CN103667516A - 早期结直肠腺癌miRNAs特异表达谱及诊断模型 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种早期结直肠腺癌血清miRNAs特异表达谱，由上调表达的miR-19a-3p，miR-92a-3p，miR-223-3p，以及下调表达的miR-422a构成。所述早期结直肠腺癌血清miRNAs特异表达谱中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，如SEQ ID NO：1～9所示。本发明还提供了一种早期结直肠腺癌血清miRNAs诊断模型，利用以下公式：logit(P=CAC)=0.4424-0.0092*（miR-19a-3p）-0.0368*（miR-92a-3p）-0.0517*（miR-223-3p）+0.2439*（miR-422a）计算，用于早期结直肠腺癌的诊断，经ROC曲线分析，此血清miRNAs模型对结直肠腺癌具有较高的诊断效率，高于传统的肿瘤标志物CEA，此模型能够诊断结直肠腺癌早期患者（TNM Ⅰ/Ⅱ期）。
Description
技术领域
本发明涉及早期结直肠腺癌miRNAs特异表达谱，以及其逆转录引物和检测引物，以及诊断模型，属于医学诊断技术领域。
背景技术
结直肠腺癌是消化系统最常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率呈逐年上升的趋势。结直肠腺癌患者的预后取决于其诊断时所处的疾病阶段，据统计，无侵袭转移的结直肠腺患者的5年生存率可高达90%，有局部转移者的5年生存率约68%，而远处转移者的5年生存率则仅约11%。因此早期发现结直肠腺癌是改善患者预后、降低死亡率的关键。
目前用于结直肠腺癌的诊断方法主要包括：CT和MRI、电子肠镜和血清CEA。CT和MRI等对于小于1cm的病灶无法早期诊断，不能用于结直肠腺癌的早期诊断；电子肠镜检查虽被推荐为诊断结直肠腺癌最可靠的方法，但却是有创检查，一定程度上增加了病人的痛苦，且价格昂贵，限制了其在大规模筛查中的应用；肿瘤标志物以其简便、经济、非侵入性等特点日益受到关注。但是，目前临床上推荐用于结直肠腺癌诊断和预后判断的肿瘤标志物只有CEA，而CEA作为肿瘤标志物其敏感性和特异性在结直肠腺癌诊断中的应用也备受质疑。目前的结直肠腺癌肿瘤标志物远远不能满足临床需求，因此，寻找敏感性特异性更高的用于早期诊断结直肠腺癌的肿瘤标志物是临床亟待解决的难题。
MicroRNA(miRNAs)是一类分布广泛的非编码蛋白质的单链小分子RNAs，其通过对mRNA降解或抑制其翻译，在转录后对靶基因的表达水平进行调节，从而参与细胞分化、生长、凋亡、代谢等功能。研究表明，机体内组织、器官的代谢异常或器质性病变可能导致特定疾病状态下某些循环miRNAs表达水平的升高或降低。近年来发现血清中存在大量丰富且稳定的miRNAs，通过对肿瘤患者血清中miRNAs表达谱与对照组进行对比分析，发现不同肿瘤中具有特定的表达谱，为肿瘤的无创性早期诊断提供了一条新的途径。因此，确定结直肠腺癌miRNAs表达谱，筛选差异表达的miRNAs，建立血清miRNAs诊断模型，有助于实现对结直肠腺癌的早期诊断。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了早期结直肠腺癌的miRNAs特异表达谱，以及其逆转录引物和检测引物、检测试剂盒，以及诊断模型。
本发明是通过以下技术方案实现的：
一种早期结直肠腺癌miRNAs特异表达谱，由上调表达的miR-19a-3p，miR-92a-3p，miR-223-3p，以及下调表达的miR-422a构成。
所述miRNAs来自外周静脉血的血清。
所述早期结直肠腺癌miRNAs特异表达谱中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，如下：
（1）miR-19a-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：1所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：2所示：
SEQ ID NO：1：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAGTTTT-3’；
SEQ ID NO：2：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTGCAAATCTATGCAA-3’；
（2）miR-92a-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：3所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：4所示：
SEQ ID NO：3：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAGGCCG-3’；
SEQ ID NO：4：5’-ACACTCCAGCTGGGTATTGCACTTGTCCCG-3’；
（3）miR-223-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：5所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：6所示：
SEQ ID NO：5：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGGGGTAT-3’；
SEQ ID NO：6：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAAT-3’；
（4）miR-422a的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：7所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：8所示：
SEQ ID NO：7：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCCTTCTG-3’；
SEQ ID NO：8：5’-ACACTCCAGCTGGGACTGGACTTAGGGTCA-3’；
（5）四种miRNAs的通用反向检测引物如SEQ ID NO：9所示：
SEQ ID NO：9：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。
一种用于早期结直肠腺癌诊断用试剂盒或生物芯片，包括上述特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物。
一种早期结直肠腺癌血清miRNAs诊断模型，该诊断模型可同时对结直肠腺癌和结直肠腺瘤进行鉴别诊断，具体如下：运用以下公式计算：
logit(P=CAC)=0.4424-0.0092*（miR-19a-3p）-0.0368*（miR-92a-3p）-0.0517*（miR-223-3p）+0.2439*（miR-422a）
公式中的“（miR-19a-3p）”、“（miR-92a-3p）”、“（miR-223-3p）”、“（miR-422a）”分别表示相对应的miRNAs的表达量。
一种利用上述诊断模型诊断的方法，如下：首先，利用上述特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物检测待诊断患者的血清中四种miRNAs的表达量，包括miR-19a-3p，miR-92a-3p，miR-223-3p和miR-422a，然后，运用以下公式进行计算：
logit(P=CAC)=0.4424-0.0092*（miR-19a-3p）-0.0368*（miR-92a-3p）-0.0517*（miR-223-3p）+0.2439*（miR-422a）
将四种miRNAs的表达量分别代入上述公式，输入Matlab软件（该软件为所属领域的常规软件，为现有技术中已有的软件），计算logit(P=CAC)，当logit(P=CAC)为1时，可以判断为结直肠腺癌；logit(P=CAC)为0时，则判断为非结直肠腺癌。
本发明采用“miRNAs cDNA文库+文库预扩增+Miseq深度测序”的研究策略，首先建立了基于临床常规收集的血清样本筛查差异表达miRNAs的技术路径，对结直肠腺癌、结直肠腺瘤患者及健康对照者血清标本中miRNAs表达谱进行了分析和比对，发现了15个差异表达miRNAs，序列见表1。然后利用SYBR Green的逆转录-实时荧光定量PCR方法，对上述15个差异表达miRNAs在结直肠腺癌、结直肠腺瘤患者及健康对照血清中的表达丰度进行验证，发现了与结直肠腺癌相关的4个miRNAs，包括表达上调的miR-19a-3p，miR-92a-3p，miR-223-3p以及表达下调的miR-422a，进而自主设计了其反转录引物和前向反向检测引物，具体见表2。进而，提供了一种诊断结直肠腺癌的血清microRNA表达模型：利用多元logistic回归方法提供了一种结直肠腺癌的血清microRNA诊断模型的计算公式：
logit(P=CAC)=0.4424-0.0092*miR-19a-3p-0.0368*miR-92a-3p-0.0517*miR-223-3p+0.2439*miR-422a。
经ROC曲线分析，此血清miRNAs模型对结直肠腺癌具有较高的诊断效率，高于传统的肿瘤标志物CEA。更为重要的是，此模型能够诊断结直肠腺癌早期患者（TNM Ⅰ/Ⅱ期）。
附图说明
图1：四种miRNAs在结直肠腺癌组和对照组中的表达，其中，A：miR-19a-3p；B：miR-92a-3p；C：miR-223-3p；D：miR-422a；横坐标的control为对照组，CAC为结直肠腺癌组；纵坐标为表达量。
图2：四种miRNAs对结直肠腺癌的诊断ROC曲线，其中，A：miR-19a-3p；B：miR-92a-3p；C：miR-223-3p；D：miR-422a。
图3：建立的诊断模型(panel)及CEA对结直肠腺癌的诊断ROC曲线。
图4：建立的诊断模型对不同分期结直肠腺癌的诊断ROC曲线，其中，A：miR-19a-3p；B：miR-92a-3p；C：miR-223-3p；D：miR-422a。
图5：建立的诊断模型对结直肠腺癌和结直肠腺瘤的鉴别诊断ROC曲线。
图2、图3、图4、图5的横坐标为特异性，纵坐标为敏感性。
具体实施方式
下面结合实施例和实验对本发明作进一步的说明。
实施例一
1、研究对象
血清标本共包括307例结直肠腺癌患者（CAC）、164例结直肠腺瘤患者和226例健康对照者。所有结直肠腺癌和腺瘤患者均来自山东大学齐鲁医院（以下称本院）普通外科住院患者，均为首次入院接受治疗的患者，入院前未曾接受任何药物或手术治疗，其分期和病理类型均经术后病理检查确认。健康对照血清来自本院健康查体中心的健康体检者，其体检报告均未见明显异常。所有样本均在取得受试者同意的情况下进行。
2、标本采集
采集血清3ml，1600g离心5分钟，进一步16000g离心10分钟，分离上清，保存于-80℃待测。将分离上清液3μl与RNA分离液3μl混合，16000g离心10分钟，分离上清，将上清1:10稀释用于逆转录模板。
4、文库构建和Miseq测序
将冻存样本常温下解冻，按照miRNeasy Mini Kit试剂盒（Qiagen公司）操作说明提取总RNA，RNA浓缩后在T4RNA连接酶的作用下，分别连接3’-linker和5’-linker，再由RT-PCR进行扩增建库。利用KAPA qPCR试剂盒进行文库检测，检测标准为：qPCR浓度大于1nM，无dimer污染。文库检测符合要求后，运用Miseq测序仪进行深度测序分析。将测序后获得的序列与miRNA数据库（miRBase17.0）中人miRNA序列比对，获取三组样本已知miRNA的表达丰度。
5、RT-qPCR
采用Takara公司的One Step
miRNA cDNA Synthesis Kit逆转录试剂盒对上述mRNA进行反转录成cDNA，进一步进行PCR反应，运行与ABI 7500实时荧光定量PCR分析仪（ABI公司）。
PCR反应体系（25μl）：
模板DNA：2ul
SYBR Premix Ex TaqⅡ：12.5μl
DyeⅡ：0.5μl
上游引物（10μM）：1μl
下游引物（10μM）：1μl
无菌水：8μl
反应条件为：95℃30秒→1个循环；（95℃5秒，57℃34秒）→45个循环；添加溶解曲线。
每个标本重复三次，检测结果采用2-△△Ct进行分析。
6、数据处理与统计分析
数据采用SPSS 17.0软件进行统计分析，两组样本miRNAs浓度的差异用Mann-Whitney U非参数检验进行比较，P<0.05被认为具有统计学差异。多元logistic回归分析用于建立miRNAs诊断模型和计算公式，诊断模型的诊断模型采用ROC曲线及曲线下面积AUC进行分析。
7、检测结果
1）经测序分析，结直肠腺癌组与对照组比较共得到15个差异表达的miRNAs（入选标准：在任一组中拷贝数大于50；在结直肠腺癌组与对照组的表达量差异大于10倍），其中上调的包括miR-195-5p，miR-92a-3p，miR-1290，miR-582-5p，miR-223-3p，miR-136-5p，miR-3074-5p，miR-29a-3p，miR-221-3p，miR-148a-3p，miR-19a-3p和miR-17-3p，下调的包括miR-422a，miR-1260a和miR-4502，序列如表1所示（如SEQ ID NO：10～24所示）。
表1 测序筛出的差异miRNAs序列
2）上述15个miRNAs经RT-qPCR验证，共筛选出4个差异miRNAs（入选标准：平均Cq值小于35；检测率大于75%；在结直肠腺癌组和对照组表达差异具有统计学意义，P<0.05），包括miR-19a-3p，miR-92a-3p，miR-223-3p和miR-422a。检测引物为自主设计，其序列及Tm值如表2所示（如SEQ ID NO：1～9所示）。
表2 引物序列
3）如图1所示，miR-19a-3p，miR-92a-3p和miR-223-3p在结直肠腺癌组具有显著高表达，miR-422a低表达。建立上述4个miRNAs各自诊断结直肠腺癌的ROC曲线，如图2所示。
4）将上述4个miRNAs带入多元logistic回归分析，建立联合诊断模型。计算公式为：
logit(P=CAC)=0.4424-0.0092*（miR-19a-3p）-0.0368*（miR-92a-3p）-0.0517*（miR-223-3p）+0.2439*（miR-422a）
经ROC曲线分析，此模型对结直肠腺癌的诊断效能AUC为0.951，敏感性和特异性分别为84.3%和91.6%，高于传统的肿瘤标志物CEA（AUC为0.667，P<0.001），如图3所示。
5）利用该诊断模型对结直肠腺癌分期为TNM Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ期的患者进行分析，其诊断Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ和Ⅳ期患者的AUC分别为0.942，0.935，0.954和0.983，如图4所示。说明该模型能够实现对结直肠腺癌的早期诊断。
6）利用该模型对结直肠腺癌和结直肠腺瘤患者进行鉴别诊断，其诊断效能AUC为0.886（95%CI：0.809-0.940），敏感性和特异性分别为72.5%和87.5%，如图5所示。说明该模型不仅能够结直肠腺癌有较高的诊断效能，对其癌前病变结直肠腺瘤也有一定的鉴别诊断价值。
Claims (6)
1.一种早期结直肠腺癌miRNAs特异表达谱，其特征在于：由上调表达的miR-19a-3p，miR-92a-3p，miR-223-3p，以及下调表达的miR-422a构成。
2.根据权利要求1所述的早期结直肠腺癌miRNAs特异表达谱，其特征在于：所述miRNAs来自外周静脉血的血清。
3.权利要求1所述的早期结直肠腺癌miRNAs特异表达谱中特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，其特征在于：包括以下引物：
（1）miR-19a-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：1所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：2所示：
SEQ ID NO：1：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAGTTTT-3’；
SEQ ID NO：2：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTGCAAATCTATGCAA-3’；
（2）miR-92a-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：3所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：4所示：
SEQ ID NO：3：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAGGCCG-3’；
SEQ ID NO：4：5’-ACACTCCAGCTGGGTATTGCACTTGTCCCG-3’；
（3）miR-223-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：5所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：6所示：
SEQ ID NO：5：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGGGGTAT-3’；
SEQ ID NO：6：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAAT-3’；
（4）miR-422a的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：7所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：8所示：
SEQ ID NO：7：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCCTTCTG-3’；
SEQ ID NO：8：5’-ACACTCCAGCTGGGACTGGACTTAGGGTCA-3’；
（5）四种miRNAs的通用反向检测引物如SEQ ID NO：9所示：
SEQ ID NO：9：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。
4.一种用于早期结直肠腺癌诊断用试剂盒或生物芯片，其特征在于：包括特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物，如下：
（1）miR-19a-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：1所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：2所示：
SEQ ID NO：1：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCAGTTTT-3’；
SEQ ID NO：2：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTGCAAATCTATGCAA-3’；
（2）miR-92a-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：3所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：4所示：
SEQ ID NO：3：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGACAGGCCG-3’；
SEQ ID NO：4：5’-ACACTCCAGCTGGGTATTGCACTTGTCCCG-3’；
（3）miR-223-3p的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：5所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：6所示：
SEQ ID NO：5：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTGGGGTAT-3’；
SEQ ID NO：6：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAAT-3’；
（4）miR-422a的逆转录引物和前向检测引物：逆转录引物的序列如SEQ ID NO：7所示，前向检测引物的序列如SEQ ID NO：8所示：
SEQ ID NO：7：
5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGCCTTCTG-3’；
SEQ ID NO：8：5’-ACACTCCAGCTGGGACTGGACTTAGGGTCA-3’；
（5）四种miRNAs的通用反向检测引物如SEQ ID NO：9所示：
SEQ ID NO：9：5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’。
5.一种早期结直肠腺癌血清miRNAs诊断模型，其特征在于：运用以下公式计算：
logit(P=CAC)=0.4424-0.0092*（miR-19a-3p）-0.0368*（miR-92a-3p）-0.0517*（miR-223-3p）+0.2439*（miR-422a）
公式中的“（miR-19a-3p）”、“（miR-92a-3p）”、“（miR-223-3p）”、“（miR-422a）”分别表示相对应的miRNAs的表达量。
6.一种利用权利要求5所述的早期结直肠腺癌血清miRNAs诊断模型诊断的方法，其特征在于：首先，利用上述特异表达miRNAs的逆转录引物和检测引物检测待诊断患者的血清中四种miRNAs的表达量，包括miR-19a-3p，miR-92a-3p，miR-223-3p和miR-422a，然后，运用以下公式进行计算：
logit(P=CAC)=0.4424-0.0092*(miR-19a-3p)-0.0368*(miR-92a-3p)-0.0517*(miR-223-3p)+0.2439*(miR-422a)
将四种miRNAs的表达量分别代入上述公式，输入Matlab软件，计算logit(P=CAC)，当logit(P=CAC)为1时，可以判断为结直肠腺癌；logit(P=CAC)为0时，则判断为非结直肠腺癌。
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