CN110221074A - Sae2在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用 - Google Patents

Sae2在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了SAE2在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的新应用。本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测SAE2在肝癌组织中的相对表达量，能够判断肝癌患者出现肝癌复发转移的风险。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了SAE2在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用于制备判断肝癌患者预后的蛋白质分子标记，对于肝癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。

Description

SAE2在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及SAE2在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用。
背景技术
肝癌即肝脏恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类。原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间叶组织，前者称为原发性肝癌，是我国高发的，危害极大的恶性肿瘤；后者称为肉瘤，与原发性肝癌相比较较为少见。继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏。一般多见于胃、胆道、胰腺、结直肠、卵巢、子宫、肺、乳腺等器官恶性肿瘤的肝转移。
SUMO化修饰是一个动态可逆的过程，SUMO分子通过在E1活化酶、E2结合酶和E3连接酶的参与下共价结合到底物蛋白赖氨酸残基上，调控底物蛋白的结构与功能，而SENPs则通过特异性地对底物靶蛋白去SUMO化修饰，与SUMO分子共同调节底物蛋白的SUMO化状态，进而调控细胞功能。SAE2是SUMO 的E1活化酶之一，对SUMO信号通路具有重要的影响。
本发明研究发现在肝癌中的SAE2表达与病人术后预后存在显著的关系，暗示SAE2可作为肝癌的术后预后的有效预警蛋白。
肝癌做为对人类健康威胁最大的肿瘤之一，至今其发生的分子机制仍不清楚，对其的治疗也缺少特异性的分子靶点，而SAE2做为十分重要的肿瘤癌基因，目前尚无文献报道SAE2与判断肝癌预后或肝癌转移相关。
发明内容
本发明目的是提供SAE2在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的新应用。
本发明采用的技术方案是：
SAE2在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用。
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测SAE2在肝癌组织中的相对表达量，能够判断肝癌患者出现肝癌复发转移的风险。基于SAE2表达量与肝癌复发转移的相关性，以该蛋白作为预后标记物对其表达量进行检测可以用于指导肝癌的预后判断，因此可将SAE2作为分子标记，利用 SAE2单克隆抗体或多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测SAE2在肝癌组织中的相对表达量。
所述试剂盒主要包括：人源SAE2单克隆抗体或多克隆抗体、免疫组化实验试剂。所述免疫组化实验试剂为本领域免疫组化实验中的常用试剂。
发明人在发现，SAE2在复发转移肝癌组织中表达高于未复发转移肝癌组织，可以推测SAE2在肝癌术后复发转移发挥重要作用。查阅国内外文献，SAE2与肝癌的发生以及复发转移的相关研究少，在本实验中，SAE2在肝癌组织中的表达上调，而在癌旁和正常乳腺组织中则表达下调，且与未复发转移组相比， SAE2在复发转移组中表达也上调，表明SAE2可能作为促进因子参与肝癌发生发展过程。通过Kaplan-Meier 生存曲线分析，SAE2表达程度与肝癌患者的预后有关，SAE2高表达的患者预后不良(P<0.05)。
综上所述，SAE2在肝癌组织中高表达，SAE2的高表达与肝癌患者术后复发转移有关。SAE2可以作为肝癌预后的一个重要候选分子标记物。
优选的，所述人源SAE2多克隆抗体由序列为SEQ ID NO.1所示的SAE2免疫兔子获得，可自行制备，也可采用市购商品。
具体的，所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％H2O2(水溶液)、3％BSA封闭液(以PBS 配制)、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶(用于标记二抗)、PBS(pH7.4)、0.01M EDTA修复液。
本发明所述试剂盒的使用方法如下：
(a)病理标本来自于肝癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。
(b)免疫组化方法利用SP染色法，具体步骤如下：
(c)制备肝癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。
(d)切片脱腊。依次浸泡：二甲苯I：10min；二甲苯II：10min；二甲苯III：10min。
(e)切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90％(v/v)乙醇：3min；80％乙醇：3min；75％乙醇： 3min。
(f)PBS清洗3次，每次5min。
(h)EDTA抗原高压修复：切片放入0.01M EDTA修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。PBS清洗3次，每次5min。
(I)加入300μL的3％(w/w)过氧化氢水溶液，37℃10min。PBS清洗3次，每次5min。
(J)加入300μL的3％(w/w)BSA封闭液(PBS配制)，37℃1h。PBS清洗3次，每次5min。
(K)加入一抗：SAE2抗体浓度：1：500，4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min，然后PBS洗 4次，每次5min。
(L)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释)，37℃45min。PBS洗4次，每次5min。
(M)PBS洗3次，每次5min。DAB(DAB显色试剂盒，购自上海生工)显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s，用自来水冲洗浸泡。
(N)脱水。依次浸泡：75％乙醇:2min；80％乙醇：2min；90％乙醇：2min；无水乙醇：2min。
(O)用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。
(P)利用显微镜和成像装置随机选取肝癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用Aperio Image Scope软件对组织样本的相片进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms(Positive Pixel Count V9)程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：
(Q)每个组织样本的免疫组织化学评分计算为Positivity×Log10[255/Iavg]，其中Positivity＝NPositive/NTotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量/显色总数量；Iavg＝(Iwp+Ip+Isp)/(Nwp+Np+Nsp)，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)，即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。
(L)采用SPSS18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用Pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用KaPlan-Meier生存分析，对数秩和检验(log-ranktest)比较生存曲线的差别。本发明显示SAE2与肝癌的预后具有显著的相关性，为预测肝癌的复发转移及术后的生存率提供一条全新途径，对肝癌患者的预后有重要作用。当癌组织SAE2免疫组化评分高于0.537时，肝癌易出现复发转移，肝癌患者术后易死亡。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了SAE2在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用于制备判断肝癌患者预后的蛋白质分子标记，对于肝癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。
附图说明
图1为SAE2在肝癌患者术后无复发转移的组织样本中表达情况；
图2为SAE2在肝癌患者术后复发转移的组织样本中表达情况；
图3为肝癌组织中SAE2低表达组与高表达组生存曲线；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
(a)病理标本来自于肝癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。
(b)免疫组化方法利用SP染色法，具体步骤如下：
(c)制备肝癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。
(d)切片脱腊。依次浸泡：二甲苯I：10min；二甲苯II：10min；二甲苯III：10min。
(e)切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90％(v/v)乙醇：3min；80％乙醇：3min；75％乙醇： 3min。
(f)PBS清洗3次，每次5min。
(h)EDTA抗原高压修复：切片放入0.01M EDTA修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。PBS清洗3次，每次5min。
(I)加入300μL的3％(w/w)过氧化氢水溶液，37℃10min。PBS清洗 3次，每次5min。
(J)加入300μL的3％(w/w)BSA封闭液(PBS配制)，37℃1h。PBS 清洗3次，每次5min。
(K)加入一抗：SAE2抗体浓度：1：500，4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min。PBS洗4次，每次5min。
(L)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释)，37℃45min。PBS洗4次，每次5min。
(M)PBS洗3次，每次5min。DAB(DAB显色试剂盒，购自上海生工)显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s，用自来水冲洗浸泡。
(N)脱水。依次浸泡：75％乙醇：2min；80％乙醇：2min；90％乙醇：2min；无水乙醇：2min。
(O)用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。
(P)利用显微镜和成像装置随机选取肝癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用Aperio Image Scope软件对组织样本的照片进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms(Positive Pixel Count V9)程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：
(Q)每个组织样本的免疫组织化学评分计算为Positivity×Log10[255/Iavg]，其中 Positivity＝NPositive/NTotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量/显色总数量；Iavg＝(Iwp+Ip+Isp)/(Nwp+Np+Nsp)，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)，即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。SAE2高低表达标准以30例肝癌组织中SAE2表达评分的中位数(0.537)为界。
(L)采用SPSS18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用Pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用KaPlan-Meier生存分析，对数秩和检验(log-ranktest)比较生存曲线的差别。
按照上述方法，本发明在30例肝癌病人的肿瘤组织中检测结果如图1-2所示：SAE2在无复发转移组中的表达(图1)低于复发转移组(图2)。
SAE2与肝癌患者预后的关系：
通过Kaplan-Meier生存曲线分析，SAE2的表达程度与肝癌患者的预后相关(图3)。
实施例2：
取某肝癌术后肿瘤样本进行石蜡包埋切片，并利用以上所述的免疫组织化学方法进行检测，经计算，其癌组织的SAE2免疫组化组织评分为0.679。经过术后随访发现，该患者在术后第19个月发生肝癌复发转移，术后30个月死亡。
实施例3：
取某肝癌术后肿瘤样本进行石蜡包埋切片，并利用以上所述的免疫组织化学方法进行检测，经计算，其癌组织的SAE2免疫组化组织评分为0.246。经过术后随访发现，该患者在术后3年均未发现转移复发，健在。
由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测SAE2分子相对表达量能预测肝癌远处转移风险以及患者术后的生存或死亡。当癌组织SAE2的免疫组化评分高于0.537时，肝癌易出现复发转移，肝癌患者术后易死亡。显然SAE2与肝癌具有相关性，因此，以SAE2作为蛋白质分子标记对其表达量进行检测能预测肝癌手术后复发转移等事件，并判断预后。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
序列表
<110> 福建师范大学
<120> SAE2在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 752
<212> PRT
<213> Human astrovirus
<400> 1
Met Ala Gly Leu Cys Trp Cys Gly Asn Asn Thr Ala Gly Leu Ser Trp
1 5 10 15
Arg Ser Pro Ala Leu Cys Lys Ser Leu Pro Val Pro Ala Gly Cys Ser
20 25 30
Thr Pro Arg Arg Asp Val Pro Cys Leu Cys Leu Pro Glu Ala Val Val
35 40 45
Arg Arg Ser Gly Asn Gln Ala Ala Leu Pro Pro Pro Ala Ser Gly Arg
50 55 60
Gly Ser Val Leu Pro Pro Pro Pro Pro Pro Arg Leu Val Val Val Pro
65 70 75 80
Pro Trp His Cys Arg Gly Gly Cys Pro Gly Ser Trp Leu Arg Arg Trp
85 90 95
Pro Gly Ala Gly Cys Trp Trp Trp Gly Arg Ala Ala Ser Ala Ala Ser
100 105 110
Ser Ser Arg Ile Ser Cys Ser Pro Val Ser Pro Thr Ser Thr Cys His
115 120 125
Gln Gly Leu Thr Ile Leu Leu Arg Leu Val Leu Lys Val Trp Ala Gln
130 135 140
Ala Ile Leu Ser Leu Cys Pro Pro Lys Val Leu Gly Leu Gln Ile Asp
145 150 155 160
Leu Asp Thr Ile Asp Val Ser Asn Leu Asn Arg Gln Phe Leu Phe Gln
165 170 175
Lys Lys His Val Gly Arg Ser Lys Ala Gln Val Ala Lys Glu Ser Val
180 185 190
Leu Gln Phe Tyr Pro Lys Ala Asn Ile Val Ala Tyr His Asp Ser Ile
195 200 205
Met Asn Pro Asp Tyr Asn Val Glu Phe Phe Arg Gln Phe Ile Leu Val
210 215 220
Met Asn Ala Leu Asp Asn Arg Ala Ala Arg Asn His Val Asn Arg Met
225 230 235 240
Cys Leu Ala Ala Asp Val Pro Leu Ile Glu Ser Gly Thr Ala Gly Tyr
245 250 255
Leu Gly Gln Val Thr Thr Ile Lys Lys Gly Val Thr Glu Cys Tyr Glu
260 265 270
Cys His Pro Lys Pro Thr Gln Arg Thr Phe Pro Gly Cys Thr Ile Arg
275 280 285
Asn Thr Pro Ser Glu Pro Ile His Cys Ile Val Trp Ala Lys Tyr Leu
290 295 300
Phe Asn Gln Leu Phe Gly Glu Glu Asp Ala Asp Gln Glu Val Ser Pro
305 310 315 320
Asp Arg Ala Asp Pro Glu Ala Ala Trp Glu Pro Thr Glu Ala Glu Ala
325 330 335
Arg Ala Arg Ala Ser Asn Glu Asp Gly Asp Ile Lys Arg Ile Ser Thr
340 345 350
Lys Glu Trp Ala Lys Ser Thr Gly Tyr Asp Pro Val Lys Leu Phe Thr
355 360 365
Lys Leu Phe Lys Asp Asp Ile Arg Tyr Leu Leu Thr Met Asp Lys Leu
370 375 380
Trp Arg Lys Arg Lys Pro Pro Val Pro Leu Asp Trp Ala Glu Val Gln
385 390 395 400
Ser Gln Gly Glu Glu Thr Asn Ala Ser Asp Gln Gln Asn Glu Pro Gln
405 410 415
Leu Gly Leu Lys Asp Gln Gln Val Leu Asp Val Lys Ser Tyr Ala Arg
420 425 430
Leu Phe Ser Lys Ser Ile Glu Thr Leu Arg Val His Leu Ala Glu Lys
435 440 445
Gly Asp Gly Ala Glu Leu Ile Trp Asp Lys Asp Asp Pro Ser Ala Met
450 455 460
Asp Phe Val Thr Ser Ala Ala Asn Leu Arg Met His Ile Phe Ser Met
465 470 475 480
Asn Met Lys Ser Arg Phe Asp Ile Lys Ser Met Ala Gly Asn Ile Ile
485 490 495
Pro Ala Ile Ala Thr Thr Asn Ala Val Ile Ala Gly Leu Ile Val Leu
500 505 510
Glu Gly Leu Lys Ile Leu Ser Gly Lys Ile Asp Gln Cys Arg Thr Ile
515 520 525
Phe Leu Asn Lys Gln Pro Asn Pro Arg Lys Lys Leu Leu Val Pro Cys
530 535 540
Ala Leu Asp Pro Pro Asn Pro Asn Cys Tyr Val Cys Ala Ser Lys Pro
545 550 555 560
Glu Val Thr Val Arg Leu Asn Val His Lys Val Thr Val Leu Thr Leu
565 570 575
Gln Asp Lys Ile Val Lys Glu Lys Phe Ala Met Val Ala Pro Asp Val
580 585 590
Gln Ile Glu Asp Gly Lys Gly Thr Ile Leu Ile Ser Ser Glu Glu Gly
595 600 605
Glu Thr Glu Ala Asn Asn His Lys Lys Leu Ser Glu Phe Gly Ile Arg
610 615 620
Asn Gly Ser Arg Leu Gln Ala Asp Asp Phe Leu Gln Asp Tyr Thr Leu
625 630 635 640
Leu Ile Asn Ile Leu His Ser Glu Asp Leu Gly Lys Asp Val Glu Phe
645 650 655
Glu Val Val Gly Asp Ala Pro Glu Lys Val Gly Pro Lys Gln Ala Glu
660 665 670
Asp Ala Ala Lys Ser Ile Thr Asn Gly Ser Asp Asp Gly Ala Gln Pro
675 680 685
Ser Thr Ser Thr Ala Gln Glu Gln Asp Asp Val Leu Ile Val Asp Ser
690 695 700
Asp Glu Glu Asp Ser Ser Asn Asn Ala Asp Val Ser Glu Glu Glu Arg
705 710 715 720
Ser Arg Lys Arg Lys Leu Asp Glu Lys Glu Asn Leu Ser Ala Lys Arg
725 730 735
Ser Arg Ile Glu Gln Lys Glu Glu Leu Asp Asp Val Ile Ala Leu Asp
740 745 750

Claims (2)

1.SAE2在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，其特征在于：以SAE2作为分子标记，利用人源SAE2单克隆抗体或人源SAE2多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测SAE2在肝癌组织中的相对表达量。
2.根据权利要求1所述的SAE2在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，其特征在于：所述人源SAE2多克隆抗体由序列为SEQ ID NO.1所示的SAE2免疫兔子获得。
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