CN117106919A - 外泌体miRNA组合在早期肺癌检测中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及外泌体miRNA组合在早期肺癌检测中的应用。具体地,本发明提供了miRNA的检测试剂的用途。本发明的miRNA组合可用于肺癌的早期筛查或鉴别诊断,以及肺癌患者干预治疗后疗效评估。本发明的检测方法简单快捷,患者依从性高,具有高灵敏度和高特异性,从而有助于更准确、更早期地进行肺癌的风险检测和预后评估。
Description
技术领域
本发明属于生物医学领域。具体的,涉及外泌体miRNA组合在早期肺癌检测中的应用。
背景技术
肺癌是世界上最常见的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率呈逐年上升趋势,目前发病率居世界首位,严重威胁着人类健康和生命。
肺癌是一种善于隐匿的疾病,经常在疾病发展到晚期才表现出临床症状,70~80%的肺癌患者在诊断出患有肺癌症状时已是中、晚期,癌细胞已经扩散,错过了最佳治愈时机,五年生存率低。对于早期的肺癌患者,经过及时治疗可大大提高患者的5年及以上生存率和生存质量。因此肺癌的早期诊断和进行有效的筛查至关重要。
目前可以用于肺癌早期诊断的方法非常局限,胸部X线敏感性较差、螺旋计算机断层扫描(computed tomography, CT)敏感性高,但准确性和特异性较差。越来越多的证据表明影像技术的局限性,例如引起疼痛和焦虑、假阳性结果和辐射暴露风险,或者价格昂贵、成像复杂和周期长,或者依赖于医师的经验与技术,且存在分辨率低、特异性和敏感性无法保证等缺陷。
此外,肺癌的早期诊断依然面临着巨大的技术瓶颈和挑战,大多数肿瘤体积已经生长到足够大时甚至肿瘤细胞已经开始转移时才能够被传统的诊断技术检测出来,这时患者病情已经处于中晚期,进行针对性治疗比较困难并且预后情况较差,这导致肺癌患者的总体生存率较低。
因此,本领域迫切需要开发一种无创、且能够更早期地、敏感地和准确地发现早期肺癌的方法。
发明内容
本发明提供了一种无创、且能够更早期地、敏感地和准确地发现早期肺癌的方法。
在本发明的第一方面,提供了一种外泌体miRNA的检测试剂的用途,用于制备一检测试剂或试剂盒,所述检测试剂或试剂盒用于(a)检测肺癌的发生风险;和/或(b)对肺癌的治疗效果进行评价;
其中,所述检测试剂用于检测所述外泌体miRNA的水平,并且所述外泌体miRNA包括以下组合:
(A1) miR-27b;和
(A2) miR-328-5p。
在另一优选例中,所述外泌体miRNA还包括选自下组的一种或多种(如1、2、3、4、5或6种)外泌体miRNA:(A3) miR-152;(A4) miR-106a;(A5) miR-148a-3p;(A6) miR-140-5p;(A7) miR-146b;和(A8) miR-142-5p。
在另一优选例中,所述外泌体miRNA还包括选自下组的任一外泌体miRNA、或其组合:
(A3) miR-152;(A4) miR-106a;(A5) miR-148a-3p;(A6) miR-140-5p;(A7) miR-146b。
在另一优选例中,所述外泌体miRNA还包括以下外泌体miRNA:(A8) miR-142-5p。
在另一优选例中,所述外泌体miRNA还包括以下外泌体miRNA:(A3) miR-152;(A4)miR-106a;(A5) miR-148a-3p;(A6) miR-140-5p;和(A7) miR-146b。
在另一优选例中,所述外泌体miRNA包括以下外泌体miRNA:(A1) miR-27b;(A2)miR-328-5p;(A3) miR-152;(A4) miR-106a;(A5) miR-148a-3p;(A6) miR-140-5p;(A7)miR-146b;和(A8) miR-142-5p。
在另一优选例中,所述外泌体miRNA是来自于外泌体的miRNA。
在另一优选例中,所述外泌体miRNA是来源于肿瘤细胞的外泌体的miRNA。
在另一优选例中,所述外泌体miRNA是来源于肺癌细胞的外泌体的miRNA。
在另一优选例中,所述检测试剂检测所述外泌体miRNA在样本中的水平。
在另一优选例中,所述样本(或待测样本)选自下组:全血、血清、血浆、组织、组织间隙液、尿液、或其组合
在另一优选例中,所述样本选自下组:全血、血清、血浆、或其组合。
在本发明的第二方面,提供了一种用于检测肺癌发生风险的试剂盒,所述试剂盒含有检测试剂,所述检测试剂用于检测外泌体miRNA的水平,
其中,所述外泌体miRNA包括以下组合:
(A1) miR-27b;和
(A2) miR-328-5p。
在另一优选例中,所述的试剂盒还包括标签或说明书,所述标签或说明书注明所述试剂盒用于(a)检测肺癌的发生风险;和(b)对肺癌的治疗效果进行评价。
在另一优选例中,所述外泌体miRNA还包括选自下组的一种或多种(如1、2、3、4、5或6种) 外泌体miRNA:(A3) miR-152;(A4) miR-106a;(A5) miR-148a-3p;(A6) miR-140-5p;(A7) miR-146b;和(A8) miR-142-5p。
在另一优选例中,所述外泌体miRNA还包括选自下组的任一外泌体miRNA、或其组合:
(A3) miR-152;(A4) miR-106a;(A5) miR-148a-3p;(A6) miR-140-5p;(A7) miR-146b。
在另一优选例中,所述外泌体miRNA还包括以下外泌体miRNA:(A8) miR-142-5p。
在另一优选例中,所述外泌体miRNA还包括以下外泌体miRNA:(A3) miR-152;(A4)miR-106a;(A5) miR-148a-3p;(A6) miR-140-5p;和(A7) miR-146b。
在另一优选例中,所述外泌体miRNA还包括以下组合:(A1) miR-27b;(A2) miR-328-5p;(A3) miR-152;(A4) miR-106a;(A5) miR-148a-3p;(A6) miR-140-5p;(A7) miR-146b;和(A8) miR-142-5p。
在另一优选例中,所述检测试剂为与所述外泌体miRNA特异性互补的核苷酸序列(或多核苷酸)。
在另一优选例中,所述检测试剂包括引物对和/或探针。
在另一优选例中,所述引物对为特异性扩增所述外泌体miRNA的引物对,所述探针是与所述外泌体miRNA特异性杂交的探针。
在另一优选例中,所述引物对选自下组:
用于扩增miR-27b的引物对:SEQ ID NO.13,SEQ ID NO.14;
用于扩增mir-328-5p的引物对:SEQ ID NO.15,SEQ ID NO.16;
用于扩增miR-152的引物对:SEQ ID NO.1,SEQ ID NO.2;
用于扩增miR-106a的引物对:SEQ ID NO.3,SEQ ID NO.4;
用于扩增miR-142-5p的引物对:SEQ ID NO.5,SEQ ID NO.6;
用于扩增miR-148a-3p的引物对:SEQ ID NO.7,SEQ ID NO.8;
用于扩增miR-140-5p的引物对:SEQ ID NO.9,SEQ ID NO.10;
用于扩增miR-146b的引物对:SEQ ID NO.11,SEQ ID NO.12;或其组合。
在另一优选例中,所述引物对选自下组:用于扩增miR-27b的引物对:SEQ IDNO.13,SEQ ID NO.14;用于扩增mir-328-5p的引物对:SEQ ID NO.15,SEQ ID NO.16;或其组合。
在另一优选例中,所述试剂盒中还包括内参分子(如内参miRNA)。
在另一优选例中,所述内参分子为let-7a。
在另一优选例中,所述检测试剂偶联或带有可检测标记。
在另一优选例中,所述可检测标记选自下组:生色团、化学发光基团、荧光团、同位素或酶。
在另一优选例中,所述的检测是针对离体样本的检测。
在本发明的第三方面,提供了一种肺癌风险判断设备,所述设备包括:
(a) 输入模块,所述输入模块用于输入某一对象的外泌体miRNA数据,所述数据包括外泌体miRNA在样本中的水平或浓度的数据;
其中,所述的外泌体miRNA包括以下组合:
(A1) miR-27b;和
(A2) miR-328-5p;
(b) 处理模块,所述处理模块将输入的外泌体miRNA的数据代入检测模型,从而获得风险值;并且将所述风险值与阈值(cutoff)进行比较,从而获得判结果;其中,当所述风险值高于所述阈值时,则提示该对象为肺癌患者;当所述风险值低于所述阈值时,则提示该对象为非肺癌患者;和
(c) 输出模块,所述输出模块用于输出所述判断结果。
在另一优选例中,所述的外泌体miRNA在样本中的水平或浓度以Ct值表示。
在另一优选例中,所述的外泌体miRNA数据包括经标准化或归一化处理的数据。
在另一优选例中,所述的检测模型的公式为:F=1/[1+e-(3.071150*X1+4.231144*X2+6.789714)];
其中,所述X1为标准化后miR-27b的Ct值,X2为标准化后miR-328-5p的Ct值。
在另一优选例中,所述检测模型公式通过设计计算机辅助程序实现自动计算。
在另一优选例中,所述外泌体miRNA还包括选自下组的任一miRNA、或其组合:
(A3) miR-152;(A4) miR-106a;(A5) miR-148a-3p;(A6) miR-140-5p;(A7) miR-146b。
在另一优选例中,所述外泌体miRNA还包括以下miRNA:(A8) miR-142-5p。
在另一优选例中,所述的对象为人。
在另一优选例中,所述的对象为非肿瘤患者、肿瘤患者。
在另一优选例中,所述肿瘤患者包括肺癌患者。
在另一优选例中,所述外泌体miRNA来源于人。
在本发明的第四方面,提供了一种检测方法,包括步骤:
(a) 提供一检测样本;
(b) 检测所述检测样本中外泌体miRNA水平,记为C1;和
(c) 将所述外泌体miRNA水平与对照参比值C0进行比较;
其中,所述外泌体miRNA包括以下组合:
(A1) miR-27b;和
(A2) miR-328-5p;
如果检测对象的外泌体miRNA的检测结果满足以下条件时,则提示所述对象的肺癌发生风险高:
(1)当某一外泌体miRNA是上调的标志物时,则当其水平高于参考值或标准值C0时,则提示所述检测对象的肺癌发生风险高;
(2)当某一外泌体miRNA是下调的标志物时,则当其水平低于参考值或标准值C0时,则提示所述检测对象的肺癌发生风险高。
在另一优选例中,所述外泌体miRNA还包括选自下组的一种或多种(如1、2、3、4、5或6种)miRNA:(A3) miR-152;(A4) miR-106a;(A5) miR-148a-3p;(A6) miR-140-5p;(A7)miR-146b;和(A8) miR-142-5p。
在另一优选例中,所述外泌体miRNA还包括选自下组的任一外泌体miRNA、或其组合:
(A3) miR-152;(A4) miR-106a;(A5) miR-148a-3p;(A6) miR-140-5p;(A7) miR-146b。
在另一优选例中,所述检测样本选自下组:全血、血清、血浆、组织、组织间隙液、尿液、或其组合。
在另一优选例中,所述检测样本选自下组:全血、血清、血浆、或其组合。
在另一优选例中,所述组织选自下组:正常组织、疑似癌组织、癌旁组织、或其组合。
在另一优选例中,所述细胞选自下组:正常细胞、疑似癌细胞、癌旁细胞、或其组合。
在另一优选例中,所述检测样本来自哺乳动物,优选为灵长类哺乳动物,更优选地为人。
在另一优选例中,所述方法为体外方法。
在另一优选例中,所述方法为非诊断性和非治疗性的方法。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了LC-K4(miR-152)分子的相对表达水平,纵坐标为标准化后的Ct值,横坐标为来自不同医学中心的各样本。
图2显示了LC-K13(miR-106a)分子的相对表达水平,纵坐标为标准化后的Ct值,横坐标为来自不同医学中心的各样本。
图3显示了LC-K15(miR-142-5p)分子的相对表达水平,纵坐标为标准化后的Ct值,横坐标为来自不同医学中心的各样本。
图4显示了LC-K16(miR-148a-3p)分子的相对表达水平,纵坐标为标准化后的Ct值,横坐标为来自不同医学中心的各样本。
图5显示了LC-K25(miR-140-5p)分子的相对表达水平,纵坐标为标准化后的Ct值,横坐标为来自不同医学中心的各样本。
图6显示了LC-K26(miR-146b)分子的相对表达水平,纵坐标为标准化后的Ct值,横坐标为来自不同医学中心的各样本。
图7显示了LC-K33(miR-27b)分子的相对表达水平,纵坐标为标准化后的Ct值,横坐标为来自不同医学中心的各样本。
图8显示了LC-K34(miR-328-5p)分子的相对表达水平,纵坐标为标准化后的Ct值,横坐标为来自不同医学中心的各样本。
图9显示了所有受试者标准化之后的Ct值的聚类分析图(L34、K15和L33)。
图10显示了所有受试者标准化之后的Ct值的聚类分析图(L25、L26、K13、K4和K16)。
图11显示了候选分子(miR-152、miR-106a、miR-142-5p、miR-148a-3p、miR-140-5p、miR-146b、miR-27b、miR-328-5p)标准化之后的Ct值进行t-SNE降维分析结果图:(A)肺癌患者和健康对照人群分布图;(B)不同检测批次之间的差异分布图。
图12显示了候选分子((miR-152、miR-106a、miR-142-5p、miR-148a-3p、miR-140-5p、miR-146b、miR-27b、miR-328-5p)之间的相关性分析图。
图13显示了(A)将模型应用于训练组时,检测模型的AUC曲线;(B)将模型应用测试组时,检测模型对肺癌和健康人群的区分能力。
图14显示了各miRNA分子的相对表达水平,纵坐标为标准化后的Ct值,横坐标为健康对照或肺癌患者的各样本。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,通过大量筛选,意外地发现可高灵敏度和高特异性的用于肺癌检测和预后的外泌体miRNA标志物。所述肺癌的检测和预后miRNA标志物包括8种miRNA以及相应的多种不同组合,8种外泌体miRNA包括:(A1) miR-27b;(A2) miR-328-5p;(A3) miR-152;(A4) miR-106a;(A5) miR-148a-3p;(A6) miR-140-5p;(A7) miR-146b;和(A8) miR-142-5p。实验表明,本发明的标志物可用于早期或辅助性地评估肺癌发生风险和预后。在此基础上完成了本发明。
具体地,本发明人选择了区分肺癌患者和健康人群具有显著意义的两种外泌体miRNA标记物((A1) miR-27b;(A2) miR-328-5p)的组合以及7种或8种外泌体miRNA标记物所构成的组合,分别构建了肺癌检测模型,用于检测肺癌发生风险和预后评估。结果表明,本发明的标志物、试剂盒和检测方法具有简单快捷,患者依从性高,高灵敏度和高特异性等优点,有助于更准确、更早期地进行肺癌的风险的检测(尤其是辅助检测和筛查)。
术语
如本发所用,“肺癌筛查”是指对那些没有肺癌相关症状的人群进行常规体检,在出现症状前及时发现肺癌。如果可以找到肺癌的疾病指征,用于提示临床医生早期对患者采取相关的治疗措施或者决策具有重要的意义。
如本发明所用,“本发明miRNA”、“本发明miRNA标志物”“本发明肺癌风险标志物”、“本发明风险标志物”和“本发明标志物”可互换使用,指的是本发明肺癌风险标志物外泌体miRNA。应理解,所述术语包括以下 miRNA中的任何一种以及2、3、4、5、6、7和8种标志物构成的任意组合:(A1) miR-27b;(A2) miR-328-5p;(A3) miR-152;(A4) miR-106a;(A5) miR-148a-3p;(A6) miR-140-5p;(A7) miR-146b;和(A8) miR-142-5p。
如本文所用,“阳性预测值”或“ppv”指的是根据本发明的方法检测呈阳性结果的人群中,同时被金标准也检测为阳性的人群所占的比例。或者说,检测出的真阳性人群占检测呈阳性人群总人数的比例。
如本发明所用,“Ct值”或“Cycle Threshold”指的是表示定量PCR中扩增产物荧光信号达到设定的荧光阈值时所对应的扩增循环数。简单地说,Ct值代表了起始模板扩增达到一定产物量时的循环数。起始模板量浓度越高,Ct值越小;起始模板量浓度越低,Ct值越大。
本文中使用的术语“样品”或“样本”是指与受试者特异地相关联的材料,从其中可以确定、计算或推断出与受试者有关的特定信息。样本可以全部或部分由来自受试者的生物材料构成。
如本文所用,术语“参比值”或“对照参比值”是指当与分析结果相比时与特定结果统计学相关的值。在优选的实施方案中,参比值是根据对比较肺癌风险标志物的mRNA表达和/或蛋白的表达,并进行统计学分析来确定的。在本文的实施例部分中显示了一些这样的研究。但是,来自文献的研究和本文公开的方法的用户经验也可用于生产或调整参比值。参比值也可以通过考虑与患者的族群、医疗史、遗传学、年龄和其它因素特别相关的情况和结果来确定。
微小RNA
微小RNA(microRNA,miRNA)是一类内生的、长度约为20-24个核苷酸的短链RNA,其为非编码RNA,在转录后阶段参与各种靶基因的表达调节。几乎所有类型的细胞都被动(例如通过凋亡小体)或主动(例如存在于外泌体或微泡中)地向循环系统释放miRNA,这些分子可以通过类似于旁分泌信号的机制影响其他组织的稳态平衡,或触发一些致病机制,包括正常细胞向肿瘤细胞转化和促进肿瘤细胞增殖等。
研究表明,一些肿瘤细胞以及癌症相关成纤维细胞可向微环境中释放miRNA,然后进入血流。
研究表明,miRNA通过表达水平的变化靶向地参与肺癌的多种细胞和分子水平的发病机制,在肺癌发生发展中发挥关键作用;最近报道显示,miRNA的表达谱可能与肺癌的肿瘤侵袭性、亚型、治疗响应和患者预后有关。此外,miRNA在各种条件下的稳定性很强,并且对RNA酶具备良好抗性,这些特点使其成为肺癌生物标志物的理想候选者。
大量的miRNA是被包装在外泌体中进行转运之后才发挥作用的。外泌体是一种球状纳米级胞外囊泡,直径通常为30-100nm,密度为1.13-1.19g/ml。
统计数据显示,外泌体含有大量不同种类的蛋白质、mRNA、miRNA和脂质,这些分子广泛参与细胞结构组成、生物合成、细胞间通信和囊泡融合等生物过程。在生理和病理条件下,外泌体可以由包括肿瘤细胞在内的多种细胞释放,而肿瘤细胞来源的外泌体则与肿瘤发展相关。并且,外泌体的富集可以从血液中比较容易地实现。
由此可知,源于肿瘤细胞的外泌体携带并稳定储存了肿瘤细胞的成分,并可以实现无创的体外富集,因此外泌体及其包含的miRNA分子可以成为“体液活检”中的一种理想的候选分子标志物,适合用于肺癌检测。
本发明的外泌体miRNA包括miRNA中的任何一种以及2、3、4、5、6、7和8种标志物构成的任意组合:(A1) miR-27b;(A2) miR-328-5p;(A3) miR-152;(A4) miR-106a;(A5)miR-148a-3p;(A6) miR-140-5p;(A7) miR-146b;和(A8) miR-142-5p。实验表明,本发明的外泌体miRNA是表征肺癌风险的标志物,可用于肺癌的早期检测和筛查。
检测方法
相比较传统的有创伤检查,本发明方法是一种无创的血液检测方法,适合作为大规模筛查的首选策略。
基于肺癌风险标志物在组织样本或血液样本中差异表达,本发明还提供了相应的判断肺癌风险的方法。
本发明涉及定量和定位检测肺癌风险标志物的外泌体miRNA水平的诊断试验方法。这些试验是本领域所熟知的。试验中所检测的人肺癌风险标志物外泌体miRNA水平,可以用于判断 (包括辅助判断)是否具有肺癌风险。
一种优选的方法是对外泌体miRNA进行PCR/qPCR/RT-PCR进行定量检测。
一种优选的方法是对外泌体miRNA或cDNA,测序进行定量检测。
肺癌风险标志物的多核苷酸可用于肺癌风险的诊断。本发明的多核苷酸的一部分或全部可作为探针固定在微阵列或DNA芯片上,用于分析中的外泌体miRNA差异表达分析和外泌体miRNA诊断。
检测试剂盒
基于本发明肺癌风险标志物与肺癌风险的相关性,因此本发明肺癌风险标志物可以作为肺癌风险的判断标志物。
本发明还提供了一种判断肺癌风险的试剂盒,所述的试剂盒含有一检测试剂,所述检测试剂用于检测本发明的肺癌风险标志物(即外泌体miRNA)。优选地,所述试剂盒含有:对本发明的抗肺癌风险标志物进行特异性扩增肺癌风险标志物外泌体miRNA或cDNA的引物或引物对、探针或芯片。
在另一优选例中,所述的试剂盒还包括标签或说明书。
本发明的主要优点包括:
1. 本发明的肺癌风险标志物(或其组合)与肺癌风险存在明显的相关性,可用于肺癌的早期检测和筛查。
2. 基于本发明标志物的检测方法,操作简单、样品采集方便,风险低,成本较低、副作用小。
3. 本发明的外泌体miRNA分子及其组合,灵敏度高、特异性好、能够快速准确地检测出早期肺癌。
4. 本发明的外泌体miRNA检测模型、检测方法和风险判断设备,对于肺癌患者与健康人群具有优秀的区分能力。
5. 本发明的检测标志物、检测试剂、试剂盒、检测方法可与常规技术(包括常规的基于其他标志物的检测、病理检测等)进行结合,从而更精准地提供针对肺癌等肿瘤的评估或诊断结果。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人, 分子克隆:实验室手册(New York: Cold Spring HarborLaboratory Press, 1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
通用方法
本发明中涉及以下实验操作或定义。应注意,本发明还可采用本领域其他常规技术进行实施,并不仅限于以下实验操作。
(一) 血清或血浆的制备和保存
肺癌患者血清或血浆在患者最初诊断为肺癌,尚未接受任何放化疗及手术治疗时收集。血浆或血清按标准临床程序制备,置于-80℃冰箱中长期保存。
(二) 差速离心法分离血清外泌体
将血清从冰箱中拿出,置于冰上解冻(使用新鲜血清则跳过此步骤);4℃ 12,000xg 离心15分钟,小心吸取上清,转移上清至新的1.5ml离心管中;添加等体积PBS溶液于上清中,混匀;按上清混合液:沉淀剂=4:1体积比加入沉淀剂;涡旋震荡15秒,4℃静置过夜;4℃ 3,000xg 离心30分钟,管底应有肉眼可见的黄白色沉淀,小心吸除全部上清液;向离心管中加入适量PBS溶液,置于混匀仪上1,500rpm 混匀10分钟,所得即为富含外泌体的溶液;向离心管中加入适量QIAzol裂解剂,震荡混匀后进入RNA抽提步骤。
(三) RNA的分离提取
已添加QIAzol的裂解溶液,室温孵育5分钟;向每管添加200μl氯仿溶液,剧烈震荡15秒,室温放置3分钟;在4℃、12,000 xg条件下离心15分钟,可见分层;将上清转移至新的2mL离心管,按上清:无水乙醇=1:1.5的体积比添加无水乙醇,来回颠倒混匀;将溶液分批次转移至RNeasy MinElute离心柱进行12,000xg离心30秒,弃废液;向离心柱中添加BufferRWT溶液700μl,12,000xg离心30秒,弃废液;向离心柱中添加Buffer RPE溶液500μl,在12,000xg离心30秒,弃废液;向离心柱中添加新鲜配制的80%乙醇溶液500μl,在12,000xg离心2分钟,弃废液并更换收集管;开盖离心,12,000xg离心5分钟,弃收集管;将离心柱放入试剂盒提供的1.5mL Rnase-free离心管中,向柱中心添加Rnase-free dH2O 14μl,12000xg离心2分钟;弃离心柱,洗脱的RNA置于冰上待用或迅速转入-80℃冰箱中储存。
(四)实时定量PCR
通过M-MLV Reverse-Transcriptase将从血清中提取的外泌体RNA逆转录为cDNA,反应条件为:1) 37℃ 1小时,2) 75℃ 15分钟。然后,使用TOYOBO SYBR进行qRT-PCR,每个反应的总体积为20μL,包含1μL cDNA (10ng/μL),并根据制造商的使用说明在ABI 7500(Thermo Fisher)实时定量PCR平台中进行。
PCR的循环条件为:1) 95°C 15秒,2) 60°C 30秒,3) 95°C 15秒,进行40个循环,然后进行熔解曲线分析以评估PCR特异性。Let-7a miRNA作为内源性对照。设置三复孔测量反应。候选miRNA的表达水平使用2-ΔΔCt方法计算。引物序列见表1。
表1. 针对靶标miRNA的引物对
(五)原始Ct值的标准化处理
将检测获得的原始Ct值(Cycle Threshold)进行标准化处理,消除批次间检测差异,后续数据分析在此基础上进行。
标准化的公式为:Scale = (X-mean(X))/RMSE(X),RMSE:Root Mean squarederror(均方根误差)。进行标准化处理会消除来自不同中心的样本对数据的影响,可见正常的标志物相关性,使后续分析更加准确。
(六)血清miRNA组合的阳性判断
本发明通过多因素逻辑回归统计分析构建肺癌检测的miRNA筛查模型,具体的逻辑回归公式为formula=1/[1+e-(3.071150*X1+4.231144*X2+6.789714)],X1为标准化后miR-27b的Ct值,X2为标准化后miR-328-5p的Ct值。经过实验分析和标准化计算得到受试者样本的X1和X2值,将它们代入公式计算,获得检测结果。
本受试人群中,当特异性固定为90%时,检测模型的阈值(cutoff)为0.4846;当特异性固定为95%时,检测模型的阈值(cutoff)为0.7929。当模型所计算的样本值大于cutoff值时,判断该样本为阳性。
(七)统计分析
使用非参数Mann-Whitney检验分析患者和对照受试者中候选外泌体miRNA的血清表达水平。P<0.05被认为差异有统计学意义。受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)用于评估miRNA的诊断性能。所有统计分析均使用SPSS 25.0软件和GraphPad Prism进行6.0软件。
(八)敏感性和特异性判断
敏感性:金标准诊断全部肺癌病例中,外泌体微小RNA组合检测结果为阳性的病例占全部患病病例的比例。
特异性:金标准诊断全部无病的受试者中,外泌体微小RNA组合检测结果为阴性的受试者占全部未患病受试者的比例。
样本采集已经受试者或患者知情同意,且获得监管部门的批准。
下述实施例中的实验方法,如无特殊说明,均为常规方法。下述实施例中所用的原料、试剂材料等,如无特殊说明,均为市售购买产品。
实施例1. 候选单分子外泌体miRNA在肺癌患者与健康对照人群中的表达情况
本发明包括健康体检人群88例和肺癌患者90例,受试者来自不少于3个不同医疗中心。所有的肺癌患者血清都是在患者诊断为肺癌尚未接受任何放化疗及手术治疗时收集的,并在-80℃冰箱保存。
受试人群信息如表2所示。
表2
本发明人通过检测受试者样本数据,经过大量筛选,最后确定8个候选分子(外泌体miRNA),分别为miR-152、miR-106a、miR-142-5p、miR-148a-3p、miR-140-5p、miR-146b、miR-27b、miR-328-5p。
以上8种分子的相对表达水平如图1-图8和图14所示。纵坐标为标准化之后的Ct值,横坐标为来自不同医学中心的样本。
横坐标中,“Healthy”代表健康对照,“Tumor”代表肺癌患者;肺癌患者来自AHSL-安徽省立医院;GDRM-广东省人民医院;GDZJ-广东湛江中心人民医院;JXZLYY-江苏肿瘤医院;SXCZ-山西长治人民医院;健康对照人群来自AHSL-安徽省立医院;SHFD-上海复旦肿瘤医院;SXCZ-山西长治人民医院;x-东北国际医院;XYSTJ-肖医生体检。
其中,纵坐标代号与候选分子名称对照表如表3所示。
表3
由图1-8可知,源于不同医疗中心的样本,通过标准化的Ct值来指征各靶标miRNA分子的水平,各miRNA在健康人群和肺癌患者之间有不同的表达水平。
类似地,本发明人将每一例受试者标准化之后的Ct值进行聚类分析。
结果如图9-图10所示,与散点图的分布相似,统计分析表明,miR-328-5p在肺癌患者中的水平趋向高于健康对照人群,而miR-142-5p和miR-27b的水平在肺癌患者体内的水平低于健康对照人群。其它分子(包括:miR-152、miR-106a、miR-148a-3p、miR-140-5p、miR-146b)并没有在聚类分析中观察到明显的分布聚集趋势。
实施例2. 肺癌外泌体miRNA检测模型的建立
在本实施例中,本发明人使用了miR-152、miR-106a、miR-142-5p、miR-148a-3p、miR-140-5p、miR-146b、miR-27b、miR-328-5p作为候选分子,利用它们标准化之后的Ct值进行t-SNE降维分析。
结果如图11中的A和图11中的B所示,这些候选分子的检测可以明显地区分肺癌患者和健康对照人群(图11中的A),而在检测批次之间没有显著的分布差异(图11中的B),表明这些候选分子对肺癌与健康人的区分与检测批次之间无关。
随后,进行了候选分子之间的相关性分析。
结果如图12所示。miR-142-5p与miR-328-5p呈现明显的负向相关。
由于miR-142-5p在单分子检测中表现为负标志物(在肺癌患者体内的水平低于健康对照人群),所以在构建模型中去除冗余标志物时,选择了去除miR-142-5p,而选择miR-328-5p参与构建肺癌外泌体miRNA检测模型。
因此,参与构建肺癌外泌体miRNA检测模型的分子为7种mRNA:miR-152、miR-106a、miR-148a-3p、miR-140-5p、miR-146b、miR-27b、miR-328-5p。
将所有受试者以近似3:1的比例,随机分为训练组人群(68例肺癌患者,67例健康对照)和测试组人群(22例肺癌患者、21例健康对照)。
在进行特征选择时,采用Wrapper法中的RFE(特征递归消除)分别计算每个特征对模型的重要程度,过程如下:
1) 选择所有特征(miR-152、miR-106a、miR-148a-3p、miR-140-5p、miR-146b、miR-27b、miR-328-5p)构建逻辑回归模型,利用AIC对模型性能进行评估;
2) 删除一个特征,重新构建逻辑回归模型,利用AIC对模型性能进行评估;
3) 采用LRT对1)、2)产生的模型进行检验得到P值,P值越小则认为删除的特征对模型的影响越大,同时根据模型的AIC值判断模型性能;
4) 重复步骤1)-3),直到将所有特征遍历,最终得到每一个特征的P值,此P值可以理解为对模型的重要程度;
通过上述特征选择,得到每个分子的P值,如表4所示。
表4
根据上述方法得到的结果可以知道,L33(miR-27b)、L34(miR-328-5p)对模型的贡献最大,在区分肺癌患者和健康人群中具有显著的意义。
因此,选择miR-27b和miR-328-5p构建逻辑回归模型。
最终获得逻辑回归公式为:formula=1/[1+e-(3.071150*X1+4.231144*X2+6.789714)],X1为标准化后miR-27b的Ct值,X2为标准化后miR-328-5p的Ct值。
经过实验分析和标准化计算得到受试者样本的X1和X2值,将它们代入公式计算,获得检测结果。本受试人群(测试组人群)中,当特异性固定为90%时,检测模型的阈值(cutoff)为0.4846;当特异性固定为95%时,检测模型的阈值(cutoff)为0.7929。当模型所计算的样本值大于cutoff值时,判断该样本为阳性。
再将该检测模型用于训练组,结果如图13中的A所示,检测阈值为0.524时,此模型的灵敏度为0.867,特异性为0.932,曲线下面积为0.961。
实施例3. 肺癌外泌体miRNA检测模型的验证
在本实施例中,采用实施例2中获得的肺癌miRNA检测模型进行验证,所述模型为基于miR-27b和miR-328-5p所构建逻辑回归模型,其中逻辑回归公式为:formula=1/[1+e-(3.071150*X1+4.231144*X2+6.789714)],X1为标准化后miR-27b的Ct值,X2为标准化后miR-328-5p的Ct值。
测试组人群包括22例肺癌患者和21例健康对照。
结果如图13中的B所示。
在测试组中,所得到的曲线下面积为0.937,当特异性固定为90%时,检测模型的阈值(cutoff或thres)为0.4846,敏感性(sen)为0.8667,阳性预测值(ppv)为0.9070;当特异性(spe)固定为95%时,检测模型的阈值(cutoff)为0.7929,敏感性为0.7778,阳性预测值为0.9459。
这充分表明,本发明的外泌体miRNA检测模型对于肺癌与健康人群具有优秀的区分能力。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (10)
1.一种外泌体miRNA的检测试剂的用途,其特征在于,用于制备一检测试剂或试剂盒,所述检测试剂或试剂盒用于检测肺癌的发生风险;
其中,所述检测试剂用于检测所述外泌体miRNA的水平,并且所述外泌体miRNA包括以下组合:
(A1) miR-27b;和
(A2) miR-328-5p。
2. 如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述外泌体miRNA还包括以下外泌体miRNA:(A3) miR-152;(A4) miR-106a;(A5) miR-148a-3p;(A6) miR-140-5p和(A7) miR-146b。
3.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述检测试剂检测所述外泌体miRNA在样本中的水平,且所述样本选自下组:全血、血清、血浆、组织、组织间隙液、尿液、或其组合。
4.如权利要求1所述的用途,其特征在于,所述试剂盒含有检测试剂,所述检测试剂用于检测外泌体miRNA的水平,
其中,所述外泌体miRNA包括以下组合:
(A1) miR-27b;和
(A2) miR-328-5p;
且所述的试剂盒还包括标签或说明书,所述标签或说明书注明所述试剂盒用于检测肺癌的发生风险。
5. 如权利要求4所述的用途,其特征在于,所述外泌体miRNA还包括以下miRNA:(A3)miR-152;(A4) miR-106a;(A5) miR-148a-3p;(A6) miR-140-5p;和(A7) miR-146b。
6.如权利要求4所述的用途,其特征在于,所述检测试剂包括引物对和/或探针。
7. 如权利要求6所述的用途,其特征在于,所述引物对选自下组:用于扩增miR-27b的引物对:SEQ ID NO.13,SEQ ID NO.14;用于扩增mir-328-5p的引物对:SEQ ID NO.15,SEQID NO.16;或其组合。
8.一种肺癌风险判断设备,其特征在于,所述设备包括:
(a) 输入模块,所述输入模块用于输入某一对象的外泌体miRNA数据,所述数据包括外泌体miRNA在样本中的水平或浓度的数据;
其中,所述的外泌体miRNA包括以下组合:
(A1) miR-27b;和
(A2) miR-328-5p;
(b) 处理模块,所述处理模块将输入的外泌体miRNA的数据代入检测模型,从而获得风险值;并且将所述风险值与阈值进行比较,从而获得判断结果;其中,当所述风险值高于所述阈值时,则提示该对象为肺癌患者;当所述风险值低于所述阈值时,则提示该对象为非肺癌患者;和
(c) 输出模块,所述输出模块用于输出所述判断结果。
9.如权利要求8所述的设备,其特征在于,所述的外泌体miRNA在样本中的水平或浓度以Ct值表示。
10.如权利要求9所述的设备,其特征在于,所述的检测模型的公式为:F=1/[1+e-(3.071150*X1+4.231144*X2+6.789714)];
其中,所述X1为标准化后(A1)miR-27b的Ct值,X2为标准化后(A2)miR-328-5p的Ct值。
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