数评分(染色指数)示意图。由上述图可看出,PBRM1蛋白在癌组织中染色强度低,但在癌旁组织中染色强度高。
试验二:PBRM1蛋白免疫组织化学检测与患者预后生存期分析:
为了审查PBRM1蛋白在结肠癌预后诊断的临床意义,我们将90例结肠癌病理样本制备组织芯片,进行免疫组织化学染色,并根据染色程度进行染色指数评分,以此将PBRM1蛋白分为高表达组(染色指数≥6)和低表达组(染色指数<6),使用SPSS 21.0进行Kaplan-Meier生存分析,检验表达模式与预后存活时间的相关性。进一步,本发明使用单一变量和多重变量COX回归分析对PBRM1蛋白表达水平作为独立预后预测指标的可能性进行评估。同时,本发明利用卡方检验(chi-square test)对PBRM1蛋白表达水平与结肠癌病人各种临床指标的相关性进行分析,以映证其作为临床标记物的重要性。
表2、参与验证试验的病人信息及PBRM1蛋白在癌组织和癌旁组织中的染色指数评分(即染色指数)
如图8所示为PBRM1蛋白高表达与病人预后生存率的关系图,其中PBRM1蛋白高表达患者组(染色指数≥6)生存时间较PBRM1蛋白低表达患者组(染色指数<6)预后存活率高(Log Rank p=0.008)。
表3、单一变量COX回归分析结肠癌患者中不同预测指标与预后生存率的关系
表4、多重变量COX回归分析结肠癌患者中不同预测指标与预后生存率的关系
变量 | 危险比[95%置信区间] | p值 |
年龄 | 1.023[0.989,1.058] | 0.190 |
临床分级 | 1.894[0.657,5.461] | 0.237 |
性别 | 1.390[0.765,2.525] | 0.280 |
淋巴结状态 | 1.182[0.297,4.695] | 0.812 |
瘤体直径大于5cm | 1.501[0.793,2.840] | 0.212 |
PBRM1表达水平 | 0.485[0.243,0.969] | 0.040 |
表5.统计分析PBRM1蛋白表达量与结肠癌病人临床指标的关系
本发明的人PBRM1蛋白氨基酸序列如下:
MGSKRRRATSPSSSVSGDFDDGHHSVSTPGPSRKRRRLSNLPTVDPIAVCHELYNTIRDYKDEQGRLLCELFIRAPKRRNQPDYYEVVSQPIDLMKIQQKLKMEEYDDVNLLTADFQLLFNNAKSYYKPDSPEYKAACKLWDLYLRTRNEFVQKGEADDEDDDEDGQDNQGTVTEGSSPAYLKEILEQLLEAIVVATNPSGRLISELFQKLPSKVQYPDYYAIIKEPIDLKTIAQRIQNGSYKSIHAMAKDIDLLAKNAKTYNEPGSQVFKDANSIKKIFYMKKAEIEHHEMAKSSLRMRTPSNLAAARLTGPSHSKGSLGEERNPTSKYYRNKRAVQGGRLSAITMALQYGSESEEDAALAAARYEEGESEAESITSFMDVSNPFYQLYDTVRSCRNNQGQLIAEPFYHLPSKKKYPDYYQQIKMPISLQQIRTKLKNQEYETLDHLECDLNLMFENAKRYNVPNSAIYKRVLKLQQVMQAKKKELARRDDIEDGDSMISSATSDTGSAKRKSKKNIRKQRMKILFNVVLEAREPGSGRRLCDLFMVKPSKKDYPDYYKIILEPMDLKIIEHNIRNDKYAGEEGMIEDMKLMFRNARHYNEEGSQVYNDAHILEKLLKEKRKELGPLPDDDDMASPKLKLSRKSGISPKKSKYMTPMQQKLNEVYEAVKNYTDKRGRRLSAIFLRLPSRSELPDYYLTIKKPMDMEKIRSHMMANKYQDIDSMVEDFVMMFNNACTYNEPESLIYKDALVLHKVLLETRRDLEGDEDSHVPNVTLLIQELIHNLFVSVMSHQDDEGRCYSDSLAEIPAVDPNFPNKPPLTFDIIRKNVENNRYRRLDLFQEHMFEVLERARRMNRTDSEIYEDAVELQQFFIKIRDELCKNGEILLSPALSYTTKHLHNDVEKERKEKLPKEIEEDKLKREEEKREAEKSEDSSGAAGLSGLHRTYSQDCSFKNSMYHVGDYVYVEPAEANLQPHIVCIERLWEDSAEKEVFKSDYYNKVPVSKILGKCVVMFVKEYFKLCPENFRDEDVFVCESRYSAKTKSFKKIKLWTMPISSVRFVPRDVPLPVVRVASVFANADKGDDEKNTDNSEDSRAEDNFNLEKEKEDVPVEMSNGEPGCHYFEQLHYNDMWLKVGDCVFIKSHGLVRPRVGRIEKVWVRDGAAYFYGPIFIHPEETEHEPTKMFYKKEVFLSNLEETCPMTCILGKCAVLSFKDFLSCRPTEIPENDILLCESRYNESDKQMKKFKGLKRFSLSAKVVDDEIYYFRKPIVPQKEPSPLLEKKIQLLEAKFAELEGGDDDIEEMGEEDSESTPKSAKGSAKKEGSKRKINMSGYILFSSEMRAVIKAQHPDYSFGELSRLVGTEWRNLETAKKAEYEGMMGGYPPGLPPLQGPVDGLVSMGSMQPLHPGGPPPHHLPPGVPGLPGIPPPGVMNQGVAPMVGTPAPGGSPYGQQVGVLGPPGQQAPPPYPGPHPAGPPVIQQPTTPMFVAPPPKTQRLLHSEAYLKYIEGLSAESNSISKWDQTLAARRRDVHLSKEQESRLPSHWLKSKGAHTTMADALWRLRDLMLRDTLNIRQAYNLENV
综上所述,本发明提供一种结肠癌预后预测标志物及其检测方法,本发明的PBRM1蛋白表达水平可以有效区分结肠癌病人术后生存期长短,从而为结肠癌预后判断提供了新途径,为临床医生对于结肠癌病情分析提供了参考依据。该PBRM1蛋白作为检测标志物具有以下特征:当样本组织的染色指数≥6时,判断为PBRM1蛋白高表达,提示结肠癌患者术后生存期长;反之,当样本组织的染色指数<6时,判断PBRM1蛋白为低表达,提示结肠癌患者术后生存期短。
应当理解的是,本发明的应用不限于上述的举例,对本领域普通技术人员来说,可以根据上述说明加以改进或变换,所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
Claims (7)
1.一种结肠癌预后预测标志物,其特征在于,所述结肠癌预后预测标志物为PBRM1蛋白。
2.一种基于权利要求1所述结肠癌预后预测标志物的检测方法,其特征在于,采用免疫组织化学法对样本组织中的PBRM1蛋白进行定量检测,确定样本组织中PBRM1蛋白的表达水平情况。
3.根据权利要求2所述结肠癌预后预测标志物的检测方法,其特征在于,具体包括:对样本组织进行免疫组织化学检测,检测样本组织中的染色指数,根据检测到的样本组织的染色指数确定样本组织中PBRM1蛋白的表达水平情况。
4.根据权利要求3所述结肠癌预后预测标志物的检测方法,其特征在于,根据检测到的样本组织的染色指数确定样本组织中PBRM1蛋白的表达水平情况的确定方法为:当检测到样本组织的染色指数≥6时,判断PBRM1蛋白为高表达;反之,当检测到样本组织的染色指数<6时,判断PBRM1蛋白为低表达。
5.根据权利要求2所述结肠癌预后预测标志物的检测方法,其特征在于,PBRM1蛋白定量检测时,使用到的定量检测试剂包括与PBRM1蛋白特异性结合的抗体。
6.根据权利要求5所述结肠癌预后预测标志物的检测方法,其特征在于,所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
7.根据权利要求5所述结肠癌预后预测标志物的检测方法,其特征在于,PBRM1蛋白定量检测时,使用到的定量检测试剂还包括检测缓冲液。
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