CN110018315A - 核纤层蛋白a在制备卵巢癌术后预后评估试剂盒中的应用 - Google Patents

核纤层蛋白a在制备卵巢癌术后预后评估试剂盒中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了核纤层蛋白A在制备卵巢癌术后预后评估试剂盒中的新应用。本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测核纤层蛋白A在卵巢癌组织中的相对表达量，能够判断卵巢癌患者出现卵巢癌复发转移的风险。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了核纤层蛋白A在制备卵巢癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用于制备判断卵巢癌患者预后的蛋白质分子标记，对于卵巢癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。

Description

核纤层蛋白A在制备卵巢癌术后预后评估试剂盒中的应用
技术领域
本发明涉及核纤层蛋白A在制备卵巢癌术后预后评估试剂盒中的应用。
背景技术
卵巢恶性肿瘤是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌。卵巢恶性肿瘤中以上皮癌最多见，其次是恶性生殖细胞肿瘤。其中卵巢上皮癌死亡率占各类妇科肿瘤的首位，对女性生命造成严重威胁。由于卵巢深居盆腔，体积小，缺乏典型症状，难以早期发现。卵巢上皮癌患者手术中发现肿瘤局限于卵巢的仅占不足30％，大多数已扩散到盆腹腔器官。
卵巢癌的发生发展及预后与癌基因的激活和抑癌基因功能失活密切关联，是多因素诱导，多基因参与的复杂病理过程。近年来，卵巢癌早期复发转移的分子机制是该领域的热门课题，深入阐明该分子机制，并在其特异性环节中导入靶向性治疗措施，有望很大幅度提高卵巢癌术后总体治疗效果。因此，探寻切实有效的卵巢癌卵巢切除术后早期复发相关预警分子标志，阐明其与卵巢癌早期复发转移的关系，这对提高卵巢癌术后治疗效果、评估卵巢癌早期复发风险、判断预后和个体化治疗有着至关重要的意义。
核纤层蛋白A是由核纤层蛋白编码的两个蛋白，参与细胞核核膜的组织，影响基因组稳定性并对细胞分化产生影响。人类肿瘤中核纤层蛋白A表达异常普遍存在，其突变造成多种核纤层蛋白病，如Emery-Dreifuss肌营养不良症、扩张型心肌病和儿童早老症等。
本发明研究发现在卵巢癌中的核纤层蛋白A表达与病人术后预后存在显著的关系，暗示核纤层蛋白A可作为卵巢癌的术后预后的有效预警蛋白。
卵巢癌做为对人类健康威胁最大的肿瘤之一，至今其发生的分子机制仍不清楚，对其的治疗也缺少特异性的分子靶点，而核纤层蛋白A做为十分重要的肿瘤癌基因，目前尚无文献报道核纤层蛋白A与判断卵巢癌预后或卵巢癌转移相关。
发明内容
本发明目的是提供核纤层蛋白A在制备卵巢癌术后预后评估试剂盒中的新应用。
本发明采用的技术方案是：
核纤层蛋白A在制备卵巢癌术后预后评估试剂盒中的应用。
本发明人经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测核纤层蛋白A在卵巢癌组织中的相对表达量，能够判断卵巢癌患者出现卵巢癌复发转移的风险。基于核纤层蛋白A表达量与卵巢癌复发转移的相关性，以该蛋白作为预后标记物对其表达量进行检测可以用于指导卵巢癌的预后判断，因此可将核纤层蛋白A作为分子标记，利用核纤层蛋白A单克隆抗体或多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测核纤层蛋白A在卵巢癌组织中的相对表达量。
所述试剂盒主要包括：人源核纤层蛋白A单克隆抗体或多克隆抗体、免疫组化实验试剂。所述免疫组化实验试剂为本领域免疫组化实验中的常用试剂。
发明人在发现，核纤层蛋白A在复发转移卵巢癌组织中表达高于未复发转移卵巢癌组织，可以推测核纤层蛋白A在卵巢癌术后复发转移发挥重要作用。查阅国内外文献，核纤层蛋白A与卵巢癌的发生以及复发转移的相关研究少，在本实验中，核纤层蛋白A在卵巢癌组织中的表达上调，而在癌旁和正常卵巢组织中则表达下调，且与未复发转移组相比，核纤层蛋白A在复发转移组中表达也上调，表明核纤层蛋白A可能作为促进因子参与卵巢癌发生发展过程。通过Kaplan-Meier生存曲线分析，核纤层蛋白A表达程度与卵巢癌患者的预后有关，核纤层蛋白A高表达的患者预后不良(P<0.05)。
综上所述，核纤层蛋白A在卵巢癌组织中高表达，核纤层蛋白A的高表达与卵巢癌患者术后复发转移有关。核纤层蛋白A可以作为卵巢癌预后的一个重要候选分子标记物。
优选的，所述人源核纤层蛋白A多克隆抗体由序列为SEQ ID NO.1所示的核纤层蛋白A免疫兔子获得，可自行制备，也可采用市购商品。
具体的，所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％H2O2(水溶液)、3％BSA封闭液(以PBS配制)、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶(用于标记二抗)、PBS(pH7.4)、0.01M EDTA修复液。
本发明所述试剂盒的使用方法如下：
(a)病理标本来自于卵巢癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。
(b)免疫组化方法利用SP染色法，具体步骤如下：
(c)制备卵巢癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。
(d)切片脱腊。依次浸泡：二甲苯I：10min；二甲苯II：10min；二甲苯III：10min。
(e)切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90％(v/v)乙醇：3min；80％乙醇：3min；75％乙醇：3min。
(f)PBS清洗3次，每次5min。
(h)EDTA抗原高压修复：切片放入0.01M EDTA修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。PBS清洗3次，每次5min。
(I)加入300μL的3％(w/w)过氧化氢水溶液，37℃10min。PBS清洗3次，每次5min。
(J)加入300μL的3％(w/w)BSA封闭液(PBS配制)，37℃1h。PBS清洗3次，每次5min。
(K)加入一抗：核纤层蛋白A抗体浓度：1：500，4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min，然后PBS洗4次，每次5min。
(L)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释)，37℃45min。PBS洗4次，每次5min。
(M)PBS洗3次，每次5min。DAB(DAB显色试剂盒，购自上海生工)显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s，用自来水冲洗浸泡。
(N)脱水。依次浸泡：75％乙醇:2min；80％乙醇：2min；90％乙醇：2min；无水乙醇：2min。
(O)用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。
(P)利用显微镜和成像装置随机选取卵巢癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用Aperio Image Scope软件对组织样本的相片进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms(Positive Pixel Count V9)程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：
(Q)每个组织样本的免疫组织化学评分计算为Positivity×Log10[255/Iavg]，其中Positivity＝NPositive/NTotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量/显色总数量；Iavg＝(Iwp+Ip+Isp)/(Nwp+Np+Nsp)，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)，即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。
(L)采用SPSS18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用Pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用KaPlan-Meier生存分析，对数秩和检验(log-ranktest)比较生存曲线的差别。本发明显示核纤层蛋白A与卵巢癌的预后具有显著的相关性，为预测卵巢癌的复发转移及术后的生存率提供一条全新途径，对卵巢癌患者的预后有重要作用。当癌组织核纤层蛋白A免疫组化评分高于0.458时，卵巢癌易出现复发转移，卵巢癌患者术后易死亡。
本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了核纤层蛋白A在制备卵巢癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用于制备判断卵巢癌患者预后的蛋白质分子标记，对于卵巢癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。
附图说明
图1为核纤层蛋白A在卵巢癌患者术后无复发转移的组织样本中表达情况；
图2为核纤层蛋白A在卵巢癌患者术后复发转移的组织样本中表达情况；
图3为卵巢癌组织中核纤层蛋白A低表达组与高表达组生存曲线；
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：
(a)病理标本来自于卵巢癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。
(b)免疫组化方法利用SP染色法，具体步骤如下：
(c)制备卵巢癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。
(d)切片脱腊。依次浸泡：二甲苯I：10min；二甲苯II：10min；二甲苯III：10min。
(e)切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90％(v/v)乙醇：3min；80％乙醇：3min；75％乙醇：3min。
(f)PBS清洗3次，每次5min。
(h)EDTA抗原高压修复：切片放入0.01M EDTA修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。PBS清洗3次，每次5min。
(I)加入300μL的3％(w/w)过氧化氢水溶液，37℃10min。PBS清洗3次，每次5min。
(J)加入300μL的3％(w/w)BSA封闭液(PBS配制)，37℃1h。PBS清洗3次，每次5min。
(K)加入一抗：核纤层蛋白A抗体浓度：1：500，4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min。PBS洗4次，每次5min。
(L)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释)，37℃45min。PBS洗4次，每次5min。
(M)PBS洗3次，每次5min。DAB(DAB显色试剂盒，购自上海生工)显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s，用自来水冲洗浸泡。
(N)脱水。依次浸泡：75％乙醇：2min；80％乙醇：2min；90％乙醇：2min；无水乙醇：2min。
(O)用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。
(P)利用显微镜和成像装置随机选取卵巢癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用Aperio Image Scope软件对组织样本的照片进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms(Positive Pixel Count V9)程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：
(Q)每个组织样本的免疫组织化学评分计算为Positivity×Log10[255/Iavg]，其中Positivity＝NPositive/NTotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量/显色总数量；Iavg＝(Iwp+Ip+Isp)/(Nwp+Np+Nsp)，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)，即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。核纤层蛋白A高低表达标准以30例卵巢癌组织中核纤层蛋白A表达评分的中位数(0.459)为界。
(L)采用SPSS18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用Pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用KaPlan-Meier生存分析，对数秩和检验(log-ranktest)比较生存曲线的差别。
按照上述方法，本发明在30例卵巢癌病人的肿瘤组织中检测结果如图1-2所示：核纤层蛋白A无复发转移组中的表达(图1)低于复发转移组(图2)。
核纤层蛋白A与卵巢癌患者预后的关系：
通过Kaplan-Meier生存曲线分析，核纤层蛋白A的表达程度与卵巢癌患者的预后相关(图3)。
实施例2：
取某卵巢癌术后肿瘤样本进行石蜡包埋切片，并利用以上所述的免疫组织化学方法进行检测，经计算，其癌组织的核纤层蛋白A免疫组化组织评分为0.552。经过术后随访发现，该患者在术后第35个月发生卵巢癌复发转移，术后52个月死亡。
实施例3：
取某卵巢癌术后肿瘤样本进行石蜡包埋切片，并利用以上所述的免疫组织化学方法进行检测，经计算，其癌组织的核纤层蛋白A免疫组化组织评分为0.382。经过术后随访发现，该患者在术后5年均未发现转移复发，健在。
由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测核纤层蛋白A分子相对表达量能预测卵巢癌远处转移风险以及患者术后的生存或死亡。当癌组织核纤层蛋白A的免疫组化评分高于0.459时，卵巢癌易出现复发转移，卵巢癌患者术后易死亡。显然核纤层蛋白A与卵巢癌具有相关性，因此，以核纤层蛋白A作为蛋白质分子标记对其表达量进行检测能预测卵巢癌手术后复发转移等事件，并判断预后。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等同物界定。
序列表
<110> 福建师范大学
<120> 核纤层蛋白A在制备卵巢癌术后预后评估试剂盒中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 664
<212> PRT
<213> Human astrovirus
<400> 1
Met Glu Thr Pro Ser Gln Arg Arg Ala Thr Arg Ser Gly Ala Gln Ala
1 5 10 15
Ser Ser Thr Pro Leu Ser Pro Thr Arg Ile Thr Arg Leu Gln Glu Lys
20 25 30
Glu Asp Leu Gln Glu Leu Asn Asp Arg Leu Ala Val Tyr Ile Asp Arg
35 40 45
Val Arg Ser Leu Glu Thr Glu Asn Ala Gly Leu Arg Leu Arg Ile Thr
50 55 60
Glu Ser Glu Glu Val Val Ser Arg Glu Val Ser Gly Ile Lys Ala Ala
65 70 75 80
Tyr Glu Ala Glu Leu Gly Asp Ala Arg Lys Thr Leu Asp Ser Val Ala
85 90 95
Lys Glu Arg Ala Arg Leu Gln Leu Glu Leu Ser Lys Val Arg Glu Glu
100 105 110
Phe Lys Glu Leu Lys Ala Arg Asn Thr Lys Lys Glu Gly Asp Leu Ile
115 120 125
Ala Ala Gln Ala Arg Leu Lys Asp Leu Glu Ala Leu Leu Asn Ser Lys
130 135 140
Glu Ala Ala Leu Ser Thr Ala Leu Ser Glu Lys Arg Thr Leu Glu Gly
145 150 155 160
Glu Leu His Asp Leu Arg Gly Gln Val Ala Lys Leu Glu Ala Ala Leu
165 170 175
Gly Glu Ala Lys Lys Gln Leu Gln Asp Glu Met Leu Arg Arg Val Gly
180 185 190
Ala Glu Asn Arg Leu Gln Thr Met Lys Glu Glu Leu Asp Phe Gln Lys
195 200 205
Asn Ile Tyr Ser Glu Glu Leu Arg Glu Thr Lys Arg Arg His Glu Thr
210 215 220
Arg Leu Val Glu Ile Asp Asn Gly Lys Gln Arg Glu Phe Glu Ser Arg
225 230 235 240
Leu Ala Asp Ala Leu Gln Glu Leu Arg Ala Gln His Glu Asp Gln Val
245 250 255
Glu Gln Tyr Lys Lys Glu Leu Glu Lys Thr Tyr Ser Ala Lys Leu Asp
260 265 270
Asn Ala Arg Gln Ser Ala Glu Arg Asn Ser Asn Leu Val Gly Ala Ala
275 280 285
His Glu Glu Leu Gln Gln Ser Arg Ile Arg Ile Asp Ser Leu Ser Ala
290 295 300
Gln Leu Ser Gln Leu Gln Lys Gln Leu Ala Ala Lys Glu Ala Lys Leu
305 310 315 320
Arg Asp Leu Glu Asp Ser Leu Ala Arg Glu Arg Asp Thr Ser Arg Arg
325 330 335
Leu Leu Ala Glu Lys Glu Arg Glu Met Ala Glu Met Arg Ala Arg Met
340 345 350
Gln Gln Gln Leu Asp Glu Tyr Gln Glu Leu Leu Asp Ile Lys Leu Ala
355 360 365
Leu Asp Met Glu Ile His Ala Tyr Arg Lys Leu Leu Glu Gly Glu Glu
370 375 380
Glu Arg Leu Arg Leu Ser Pro Ser Pro Thr Ser Gln Arg Ser Arg Gly
385 390 395 400
Arg Ala Ser Ser His Ser Ser Gln Thr Gln Gly Gly Gly Ser Val Thr
405 410 415
Lys Lys Arg Lys Leu Glu Ser Thr Glu Ser Arg Ser Ser Phe Ser Gln
420 425 430
His Ala Arg Thr Ser Gly Arg Val Ala Val Glu Glu Val Asp Glu Glu
435 440 445
Gly Lys Phe Val Arg Leu Arg Asn Lys Ser Asn Glu Asp Gln Ser Met
450 455 460
Gly Asn Trp Gln Ile Lys Arg Gln Asn Gly Asp Asp Pro Leu Leu Thr
465 470 475 480
Tyr Arg Phe Pro Pro Lys Phe Thr Leu Lys Ala Gly Gln Val Val Thr
485 490 495
Ile Trp Ala Ala Gly Ala Gly Ala Thr His Ser Pro Pro Thr Asp Leu
500 505 510
Val Trp Lys Ala Gln Asn Thr Trp Gly Cys Gly Asn Ser Leu Arg Thr
515 520 525
Ala Leu Ile Asn Ser Thr Gly Glu Glu Val Ala Met Arg Lys Leu Val
530 535 540
Arg Ser Val Thr Val Val Glu Asp Asp Glu Asp Glu Asp Gly Asp Asp
545 550 555 560
Leu Leu His His His His Gly Ser His Cys Ser Ser Ser Gly Asp Pro
565 570 575
Ala Glu Tyr Asn Leu Arg Ser Arg Thr Val Leu Cys Gly Thr Cys Gly
580 585 590
Gln Pro Ala Asp Lys Ala Ser Ala Ser Gly Ser Gly Ala Gln Val Gly
595 600 605
Gly Pro Ile Ser Ser Gly Ser Ser Ala Ser Ser Val Thr Val Thr Arg
610 615 620
Ser Tyr Arg Ser Val Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Phe Gly Asp Asn
625 630 635 640
Leu Val Thr Arg Ser Tyr Leu Leu Gly Asn Ser Ser Pro Arg Thr Gln
645 650 655
Ser Pro Gln Asn Cys Ser Ile Met
660

Claims (2)

1.核纤层蛋白A在制备卵巢癌术后预后评估试剂盒中的应用，其特征在于：以核纤层蛋白A作为分子标记，利用人源核纤层蛋白A单克隆抗体或人源核纤层蛋白A多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测核纤层蛋白A在卵巢癌组织中的相对表达量。
2.根据权利要求1所述的核纤层蛋白A在制备卵巢癌术后预后评估试剂盒中的应用，其特征在于：所述人源核纤层蛋白A多克隆抗体由序列为SEQ ID NO.1所示的核纤层蛋白A免疫兔子获得。
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