CN110865186B - 蛋白标志物或其组合在结直肠癌预后判断中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物学、临床检测领域，涉及蛋白标志物或其组合在结直肠癌预后判断中的应用。具体地，本发明涉及选自如下的(1)－(7)项中的任意一项在制备结直肠癌(例如II期或III期结直肠癌)的诊断、复发风险评估、预后判断或者辅助治疗的药物中的用途：(1)p‑mTOR，(2)p‑mTOR、MAP4，(3)p‑mTOR、DNAJB6，(4)MAP4，(5)MAP4、DNAJB6，(6)p‑mTOR、MAP4、DNAJB6，和(7)试剂，其能够检测(例如定量检测或定性检测)上述(1)－(6)项中的任意一项。本发明的标志物或标志物组合能够有效地用于结直肠癌患者的预后判断，例如患者术后生存期及中位生存时间的预测。

Description

蛋白标志物或其组合在结直肠癌预后判断中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学领域和临床检测领域，涉及蛋白标志物或其组合在结直肠癌预后判断中的应用。

背景技术

结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是最常见的消化系统恶性肿瘤之一。全球每年有约120万名患者被确诊为结直肠癌，超过60万名患者直接或间接死于结直肠癌。在欧美发达国家，结直肠癌是发病率位居第三位、死亡率位居第二位的恶性肿瘤。在我国，结直肠癌近年来的发病率呈逐年上升趋势。

目前CRC的治疗以手术为主，手术后的复发和转移是CRC治疗失败及患者死亡的主要原因。II期CRC患者预后相对较好，因此临床上对多数II期患者不进行辅助治疗，只有同时伴有高危因素时才被建议进行辅助化疗。但是，虽然分期同属于II期CRC，但不同患者之间预后存在很大差异，其中20％－30％患者术后会出现复发转移，因此对于这部分患者而言会有治疗不足的情况发生。III期CRC患者术后的复发风险为15％－50％，因此，若无明显禁忌均被推荐进行辅助化疗。然而，部分III期患者复发转移风险较低，进行辅助化疗则会导致过度治疗，给病人的身体带来不必要的损伤。

因此，CRC临床治疗中面临的一个重要问题是如何准确甄别那些具有较高复发转移风险的患者，对其进行积极干预和有效的治疗。基于TNM分期等临床指标不能准确判断CRC患者的预后，无法区分哪些II期患者和III期患者存在较高复发转移风险，因此哪些患者可能从辅助治疗中获益尚不明确。

目前尚需要开发新的分子标志物，以准确地预测结直肠癌患者的预后，进行有针对性的治疗，避免治疗不足或过度治疗，从而有效提高结直肠癌患者的生存时间。

发明内容

发明人通过深入的研究和创造性的劳动，发现p-mTOR或MAP4是有效的肿瘤蛋白标志物，并进一步得到了肿瘤蛋白标志物组合，其含有p-mTOR和/或MAP4，优选地还含有DNAJB6。本发明人惊奇地发现，该肿瘤蛋白标志物或肿瘤蛋白标志物组合能够有效地用于结直肠癌患者的预后判断，例如患者术后生存期及中位生存时间的预测。

由此提供了下述发明：

本发明的一个方面涉及选自如下的(1)－(7)项中的任意一项在制备用于结直肠癌(例如II期或III期结直肠癌)的诊断、复发风险评估、预后判断、治疗或者辅助治疗的药物中的用途：

(1)p-mTOR，

(2)p-mTOR、MAP4，

(3)p-mTOR、DNAJB6，

(4)MAP4，

(5)MAP4、DNAJB6，

(6)p-mTOR、MAP4、DNAJB6，和

(7)试剂，其能够检测(例如定量检测或定性检测)上述(1)－(6)项中的任意一项。

上述(1)－(6)为的蛋白或蛋白组合，也分别称为蛋白标志物或蛋白标志物组合。

在本发明的一个或多个实施方案中，所述的用途，其中，(7)中所述试剂为一种或多种抗体，或者为包含所述一种或多种抗体的药物组合物；优选地，所述抗体为单克隆抗体。优选地，所述抗体为能够特异性结合p-mTOR、MAP4和/或DNAJB6的单克隆抗体或其抗原结合片段。

在本发明的一个或多个实施方案中，所述的用途，其中，所述抗体还连接有可检测的标记物，例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。

本发明的另一方面涉及核酸在制备用于结直肠癌(例如II期或III期结直肠癌)的诊断、复发风险评估、预后判断、治疗或者辅助治疗的药物中的用途，所述核酸编码选自如下的(1)－(7)项中的任意一项：

(1)p-mTOR，

(2)p-mTOR、MAP4，

(3)p-mTOR、DNAJB6，

(4)MAP4，

(5)MAP4、DNAJB6，

(6)p-mTOR、MAP4、DNAJB6，和

(7)试剂，其能够检测(例如定量检测或定性检测)上述(1)－(6)项中的任意一项。

在本发明的一个或多个实施方案中，所述的用途，其中，所述试剂为特异性的引物或者探针，或者为包含所述引物或者探针的药物组合物。优选地，所述引物或探针为能够特异性结合编码p-mTOR、MAP4和/或DNAJB6的核酸的引物或探针。

在本发明的一个或多个实施方案中，所述的用途，其中，所述探针还连接有可检测的标记物，例如荧光基团；优选地，所述荧光基团为选自cy3、cy5、Texas Red、6-FAMTM、AF532、AF647和AF688中的至少一种。

本发明的再一方面涉及一种蛋白组合，其包含选自如下的①－④项中的任意一项；

①p-mTOR、MAP4，

②p-mTOR、DNAJB6，

③MAP4、DNAJB6，和

④p-mTOR、MAP4、DNAJB6。

本发明的再一方面涉及一种检测剂，其包含抗体，所述抗体能够特异性结合选自如下的①－④项中的任意一项；

①p-mTOR、MAP4，

②p-mTOR、DNAJB6，

③MAP4、DNAJB6，和

④p-mTOR、MAP4、DNAJB6；

优选地，所述抗体为2种或3种；

优选地，所述抗体为单克隆抗体；

优选地，所述抗体还连接有可检测的标记物，例如放射性同位素、荧光物质、发光物质、有色物质或酶。

本发明的再一方面涉及一种检测剂，其包含引物或探针，所述引物或探针能够特异性地结合核酸，所述核酸编码选自如下的①－④项中的任意一项；

①p-mTOR、MAP4，

②p-mTOR、DNAJB6，

③MAP4、DNAJB6，和

④p-mTOR、MAP4、DNAJB6；

优选地，所述引物或探针为2种或3种；

优选地，所述探针还连接有可检测的标记物，例如荧光基团；

优选地，所述荧光基团为选自cy3、cy5、Texas Red、6-FAMTM、AF532、AF647和AF688中的至少一种。

本发明的再一方面涉及一种试剂盒，其包含本发明任一项所述的检测剂。

本发明还涉及一种诊断、复发风险评估、预后判断、治疗或者辅助治疗结直肠癌或结直肠癌患者的方法，包括检测含p-mTOR、MAP4和/或DNAJB6蛋白表达水平或其编码基因水平的步骤，例如通过免疫组织化学(IHC)的方法进行检测。在本发明的一个实施方案中，所针对的样品为结肠癌患者的组织样本。当本发明涉及的三种标志物中任意1-2种标志物的抗原－抗体反应呈现中等或高表达时，判断所测结直肠癌患者预后相对较差(中位生存时间44个月)；3种标志物的抗原－抗体反应均呈现中等或高表达时，判断所测结直肠癌患者预后相对最差(中位生存时间为30个月)；3种标志物的抗原－抗体反应均呈现低表达时，判断所测结直肠癌患者的预后最好(中位生存时间为60个月)。

检测蛋白标志物的方法涉及使用其特异性抗体与蛋白质标志物分子相互作用并进行检测。例如可以如本文所述使用针对蛋白标志物的免疫组织化学实验(IHC)试剂(其中包含该蛋白的抗体)。可以使用本领域技术人员熟知的标准技术制备抗体，或者使用商售的抗体。可以使用多克隆抗体，但优选单克隆抗体。

可以使用免疫测定的方法定量检测蛋白标志物的存在。所述免疫测定通常包括将生物样品与抗体一起孵育，并通过熟知技术IHC检测结合抗体。

在本发明的实施方案中，制备样本方法、IHC方法和高表达判断标准如下：

(1)制备样本：

将30min之内的离体手术组织投入中性福尔马林固定液中固定过夜，流水冲洗，经过脱水、透明和浸蜡，制备组织蜡块。以组织病理学判断为结直肠癌的病例。每个病例选取3个典型的癌组织点和2个正常的癌旁组织点，制作组织微阵列并制备4μm切片。

(2)IHC：各蛋白的具体检测方法如下：

将组织芯片正面迎风置于65℃烘烤箱中烘烤40min，使标本贴附得更好；依次浸入室温的二甲苯洗缸I、II、III中，每次10min；转入100％、85％、75％乙醇中各3min进行梯度水化，然后转入0.01MpH7.2-7.4的PBS缓冲液I、II、III中，每次5min；置于3％过氧化氢洗缸中15min，封闭内源性过氧化酶。提前将约180mL枸橼酸钠缓冲液(0.01M pH6.0)倒入抗原修复盒中微波炉高火加热3分钟；将组织芯片浸入加热后的枸橼酸钠缓冲液中，微波炉中低火20min。将加热后的浸于枸橼酸钠的组织芯片置于通风处自然冷却至室温。将芯片依次转入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。吸干PBS，用PAP Pen免疫组化石蜡笔沿组织芯片边缘画出其范围，将稀释后的一抗溶液或抗体工作液用200μL微量加样器铺满所画范围内的组织阵列表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育2h或4℃冰箱中过夜。在纸巾上去除多余一抗，将组织芯片依次浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。加PV8000kit中的二抗，确保铺满所画范围内的组织阵列表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育30min。去除多余试剂，将组织芯片依次浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min；将DAB试剂盒中的试剂，按1mLDAB稀释液加50μL DAB浓缩液的比例混匀；用200μL微量加样器将稀释后的DAB溶液铺满所画范围内的组织阵列表面进行显色，同一芯片各点之间保持显色时间一致；在镜下观察显色效果直至同一芯片内部及不同芯片之间形成较显著的对比后，在纸巾上去除多余DAB溶液并置于蒸馏水中终止显色反应(显色时间一般为30-60s，不同抗体间显色时间有所差异)；将苏木素染液用1mL微量加样迅速铺满所画范围内的组织阵列表面，约10s后用缓慢的流水冲去染液；将染色后的芯片置于1％氨水中以充分返蓝。将组织芯片依次浸入75％、85％、100％乙醇中各3min进行脱水。浸入二甲苯洗缸中，10min，脱去PAP Pen免疫组化石蜡笔画出的笔迹，将组织芯片置于通风处晾干，用快干封片剂封片。在显微镜下按评分标准对每个组织芯片的染色程度进行评分，并对较典型的染色部分进行拍照。

(3)IHC结果评价标准：

p-mTOR蛋白主要定位于细胞浆，部分位于细胞膜。在显微镜下观察免疫组化反应着色的肿瘤细胞，完全无显色或者<10％的肿瘤细胞出现胞浆或膜显色评为0分，＞10％的肿瘤细胞出现很弱的胞浆或膜显色评为1分，＞10％的肿瘤细胞出现很弱至中等强度的胞浆或膜显色评为2分，＞10％的肿瘤细胞出现较强的胞浆或膜显色评为3分。其中，＜2定义为低表达，≥2定义为高表达。

DNAJB6主要定位于胞浆和胞核，在显微镜下观察免疫组化反应着色的肿瘤细胞，完全无显色或者<10％的肿瘤细胞出现胞浆或胞核显色为0分，＞10％的肿瘤细胞出现很弱的胞浆或胞核显色评为1分，＞10％且＜50％的肿瘤细胞出现较弱至中等强度的胞浆或胞核显色评为2分，＞10％的肿瘤细胞出现较强的胞浆或胞核显色评为3分。其中，＜2定义为低表达，≥2定义为高表达。

MAP4定位于胞浆，在显微镜下观察免疫组化反应着色的肿瘤细胞，完全无显色或者<10％的肿瘤细胞出现胞浆显色评为0分，＞10％的肿瘤细胞出现很弱的胞浆显色评为1分，＞10％的肿瘤细胞出现很弱至中等强度的胞浆显色评为2分，＞10％的肿瘤细胞出现较强的胞浆显色评为3分。其中，＜2定义为低表达，≥2定义为高表达。

三种蛋白组成的标志物组合表达水平的评分原则：首先用Kaplan-Meier法单因素生存分析法计算单个标志物表达水平与患者生存时间的相关性，根据单个标志物所占权重(p-mTOR：0.785、MAP4：0.655、DNAJB6：0.669)，计算出标志物组合表达情况的最终评分(最终评分＝0.785×p-mTOR原始评分+0.655×MAP4原始评分+0.669×DNAJB6原始评分)，根据X-title软件提供的算法计算出最优划分阈值，将标志物组合表达水平分为三组：表达水平低(评分为0.00-0.67)、表达水平中等(评分为0.79-1.45)和表达水平高(评分为1.45-2.11)。

以下是对本发明中涉及的部分术语的解释：

mTOR(mammalian target of rapamycin/mechanistic target of rapamycin)是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，属于PI3K相关激酶超家族成员，在控制细胞生长和代谢等方面起重要作用。mTOR信号通路在多种恶性肿瘤中异常活化并可促进肿瘤细胞的生长、侵袭和转移等恶性表型。Ser2448发生磷酸化可使mTOR活化，发挥促癌功能，在本发明中表示为p-mTOR。在本发明的一个实施方案中，mTOR的氨基酸序列请参见GenBank登录号NP_004949.1，其编码核酸序列请参见NM_004958。

MAP4(Microtubule-associated protein 4，MAP4)属于微管相关蛋白(microtubule associated proteins,MAPs)家族的一员。MAP4在神经组织以外的其它组织中广泛表，其主要功能是通过与微管蛋白结合稳定微管结构，在神经分化、树突延长和细胞有丝分裂中均发挥重要作用。MAP4过表达可促进食管癌和膀胱癌细胞的侵袭能力，但其在结直肠癌中的作用及与患者预后的关系尚无报道。在本发明的一个实施方案中，MAP4的氨基酸序列请参见GenBank登录号NP_001127836.1，其编码核酸序列请参见NM_001134364.1。

DNAJB6属于Hsp40家族成员，可以与抗凋亡伴侣蛋白Hsp70相结合，激活Hsp70的ATP酶活性，使之能识别新生多肽链或非活性多肽链，促进底物多肽链的正确折叠，进而参与蛋白质的翻译后加工过程。DNAJB6在结直肠癌中表达升高，可以促进细胞的侵袭。在本发明的一个实施方案中，DNAJB6的氨基酸序列请参见GenBank登录号NP_490647.1，其编码核酸序列请参见NM_058246.3。

在本发明中，当提及上述任一个蛋白的氨基酸序列时，其包括该蛋白的全长，还包括其融合蛋白。然而，本领域技术人员理解，在所述蛋白的氨基酸序列中，可天然产生或人工引入突变或变异(包括但不限于置换，缺失和/或添加)，而不影响其生物学功能。在本发明的一个实施方案中，该蛋白为人蛋白。

结肠和直肠在解剖学上是连续的，生物学行为上也存在相似之处，因此可合并在一起进行研究。本发明中，术语“结直肠癌”，如果没有特别说明，是指结肠癌或直肠癌，也可指结肠癌和直肠癌。

根据UICC(国际抗癌联盟)发布的第八版的恶性肿瘤的TNM分期。结直肠癌的分期通常由三个基本分期要素组成，即T分期、N分期、M分期。由这三个要素，共同决定最后的分期。这是目前通用的分期方法。T分期：T指肿瘤原发灶的情况，随着肿瘤体积的增加和邻近组织受累范围的增加，依次用T1～T4来表示。N分期：N指区域淋巴结受累情况。淋巴结未受累时，用N0表示。随着淋巴结受累程度和范围的增加，依次用N1～N2表示。M分期：M指远处转移(通常是血道转移)，没有远处转移者用M0表示，有远处转移者用M1表示。

I期结直肠癌：肿瘤细胞侵犯结肠粘膜下层和固有肌层，而无区域淋巴结转移的结肠癌。I期结直肠癌包括T1N0M0和T2N0M0期。

II期结直肠癌：肿瘤细胞穿透结肠固有肌层到达浆膜下层，或侵犯无腹膜覆盖的结肠旁组织，或透腹膜脏层或直接侵犯或粘连于其他器官或结构，无区域淋巴结转移的结肠癌。II期结直肠癌包括T3N0M0、T4aN0M0和T4bN0M0。

III期结直肠癌：肿瘤细胞侵犯结肠黏膜下层和固有肌层，或穿透结肠固有肌层到达浆膜下层，或侵犯无腹膜覆盖的结肠旁组织，或透腹膜脏层或直接侵犯或粘连于其他器官或结构，并且存在区域淋巴结转移的结肠癌。

本发明中，术语“预后”具有本领域技术人员知悉的含义。在本发明的一个实施方案中，预后是指无病生存时间和/或无复发转移时间。其中，如果对象是一个群体(2个或2个以上患者)，预后是指中位无病生存时间和/或中位无复发转移时间，例如：小于30个月、30－60个月、30－44个月、30－57个月、44－57个月、57－60个月、大于60个月、30、44、57或60个月。

如本文中所使用的，术语“抗体”是指，是指通常由两对多肽链(每对具有一条“轻”(L)链和一条“重”(H)链)组成的免疫球蛋白分子。从一般意义上，重链可以理解为抗体中分子量较大的多肽链，轻链是指抗体中分子量较小的多肽链。轻链可分类为κ和λ轻链。重链通常可分类为μ、δ、γ、α或ε，并且分别将抗体的同种型定义为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。在轻链和重链内，可变区和恒定区通过大约12或更多个氨基酸的“J”区连接，重链还包含大约3个或更多个氨基酸的“D”区。各重链由重链可变区(V_H)和重链恒定区(C_H)组成。重链恒定区由3个结构域(C_H1、C_H2和C_H3)组成。各轻链由轻链可变区(V_L)和轻链恒定区(C_L)组成。轻链恒定区由一个结构域C_L组成。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。V_H和V_L区还可被细分为具有高变性的区域(称为互补决定区(CDR))，其间散布有较保守的称为构架区(FR)的区域。各V_H和V_L由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。各重链/轻链对的可变区(V_H和V_L)分别形成抗体结合部位。氨基酸至各区域或结构域的分配遵循Kabat Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest(National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1987and 1991))，或Chothia&Lesk(1987)J.Mol.Biol.196:901-917；Chothia等人(1989)Nature 342:878-883的定义。术语“抗体”不受任何特定的产生抗体的方法限制。例如，其包括，特别地，重组抗体、单克隆抗体和多克隆抗体。抗体可以是不同同种型的抗体，例如，IgG(例如，IgG1，IgG2，IgG3或IgG4亚型)，IgA1，IgA2，IgD，IgE或IgM抗体。

如本文中所使用的，术语“单抗”和“单克隆抗体”是指，来自一群高度同源的抗体分子中的一个抗体或抗体的一个片断，也即除可能自发出现的自然突变外，一群完全相同的抗体分子。单抗对抗原上的单一表位具有高特异性。多克隆抗体是相对于单克隆抗体而言的，其通常包含至少2种或更多种的不同抗体，这些不同的抗体通常识别抗原上的不同表位。单克隆抗体通常可采用Kohler等首次报道的杂交瘤技术获得(Nature,256:495,1975)，但也可采用重组DNA技术获得(如参见U.S.P4,816,567)。

本发明中，术语“特异性结合”是指，两分子间的非随机的结合反应，如抗体和其所针对的抗原之间的反应。在某些实施方式中，特异性结合某抗原的抗体(或对某抗原具有特异性的抗体)是指，抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^-9M或10^-10M或更小的亲和力(K_D)结合该抗原。

如本文中所使用的，术语“K_D”是指特定抗体-抗原相互作用的解离平衡常数，其用于描述抗体与抗原之间的结合亲和力。平衡解离常数越小，抗体-抗原结合越紧密，抗体与抗原之间的亲和力越高。通常，抗体以小于大约10^-5M，例如小于大约10^-6M、10^-7M、10^-8M、10^{- 9}M或10^-10M或更小的解离平衡常数(K_D)结合抗原，例如，如使用表面等离子体共振术(SPR)在BIACORE仪中测定的。

本发明中，术语“核酸“包括DNA、相应的cDNA或RNA；所述RNA优选为mRNA。当编码的蛋白为两个或3个时，可以通过一条核酸分子编码，也可以通过2条或者3条核酸分子编码。当通过2条或者3条核酸分子编码时，此时的核酸实际上是核酸组合，即核酸分子的组合。

如本文中所使用的，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、30、35、40、45、50个或者更多个碱基的多核苷酸片段。

本领域技术人员公知，引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，术语“特异性引物或探针”是指引物或探针能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。此类引物或探针的设计是本领域技术人员公知的，参见例如，Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)；和Ausubel等人,Current Protocols in Molecular Biology,Greene PublishingAssociates(1992)。

通常，引物与待扩增的目的基因或其互补链具有大体上的同一性，从而能够特异性扩增目的基因。例如，引物与待扩增的目的基因或其互补链具有至少60％的序列同一性，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性。

如本文中所使用的，术语“同一性”用于指两个多肽之间或两个核酸之间序列的匹配情况。当两个进行比较的序列中的某个位置都被相同的碱基或氨基酸单体亚单元占据时(例如，两个DNA分子的每一个中的某个位置都被腺嘌呤占据，或两个多肽的每一个中的某个位置都被赖氨酸占据)，那么各分子在该位置上是同一的。两个序列之间的“百分数同一性”是由这两个序列共有的匹配位置数目除以进行比较的位置数目×100的函数。例如，如果两个序列的10个位置中有6个匹配，那么这两个序列具有60％的同一性。例如，DNA序列CTGACT和CAGGTT共有50％的同一性(总共6个位置中有3个位置匹配)。通常，在将两个序列比对以产生最大同一性时进行比较。这样的比对可通过使用，例如，可通过计算机程序例如Align程序(DNAstar,Inc.)方便地进行的Needleman等人(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的方法来实现。

发明的有益效果

本发明能够针对结直肠癌患者(个人或者群体)进行较为准确的预后判断。另外，本发明检测结果有助于临床医生为结直肠癌患者(特别是II期结直肠癌患者或III期结直肠癌患者)制定更为合理的治疗方案，包括确定随诊的频率，选择合适的治疗方式及治疗药物，因而在改善患者的治疗效果及提高患者的生存时间方面有较高的应用价值。

附图说明

图1：p-mTOR、MAP4和DNAJB6蛋白在结直肠癌及癌旁正常组织中的表达情况(部分组织样品的示例)。

图2A：p-mTOR表达与结肠癌患者术后总生存时间的关系。针对的是结直肠癌蜡块组织样本，纵坐标为结直肠癌患者存活率。

图2B：MAP4表达与结直肠癌患者术后总生存时间的关系。针对的是结直肠癌蜡块组织样本，纵坐标为结直肠癌患者存活率。

图2C：DNAJB6表达与结直肠癌患者术后总生存时间的关系。针对的是结直肠癌蜡块组织样本，纵坐标为结直肠癌患者存活率。

图2D：标志物组合表达与结直肠癌患者术后总生存时间的关系。针对的是结直肠癌蜡块组织样本，纵坐标为结直肠癌患者存活率。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

在本发明中，检测DNAJB6的抗体购自Proteintech公司(美国)，货号为66587-1-Ig；检测MAP4的抗体购自Proteintech公司(美国)，货号为11229-1-AP；p-mTOR(Ser2448)的抗体购自CST公司(美国)，货号为2976。免疫组化检测系统试剂盒购自北京中衫金桥生物技术有限公司，货号为PV-8000。

在本发明中，IHC方法和表达的高中低判断标准如下：

(1)IHC：各蛋白的具体检测方法如下：

将组织芯片正面迎风置于65℃烘烤箱中烘烤40min，使标本贴附得更好；依次浸入室温的二甲苯洗缸I、II、III中，每次10min；转入100％、85％、75％乙醇中各3min进行梯度水化，然后转入0.01M pH7.2-7.4的PBS缓冲液I、II、III中，每次5min；置于3％过氧化氢洗缸中15min，封闭内源性过氧化酶。提前将约180mL枸橼酸钠缓冲液(0.01M pH6.0)倒入抗原修复盒中微波炉高火加热3分钟；将组织芯片浸入加热后的枸橼酸钠缓冲液中，微波炉中低火20分钟。将加热后的浸于枸橼酸钠的组织芯片置于通风处自然冷却至室温。将芯片依次转入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。吸干PBS，用PAP Pen免疫组化石蜡笔沿组织芯片边缘画出其范围，将稀释后的一抗溶液或抗体工作液用200μL微量加样器铺满所画范围内的组织阵列表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育2h或4℃冰箱中过夜。在纸巾上去除多余一抗，将组织芯片依次浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min。加PV8000kit中的二抗，确保铺满所画范围内的组织阵列表面并置于湿盒之中，37℃恒温培养箱中孵育30min。去除多余试剂，将组织芯片依次浸入PBS缓冲液I、II、III中，每次3min；将DAB试剂盒中的试剂，按1mL DAB稀释液加50μL DAB浓缩液的比例混匀；用200μL微量加样器将稀释后的DAB溶液铺满所画范围内的组织阵列表面进行显色，同一芯片各点之间保持显色时间一致；在镜下观察显色效果直至同一芯片内部及不同芯片之间形成较显著的对比后，在纸巾上去除多余DAB溶液并置于蒸馏水中终止显色反应(显色时间一般为30s－60s，不同抗体间显色时间有所差异)；将苏木素染液用1mL微量加样迅速铺满所画范围内的组织阵列表面，约10s后用缓慢的流水冲去染液；将染色后的芯片置于1％氨水中以充分返蓝。将组织芯片依次浸入75％、85％、100％乙醇中各3min进行脱水。浸入二甲苯洗缸中，10min，脱去PAP Pen免疫组化石蜡笔画出的笔迹，将组织芯片置于通风处晾干，用快干封片剂封片。在显微镜下按评分标准对每个组织芯片的染色程度进行评分，并对较典型的染色部分进行拍照。

(2)IHC结果评价标准：

p-mTOR蛋白主要定位于细胞浆，部分位于细胞膜。在显微镜下观察免疫组化反应着色的肿瘤细胞，完全无显色或者<10％的肿瘤细胞出现胞浆或膜显色评为0分，＞10％的肿瘤细胞出现很弱的胞浆或膜显色评为1分，＞10％的肿瘤细胞出现很弱至中等强度的胞浆或膜显色评为2分，＞10％的肿瘤细胞出现较强的胞浆或膜显色评为3分。其中，＜2定义为低表达，≥2定义为高表达。

DNAJB6主要定位于胞浆和胞核，在显微镜下观察免疫组化反应着色的肿瘤细胞，完全无显色或者<10％的肿瘤细胞出现胞浆或胞核显色为0分，＞10％的肿瘤细胞出现很弱的胞浆或胞核显色评为1分，＞10％且＜50％的肿瘤细胞出现较弱至中等强度的胞浆或胞核显色评为2分，＞10％的肿瘤细胞出现较强的胞浆或胞核显色评为3分。其中，＜2定义为低表达，≥2定义为高表达。

MAP4定位于胞浆，在显微镜下观察免疫组化反应着色的肿瘤细胞，完全无显色或者<10％的肿瘤细胞出现胞浆显色评为0分，＞10％的肿瘤细胞出现很弱的胞浆显色评为1分，＞10％的肿瘤细胞出现很弱至中等强度的胞浆显色评为2分，＞10％的肿瘤细胞出现较强的胞浆显色评为3分。其中，＜2定义为低表达，≥2定义为高表达。

实施例1：p-mTOR、MAP4和DNAJB6表达水平与结直肠癌临床病理参数的相关性研究

(1)针对73例经病理学检测确诊的结直肠癌组织样本(多数病例只有结肠癌或直肠癌，但部分患者同时存在结肠癌和直肠癌)，使用上述的IHC方法检测p-mTOR、MAP4和DNAJB6三个蛋白的表达水平，并判断其表达水平是高表达还是低表达。检测结果以及患者的临床病理参数如下面的表1所示。

表1：p-mTOR、MAP4和DNAJB6表达水平与结直肠癌临床病理参数的相关性

表1中：

*表示Fisher精确检验，

P值用斜体标出；

根据结直肠肿瘤细胞分化程度可对肿瘤进行病理分级：高分化(G1)：>95％腺管形成，恶性程度低；中分化(G2)，50％-95％腺管形成，恶性程度中等；低分化(G3)：<50％腺管形成，恶性程度高。

病理TNM分期(pTNM)：pT：Tumor，反映原发肿瘤的浸润深度。随着肿瘤浸润深度的增加，依次用T1～T4来表示。T1:肿瘤侵犯粘膜下层；T2:肿瘤侵犯固有肌层；T3:肿瘤侵犯浆膜下或侵犯无腹膜被覆的结肠或直肠周组织；T4:肿瘤直接侵犯其他器官、结构和(或)穿透脏层腹膜。pN：Lymph Node，代表区域淋巴结受累情况。淋巴结未受累时，用N0表示；随着淋巴结受累程度和范围的增加，依次用N1-N2表示；pM：Metastasis，反映肿瘤的远处转移情况。没有远处转移者用M0表示，有远处转移者用M1表示。根据AJCC分期第七版进行分期。

从表1可以看出，在结直肠癌中，MAP4的高表达表达与病理分级呈正相关(P＝0.005)，而与其它临床病理参数无相关性；而DNAJB6和p-mTOR的表达水平与临床病理参数无关。

部分结直肠癌病例的IHC检测结果如图1所示。

图1显示，p-mTOR、MAP4和DNAJB6三个蛋白在部分结直肠癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常组织。

实施例2：p-mTOR、MAP4和DNAJB6表达水平与患者术后总生存期的相关性研究

结直肠癌蛋白表达情况及患者术后总生存时间如下面的表2以及附图2A－2D所示。

表2：结直肠癌蛋白表达情况及患者术后总生存时间数据

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结合表1中的数据以及患者的总生存时间数据(表2)，进行多因素Cox回归分析。

Kaplan-Meier法单因素生存分析的具体方法：首先计算出存活时间超过一定时期(1个月)的病人再活过下一时期(1个月)的概率(即生存概率)，然后将逐个生存概率相乘，即为相应时段的生存率。

多因素Cox回归分析的目的是处理多因素生存分析数据，寻找影响生存状况的危险因素。建议纳入Cox回归模型的变量有：1)单因素分析差异有统计学意义的变量(即前面Kaplan-Meier法单因素分析结果中差异有统计学意义的变量)；2)单因素分析时，没有发现差异有统计学意义，但是临床上认为与因变量关系密切的自变量。

以上统计分析使用SPSS 22.0软件(SPSS Inc.Chicago,IL,USA)，详细使用方法参见SPSS常用统计分析教程(李志辉、罗平主编，SPSS 22.0中英文版，电子工业出版社出版，2015年8月，第4版)。

结直肠癌患者根治术后总生存期的Cox回归分析结果见下面的表3，其中术后总生存期是指从根治术后开始至因该肿瘤引起死亡的时间。

表3：结直肠癌患者术后总生存期的多因素Cox回归分析

表3显示了p-mTOR、MAP4和DNAJB6蛋白表达水平与结直肠癌患者术后总生存期之间的关系。

表3的结果显示，作为单个蛋白标志物(模型A-C)，只有p-mTOR是独立的预后因子(P＝0.009)。3个蛋白组合作为标志物(模型D)也是结直肠癌患者的独立预后因子(P＝0.002)，其P值低于单个标志物，以及临床上常用的病理分期、病理分级及淋巴结转移、远处转移等与患者预后相关的临床病理参数。

实施例3：p-mTOR、MAP4和DNAJB6表达水平与CRC患者中位生存时间的相关性研究

根据IHC方法检测获得的p-mTOR、MAP4和DNAJB6三个蛋白的表达水平，结合患者术后生存时间，用寿命表法和加权回归法分别分析单个标志物及标志物组合表达水平与CRC患者中位生存时间的关系。

中位生存时间，又称半数生存期，表示恰好有50％的个体尚未存活的时间。中位生存时间越长，表示疾病的预后越好；中位生存时间越短，表示预后越差。

寿命表(Life Table)法分析中位生存时间的具体方法：将生存时间分成许多小的时间段，计算该段内生存率的变化情况，分析的重点是研究总体的生存规律。

用寿命表法计算出的单个蛋白标志物表达水平与结直肠癌患者中位生存时间的相关性见表4。

表4：单个蛋白标志物表达水平与结直肠癌患者中位生存时间的相关性

表4显示了p-mTOR、MAP4和DNAJB6标志物组合中单个蛋白表达水平与结直肠癌患者术后中位生存期之间的关系。单个蛋白标志物低表达的患者中位生存时间均为60个月，单个蛋白标志物高表达的患者中位生存时间为38－45个月。其中，p-mTOR，MAP4的表达水平与结直肠癌患者中位生存时间有显著相关性，P值均小于0.05，具有统计学意义。

因为单个蛋白标志物对患者的预后生存影响不等，故使用加权回归法分析蛋白标志物组合与结直肠癌患者术后中位生存期之间的关系。

加权回归法分析中位生存时间的具体方法：首先用Kaplan-Meier法单因素生存分析计算单个蛋白表达水平与患者生存时间的相关性(表5)，对单个分子的权重进行归一化处理，计算出标志物组合表达情况的最终评分，根据X-title软件提供的算法计算出最优划分阈值，对标志物组合进行分组，最后用寿命表(Life Table)法计算标志物组合的表达情况与中位生存时间的关系。

表5：单个蛋白标志物表达水平与结直肠癌患者生存时间的相关性

变量	风险系数	95％置信区间	P值
				DNAJB6	0.669	0.885-4.189	0.098
MAP4	0.655	0.748-4.531	0.184
				p-mTOR	0.785	1.089-4.351	0.028

表5显示了单个蛋白标志物表达水平与结直肠癌患者生存时间之间的相关性。风险系数为正，说明与预后成正相关，风险系数为负，说明与预后成负相关。其绝对值越大，表明分子对预后的影响越大。分析结果显示，p-mTOR、MAP4和DNAJB6三个主因子的权重分别为0.785、0.655和0.669。与多因素Cox回归分析结果相一致，p-mTOR所占权重最大(HR＝0.785)，与预后相关性最强(P＝0.028)。

故用如下公式计算标志物组合的表达水平：0.669×DNAJB6原始评分+0.655×MAP4原始评分+0.785×p-mTOR原始评分。根据X-title软件提供的算法计算出最优划分区，并根据最终评分将CRC患者的预后分为低危(评分为0.00-0.67)、中危(评分为0.79-1.45)和高危(评分为1.45-2.11)三组。

用寿命表法计算标志物组合的表达情况与中位生存时间的相关性，结果如表6所示。

表6：3种标志物的组合表达水平与结直肠癌患者中位生存时间的相关性

标志物组合中蛋白表达情况	中位生存时间(月)	P值
			表达水平高	60	0.004
表达水平中等	44	0.004
			表达水平低	30	0.004

表6显示了标志物组合表达水平与结直肠癌患者术后中位生存时间的相关性。标志物组合的蛋白表达水平与结直肠癌患者中位生存时间有显著相关性，P＝0.004，具有统计学意义。所述CRC患者整体的中位生存时间为57个月。

如表6，当p-mTOR、MAP4和DNAJB6标志物组合蛋白表达水平低时患者的中位生存时间为60个月，表达水平中等时患者的中位生存时间为44个月，表达水平高时患者的中位生存时间为30个月，差异具有统计学意义(P＝0.004)，其P值小于任何单一标志物(表4)。

尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，本领域技术人员将会理解。根据已经公开的所有教导，可以对那些细节进行各种修改和替换，这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。

Claims (15)

1.选自如下的(1)－(4)项中的任意一项在制备用于结直肠癌复发风险评估或预后判断的药物中的用途：

(1)p-mTOR，

(2)p-mTOR、MAP4，

(3)p-mTOR、DNAJB6，和

(4)试剂，其能够检测上述(1)－(3)项中的任意一项。

2.根据权利要求1所述的用途，其中，所述结直肠癌为II期或III期结直肠癌。

3.根据权利要求1所述的用途，其中，所述检测为定量检测或定性检测。

4.根据权利要求1所述的用途，其中，所述试剂为一种或多种抗体，或者为包含所述抗体的药物组合物。

5.根据权利要求4所述的用途，其中，所述抗体为单克隆抗体。

6.根据权利要求4至5中任一权利要求所述的用途，其中，所述抗体还连接有可检测的标记物。

7.根据权利要求6所述的用途，其中，所述可检测的标记物为放射性同位素、荧光物质、有色物质或酶。

8.根据权利要求6所述的用途，其中，所述可检测的标记物为发光物质。

9.核酸在制备用于结直肠癌复发风险评估或预后判断的药物中的用途，所述核酸编码选自如下的(1)－(4)项中的任意一项：

(1)p-mTOR，

(2)p-mTOR、MAP4，

(3)p-mTOR、DNAJB6，和

(4)试剂，其能够检测上述(1)－(3)项中的任意一项。

10.根据权利要求9所述的用途，其中，所述结直肠癌为II期或III期结直肠癌。

11.根据权利要求9所述的用途，其中，所述检测为定量检测或定性检测。

12.根据权利要求9所述的用途，其中，所述试剂为特异性的引物或者探针，或者为包含所述引物或者探针的药物组合物。

13.根据权利要求12所述的用途，其中，所述探针还连接有可检测的标记物。

14.根据权利要求13所述的用途，其中，所述可检测的标记物为荧光基团。

15.根据权利要求14所述的用途，其中，所述荧光基团为选自cy3、cy5、Texas Red、6-FAMTM、AF532、AF647和AF688中的至少一种。

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