CN104415347A - miRNA-27b在抗肿瘤耐药中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及miRNA-27b在抗肿瘤耐药中的应用。具体地，本发明通过高通量microRNA芯片对肿瘤患者的肿瘤组织进行研究以及对人类miRNA文库进行大规模筛选，在大量microRNA中，发现miR-27b在肿瘤中普遍下调，且miR-27b家族成员能提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物的敏感性。本发明还发现miR-27b以肿瘤耐药信号通路上的p53和CYP1B1等基因为靶点；促进p53和抑制CYP1B1表达可提高肿瘤对抗肿瘤药的敏感性。

Description

miRNA-27b在抗肿瘤耐药中的应用

技术领域

本发明属于生物技术和医学领域，具体地，本发明涉及抗肿瘤耐药相关的microRNA及其应用。

背景技术

使用抗肿瘤药物是肿瘤治疗的重要方案，尤其对于不能进行手术切除的晚期肿瘤尤为重要。然而，临床研究表明，肿瘤细胞对药物的耐受是造成用药失败的主要原因，尤其对于肝癌和肾癌这两类实体瘤，耐药现象尤为严重，sorafenib作为最有效的靶点特异性药物之一，也仅能短暂地延长病人三个月的存活时间。而且肿瘤细胞一旦对某种药物产生耐药性以后，往往还会发展出对其他结构和功能不相关药物的耐受性。这种多药耐药性现象提示我们，肿瘤细胞有可能采用某些普遍的分子机制来对抗不同类型的抗肿瘤药物，这些分子机制包括：肿瘤细胞内药物积累减少，肿瘤细胞逃避药物所诱导的死亡，以及肿瘤细胞对药物解毒能力的增强。理论上来说，抑制这其中任意一条关键的耐药性信号通路都应该能增强肿瘤细胞对药物的响应，但事实上针对这些信号通路设计的药物在临床转化中却并不尽如人意。这主要是因为多种耐药性信号通路之间相互联系，形成复杂的调控网络，当某条通路被抑制后，其他的耐药性通路依然持续发挥着作用，单独考虑某一条信号通路来解决肿瘤细胞耐药性的问题是不够的。另外，耐药性信号通路的冗余性和复杂性造成了不同的病人对药物响应存在差异，对于不同类型的病人需要有所区分从而采用适合的分子标志物来预测药物响应，因此单一地考虑某一条耐药性通路也为寻找合理的分子标志造成了局限。综上所述，我们认为寻找一个能抑制多条耐药性信号通路的新靶点将更有效地增强肿瘤细胞对药物的响应，并且对于多种耐药性分子机制综合性的理解也将有助于找到更为准确合理的分子标志从而指导个性化治疗。

miRNA是重要的转录后调控因子，能够参与到众多的生物学过程当中，其中也包括肿瘤发生。应用miRNA作为未来的一种肿瘤治疗手段具有很多优势，其中最为重要的是，miRNA能够同时抑制多条信号通路来实现其生物学功能。因此，肿瘤细胞复杂而冗余的耐药性通路有望通过miRNA的应用来得以控制。那么是否存在调控肿瘤耐药性的关键miRNA呢？为了寻找这样的miRNA，我们认为下面四条标准是必不可少的：首先，它们需要增强肿瘤细胞对多种药物的敏感性，以便解决临床上观察到的多药耐药性现象；其次，它们可以调控多条关键的耐药性信号通路，避免因耐药性信号通路的冗余而造成的治疗失败；再次，它们在肿瘤中要存在遗传学或表观遗传学的变化，而在正常组织中则不存在相应的变化，以便在治疗过程中可以避免对正常细胞的伤害；最后，这些关键miRNA下游执行功能的重要基因要能成为分子标志物来指导个性化治疗。

事实上目前已经有一些文献报道了miRNA与肿瘤耐药性的关系。例如，在肝癌中，miR-221/222能通过靶向抑癌基因PTEN和TIMP3来诱导肿瘤细胞对TRAIL的耐受性，miR-199a-3p能通过抑制mTOR和c-Met增强肿瘤细胞对多柔比星的敏感性。这些研究为阐释miRNA与耐药性的关系奠定了基础，但是到目前为止，尤其是在肝癌和肾癌的研究中，还没有文章系统地分析过在人类众多的miRNA当中，哪些是调控耐药性的关键因子，也不清楚如何利用miRNA进行个性化治疗。

因此，本领域迫切需要寻找能够增强肿瘤细胞对化疗药物敏感性的方法，并开发相应的治疗药物。

发明内容

本发明的目的就是寻找提高肿瘤细胞对抗肿瘤药物敏感性的关键miRNA。

本发明的第一方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物包括药学上可接受的载体和有效量的选自下组的一种或多种活性成分：

(a).miRNA-27b家族的微小RNA，所述miRNA-27b家族的微小RNA包括：miRNA-27b或经修饰的miRNA-27b衍生物；或核心序列为5’ucacagu3’、长度为18-26nt、功能与miRNA-27b相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；

(b).前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miRNA-27b；

(c).多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；

(d).表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA-27b、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；

(e).(a)中所述的微小RNA的激动剂。

在另一优选例中，(a)中所述的核心序列指微小RNA第2-8位的核苷酸序列；和/或所述的“功能与miRNA-27b相同或基本相同”是指保留了miRNA-27b的≥40%，且≤500%的增强肿瘤细胞对药物敏感性的功能。

在另一优选例中，所述的miRNA-27b的序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述的药物组合物还包括任选的抗肿瘤药物。

在另一优选例中，所述的抗肿瘤药物包括：化疗剂、多靶点激酶抑制剂。

在另一优选例中，所述的化疗剂包括(但不限于)：多柔比星(Doxorubicin)、表柔比星(Epirubicin)、依托泊甙(Etoposide)、顺铂(Cisplatin)。

在另一优选例中，所述的多靶点激酶抑制剂包括(但不限于)索拉菲尼(Sorafenib)、吉非替尼(Gefitinib)。

在另一优选例中，所述的经修饰的miRNA衍生物，其修饰选自下组的一种或多种修饰形式：核苷酸的糖基修饰、核苷酸之间连接方式的修饰、胆固醇修饰、锁核苷酸修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、烃基修饰、和核酸修饰。

在另一优选例中，所述的核苷酸的糖基修饰包括2-O-甲基的糖基修饰、2-O-甲氧乙酯的糖基修饰、2-O-烷基的糖基修饰、2-氟代的糖基修饰、糖环修饰、锁核苷酸修饰；和/或

所述的核苷酸之间连接方式的修饰包括硫代磷酸修饰、磷酸烷基化修饰；和/或

所述的核酸修饰包括“TT”修饰。

在另一优选例中，(a)中所述经修饰的miRNA衍生物是具有式I所示结构的化合物单体或其多聚体：

(X)n-(Y)m

式I，

在式I中，

各X为(a)中所述的微小RNA；

各Y独立地为促进微小RNA施药稳定性的修饰物；

Y连接于X的左侧、右侧或中间；

n为1-100的(较佳地1-20)正整数(较佳地n为1、2、3、4或5)；

m为1-1000的(较佳地1-200)正整数；

各“-”表示接头、化学键、或共价键。

在另一优选例中，所述的接头是长度为1-10个碱基的核酸序列。

在另一优选例中，所述的Y包括(但不限于)胆固醇、类固醇、甾醇、醇、有机酸、脂肪酸、酯、单糖、多糖、氨基酸、多肽、单核苷酸、多核苷酸。

在另一优选例中，(b)所述的前体miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

在另一优选例中，(c)中所述的多核苷酸具有式II所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向

式II，

式II中，

Seq_正向为能在宿主中被加工成所述的微小RNA核苷酸序列；

Seq_反向为与Seq_正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

并且式II所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：

式III，

式III中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

在另一优选例中，(d)中所述的表达载体包括：病毒载体和非病毒载体。

在另一优选例中，(e)中所述miRNA-27b的激动剂选自下组：促进miRNA-27b表达的物质、提高miRNA-27b活性的物质。

在另一优选例中，所述的药物组合物还含有选自下组的一种或多种物质：

抑制CYP1B1表达或活性的CYP1B1抑制剂；

促进p53表达或活性的p53促效剂。

在另一优选例中，所述的药学上可接受的载体选自下组：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。

在另一优选例中，所述药物组合物用于制备增强肿瘤细胞对药物敏感性、或预防或治疗肿瘤(尤其是耐药性肿瘤)。

本发明第二方面，提供了一种活性成分的用途，其中，所述的活性成分选自下组：

(a).miRNA-27b家族的微小RNA，所述miRNA-27b家族的微小RNA包括：miRNA-27b或经修饰的miRNA-27b衍生物；或核心序列为5’ucacagu3’、长度为18-26nt、功能与miRNA-27b相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；

(b).前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miRNA-27b；

(c).多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；

(d).表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA-27b、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；

(e).(a)中所述的微小RNA的激动剂；

所述活性成分用于制备增强肿瘤细胞对药物敏感性的药物、或制备预防或治疗肿瘤(尤其是耐药性肿瘤)的药物。

在另一优选例中，所述的肿瘤选自下组：肺癌、肝癌、肾癌、胃癌、肠癌、、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌。

本发明第三方面，提供了一种筛选用于提高肿瘤细胞对药物敏感性的候选药物的方法，包括步骤：

(a)将候选物质施用于测试组的细胞或动物，并测定施用后所述测试组中miRNA-27b的表达水平；

(b)将测试组的miRNA-27b与对照组的miRNA-27b的表达水平进行比较，所述对照组中未施用所述候选物质；

其中，当测试组的miRNA-27b的表达水平显著高于对照组的miRNA-27b的表达水平时，则表明该候选物质是用于提高肿瘤细胞对药物敏感性的候选药物。

在另一优选例中，所述的“显著高于”是指测试组的miRNA-27b的表达水平是对照组的miRNA-27b的表达水平1.5倍以上(如1.5-5倍，较佳地1.5-3倍)。

在另一优选例中，步骤(b)还包括测定对野生型P53基因的表达促进作用；和/或测定对CYP1B1基因的表达抑制作用。

在另一优选例中，所述对野生型P53基因的表达促进作用指测试组的P53基因表达水平是对照组的P53基因表达水平1.5倍以上(如1.5-5倍，较佳地1.5-3倍)。

在另一优选例中，所述对CYP1B1基因的表达抑制作用指测试组的CYP1B1基因表达水平是对照组的CYP1B1基因表达水平0.5倍以下(如0.01-0.5倍，较佳地0.1-0.25倍)。

本发明第四方面，提供了一种微小RNA即miRNA-27b的用途，用于制备进行肿瘤预后和/或判断肿瘤是否耐药的试剂或试剂盒；其中，所述的试剂盒中包括以下说明：

(i)若检测对象的miRNA-27b的表达量显著低于正常水平，则说明该检测对象的肿瘤预后差和/或该检测对象肿瘤耐药可能性大；

(ii)若检测对象的miRNA-27b的表达量正常或显著高于正常水平，则说明该检测对象的肿瘤预后好和/或该检测对象肿瘤耐药可能性小。

在另一优选例中，所述的预后差指所述检测对象的生存期低于同类肿瘤患者的平均生存期。

在另一优选例中，所述的预后好指所述检测对象的生存期高于同类肿瘤患者的平均生存期。

在另一优选例中，所述的检测对象包括肿瘤患者。

在另一优选例中，所述的试剂包括探针、芯片、引物。

本发明第五方面，提供了一种miRNA-27b的用途，用于制备P53的激活剂或用于制备CYP1B1的抑制剂。

本发明第六方面，提供了一种检测或判断肿瘤预后或肿瘤是否耐药的方法，包括以下步骤：

(a)检测肿瘤患者或肿瘤样品的miRNA-27b的表达量；

(b)将(a)中的检测结果与对照组或对照值进行比较；

其中，当肿瘤患者或肿瘤样品的miRNA-27b的表达量显著低于对照组或对照值，则表明该肿瘤患者预后差或该肿瘤耐药性可能大。

本发明第七方面，提供了一种预防或治疗肿瘤耐药的方法，向需要的对象施用安全有效量的本发明第一方面所述的药物组合物。

在另一优选例中，所述的预防或治疗肿瘤耐药的方法还包括在抗肿瘤药存在的条件下，向需要的对象施用安全有效量的本发明第一方面所述的药物组合物。

本发明第八方面，提供了一种判断肿瘤患者是否适合使用如本发明第一方面所述的药物组合物以预防或治疗肿瘤耐药的方法，包括步骤：

(a)测定肿瘤患者P53是否为野生型或测定CYP1B1的表达量；

(b)将(a)中的测定结果与正常人群相比较；

其中，若P53为野生型或CYP1B1的表达量显著高于正常人群，则表明该肿瘤患者适合使用如本发明第一方面所述的药物组合物以预防或治疗肿瘤耐药。

应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

下列附图用于说明本发明的具体实施方案，而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。

图1显示了通过高通量筛选寻找增强药物敏感性的miRNA

图1a显示了高通量筛选流程图。将HepG2细胞铺到96孔板中，12小时后转染miRNA。转染48小时后加0.1μM的多柔比星(doxorubicin)处理3天，相对于不做处理的对照组，这个浓度的多柔比星能在3天内杀死25%的细胞。利用针对MRP1的siRNA作为阳性对照。每个miRNA对多柔比星敏感性的影响用细胞存活率表示。

图1b显示了Z-score(Z-分数)的分布图。图中每一个点代表一个miRNA的Z-score值。将Z≤-1.65or Z≥1.65分别作为筛选能够增加或降低药物敏感性的阈值(P<0.1)。

图1c显示了验证初筛中能够增强药物敏感性的miRNA。33个初筛得到的miRNA中，相对于MRP1的敲低，有22个能够显著地提高对多柔比星的敏感性(P<0.05)。

图1d-e为构建miRNA-信号通路网络图。图1d通过靶基因预测(Targetscan)每个miRNA的靶基因，然后利用KEGG分析每个miRNA的靶基因所富集的pathway。图1e根据miRNAs和他们所靶向的信号通路之间的相互作用关系作图。

图2显示了miR-27b能够在体外和体内增强对药物的敏感性

图2a利用miR-27b mimics(图2a)增加或利用miR-27b抑制剂(图2b)降低miR-27b的表达量后，检测细胞对不同浓度多柔比星的响应。

图2c显示了miR-27b体内原位成瘤实验。HepG2和matrigel等体积混合，原位注射到免疫缺陷小鼠的体内。3周后在肿瘤中过表达miR-27b，随后进行多柔比星给药，每周一次，持续3次。

图2d-e显示了3周后取下肿瘤并测量肿瘤大小(n=5)。

图2f-m显示了在其他肿瘤细胞中检测过表达miR-27b后能够增强细胞对多柔比星的响应，包括3个肝癌细胞系SNU-182,SNU-739和Tong(图2f-h)，4个肾癌细胞系786-O,769-P,ACHN和Caki-1(i-l)和一个宫颈癌细胞系Hela(图2m)。

图2n-r显示了miR-27b能增强HepG2对不同药物的敏感性。

图3显示了miR-27b表达量的降低与病人对药物的响应差存在相关性

图3a，b显示了miR-27b的表达量在肝癌(a，n=49，P<0.001)和肾癌样本(b，n=66，p<0.001)中相对于癌旁组织发生下调。

图3c，d显示了在肝癌和肾癌中，miR-27b位点发生缺失。相对log2拷贝数比值小于<-0.1代表缺失。

图3e，f显示了miR-27b的启动子区域在肾癌中(f，n=24)发生了超甲基化，但是在肝癌中(图3e，n=41)没有发生超甲基化。利用中位β值来计算miR-27b的启动子区域甲基化水平。

图3g显示了miR-27b高表达的病人可以预测对药物的响应好。利用Kaplan-Meier方法计算用过药的肾癌病人的生存曲线。所有数据都来源于TCGA数据库。

图4显示了miR-27b通过激活p53增强药物的敏感性

图4a显示了miR-27b能增强多柔比星诱导的S期阻滞。

图4b-c显示了cmiR-27b增强多柔比星诱导的凋亡(图4b)和坏死(图4c)。

图4d显示排名前8位的受miR-27b调控的信号通路。细胞首先转染miR-27b或scrambled miRNA阴性对照，然后加多柔比星处理，比较过表达miR-27b后表达发生变化的基因。

图4e-f显示了利用western检测HepG2(图4e)和ACHN(图4f)中磷酸化的p53和总的p53水平。

图4g-h通过shRNA敲低p53可以在HepG2和ACHN细胞中逆转由miR-27b所引起的增敏表型。

图4i显示了寻找miR-27b靶基因的策略。通过microarray分析找到152个在过表达miR-27b后发生大于2.5倍下调的基因。在Targetscan，Pictar和miRanda中预测miR-27b的靶基因，其中有321个基因能够同时被这三种预测方法预测到。比较microarray和预测结果的交集发现有3个可能的miR-27b靶基因，分别是CCNG1，CALD1和PLXND1。

图4j显示了miR-27b能够降低CCNG1的mRNA水平。

图4k显示了利用siRNA敲低CCNG1能够增强磷酸化及总的p53蛋白水平。

图4l显示了miR-27b能够降低带有CCNG1野生型3'UTR的荧光素酶活性，不能降低带有CCNG13'UTR突变的荧光素酶活性。

图4m，n显示了过表达CCNG1能够减弱由miR-27b诱导的增敏表型。

图5显示了miR-27b通过降低CYP1B1的蛋白水平增强肿瘤细胞对药物的敏感性

图5a显示了细胞在过表达miR-27b后加多柔比星处理，检测CYP1B1蛋白水平的变化。

图5b显示了miR-27b能够降低带有CYP1B1野生型3'UTR的荧光素酶活性，不能降低带有CYP1B13'UTR突变的荧光素酶活性。

图5c-d显示了利用siRNA敲低CYP1B1能够增强p53突变型细胞系SNU182和786-O对多柔比星的敏感性。

图5e-f显示了过表达CYP1B1能够减弱由miR-27b诱导的增敏表型。

图5g显示了miR-27b调控药物响应机制的示意图。

图6显示了利用p53和CYP1B1基因标签对病人进行分类来预测适合采用miR-27b治疗的病人群体

图6a显示了根据p53和CYP1B1的基因标签将病人分类。拥有p53野生型或CYP1B1高表达的病人被分为组一。同时拥有p53突变型和CYP1B1低表达的病人被分为组二。

图6b-c显示了将用过细胞毒性药物或靶向性药物的肾癌病人根据p53和CYP1B1基因标签分成组一和组二。在组一病人中，miR-27b高表达的病人相对低表达的病人有更长的生存时间。在组二病人中，miR-27b的表达量不能决定病人的存活时间。

图6d-e显示了将用过细胞毒性药物或靶向性药物的肺癌病人根据p53和CYP1B1基因标签分成组一和组二。在组一病人中，miR-27b高表达的病人相对低表达的病人有更长的生存时间。在组二病人中，miR-27b的表达量不能决定病人的存活时间。

图6f-g显示了将用过细胞毒性药物或靶向性药物的头颈癌病人根据p53和CYP1B1基因标签分成组一和组二。在组一病人中，miR-27b高表达的病人相对低表达的病人有更长的生存时间。在组二病人中，miR-27b的表达量不能决定病人的存活时间。所有原始数据都来源于TCGA数据库。

图7.建立并优化高通量筛选系统

图7a显示了敲低MRP1能够增强细胞对药物的敏感性，将MRP1的siRNA作为阳性对照。96孔板铺不同数量的HepG2细胞，找到合适的细胞数。

图7b显示了检测MRP1siRNA能够敲低MRP1的持续时间。

图7c显示了敲低MRP1能够增强HepG2对多柔比星的敏感性。

图7d显示了筛选的重复性验证。

图7e显示了Z-scores服从正太分布。

图8.miR-27b通过激活p53增强肿瘤细胞对药物的敏感性

图8a显示了利用多柔比星自身的荧光检测细胞中多柔比星的浓度。

图8b显示了miR-27b能够增强细胞在受到多柔比星刺激后剪切的半胱氨酸天冬酶-3(cleaved caspase-3)的水平。

图8c显示了p53信号通路相关基因的表达变化。

图8d-e显示了p53的shRNA能够明显的降低HepG2及ACHN细胞中p53的mRNA水平。

图9.miR-27b通过直接靶向CCNG1来调节p53活性

图9a-b显示了miR-27b能够降低CALD1和PLXND1的mRNA水平。

图9c-e显示了针对CCNG1，CALD1和PLXND1的siRNA能够显著地降低这些基因的mRNA水平。

图9f-g显示了敲低CALD1或PLXND1后检测磷酸化和总的p53蛋白含量。

图10miR-27b通过下调CCNG1增强肿瘤细胞的药物敏感性

图10a显示了CCNG1的siRNA能够敲低CCNG1的mRNA水平。

图10b-c显示了敲低CCNG1能够增强HepG2和ACHN对药物的敏感性。

图10d-e显示了利用q-PCR检测CCNG1在HepG2和ACHN细胞中的过表达情况。

图11在p53突变的细胞系中miR-27b通过不依赖于CCNG1的方式调控药物敏感性

图11a-b显示了通过q-PCR方法可以检测到CCNG1的mRNA水平在SNU-182和786-O里下调。

图11c-d显示了抑制CCNG1并不能增强SNU-182和786-O细胞对多柔比星的敏感性。

图12.miR-27b还可以通过下调CYP1B1来增强药物敏感性

图12a显示了通过q-PCR方法在HepG2细胞里检测过表达miR-27b以后CYP1B1的mRNA水平变化。

图12b-c显示了利用CYP1B1的siRNA可以有效地在SNU-182(图12b)显示了和786-O(图12c)显示了细胞里降低CYP1B1的mRNA水平。

图12d显示了利用siRNA沉默CYP1B1可以增强HepG2细胞的药物敏感性。

图12e显示了在miR-27b过表达的HepG2细胞里外源转入CYP1B1，增敏表型会得以恢复。

图13.建立和验证CYP1B1基因标签

图13a显示了CYP1B1基因标签的构建过程。我们利用了14个HumanProtein Atlas(HPA)和the Cancer Cell Line Encyclopedia(CCLE)共有的细胞系，从HPA可以得到CYP1B1蛋白表达量，从CCLE可以得到全基因组基因表达谱。我们首先将这14个细胞系分成CYP1B1高表达和CYP1B1低表达两组，然后利用GenePattern筛选出两组细胞的差异最显著的57个基因作为CYP1B1基因标签。

图13b显示了利用CYP1B1基因标签进行聚类分析可以把上述14个细胞系准确地分为CYP1B1高表达和低表达两组。

图13c显示了为了评估CYP1B1标签的可靠性，我们从CCLE中选用了64个具有基因表达谱的肝癌和肾癌细胞系，利用CYP1B1标签进行聚类分析，将这些细胞系分成高表达(蓝色)和低表达(黑色)两组。图13d显示了在上述64个细胞系中，通过对实验室拥有的其中6个细胞系的CYP1B1水平进行western检测，发现CYP1B1的表达情况与预测结果一致。

图14.利用p53和CYP1B1基因标签对肿瘤病人进行分类

图14a-b显示了根据p53标签(图14a)和CYP1B1标签(图14b)，对TCGA数据库中60个使用过化疗药物或者多激酶抑制剂进行治疗的肾癌病人进行分层聚类(hierarchical clustering)。

图14c-d显示了根据p53标签(图14c)和CYP1B1标签(图14d)，对TCGA数据库中34个使用过化疗药物或者多激酶抑制剂进行治疗的肺癌病人进行分层聚类。

图14e-f显示了根据p53标签(图14e)和CYP1B1标签(图14f)，对TCGA数据库中92个使用过化疗药物或者多激酶抑制剂进行治疗的头颈癌病人进行分层聚类。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，筛选了大量microRNA后，首次发现miR-27b在肿瘤组织中普遍下调，且导入miR-27b家族成员能提高肿瘤对化疗药物的敏感性；对于已经发病的肿瘤，导入miR-27b家族成员能显著改善肿瘤对抗肿瘤药的耐药性。本发明还发现miR-27b以CYP1B1等基因为靶点；促进p53表达或抑制CYP1B1的表达可抑制肿瘤的耐药性。在此基础上完成了本发明。

miRNA及其前体

本发明提供了一类涉及肿瘤耐药的miRNA。如本文所用，所述的“miRNA”是指一类RNA分子，从可形成miRNA前体的转录物加工而来。成熟的miRNA通常具有18-26个核苷酸(nt)(更特别的约19-22nt)，也不排除具有其它数目核苷酸的miRNA分子。miRNA通常可被Northern印迹检测到。

人来源的miRNA可被从人细胞中分离。如本文所用，“分离的”是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其他物质中分开，则为分离纯化的。

miRNA可从前体miRNA(Precursor miRNA，Pre-miRNA)加工而来，所述的前体miRNA可折叠成一种稳定的茎环(发夹)结构，所述的茎环结构长度一般在50-100bp之间。所述的前体miRNA可折叠成稳定的茎环结构，茎环结构的茎部两侧包含基本上互补的两条序列。所述的前体miRNA可以是天然的或是人工合成的。

前体miRNA可被剪切生成miRNA，所述的miRNA可与编码基因的mRNA的至少一部分序列基本上互补。如本文所用，“基本上互补”是指核苷酸的序列是足够互补的，可以以一种可预见的方式发生相互作用，如形成二级结构(如茎环结构)。通常，两条“基本上互补”的核苷酸序列互相之间至少有70%的核苷酸是互补的；优选的，至少有80%的核苷酸是互补的；更优选的，至少有90%的核苷酸是互补的；进一步优选的，至少有95%的核苷酸是互补的；如98%、99%或100%。一般地，两条足够互补的分子之间可以具有最多40个不匹配的核苷酸；优选的，具有最多30个不匹配的核苷酸；更优选的，具有最多20个不匹配的核苷酸；进一步优选的，具有最多10个不匹配的核苷酸，如具有1、2、3、4、5、8、11个不匹配的核苷酸。

如本文所用，“茎环”结构也被称作“发夹”结构，是指一种核苷酸分子，其可形成一种包括双链区域(茎部)的二级结构，所述的双链区域由该核苷酸分子的两个区域(位于同一分子上)形成，两个区域分列双链部分的两侧；其还包括至少一个“环”结构，包括非互补的核苷酸分子，即单链区域。即使该核苷酸分子的两个区域不是完全互补的，核苷酸的双链部分也可保持双链状态。例如，插入、缺失、取代等可导致一个小区域的不互补或该小区域自身形成茎环结构或其它形式的二级结构，然而，该两个区域仍可基本上互补，并在可预见的方式中发生相互作用，形成茎环结构的双链区域。茎环结构是本领域技术人员所熟知的，通常在获得了一条具有一级结构的核苷酸序列的核酸后，本领域技术人员能够确定该核酸是否能形成茎环结构。

本发明所述的miRNA是指：miRNA-27b家族的微小RNA，所述miRNA-27b家族的微小RNA包括：miRNA-27b或经修饰的miRNA-27b衍生物、和核心序列为ucacagu、长度为18-26nt、功能与miRNA-27b相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物。

在本发明的一个优选例中，miRNA-27b的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示。

在另一优选例中，所述的微小RNA来源于人或非人哺乳动物；较佳地所述的非人哺乳动物为大鼠、小鼠，鼠和人的23家族序列完全一致。核心序列指微小RNA第2-8位的核苷酸序列。所述的“功能与miRNA-27b相同或基本相同”是指保留了miRNA-27b的≥40%、≥50%、≥60%、≥70%、≥80%、≥90%的提高肿瘤对抗肿瘤药敏感性的功能。

本发明还包括miRNA变体和衍生物。此外，广义上的miRNA衍生物也可包括miRNA变体。本领域的普通技术人员可以使用通用的方法对miRNA-27b进行修饰，修饰方式包括(但不限于)：甲基化修饰、烃基修饰、糖基化修饰(如2-甲氧基-糖基修饰、烃基-糖基修饰、糖环修饰等)、核酸化修饰、肽段修饰、脂类修饰、卤素修饰、核酸修饰(如“TT”修饰)等。

多核苷酸构建物

根据本发明所提供的miRNA序列，可设计出在被导入后可被加工成可影响相应的mRNA表达的miRNA的多核苷酸构建物，也即所述多核苷酸构建物能够在体内上调相应的miRNA的量。因此，本发明提供了一种分离的多核苷酸(构建物)，所述的多核苷酸(构建物)可被人细胞转录成前体miRNA，所述的前体miRNA可被人细胞剪切且表达成所述的miRNA。

作为本发明的一种优选方式，所述的多核苷酸构建物含有式II所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向

式II

式II中，

Seq_正向为可在细胞中表达成所述的miRNA-27b的核苷酸序列，Seq_反向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；或者，Seq_反向为可在细胞中表达成所述的miRNA的核苷酸序列，Seq_正向为与Seq_正向基本上互补的核苷酸序列；X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

式I所示的结构在转入细胞后，形成式III所示的二级结构：

式III

式III中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述；

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

通常，所述的多核苷酸构建物位于表达载体上。因此，本发明还包括一种载体，它含有所述的miRNA，或所述的多核苷酸构建物。所述的表达载体通常还含有启动子、复制起点和/或标记基因等。本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如卡拉霉素、庆大霉素、潮霉素、氨苄青霉素抗性。

P53

p53基因是一个抑癌基因(Genbank id:7157)，与细胞周期调控、DNA修复、细胞分化、细胞凋亡等重要的生物学功能有关。p53基因分为野生型和突变型两种，p53基因的突变(缺失)与肿瘤的发生发展、转移、复发及不良预后密切相关。

CYP1B1

即细胞色素P4501B1(基因id：1545，其蛋白Genbank登录号：NP_000095)，是一类超基因家族酶系，参与多种内源性和外源性化合物的氧化和解毒代谢，CYP1B1是CYP1家族中一个相对较新的成员。CYP1B1在正常组织中低表达，而在许多肿瘤组织中则特异性高表达，可激活和代谢产生致癌物质。

药物组合物

本发明提供了一种药物组合物，包括药学上可接受的载体或有效量的选自下组的一种或多种活性成分：(a)miRNA-27b家族的微小RNA，所述miRNA-27b家族的微小RNA包括：miRNA-27b或经修饰的miRNA-27b衍生物、和核心序列为5’ucacagu3’、长度为18-26nt、功能与miRNA-27b相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；(b)前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miRNA-27b；(c)多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；(d)表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA-27b、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；(e)(a)中所述的微小RNA的激动剂。

在本发明的另一优选例中，所述的miRNA-27b来源于人或非人哺乳动物。人源和鼠源的miRNA-27b成熟序列完全相同。

在本发明的另一优选例中，所述的经修饰的miRNA衍生物是具有式I所示结构的化合物单体或其多聚体：

(X)n-(Y)m

式I

在式I中，各X为(a)中所述的微小RNA；各Y独立地为促进微小RNA施药稳定性的修饰物；n为1-100的(较佳地1-20)正整数(较佳地n为1、2、3、4或5)；m为1-1000的(较佳地1-200)正整数；各“-”表示接头、化学键、或共价键；在另一优选例中，所述的接头是长度为1-10个碱基的核酸序列。所述的Y包括(但不限于)胆固醇、类固醇、甾醇、醇、有机酸、脂肪酸、酯、单糖、多糖、氨基酸、多肽、单核苷酸、多核苷酸。

在本发明的另一优选例中，(c)中所述的多核苷酸具有式II所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向

式II

式II中，Seq正向为能在宿主中被加工成miRNA-27b的核苷酸序列；Seq反向为与Seq正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；X为位于Seq正向和Seq反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq正向和Seq反向不互补；并且式II所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：

式III，

式III中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，||表示在Seq_正向和Seq_{反 向}之间形成的碱基互补配对关系。

在本发明的另一优选例中，所述的前体miRNA的序列如SEQ ID NO.:2所示。

如本文所用，术语“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量的本发明的活性成分以及药学上可接受的载体。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。通常药物制剂应与给药方式相匹配，本发明的药物组合物的剂型为注射剂、口服制剂(片剂、胶囊、口服液)、透皮剂、缓释剂。例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。所述的药物组合物宜在无菌条件下制造。

本发明所述的活性成分的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的活性成分的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。通常，当本发明的活性成分每天以约0.00001mg-50mg/kg动物体重(较佳的0.0001mg-10mg/kg动物体重)的剂量给予，能得到令人满意的效果。例如，由治疗状况的迫切要求，可每天给予若干次分开的剂量，或将剂量按比例地减少。

本发明所述的药学上可接受的载体包括(但不限于)：水、盐水、脂质体、脂质、蛋白、蛋白-抗体缀合物、肽类物质、纤维素、纳米凝胶、或其组合。载体的选择应与给药方式相匹配，这些都是本领域的普通技术人员所熟知的。

本发明还提供了所述药物组合物的用途，用于制备增强肿瘤细胞对药物敏感性的药物、或制备预防或治疗肿瘤(尤其是耐药性肿瘤)的药物，其中，所述的肿瘤选自下组：肺癌、肝癌、肾癌、胃癌、肠癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、肺癌、头颈癌。

诊断方法

本发明还提供了一种检测检测或判断肿瘤预后或肿瘤是否耐药的方法。

在一个优选例中，包括步骤：(a)检测肿瘤患者或肿瘤样品的miRNA-27b的表达量；

(b)将(a)中的检测结果与对照组或对照值进行比较；

其中，当肿瘤患者或肿瘤样品的miRNA-27b的表达量显著低于对照组或对照值，则表明该肿瘤患者预后差或该肿瘤耐药性可能大。

预防或治疗方法

本发明提供了一种预防或治疗肿瘤耐药的方法。

在一个优选例中，所述的方法包括向需要的对象施用安全有效量的本发明药物组合物。

此外，本发明还提供了一种判断肿瘤患者是否适合使用如本发明药物组合物以预防或治疗肿瘤耐药的方法，包括步骤：

(a)测定肿瘤患者P53是否为野生型或测定CYP1B1的表达量；

(b)将(a)中的测定结果与正常人群相比较；

其中，若P53为野生型或CYP1B1的表达量显著高于正常人群，则表明该肿瘤患者适合使用如本发明药物组合物以预防或治疗肿瘤耐药。

本发明的主要优点包括：

(1)本发明提供了耐药肿瘤中存在着一类普遍下调的miR-27b，导入miR-27b家族，包括miR-27b，可以预防和治疗肿瘤(尤其是耐药肿瘤)疾病；

(2)miR-27b可以作用于肿瘤耐药通路中的很多相关基因，如促进P53基因(尤其是通过抑制CCNG1)、抑制CYP1B1基因的表达，从而提高各类肿瘤对药物的敏感性。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:ColdSpring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

材料与方法

细胞培养

癌细胞系HepG2,HeLa,Tong和HEK-293FT用DMEM(HyClone)培养基培养。SNU-182,SNU-739,769-P,786-O用1640(HyClone)培养基培养。ACHN细胞用MEM(Gibco)培养基培养。Caki-1细胞用McCoy's5A(HyClone)培养基培养.。所有的培养基都加10%的血清(HyClone)。细胞系在含有5%的CO2和37oC的培养箱中培养。(不同肿瘤细胞系分别为肝癌细胞系SNU-182(购自Korean CellLine Bank)，SNU-739(购自Korean Cell Line Bank)和Tong(见Yuh-Shan Jou，Characteristics of a cell line(Tong/HCC)established from a humanhepatocellular carcinoma)，4株肾癌细胞系786-O，769-P，ANHN和Caki-1(购自中国科学院细胞库)，以及一株子宫颈癌细胞系HeLa(购自中国科学院细胞库)。)

细胞周期分析

在6孔板的每个孔中铺2x10⁵个HepG2细胞，12小时后转染miR-27b或miRNA阴性对照。2天后用0.5μM的多柔比星处理48小时，然后换成无多柔比星的培液再培养24小时。之后用胰酶消化，PBS洗一次，用预冷的70%乙醇在4度处理30分钟。PBS洗3次，细胞用0.5ml含有50μg/ml propidium iodide和20μg/ml RNase A的PBS重悬，37℃放置30分钟。样品用FACSCalibur(Becton Dickinson)(分析)细胞周期。

细胞凋亡分析

在6孔板的每个孔中铺2x105个HepG2细胞，12小时后转染miR-27b或miRNA阴性对照。2天后细胞用1μM的多柔比星处理24小时，然后换成无多柔比星的培液继续培养24小时。凋亡的细胞用Annexin V-FITC ApoptosisDetection Kit(Sigma)检测，FACSCalibur用于分析凋亡。

检测细胞坏死

96孔板每孔铺1x10⁴个HepG2细胞，12小时候转染miR-27b或miRNA阴性对照。转然后48小时换成含有0.5μM的多柔比星处理48小时。利用ELISA(Roche)试剂盒检测凋亡的细胞。

RNA抽提及实时定量PCR

利用Trizol(Invitrogen)试剂抽提细胞RNA。取1μg RNA用M-MLV ReverseTranscriptase(Promega)试剂盒进行反转合成cDNA。采取SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)进行实时定量PCR，利用ABI7500fast real-time PCR system(Applied Biosystems)检测基因表达。其中，PCR采用的引物见表1：

表1

抗体

p53(Cell Signaling,#2524,1:1000)，磷酸化p53抗体(Cell Signaling,#9284,1:1500)，cleaved caspase-3(Cell Signaling,#9664,1:500)，CYP1B1(Abcam,ab33586,1:2000)和-Actin(Sigma,A2228,1:6000)。

载体构建

将CCNG1或CYP1B1基因的开放阅读框克隆到慢病毒载体上。将CCNG1和CYP1B1的野生型和突变的seed sequence序列克隆到由带有luciferase表达基因的pcDNA3.0载体上。

慢病毒包装和感染

pCDH-CCNG1或pCDH-CYP1B1载体和包装载体psPAX2及pMD2.G用钙转法共转HEK-293FT细胞，48小时后收病毒。感染HepG2细胞时加4μg/ml Polybrene(Sigma)。

miRNA及siRNA转染

miR-27b mimics，miRNA mimics阴性对照，miR-27b inhibitor及miRNAinhibitor对照全部购于Dharmacon。用于体内实验的In Vivo Ready miR-27bmimics及miRNA阴性对照购于Ambion。针对CCNG1，CYP1B1的siRNA及阴性对照购于Ribobio。miRNA及siRNA转染试剂Lipofectamine RNAiMAX Reagent购于Invitrogen。

荧光素酶实验

12孔板每孔铺10⁵个细胞，12小时后同时共转50nM miR-27b mimics或miRNA control及带有目的基因3'UTR的荧光素报告载体。48小时后利用双荧光报告系统(promega)检测荧光素酶活性。

原位成瘤实验

3x10⁶HepG2细胞和matrigel等体积混合，原位注射到免疫缺陷小鼠最大的肝叶中。三周后利用脂质体Invivofectamine2.0(Invirogen)包裹经过化学修饰的miRNA-27b mimics(3.5mg/kg)及阴性对照miRNA mimics，通过尾静脉注射在肝中过表达miRNA-27b。两天后尾静脉注射3mg/kg的多柔比星。miRNAmimics及多柔比星连续注射3周后处死小鼠，取出肝脏，测量肿瘤大小。肿瘤的大小用以下的公式计算：肿瘤体积=a x b²/2，a代表最长边，b代表最短边。所有的动物实验都按照中科院动物管理标准进行。

Microarray分析

HeLa细胞先转染miR-27b mimics或miRNA mimics阴性对照，两天后加多柔比星处理48小时。利用Agilent Whole Human Genome Oligo Microarray(4x44K)芯片检测基因表达。通过与miRNA阴性对照比较，找到在过表达miR-27bmimics后基因表达变化超过1.5倍的基因，利用Gene Set Enrichment Analysis(GSEA,www.broadinstitute.org/gsea/)软件分析这些发生变化的基因所调控的信号通路。基因集合的P值低于10⁵被认为是有显著性的。

病人分析

所有病人的数据都来源于TCGA data portal(cancergenome.nih.gov),截止于2012年12月31日。49对肝癌样本同时拥有miRNA表达及SNP数据，其中41对样本有DNA甲基化数据。66对肾癌病人同时拥有miRNA表达量及SNP数据，其中24人拥有DNA甲基化数据。DNA拷贝数的变化通过GISTIC2.0程序计算获得。数值低于-0.1的基因区段认为是基因部分缺失，低于-1.28认为是完全缺失。DNA甲基化水平用数值表示，数值的范围从0到1，0代表完全没有甲基化，1代表完全甲基化。将miR-27b启动子区域CpG岛的甲基化读值的中位数定义为miR-27b基因的甲基化水平。

60个肾癌病人同时拥有miRNA和mRNA表达量的数据以及病人信息。所有的病人都接受过细胞毒性药物或靶向性药物的治疗。miR-27b表达量的中位数作为区分miR-27b低表达和高表达的标准。应用Kaplan-Meier方法计算60个用过药的肾癌病人的总体生存曲线，利用log-tank test计算显著性差异。

p53及CYP1B1标签构建

以前发表的p53标签包含32个基因，这32个基因可以显著的区别癌症样本中携带的是野生型p53还是突变型p53。在从TCGA获得的病人mRNAsequencing表达量数据中提取这32个基因的表达量，选取在一半以上病人样本中读值大于20的基因用来计算p53的突变情况。

为了构建CYP1B1的标签用来区分临床样本中CYP1B1的蛋白表达量。我们首先从The Human Protein Atlas(www.proteinatlas.org)数据库中获得14个细胞系CYP1B1的蛋白水平的表达量。从the Cancer Cell Line Encyclopedia(www.broadinstitute.org/ccle/home)获得这14个细胞mRNA表达量的数据。首先根据根据这14个细胞系CYP1B1蛋白的表达水平将这14个细胞系分成两组，每组7个细胞。然后利用GenePattern中的ComparativeMarkerSelectionmodule计算这两组细胞中的差异表达基因。双尾的t-test被用来计算差异表达基因的显著性，根据p值对差异表达的基因进行排序。其中排名前57个差异表达明显的基因可以很好的区分细胞系中CYP1B1蛋白的表达水平，我们把这57个基因作为CYP1B1的标签。

为了验证CYP1B1的标签，我们在CCLE数据库中选择了所有64个有mRNA表达的数据的肝癌和肾癌的细胞系。然后根据CYP1B1的标签利用Hierarchicalclustering算法将这64个细胞系区分成CYP1B1蛋白高表达和低表达两组。我们实验室有其中的6株细胞，通过western验证CYP1B1标签预测的CYP1B1表达量是正确的。

根据p53和CYP1B1标签将病人分类

我们从TCGA中获取了60个肾癌，34个肺癌和92个头颈癌病人的全部信息，这些样本有mRNA和miRNA的表达量数据，所有病人都有过用药经历。根据p53和CYP1B1的标签基因，利用GenePatten中的HierarchicalClusteringalgorithm算法，预测p53是否有功能及CYP1B1蛋白表达量，将病人分类。首先对基因表达量进行归一化，然后进行mean centered处理。通过计算每个病人的Pearson相关性表示病人之间的距离。Hierarchical clustering的具体算法是Pairwise average linkage。

将拥有野生型p53或CYP1B1蛋白高表达的病人分为组1，其他同时拥有p53功能缺失或CYP1B1低表达的病人分为组2。然后利用Kaplan-Meier及log-rank test计算这两组病人的总体生存曲线及显著性差异。

统计学分析

所有统计学分析都是利用GraphPad Prism5软件计算的。所有药物响应曲线的显著性都是通过F-test计算的。将双尾p<0，05定为显著性差异。计算病人生存曲线时用到的都是双尾的log-rank test。所有成对样品之间的比较用到的都是成对t-test。所有用到的误差都是±s.e.m。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。

实施例1能够增强药物敏感性的miRNA的筛选

方法：通过高通量筛选寻找增强药物敏感性的miRNA。筛选文库包含828个合成的人源miRNA mimics。

在96孔板中铺1x10⁴个肝癌细胞系HepG2细胞(购自ATCC)，24小时后用转染试剂Lipofectamine RNAiMAX(Invitrogen)将miRNA mimics转染到细胞中。每种miRNA转染两个孔。其中一个孔在转然后48小时后换成0.1μM多柔比星培养，另一个孔不做任何处理。3天后用CellTiter-Glo LuminescentCell Viability Assay(Promega)测细胞存活数。

每个miRNA决定的细胞存活率定义为：加多柔比星处理后的细胞数/未做处理的细胞数。

归一化的细胞存活率定义为：每个miRNA决定的细胞存活率/阴性对照miRNA决定的细胞存活率。

Z-score被用来计算每个miRNA决定的细胞存活率相对其他miRNA的作用强度。Z-score=(x–μ)/σ，x代表每个miRNA决定的的细胞存活率，μ代表所有miRNA决定的细胞存活率的平均值，σ代表所有miRNA决定的细胞存活率的标准差。

结果：如图1a和图7a-c所示。在筛选系统中，选用了肝癌细胞系HepG2和化疗药物多柔比星，因为HepG2是一个广泛用于细胞毒性研究的细胞模型，而已有文章报道肿瘤细胞对多柔比星的敏感性往往与对其他药物的敏感性呈正相关，因此利用HepG2和多柔比星作为代表，可预测肿瘤细胞对多种不同抗肿瘤药物的敏感性。

随机选取了146个miRNA进行了两次独立的重复筛选，得到了0.67的皮尔森相关系数，表明我们采用的筛选系统是稳定的(图7d)。

Z-score用于衡量每一个miRNA对于调控药物敏感性作用的强弱。如图图7e所示，Z-score近似服从标准正态分布。

选取90%置信区间，有33个miRNA的Z-score值低于-1.65(P<0.1)，它们能够增强HepG2对于多柔比星的敏感性，而另外55个miRNAs的作用正好相反，它们能够增强HepG2对于多柔比星的耐受性(Z-score>1.65,P<0.1,如图1b)。

此外，为了排除假阳性，对以上33个miRNA进行了重复验证，其中有22个miRNA能够再次被验证出来增强HepG2对多柔比星的敏感性，如图1c所示。

实施例2对实施例1中获得的增强药物敏感性的miRNA进行筛选，并获得关键miRNA

方法：采用Targetscan预测每一个miRNA的靶基因，如图1d所示，然后利用Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)分析每一个miRNA有可能靶向的信号通路。最后利用Cytoscape软件将miRNA与其所靶向的信号通路绘制成图，如图1e所示。

结果：其中有11个miRNA能够协同调控一些共同的信号通路，这些信号通路与细胞增殖、凋亡、代谢密切相关。

其中，miR-27b连接了数量最多的通路并且位于“miRNA-信号通路”调控网络的最核心位置，因此，实验推断miR-27b有可能通过调控下游多种关键信号通路来增强肿瘤细胞对药物的敏感性。

实施例3miR-27b能降低化疗药的IC50

在96孔板中铺1x10⁴个HepG2细胞，12小时后用转染试剂LipofectamineRNAiMAX(Invitrogen)将miRNA mimics(终浓度50nM)转染到细胞中。转染48小时后换成含不同浓度多柔比星的培液进行培养。3天后用CellTiter-GloLuminescent Cell Viability Assay(Promega)测细胞存活数。

为了更仔细地分析miR-27b的增敏效应，绘制了多柔比星的剂量-效应曲线。过表达miR-27b显著地增强了HepG2细胞对多柔比星的敏感性，IC50从0.3μM下降到0.046μM，达到6.5倍的降低(图2a)。此外，使用miR-27b抑制剂降低内源miR-27b的表达引起IC₅₀值上升1.7倍(图2b)。

实施例4miR-27b对于肿瘤病人对药物敏感性的作用

4.1肝癌和肾癌样本中miR-27b表达量下降

采用公用数据库The Cancer Genome Atlas(TCGA)的数据，分析在肝癌和肾癌中miR-27b的表达水平。

结果如图3a，b所示可见：在49个成对的肝癌样本和66个成对的肾癌样本中，miR-27b的表达量都在肿瘤里显著下降。

4.2对5.1中miR-27b表达量下降的原因分析

通过分析基因拷贝数变化，5.1中49个肝癌样本中的18个，以及66个肾癌样本中的27个，都表现出miR-27b等位基因的缺失，如图3c,d所示。

其中，分别有24对肝癌样本和41对肾癌样本具有DNA甲基化数据。在肾癌中，我们发现miR-27b基因的启动子甲基化水平高于与其成对的正常组织，而在肝癌中没有发生相似的变化，如图3e,f所示。

上述结果表明基因拷贝数的缺失或启动子区域DNA高度甲基化是miR-27b表达水平下降的重要原因之一。

4.3肿瘤中miR-27b表达水平的下降造成肿瘤对抗肿瘤药物的敏感性下降

选用了TCGA中60个使用过化疗药物或者多靶点激酶抑制剂进行治疗的肾癌病人样本进行分析。

以miR-27b表达量的中位数为界限，病人被分为高表达和低表达两组。明显看得出，miR-27b低表达的病人药物响应差、存活时间短(图3g)。

结论：上述结果表明，miR-27b表达水平下降是的原因之一是基因拷贝数的缺失或启动子区域DNA高度甲基化，而肿瘤中miR-27b表达水平的下降造成肿瘤对抗肿瘤药物的敏感性下降。

实施例5miR-27b增强肝癌、肾癌、子宫颈癌细胞对多种抗肿瘤药物的敏感性

5.1测定miR-27b是否在体内增强肿瘤细胞对多柔比星的敏感性

方法：将HepG2细胞移植入免疫缺陷小鼠的肝脏，待其成瘤后，用miR-27b和多柔比星对小鼠进行联合处理。

结果：如图2c的定量PCR结果表明，经过修饰的miR-27b能够有效的被体内转染试剂(invivo fectamine)输送进入肝癌细胞(图2c)(引物如SEQ IDNO.:7、SEQ ID NO.:8、SEQ ID NO.:9所示)。单独用多柔比星或者miR-27b处理对肿瘤的生长没有明显影响，然而多柔比星和miR-27b的联合使用显著抑制了肿瘤的生长(图2d,e)。

5.2采用4.1中相同的方法，测定miR-27b是否能增强不同肿瘤细胞系对抗肿瘤药物敏感性

其中，不同肿瘤细胞系分别为肝癌细胞系SNU-182(购自Korean Cell LineBank)，SNU-739(购自Korean Cell Line Bank)和Tong(见Yuh-Shan Jou，Characteristics of a cell line(Tong/HCC)established from a humanhepatocellular carcinoma)，4株肾癌细胞系786-O，769-P，ANHN和Caki-1(购自中国科学院细胞库)，以及一株子宫颈癌细胞系HeLa(购自中国科学院细胞库)。

结果如图2f-h所示，miR-27b能增强不同肿瘤细胞系对化疗药物多柔比星的敏感性。

由此可见，miR-27b能增强不同肿瘤细胞系对抗肿瘤药物的敏感性。

5.3采用相同的方法，测定miR-27b是否能增强肿瘤细胞系对不同抗肿瘤药物敏感性

其中，不同化疗药物为表柔比星、依托泊苷和顺铂以及2种分子靶向药物索拉菲尼和吉非替尼。

结果如图2n-r所示，miR-27b能增强肝癌细胞系对多种化疗药物和靶点特异性药物的敏感性。

由此可见，miR-27b能增强肿瘤细胞系对不同抗肿瘤药物敏感性。

结论：miR-27b是一个在多种肿瘤细胞系中对多种抗肿瘤药物都具有增敏效应的miRNA。因此，高表达miR-27b的肿瘤病人对抗肿瘤药物的敏感性增强。

实施例6miR-27b增强药物敏感性的机制研究

6.1miR-27b对降低药物外排的影响：

方法：在肿瘤细胞中过表达miR-27b或表达随机序列，并将这两组细胞用多柔比星进行处理，通过对它们基因表达谱的比较。

结果：图8a可见，ABC转运蛋白家族基因和多柔比星的靶点基因拓扑异构酶IIａ并没有明显改变，且miR-27b的过表达也不改变多柔比星在细胞内的积累量。

由此可见，miR-27b并非通过降低药物外排来促进药物敏感性的。

6.2miR-27b通过对p53基因的调控

基因表达谱数据的进一步挖掘，我们发现与细胞周期转换以及细胞死亡相关的基因表达水平被显著改变，这与“miRNA-信号通路”网络中的预测出的信号通路相吻合(图1e)。

实验数据表明，miR-27b确实显著增强了多柔比星诱导的S期阻滞(图4a)、细胞凋亡和细胞坏死(图4b,c和图8b)。

在利用Gene Set Enrichment Analysis(GSEA)将过表达miR-27b后变化量超过1.5倍的基因进行功能富集分析，发现p53信号通路位居榜首(图4d和图8c)。

通过蛋白水平的检测，发现miR-27b能够在HepG2和ACHN细胞系中进一步增强多柔比星对磷酸化p53和总p53的激活程度(图4e,f)。并且在这两个p53野生型的细胞系中，p53的敲除能够回复miR-27b所引起的的增敏表型(图4g,h和图8d,e)。这些结果表明miR-27b通过进一步激活p53来增强多柔比星诱导的细胞死亡。

实施例7miR-27b通过直接靶向CCNG1来调节p53活性

由于miRNA通常是抑制它们下游的靶基因表达，因此miR-27b有可能通过拮抗某个p53的负调控基因从而增强p53活性。

利用TargetScan，Pictar和miRanda来预测miR-27b的靶基因，获得交集基因321个。利用芯片数据分析，获得152个基因能被miR-27b下调2.5倍以上。通过寻找这个321个预测基因与152个被miR-27b下调基因的交集，筛选出3个可能的miR-27b靶基因CCNG1，CALD1和PLXND1(图4i)。

7.1CCNG1敲除可以增加磷酸化p53和总p53的水平

通过q-PCR验证，在miR-27b过表达的条件下，这三个基因的mRNA水平都发生下调(图4j和图9a,b)(引物如SEQ ID NO.:5和SEQ ID NO.:6所示)。但是只有CCNG1敲除可以增加磷酸化p53和总p53的水平，而CALD1和PLXND1的敲除不改变磷酸化p53和总p53的水平(图4k和图9c-g)。

7.2证明CCNG1为p53的靶基因

野生型和突变型的CCNG1的3'UTR被分别克隆到荧光素酶的下游。如图4可见，ImiR-27b明显减弱了带有野生型3'UTR的荧光素酶活性，但是对带有突变型3'UTR的荧光素酶活性没有影响，这说明CCNG1确实是miR-27b的靶基因。

7.3miR-27b通过靶向下调CCNG1来激活p53的活性

和过表达miR-27b的表型相似，利用siRNA敲除CCNG1也能增强HepG2和ACHN细胞对多柔比星的敏感性(图10a-c)。与之相对比，在HepG2和ACHN细胞中过表达CCNG1减弱了miR-27b引起的敏感效应(图4m,n和图10d,e)。综合来看，这些结果表明miR-27b通过靶向CCNG1来激活p53的活性，从而增强依赖于p53的细胞死亡，提高肿瘤细胞的药物敏感性。

实施例8miR-27b通过下调CYP1B1来增强药物敏感性

8.1CYP1B1也是miR-27b的靶基因

尽管在SNU-182和786-O细胞中CCNG1的mRNA水平会被miR-27b下调(图11a,b)，但敲除CCNG1并不能增强这些p53突变的细胞系的药物敏感性(图11c,d)，因此，miR-27b除了影响CCNG1和p53，还有可能通过其他的机制来促进药物敏感性。

如图5a、b和图12a所示，miR-27b能够在蛋白水平显著下调CYP1B1，但是在mRNA水平却没有影响(引物如SEQ ID NO.:3和SEQ ID NO.:4所示)，且miR-27b能够下调带有野生型CYP1B13'UTR的荧光报告基因的活性，而不影响带有突变型CYP1B13'UTR的荧光报告基因的活性。这些数据表明CYP1B1也是miR-27b的靶基因。

8.2miR-27b所引起的药物增敏性通过调控CYP1B1来实现

如图5c,d和图12b-d所示，CYP1B1的敲除能够增强p53突变型细胞系SNU-182和786-O以及p53野生型细胞系HepG2对多柔比星的敏感性。并且，在这两类细胞系中，CYP1B1过表达均能减弱由miR-27b所诱导的增敏效应(图5e,f和图12e)。

这些数据显示miR-27b可以通过两种途径增强肿瘤细胞对药物的敏感性，一种是促进依赖于野生型p53所调控的细胞死亡，另一种是通过靶向CYP1B1来降低细胞对药物的解毒作用(图5g)。

实施例9建立可以代表CYP1B1蛋白水平的基因标签以及代表p53基因的基因标签选择。

基因标签能够更准确地描述特定基因的功能，因此利用p53和CYP1B1基因标签对病人进行分类来寻找适合采用miR-27b治疗的病人群体。

9.1代表CYP1B1蛋白水平的基因标签的建立

利用了14个Human Protein Atlas(HPA)和the Cancer Cell LineEncyclopedia(CCLE)共有的细胞系，从HPA可以得到CYP1B1蛋白表达量，从CCLE可以得到全基因组基因表达谱。

首先将这14个细胞系分成CYP1B1高表达和CYP1B1低表达两组，然后利用GenePattern筛选出两组细胞的差异基因(图13a)。

得到了57个差异基因，利用它们进行聚类分析可以把上述14个细胞系准确地分为CYP1B1高表达和低表达两组，把这57个基因作为CYP1B1的标签(图13b)。

9.2CYP1B1标签的可靠性验证

从CCLE中选用了64个具有基因表达谱的肝癌和肾癌细胞系，利用CYP1B1标签进行聚类分析，将这些细胞系分成高表达和低表达两组(图13c)。在上述64个细胞系中，我们对实验室拥有的其中6个细胞系的CYP1B1水平进行了western检测，发现CYP1B1的表达情况与预测结果一致，这说明CYP1B1标签能够准确地代表CYP1B1的蛋白水平(图13d)。

实施例10miR-27b会特异性地在带有野生型p53基因或者高表达CYP1B1的病人中促进其对抗肿瘤药物的响应

10.1具有p53野生型或具有CYP1B1高表达的标签的肾癌对药物响应好

根据p53和CYP1B1标签，60个使用过化疗药物或者多激酶抑制剂进行治疗的肾癌病人通过分层聚类(hierarchical clustering)被分为两组(图6a)。

组I的病人具有p53野生型或具有CYP1B1高表达的标签；

组II的病人同时具有p53突变型和CYP1B1低表达的标签(图14a,b)。

结果如图6b,c所示，在组I中miR-27b高表达的病人药物响应好，而在组II中病人对药物的响应与miR-27b的表达量无关。

10.2将miR-27b的应用推广到其他肿瘤

从TCGA数据库中找出了34个肺癌病人样本以及92个头颈癌病人样本，这些病人都接受了化疗药物或者靶点特异性抑制剂的治疗。这两类癌症病人根据p53和CYP1B1标签被分为两个组(图14c-f)。

如图6e,g所示，在组I中miR-27b高表达的病人药物响应好，而在组II中miR-27b的表达量与病人的药物响应不相关。

结论：这些数据表明，癌症病人可以根据p53和CYP1B1标签进行分类，对于p53野生型或者CYP1B1高表达的癌症病人，使用miR-27b和抗肿瘤药物联合治疗将得到更好的效果。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (14)

1.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括药学上可接受的载体和有效量的选自下组的一种或多种活性成分：

(a).miRNA-27b家族的微小RNA，所述miRNA-27b家族的微小RNA包括：miRNA-27b或经修饰的miRNA-27b衍生物；或核心序列为5’ucacagu3’、长度为18-26nt、功能与miRNA-27b相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；

(b).前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miRNA-27b；

(c).多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；

(d).表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA-27b、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；

(e).(a)中所述的微小RNA的激动剂。

2.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，(a)中所述的核心序列指微小RNA第2-8位的核苷酸序列；和/或所述的“功能与miRNA-27b相同或基本相同”是指保留了miRNA-27b的≥40%，且≤500%的增强肿瘤细胞对药物敏感性的功能。

3.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的miRNA-27b的序列如SEQ ID NO.:1所示。

4.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，所述的药物组合物还包括任选的抗肿瘤药物。

5.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，(a)中所述经修饰的miRNA衍生物是具有式I所示结构的化合物单体或其多聚体：

(X)n-(Y)m

式I，

在式I中，

各X为(a)中所述的微小RNA；

各Y独立地为促进微小RNA施药稳定性的修饰物；

Y连接于X的左侧、右侧或中间；

n为1-100的(较佳地1-20)正整数(较佳地n为1、2、3、4或5)；

m为1-1000的(较佳地1-200)正整数；

各“-”表示接头、化学键、或共价键。

6.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，(b)所述的前体miRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

7.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，(c)中所述的多核苷酸具有式II所示的结构：

Seq_正向-X-Seq_反向

式II，

式II中，

Seq_正向为能在宿主中被加工成所述的微小RNA核苷酸序列；

Seq_反向为与Seq_正向基本上互补或完全互补的核苷酸序列；

X为位于Seq_正向和Seq_反向之间的间隔序列，并且所述间隔序列与Seq_正向和Seq_反向不互补；

并且式II所示的结构在转入宿主细胞后，形成式III所示的二级结构：

式III，

式III中，Seq_正向、Seq_反向和X的定义如上述，

||表示在Seq_正向和Seq_反向之间形成的碱基互补配对关系。

8.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，(d)中所述的表达载体包括：病毒载体或非病毒载体。

9.如权利要求1所述的药物组合物，其特征在于，(e)中所述miRNA-27b的激动剂选自下组：促进miRNA-27b表达的物质、提高miRNA-27b活性的物质。

10.一种活性成分的用途，其中，所述的活性成分选自下组：

(a).miRNA-27b家族的微小RNA，所述miRNA-27b家族的微小RNA包括：miRNA-27b或经修饰的miRNA-27b衍生物；或核心序列为5’ucacagu3’、长度为18-26nt、功能与miRNA-27b相同或基本相同的微小RNA或经修饰的miRNA衍生物；

(b).前体miRNA，所述的前体miRNA能在宿主内加工成(a)中所述的miRNA-27b；

(c).多核苷酸，所述的多核苷酸能被宿主转录形成(b)中所述的前体miRNA，并加工形成(a)中所述的微小RNA；

(d).表达载体，所述表达载体含有(a)中所述的miRNA-27b、或(b)中所述的前体miRNA、或(c)中所述的多核苷酸；

(e).(a)中所述的微小RNA的激动剂；

其特征在于，所述活性成分用于制备增强肿瘤细胞对药物敏感性的药物、或制备预防或治疗肿瘤(尤其是耐药性肿瘤)的药物。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的肿瘤选自下组：肺癌、肝癌、肾癌、胃癌、肠癌、子宫颈癌、卵巢癌、乳腺癌、头颈癌。

12.一种筛选用于提高肿瘤细胞对药物敏感性的候选药物的方法，其特征在于，包括步骤：

(a)将候选物质施用于测试组的细胞或动物，并测定施用后所述测试组中miRNA-27b的表达水平；

(b)将测试组的miRNA-27b与对照组的miRNA-27b的表达水平进行比较，所述对照组中未施用所述候选物质；

其中，当测试组的miRNA-27b的表达水平显著高于对照组的miRNA-27b的表达水平时，则表明该候选物质是用于提高肿瘤细胞对药物敏感性的候选药物。

13.一种微小RNA即miRNA-27b的用途，其特征在于，用于制备进行肿瘤预后和/或判断肿瘤是否耐药的试剂或试剂盒；其中，所述的试剂盒中包括以下说明：

(i)若检测对象的miRNA-27b的表达量显著低于正常水平，则说明该检测对象的肿瘤预后差和/或该检测对象肿瘤耐药可能性大；

(ii)若检测对象的miRNA-27b的表达量正常或显著高于正常水平，则说明该检测对象的肿瘤预后好和/或该检测对象肿瘤耐药可能性小。

14.一种miRNA-27b的用途，其特征在于，用于制备P53的激活剂或用于制备CYP1B1的抑制剂。