CN106771252A - Amacr蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用及试剂盒 - Google Patents

Amacr蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用及试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明提供了AMACR蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的新应用。本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测AMACR蛋白在肝癌组织中的相对表达量，能够判断肝癌患者出现肝癌复发转移的风险。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了AMACR蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用于制备判断肝癌患者预后的蛋白质分子标记，对于肝癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。

Description

AMACR蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用及试 剂盒
(一)技术领域
本发明涉及AMACR蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用及试剂盒。
(二)背景技术
我国为原发性肝癌高发地区，全世界每年新发病例的55％发生在中国大陆，为我国癌症死因的第二位。经过50多年发展，目前已经确立了以手术切除为主的综合治疗模式，肝癌治疗取得明显效果。但肝癌术后5年内复发转移率高达50％～70％，肝癌易复发转移的生物学特性是目前进一步提高肝癌治疗效果的瓶颈问题，已成为近年来临床和基础研究的热点方向之一。研究表明，肝癌术后复发转移最早可在术后2个月以内；术后1～2年为复发转移的高发期。Shimul等报道56例肝癌根治术后复发病人，1年内复发21例(38％)，1年后复发31例(55％)；并发现复发后生存率与复发时间密切相关：术后1年内复发者3年生存率显著低于年后复发者(Shah SA.,J Am Coll Surg 2006)。Hayashi等观察了肝癌术后复发时间与预后间的关系，1年内复发患者1、3、5年生存率分别为75.7％、36.6％和28.3％，远低于2年后复发的生存率(1、3、5年生存率分别为100％、92.2％和68.6％)。可见肝癌术后1年内复发的比例较高，且对生存率有明显影响。因此有必要寻找肝癌术后近期复发转移的预后指标，以指导临床针对高危人群采取防治措施，提高肝癌生存率。目前临床主要依靠定期复查和影像学检查来发现术后的复发转移；在中国阳性的肝癌只有70～80％，CT或B超难以发现小于1CM的肝癌，诊断中均存在盲区，不能准确及时预测。本项目拟寻找肝癌术后早期转移复发的标志分子，并进行大样本的临床验证，考察其在肝癌术后预后判断的意义；项目的开展对于提高肝癌术后预后的准确性具有重要的意义。
申请人课题组前期采用iTRAQ标记的定量蛋白质组学技术(2D-LC-MS/MS技术)开展了肝细胞癌根治术后近期复发转移的差异表达蛋白质组研究，筛选出了一系列可能与肝癌的早期转移复发相关的蛋白分子；其中包括α甲酰基辅酶A消旋酶(AMACR)。AMACR(P504S)基因定位于染色体，编码382个氨基酸；存在于过氧化物酶体和线粒体上；在支链脂肪酸及脂肪酸衍生物的β氧化和胆酸代谢中间产物的氧化中发挥重要作用。目前已经有广泛的研究证明AMACR过表达于前列腺癌中；已经成为前列腺癌诊断的分子标志物之一；在外科病理诊断中，其与34βE12、p63联合检测已经成为前列腺癌诊断的常用方法。目前进一步的研究证明，除了在前列腺癌中过表达外也与其他恶性肿瘤相关；在消化道中，AMACR可在75％的结肠腺瘤和大多数中、高分化结肠腺癌中表达；但在正常胃、小肠和结肠上皮中表达阴性。
申请人课题组结合定量蛋白质组学筛选的结果，开展了AMACR在肝细胞性肝癌术后转移复发的临床样品中的组织芯片研究；研究结果表明，AMACR可能与肝癌术后的预后相关：在极早期(6个月内)转移复发的病人组织标本中，AMACR的表达显著下调(免疫组化的阳性率仅15％)；而在到月转移复发的病人组织标本中，AMACR的表达显著上调(免疫组化的阳性率高达90％)；而在二年以后转移复发(或未转移复发)的病人组织样品中，免疫组化的阳性率为40％。从我们实验数据可以看出，表达量的在肝癌术后的病人组织中复杂多变；与手术后转移复发的时间密切相关(也与肿瘤的恶性程度相关，在前列腺癌中已经有类似报到)。
肝癌做为对人类健康威胁最大的肿瘤之一，至今其发生的分子机制仍不清楚，对其的治疗也缺少特异性的分子靶点，而AMACR做为十分重要的肿瘤癌基因，目前尚无文献报道AMACR蛋白与判断肝癌预后相关。
(三)发明内容
本发明目的是提供AMACR蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的新应用及试剂盒。
本发明采用的技术方案是：
AMACR蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用。
优选的，所述AMACR蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测AMACR蛋白在肝癌组织中的相对表达量，能够判断肝癌患者出现肝癌复发转移的风险。基于AMACR蛋白表达量与肝癌复发转移的相关性，以该蛋白作为预后标记物对其表达量进行检测可以用于指导肝癌的预后判断，因此可将AMACR蛋白作为分子标记，利用AMACR单克隆抗体或多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测AMACR蛋白在肝癌组织中的相对表达量。
所述试剂盒主要包括：人源AMACR单克隆抗体或多克隆抗体、免疫组化实验试剂。所述免疫组化实验试剂为本领域免疫组化实验中的常用试剂。
发明人在蛋白组学研究中发现，AMACR在复发转移肝癌组织中表达低于未复发转移肝癌组织，并且在后续的验证实验中通过蛋白水平和基因水平证实了AMACR在肝癌术后复发转移组中表达下调，可以推测AMACR在肝癌术后复发转移发挥重要作用。
综上所述，AMACR在早期复发转移肝癌组织中低表达，AMACR的低表达与肝细胞癌患者术后复发转移有关。AMACR可以作为肝癌预后的一个重要候选分子标记物。
优选的，所述人源AMACR多克隆抗体由序列为SEQ ID NO.1所示的AMACR蛋白免疫兔子获得，可自行制备，也可采用市购商品。
具体的，所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％H2O2(水溶液)、3％BSA封闭液(以PBS配制)、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶(用于标记二抗)、PBS(pH7.4)、0.01M EDTA修复液。
所述试剂盒使用方法如下：
(1)取肝癌患者病理标本，利用人源AMACR单克隆抗体或多克隆抗体，和免疫组化实验试剂，进行免疫组化染色；
(2)利用显微镜和成像装置随机选取肝癌组织和癌旁组织3个视野拍摄为数码照片；
(3)利用Aperio Image Scope软件对组织样本进行扫描，扫描后对每个样本进行阳性强度计算，换算为该样品的免疫组织化学评分；
(4)通过所得到的评分评估患者术后的预后情况。
具体的，本发明所述试剂盒的使用方法如下：
(a)病理标本来自于肝癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。
(b)免疫组化方法利用SP染色法，具体步骤如下：
(c)制备肝癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。
(d)切片脱腊。依次浸泡：二甲苯I：10min；二甲苯II：10min；二甲苯III：10min。
(e)切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90％(v/v)乙醇：3min；80％乙醇：3min；75％乙醇：3min。
(f)PBS清洗3次，每次5min。
(h)EDTA抗原高压修复：切片放入0.01M EDTA修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。PBS清洗3次，每次5min。
(I)加入300μL的3％(w/w)过氧化氢水溶液，37℃10min。PBS清洗3次，每次5min。
(J)加入300μL的3％(w/w)BSA封闭液(PBS配制)，37℃1h。PBS清洗3次，每次5min。
(K)加入一抗：AMACR抗体浓度：1：300(自制)，4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min，然后PBS洗4次，每次5min。
(L)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释)，37℃45min。PBS洗4次，每次5min。
(M)PBS洗3次，每次5min。DAB(DAB显色试剂盒，购自上海生工)显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s，用自来水冲洗浸泡。
(N)脱水。依次浸泡：75％乙醇:2min；80％乙醇：2min；90％乙醇：2min；无水乙醇：2min。
(O)用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。
(P)利用显微镜和成像装置随机选取肝癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用Aperio Image Scope软件对组织样本的相片进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms(Positive Pixel Count V9)程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：
(Q)每个组织样本的免疫组织化学评分计算为Positivity×Log10[255/Iavg]，其中Positivity＝NPositive/NTotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量/显色总数量；Iavg＝(Iwp+Ip+Isp)/(Nwp+Np+Nsp)，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)，即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。
(L)采用SPSS18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用Pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用KaPlan-Meier生存分析，对数秩和检验(log-ranktest)比较生存曲线的差别。本发明显示AMACR蛋白与肝癌的预后具有显著的相关性，为预测肝癌的复发转移及术后的生存率提供一条全新途径，对肝癌患者的预后有重要作用。当癌组织AMACR免疫组化评分低于于0.2894时，肝细胞癌易出现复发转移，肝癌患者术后易死亡。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了AMACR蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用于制备判断肝癌患者预后的蛋白质分子标记，对于肝细胞癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。
(四)附图说明
图1为AMACR蛋白在肝细胞癌中不同的表达水平，其中A：表达阴性；B：弱表达；C：中等表达；D：强表达；
图2为肝癌组织中AMACR低表达组与高表达组生存曲线。
(五)具体实施方式
实施例1：
(a)病理标本来自于肝癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。
(b)免疫组化方法利用SP染色法，具体步骤如下：
(c)制备肝癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。
(d)切片脱腊。依次浸泡：二甲苯I：10min；二甲苯II：10min；二甲苯III：10min。
(e)切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90％(v/v)乙醇：3min；80％乙醇：3min；75％乙醇：3min。
(f)PBS清洗3次，每次5min。
(h)EDTA抗原高压修复：切片放入0.01M EDTA修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。PBS清洗3次，每次5min。
(I)加入300μL的3％(w/w)过氧化氢水溶液，37℃10min。PBS清洗3次，每次5min。
(J)加入300μL的3％(w/w)BSA封闭液(PBS配制)，37℃1h。PBS清洗3次，每次5min。
(K)加入一抗：AMACR抗体浓度：1：300(自制)，4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min，然后PBS洗4次，每次5min。
(L)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释)，37℃45min。PBS洗4次，每次5min。
(M)PBS洗3次，每次5min。DAB(DAB显色试剂盒，购自上海生工)显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s，用自来水冲洗浸泡。
(N)脱水。依次浸泡：75％乙醇:2min；80％乙醇：2min；90％乙醇：2min；无水乙醇：2min。
(O)用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。
(P)利用显微镜和成像装置随机选取肝癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用Aperio Image Scope软件对组织样本的相片进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms(Positive Pixel Count V9)程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：
(Q)每个组织样本的免疫组织化学评分计算为Positivity×Log10[255/Iavg]，其中Positivity＝NPositive/NTotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量/显色总数量；Iavg＝(Iwp+Ip+Isp)/(Nwp+Np+Nsp)，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)，即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。
(L)采用SPSS18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用Pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用KaPlan-Meier生存分析，对数秩和检验(log-ranktest)比较生存曲线的差别。
术后不同时间段转移复发的肝细胞癌患者AMACR的表达量结果参见表1：
表1：术后不同时间段转移复发的肝细胞癌患者AMACR的表达量
**P<0.01.
AMACR蛋白在肝细胞癌中不同的表达水平参见图1，由图可见：AMACR在不同预后病人的肝癌组织中表达显著不同，在早期复发转移的肝癌病人肿瘤组织中的AMACR的表达量显著低于晚复发或未复发的肝癌病人。
肝癌组织中AMACR低表达组与高表达组生存曲线参见图2，由图可见：肿瘤组织低表达AMACR的肝癌病人的预后显著差于高表达AMACR的肝癌病人。(需根据附图做简要分析)显示AMACR蛋白与肝癌的预后具有显著的相关性，为预测肝癌的复发转移及术后的生存率提供一条全新途径，对肝癌患者的预后有重要作用。
SEQUENCE LISTING
<110> 福建医科大学
<120> AMACR蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用及试剂盒
<130>
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 382
<212> PRT
<213> Human adenovirus type 1
<400> 1
Met Ala Leu Gln Gly Ile Ser Val Val Glu Leu Ser Gly Leu Ala Pro
1 5 10 15
Gly Pro Phe Cys Ala Met Val Leu Ala Asp Phe Gly Ala Arg Val Val
20 25 30
Arg Val Asp Arg Pro Gly Ser Arg Tyr Asp Val Ser Arg Leu Gly Arg
35 40 45
Gly Lys Arg Ser Leu Val Leu Asp Leu Lys Gln Pro Arg Gly Ala Ala
50 55 60
Val Leu Arg Arg Leu Cys Lys Arg Ser Asp Val Leu Leu Glu Pro Phe
65 70 75 80
Arg Arg Gly Val Met Glu Lys Leu Gln Leu Gly Pro Glu Ile Leu Gln
85 90 95
Arg Glu Asn Pro Arg Leu Ile Tyr Ala Arg Leu Ser Gly Phe Gly Gln
100 105 110
Ser Gly Ser Phe Cys Arg Leu Ala Gly His Asp Ile Asn Tyr Leu Thr
115 120 125
Leu Ser Gly Val Leu Ser Lys Ile Gly Arg Ser Gly Glu Asn Pro Tyr
130 135 140
Ala Pro Leu Asn Leu Leu Ala Asp Phe Ala Gly Gly Gly Leu Met Cys
145 150 155 160
Ala Leu Gly Ile Ile Met Ala Leu Phe Asp Arg Thr Arg Thr Gly Lys
165 170 175
Gly Gln Val Ile Asp Ala Asn Met Val Glu Gly Thr Ala Tyr Leu Ser
180 185 190
Ser Phe Leu Trp Lys Thr Gln Lys Leu Ser Leu Trp Glu Ala Pro Arg
195 200 205
Gly Gln Asn Met Leu Asp Gly Gly Ala Pro Phe Tyr Thr Thr Tyr Arg
210 215 220
Thr Ala Asp Gly Glu Phe Met Ala Val Gly Ala Ile Glu Pro Gln Phe
225 230 235 240
Tyr Glu Leu Leu Ile Lys Gly Leu Gly Leu Lys Ser Asp Glu Leu Pro
245 250 255
Asn Gln Met Ser Met Asp Asp Trp Pro Glu Met Lys Lys Lys Phe Ala
260 265 270
Asp Val Phe Ala Glu Lys Thr Lys Ala Glu Trp Cys Gln Ile Phe Asp
275 280 285
Gly Thr Asp Ala Cys Val Thr Pro Val Leu Thr Phe Glu Glu Val Val
290 295 300
His His Asp His Asn Lys Glu Arg Gly Ser Phe Ile Thr Ser Glu Glu
305 310 315 320
Gln Asp Val Ser Pro Arg Pro Ala Pro Leu Leu Leu Asn Thr Pro Ala
325 330 335
Ile Pro Ser Phe Lys Arg Asp Pro Phe Ile Gly Glu His Thr Glu Glu
340 345 350
Ile Leu Glu Glu Phe Gly Phe Ser Arg Glu Glu Ile Tyr Gln Leu Asn
355 360 365
Ser Asp Lys Ile Ile Glu Ser Asn Lys Val Lys Ala Ser Leu
370 375 380

Claims (6)

1.AMACR蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述AMACR蛋白氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.一种肝癌术后预后评估试剂盒，所述试剂盒主要包括：人源AMACR单克隆抗体或多克隆抗体，和免疫组化实验试剂。
4.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述人源AMACR多克隆抗体由序列为SEQ IDNO.1所示的AMACR蛋白免疫小鼠获得。
5.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％H2O2、3％BSA封闭液、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶、PBS、0.01M EDTA修复液。
6.如权利要求3所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒使用方法如下：
(1)取巨大肝癌患者病理标本，利用人源AMACR单克隆抗体或多克隆抗体，和免疫组化实验试剂，进行免疫组化染色；
(2)利用显微镜和成像装置随机选取肝癌组织和癌旁组织3个视野拍摄为数码照片；
(3)利用Aperio Image Scope软件对组织样本进行扫描，扫描后对每个样本进行阳性强度计算，换算为该样品的免疫组织化学评分；
(4)通过所得到的评分评估患者术后的预后情况。
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