CN110872625A - 一种结直肠癌标志物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种结直肠癌标志物及其应用，具体涉及一种结直肠癌标志物GTF2H5基因的异常表达及其检测方法和应用，所述结直肠癌标志物包括GTF2H5基因异常表达的核酸或/和蛋白质，并通过运用基因测序技术、芯片半定量检测技术、qPCR定量检测技术、蛋白印迹半定量检测技术、免疫组织化学染色技术、原位杂交技术和液体活检技术能够实现GTF2H5基因异常、核酸或/和蛋白质表达的检测，此检测的准确性较好、特异性较强、敏感性较高。

Description

一种结直肠癌标志物及其应用
技术领域
本发明属于癌症领域，特别是结直肠癌，本发明涉及一种结直肠癌标志物及其应用，具体涉及一种结直肠癌标志物GTF2H5蛋白及其检测方法和应用。
背景技术
结直肠癌(colorectal cancer,CRC)是一种人类最常见的恶性肿瘤之一，一种常见的消化系统恶性肿瘤，发病率逐年增高，居恶性肿瘤的第3位，起病隐匿，预后较差。结直肠癌的发生发展，可分为异常增生、原位肿瘤、恶性侵润、远端转移等数个病程阶段。由于其病因及发病机制并未阐明，尚无特效药物和特异性检测标志物。但是，早期发现、早期干预可明显改善和预后。目前，国内外对结直肠癌的诊治手段主要是通过对已确诊患者的手术切除、放疗、化疗和其他综合治疗，但由于此时癌症病灶被发现多已处于中晚期，癌细胞极易发生近处淋巴结转移和远端器官转移(如：肝脏或肺部等)，以致误诊率高，患者5年生存率低。
近年来，大肠癌早期检测依赖于高科技的分子诊断技术，已有了突飞猛进的发展，包括对患者血液和粪便进行无创或微创的微量检测及动态实时监控。例如，多种基因的表达或变异被发现与大肠癌发病相关，包括p53基因突变和p53蛋白质过度表达、K-ras基因突变、细胞色素D1表达、BCL-2基因重排、端粒酶家族基因hTERT过度表达有关；此外，APC和MCC基因突变、C-myc基因的过度表达、p16基因突变、CD44基因的异常表达等都与大肠癌有关。继基因表达和变异之后，多种蛋白质肿瘤标志物也被发现与大肠癌发病相关。但是，特异性的新分子标志物和早期检测技术成熟亟待于进一步的研发。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的是提供一种结直肠癌标志物及其应用，所述结直肠癌标志物为GTF2H5基因表达的核酸与蛋白质，通过检测GTF2H5基因的核酸与蛋白质表达水平能够对结直肠癌进行判断，准确性较高、特异性较强、敏感性较高。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了用于结直肠癌的标志物，包括GTF2H5基因。
本发明中，结直肠癌属于多因素相关疾病，需要通过多个基因变异或与其表达关联的核酸和蛋白质的共同检测才能实现结直肠癌的精准检测。在经过多层次多角度的实验后，发明人发现，通过检测GTF2H5基因表达，其在病灶组织中mRNA和蛋白质的表达水平与癌旁组织比对，呈现显著性增高的差异表达，能够清楚地指示结直肠的癌变组织。
不仅如此，发明人还发现，随着结直肠癌恶性程度的增加，GTF2H5基因的核酸或/蛋白质的表达水平也会发生改变，因此，通过检测GTF2H5蛋白的表达水平能够推测结直肠癌的恶性程度。
根据本发明，所述标志物还包括GTF2H5表达的核酸和/或蛋白，所述GTF2H5基因作为标志物，其表达异常时，其表达的核酸和/或蛋白也会异常表达，通过检测GTF2H5本身或是其表达的核酸或蛋白都能够实现结直肠癌的检测。
根据本发明，所述标志物在结直肠癌原位癌细胞、结直肠癌转移癌细胞或外周血浆中的任意一种或至少两种中高表达。
根据本发明，所述标志物用作结直肠癌早期检测装置、药物检测有效性判断标志物或患者预后标志物中的任意一种或至少两种的组合。
本发明中，所述药物检测有效性选自但不限于所述的药物，还可以包括检测方法、检测试剂、试剂盒或检测仪器。
根据本发明，所述标志物还包括其他用于检测结直肠癌的基因变异的核酸和/或蛋白。
第二方面，本发明提供如第一方面所述的标志物在作为检测结直肠癌的试剂、检测结直肠癌的试剂盒或检测结直肠癌的药物的靶点中的用途。
根据本发明，所述标志物用作结直肠癌的早期检测装置、药物检测有效性判断标志物或患者预后标志物中的任意一种或至少两种的组合的用途。
第三方面，本发明提供一种检测结直肠癌的装置，包括：检测GTF2H5基因表达的单元，所述单元还可以是检测GTF2H5表达核酸和/或蛋白的单元。
根据本发明，所述单元为基因测序技术单元、芯片半定量检测技术单元、qPCR定量检测单元、蛋白印迹半定量检测技术单元、免疫组织化学染色技术单元、原位杂交技术单元或液体活检技术单元中的任意一种或至少两种的组合。
在一些具体的实施例中，采用基因测序技术对不同程度病变样本进行标志物的SNP检测，确定其变异位点与癌变的关系。
在一些具体的实施例中，采用qPCR定量检测技术对不同程度病变样本进行标志物的mRNA定量检测，确定其表达水平与癌变的关系。
在一些具体的实施例中，采用芯片半定量检测技术对不同程度病变样本进行标志物的mRNA半定量检测，确定其表达水平与癌变的关系。
在一些具体的实施例中，采用原位杂交检测技术(ISH技术)对不同程度病变样本进行标志物的原位mRNA检测，确定其表达水平与癌变的关系。
在一些具体的实施例中，采用蛋白印迹半定量检测技术(Western blot)对不同程度病变样本进行标志物的蛋白质半定量检测，确定其表达水平与癌变的关系。
在一些具体的实施例中，采用免疫组织化学染色技术(IHC技术)对不同程度病变样本进行标志物的原位蛋白质半定量检测，确定其表达水平与癌变的关系。
在一些具体的实施例中，采用液体活检技术对患者外周血样本中这一分子标志物进行无创、动态的半定量检测，确定其表达水平与结直肠癌的手术切除术、放疗、化疗、或其他干预疗效评估及疗程监控有效性的关系。
与现有技术相比，本发明具有的有益效果：
(1)本发明提供了以GTF2H5基因变异、核酸与蛋白质表达差异作为结直肠癌的检测装置，通过检测GTF2H5基因变异、核酸与蛋白质表达差异，并通过与其他检测手段配合，辅助早期筛查，以及提高结直肠癌的精准检测；
(2)本发明结直肠癌的检测装置，结合于其他检测方法，能够对不同恶性程度的结直肠癌进行区分，能够提高结直肠癌的疗效评估与预后判定，具有特异性较高、灵敏度较好和准确性较好的检测优势。
附图说明
图1(a)为本发明GTF2H5蛋白质在结直肠癌组织和癌旁对照组织中的表达情况，图1(b)为本发明GTF2H5蛋白质在结直肠癌组织和癌旁对照组织中的表达统计。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
材料
结直肠癌组织样本来自结直肠癌微阵列组织芯片(CO803a，US Biomax)，选购于西安艾丽娜生物科技有限公司，共有结直肠组织80例，其中含腺癌39例，印戒细胞癌1例和40例相匹配的癌旁结肠组织。
检测方法
将取得的结直肠癌组织样本和结直肠癌癌旁组织采用qPCR、Western blot、IHC其中一种或几种组合方式进行检测(具体方法如下)并分析比较，结果如图1所示。
方法一：实时荧光定量PCR(qPCR)
每份组织进行液氮研磨后，加1mL Trizol试剂，室温放置5分钟后，将混合液转移至RNase Free的1.5mL离心管中。随后加入200μL的三氯甲烷，充分混匀后室温静置2分钟，4℃离心12000rpm,15分钟。小心吸取出上清液放置到新的RNase Free 1.5mL离心管，加入等体积异丙醇，-20℃沉淀30分钟，12000rpm离心10分钟。75％乙醇洗涤两次。操作台风干后加入30μL DEPC水溶解。Nanodrop 2000测量RNA浓度。1μg总RNA为模板，反转录cDNA。根据说明书操作规范进行qPCR检测。
方法二：蛋白质免疫印迹(Western blot)
4℃预冷的PBS洗涤组织三次，加入适量RIPA裂解液，4℃静置约30分钟。充分裂解后移入离心管中。4℃旋转摇床孵育30分钟。4℃离心12000rpm，20分钟。BCA法测蛋白浓度并蛋白变性。蛋白质样品上样后程序为80V 30分钟，120V 60分钟。转膜后添加特异性一抗，4℃摇床孵育过夜。添加二抗后室温孵育1小时。ELC化学曝光并拍照。
方法三：免疫组化(IHC)
石蜡包埋的组织芯片置于60℃烘箱2小时，TO透明剂脱蜡10分钟，梯度酒精依次浸泡各5分钟，PBS缓冲液清洗3遍，每次5分钟。然后将芯片置于抗原修复蒸锅加热30分钟，自然冷却至室温。PBS清洗3遍，每次5分钟后特异性一抗孵育过夜。PBS清洗3遍，每次5分钟。滴加PV9000反应增强液，室温孵育20分钟。PBS清洗3遍，每次5分钟。滴加PV9000增强酶标抗兔IgG聚合物，室温孵育20分钟，PBS清洗3遍，每次5分钟。AEC检测试剂盒显色。将组织芯片置于苏木素染液中染色，再自来水流缓冲10分钟，甘油明胶封片。蔡司显微镜进行扫描拍照，ZEN数据收集成像软件观测阳性信号。
从图1(a)-图1(b)可以看出，与癌旁组织相比，在结直肠癌患者病变组织中获得了GTF2H5基因显著性的差异表达，其中GTF2H5在结直肠癌组织中高表达，在癌旁组织中基本无表达或表达量很低。
综上所述，本发明提供了以GTF2H5基因变异、核酸与蛋白质表达差异作为结直肠癌的检测装置，通过检测GTF2H5基因变异、核酸与蛋白质表达差异，并通过与其他检测手段配合，辅助早期筛查，以及提高结直肠癌的精准检测，能够对不同恶性程度的结直肠癌进行区分，能够提高结直肠癌的疗效评估与预后判定，具有特异性较高、灵敏度较好和准确性较好的检测优势。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (9)

1.用于结直肠癌的标志物，其特征在于，包括GTF2H5基因。
2.根据权利要求1所述的标志物，其特征在于，所述标志物还包括GTF2H5表达的核酸和/或蛋白质。
3.根据权利要求1或2所述的标志物，其特征在于，所述标志物在结直肠原位癌细胞、结直肠癌转移癌细胞或外周血浆中的任意一种或至少两种中。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的标志物，其特征在于，所述标志物用作结直肠癌早期检测装置、药物有效性判断标志物或患者预后标志物中的任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的标志物，其特征在于，所述标志物还包括用于检测结直肠癌基因异常表达的核酸和/或蛋白。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的标志物在作为检测结直肠癌的试剂、检测结直肠癌的试剂盒或检测结直肠癌的药物的靶点中的用途。
7.根据权利要求6所述的用途，其特征在于，所述标志物用作结直肠癌的早期检测装置、药物有效性判断标志物或患者预后标志物中的任意一种或至少两种的组合的用途。
8.一种检测结直肠癌的装置，其特征在于，包括：检测GTF2H5基因表达的单元。
9.根据权利要求8所述的装置，其特征在于，所述单元为基因测序技术单元、芯片半定量检测技术单元、qPCR定量检测技术单元、蛋白印迹半定量检测技术单元、免疫组织化学染色技术单元、原位杂交技术单元或液体活检技术单元中的任意一种或至少两种的组合。
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