CN116077664A - 一种肿瘤药物标志物蛋白激酶hunk及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种肿瘤药物标志物蛋白激酶HUNK标志物在制备治疗肿瘤及与肿瘤转移性相关疾病的药物中的应用，所述治疗肿瘤及与肿瘤转移性相关疾病的药物包括用于抑制HUNK表达的成分与纳米类药物。本发明HUNK抑制细胞由小窝蛋白介导的内吞作用，该内吞途径涉及白蛋白紫杉醇等纳米类药物进入细胞的一种主要途径，该蛋白的sirna和抑制剂可作为该基因高表达癌症中的纳米药物治疗。在实验应用中，高表达HUNK基因的肿瘤细胞对白蛋白紫杉醇不敏感，而敲除HUNK或抑制剂处理的细胞则对白蛋白紫杉醇更加敏感，实验中发现敲除或抑制HUNK可促进白蛋白的内吞，并促进其进入溶酶体降解。

Description

一种肿瘤药物标志物蛋白激酶HUNK及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种肿瘤药物标志物蛋白激酶HUNK及其应用。

背景技术

肿瘤(tumor)是机体细胞在各种始动与促进因素作用下产生的增生与异常分化所形成的新生物。肿瘤的生长不受正常机体生理调节，而是破坏正常组织与器官。根据肿瘤的生物学行为可分为良性肿瘤、恶性肿瘤及介于良、恶性肿瘤之间的交界性肿瘤。有明确肿块形成的为实体瘤，而没有明确肿块的为非实体瘤，非实体瘤大多为血液系统恶性肿瘤。为了治疗肿瘤，通常采用抗体类药物和纳米类药物，而纳米药物则是广谱肿瘤药物，但纳米药物的内吞效率有限，限制了其在肿瘤临床治疗中的效果。

发明内容

本发明的目的在于蛋白激酶HUNK标志物在制备治疗肿瘤及与肿瘤转移性相关疾病的药物中的应用，通过HUNK抑制细胞由小窝蛋白介导的内吞作用，该内吞途径涉及白蛋白紫杉醇等纳米类药物进入细胞的一种主要途径，该蛋白的sirna和抑制剂可作为该基因高表达癌症中的纳米药物治疗。

本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

一种药物组合物，所述药物组合物包括a)纳米药物，以及如下b)和c)中的至少一种：

b)降低或消除HUNK基因表达的试剂。

c)降低或消除HUNK蛋白的激酶活性的试剂。

进一步的，所述降低或消除HUNK基因表达的试剂选自如下至少一种：

b1)多核苷酸，所述多核苷酸包含降低或消除所述HUNK基因的表达水平的核苷酸序列。

b2)重组载体，所述重组载体包含所述b1)所示的多核苷酸序列。

优选地，所述b1)所示的多核苷酸包含以HUNK基因为靶点的shRNA、siRNA和/或sgRNA。

进一步的，所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:X-X任一项所示的核苷酸序列，或与之具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

进一步的，所述降低或消除HUNK蛋白的激酶活性的试剂选自：

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂和酪氨酸蛋白激酶抑制剂。

进一步的，所述纳米药物选自紫杉烷类；优选为紫杉醇或白蛋白紫杉醇；更优选地，所述药物组合物中，所述白蛋白紫杉醇的浓度为0.1-1000nM，更优选为10-1000nM。

进一步的，药物组合物在制备治疗癌症或肿瘤的药物中的用途；

优选地，所述癌症或肿瘤选自结肠癌、直肠癌、乳癌、子宫内膜癌、鳞状细胞癌、滤泡性淋巴瘤、肾细胞癌、葡萄膜黑色素瘤、子宫颈癌、头颈癌、霍奇金病、星形细胞癌、肺腺癌、间皮瘤、绒毛膜癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胰腺癌、肾癌、肺癌、肝癌、脑癌、胃癌、膀胱癌、食管癌、宫颈癌、多发性骨髓瘤、白血病、淋巴瘤或胶质母细胞瘤。

进一步的，选自如下b)和c)中至少一种的试剂在制备用于促进细胞内吞的药物中的用途：

b)降低或消除HUNK基因表达的试剂。

c)降低或消除HUNK蛋白的激酶活性的试剂。

优选地，所述用于促进细胞内吞的药物是用于促进纳米药物内吞的药物。

优选地，所述纳米药物选自化学治疗剂、免疫检查点抑制剂或抗体药物偶联物。

进一步的，选自如下b)和c)中至少一种的试剂在制备用于抑制AGAP3蛋白磷酸化的药物中的用途：

b)降低或消除HUNK基因表达的试剂。

c)降低或消除HUNK蛋白的激酶活性的试剂。

进一步的，一种用于促进细胞内吞的方法，其包括向细胞施用如下至少一种试剂的步骤：

b)降低或消除HUNK基因表达的试剂。

c)降低或消除HUNK蛋白的激酶活性的试剂。

优选地，所述细胞为肿瘤细胞。

可选地，所述细胞为体外培养细胞或包含于受试者体内的细胞。

进一步的，一种用于抑制AGAP3蛋白磷酸化的方法，其包括向细胞施用如下至少一种试剂的步骤：

b)降低或消除HUNK基因表达的试剂。

c)降低或消除HUNK蛋白的激酶活性的试剂。

优选地，所述细胞为肿瘤细胞。

可选地，所述细胞为体外培养细胞或包含于受试者体内的细胞。

本发明的有益效果：

1、在实验应用中，高表达HUNK基因的肿瘤细胞对白蛋白紫杉醇不敏感，而敲除HUNK或抑制剂处理的细胞则对白蛋白紫杉醇更加敏感，实验中发现敲除或抑制HUNK可促进牛血清白蛋白的内吞，并促进其进入溶酶体降解；

2、本发明标志物通过对HUNK基因进行sirna或药物靶向，进而促进纳米药物对肿瘤的治疗解决纳米药物的耐药性，提升了治疗效果；

3、本发明提出了新的可以和白蛋白紫杉醇等纳米药物联合使用的标志物，可降低纳米药物的毒性和使用量，进而提高药物效果，降低副作用。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步的说明。

图1是本发明HUNK敲除细胞系中的通路富集；

图2是本发明HUNK敲除KO细胞系中内吞物；

图3是本发明细胞使用MOCK模拟处理结果；

图4是本发明检测bsa内吞的蛋白量；

图5是本发明检测bsa荧光图；

图6是本发明不同时间点检测细胞荧光情况；

图7是图6定位bsa和整体bsa溶酶体的荧光强度量化统计；

图8是本发明通过western检测内吞BSA的蛋白总量情况；

图9是早期内体标志物RAB5和晚期内体标志物RAB7检测情况；

图10是添加不同bsa时间点检测bsa蛋白量；

图11是本发明ab7和lamp1共定位晚期内体溶酶体的总量；

图12是本发明ko后晚期内体溶酶体的大小情况；

图13是本发明图12晚期内体溶酶体数量和大小的五次实验的量化统计；

图14是ko细胞中过表达neo对照质粒，hunk基因质粒，和hunk基因的激酶活性突变质粒dk1和dk2；

图15是细胞添加bsa检测蛋白量；

图16是hunk激酶抑制剂sts处理后情况；

图17是sts处理后rab7和lamp1共定位；

图18是晚期内体溶酶体上升，sts处理后rab7、lamp1共定位上升；

图19是AWT和ko细胞系中的rab7和lamp1染色被hunk磷酸化情况；

图20是通过蛋白印迹检测bsa内吞，s395d抑制了bsa内吞情况；

图21是gst沉淀的蛋白磷酸化检测发现HUNK磷酸化s395；

图22是hunk敲除后s395磷酸化下调情况；

图23是表达hunk和突变体提取蛋白情况；

图24是敲除细胞和对照细胞经过白蛋白紫杉醇处理后对药物敏感情况；

图25是sts和模拟mock处理后添加白蛋白紫杉醇对药物敏感情况；

图26是三维培养的WT，ko和sts细胞对白蛋白紫杉醇的药物毒性对比图；

图27是三维培养的WT，ko和sts细胞在不同培养条件下细胞球的灰度值；

图28是本发明WT与KO的基因表达。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

本实施例提供一种肿瘤药物标志物，标志物以蛋白激酶HUNK为靶标，通过sirna对HUNK基因进行敲减，在sw480中构建HUNK敲除细胞系KO，WT为正常sw480细胞，KO为HUNK敲除细胞，标志物应用在纳米药物治疗联合使用HUNKsirna或抑制剂的实验，具体实验如下：

在HUNK敲除细胞系中WT和KO细胞系提取rna，逆转录构建cdna文库并进行转录组测序，随后比对差异基因，通过GSEA软件进行KEGG通路富集，将排在前20的富集通路绘制成气泡图，如图1所示。

通过生物信息学进行通路富集，发现溶酶体lysosome和endocytosis内吞通路得到富集，WT和KO细胞系进行24小时无血清培养基的饥饿处理，在HUNK敲除KO细胞系中通过Alexa-488偶联的牛血清白蛋白BSA、alexa-555偶联的鞘磷脂CTB、alexa-488偶联的转铁蛋白Tfn和alexa-555偶联的葡聚糖Dextran四种不同的内吞物进行添加，添加处理1小时后加入细胞核染料Hoechst处理5分钟，随后进行共聚焦拍摄，内吞物BSA和ctb为小窝途径的内吞物，tfn和dextran为网格途径的内吞物，结果如图2处所示，通过内吞物的荧光强度量化，发现BSA和CTB在KO细胞中显著上升；

在细胞中使用MOCK模拟处理，如图3处所示，具体为加入二甲亚砜溶剂作为对照，WT和KO各一组MOCK处理，KO组中加入抑制小窝蛋白内吞的beta-环糊精(cyclodextrin)和抑制网格蛋白的CPZ，对绿色荧光蛋白绑定的BSA内吞进行量化，实验具体操作为无血清培养基处理24小时后，加入抑制剂预处理30分钟，随后加入荧光偶联的BSA处理1小时，小窝抑制剂β环糊精显著抑制了BSA内吞；

通过蛋白印迹检测bsa内吞，如图4处所示，WT和KO细胞系经过24小时无血清饥饿处理，随后添加10um的BSA到培养基中孵育，1小时后用PBS洗细胞，去除PBS后加入裂解液提取蛋白，进行蛋白的western检测，通过HUNK\BSA\GAPDH的抗体检测蛋白表达量，其中GAPDH为内参对照；

在KO细胞系中进行小窝蛋白CAV1和网格蛋白clathrin的sirna敲减，siNC为敲减的对照，细胞经过siran的转染24小时后，经24小时无血清处理，加入荧光偶联的BSA，添加1小时后加入Hoechst进行细胞核染色，随后使用共聚焦显微镜拍摄，如图5所示,敲减小窝后显著抑制了BSA内吞。

实施例2

本实施例通过检测rab5和rab7共定位，WT和KO细胞系进行早期内体标志物RAB5和晚期内体标志物RAB7的双色荧光染色的检测，对早期内体和晚期内体溶酶体的表达，具体实验操作如下：

将WT和KO细胞系经过24小时无血清饥饿处理，随后添加lysotracker(细胞溶酶体的红色染料)处理30分钟，随后加入荧光偶联的bsa处理不同时间点，在不同时间梯度添加BSA后进行共聚焦拍摄，拍摄前5分钟加入Hoechst进行细胞核染色，如图6所示，KO细胞系中bsa显著富集到溶酶体，western显示结果同样如此。

通过lysotracker检测溶酶体，经过荧光强度量化，统计比较与红色溶酶体部分重叠的绿色BSA荧光值与总的BSA荧光值的百分比，从而计算添加不同时间点的BSA后，BSA在溶酶体中的数量占所有内吞BSA的比例，通过比较溶酶体定位的bsa和整体bsa的定位检测bsa进入溶酶体的比例，从而进行荧光强度量化统计，如图7所示，图7为图6的荧光强度量化统计；

通过24小时无血清培养，预处理后，添加不同bsa时间点检测bsa蛋白量，随后通过裂解液提取蛋白，通过western检测内吞BSA的蛋白总量，GAPDH作为内参；结果如图8所示；

通过如图9和图10所示的检测rab5和rab7共定位，WT和KO细胞系进行早期内体标志物RAB5和晚期内体标志物RAB7的双色荧光染色的检测，两种标志物的共定位部分为晚期内体形成的部分；WT和KO细胞系进行晚期内体标志物RAB7和溶酶体LAMP1的双色荧光染色的检测；两种标志物的共定位部分为晚期内体溶酶体形成的部分，基因敲除后晚期内体溶酶体的形成显著增加。

如图11所示为LAMP1染色的超分辨结果，通过sim超分辨检测晚期内体溶酶体，在KO细胞系中LAMP1标记的晚期内体溶酶体大小显著比WT细胞中大；如图12所示，将培养的WT和KO细胞系经过lysotracker处理30分钟，随后用针筒反复破碎细胞，并通过密度梯度离心法提取细胞的溶酶体，经过纳米颗粒分析系统NTA检测带有绿色荧光的溶酶体的颗粒大小和数量，ko后晚期内体溶酶体更大,H-Iko细胞中的晚期内体溶酶体的大小和数量更大更多；

通过纳米颗粒检测仪NTA检测，如图13(A)和图13(B)所示，暗示早期内体和晚期内体溶酶体增加，溶酶体的体积增大，暗示内吞形成增加。

实施例3

本实施例采用慢病毒过表HUNK全长基因和激酶活性缺失的突变体检测加入HUNK的抑制剂STS对晚期内体溶酶体的表达情况，包括如下步骤：

在WT和KO细胞系中用慢病毒过表HUNK全长基因和激酶活性缺失的突变体，DK#1和DK#2为91号氨基酸的两种突变形式，Neo为空载体作为空白对照，细胞稳定转入HUNK全长、激酶活性缺失突变和空白载体后，血清饥饿24小时，加入荧光BSA处理1小时，拍摄前加入Hoechst指示细胞核，然后对荧光强度进行量化统计如图14所示，加入BSA处理1小时随后PBS洗细胞，加入裂解液提取细胞蛋白，通过western检测细胞中的蛋白表达情况结果如图15所示。

Sw480细胞系经过24小时血清饥饿，随后加入HUNK的抑制剂STS处理30分钟，随后加入荧光偶联的BSA处理1小时，MOCK为溶剂二甲亚砜的对照处理，在拍摄前加入Hoechst指示细胞核的位置，荧光BSA的量化统计，如图16所示。

通过对Sw480细胞系经过24小时血清饥饿，随后加入HUNK的抑制剂STS处理30分钟，通过对晚期内体标志物RAB7和溶酶体标志物LAMP1的免疫荧光染色，如图17所示，指示Rab7和LAMP1的荧光强度量化，显示HUNK基因敲除之后晚期内体溶酶体的生成增加了；如图18所示为图17的共定位系数量化，同样显示HUNK基因敲除之后晚期内体溶酶体的生成增加了。

综上所述，在WT和ko细胞中添加bsa，其中ko细胞中过表达neo对照质粒，hunk基因质粒，和hunk基因的激酶活性突变质粒dk1和dk2，发现hunk过表抑制了bsa内体，而dk1和dk2不能；通过上述细胞添加bsa检测蛋白量，同样dk1和dk2不能抑制bsa内吞通过hunk激酶抑制剂sts处理，发现bsa内吞增加dsts处理后rab7和lamp1共定位上升，表明晚期内体溶酶体上升sts处理后rab7、lamp1共定位上升。

实施例四

本实施了中AGAP3的S395位点的模拟磷酸化突变S395D可以在HUNK敲除细胞系中抑制BSA的内吞，具体操作如下：

先在WT和KO细胞系中过表达对照Neo载体，HUNK基因，AGAP3基因全长及AGAP3基因的两个位点的模拟磷酸化突变，进行RAB7和LAMP1的荧光染色，随后进行荧光强度量化，如图19所示显示AGAP3的S395位点的模拟磷酸化突变S395可以在HUNK敲除细胞系中显著的抑制晚期内体溶酶体的产生，而野生型AGAP3则不能，暗示HUNK对AGAP3的磷酸化参与了这个功能，AGAP3的S395位丝氨酸可以被hunk磷酸化，而S395突变抑制了rab7和lamp1代表的晚期内体溶酶体的形成。

然后在WT和KO细胞系中过表达对照Neo载体，HUNK基因，AGAP3基因全长及AGAP3基因的两个位点的模拟磷酸化突变，进行BSA的内吞实验，细胞经24小时血清饥饿，随后添加BSA处理1小时，随后进行western蛋白检测，如图20所示显示AGAP3的S395位点的模拟磷酸化突变S395D可以在HUNK敲除细胞系中显著的抑制BSA的内吞，而野生型AGAP3则不能，暗示HUNK对AGAP3的磷酸化参与了这个功能，通过蛋白印迹检测bsa内吞，s395抑制了bsa内吞。

构建AGAP3的1-411氨基酸的一个半长片段(M2)，通过GST-M2在细菌中进行表达，随后使用GST pulldown技术将融合蛋白纯化，用体外翻译试剂盒对HUNK蛋白进行体外翻译，将翻译的HUNK-FLAG全长蛋白(500ng)和GST-M2蛋白(1ug)进行体外磷酸化实验，通过磷酸化的AGAP3抗体(p-AGAP3)检测AGAP3的磷酸化水平，如图21所示，gst沉淀的蛋白磷酸化检测发现HUNK可以磷酸化s395，而不能磷酸化s395a突变。

在WT和KO细胞系中检测AGAP3的磷酸化水平，发现KO可以显著下调AGAP3的S395位点的磷酸化，如图22所示hunk敲除后s395磷酸化下调；在WT和KO细胞系中用慢病毒过表HUNK全长基因和激酶活性缺失的突变体，DK#1和DK#2为91号氨基酸的两种突变形式，提取细胞蛋白，通过western检测AGAP3的磷酸化水平，AGAP3在KO后磷酸化明显下调，而过表达HUNK可以弥补其磷酸化水平，激酶活性突变的HUNK则不能弥补其磷酸化水平，如图23所示。

实施例5

本实施例通过添加不同浓度的白蛋白紫杉醇，获得KO细胞系和STS细胞系活性显著低于WT细胞的效果，具体实验如下：

先在WT和KO细胞系中添加白蛋白紫杉醇Nab-paclitaxel，检测细胞活性，不同浓度的白蛋白紫杉醇添加48小时后检测，ko细胞系对药物更加敏感如图24所示，KO细胞系活性显著低于WT细胞；

然后在MOCK和STS处理的细胞系中添加白蛋白紫杉醇Nab-paclitaxel，不同浓度的白蛋白紫杉醇添加后，STS细胞系活性显著低于MOCK细胞，如图25所示；

经过三维培养的WT，ko和sts细胞对白蛋白紫杉醇的药物毒性，细胞种植在无接触培养皿中72小时形成三维球，在WT和KO细胞系\STS处理细胞系中添加白蛋白紫杉醇Nab-paclitaxel，经过白蛋白紫杉醇处理7天后拍摄，并比较不同培养条件下细胞球的灰度，检测细胞活性，如图26、图27所示不同浓度的白蛋白紫杉醇添加后，KO细胞系和STS细胞系活性显著低于WT细胞，图26是图27的量化，图27是三维培养的细胞，wt和KO细胞系培养48小时成球后加入白紫处理7天，检测细胞三维球的大小，在不影响球体大小的情况下较低浓度的STS处理，同时加以不同浓度的白紫，STS组是使用了不影响细胞球大小的浓度。HUNK的靶向siRNA序列为，其中si-NC为对照：

Table 2Sequences of siRNA for KD.

Claims (9)

1.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括a)纳米药物，以及如下b)和c)中的至少一种：

b)降低或消除HUNK基因表达的试剂；

c)降低或消除HUNK蛋白的激酶活性的试剂。

2.根据权利要求1所述的药物组合物，其中，所述降低或消除HUNK基因表达的试剂选自如下至少一种：

b1)多核苷酸，所述多核苷酸包含降低或消除所述HUNK基因的表达水平的核苷酸序列；

b2)重组载体，所述重组载体包含所述b1)所示的多核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的药物组合物，其中，所述多核苷酸包含如SEQ ID NO:X-X任一项所示的核苷酸序列，或与之具有至少90％序列同一性的核苷酸序列。

4.根据权利要求1-3任一项所述的药物组合物，其中，所述降低或消除HUNK蛋白的激酶活性的试剂选自：

丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶抑制剂和酪氨酸蛋白激酶抑制剂。

5.根据权利要求1-4任一项所述的药物组合物，其中，所述纳米药物选自紫杉烷类；所述白蛋白紫杉醇的浓度为0.1-1000nM。

6.选自如下b)和c)中至少一种的试剂在制备用于促进细胞内吞的药物中的用途：

b)降低或消除HUNK基因表达的试剂；

c)降低或消除HUNK蛋白的激酶活性的试剂。

7.选自如下b)和c)中至少一种的试剂在制备用于抑制AGAP3蛋白磷酸化的药物中的用途：

b)降低或消除HUNK基因表达的试剂；

c)降低或消除HUNK蛋白的激酶活性的试剂。

8.一种用于促进细胞内吞的方法，其包括向细胞施用如下至少一种试剂的步骤：

b)降低或消除HUNK基因表达的试剂；

c)降低或消除HUNK蛋白的激酶活性的试剂。

9.一种用于抑制AGAP3蛋白磷酸化的方法，其包括向细胞施用如下至少一种试剂的步骤：

b)降低或消除HUNK基因表达的试剂；

c)降低或消除HUNK蛋白的激酶活性的试剂。

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