CN116356034A - 一种用于预测儿童神经母细胞瘤复发的检测试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于预测儿童神经母细胞瘤复发的检测试剂盒及其应用。本申请的检测试剂盒可以快速检测血清中BDNF表达水平变化，通过对儿童神经母细胞瘤发生机制的深入研究，发现神经母细胞瘤患儿血清中BDNF的浓度水平高低以及治疗后BDNF的浓度变化可以成为预测高危NB患儿治疗后是否复发的有效指标；本申请的检测方法在保证高敏感性和特异性的情况下，较传统ELISA法可以缩短实验时间达4小时以上，大大缩短了检测时间，减少人员操作误差导致假阳性或假阴性，保证检测结果的一致性。从而为儿童神经母细胞瘤的预后评价提供有效的临床指导意义。

Description

一种用于预测儿童神经母细胞瘤复发的检测试剂盒及其应用

技术领域

本申请涉及生物技术领域，尤其是涉及一种用于预测儿童神经母细胞瘤的复发的检测试剂盒及其应用。

背景技术

神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是儿童常见的恶性实体肿瘤，发病率约为(0.3～5.5)/10万，80％病例发生于5岁以下儿童。NB起源于原始神经嵴细胞，具有原发部位隐匿、早期诊断困难、恶性程度高、发展迅速和早期转移等临床特点，高危NB患儿即使经过积极治疗，仍有50％的患儿出现复发，远期生存率极低，属公认的儿童肿瘤难治症。尝试建立能有效预测复发的检测指标以对NB患儿进行预后判断以及应用针对性的“个体化”分层治疗方案，对提高NB患儿的长期存活具有重要意义。

脑神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)是一类分子量为12.3KD的碱性蛋白质，由119个氨基酸残基构成，并含有3对二硫键，在体内以二聚体的形式存在，主要分布在中枢神经系统，并对多种类型神经元的生长、发育、分化、维护和再生具有重要作用。研究发现原肌球蛋白酪氨酸激酶受体家族(Trk)成员之一的TrkB是BDNF的高亲和性受体，高表达TrkB的NB肿瘤细胞增殖快且容易发生远处侵袭性转移；BDNF与NB细胞上的TrkB受体结合后，TrkB受体发生同源二聚体化导致其胞内段的酪氨酸激酶区域活化，从而启动NB肿瘤细胞内信号级联反应：(1)激活PI3K/AKT通路，抑制凋亡蛋白的活性加快肿瘤生长，(2)激活Ras/MAPK信号通路，激活抗凋亡蛋白，促进肿瘤生长及转移(图1)。

目前已证实BDNF/TrkB信号转导通路与NB的发生及不良预后有关，且TrB的高表达也为高危NB公认的标志之一。本申请人的前期研究亦与其他研究者的报道一致，显示BDNF的高亲和性受体TrkB在预后不良的4期NB中的表达阳性率为100％，但高危NB的患儿如何能准确地预测其在接受相应的治疗方案后会否复发？仍是目前儿童肿瘤临床诊治中面临的挑战。

目前检测血清中BDNF水平的方法多采用酶联免疫吸附法(ELISA法)，传统夹心ELISA利用的是一对能够结合于靶蛋白上至少两个不同位点的抗体。捕获抗体预包被于微孔板的微孔表面，并与靶蛋白选择性结合。清洗后，加入检测抗体，连接到靶蛋白的第二位点，形成夹心复合物。该方法具有高灵敏、高专一性的特点，但实验的操作时间需要5小时以上，主要原因是一抗抗体的特异性结合力较差，标准品的制备步骤繁琐。

因此，亟需一种可以缩短时间、简化标准品的检测血清中BDNF水平的试剂盒。

发明内容

本申请的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种用于预测儿童神经母细胞瘤复发的检测试剂盒及其应用。本申请制备的检测试剂盒可以快速检测血清中BDNF表达水平变化，在保证高敏感性和特异性的情况下，可大大缩短检测时间，减少人员操作误差导致假阳性或假阴性，保证检测结果的一致性，为儿童神经母细胞瘤的预后评价提供有效的临床指导意义。

为实现上述目的，本申请采取的技术方案为：

第一目的，本申请提供了一种BDNF作为标志物在制备用于预测儿童神经母细胞瘤复发的产品中的应用。

第二目的，本申请提供了检测BDNF表达水平的试剂在制备用于预测儿童神经母细胞瘤复发的产品中的应用。所述BDNF标志物在复发神经母细胞瘤患儿血清中的表达水平要高于缓解神经母细胞瘤患儿血清。

在本申请的技术方案中，本申请发现复发神经母细胞瘤患儿血清中BDNF浓度水平明显高于缓解神经母细胞瘤患儿血清；在对14例神经母细胞瘤患儿治疗前后血清中BDNF的浓度检测发现4例复发的患儿治疗后的BDNF浓度反而较治疗前升高，而10例神经母细胞瘤缓解的患儿治疗后的BDNF浓度均较治疗前明显下降。结果显示：神经母细胞瘤患儿血清中BDNF的浓度水平高低以及治疗后BDNF的浓度变化可以成为预测高危NB患儿治疗后是否复发的有效指标。目前将BDNF检测水平作为高危神经母细胞瘤患儿复发预测指标的研究目前国内外均未见报道。

作为本申请所述应用的优选实施方式，所述产品包括芯片或试剂盒。

第三目的，本申请提供了一种用于预测儿童神经母细胞瘤复发的检测试剂盒，所述试剂盒包括检测BDNF表达水平的试剂。

本申请提供了可以快速检测血清中BDNF表达水平变化的检测试剂盒，本申请通过对儿童神经母细胞瘤发生机制的深入研究，发现通过检测血清中BDNF表达水平变化，可以有效应用于预测评价儿童神经母细胞瘤的预后；基于此研制了一种检测血清中BDNF的改良的快速检测的ELISA试剂盒，在保证高敏感性和特异性的情况下，可大大缩短检测时间，减少人员操作误差导致假阳性或假阴性，保证检测结果的一致性。从而为儿童神经母细胞瘤的预后评价提供有效的临床指导意义。

作为本申请所述用于预测儿童神经母细胞瘤复发的检测试剂盒的优选实施方式，所述试剂盒包括用于预测儿童神经母细胞瘤复发的ELISA检测试剂盒。

作为本申请所述用于预测儿童神经母细胞瘤复发的检测试剂盒的优选实施方式，所述检测试剂盒包括：

BDNF抗原、BDNF单克隆抗体、质控品、BDNF标准品、偶联抗体、底物液和终止液。

在一些具体实施例中，所述BDNF抗原为含有BDNF合成肽的Tris缓冲液，在Tris缓冲液中，所述BDNF合成肽的质量浓度为4.5～5.5μg/ml。所述TRIS缓冲液的浓度为10mmol/L。

在一些具体实施例中，所述质控品为含有BDNF合成肽的冻干粉的Tris缓冲液，在Tris缓冲液中，所述BDNF合成肽的质量浓度为1.4～1.6μg/L或4.25～4.6μg/L。

在一些具体实施例中，所述BDNF标准品包括标准品0～5；所述标准品0为不含有BDNF合成肽的冻干粉的Tris缓冲液；所述标准品1～5为含有BDNF合成肽的冻干粉的Tris缓冲液1～5，在Tris缓冲液1中，所述BDNF合成肽的质量浓度为0.75μg/L；在Tris缓冲液2中，所述BDNF合成肽的质量浓度为1.25μg/L；在Tris缓冲液3中，所述BDNF合成肽的质量浓度为2.50μg/L；在Tris缓冲液4中，所述BDNF合成肽的质量浓度为5.00μg/L；在Tris缓冲液5中，所述BDNF合成肽的质量浓度为10.00μg/L。

在一些具体实施例中，BDNF单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：取健康雄性家兔，采用皮下注射方式，对家兔58处部位进行免疫接种，初次免疫注射1mg/ml浓度的BDNF抗原0.2ml，第3周、第4周及第5周注射1mg/ml浓度的BDNF抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合溶液0.4ml；拉颈处死家兔，收集血液，3000r/min离心30min后取上清，加入防腐剂和稳定剂，4℃密封保存。

第四目的，本申请提供了一种非疾病诊断和治疗目的的检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

1)向BDNF微孔板中加入生物素标记的BDNF抗原，孵育；

2)在步骤1)的BDNF微孔板中加入BDNF标准品、质控品及血清样，再加入BDNF单克隆抗体，混合孵育，形成抗原抗体复合物；

3)向步骤2)的BDNF微孔板中加入过氧化物酶偶联抗体，通过孵育将过氧化物酶偶联抗体和抗原抗体复合物进一步结合；

4)向步骤3)的BDNF微孔板中加入底物液，孵育，再加入终止液，在2小时内以650nm为参照测定450nm下的吸光度，根据标准品回归拟合的标准曲线计算质控品及血清样中的BDNF浓度值。

作为本申请所述BDNF多肽的检测方法的优选实施方式，所述步骤1)的BDNF微孔板为预包被链菌抗生物素蛋白的BDNF微孔板。

通过蛋白包被的微孔板能将BDNF单克隆抗体通过Fc区附着到微孔板上，从而正确地定向他们，并保留其抗原结合能力。

作为本申请所述BDNF多肽的检测方法的优选实施方式，所述步骤1)中，孵育的温度为18～22℃，孵育30min；所述步骤2)中，孵育的温度为2～8℃，孵育30min。

采用上述检测方法可以大大缩短检测BDNF的时间，减少人员操作误差导致假阳性或假阴性，保证检测结果的一致性；同时检测敏感性和特异性也较高。

与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：

本申请提供了一种用于预测儿童神经母细胞瘤复发的检测试剂盒及其应用，本申请的检测试剂盒可以快速检测血清中BDNF表达水平变化，通过对儿童神经母细胞瘤发生机制的深入研究，发现神经母细胞瘤患儿血清中BDNF的浓度水平高低以及治疗后BDNF的浓度变化可以成为预测高危NB患儿治疗后是否复发的有效指标；基于此本申请研制了一种检测血清中BDNF的改良的快速检测的ELISA试剂盒，在保证高敏感性和特异性的情况下，较传统ELISA法可以缩短实验时间达4小时以上，大大缩短了检测时间，减少人员操作误差导致假阳性或假阴性，保证检测结果的一致性。从而为儿童神经母细胞瘤的预后评价提供有效的临床指导意义。

附图说明

图1为BDNF/TrkB信号传导通路图(主要的下游通路为：①激活PI3K/AKT通路，抑制凋亡蛋白的活性加快肿瘤生长②激活Ras/ERK信号通路，激活抗凋亡蛋白，促进肿瘤生长及转移)；

图2为实施例1和对比例1的血清BDNF检测结果标准对数曲线图(左侧为实施例1的试剂盒；右侧为对比例1的试剂盒)；

图3为对比例1的标准品制备部分流程图；

图4为试验例一的各组血清BDNF浓度(单位：ng/L)；

图5为不同治疗结局的NB患儿初发时血清BDNF的浓度比较(单位：ng/mL)。

具体实施方式

为更好的说明本申请的目的、技术方案和优点，下面将结合附图和具体实施例对本申请作进一步说明。

在以下实施例中，所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法，所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本申请所述“抗体”应该解释为涵盖具有所需特异性的结合结构域的任意特异性结合因子。本申请所述单克隆抗体可以是，例如，单价的或是单链抗体、双链抗体、嵌合抗体、人源化抗体、以及上述抗体的衍生物、功能等同物和同源物，也包括抗体片段和含有抗原结合结构域的任何多肽。

实施例1、一种用于预测儿童神经母细胞瘤复发的检测试剂盒及其应用

本实施例提供了一种用于预测儿童神经母细胞瘤的指标BDNF的检测试剂盒，所述检测试剂盒包括：生物素标记的BDNF抗原、BDNF单克隆抗体、质控品、BDNF标准品、过氧化物酶偶联抗体、底物液和终止液。

所述检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：

(1)制备生物素标记的BDNF抗原：取BDNF合成肽20～30mg，与10ml浓度为10mmol/L的TRIS缓冲液混合，得抗原稀释液。取浓度为1.2～1.35mg/ml的生物素，按照抗原稀释液：生物素＝1:4体积比混合，采用简易过碘酸钠法将生物素与BDNF合成肽交联，获得生物素标记的BDNF抗原，然后加入防腐剂和稳定剂，所述BDNF抗原的浓度为4.5～5.5μg/ml。

(2)BDNF单克隆抗体的制备：取健康雄性家兔，采用皮下注射方式，对家兔58处部位进行免疫接种，初次免疫注射1mg/ml浓度的BDNF抗原0.2ml，第3周、第4周及第5周注射1mg/ml浓度的BDNF抗原与不完全弗氏佐剂等体积混合溶液0.4ml；拉颈处死家兔，收集血液，3000r/min离心30min后取上清，加入防腐剂和稳定剂，4℃密封保存。

(3)质控品制备：将BDNF合成肽冻干粉(Abnova，P4375)与10mmol/L的TRIS缓冲液混合，质控品1中BDNF浓度约为1.4～1.6μg/L，质控品2中BDNF浓度约为4.25～4.6μg/L，并加入1％的BSA和0.018％的Bronidox 5L作为防腐剂和稳定剂，4℃密封保存。

(4)BDNF标准品制备：取3ml浓度为10mmol/L的TRIS缓冲液作为标准品0，加入1％的BSA和0.018％的Bronidox 5L作为防腐剂和稳定剂，4℃密封保存。

标准品1-5取BDNF合成肽冻干粉，分别用10mmol/L的TRIS缓冲液稀释至BDNF浓度为0.75μg/L，1.25μg/L，2.50μg/L，5.00μg/L，10.00μg/L，各取0.4ml，分装，4℃密封保存。所述标准品0为不含有BDNF合成肽的冻干粉的Tris缓冲液。

其他：过氧化物酶偶联抗体、预包被链菌抗生物素蛋白的BDNF微孔板(TAKARA，MK100)、底物液(Sigma-Aldrich，p7998)、终止液(Solarbio，C1058)和清洗液(Saint-Bio，T16382)。

表1本申请用于预测儿童神经母细胞瘤的指标BDNF的检测试剂盒

采用上述制备的检测试剂盒检测BDNF多肽的方法(改良ELISA法)，包括以下步骤：

1)预孵育：向BDNF微孔板(预包被链菌抗生物素蛋白的BDNF微孔板)的各孔加入100μL上述制备的生物素标记的BDNF抗原，用封口膜密封，室温(18～22℃)下孵育30分钟，不要震荡；

2)清洗：用洗涤缓冲液以1体积浓缩洗涤缓冲液(20X)加20体积蒸馏水的比例稀释，手工清洗微孔板5次。

3)抗体孵育：向步骤1)的BDNF微孔板的孔中加入40μL血清BDNF标准品(0～5)，质控品及血清样，再加入100μL BDNF单克隆抗体溶液。用封口膜密封微孔板，在冰箱中(2～8℃)下孵育30分钟，不要震荡；最终形成抗原抗体复合物。

4)清洗：同步骤2)。

5)向步骤3)的BDNF微孔板中加入过氧化物酶偶联抗体(AAT Bioquest，AAT-5506)，通过孵育将过氧化物酶偶联抗体和抗原抗体复合物进一步结合；

6)向步骤5)的BDNF微孔板中加入100μL底物液，用封口膜密封，室温(18～22℃)下孵育15分钟，不要震荡。再加入100μL终止液，在2小时内以650nm为参照测定450nm下的吸光度，计算每组重复标准品、对照品和样品的平均吸光度，并减去平均零标准光密度。在对数曲线图纸上或使用西格玛绘图软件绘制标准曲线，标准浓度在x轴上，吸光度在y轴上。通过标准点绘制最佳拟合直线，见图2。

试验例一、临床样本检测

1、本试验分别从产科足月新生儿(新生儿组)、儿童保健门诊(儿童组)、体检科青壮年(成人组)以及我院儿童肿瘤专科4期NB患儿(患者组)中采集脐血或外周血2ml，用离心机在37℃条件下静置1小时，再用离心机1500g，10min。收集上层清亮液体至EP管中，放-20℃冰箱保存。采用上述本申请用于预测儿童神经母细胞瘤的指标BDNF的检测试剂盒(详见实施例1的实验方法)进行检测，检测结果统计情况如下图4。数据采用SPSS21.0统计软件进行数据分析，统计描述指标为中值(P25，P75)，进行K个独立样本Kruskal Wallis H检验及多组样本间两两比较Mann-Whitney U检验，检验水准设定为0.05，P＜0.05则为有统计学意义。

各组结果如下：参考表2，患者组血清BDNF浓度为：4168.00(2904.25，5701.25)ng/L。新生儿组脐血BDNF浓度为：3628.50(1755.75，6449.25)ng/L。儿童组(3-7岁的健康儿童)血清BDNF浓度为：2195.00(846.45，3690.25)ng/L。成人组(16～35岁的青壮年)血清BDNF浓度为：1471.00(1132.00，2056.00)ng/L。比较组间差异，结果如下：(1)患者组、新生儿组血清或脐血中BDNF浓度高于成人组(16-35岁)、儿童组(3-7岁)；(2)NB患者组与新生儿组间、儿童组与成人组间，并无显著差异。以上结果证实NB患儿血清中BDNF的浓度明显高于正常儿童组(3～7岁)，BDNF在血清中的高水平表达是导致儿童NB持续进展的重要因素。

表2

2、从中山大学孙逸仙纪念医院儿科肿瘤专科收集14例儿童NB初发时的血清，方法为先抽取14例患儿的外周血2ml，用离心机在37℃条件下静置1小时，再用离心机1500g，10min。收集上层清亮液体至EP管中，放-20℃冰箱保存。全部患儿随访至结束治疗后1年，分为复发组和缓解组，其中缓解组包括完全缓解和部分缓解的患儿。分离好的血清采用上述本申请用于预测儿童神经母细胞瘤的指标BDNF的检测试剂盒(详见实施例1的实验方法)进行检测，检测结果统计情况如下图5和表3。数据采用SPSS21.0统计软件进行数据分析，统计描述指标为中值(P25，P75)，进行K个独立样本Kruskal Wallis H检验，检验水准设定为0.05，P＜0.05则为有统计学意义。根据目前的数据分析：复发组4例，缓解组10例，复发组患儿血清中BDNF水平明显高于缓解组。后续纳入更多病例，可统计分析初发时高水平的血清BDNF与肿瘤危险度、临床分期、疗效及长期预后的相关性，为儿童NB提供新的、有效且可行的复发预测指标。

表3

结论：复发组患儿初发时血清中BDNF的浓度比缓解组患儿明显升高，差异有统计学意义(P＝0.014)。

3、从中山大学孙逸仙纪念医院儿科肿瘤专科收集14例儿童NB患者治疗前后的血清，采集方法同上述。所有患儿随访至治疗结束后1年，治疗结局分为复发组和缓解组，其中缓解组包括完全缓解和部分缓解的患儿。收集后分离好的血清采用上述本申请用于预测儿童神经母细胞瘤的指标BDNF的检测试剂盒(详见实施例1的实验方法)进行检测，检测结果统计情况如下表4。

表4不同治疗结局的NB治疗前后血清BDNF浓度变化(ng/mL)

根据目前的数据分析：14例NB患儿中结疗后1年复发组4例，缓解组10例。4例复发的患儿治疗后的BDNF浓度反而较治疗前升高，而10例缓解的患儿治疗后的BDNF浓度均较治疗前明显下降。该结果证实NB患儿血清中BDNF的浓度水平高低以及治疗后BDNF的浓度变化可以成为预测高危NB患儿治疗后是否复发的有效指标。

对比例1、传统BDNF的ELISA试剂盒及其传统ELISA检测方法

本对比例提供了传统BDNF的ELISA试剂盒，具体组成如表5所示。

表5传统BDNF的ELISA试剂盒组成

名称	规格
		BDNF微孔板	96孔板
标准品稀释液	20ml
		BDNF抗体(Biolegend，446607)	6ml
质控品	1ml
		标准品	0.6ml
过氧化物酶偶联抗体	6ml
		HRP链霉亲和素浓缩液	6ml
实验稀释液	20ml
		洗涤缓冲液	20ml，20X
底物液	6ml
		终止液	6ml

传统BDNF试剂盒检测步骤：标准品制备→抗体→链霉亲和素孵育→底物反应→检测。

传统ELISA检测方法，包括以下步骤：

1、配制ELISA需要使用液体包括：

(1)标准品稀释液：

浓度0.01mol/L的PBS缓冲液(pH7.2-7.4)；

磷酸二氢钾(KH₂PO₄)：0.27g；

磷酸氢二钠(Na₂HPO₄)：1.42g；

氯化钠(NaCl)：8g；

KCl 0.2g；

加去离子水约800mL充分搅拌溶解，然后加入浓盐酸或者氢氧化钠调pH至7.2-7.4，后定容到1L.浓度为10mmol/L。

(2)实验稀释液：

牛血清白蛋白(BSA)0.1g；

加洗涤缓冲液至100ml；

或以羊血清、兔血清等血清与洗涤液配成5～10％使用。

(3)洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M

KH₂PO₄ 0.2g；

Na₂HPO₄·12H₂O 2.9g；

NaCl 8.0g；

KCl 0.2g；

Tween-20(0.05％)0.5ml；

加蒸馏水至1000ml。

(4)底物液(PH5.0磷酸棗柠檬酸):

0.2M Na₂HPO₄(28.4g/L)25.7ml

0.1M柠檬酸(19.2g/L)24.3ml

加蒸馏水50ml。

(5)终止液(2M H₂SO₄)：

蒸馏水178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。

2、标准品(1～5)制备：1.样品稀释：血清样品的稀释应使用标准品稀释液，稀释度为100倍。2.标准品制备：标注标准蛋白的小瓶中加入720μL标准品稀释液，以制备400ng/ml的标准品。再加入40μL BDNF标准溶液，加入960μL分析稀释液以制备16ng/mL标准溶液。用移液管将300μl标准品稀释液移到每根试管中。储备液(如下图3所示)用于生产稀释液。在下一次转移之前，将每根管子彻底混合。标准品稀释液作为零标准(0ng/mL)。

3、孵育抗体：首先取50μL的标准品，将其分别加于酶标板的空白微孔中，然后取样品50μL分别加入其他微孔中，对两组分别进行标记编号。向小瓶中添加100μL 1X试验稀释液，以制备检测抗体浓缩物。上下吸管轻轻搅拌(浓缩液可在4℃下储存5天)。向每个孔中添加100μL 1X制备的BDNF抗体(Biolegend，446607)。在室温下轻轻摇动培养1小时。快速旋转检测抗体瓶。期间采用洗机板对其进行清洗，每次静置10-20s，共进行5次清洗。

4、链霉亲和素孵育：1.配制链霉亲和素溶液：将50μL HRP链霉亲和素浓缩液加入10mL 1X标准品稀释液的试管中，以制备最终200倍稀释的HRP-链霉亲和素溶液(稀释后的溶液需现用)；混合均匀。2.孵育：向每个孔中添加100μL制备的链霉亲和素溶液。在室温下轻轻摇动培养45分钟。期间采用洗机板对其进行清洗，每次静置10-20s，共进行5次清洗。底物反应：向每个孔中添加100μL实验稀释液。在室温下，轻轻摇动，孵育30分钟。

5、终止反应并检测：向每个孔中添加50μL终止液，反应终止。然后用ELX 800酶标仪(Bio-TEK Instruments INC)定量测定450nm处的吸光度。

6、计算结果：计算每组重复标准品、对照品和样品的平均吸光度，并减去平均零标准光密度。在对数曲线图纸上或使用西格玛绘图软件绘制标准曲线，标准浓度在x轴上，吸光度在y轴上。通过标准点绘制最佳拟合直线(图2)。

从中山大学孙逸仙纪念医院儿科肿瘤专科收集5例儿童NB患者的血清(样本1～5)，采集方法同试验例一所示。

表6传统ELISA法和改良ELISA法质控及样本检测结果对比

由上述实验结果(表6)可知：用四参数对数曲线拟合构建标准曲线，同时用传统法和改良的ELISA法质控和患者样本(试验例一中的NB患儿标本)中血清中BDNF的浓度。结果证实两种方法的结果并无显著差异，本申请的检测试剂盒同样具有高敏感性、高特异性的特点，并且改良ELISA法较传统ELISA法可以缩短实验时间达4小时以上。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本申请的技术方案而非对本申请保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本申请作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本申请的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本申请技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.BDNF作为标志物在制备用于预测儿童神经母细胞瘤复发的产品中的应用。

2.检测BDNF表达水平的试剂在制备用于预测儿童神经母细胞瘤复发的产品中的应用。

3.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括芯片或试剂盒。

4.一种用于预测儿童神经母细胞瘤复发的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测BDNF表达水平的试剂。

5.如权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括用于预测儿童神经母细胞瘤复发的ELISA检测试剂盒。

6.如权利要求5所述的检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括：

BDNF抗原、BDNF单克隆抗体、质控品、BDNF标准品、偶联抗体、底物液和终止液。

7.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述BDNF抗原为含有BDNF合成肽的Tris缓冲液，在Tris缓冲液中，所述BDNF合成肽的质量浓度为4.5～5.5μg/ml。

8.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述质控品为含有BDNF合成肽的冻干粉的Tris缓冲液，在Tris缓冲液中，所述BDNF合成肽的质量浓度为1.4～1.6μg/L或4.25～4.6μg/L。

9.如权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述BDNF标准品包括标准品0～5；所述标准品0为不含有BDNF合成肽的冻干粉的Tris缓冲液；所述标准品1～5为含有BDNF合成肽的冻干粉的Tris缓冲液1～5，在Tris缓冲液1中，所述BDNF合成肽的质量浓度为0.75μg/L；在Tris缓冲液2中，所述BDNF合成肽的质量浓度为1.25μg/L；在Tris缓冲液3中，所述BDNF合成肽的质量浓度为2.50μg/L；在Tris缓冲液4中，所述BDNF合成肽的质量浓度为5.00μg/L；在Tris缓冲液5中，所述BDNF合成肽的质量浓度为10.00μg/L。

10.一种非疾病诊断和治疗目的的如权利要求4～9任一项所述的检测试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)向BDNF微孔板中加入生物素标记的BDNF抗原，孵育；

2)在步骤1)的BDNF微孔板中加入BDNF标准品、质控品及血清样，再加入BDNF单克隆抗体，混合孵育，形成抗原抗体复合物；

3)向步骤2)的BDNF微孔板中加入过氧化物酶偶联抗体，通过孵育将过氧化物酶偶联抗体和抗原抗体复合物进一步结合；

4)向步骤3)的BDNF微孔板中加入底物液，孵育，再加入终止液，在2小时内以650nm为参照测定450nm下的吸光度，根据标准品回归拟合的标准曲线计算质控品及血清样中的BDNF浓度值。

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