CN110018309A - 通过蛋白标志物判断结直肠癌预后的试剂盒 - Google Patents

Abstract

本公开涉及一种检测蛋白标志物的配体在制备用于判断结直肠癌预后的产品中的用途，以及一种用于判断结直肠癌预后的试剂盒。本公开利用配体联合检测样品中的Osteoglycin蛋白，可以有效判断结直肠癌患者预后，有利于指导结直肠癌患者的术后用药，使患者得到最佳的受益。

Description

通过蛋白标志物判断结直肠癌预后的试剂盒

技术领域

本公开涉及分子生物学、临床检测技术领域，具体地，涉及蛋白标志物在判断结直肠癌预后的产品中的用途和通过蛋白标志物判断结直肠癌预后的试剂盒。

背景技术

结肠癌是最常见的消化系统肿瘤之一，全球结直肠癌的死亡率位居所有肿瘤死亡率的第四位。根据卫生部全国肿瘤防治办公室提供的最新资料显示，结直肠癌分别居我国恶性肿瘤发病率和死亡率的第三位和第五位，其发病率在城市地区中已达第二位。结肠癌的死亡大多是由复发转移造成的，迄今为止，与结直肠癌复发转移相关的分子机制尚未阐明，寻找与之密切相关的分子标志物并分析具体作用机制，仍是当前的主要研究方向。

结直肠癌发生发展过程中很多基因与分子发生改变，包括Ras、TP53、APC和CD44等基因的改变，这些改变赋于了肿瘤固有特征，提供了临床医生判断肿瘤预后及对治疗反应性很好的工具，从而有助于制定个性化临床治疗方案。但目前尚无一个指标获得全球学者绝对一致性的评价，这可能与检测方法多样化及肿瘤的异质性有关。

鉴于此，本领域迫切需要研发出可用于预后判断的蛋白标志物或标志物组合，以期在临床治疗前，能够预判复发的几率和预测最佳或最差的受益。

发明内容

本公开的目的是提供一种检测蛋白标志物的配体在制备用于判断结直肠癌预后的产品中的用途和用于判断结直肠癌预后的试剂盒。

为了实现上述目的，本公开第一方面：提供一种检测蛋白标志物的配体在制备用于诊断结直肠癌和/或判断结直肠癌预后的产品中的用途，其中，所述蛋白标志物为Osteoglycin蛋白。

可选地，所述配体为核酸和/或多肽，所述多肽包括抗体，所述多肽包括抗体，所述抗体为选自人抗体、嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体、单克隆抗体、单克隆抗体的抗原结合片段和多克隆抗体中的至少一种。

可选地，所述单克隆抗体为编号NBP1-87766的单克隆抗体。

可选地，检测蛋白标志物是通过以下步骤进行的：

1)获得结直肠癌组织样品；以及

2)确定样品中蛋白标志物的表达水平。

可选地，步骤2)的方法为组织微阵列和/或免疫组织化学方法。

本公开第二方面：提供一种用于诊断结直肠癌和/或判断结直肠癌预后的试剂盒，其中，所述试剂盒包括检测蛋白标志物的配体，所述蛋白标志物为Osteoglycin蛋白。

可选地，所述配体核酸和/或多肽，所述多肽包括抗体，所述多肽包括抗体，所述抗体为选自人抗体、嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体、单克隆抗体、单克隆抗体的抗原结合片段和多克隆抗体中的至少一种。

通过上述技术方案，本公开利用配体联合检测样品中的Osteoglycin蛋白，可以有效对结直肠癌患者进行诊断，其准确性显著高于使用单一蛋白标志物的检测结果。本公开的方法也能够有效的判断结直肠癌患者预后判断，有利于指导结直肠癌患者的术后用药，使患者得到最佳的受益。

本公开的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。

附图说明

附图是用来提供对本公开的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本公开，但并不构成对本公开的限制。在附图中：

图1是Osteoglycin蛋白表达与结直肠癌患者总生存之间的关系。

图2是正常组织和结直肠癌组织中Osteoglycin蛋白的检测结果对比，其中，左图是正常组织的检测结果，右图是结直肠癌组织的检测结果。

具体实施方式

以下结合附图对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

本公开第一方面：提供一种检测蛋白标志物的配体在制备用于诊断结直肠癌和/或判断结直肠癌预后的产品中的用途，其中，所述蛋白标志物为Osteoglycin蛋白。

所述Osteoglycin蛋白是一种被分泌到细胞外的富含亮氨酸糖蛋白，于1989年由Bentz H首次在牛的骨有机质中分离得到，其前体形式是含有299个氨基酸的Mimecan分子，在体外其C-端被剪切后成为含有105个氨基酸的成熟蛋白。与其它的富含亮氨酸的糖蛋白功能类似，Osteoglycin蛋白主要介导细胞外基质的形成，可以促进成骨细胞形成而抑制破骨细胞形成，从而诱导骨的形成。另外，Osteoglycin蛋白对于维持角膜基质细胞、血管平滑肌细胞和垂体促肾上腺皮质激素细胞的功能起到了重要的作用。Osteoglycin蛋白在NCBI数据库中的参考编号为NP_077727.3；Osteoglycin基因在NCBI数据库中的参考编号为4969。

根据本公开，所述Osteoglycin蛋白具有以下特征：

在结直肠癌患者癌组织中的水平相对较低；

在结直肠癌患者癌旁组织中的水平相对较高；

在预后较差的结直肠癌患者中水平相对较低；

在预后较好的结直肠癌患者中水平相对较高。

参考图2可见，Osteoglycin蛋白在结肠癌组织中的水平低于癌旁正常组织。

根据本公开，所述配体为可以与Osteoglycin蛋白特异性结合，用于检测所述蛋白的配体，例如可以为核酸和/或多肽。其中，所述多肽包括抗体，所述抗体例如为选自人抗体、嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体、单克隆抗体、单克隆抗体的抗原结合片段和多克隆抗体中的至少一种。可以使用本领域技术人员熟知的标准技术产生抗体，或者可以使用购买的抗体。进一步地，所述单克隆抗体可以为编号NBP1-87766的单克隆抗体。

根据本公开，检测蛋白标志物是通过以下步骤进行的：

1)获得结直肠癌组织样品；以及

2)使所述配体与待测样品反应，确定反应结果。

其中，步骤2)的方法为组织微阵列和/或免疫组织化学方法。

例如可以使用免疫测定的方法定量检测蛋白标志物的存在。所述免疫测定通常包括将生物样品与抗体一起孵育，并通过本领域技术人员所熟知的技术如免疫组织化学实验(IHC)检测结合抗体。

在本公开的一种具体实施方式中，制备样本方法、IHC方法和阳性判断标准如下：

(1)制备样本：

将30min之内的离体手术组织投入中性福尔马林固定液中固定过夜，流水冲洗，经过脱水、透明和浸蜡，制备组织蜡块。以组织病理学判断为II期结肠癌的病例。每个选取3个典型的癌组织点和2个正常的癌旁组织点，制作组织微阵列并制备4μm切片。

(2)IHC：蛋白的具体检测方法如下：

将组织芯片正面迎风置于65℃烘烤箱中烘烤40min，使标本贴附更好，浸入二甲苯洗缸I、II、III中，分别置于25℃恒温水浴箱中10min，转入100％、85％、75％乙醇中各3min梯度水化，然后转入PBS缓冲液I、II、III中，每次5min，置于3％过氧化氢洗缸中15min，封闭内源性过氧化酶。浸入加热后的枸橼酸钠缓冲液中，微波炉中低火20min。浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。用PAP Pen免疫组化石蜡笔沿组织芯片边缘画出其范围，将稀释后的一抗溶液或抗体工作液用200μL微量加样器铺满所画范围内的组织阵列表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育2h或4℃冰箱中过夜。在纸巾上去除多余一抗，将组织芯片依次浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。加二步法免疫组化检测试剂盒中的试剂Ⅱ，确保铺满所画范围内的组织阵列表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育15min。在纸巾上去除多余试剂，将组织芯片依次浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。加二步法免疫组化检测试剂盒中的试剂Ⅲ(Polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG)，确保铺满所画范围内的组织阵列表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育30min。在纸巾上去除多余试剂，将组织芯片依次浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。取DAB试剂盒取适量试剂，按1mLDAB稀释液加50μLDAB浓缩液的比例混匀；用200μL微量加样器将稀释后的DAB溶液铺满所画范围内的组织阵列表面进行显色，同一芯片保持显色时间一致；在镜下观察显色效果直至同一芯片内部及不同芯片之间形成较显著的对比后在纸巾上去除多余DAB溶液并置于蒸馏水中；显色时间为60s，不同抗体间显色时间有所差异。将苏木素染液用1000μL微量加样器迅速铺满所画范围内的组织阵列表面，10s后用缓慢的流水立刻冲去；将染色后的芯片置于1％氨水中。将组织芯片依次浸入75％、85％、100％乙醇中各3min梯度脱水。浸入二甲苯洗缸中，10min，脱去PAP Pen免疫组化石蜡笔画出的笔迹，将组织芯片置于通风处晾干，用快干封片剂封片。

(3)阳性判断标准：

计数20个高倍视野的免疫组化反应着色的细胞，染色强度积分为：无染色0分，弱染色1分，中等染色2分，强染色3分；染色面积积分为：着色范围≤10％为0分，>10％-25％为1分，>25％-50％为2分，>50％～75％为3分>75％为4分。若两者积分之和≥3分则为阳性，低于3分则为阴性。

当检测结果呈现阳性时，指示患者预后较好。

本公开第二方面：提供一种用于诊断结直肠癌和/或判断结直肠癌预后的试剂盒，其中，所述试剂盒包括检测蛋白标志物的配体，所述蛋白标志物为Osteoglycin蛋白。

根据本公开，所述配体为可以与Osteoglycin蛋白特异性结合，用于检测所述蛋白的配体，例如可以为核酸和/或多肽。其中，所述多肽包括抗体，所述抗体例如为选自人抗体、嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体、单克隆抗体、单克隆抗体的抗原结合片段和多克隆抗体中的至少一种。可以使用本领域技术人员熟知的标准技术产生抗体，或者可以使用购买的抗体。进一步地，所述单克隆抗体可以为编号NBP1-87766的单克隆抗体。

本公开利用配体联合检测样品中的Osteoglycin蛋白，可以有效对结直肠癌患者进行诊断，其准确性显著高于使用单一蛋白标志物的检测结果。本公开的方法也能够有效的判断结直肠癌患者预后判断，有利于指导结直肠癌患者的术后用药，使患者得到最佳的受益。

以下对本公开的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本公开，并不用于限制本公开。

实施例中，检测Osteoglycin蛋白的抗体测试剂订制于NOVUS Biologicals(美国)公司，货号为NBP1-87766；免疫组化二抗试剂盒购自北京中衫金桥生物技术有限公司，货号为PV-9000。

实施例

针对130结直肠癌患者的肿瘤组织样本，使用IHC方法检测Osteoglycin蛋白的水平，并结合患者的五年总生存，进行单因素和多因素方差分析。

(1)制备样本：

将30min之内的离体手术组织投入中性福尔马林固定液中固定过夜，流水冲洗，经过脱水、透明和浸蜡，制备组织蜡块。以组织病理学判断为II期结肠癌的病例。每个选取3个典型的癌组织点和2个正常的癌旁组织点，制作组织微阵列并制备4μm切片。

(2)IHC：蛋白的具体检测方法如下：

将组织芯片正面迎风置于65℃烘烤箱中烘烤40min，使标本贴附更好，浸入二甲苯洗缸I、II、III中，分别置于25℃恒温水浴箱中10min，转入100％、85％、75％乙醇中各3min梯度水化，然后转入PBS缓冲液I、II、III中，每次5min，置于3％过氧化氢洗缸中15min，封闭内源性过氧化酶。浸入加热后的枸橼酸钠缓冲液中，微波炉中低火20min。浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。用PAP Pen免疫组化石蜡笔沿组织芯片边缘画出其范围，将稀释后的一抗溶液或抗体工作液用200μL微量加样器铺满所画范围内的组织阵列表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育2h或4℃冰箱中过夜。在纸巾上去除多余一抗，将组织芯片依次浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。加二步法免疫组化检测试剂盒中的试剂Ⅱ，确保铺满所画范围内的组织阵列表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育15min。在纸巾上去除多余试剂，将组织芯片依次浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。加二步法免疫组化检测试剂盒中的试剂Ⅲ(Polyperoxidase-anti-mouse/rabbit IgG)，确保铺满所画范围内的组织阵列表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育30min。在纸巾上去除多余试剂，将组织芯片依次浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。取DAB试剂盒取适量试剂，按1mLDAB稀释液加50μLDAB浓缩液的比例混匀；用200μL微量加样器将稀释后的DAB溶液铺满所画范围内的组织阵列表面进行显色，同一芯片保持显色时间一致；在镜下观察显色效果直至同一芯片内部及不同芯片之间形成较显著的对比后在纸巾上去除多余DAB溶液并置于蒸馏水中；显色时间为60s，不同抗体间显色时间有所差异。将苏木素染液用1000μL微量加样器迅速铺满所画范围内的组织阵列表面，10s后用缓慢的流水立刻冲去；将染色后的芯片置于1％氨水中。将组织芯片依次浸入75％、85％、100％乙醇中各3min梯度脱水。浸入二甲苯洗缸中，10min，脱去PAP Pen免疫组化石蜡笔画出的笔迹，将组织芯片置于通风处晾干，用快干封片剂封片。

(3)阳性判断标准：

计数20个高倍视野的免疫组化反应着色的细胞，染色强度积分为：无染色0分，弱染色1分，中等染色2分，强染色3分；染色面积积分为：着色范围≤10％为0分，>10％-25％为1分，>25％-50％为2分，>50％～75％为3分>75％为4分。若两者积分之和≥3分则为阳性，低于3分则为阴性。

图1为Osteoglycin蛋白表达与结直肠癌患者总生存之间的关系。由图1可以看出，当检测结果呈现阳性时，患者预后较好。表1为Osteoglycin蛋白表达与结直肠癌各临床参数之间的关系。从表1可以看出，在结直肠癌中，Osteoglycin蛋白的高表达与淋巴结转移、临床分期呈正相关，而与其他临床病理参数无相关性。

表1

当用Osteoglycin蛋白分别进行五年总生存诊断时，单因素分析和多因素回归分析的结果显示，Osteoglycin蛋白可以作为独立的预后因子(P<0.001)，均低于临床上常用的T分期、分化状态分期等预后判断标准。总生存的COX回归分析见表2。

表2

以上结合附图详细描述了本公开的优选实施方式，但是，本公开并不限于上述实施方式中的具体细节，在本公开的技术构思范围内，可以对本公开的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本公开的保护范围。

另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本公开对各种可能的组合方式不再另行说明。

此外，本公开的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本公开的思想，其同样应当视为本公开所公开的内容。

Claims (7)

1.一种检测蛋白标志物的配体在制备用于判断结直肠癌预后的产品中的用途，其中，所述蛋白标志物为Osteoglycin蛋白。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述配体为核酸和/或多肽，所述多肽包括抗体，所述抗体为选自人抗体、嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体、单克隆抗体、单克隆抗体的抗原结合片段和多克隆抗体中的至少一种。

3.根据权利要求2所述的用途，其中，所述单克隆抗体为编号NBP1-87766的单克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的用途，其中，检测蛋白标志物是通过以下步骤进行的：

1)获得结直肠癌组织样品；以及

2)确定样品中蛋白标志物的表达水平。

5.根据权利要求4所述的用途，其中，步骤2)的方法为组织微阵列和/或免疫组织化学方法。

6.一种用于判断结直肠癌预后的试剂盒，其中，所述试剂盒包括检测蛋白标志物的配体，所述蛋白标志物为Osteoglycin蛋白。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其中，所述配体为核酸和/或多肽，所述多肽包括抗体，所述抗体为选自人抗体、嵌合抗体、重组抗体、人源化抗体、单克隆抗体、单克隆抗体的抗原结合片段和多克隆抗体中的至少一种。