CN113134010A - 一种靶向雌激素受体α的微小RNA及其抗肿瘤用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种微小RNA在抗肿瘤中的用途。更具体地，本发明涉及微小RNA‑3074‑5p在抗雌激素受体α(ERα)阳性肿瘤中的用途，及其在化疗增敏中的用途。本发明发现的微小RNA‑3074‑5p能够抑制ERα阳性乳腺癌细胞的增殖，以及乳腺癌细胞中ERα和抗凋亡蛋白Bcl‑2的表达水平，诱导ERα阳性乳腺癌细胞凋亡，还能增强化疗药物的抗肿瘤作用，为有效治疗ERα阳性肿瘤提供新的途径和手段。

Description

一种靶向雌激素受体α的微小RNA及其抗肿瘤用途

技术领域

本发明属于医药学领域，更具体地涉及一种靶向雌激素受体α的微小RNA及其抗肿瘤用途。

背景技术

乳腺癌是全球女性中最普遍发生的恶性肿瘤，2015年中国女性乳腺癌发生率约为15％。虽然乳腺癌的临床预后及五年生存率已有显著改善，但化疗耐药等问题仍使其死亡率高居女性癌症死亡率第二位。约70％的原位乳腺癌表达雌激素受体α(ERα)，ERα不仅是乳腺癌治疗的最佳预后指标，而且也是乳腺癌内分泌治疗的关键靶分子。ERα作为一种细胞核转录因子，能够介导受雌激素刺激的肿瘤细胞增殖。ERα在乳腺癌、子宫内膜癌及卵巢癌中高表达，并成为最早的治疗靶点之一。除此之外，有报道显示ERα促进男性肝癌发生发展，并且参与调节肝癌发生的主要危险因素，即HBV感染的病理过程。有研究用慢病毒介导的siRNA抑制ERα表达，能够有效抑制肝癌细胞增殖及侵袭能力，并诱导凋亡。

微小RNA即microRNA或miRNA，一般为长19-23个核苷酸的单链非编码RNA序列，通过与靶基因mRNA的3’-UTR区，甚至与靶基因蛋白编码区互补结合，调控其转录或翻译。MicroRNA可通过与靶基因mRNA特定区域结合而调控其表达，具有广泛的生理调控作用。文献报道，miRNA在乳腺癌中表达异常，并参与调控乳腺癌细胞的增殖、凋亡和转移等。近年来，miRNAs在人类疾病临床诊治中的应用价值受到广泛关注，已证实，“致癌miRNAs”特异性抑制剂在小鼠体内能抑制肿瘤生长和转移，而“抑癌miRNAs”类似物也是潜在的新药，miR-34类似物MRX34作为抗肿瘤药物已进入临床试验阶段。

目前，关于miRNA在癌症治疗中的应用的研究还有许多不足，本领域迫切需要对肿瘤组织中异常表达的miRNA进行进一步的研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种靶向雌激素受体α的微小RNA及其抗肿瘤用途。

更具体地，本发明的目的在于提供microRNA-3074-5p在抗肿瘤耐药及抗肿瘤药物增敏中的应用

在本发明的第一方面，提供了一种活性成分的用途，其中，所述的活性成分选自下组：

(a)miRNA-3074-5p家族的微小RNA，所述miRNA-3074-5p家族的微小RNA包括：miRNA-3074-5p或经修饰的miRNA-3074-5p衍生物；

(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miRNA-3074-5p；

(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；

(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA-3074-5p、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；

所述活性成分用于制备增强肿瘤细胞对药物敏感性的组合物、或制备预防或治疗耐药性肿瘤的组合物。

在另一优选例中，所述的miRNA-3074-5p的序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述的经修饰的miRNA衍生物，其修饰选自下组的一种或多种修饰形式：核苷酸的糖基修饰、核苷酸之间连接方式的修饰、胆固醇修饰、锁核苷酸修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、烃基修饰、和核酸修饰。

在另一优选例中，所述的核苷酸的糖基修饰包括2-O-甲基的糖基修饰、2-O-甲氧乙酯的糖基修饰、2-O-烷基的糖基修饰、2-氟代的糖基修饰、糖环修饰、锁核苷酸修饰；和/或

所述的核苷酸之间连接方式的修饰包括硫代磷酸修饰、磷酸烷基化修饰；和/或

所述的核酸修饰包括“TT”修饰。

在另一优选例中，(a)中所述经修饰的miRNA衍生物是具有式I所示结构的化合物单体或其多聚体：

(X)n-(Y)m

式I，

在式I中，

各X为(a)中所述的微小RNA；

各Y独立地为促进微小RNA施药稳定性的修饰物；

Y连接于X的左侧、右侧或中间；

n为1-100的(较佳地1-20)正整数(较佳地n为1、2、3、4或5)；

m为1-1000的(较佳地1-200)正整数；

各“-”表示接头、化学键、或共价键。

在另一优选例中，所述的接头是长度为1-10个碱基的核酸序列。

在另一优选例中，所述的Y包括(但不限于)胆固醇、类固醇、甾醇、醇、有机酸、脂肪酸、酯、单糖、多糖、氨基酸、多肽、单核苷酸、多核苷酸。

在另一优选例中，(c)中所述的多核苷酸具有式II所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向

式II，

式II中，

Seq_正向为能在宿主中被加工成所述的微小RNA核苷酸序列；

Seq_反向为与Seq_正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

并且式II所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：

式III中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

在另一优选例中，所述的miR-3074-5p为双链形式(即miR-3074-5p mimic)，其序列为：

5’-GUUCCUGCUGAACUGAGCCAG-3’

5’-GGCUCAGUUCAGCAGGAACUU-3’

在另一优选例中，(d)中所述的表达载体包括：病毒载体和非病毒载体。

在另一优选例中，(d)中所述的表达载体包括：腺病毒表达载体、慢病毒表达载体。

在另一优选例中，(e)中所述miRNA-3074-5p的激动剂包括：促进miRNA-3074-5p表达的物质、提高miRNA-3074-5p活性的物质。

在另一优选例中，所述药物(敏感性增强的药物)选自下组：他莫昔芬、多柔比星、紫杉醇、曲妥珠单抗、多西他赛、或其组合。

在另一优选例中，所述耐药性肿瘤是对他莫昔芬产生耐药性的肿瘤。

在另一优选例中，所述的肿瘤为雌激素受体α阳性肿瘤。

在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：乳腺癌、子宫内膜癌、卵巢癌、子宫颈癌肺癌、肝癌、肾癌、胃癌、肠癌、头颈癌、或其组合。

在本发明的第二方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的载体和有效量的选自下组的一种或多种活性成分：

(a)miRNA-3074-5p家族的微小RNA，所述miRNA-3074-5p家族的微小RNA包括：miRNA-3074-5p或经修饰的miRNA-3074-5p衍生物；

(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miRNA-3074-5p；

(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；

(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA-3074-5p、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；

(e)(a)中所述的微小RNA的激动剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物还含有：

(i)抑制雌激素受体α表达或活性的雌激素受体α抑制剂；和/或

(ii)抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达或活性的Bcl-2抑制剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物还包括任选的抗肿瘤药物。

在另一优选例中，所述的抗肿瘤药物包括：化疗剂、多靶点激酶抑制剂。

在另一优选例中，所述的化疗剂包括(但不限于)：多柔比星(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、依托泊甙(Etoposide)、顺铂(Cisplatin)。

在另一优选例中，所述的多靶点激酶抑制剂包括(但不限于)索拉菲尼(Sorafenib)、吉非替尼(Gefitinib)。

在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体选自下组：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。

在另一优选例中，所述的药物组合物的剂型为注射剂。

在另一优选例中，所述的药物组合物为纳米制剂。

在本发明的第三方面，提供了一种药盒，所述的药盒包括：

(I)第一容器，所述的第一容器中包含第一活性成分他莫昔芬；

(II)第二容器，所述的第二容器中包含选自下组的一种或多种第二活性成分：

(a)miRNA-3074-5p家族的微小RNA，所述miRNA-3074-5p家族的微小RNA包括：miRNA-3074-5p或经修饰的miRNA-3074-5p衍生物；

(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miRNA-3074-5p；

(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；

(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA-3074-5p、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；

(e)(a)中所述的微小RNA的激动剂；

(III)说明书，所述说明书中记载了联合给予第一活性成分和第二活性成分从而治疗癌症的说明。

在另一优选例中，所述的第一活性成分和第二活性成分先后施用或同时施用。

在本发明的第四方面，提供了一种筛选用于提高肿瘤细胞对药物敏感性的候选药物的方法，包括步骤：

(a)将候选物质施用于测试组的细胞或动物，并测定施用后所述测试组中miRNA-3074-5p的表达水平；

(b)将测试组的miRNA-3074-5p与对照组的miRNA-3074-5p的表达水平进行比较，所述对照组中未施用所述候选物质；

其中，当测试组的miRNA-3074-5p的表达水平显著高于对照组的miRNA-3074-5p的表达水平时，则表明该候选物质是用于提高肿瘤细胞对药物敏感性的候选药物。

在另一优选例中，所述的“显著高于”是指测试组的miRNA-3074-5p的表达水平是对照组的miRNA-3074-5p的表达水平1.5倍以上(如1.5-5倍，较佳地1.5-3倍)。

在另一优选例中，步骤(b)还包括测定对ERα基因的表达的抑制作用；和/或测定对Bcl-2基因的表达的抑制作用。

在另一优选例中，所述对ERα基因的表达抑制作用指测试组的ERα基因表达水平是对照组的ERα基因表达水平0.8倍以下(如0.1-0.5倍)。

在另一优选例中，所述对Bcl-2基因的表达抑制作用指测试组的Bcl-2基因表达水平是对照组的Bcl-2基因表达水平0.8倍以下(如0.1-0.5倍)。

在本发明的第五方面，提供了一种miRNA-3074-5p或其检测试剂的的用途，用于制备进行肿瘤预后和/或判断肿瘤是否耐药的试剂或试剂盒；其中，所述的试剂盒中包括以下说明：

(i)若检测对象的miRNA-3074-5p的表达量显著低于正常水平，则说明该检测对象的肿瘤预后差和/或该检测对象肿瘤耐药可能性大；

(ii)若检测对象的miRNA-3074-5p的表达量正常或显著高于正常水平，则说明该检测对象的肿瘤预后好和/或该检测对象肿瘤耐药可能性小。

在另一优选例中，所述的肿瘤预后是用他莫昔芬治疗的肿瘤预后。

在另一优选例中，所述的预后差指所述检测对象的生存期低于同类肿瘤患者的平均生存期。

在另一优选例中，所述的预后好指所述检测对象的生存期高于同类肿瘤患者的平均生存期。

在另一优选例中，所述肿瘤耐药是指肿瘤对他莫昔芬产生耐药性。

在另一优选例中，所述的检测对象包括肿瘤患者。

在另一优选例中，所述的试剂包括探针、芯片、引物。

在本发明的第六方面，提供了一种miRNA-3074-5p的用途，用于制备ERα的抑制剂或用于制备Bcl-2的抑制剂。

在本发明的第七方面，提供了一种检测或判断肿瘤预后或肿瘤是否耐药的方法，包括以下步骤：

(a)检测肿瘤患者或肿瘤样品的miRNA-3074-5p的表达量；

(b)将(a)中的检测结果与对照组或对照值进行比较；

其中，当肿瘤患者或肿瘤样品的miRNA-3074-5p的表达量显著低于对照组或对照值，则表明该肿瘤患者预后差或该肿瘤耐药性可能大。

在本发明的第八方面，提供了一种预防或治疗肿瘤耐药的方法，向需要的对象施用安全有效量的本发明第二方面所述的药物组合物，或本发明第三方面所述的药盒。

在另一优选例中，所述的预防或治疗肿瘤耐药的方法还包括在抗肿瘤药存在的条件下，向需要的对象施用安全有效量的权利要求2所述的药物组合物，或权利要求3所述的药盒。

具体而言，本发明提供了以下内容：

1、本发明公开了microRNA-3074-5p的新用途，microRNA-3074-5p可以作为抗ERα阳性肿瘤的治疗药物，并在乳腺癌中可用于化疗药物他莫昔芬的增敏剂，有效提高他莫昔芬对乳腺癌细胞的增殖的抑制作用。

2、本发明利用不同ERα表达的乳腺癌细胞模型，瞬时转染miR-3074-5p类似物(miR-3074-5p mimic)，发现过表达miR-3074-5p显著抑制ERα阳性乳腺癌细胞MCF-7和T47D的增殖，但是对ERα阴性的正常乳腺上皮细胞MCF-10A增殖无明显影响(图1)，说明miR-3074-5p对乳腺癌细胞的抑制作用可能与ERα表达水平直接相关。

3、为检测miR-3074-5p对ERα表达阳性乳腺癌细胞凋亡的影响，本发明利用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒进行染色，并利用流式细胞仪检测细胞凋亡率，发现过表达miR-3074-5p显著增强MCF-7细胞的凋亡率(图2)，这可能是转染miR-3074-5p mimic导致MCF-7细胞数量减少的原因之一。

4、本发明研究发现，用2μM他莫昔芬处理MCF-7细胞48h后，miR-3074-5p的表达水平显著降低，而处理24h时则无明显变化(图3)。该结果提示，TAM作用诱导MCF-7细胞中miR-3074-5p的表达水平显著降低可能成为其诱发获得性耐药的原因之一。而在MCF-7细胞中瞬时转染过表达miR-3074-5p mimic，24h后加药并继续培养，于加药72h后用细胞计数仪进行细胞计数，发现过表达miR-3074-5p显著增强TAM对MCF-7细胞增殖的抑制(图4)。

6、Bcl-2是抗凋亡家族蛋白中最重要的成员之一，且Bcl-2表达升高是TAM耐药性产生的标志。本发明研究在MCF-7细胞中转染miR-3074-5p mimic 48h后，用western blot方法检测Bcl-2的蛋白表达是否改变，发现miR-3074-5p能够在蛋白水平显著抑制Bcl-2的表达(图5)，提示其可能是miR-3074-5p诱导MCF-7细胞凋亡的机制之一。

7、结合miR-3074-5p对ER阳性(MCF-7)与阴性(MCF-10A)细胞作用的差异，并且ERα作为转录因子，能够调控Bcl-2蛋白的表达，可以推测ERα是miR-3074-5p的一个潜在靶基因。为验证该推测，分别采用荧光定量PCR技术及western blot技术检测了过表达miR-3074-5p 48h后MCF-7细胞中ERα的表达水平，发现过表达miR-3074-5p显著抑制ERα的mRNA及蛋白的表达(图6)。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

图1显示了脂质体转染miR-3074-5p合成类似物(3074mimic)72小时后抑制ERα阳性乳腺癌细胞MCF-7和T47D的增殖，而不影响正常乳腺上皮细胞MCF-10A的增殖。

图2显示了脂质体转染miR-3074-5p合成类似物48小时后促进ERα阳性乳腺癌细胞MCF-7的细胞凋亡。其中，图2A为三次实验统计结果，图2B为代表性流式细胞检测图片。

图3显示了2μM他莫昔芬刺激ERα阳性乳腺癌MCF-7细胞24h，48h对miR-3074-5p表达水平影响的qPCR检测结果。

图4显示了脂质体转染miR-3074-5p合成类似物显著促进他莫昔芬对MCF-7细胞增殖的抑制。

图5显示了脂质体转染miR-3074-5p合成类似物抑制MCF-7细胞中Bcl-2表达水平的western blot检测结果。

图6显示了脂质体转染miR-3074-5p合成类似物抑制MCF-7细胞中ERα表达水平的荧光定量PCR检测结果(图6A)及western blot检测结果(图6B、图6C)

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现微小RNA-3074-5p在抗雌激素受体α(ERα)阳性肿瘤中的用途，及其在化疗增敏中的用途。本发明发现的微小RNA-3074-5p能够抑制ERα阳性乳腺癌细胞的增殖，以及乳腺癌细胞中ERα和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平，诱导ERα阳性乳腺癌细胞凋亡，此外还能增强化疗药物(他莫昔芬)的抗肿瘤作用，为有效治疗ERα阳性肿瘤提供新的途径和手段。在此基础上，完成了本发明。

miRNA及其前体

本发明提供了一类涉及肿瘤耐药的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一类RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。

人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。

前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70％的核苷酸是互补的；优选的，至少有80％的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90％的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95％的核苷酸是互补的；如98％、99％或100％。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

本发明提供的miR-3074-5p是经深度测序技术筛选获得的microRNA，其在复发性流产患者绒毛组织中显著高表达，能抑制人滋养细胞侵袭并促进其凋亡，其序列为：5'-GUUCCUGCUGAACUGAGCCAG-3'(SEQ ID NO:1)。

本发明研究了miR-3074-5p对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响，发现它能抑制ERα阳性乳腺癌细胞MCF-7的增殖，以及细胞中ERα蛋白的表达，并促进该细胞的凋亡，但对ERα阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231无明显作用。本发明还发现，他莫昔芬处理MCF-7细胞48h后，miR-3074-5p的表达水平显著降低，过表达miR-3074-5p显著增强TAM对MCF-7细胞增殖的抑制。

本发明所述的miRNA是指miRNA-3074-5p家族的微小RNA，所述miRNA-3074-5p家族的微小RNA包括：miRNA-3074-5p或经修饰的miRNA-3074-5p衍生物，所述衍生物的功能与miRNA-3074-5p相同或基本相同。

在另一优选例中，所述的微小RNA来源于人或非人哺乳动物；较佳地所述的非人哺乳动物为大鼠、小鼠，鼠和人的23家族序列完全一致。

核心序列指微小RNA第2-8位的核苷酸序列。所述的“功能与miRNA-3074-5p相同或基本相同”是指保留了miRNA-3074-5p的≥40％、≥50％、≥60％、≥70％、≥80％、≥90％的提高肿瘤对抗肿瘤药敏感性的功能。

本发明还包括miRNA变体和衍生物。此外，广义上的miRNA衍生物也可包括miRNA变体。本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miRNA-3074-5p进行修饰，修饰方式包括(但不限于)：甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、核酸修饰(如“TT”修饰)等。

多核苷酸构建物

根据本发明所提供的miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。

作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式II所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向

式II

式II中，

Seq_正向为可在细胞中表达成所述的miRNA-3074-5p的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq_反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

式I所示的结构在转入细胞后，形成式III所示的二级结构：

式II I中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述；

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

他莫昔芬

他莫昔芬(TAM)是雌激素的竞争性拮抗剂，其通过结合雌激素受体干扰内源性雌激素对乳腺癌的促进作用。作为ERα阳性乳腺癌内分泌治疗的金标准，TAM同时也是FDA批准的首个乳腺癌化学预防药物，能显著提高患者五年生存率，并且持续服用十年以上能有效预防复发。然而，长期服用TAM会导致获得性耐药，并且具有诱发子宫内膜癌、非酒精性脂肪肝等的风险，极大限制了TAM的临床应用。

药物组合物

本发明提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体或有效量的选自下组的一种或多种活性成分：(a)miRNA-3074-5p家族的微小RNA，所述miRNA-3074-5p家族的微小RNA包括：miRNA-3074-5p或经修饰的miRNA-3074-5p衍生物；(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miRNA-3074-5p；(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA-3074-5p、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；(e)(a)中所述的微小RNA的激动剂。

在本发明的另一优选例中，所述的miRNA-3074-5p来源于人或非人哺乳动物。人源和鼠源的miRNA-3074-5p成熟序列完全相同。

在本发明的另一优选例中，所述的经修饰的miRNA衍生物是具有式I所示结构的化合物单体或其多聚体：

(X)n-(Y)m

式I

在式I中，各X为(a)中所述的微小RNA；各Y独立地为促进微小RNA施药稳定性的修饰物；n为1-100的(较佳地1-20)正整数(较佳地n为1、2、3、4或5)；m为1-1000的(较佳地1-200)正整数；各“-”表示接头、化学键、或共价键；在另一优选例中，所述的接头是长度为1-10个碱基的核酸序列。所述的Y包括(但不限于)胆固醇、类固醇、甾醇、醇、有机酸、脂肪酸、酯、单糖、多糖、氨基酸、多肽、单核苷酸、多核苷酸。

在本发明的另一优选例中，(c)中所述的多核苷酸具有式II所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向

式II

式II中，Seq_正向为能在宿主中被加工成miRNA-3074-5p的核苷酸序列；Seq_反向为与Seq_正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；并且式II所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：

式III中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

本发明还提供了所述药物组合物的用途，用于制备增强肿瘤细胞对药物敏感性的药物、或制备预防或治疗肿瘤(尤其是耐药性肿瘤)的药物，其中，所述的肿瘤选自下组：肺癌、肝癌、肾癌、胃癌、肠癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌。

诊断方法

本发明还提供了一种检测检测或判断肿瘤预后或肿瘤是否耐药的方法。

在一个优选例中，包括步骤：(a)检测肿瘤患者或肿瘤样品的miRNA-3074-5p的表达量；

(b)将(a)中的检测结果与对照组或对照值进行比较；

其中，当肿瘤患者或肿瘤样品的miRNA-3074-5p的表达量显著低于对照组或对照值，则表明该肿瘤患者预后差或该肿瘤耐药性可能大。

预防或治疗方法

本发明提供了一种预防或治疗肿瘤耐药的方法。

在一个优选例中，所述的方法包括向需要的对象施用安全有效量的本发明药物组合物。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明的RNA-3074-5p可以增强化疗药物(他莫昔芬)的抗肿瘤作用，治疗耐药性ERα阳性肿瘤。

(b)本发明的RNA-3074-5p能够抑制ERα阳性乳腺癌细胞的增殖，以及乳腺癌细胞中ERα和抗凋亡蛋白Bcl-2的表达水平，诱导ERα阳性乳腺癌细胞凋亡。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1 miR-3074-5p对ERα阳性和ERα阴性的细胞的影响

利用自动细胞计数仪检测转染miR-3074-5p对ERα阳性的乳腺癌细胞MCF-7，T47D以及ERα阴性的乳腺上皮细胞MCF-10A增殖影响。

分别用胰酶消化收集培养三种细胞，用细胞计数仪进行计数并分别接种3×10⁴，4×10⁴，3×10⁴个细胞/孔，0.5ml/孔培养基培养过夜。用脂质体转染试剂lipofectamine2000将miR-3074-5p及阴性对照序列分别转染三种细胞，继续培养72小时后，消化收集每孔中的细胞，用终浓度为0.1％的台盼蓝试剂染色，并在自动细胞计数仪上读取并比较阴性对照组和过表达miR-3074-5p组的活细胞数量，并用Graphpad Prism 6进行统计并作图。

结果如图1所示，过表达miR-3074-5p显著抑制ERα阳性乳腺癌细胞MCF-7和T47D的增殖，但是对ERα阴性的正常乳腺上皮细胞MCF-10A增殖无明显影响(图1)，说明miR-3074-5p对乳腺癌细胞的抑制作用可能与ERα表达水平直接相关。

实施例2 miR-3074-5p对ERα阳性的乳腺癌细胞凋亡率的影响

用Annexin V-FITC/PI双染试剂盒检测转染miR-3074-5p对ERα阳性的乳腺癌细胞MCF-7凋亡率的影响。

在6孔板中接种5×10⁵个细胞/孔，2ml培养基/孔，过夜培养。用脂质体转染试剂lipofectamine2000将miR-3074-5p mimic(miR-3074-5p mimic是内源性miR-3074-5p模拟物的双链形式)及阴性对照序列分别转染细胞，继续培养48小时后，参照凋亡检测试剂盒说明书稍作调整进行染色，用PBS洗细胞2次，加入不含EDTA的胰酶，消化收集每孔中的细胞，2000rpm，5min离心，并用1ml PBS重悬，计数，各组统一取约1×10⁵个细胞，并用250ul试剂盒中的binding buffer重悬细胞，分别加入AnnexinV-FITC，PI各2.5ul，常温下染色10min，置于冰上待测。同时准备AnnexinV-FITC和PI单染细胞样品，用于调节FITC和PerCP两个通道的荧光补偿，调节后用流式细胞仪检测荧光信号并进行数据分析。

结果如图2所示，过表达miR-3074-5p显著增加MCF-7细胞凋亡率，这可能是转染miR-3074-5p mimic导致MCF-7细胞数量减少的原因之一。

实施例3 他莫昔芬对ERα阳性乳腺癌细胞中miR-3074-5p表达水平的影响

利用荧光定量PCR技术检测一定量的他莫昔芬刺激对ERα阳性乳腺癌细胞MCF-7中miR-3074-5p表达水平的影响。

将MCF-7细胞利用去激素条件(10％活性炭处理的血清，无酚红培养基)培养48h后，用2μM他莫昔芬刺激24h，48h，将细胞用冰PBS洗一次，收集于Trizol中并抽提RNA，采用miR-3074-5p的特异性引物进行反转录，并用荧光定量PCR技术检测miR-3074-5p的表达水平。

结果如图3所示，用2μM他莫昔芬处理MCF-7细胞48h后，miR-3074-5p的表达水平显著降低，而处理24h时则无明显变化(图3)。该结果提示，TAM作用诱导MCF-7细胞中miR-3074-5p的表达水平显著降低可能成为其诱发获得性耐药的原因之一。

实施例4 miR-3074-5p对他莫昔芬抗肿瘤作用的影响

利用自动细胞计数仪检测转染miR-3074-5p对他莫昔芬抗ERα阳性乳腺癌细胞MCF-7增殖的增敏作用。

于24孔板中接种3×10⁴个细胞/孔MCF-7细胞，过夜培养后用脂质体转染试剂lipofectamine2000将miR-3074-5p mimic及阴性对照序列分别转染细胞，24h后加药(加入1μM他莫昔芬)并继续培养，于加药72h后消化收集每孔中的细胞，用终浓度为0.1％的台盼蓝试剂染色，并在自动细胞计数仪上计数，比较单用他莫昔芬和miR-3074-5p合并他莫昔芬对MCF-7细胞增殖的影响。

结果如图4所示，转染miR-3074-5p mimic+1μM他莫昔芬组细胞数较转染阴性对照序列1μM他莫昔芬组明显减少，说明过表达miR-3074-5p显著增强TAM对MCF-7细胞增殖的抑制。

实施例5 miR-3074-5p对ERα表达的影响

用荧光定量PCR技术检测miR-3074-5p mimic对MCF-7细胞中ERα表达水平的影响。

在MCF-7细胞中转染miR-3074-5p mimic 48h后，用Trizol收集细胞并抽提各组细胞中的RNA，并用荧光定量PCR检测ERα的mRNA表达情况。

结果显示，miR-3074-5p能够在mRNA水平显著抑制ERα的表达。

实施例6 miR-3074-5p对Bcl-2表达的影响

用western blot技术检测miR-3074-5p mimic对MCF-7细胞中Bcl-2及ERα表达水平的影响。

在MCF-7细胞中转染miR-3074-5p mimic 48h后，收集各组细胞，裂解抽提蛋白并用western blot方法检测Bcl-2及ERα的蛋白表达是否改变，发现miR-3074-5p能够在蛋白水平显著抑制Bcl-2和ERα的表达。

Bcl-2检测结果如图5所示，miR-3074-5p能够在蛋白水平显著抑制Bcl-2的表达，提示其可能是miR-3074-5p诱导MCF-7细胞凋亡的机制之一。

ERα检测结果如图6所示，过表达miR-3074-5p显著抑制ERα的mRNA及蛋白的表达

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海市计划生育科学研究所

<120> 一种靶向雌激素受体α的微小RNA及其抗肿瘤用途

<130> P2020-0575

<150> CN202010067727.7

<151> 2020-01-20

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> RNA

<213> 人工序列（Artificial Sequence）

<400> 1

guuccugcug aacugagcca g 21

Claims (10)

1.一种活性成分的用途，其中，所述的活性成分选自下组：

(a)miRNA-3074-5p家族的微小RNA，所述miRNA-3074-5p家族的微小RNA包括：miRNA-3074-5p或经修饰的miRNA-3074-5p衍生物；

(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miRNA-3074-5p；

(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；

(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA-3074-5p、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；

其特征在于，所述活性成分用于制备增强肿瘤细胞对药物敏感性的组合物、或制备预防或治疗耐药性肿瘤的组合物。

2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的经修饰的miRNA衍生物，其修饰选自下组的一种或多种修饰形式：核苷酸的糖基修饰、核苷酸之间连接方式的修饰、胆固醇修饰、锁核苷酸修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、烃基修饰、和核酸修饰。

3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的核苷酸的糖基修饰包括2-O-甲基的糖基修饰、2-O-甲氧乙酯的糖基修饰、2-O-烷基的糖基修饰、2-氟代的糖基修饰、糖环修饰、锁核苷酸修饰；和/或

所述的核苷酸之间连接方式的修饰包括硫代磷酸修饰、磷酸烷基化修饰；和/或

所述的核酸修饰包括“TT”修饰。

4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，(a)中所述经修饰的miRNA衍生物是具有式I所示结构的化合物单体或其多聚体：

(X)n-(Y)m

式I，

在式I中，

各X为(a)中所述的微小RNA；

各Y独立地为促进微小RNA施药稳定性的修饰物；

Y连接于X的左侧、右侧或中间；

n为1-100的(较佳地1-20)正整数(较佳地n为1、2、3、4或5)；

m为1-1000的(较佳地1-200)正整数；

各“-”表示接头、化学键、或共价键。

5.如权利要求1所述的用途，其特征在于，(c)中所述的多核苷酸具有式II所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向

式II，

式II中，

Seq_正向为能在宿主中被加工成所述的微小RNA核苷酸序列；

Seq_反向为与Seq_正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

并且，式II所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：

式III中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述药物选自下组：他莫昔芬、多柔比星、紫杉醇、曲妥珠单抗、多西他赛、或其组合。

7.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤为雌激素受体α阳性肿瘤。

8.一种药盒，其特征在于，所述的药盒包括：

(I)第一容器，所述的第一容器中包含第一活性成分他莫昔芬；

(II)第二容器，所述的第二容器中包含选自下组的一种或多种第二活性成分：

(a)miRNA-3074-5p家族的微小RNA，所述miRNA-3074-5p家族的微小RNA包括：miRNA-3074-5p或经修饰的miRNA-3074-5p衍生物；

(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miRNA-3074-5p；

(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；

(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA-3074-5p、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；

(e)(a)中所述的微小RNA的激动剂；

(III)说明书，所述说明书中记载了联合给予第一活性成分和第二活性成分从而治疗癌症的说明。

9.一种筛选用于提高肿瘤细胞对药物敏感性的候选药物的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将候选物质施用于测试组的细胞或动物，并测定施用后所述测试组中miRNA-3074-5p的表达水平；

(b)将测试组的miRNA-3074-5p与对照组的miRNA-3074-5p的表达水平进行比较，所述对照组中未施用所述候选物质；

其中，当测试组的miRNA-3074-5p的表达水平显著高于对照组的miRNA-3074-5p的表达水平时，则表明该候选物质是用于提高肿瘤细胞对药物敏感性的候选药物。

10.一种miRNA-3074-5p或其检测试剂的用途，其特征在于，用于制备进行肿瘤预后和/或判断肿瘤是否耐药的试剂或试剂盒；其中，所述的试剂盒中包括以下说明：

(i)若检测对象的miRNA-3074-5p的表达量显著低于正常水平，则说明该检测对象的肿瘤预后差和/或该检测对象肿瘤耐药可能性大；

(ii)若检测对象的miRNA-3074-5p的表达量正常或显著高于正常水平，则说明该检测对象的肿瘤预后好和/或该检测对象肿瘤耐药可能性小。

Images