CN105349622A - Gls在制备肝癌诊断和预后评估试剂盒中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域,涉及一种GLS1和GLS2蛋白和基因的新应用,特别是在制备肝癌诊断和预后评估试剂盒中的应用,具体的说本发明的目的在于提供一种基于GLS1/GLS2蛋白表达检测、GLS1/GLS2?mRNA表达检测的肝癌早期诊断策略和应用。本发明包括用于肝癌诊断的GLS1/GLS2免疫组化检测试剂盒,GLS1/GLS2荧光定量PCR检测试剂盒。本发明检测试剂盒提供一种GLS1/GLS2免疫组化检测的方法。本发明检测试剂盒提供一种GLS1/GLS2免疫组化检测诊断肝细胞肝癌的标准。本发明方法是通过检测肝组织中GLS1/2mRNA、蛋白的表达变化的情况,预警肝组织的癌变是否发生及肝癌的发生发展情况,为肝癌的确诊及预后、靶向肿瘤代谢的个体化治疗提供必要的依据。
Description
所属技术领域
本发明属于生物技术领域,涉及一种GLS1和GLS2蛋白的应用,具体地说,涉及GLS1和GLS2蛋白在制备肝癌诊断和预后评估试剂盒中的应用。
背景技术
肝细胞癌(肝癌)是我国常见的恶性肿瘤。治疗仍以手术为主,但临床上90%的肝癌患者在被诊断为肝癌的时候,已经失去手术机会。而且,肝切除术后5年内复发率高达80%,长期存活率仍然不高。早期诊断是提高术后生存期的最重要的策略。因此,肝癌急需早期诊断和转移复发预测的标记物,提高肝癌的诊断率、手术率、和长期生存时间。
血清甲胎蛋白AFP升高与肿瘤复发相关,但约有40%的患者AFP为阴性,且与预后无正相关。迄今为止,尚无确定的蛋白标记能够较准确地诊断或预示肿瘤复发转移,也没有评价肝癌预后的指标。因此本领域迫切需要寻找能协助肝癌早期诊断和预测肝癌病情及预后的相关基因和/或蛋白,这方面的研究对临床治疗肝癌及预防肿瘤复发具有重要意义。
肿瘤细胞为适应其快速增殖的需要对其新陈代谢过程重编程产生了两个重要代谢途径——有氧糖酵解(AerobicGlycolysis)和谷氨酰胺酵解(Glutaminolysis)。肿瘤细胞即使在氧充足的条件下也将大部分的葡萄糖转化为乳酸,为其快速增殖提供充足的能量。但这也使得进入三羧酸循环(TCAcycle)的丙酮酸比例减少,致使细胞合成代谢的原料和中间产物不充足。为了弥补这种不足,肿瘤细胞产生了一个替代途径来补充这些中间产物,也就是谷氨酰胺酵解(Glutaminolysis)。谷氨酰胺由谷氨酰胺酶(Glutaminase,GLS)水解转变成谷氨酸,并且进一步被谷氨酸脱氢酶(Glutamatedehydrogenase,GDH)催化产生α-酮戊二酸(α-ketoglutarate,α-KG),进入三羧酸循环(TCAcycle),进而维持细胞代谢中间产物的充足,从而形成一个以谷氨酰胺为原料进入三羧酸循环的补充代谢流,称之为谷氨酰胺酵解。谷氨酰胺酶(Glutaminase,GLS)是谷氨酰胺酵解过程的关键限速酶,已有研究表明靶向GLS能够有效的杀伤肿瘤细胞。
在人类细胞中有两种类型的谷氨酰胺酶,即由2号染色体编码的GLS1和由12号染色体编码的GLS2。GLS1最早发现于肾脏(kidney-type),随后发现也表达在肿瘤细胞中,如人类B淋巴细胞瘤,乳腺癌,胰腺癌,胶质细胞瘤等肿瘤细胞中GLS1表达量或活性和正常组织相比明显增加,在大鼠和人肝癌(小样本)中也较正常肝细胞高。GLS1基因编码的蛋白有GAC(GlutaminaseC),KGA(kidneyGlutaminaseisoform)等;GLS2是2010年发现的一种肝型(liver-type)的肿瘤抑制因子。研究发现,GLS2在肝癌组织中的表达量明显低于正常肝组织。
我们前期临床研究发现:在450例肝癌组织和200例其它肝疾病组织中,GLS1在450例肝癌组织中的阳性率高90%,诊断肝癌的敏感性高达87.2%,特异性高达74.86%;有趣的是,GLS2的表达呈现出与GLS1表达完全相反的趋势。进一步我们追踪了90例患者发现,GLS1表达水平与患者的复发和预后相关,即GLS1高表达患者生存时间显著缩短。上述研究结果提示,谷氨酰胺酶GLS1和GLS2可能是一种潜在的肝癌生物标记。
目前,世界上尚未有将谷氨酰胺酶GLS1和GLS2作为肝细胞癌的生物标记的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供GLS1和GLS2蛋白和基因的新应用,特别是在制备肝癌诊断和预后评估试剂盒中的应用。
本发明提供一种基于GLS1/GLS2蛋白表达检测、GLS1/GLS2mRNA表达检测的肝癌早期诊断方法和应用。该方法和应用主要包括:
(1)提供诊断试剂盒临床检测所需的试剂以及可靠操作流程。
(2)临床可疑肝癌病例采取本诊断试剂盒检测,进行诊断和预后评估。
(3)提供一种基于GLS1和GLS2蛋白表达检测、GLS1和GLS2mRNA表达检测的肝癌早期诊断标准。
(4)扩大样本量验证肝癌和其他肝脏疾病组织中GLS1和GLS2蛋白免疫组织化学检测、GLS1和GLS2mRNA荧光定量PCR检测的情况。
(5)选择高敏感性GLS1和GLS2抗体、GLS1和GLS2引物。
本发明包括用于肝癌诊断的GLS1免疫组织化学检测试剂盒,GLS1和GLS2免疫组织化学检测试剂盒,GLS1荧光定量PCR检测试剂盒,GLS1和GLS2荧光定量PCR检测试剂盒。
本发明试剂盒提供一种GLS1和GLS2免疫组织化学检测的方法。本发明试剂盒提供一种GLS1和GLS2免疫组化检测诊断肝细胞肝癌的标准。本发明试剂盒包括试剂A,试剂B,试剂C,试剂D,试剂E和试剂F。
本发明试剂盒提供一种GLS1/GLS2荧光定量PCR的检测方法。本发明试剂盒包括特异性引物:GLS1的引物:其序列为上游SEQIDNO.1,下游SEQIDNO.2;GLS2的引物:其序列为上游SEQIDNO.3,下游SEQIDNO.4;内参基因GAPDH的引物,其序列为上游SEQIDNO.5,下游SEQIDNO.6;序列详细碱基对见序列表。
本发明所述的检测方法,其特异性特征是,所述的样本均来自肝癌病人肝组织中癌组织及远离癌巢的正常组织。
本发明的试剂盒为一种通过对组织或细胞提取总RNA,并通过逆转录mRNA样品得到cDNA,再结合荧光定量PCR检测技术,准确的检测标本中GLS1和GLS2mRNA的表达量的试剂盒。
本发明方法是通过检测肝组织中GLS1和GLS2mRNA的表达变化量,预警肝组织的癌变是否发生及肝癌的发生发展情况,为肝癌的确诊及诊治过程提供重要信息。
本发明具有如下的有益效果:
本发明的临床意义是跟踪检测肝脏癌变的发生和病理演变过程中GLS1和GLS2蛋白、mRNA表达变化,预警肝癌发生发展趋势。
本发明的GLS1和GLS2与临床上其它癌症标志物,以及影像学检查有显著不同。
本发明可以在基因转录水平检测GLS1和GLS2基因的异常表达。在影像学检查发现占位性癌病灶之前,及时检测到GLS1和GLS2基因的表达异常,提供一种肝癌早期筛查、早期诊断、早期治疗的方法和应用,为肝癌患者脱离病痛提供极有前景的策略。
本发明中的GLS1和GLS2抗体、GLS1和GLS2引物检测试剂盒为肝癌及其他癌症的基础研究和临床研究提供了良好的工具。
本发明中GLS1和GLS2的表达与肝癌患者预后明显相关,对判断肝癌患者预后具有重要作用;对肝癌病人术后随访和序贯治疗具有重要的指导意义。
本发明中提供的试剂盒具有灵敏度高、特异性强、操作简单的特点,不仅可以在大中型医院推广,也可以在基层医院中广泛使用。
本发明的其他具体优点和效果将在下面继续说明。
附图说明:
图1GLS1和GLS2在肝癌组织中的分布与表达
免疫组织化学与荧光定量PCR两种方法检测112对肝癌组织和癌旁组织中GLS1、GLS2蛋白的分布与表达情况,苏木精-伊红染色(HEstaining)判定组织病理分类。图1A是免疫组织化学检测肝癌组织(TT)和癌旁组织(NT)中GLS1、GLS2蛋白分布与表达的代表图片(本专利申请附图的原始彩图中,肿瘤组织(TT)GLS1染色呈棕黄色阳性,GLS2染色阴性,而癌旁组织(NT)中GLS1染色阴性,GLS2染色呈棕黄色阳性)。图1B是112对肝癌组织和癌旁组织中GLS1、GLS2蛋白表达水平的统计数据。++代表强阳性染色,+代表弱阳性染色,-代表阴性染色;分别代表高表达、低表达、基本不表达。图1C是荧光定量PCR检测肝癌组织(TT)和癌旁组织(NT)中GLS1、GLS2mRNA的表达。**p<0.01,***p<0.001。
图2GS在肝癌组织中的分布与表达
免疫组织化学与荧光定量PCR两种方法检测112对肝癌组织和癌旁组织中谷氨酰胺合成酶(GS,GlutamineSynthetase)蛋白的分布与表达情况,苏木精-伊红染色(HEstaining)判定组织病理分类。图2A是免疫组织化学检测肝癌组织(TT)和癌旁组织(NT)中GS蛋白分布与表达的代表图片(本专利申请附图的原始彩图中,肿瘤组织(TT)中GS染色呈棕黄色阳性、呈现集中分布,而癌旁组织(NT)中GS染色呈棕黄色阳性、呈现弥散分布。)。图2B是112对肝癌组织和癌旁组织中GS蛋白表达水平的统计数据。++代表强阳性染色,高表达;+代表弱阳性染色,低表达。图2C是荧光定量PCR法检测肝癌组织(TT)和癌旁组织(NT)中GLULmRNA(编码GS蛋白)的表达。图2D是使用非配对Spearman相关性分析法分析GLULmRNA在肝癌组织(TT)和癌旁组织(NT)中表达的相关性。
图3GLS1和2在肝癌和其他肝病组织中的分布与表达
免疫组织化学法检测112对肝癌组织和癌旁组织、10个不典型增生组织、44个肝硬化组织、5个肝腺瘤组织、12个局灶性结节增生组织、20个正常肝组织中GLS1和GLS2的表达情况,苏木精-伊红染色(HEstaining)判定组织病理分类。图3A是免疫组织化学检测肝癌组织(TT)与癌旁组织(NT)、不典型增生组织(DN)、肝硬化组织(FL)、肝腺瘤组织(HCA)、局灶性结节增生组织(FNH)、正常肝组织(NL)中GLS1和GLS2表达的代表性图片(本专利申请黑白图片的原始彩图中肿瘤组织(TT)中GLS1染色呈棕黄色阳性,GLS2染色阴性;癌旁组织(NT)中GLS1染色阴性,GLS2染色呈棕黄色阳性;不典型增生组织(DN)中GLS1染色呈浅棕黄色弱阳性,GLS2染色呈浅棕黄色弱阳性;肝硬化组织(FL)中GLS1染色阴性,GLS2染色呈棕黄色阳性;肝腺瘤组织(HCA)中GLS1染色阴性,GLS2染色呈浅棕黄色弱阳性;局灶性结节增生组织(FNH)中GLS1染色阴性,GLS2染色呈棕黄色阳性;正常肝组织(NL)中GLS1染色阴性,GLS2染色呈棕黄色阳性。)。图3B&C是以上组织中GLS1、GLS2蛋白表达水平的统计数据。++/2代表强阳性染色,+/2代表弱阳性染色,-/0代表阴性染色;分别代表高表达、低表达、基本不表达。PP表示阳性率,NP表示阴性率,SE表示敏感性,SP特异性。
图4GLS1/2蛋白表达与肝癌的恶性转化情况分析
免疫组织化学法检测112个肝癌组织、10个不典型增生组织、19个IV期肝硬化组织、12个III期肝硬化组织、5个II期肝硬化组织、8个I期肝硬化组织、20个正常肝组织中GLS1和GLS2的表达情况,苏木精-伊红染色(HEstaining)判定组织病理分类。图4A是免疫组织化学检测肝癌组织(TT)、不典型增生组织(DN)、IV期肝硬化组织(S4)、III期肝硬化组织(S3)、II期肝硬化组织(S2)、I期肝硬化组织(S1)、正常肝组织(NL)中GLS1和GLS2表达的代表性图片(本专利申请黑白图片的原始彩图中肿瘤组织(TT)中GLS1染色呈棕黄色阳性,GLS2染色阴性;不典型增生组织(DN)中GLS1染色弱阳性,GLS2染色呈浅棕黄色弱阳性;IV期肝硬化组织(S4)中GLS1染色阴性,GLS2染色呈棕黄色阳性;III期肝硬化组织(S3)中GLS1染色阴性,GLS2染色呈棕黄色阳性;II期肝硬化组织(S2)中GLS1染色阴性,GLS2染色呈棕黄色阳性;I期肝硬化组织(S1)中GLS1染色阴性,GLS2染色呈棕黄色阳性;正常肝组织(NL)中GLS1染色阴性,GLS2染色呈棕黄色阳性。)。图4B是以上组织中GLS1、GLS2蛋白表达水平的统计数据。++代表强阳性染色,+代表弱阳性染色,-代表阴性染色;分别代表高表达、低表达、基本不表达;Weight表示加权值。
图5GLS1在肝癌组织中的表达与患者生存时间
组织芯片法检测90例肝癌患者的肝癌组织与癌旁组织中GLS1蛋白的表达,并分析患者的生存期与GLS1表达的关系。图5A是组织芯片法检测90个肝癌患者的肝癌组织(TT)与癌旁组织(NT)中GLS1蛋白的表达.的全图和统计数据,芯片图中颜色越深表示染色阳性程度越高,++代表强阳性染色,+代表弱阳性染色,-代表阴性染色;分别代表高表达、低表达、基本不表达。图5B是90例患者中低表达GLS1和高表达GLS1患者的生存时间比较,黑线表示GLS1低表达患者(包括阴性和弱阳性染色的患者)的生存时间,红线表示GLS1高表达患者(表示强阳性染色的患者)的生存时间,圆圈表示统计中断。
图6GLS2在肝癌组织中的表达与患者生存时间
组织芯片法检测90例肝癌患者的肝癌组织与癌旁组织中GLS2蛋白的表达,并分析患者的生存期与GLS2表达的关系。图6A是组织芯片法检测90个肝癌患者的肝癌组织(TT)与癌旁组织(NT)中GLS2蛋白的表达.的全图和统计数据,芯片图中颜色越深表示染色阳性程度越高,++代表强阳性染色,+代表弱阳性染色,-代表阴性染色;分别代表高表达、低表达、基本不表达。图6B是90例患者中GLS2表达强度与生存时间的统计,黑线表示GLS2染色阴性患者的生存时间,红线表示GLS2染色弱阳性患者的生存时间,绿线表示GLS2染色强阳性患者的生存时间,圆圈表示统计中断。
具体实施方式
通过大样本研究(400例肝癌和100余例其他肝疾病),采用免疫组织化学染色、荧光定量PCR技术,检测GLS1和GLS2蛋白或基因在肝癌组织中的相对表达量,诊断肝癌并判断肝癌患者出现复发的风险及术后状况。本发明研究GLS1和GLS2蛋白、mRNA与肝细胞癌发生、发展的相关性,以及以GLS1和GLS2蛋白、mRNA作为标志物指导肝癌的预后判断。
具体实施方案如下述实施例及实验例。
实施例1GLS1免疫组化检测试剂盒
本试剂盒是一种用于诊断肝癌的诊断试剂盒,通过免疫组织化学技术检测肝癌患者的手术切除组织中GLS1蛋白的表达情况,判定组织是否是肝癌组织;适用于石蜡包埋切片,冰冻切片,培养细胞涂片及血液标本。
1.1试剂盒组成
试剂A:封闭液,10%山羊血清,×1。
试剂B:兔抗GLS1单克隆抗体,×1。
试剂C:抗兔生物素化二抗,×1。
试剂D:链亲和素标记HRP,×1。
试剂E:20倍浓缩DAB显色液,×1。
试剂F:氨水,×1。
1.2试剂盒保存条件:2~8度保存。
1.3试剂盒染色步骤及结果判定
1.3.1标本制备,石蜡切片用二甲苯脱蜡、入水,抗原修复。染色前用PBS浸泡组织或细胞涂片10分钟。
1.3.2石蜡切片放入3%H2O2-甲醇液中浸泡十分钟,用PBS洗3次,每次2分钟。
1.3.3加一滴试剂A于组织切片上,完全覆盖待检组织,孵育10分钟之后吸干液体。
1.3.4每张切片滴加试剂B(一抗),放入孵育盒,置于4度冰箱过夜孵育。
1.3.5取出切片,用0.01MPBST洗3次,每次5分钟。
1.3.6每张切片加一滴试剂C(需完全覆盖组织),孵育10分钟。
1.3.7用0.01MPBST洗4次,每次5分钟
1.3.8每张切片滴加试剂E染色(现用现稀释),室温显色1-10分钟,显微镜观察判断终止时间。
1.3.9双蒸水终止显色,苏木素复染2分钟,双蒸水冲洗2分钟。
1.3.10滴加试剂F返蓝30秒,双蒸水冲洗2分钟,无水酒精脱水2分钟。
1.3.11风干后使用中性树胶封片,显微镜下观察染色,随机取3个不同的视野,记录GLS1染色强度及范围,根据表1判定组织病理分类。
表1试剂盒结果判定
1.4试剂盒检测结果
利用本实施例的试剂盒对以下样本进行检测:
2004年1月-2010年8月间,南京鼓楼医院肝癌研究所收集的112例肝癌病人的肝癌组织及配对的癌旁组织。其中接受先期治疗0例,男性94例(83.93%),平均年龄52.95±10.19岁。
10个不典型增生组织、44个肝硬化组织、5个肝腺瘤组织、12个局灶性结节增生组织、20个正常肝组织来源于2005年-2013年间在南京鼓楼医院接受手术的病人的活体供体或心脏死亡后捐献供体。
检测结果如下:
1.4.1结果如图1A&B所示,在112例肿瘤组织的GLS1蛋白表达检测中,有83例呈强阳性染色(74.11%),23例呈弱阳性染色(20.54%),阴性染色仅有6例(5.36%)。在癌旁组织的GLS1蛋白表达检测中,93.64%(103/110)的病例呈阴性染色,仅有6.36%(7/110)的病例呈现弱阳性染色。
1.4.2结果如图3所示,在GSL1染色的组织中,94.64%的肝癌组织(TT),60%的不典型增生组织(DN)、36.4%的肝硬化组织(FL)、20%的肝腺瘤组织(HCA)、25%的局灶性结节增生组织(FNH)、10%的正常肝组织(NL)呈GLS1阳性。图3C的统计数据显示,若以GLS1强阳性为诊断域,则肝细胞肝癌的诊断敏感性为96.51%(83/86),特异性为75.21%。
1.4.3结果如图4所示,在GSL1染色的组织中,肝癌组织(TT)、不典型增生组织(DN)、IV期肝硬化组织(S4)、III期肝硬化组织(S3)、II期肝硬化组织(S2)、I期肝硬化组织(S1)、正常肝组织(NL)的阳性率呈下降趋势。
1.5结论
GLS1蛋白在肝癌细胞中高表达,在正常肝细胞中不表达或低表达,是诊断肝癌的特异性和敏感性指标。
实施例2GLS1和GLS2免疫组化检测试剂盒
本试剂盒是一种用于诊断肝癌的诊断试剂盒,通过免疫组织化学技术检测肝癌患者的手术切除组织中GLS1、GLS2蛋白的表达情况,判定组织是否是肝癌组织;适用于石蜡包埋切片,冰冻切片,培养细胞涂片及血液标本。
2.1试剂盒组成
试剂A:封闭液,10%山羊血清,×1。
试剂B:兔抗GLS1单克隆抗体,兔抗GLS2单克隆抗体,×1。
试剂C:抗兔生物素化二抗,×1。
试剂D:链亲和素标记HRP,×1。
试剂E:20倍浓缩DAB显色液,×1。
试剂F:氨水,×1。
2.2试剂盒保存条件:2~8度保存。
2.3试剂盒染色步骤及结果判定
2.3.1标本制备,石蜡切片用二甲苯脱蜡、入水,抗原修复。染色前用PBS浸泡组织或细胞涂片10分钟。
2.3.2石蜡切片放入3%H2O2-甲醇液中浸泡十分钟,用PBS洗3次,每次2分钟。
2.3.3加一滴试剂A于组织切片上,完全覆盖待检组织,孵育10分钟之后吸干液体。
2.3.4每张切片滴加试剂B(一抗),放入孵育盒,置于4度冰箱过夜孵育。
2.3.5取出切片,用0.01MPBST洗3次,每次5分钟。
2.3.6每张切片加一滴试剂C(需完全覆盖组织),孵育10分钟。
2.3.7用0.01MPBST洗4次,每次5分钟
2.3.8每张切片滴加试剂E染色(现用现稀释),室温显色1-10分钟,显微镜观察判断终止时间。
2.3.9双蒸水终止显色,苏木素复染2分钟,双蒸水冲洗2分钟。
2.3.10滴加试剂F返蓝30秒,双蒸水冲洗2分钟,无水酒精脱水2分钟。
2.3.11风干后使用中性树胶封片,显微镜下观察染色,随机取3个不同的视野,记录GLS1染色强度及范围,根据表1判定组织病理分类。
2.4试剂盒检测结果
利用本实施例的试剂盒对以下样本进行检测:
2004年1月-2010年8月间,南京鼓楼医院肝癌研究所收集的112例肝癌病人的肝癌组织及配对的癌旁组织。其中接受先期治疗0例,男性94例(83.93%),平均年龄52.95±10.19岁。
10个不典型增生组织、44个肝硬化组织、5个肝腺瘤组织、12个局灶性结节增生组织、20个正常肝组织来源于2005年-2013年间在南京鼓楼医院接受手术的病人的活体供体或心脏死亡后捐献供体。
检测结果如下:
2.4.1结果如图1A&B所示,在112例肿瘤组织的GLS1蛋白表达检测中,有83例呈强阳性染色(74.11%),23例呈弱阳性染色(20.54%),阴性染色仅有6例(5.36%);而在此112例肿瘤组织的GLS2蛋白表达检测中,有70例阴性染色(62.50%),强阳性染色只有5例(4.46%)。在癌旁组织的GLS1蛋白表达检测中,93.64%(103/110)的病例呈阴性染色,仅有6.36%(7/110)的病例呈现弱阳性染色;而在癌旁组织的GLS2蛋白表达检测中,103例组织呈阳性染色(92.79%),仅有8例为阴性染色(7.21%)。
2.4.2结果如图3所示,94.64%的肝癌组织(TT),60%的不典型增生组织(DN)、36.4%的肝硬化组织(FL)、20%的肝腺瘤组织(HCA)、25%的局灶性结节增生组织(FNH)、10%的正常肝组织(NL)呈GLS1阳性;而在GLS2染色的组织中,有37.5%的肝癌组织呈阳性,80%肝腺瘤组织呈阳性,全部的其他肝病组织和正常组织呈阳性。图3C的统计数据显示,若以GLS1强阳性为诊断域,则肝细胞肝癌的诊断敏感性为96.51%(83/86),特异性为75.21%;而若以GLS1强阳性并GLS2阴性为诊断域,则敏感性增加到100%。
2.4.3结果如图4所示,在GSL1染色的组织中,肝癌组织(TT)、不典型增生组织(DN)、IV期肝硬化组织(S4)、III期肝硬化组织(S3)、II期肝硬化组织(S2)、I期肝硬化组织(S1)、正常肝组织(NL)的阳性率呈下降趋势;而在GLS2染色的组织中,以上组织阳性率呈上升趋势。
2.5结论
2.5.1GLS1蛋白在肝癌细胞中高表达,在正常肝细胞中不表达或低表达,是诊断肝癌的特异性和敏感性指标。
2.5.2GLS2蛋白在肝癌细胞中不表达或低表达,在正常肝细胞中高表达,可以作为GLS1诊断肝癌的补充指标,提高诊断的敏感性。
2.5.3肝癌恶性转化过程中,其谷氨酰胺代谢呈现GLS2向GLS1转变的现象。
实施例3GLS1的荧光定量PCR检测试剂盒
本试剂盒是一种用于诊断肝癌的诊断试剂盒,通过荧光定量PCR技术检测肝癌患者的手术切除组织中GLS1mRNA的表达情况,判定组织是否是肝癌组织;适用于新鲜手术切除组织或-80度冷冻保存的组织。
3.1试剂盒组成
试剂A:TRIzol,×1。
试剂B:75%乙醇,×1。
试剂C:RNase-freewater,×1。
试剂D:逆转录酶,×1。
试剂E:SYBRGreen荧光定量PCR酶,×1。
试剂F:GLS1正向引物(SEQIDNO.1),×1。
试剂G:GLS1负向引物(SEQIDNO.2),×1。
3.2试剂盒保存条件:试剂D和E保存于-20度,其余保存于4度。
3.3试剂盒使用步骤及结果判定
3.3.1将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml试剂A,用匀浆仪进行匀浆处理。
3.3.2将匀浆样品在室温(15-30度)放置5分钟,加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
3.3.3置于离心机4度10000×g离心15分钟。样品分为三层,上层含RNA。将上层移到无RNase的EP管内。
3.3.4每管加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟,4度10000×g离心10分钟,去除上清。
3.3.4每管加入1ml试剂B,洗涤RNA沉淀。4度7500×g离心5分钟,弃上清。
3.3.5室温放置干燥10分钟,用20μl试剂C将RNA溶解。负80度冰箱长期保存。
3.3.6按照(Xμl(500ngRNA)+2μl试剂D+(10-X)μl试剂C)体系加样,离心后,放入37度孵育15分钟,然后置于85度5秒,最后放入4度冷却,反转录出cDNA,长期保存需放置于负20度冰箱。
3.3.7按照(2μlcDNA+5μl试剂E+0.3μl正向引物(试剂F)+0.3μl负向引物(试剂G)+3.4μl试剂C)体系,离心后,置于AppliedBiosystemsViiATM7Real-TimePCRSystem进行PCR反应,退火温度为54度,循环数为45。
3.3.8荧光定量PCR技术测得的ct值,采用相对定量(2-Δct)的方法计算。若所测组织的GLS1mRNA含量比正常肝组织显著增高,并且GLS2mRNA含量比正常肝组织显著降低,则提示该组织极有可能为肝癌组织。
3.4试剂盒检测结果判定
利用本实施例的试剂盒对以下样本进行检测:
2004年1月-2010年8月间,南京鼓楼医院肝癌研究所收集的112例肝癌病人的肝癌组织及配对的癌旁组织。其中接受先期治疗0例,男性94例(83.93%),平均年龄52.95±10.19岁。
10个不典型增生组织、44个肝硬化组织、5个肝腺瘤组织、12个局灶性结节增生组织、20个正常肝组织来源于2005年-2013年间在南京鼓楼医院接受手术的病人的活体供体或心脏死亡后捐献供体。
结果如图1C所示,98例肝癌组织(TT)中GLS1mRNA的含量显著高于癌旁组织(NT)。
2.5结论
GLS1mRNA在肝癌细胞中高表达。
实施例4GLS1和GLS2的荧光定量PCR检测试剂盒
本试剂盒是一种用于诊断肝癌的诊断试剂盒,通过荧光定量PCR技术检测肝癌患者的手术切除组织中GLS1、GLS2mRNA的表达情况,判定组织是否是肝癌组织;适用于新鲜手术切除组织或-80度冷冻保存的组织。
4.1试剂盒组成
试剂A:TRIzol,×1。
试剂B:75%乙醇,×1。
试剂C:RNase-freewater,×1。
试剂D:逆转录酶,×1。
试剂E:SYBRGreen荧光定量PCR酶,×1。
试剂F:GLS1正向引物(SEQIDNO.1),×1。
试剂G:GLS1负向引物(SEQIDNO.2),×1。
试剂H:GLS2正向引物(SEQIDNO.3),×1。
试剂I:GLS2负向引物(SEQIDNO.4),×1。
4.2试剂盒保存条件:试剂D和E保存于-20度,其余保存于4度。
4.3试剂盒使用步骤及结果判定
4.3.1将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1ml试剂A,用匀浆仪进行匀浆处理。
4.3.2将匀浆样品在室温(15-30度)放置5分钟,加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
4.3.34度10000×g离心15分钟。样品分为三层,上层含RNA。将上层移到无RNase的EP管内。
4.3.4每管加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟,4度10000×g离心10分钟,去除上清。
4.3.4每管加入1ml试剂B,洗涤RNA沉淀。4度7500×g离心5分钟,弃上清。
4.3.5室温放置干燥10分钟,用20μl试剂C将RNA溶解。负80度冰箱长期保存。
4.3.6按照(Xμl(500ngRNA)+2μl试剂D+(10-X)μl试剂C)体系加样,离心后,放入37度孵育15分钟,然后置于85度5秒,最后放入4度冷却,反转录出cDNA,长期保存需放置于负20度冰箱。
4.3.7按照(2μlcDNA+5μl试剂E+0.3μl正向引物(试剂F/H)+0.3μl负向引物(试剂G/I)+3.4μl试剂C)体系,离心后,置于AppliedBiosystemsViiATM7Real-TimePCRSystem进行PCR反应,退火温度为54度,循环数为45。
4.3.8荧光定量PCR技术测得的ct值,采用相对定量(2-Δct)的方法计算。若所测组织的GLS1mRNA含量比正常肝组织显著增高,并且GLS2mRNA含量比正常肝组织显著降低,则提示该组织极有可能为肝癌组织。
4.4试剂盒检测结果判定
利用本实施例的试剂盒对以下样本进行检测:
2004年1月-2010年8月间,南京鼓楼医院肝癌研究所收集的112例肝癌病人的肝癌组织及配对的癌旁组织。其中接受先期治疗0例,男性94例(83.93%),平均年龄52.95±10.19岁。
10个不典型增生组织、44个肝硬化组织、5个肝腺瘤组织、12个局灶性结节增生组织、20个正常肝组织来源于2005年-2013年间在南京鼓楼医院接受手术的病人的活体供体或心脏死亡后捐献供体。
结果如图1C所示,98例肝癌组织(TT)中GLS1mRNA的含量显著高于癌旁组织(NT);而肝癌组织中GLS2mRNA的含量显著低于癌旁组织。
4.5结论
GLS1mRNA在肝癌细胞中高表达,而GLS2mRNA在肝癌细胞中不表达或显著低表达。
实验例1免疫组织化学法检测GLS1/GLS2/GS蛋白表达
1.1病例组织收集
本实验例所用的组织样本有:
2004年1月-2010年8月间,南京鼓楼医院肝癌研究所收集的112例肝癌病人的肝癌组织及配对的癌旁组织。其中接受先期治疗0例,男性94例(83.93%),平均年龄52.95±10.19岁。
10个不典型增生组织、44个肝硬化组织、5个肝腺瘤组织、12个局灶性结节增生组织、20个正常肝组织来源于2005年-2013年间在南京鼓楼医院接受手术的病人的活体供体或心脏死亡后捐献供体。
1.2免疫组织化学检测步骤
1.2.1制备肝癌组织石蜡切片,4μm/片,60℃烤箱过夜;
1.2.2切片脱腊至水;(二甲苯①2分钟→二甲苯②2分钟→二甲苯③2分钟→100%乙醇2分钟→95%乙醇2分钟→85%乙醇2分钟→75%乙醇2分钟→双蒸水2分钟);
1.2.33%H202甲醇液,室温放置15分钟;
1.2.4双蒸水洗三次,每次2分钟;
1.2.5抗原修复,切片放入0.01MTris/EDTA缓冲液(PH8.0)中煮沸2分钟,停火8分钟;
1.2.6自然冷却至室温,0.0lMPBST洗3次,每次5分钟;
1.2.7滴加稀释后的一抗(兔GLS1单克隆抗体,1:3200稀释;兔GLS2单克隆抗体,1:400稀释;兔GS单克隆抗体,1:300稀释),置入孵育盒,放置于4度冰箱过夜孵育;
1.2.8取出,0.0lMPBST洗3次,每次5分钟;
1.2.9滴加二抗,37度孵育18分钟;
1.2.100.0lMPBST洗4次,每次5分钟;DAB显色1-10分钟,镜下观察判断终止时间;
1.2.11双蒸水终止显色,苏木素复染2分钟;
1.2.12双蒸水冲洗2分钟;
1.2.13氨水返蓝30s,双蒸水冲洗2分钟;
1.2.14无水酒精脱水2分钟;
1.2.15待组织风干后,使用中性树胶封片;
1.2.16显微镜下观察阳性染色,分别于肝癌组织和癌旁组织各随机选取3个视野,拍照;依据肝细胞和肝癌细胞染色程度及阳性率,对GLS1/2表达情况进行评分,评分标准见表1。
1.3结果总结
1.3.1结果如图1A&B所示,在112例肿瘤组织的GLS1蛋白表达检测中,有83例呈强阳性染色(74.11%),23例呈弱阳性染色(20.54%),阴性染色仅有6例(5.36%);而在此112例肿瘤组织的GLS2蛋白表达检测中,有70例阴性染色(62.50%),强阳性染色只有5例(4.46%)。在癌旁组织的GLS1蛋白表达检测中,93.64%(103/110)的病例呈阴性染色,仅有6.36%(7/110)的病例呈现弱阳性染色;而在癌旁组织的GLS2蛋白表达检测中,103例组织呈阳性染色(92.79%),仅有8例为阴性染色(7.21%)。
1.3.2结果如图2A&B所示,在112例肿瘤组织和癌旁组织的GS蛋白表达检测中,强阳性染色率分别为88.39%(99/112)、91.07%(102/112),无阴性染色出现。图3A中肝癌组织GS成弥散分布,癌旁组织GS呈集中分布。
1.3.3结果如图3所示,94.64%的肝癌组织(TT),60%的不典型增生组织(DN)、36.4%的肝硬化组织(FL)、20%的肝腺瘤组织(HCA)、25%的局灶性结节增生组织(FNH)、10%的正常肝组织(NL)呈GLS1阳性;而在GLS2染色的组织中,有37.5%的肝癌组织呈阳性,80%肝腺瘤组织呈阳性,全部的其他肝病组织和正常组织呈阳性。图3C的统计数据显示,若以GLS1强阳性为诊断域,则肝细胞肝癌的诊断敏感性为96.51%(83/86),特异性为75.21%;而若以GLS1强阳性并GLS2阴性为诊断域,则敏感性增加到100%。
1.3.4结果如图4所示,在GSL1染色的组织中,肝癌组织(TT)、不典型增生组织(DN)、IV期肝硬化组织(S4)、III期肝硬化组织(S3)、II期肝硬化组织(S2)、I期肝硬化组织(S1)、正常肝组织(NL)的阳性率呈下降趋势;而在GLS2染色的组织中,以上组织阳性率呈上升趋势。
1.4结论
1.4.1GLS1蛋白在肝癌细胞中高表达,在正常肝细胞中不表达或低表达,是诊断肝癌的特异性和敏感性指标。
1.4.2肝癌组织中GS蛋白表达呈弥散状,GS表达的阳性率和表达的强度在肝癌组织和正常组织中无明显差异;不宜用作诊断肝癌的特异性及敏感性指标。
1.4.3GLS2蛋白在肝癌细胞中不表达或低表达,在正常肝细胞中高表达,可以作为GLS1诊断肝癌的补充指标,提高诊断的敏感性。
1.4.4肝癌恶性转化过程中,其谷氨酰胺代谢呈现GLS2向GLS1转变的现象。
实验例2荧光定量PCR技术检测GLS1/GLS2/GSmRNA表达
2.1病例组织收集
同实验例1
2.2荧光定量PCR检测步骤
2.2.1病例组织RNA提取
2.2.1.1将组织在液氮中磨碎,每50-100mg组织加入1mlTRIzol,用匀浆仪进行匀浆处理
2.2.1.2将匀浆样品在室温(15-30度)放置5分钟,每1mlTRIzol加入0.2ml氯仿,剧烈振荡15秒,室温放置3分钟。
2.2.1.34度10000×g离心15分钟。样品分为三层,上层含RNA。将上层移到新无RNaseEP管内。
2.2.1.4每管加入0.5ml异丙醇,室温放置10分钟,4度10000×g离心10分钟,去除上清。
2.2.1.5用75℅乙醇洗涤RNA沉淀。4度7500×g离心5分钟,弃上清。
2.2.1.6室温放置干燥10分钟,用20μlRNase-free水将RNA溶解。负80度冰箱长期保存。
2.2.2反转录出cDNA
使用TaKaRaRT-PCRMasterMix(DRR0036A)按照(Xμl(500ngRNA)+2μl逆转录酶混合物+(10-X)μlRNase-freewater)体系加样,放入37度15分钟,之后85度5秒,4度冷却存放,长期保存放置于负20度冰箱。
2.2.3荧光定量PCR
使用FastStartUniversalSYBRGreenMaster(Roche,Mannheim,Germany,04913914001)和AppliedBiosystemsViiATM7Real-TimePCRSystem检测GLS1/GLS2/GSmRNA水平。引物由Invitrogen公司合成(序列表见表2),GAPDH的正向引物和反向引物分别如序列表SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示;GLS1的正向引物和反向引物分别如序列表SEQIDNO:1和SEQIDNO:2所示;GLS2的正向引物和反向引物分别如序列表SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示;GLUL的正向引物和反向引物分别如序列表SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示。荧光定量RT-PCR结果分析采用相对定量的方法分析。
表2荧光定量PCR引物序列
2.3结果总结
2.3.1结果如图1C所示,98例肝癌组织(TT)中GLS1mRNA的含量显著高于癌旁组织(NT);而肝癌组织中GLS2mRNA的含量显著低于癌旁组织。
2.3.2结果如图2C所示,98例肝癌组织(TT)中GSmRNA的含量与癌旁组织(NT)基本相同,无显著性差异;肝癌组织中GSmRNA与癌旁组织中的GSmRNA显著相关。
2.4结论
2.4.1GLS1mRNA在肝癌细胞中高表达,而GLS2mRNA在肝癌细胞中不表达或显著低表达。
2.4.2肝癌组织中GSmRNA的表达与癌旁组织无明显差异,GSmRNA定量不宜作为诊断肝癌的指标。
实验例3组织芯片检测GLS1和GLS2表达
90例肝癌组织(TT)和癌旁组织(NT)收集于南京鼓楼医院,组织芯片交由上海生物芯片有限公司(生物芯片上海国家工程研究中心)制作,芯片编号为HLiv-HCC180Sur-01。患者生存时间统计据病例跟踪访问。
结果如图5A所示,在90例肿瘤组织(TT)GLS1染色中,80%呈强阳性,16.67%呈弱阳性,3.33%阴性;在90例癌旁组织中,13.3%呈强阳性,53.3%呈弱阳性,33.3%呈阴性。图5B显示,低GLS1表达的患者(lowGLS1expression,阴性和弱阳性)生存时间显著长于高GLS1表达(highGLS2expression,强阳性)的患者,中位生存期分别为44.56个月(高GLS1表达)和29.32个月(低GLS1表达)。图6A所示,在86例肿瘤组织(TT)GLS2染色中,20.93%呈强阳性,44.19%呈弱阳性,34.88%阴性;在86例癌旁组织中,77.91%呈强阳性,17.44%呈弱阳性,4.65%呈阴性。图6B,86例患者生存时间统计显示,GLS2染色阴性患者的生存时间最短,GLS2染色阳性患者的生存时间最长。结果表明GLS1和GLS2可以作为肝细胞肝癌预后的独立标志物,但GLS1在预后评判中起主导作用。
Claims (27)
1.GLS1基因在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用,其特征在于,所述肝癌诊断试剂盒以GLS1基因作为诊断标记物。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征在于,所述肝癌诊断试剂盒是通过荧光定量PCR技术检测疑似肝癌患者的手术切除组织中GLS1基因的水平,所述GLS1基因在瘤内的水平高于瘤旁与肝癌的发生呈正相关。
4.GLS1和GLS2基因在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用,其特征在于,所述肝癌诊断试剂盒以GLS1和GLS2基因作为诊断标记物。
6.根据权利要求5所述的应用,其特征在于,所述肝癌诊断试剂盒是通过荧光定量PCR技术检测疑似肝癌患者的手术切除组织中GLS1和GLS2基因的水平,所述GLS1基因在瘤内的水平高于瘤旁与肝癌的发生呈正相关,GLS2基因在瘤内的水平低于瘤旁与肝癌的发生呈负相关。
7.GLS1基因编码的蛋白在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述肝癌诊断试剂盒以GLS1基因编码的蛋白作为诊断标记物。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述肝癌诊断试剂盒是通过免疫组化技术检测肝癌患者的手术切除组织中GLS1蛋白的表达情况,所述的GLS1蛋白在癌内的表达水平高于癌旁与肝癌的发生呈正相关。
10.GLS1和GLS2基因编码的蛋白在制备肝癌诊断试剂盒中的应用。
11.根据权利要求10所述的应用,其特征在于,所述肝癌诊断试剂盒以GLS1和GLS2基因编码的蛋白作为诊断标记物。
12.根据权利要求11所述的应用,其特征在于,所述肝癌诊断试剂盒是通过免疫组化技术检测肝癌患者的手术切除组织中GLS1和GLS2蛋白的表达情况,所述的GLS1蛋白在癌内的表达水平高于癌旁与肝癌的发生呈正相关,GLS2蛋白在癌内的水平低于癌旁与肝癌的发生呈负相关。
13.GLS1基因编码的蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。
14.根据权利要求13所述的应用,其特征在于,所述肝癌预后评估试剂盒以GLS1基因编码的蛋白作为预后评估标记物。
15.根据权利要求14所述的应用,其特征在于,所述肝癌预后评估试剂盒是通过免疫组化技术检测肝癌患者的手术切除组织中GLS1蛋白的表达情况,所述的GLS1蛋白癌内表达的程度与肝癌患者的预后生存期呈负相关。
16.GLS1和GLS2基因编码的蛋白在制备肝癌预后评估试剂盒中的应用。
17.根据权利要求16所述的应用,其特征在于,所述肝癌预后评估试剂盒以GLS1和GLS2基因编码的蛋白作为预后评估标记物。
18.根据权利要求17所述的应用,其特征在于,所述预后评估试剂盒是通过免疫组化技术检测肝癌患者的手术切除组织中GLS1和GLS2蛋白的表达情况,所述的GLS1蛋白癌内表达的程度与肝癌患者的预后生存期呈负相关,GLS2蛋白癌内表达的程度与肝癌患者的预后生存期呈正相关。
19.一种用于诊断肝癌的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒是通过荧光定量PCR技术检测疑似肝癌患者的手术切除组织中GLS1基因的水平,所述的GLS1基因在瘤内的水平高于瘤旁与肝癌的发生呈正相关。
20.根据权利要求19所述的诊断肝癌的试剂盒,其特征在于,所述诊断肝癌的
试剂盒包括如下试剂:
试剂A:TRIzol,×1;
试剂B:75%乙醇,×1;
试剂C:RNase-freewater,×1;
试剂D:逆转录酶,×1;
试剂E:SYBRGreen荧光定量PCR酶,×1;
试剂F:GLS1正向引物(SEQIDNO:1),×1;
试剂G:GLS1负向引物(SEQIDNO:2),×1。
21.一种用于诊断肝癌的试剂盒,其特征在于,所述诊断肝癌的试剂盒是通过荧光定量PCR技术检测疑似肝癌患者的手术切除组织中GLS1和GLS2基因的水平,所述的GLS1基因在瘤内的水平高于瘤旁与肝癌的发生呈正相关,GLS2基因在瘤内的水平低于瘤旁与肝癌的发生呈负相关。
22.根据权利要求21所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括如下试剂:
试剂A:TRIzol,×1;
试剂B:75%乙醇,×1;
试剂C:RNase-freewater,×1;
试剂D:逆转录酶,×1;
试剂E:SYBRGreen荧光定量PCR酶,×1;
试剂F:GLS1正向引物(SEQIDNO:1),×1;
试剂G:GLS1负向引物(SEQIDNO:2),×1;
试剂H:GLS2正向引物(SEQIDNO:3),×1;
试剂I:GLS2负向引物(SEQIDNO:4),×1。
23.一种用于诊断肝癌和预后评估的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒是通过免疫组化技术检测肝癌患者的手术切除组织中GLS1蛋白的表达情况,所述的GLS1蛋白在癌内的表达水平高于癌旁与肝癌的发生呈正相关,所述的GLS1蛋白癌内表达的阳性率与肝癌患者的预后生存期呈负相关。
24.根据权利要求23所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括如下试剂:
试剂A:封闭液,10%山羊血清,×1;
试剂B:兔抗GLS1单克隆抗体,×1;
试剂C:抗兔生物素化二抗,×1;
试剂D:链亲和素标记HRP,×1;
试剂E:20倍浓缩DAB显色液,×1;
试剂F:氨水,×1。
25.一种用于诊断肝癌和预后评估的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒是通过免疫组化技术检测肝癌患者的手术切除组织中GLS1和GLS2蛋白的表达情况,所述的GLS1蛋白在癌内的表达水平高于癌旁与肝癌的发生呈正相关,GLS2蛋白在瘤内的水平低于瘤旁与肝癌的发生呈负相关;所述的GLS1蛋白癌内表达的阳性率与肝癌患者的预后生存期呈负相关,所述的GLS2蛋白癌内表达的阳性率与肝癌患者的预后生存期呈正相关。
26.根据权利要求25所述的试剂盒,其特征在于,所述试剂盒包括如下试剂:
试剂A:封闭液,10%山羊血清,×1;
试剂B:兔抗GLS1单克隆抗体及兔抗GLS2单克隆抗体,×1;
试剂C:抗兔生物素化二抗,×1;
试剂D:链亲和素标记HRP,×1;
试剂E:20倍浓缩DAB显色液,×1;
试剂F:氨水,×1。
27.GLS1基因编码的蛋白在制备肝癌个体化治疗筛选试剂盒中的应用,其特征在于,所述肝癌个体化治疗筛选试剂盒是通过免疫组化技术检测肝癌患者的手术切除组织中GLS1蛋白的表达情况,所述的GLS1蛋白在癌内的高表达能够指导抗谷氨酰胺酵解的临床治疗。
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PB01 | Publication | ||
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