CN113552352A - 一种用于儿童实体瘤的检测靶标组合及其检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于儿童实体瘤的检测靶标组合及其检测方法,所述靶标或其组合包括蛋白:SHH,PTCH,SMO,GLI中的至少一种,发明人发现通过检测这些蛋白阳性表达水平变化,可以有效应用于检测、分类或预测、治疗监测、预后或其它评价儿童实体瘤中;基于此研制了一种儿童实体瘤检测检测试剂盒并制订了一套标准化的检测方法,可大大提高检测结果的准确率,减少人员操作误差导致假阳性或假阴性,规范病理医生的判读结果,保证检测结果的一致性。从而为儿童实体瘤的检测、分类或预测、治疗监测、预后或其它评价中提供有效的临床指导意义。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域,特别是涉及一种用于儿童实体瘤的检测靶标组合及其检测方法。
背景技术
临床肿瘤治疗方案中,靶向药物治疗一直是肿瘤治疗领域研究的方向。不断有新的靶向药物应道临床治疗方案中,三氧化二砷(ATO)治疗儿童肿瘤(与HedgeHog通路驱动相关)的临床应用,国内外在ATO治疗儿童实体瘤作用机制方面,可能与HedgeHog通路相关已公开发表论文,多为临床前研究,通过HH信号通路异常激活促使部分高危肿瘤的发生,Nüsslein-Vollhard C团队于1980年首先在《Nature》上报道在黑腹果蝇体内发现了Hedgehog(HH)基因,HH信号通路主要包括HH信号多肽、跨膜蛋白Patched(PTCH)和Smoothened(SMO)、以及核转录因子Gli1/2/3等四个部份。HH信号蛋白是整个通路的启动因子,包括Sonichedgehog(SHH),Indian hedgehog(IHH)和Desert hedgehog(DHH)等三种类型;不同HH信号多肽与膜蛋白受体PTCH结合后,解除了PTCH分子对细胞信号转导的关键膜蛋白SMO的抑制作用,SMO蛋白分子的激活可使HH信号通路中核转录因子Gli功能状态发生改变,进而控制下游基因转录活性的变化(见图1)。HH信号通路作为生物进化中保守的信号通路在人胚胎时期组织分化发育调节中起巨大作用,哺乳动物的3种HH信号蛋白SHH、IHH及DHH分别调控不同胚胎组织的分化:SHH调控原始神经系统发育、分化;IHH调控骨骼发育;而DHH促进胎儿卵巢、睾丸间质细胞的分化。
发明人使用Gli1特异性靶向抑制药物三氧化二砷(ATO)联合常规化疗方案治疗目前正在进行的ATO联合化疗治疗儿童HH驱动肿瘤中两类相对难治的瘤种NB(神经母细胞瘤)及RMS(横纹肌肉瘤),临床发现利用ATO拮抗Gli1蛋白,抑制HH信号通路可有效治疗上述两种肿瘤,在治疗儿童患者中临床研究属于空白期。目前正在进行的全球首个专门针对儿童4/M期NB的评估ATO联合化疗疗效的在册临床研究(中国临床试验注册号:ChiCTR1800014748,美国临床试验注册号:NCT03503864),截至2020年8月14日,根据目前入组的53例4/M期NB的病例数,试验组的客观缓解率较对照组提高40%(87.5%vs.46.2%,p=0.005)。ATO联合化疗治疗ARMS的临床研究(中国临床试验注册号ChiCTR1900024911),目前入组7例ARMS,初诊ARMS患儿共3例,全部3例患儿均达到完全缓解(CR);复发难治ARMS共4例,其中CR 2例,部分缓解(PR)1例,疾病稳定(SD)1例。
目前临床前研究证实HH通路的信号激活,与SHH,PTCH,SMO,GLI蛋白具有相关性。但这4个蛋白的表达情况与儿童实体瘤的关系在目前临床检测中鲜有研究。
发明内容
基于此,本发明的目的之一在于提出一种用于检测儿童实体瘤的靶标或其组合。
包括如下技术方案:
一种用于检测儿童实体瘤的靶标或其组合,所述靶标或其组合包括蛋白:SHH,PTCH,SMO,GLI中的至少一种。
在其中一些实施例中,上述靶标组合包括蛋白:SHH,PTCH,SMO和GLI。
本发明的目的之一还在于提出一种上述靶标或其组合在制备检测、分类或预测、治疗监测、预后或其它评价儿童实体瘤的试剂盒中的应用。
在其中一些实施例中,上述儿童实体瘤选自神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、淋巴母细胞瘤、髓母细胞瘤。
本发明的目的之一还在于提出一种儿童实体瘤检测试剂盒。
实现上述目的的技术方案如下:
一种儿童实体瘤检测检测试剂盒,其包括检测上述靶标或其组合的表达程度的试剂。
在其中一些实施例中,上述试剂盒通过抗原抗体反应对包括权利要求1-2任一项靶标或其组合进行检测。
在其中一些实施例中,上述试剂盒为采用免疫组化、酶联免疫吸附法、蛋白/肽段芯片检测、免疫印迹、微珠免疫检测、微流控免疫检测或它们的组合制备而成的试剂盒。
在其中一些实施例中,上述试剂盒为免疫组化检测试剂盒,用于免疫染色包括权利要求1-2任一项靶标或其组合的表达水平。
在其中一些实施例中,上述试剂盒包括过氧化物酶阻断剂、一抗试剂、二抗试剂、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、苏木素复染液以及免疫组化抗原修复缓冲液,其中,所述一抗试剂包括SHH抗体工作液、PTCH抗体工作液、SMO抗体工作液和GLI抗体工作液中的任意至少一种;所述二抗试剂为酶标多克隆羊抗兔免疫球蛋白。
在其中一些实施例中,上述一抗试剂包括SHH抗体工作液、PTCH抗体工作液、SMO抗体工作液和GLI抗体工作;
所述SHH抗体工作液包括3-6μg/mL的SHH兔单克隆IgG抗体;
所述PTCH抗体工作液包括3-6μg/mL的PTCH兔多克隆IgG抗体;
所述SMO抗体工作液包括3-6μg/mL的SMO兔多克隆IgG抗体;
所述GLI抗体工作液包括3-6μg/mL的GLI兔多克隆IgG抗体。
在其中一些实施例中,上述二抗试剂中HRP酶标多克隆羊抗兔免疫球蛋白的浓度为2μg/mL-5μg/mL。
与现有技术相比,本发明具有以下有益效果:
本发明的发明人通过对HedgeHog通路和儿童实体瘤的深入研究,找到了4个蛋白SHH,PTCH,SMO,GLI,发现通过检测这些蛋白阳性表达水平变化,可以有效应用于检测、分类或预测、治疗监测、预后或其它评价儿童实体瘤中;基于此研制了一种儿童实体瘤检测检测试剂盒并制订了一套标准化的检测方法,可大大提高检测结果的准确率,减少人员操作误差导致假阳性或假阴性,规范病理医生的判读结果,保证检测结果的一致性。从而为儿童实体瘤的检测、分类或预测、治疗监测、预后或其它评价中提供有效的临床指导意义。
附图说明
图1为Hedgehog(HH)信号通路各组件作用示意图。
图2为实施例3中编号为235915的临床样本免疫组化检测结果图。
图3为实施例3中编号为652483的临床样本免疫组化检测结果图。
图4为实施例3中编号为32001372的临床样本免疫组化检测结果图。
图5为实施例3中编号为513254-19的临床样本免疫组化检测结果图。
图6为实施例3中编号为C2103695的临床样本免疫组化检测结果图。
图7为实施例3中编号为202100417的临床样本免疫组化检测结果图。
图8为实施例3中编号为202105125的临床样本免疫组化检测结果图。
图9为实施例3中编号为N107244的临床样本免疫组化检测结果图。
图10为实施例3中编号为218301-7的临床样本免疫组化检测结果图。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现,并不限于本文所描述的实施例。相反地,提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂,均为市售产品。
除非另有定义,本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的,不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
在整个说明书和权利要求书中,以下术语具有与本文明确相关的含义,除非上下文另有明确规定。在本发明中使用的短语“在一个实施方案中”不一定指代相同的实施方案,尽管其可能是。此外,在本发明中使用的短语“在另一实施方案中”不一定指代不同的实施方案,尽管其可能是。因此,如下所述,可以容易地组合本发明的各个实施方案,而不脱离本发明的范围或精神。
此外,如本发明所使用的,术语“或”是包含性的“或”符号,并且等同于术语“和/或”,除非上下文另有明确规定。术语“基于”不是排他性的,并且允许基于未描述的其他因素,除非上下文另有明确规定。此外,在整个说明书中,“一个”、“一种”和“所述/该”的含义包括复数指示物。“在......中”中的含义包括“在......中”和“在......上”。
以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
实施例1试剂盒的制备及其检测方法
试剂盒的组成及配制:
包括过氧化物酶阻断剂、一抗试剂、二抗试剂、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、苏木素复染液以及免疫组化抗原修复缓冲液;具体如下表所示:
表1-1
抗原修复液:选用中山澳泉低pH抗原修复液粉剂1包加入2L蒸馏水配制成抗原修复工作液,具体为pH6.0 0.1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,包括3.8ml的0.1M柠檬酸和16.2ml的0.1M柠檬酸钠。
DAB显色液:取5ml塑料试管一支,分别加入DAB Substrate Buffer 2ml和DABChromogen 20μL混匀备用。
试剂盒检测步骤:
免疫组化检测主要步骤包括石蜡切片烤片→脱蜡→抗原修复→阻断→一抗→二抗→显色;
(1)烤片:取待检组织样品切片4-5μm,捞取在阳离子防脱玻片中央区域进行裱片,置于58℃±2℃恒温箱内烤片1小时。
(2)脱蜡:采用罗氏诊断产品(上海)有限公司的脱蜡清洗缓冲液进行如下步骤:
EZ prep:将已烤干的切片依次置于EZ prepI、II、III、Ⅳ脱蜡;
EZ prep(I):65℃±2℃水浴箱内脱蜡浸泡5分钟;
EZ prep(II):65℃±2℃水浴箱内脱蜡浸泡5分钟;
EZ prep(III):65℃±2℃水浴箱内脱蜡浸泡5分钟;
EZ prep(Ⅳ):65℃±2℃水浴箱内脱蜡浸泡5分钟;
自来水流水冲洗2分钟;过蒸馏水1分钟。
(3)抗原修复:将已冲洗干净组织切片放入已加入抗原修复液的高压锅内,盖好高压检查安全筏,用高火加热煮沸后调至低火保持沸腾喷气3分钟,关掉正在工作中的电磁炉开关,5分钟后将高压锅移至冷水中冷却。
待高压锅内抗原修复液完全冷却后,打开高压锅将组织切片用流水冲洗干净移至蒸馏水中浸泡2分钟;
(4)阻断:3%H2O2中浸泡8分钟,流水冲洗蒸馏水冲洗。
(5)滴加一抗(SHH抗体工作液(3μg/mL)、PTCH抗体工作液(3μg/mL)、SMO抗体工作液(4μg/mL)和GLI抗体工作液(4μg/mL))。
取出切片,擦干组织周围的水,用免疫组化笔在组织块周围画一圆圈注意圈接头要接好,防止抗体跑出圈外造成假阴性。防止组织干片,PBS冲洗;
甩去待测组织切片上多余的PBS后滴加抗体,阳性对照组织切片(神经母细胞瘤组织,于中山大学孙逸仙纪念医院采集获取)、阴性对照组织切片(阑尾组织,于中山大学孙逸仙纪念医院采集获取)上也滴加同样的抗体,抗体的量以充分覆盖组织块为度(约150μl);空白对照片上滴加兔IgG阴性抗体(Normal Rabbit IgG,安捷伦)。注意:切片在加抗体前要保持湿润,切忌干燥;加抗体前组织片上残余水分不可过多,避免一抗被二次稀释;
将切片放入孵育盒中,盖好盖子,孵育盒放入37℃恒温箱中孵育1小时;
从冰箱里拿出试剂需放置室温30分钟恢复室温;
将孵育盒倾斜30~40度角用PBS洗3次,每次2分钟。
(6)滴加二抗
甩去切片上多余的PBS,在待测病人组织切片和阳性、阴性、空白对照片中滴加PostPrimary(二抗试剂-兔信号增强剂),试剂应充分覆盖组织,放入37℃恒温箱中孵育30分钟。
将孵育盒倾斜30~40度角用PBS洗3次,每次2分钟;
甩去切片上多余的PBS,在待测病人组织切片和阳性、阴性、空白对照片中滴加Polymer(二抗试剂-兔信号增强剂),试剂应充分覆盖组织,放入37℃恒温箱中孵育30分钟。
将孵育盒倾斜30~40度角用PBS洗3次,每次2分钟。
(7)显色、衬染、封片
取出切片,擦掉组织周围的多余的PBS,加入配好的DAB显色液中显色3~5分钟,在显微镜下控制染色的强度;
将切片置自来水中终止显色,再用流水冲洗5-10分钟;
苏木素染液复染1分钟,0.5%盐酸酒精分化3秒钟;
流水冲洗5-10分钟,返蓝;
脱水、透明、封片、镜检。
注:可根据手工染色流程方案,与市面上全自动免疫组化染色机进行自动化设定,设置关键要素参照上述手工免疫组化染色,低pH抗原修复液、37℃孵育、一抗参照30至60分钟,二抗参照30分钟。
(五)判读标准
HE:通过HE显微镜下阅片肿瘤区域、肿瘤周围基质、肿瘤细胞群内基质。肿瘤本身坏死区、手术过程中产生的烧灼和挤压,人为损伤区域在评估中要扣除。
免疫组化:SMO阳性定位肿瘤细胞的细胞核/浆,棕黄色,阴性肿瘤细胞无表达。GLI阳性定位肿瘤细胞的细胞核/浆,棕黄色,阴性肿瘤细胞无表达。SHH阳性定位肿瘤细胞的细胞浆,棕黄色,阴性肿瘤细胞无表达。PTCH阳性定位肿瘤细胞的细胞浆,棕黄色,阴性肿瘤细胞无表达。
阳性:肿瘤细胞阳性呈棕黄色细胞核或细胞浆染色,肿瘤间质免疫不参与判读,任何强度染色的肿瘤细胞/总的肿瘤细胞数x100%:5、10、20、25、30、40、50、60、75、80、90、100%,≥5%为阳性;
阴性:肿瘤细胞阳性呈棕黄色细胞核或细胞浆染色,肿瘤间质免疫不参与判读,任何强度染色的肿瘤细胞/总的肿瘤细胞数x100%,<5%为阴性。
实施例2临床样本的检测
从中山大学孙逸仙纪念医院采集10例儿童HH驱动肿瘤患儿的穿刺或手术标本,其中神经母细胞瘤6例、横纹肌肉瘤1例、淋巴母细胞瘤1例、髓母细胞瘤1例、肾母细胞瘤1例。经10%中性福尔马林固定48-72小时石蜡包埋(FFPE),采用实施例1所述免疫组化试剂盒进行检测,检测结果统计情况如下表2-1所示。
表2-1
其中:CR为完全缓解,PR为部分缓解,SD为疾病稳定;(-)即<5%为免疫组化阴性,(+)即≥5%为免疫组化阳性,下同。
实施例3临床样本检测
从中山大学孙逸仙纪念医院采集9例儿童血液肿瘤专科白片样本,采用实施例1所述免疫组化试剂盒进行检测,检测结果统计情况如下表3-1,每例样本的部分免疫组化结果如图2-10所示。
表3-1
根据目前的数据分析,可发现危险度分级为高危或临床分期为晚期的HH驱动肿瘤患儿肿瘤组织均表现HH通路组件蛋白高阳性率,证实检测方法的成功建立并具有高度敏感性。后续纳入更多病例,可统计分析HH通路组件蛋白阳性比例与肿瘤危险度、临床分期、疗效及长期预后的相关性,为儿童HH驱动肿瘤提供新的、有效且可行的预后预测标志。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
Claims (10)
1.一种用于检测儿童实体瘤的靶标或其组合,其特征在于,所述靶标或其组合包括蛋白:SHH,PTCH,SMO,GLI中的至少一种。
2.根据权利要求1所述用于检测儿童实体瘤的靶标组合,其特征在于,所述靶标组合包括蛋白:SHH,PTCH,SMO和GLI。
3.权利要求1-2任一项靶标或其组合在制备检测、分类或预测、治疗监测、预后或其它评价儿童实体瘤的试剂盒中的应用。
4.根据权利要求3所述应用,其特征在于,所述儿童实体瘤选自神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、淋巴母细胞瘤、髓母细胞瘤。
5.一种儿童实体瘤检测试剂盒,其特征在于,包括检测权利要求1-2任一项所述靶标或其组合的表达程度的试剂。
6.根据权利要求5所述检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒通过抗原抗体反应对包括权利要求1-2任一项靶标或其组合进行检测;所述试剂盒为采用免疫组化、酶联免疫吸附法、蛋白/肽段芯片检测、免疫印迹、微珠免疫检测、微流控免疫检测或它们的组合制备而成的试剂盒。
7.根据权利要求6所述检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒为免疫组化检测试剂盒,用于免疫染色包括权利要求1-2任一项靶标或其组合的表达水平。
8.根据权利要求7所述检测试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括过氧化物酶阻断剂、一抗试剂、二抗试剂、DAB显色底物、DAB显色缓冲液、苏木素复染液以及免疫组化抗原修复缓冲液,其中,所述一抗试剂包括SHH抗体工作液、PTCH抗体工作液、SMO抗体工作液和GLI抗体工作液中的任意至少一种;所述二抗试剂为酶标多克隆羊抗兔免疫球蛋白。
9.根据权利要求8所述检测试剂盒,其特征在于,所述一抗试剂包括SHH抗体工作液、PTCH抗体工作液、SMO抗体工作液和GLI抗体工作;
所述SHH抗体工作液包括3-6μg/mL的SHH兔单克隆IgG抗体;
所述PTCH抗体工作液包括3-6μg/mL的PTCH兔多克隆IgG抗体;
所述SMO抗体工作液包括3-6μg/mL的SMO兔多克隆IgG抗体;
所述GLI抗体工作液包括3-6μg/mL的GLI兔多克隆IgG抗体。
10.根据权利要求8所述检测试剂盒,其特征在于,所述二抗试剂中HRP酶标多克隆羊抗兔免疫球蛋白的浓度为2μg/mL-5μg/mL。
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2021
- 2021-07-06 CN CN202110763960.3A patent/CN113552352A/zh active Pending
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