CN107632160B - Celsr3蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用、肝癌预后评估试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了CELSR3蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用、肝癌预后评估试剂盒及方法。本发明采用免疫组化方法检测CELSR3蛋白在肝癌组织中的相对表达量，以此判断肝癌患者出现肝癌复发转移的风险。本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了CELSR3蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用于制备判断肝癌患者预后的蛋白质分子标记，对于肝癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。

Description

CELSR3蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用、肝癌 预后评估试剂盒及方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及CELSR3蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用、肝癌预后评估试剂盒及方法。

背景技术

肝癌即肝脏恶性肿瘤，可分为原发性和继发性两大类。原发性肝脏恶性肿瘤起源于肝脏的上皮或间叶组织，前者称为原发性肝癌，是我国高发的，危害极大的恶性肿瘤；后者称为肉瘤，与原发性肝癌相比较为少见。继发性或称转移性肝癌系指全身多个器官起源的恶性肿瘤侵犯至肝脏，一般多见于胃、胆道、胰腺、结直肠、卵巢、子宫、肺、乳腺等器官恶性肿瘤的肝转移。

肝癌结节外观多数呈球状，边界不甚规则，肿瘤周围可出现“卫星结节”。肝脏周边部靠近包膜的癌结节一般凸出表面但无中心凹陷。癌结节切面多呈灰白色，部分可因脂肪变性或坏死而呈黄色，亦可因含较多胆汁而显绿色，或因出血而呈红褐色。出血坏死多见于大结节的中央部。癌结节质地与组织学类型有关，实体型癌切面呈均质、光滑且柔软；梁状型癌切面则干燥呈颗粒状；胆管细胞癌因富含胶原纤维质地致密。肝癌体积明显增大，重量可达2000～3000g，不伴肝硬化的巨块型肝癌体积更大，重量可达7000g以上。多数肝癌伴大结节性或混合性肝硬化，部分门静脉、肝静脉腔内可见癌栓形成。

肝癌的发生发展及预后与癌基因的激活和抑癌基因功能失活密切关联，是多因素诱导，多基因参与的复杂病理过程。近年来，肝癌早期复发转移的分子机制是该领域的热门课题，深入阐明该分子机制，并在其特异性环节中导入靶向性治疗措施，有望很大幅度提高肝癌术后总体治疗效果。因此，探寻切实有效的肝癌肝切除术后早期复发相关预警分子标志，阐明其与肝癌早期复发转移的关系，这对提高肝癌术后治疗效果、评估肝癌早期复发风险、判断预后和个体化治疗有着至关重要的意义。

CELSR3(Cadherin EGF Laninin Seven Pass Receptor 1-3)编码属于钙粘蛋白家族的非典型钙粘蛋白。CELSR3蛋白在皮层中间神经元迁移，神经元轴突、树突的发育上发挥了重要作用。然而，相对于其广泛的表达，CELSR3及其家族在其他组织中的功能却未明。

肝癌做为对人类健康威胁最大的肿瘤之一，至今其发生的分子机制仍不清楚，对肝癌的治疗也缺少特异性的分子靶点，而CELSR3做为十分重要的肿瘤癌基因，目前尚无文献报道CELSR3蛋白与判断肝癌预后或肝癌转移相关。本发明研究发现在肝癌中的CELSR3表达与病人术后预后存在显著的关系，暗示CELSR3可作为肝癌的术后预后的有效预警蛋白。

发明内容

本发明目的在于提供CELSR3蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，并提供用于肝癌术后预后评估的试剂盒及方法。

本发明经过广泛而深入的研究，首次发现，采用免疫组化方法检测CELSR3蛋白在肝癌组织中的相对表达量，能够判断肝癌患者出现肝癌复发转移的风险。基于CELSR3蛋白表达量与肝癌复发转移的相关性，以CELSR3蛋白作为预后标记物对其表达量进行检测可以用于指导肝癌的预后判断。

因此，本发明提供了CELSR3蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，该应用是以CELSR3蛋白作为分子标记，利用CELSR3单克隆抗体或CELSR3多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测CELSR3蛋白在肝癌组织中的相对表达量。

本发明还提供了所述应用中用于肝癌术后预后评估的试剂盒，该试剂盒包括：人源CELSR3单克隆抗体或CELSR3多克隆抗体、免疫组化实验试剂。所述免疫组化实验试剂为本领域免疫组化实验中的常用试剂。

发明人经过研究发现，CELSR3在复发转移肝癌组织中表达高于未复发转移肝癌组织，可以推测CELSR3在肝癌术后复发转移中发挥重要作用。查阅国内外文献，CELSR3与肝癌的发生以及复发转移的相关研究少，在本研究中，CELSR3在肝癌组织中的表达上调，而在癌旁和正常肝组织中则表达下调，且与未复发转移组相比，CELSR3在复发转移组中表达也上调，表明CELSR3可能作为促进因子参与肝癌发生发展过程。通过Kaplan-Meier生存曲线分析，CELSR3表达程度与肝癌患者的预后有关，CELSR3高表达的患者预后不良(P<0.05)。

综上所述，CELSR3在肝癌组织中高表达，CELSR3的高表达与肝癌患者术后复发转移有关。CELSR3可以作为肝癌预后的一个重要候选分子标记物。

优选的，所述人源CELSR3多克隆抗体由序列为SEQ ID NO.1所示的CELSR3蛋白免疫兔子获得，可自行制备，也可采用市购商品。

本发明所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％H₂O₂(水溶液)、3％BSA封闭液(以PBS配制)、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶(用于标记二抗)、PBS(pH7.4)、0.01M EDTA修复液。

利用本发明所述试剂盒进行肝癌术后预后评估的方法如下：

(1)取肝癌患者病理标本，利用人源CELSR3单克隆抗体或人源CELSR3多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，进行免疫组化染色；

其中，病理标本来自于肝癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。免疫组化方法利用SP染色法，具体步骤如下：

(a)制备肝癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。

(b)切片脱腊。依次浸泡：二甲苯I：10min；二甲苯II：10min；二甲苯III：10min。

(c)切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90％(v/v)乙醇：3min；80％乙醇：3min；75％乙醇：3min。

(d)PBS清洗3次，每次5min。

(e)EDTA抗原高压修复：切片放入0.01M EDTA修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。PBS清洗3次，每次5min。

(f)加入300μL的3％(w/w)过氧化氢水溶液，37℃10min。PBS清洗3次，每次5min。

(g)加入300μL的3％(w/w)BSA封闭液(PBS配制)，37℃1h。PBS清洗3次，每次5min。

(h)加入一抗：CELSR3抗体浓度：1：500，4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min，然后PBS洗4次，每次5min。

(i)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释)，37℃45min。PBS洗4次，每次5min。

(j)PBS洗3次，每次5min。DAB(DAB显色试剂盒，购自上海生工)显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s，用自来水冲洗浸泡。

(k)脱水。依次浸泡：75％乙醇：2min；80％乙醇：2min；90％乙醇：2min；无水乙醇：2min。

(L)用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。

(2)利用显微镜和成像装置随机选取肝癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用Aperio Image Scope软件对组织样本的相片进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms(Positive Pixel Count V9)程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：

(3)每个组织样本的免疫组织化学评分计算为Positivity×Log10[255/Iavg]，其中Positivity＝NPositive/NTotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量/显色总数量；Iavg＝(Iwp+Ip+Isp)/(Nwp+Np+Nsp)，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)，即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。

(4)采用SPSS18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用Pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用KaPlan-Meier生存分析，对数秩和检验(log-ranktest)比较生存曲线的差别。本发明显示CELSR3蛋白与肝癌的预后具有显著的相关性，为预测肝癌的复发转移及术后的生存率提供一条全新途径，对肝癌患者的预后有重要作用。当癌组织CELSR3免疫组化评分高于0.462时，肝癌易出现复发转移，肝癌患者术后易死亡。

本发明的有益效果主要体现在：本发明研究发现在肝癌中的CELSR3表达与病人术后预后存在显著的关系，暗示CELSR3可作为肝癌的术后预后的有效预警蛋白。因此，本发明提供了CELSR3蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，提示该蛋白能用于制备判断肝癌患者预后的蛋白质分子标记，对于肝癌病人术后监控和序贯治疗也具有重要的指导意义。

附图说明

图1为CELSR3在肝癌患者术后1年内无复发转移的组织样本中弱表达；

图2为CELSR3在肝癌患者术后1年内复发转移的组织样本中高表达；

图3为CELSR3在肝癌旁组织中弱表达；

图4为肝癌组织中CELSR3低表达组与高表达组生存曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不限于此：

实施例1

用于肝癌术后预后评估的试剂盒，该试剂盒包括：用于对肝癌组织中的CELSR3蛋白的相对表达量进行检测的人源CELSR3单克隆抗体或CELSR3多克隆抗体、免疫组化实验试剂。其中，免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％H₂O₂、3％BSA封闭液、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶、PBS以及0.01M EDTA修复液。

本发明所述人源CELSR3多克隆抗体由序列为SEQ ID NO.1所示的CELSR3蛋白免疫兔子获得。可自行制备，也可采用市购商品。

本发明所述免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3％H₂O₂(水溶液)、3％BSA封闭液(以PBS配制)、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶(用于标记二抗)、PBS(pH7.4)、0.01M EDTA修复液。

实施例2

CELSR3蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，该应用是利用本发明试剂盒进行肝癌术后预后评估，方法如下：

(1)取肝癌患者病理标本，利用人源CELSR3单克隆抗体或人源CELSR3多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂，进行免疫组化染色；

其中，病理标本来自于肝癌患者活检组织或术中、术后的病理取材。免疫组化方法利用SP染色法，具体步骤如下：

(a)制备肝癌组织石蜡切片，60℃烤箱过夜。

(b)切片脱腊。依次浸泡：二甲苯I：10min；二甲苯II：10min；二甲苯III：10min。

(c)切片水化。依次浸泡：无水乙醇：3min；90％(v/v)乙醇：3min；80％乙醇：3min；75％乙醇：3min。

(d)PBS清洗3次，每次5min。

(e)EDTA抗原高压修复：切片放入0.01M EDTA修复液浸泡，沸水浴5min，冷却至室温。PBS清洗3次，每次5min。

(f)加入300μL的3％(w/w)过氧化氢水溶液，37℃10min。PBS清洗3次，每次5min。

(g)加入300μL的3％(w/w)BSA封闭液(PBS配制)，37℃1h。PBS清洗3次，每次5min。

(h)加入一抗：CELSR3抗体浓度：1：500，4℃冰箱放置16h后取出，室温复温15min，然后PBS洗4次，每次5min。

(i)滴加二抗，所述的二抗为辣根过氧化物酶标记羊抗兔IgG(购自福州迈新试剂公司，即用型，无需稀释)，37℃45min。PBS洗4次，每次5min。

(j)PBS洗3次，每次5min。DAB(DAB显色试剂盒，购自上海生工)显色2-10min，镜下观察；双蒸水洗止显色，苏木素复染10s，用自来水冲洗浸泡。

(k)脱水。依次浸泡：75％乙醇：2min；80％乙醇：2min；90％乙醇：2min；无水乙醇：2min。

(L)用电吹风吹干，加入中性树胶，盖玻片覆盖。

(2)利用显微镜和成像装置随机选取肝癌组织和癌旁组织3个视野拍摄，利用Aperio Image Scope软件对组织样本的相片进行扫描，扫描后采用该软件的Algorithms(Positive Pixel Count V9)程序对每个样本进行阳性强度计算，计算数据如下：

(3)每个组织样本的免疫组织化学评分计算为Positivity×Log10[255/Iavg]，其中Positivity＝NPositive/NTotal，即阳性率，计算方法为阳性象素数量/显色总数量；Iavg＝(Iwp+Ip+Isp)/(Nwp+Np+Nsp)，即阳性平均强度，计算方法为阳性平均强度＝(弱阳性象素总强度+阳性象素总强度+强阳性象素总强度)/(弱阳性象素数量+阳性象素数量+强阳性象素数量)，即为该组织的免疫组化评分，用于后续分析。CELSR3高低表达标准以358例肝癌组织中CELSR3表达评分的中位数(0.462)为界。

(4)采用SPSS18.0进行统计分析，检验指标与临床资料之间的计数资料采用Pearson卡方检验，计量资料采用t检验。检测指标与临床预后的分析采用KaPlan-Meier生存分析，对数秩和检验(log-ranktest)比较生存曲线的差别。

按照上述方法，本发明在358例肝癌病人的肿瘤组织中检测结果如图1-3所示：CELSR3在1年内无复发转移组中弱表达；在复发转移组中高表达(图2)；在癌旁组织中弱表达(图3)。

CELSR3与肝癌患者预后的关系：

通过Kaplan-Meier生存曲线分析，CELSR3的表达程度与肝癌患者的预后相关，如图4所示，CELSR3高表达的患者平均生存期(存活率)低于CELSR3低表达的患者。

实施例3

取某肝癌术后肿瘤样本进行石蜡包埋切片，并利用以上所述的免疫组织化学方法进行检测，经计算，其癌组织的CELSR3免疫组化组织评分为0.632。经过术后随访发现，该患者在术后第9个月发生肝癌复发转移，术后十八个月死亡。

实施例4

取某肝癌术后肿瘤样本进行石蜡包埋切片，并利用以上所述的免疫组织化学方法进行检测，经计算，其癌组织的CELSR3免疫组化组织评分为0.212。经过术后随访发现，该患者在术后1年均未发现转移复发，健在。

由以上试验结果可知，通过采用免疫组化的方法检测CELSR3蛋白分子相对表达量能预测肝癌远处转移风险以及患者术后的生存或死亡。当癌组织CELSR3的免疫组化评分高于0.462时，肝癌易出现复发转移，肝癌患者术后易死亡。显然CELSR3蛋白与肝癌具有相关性，因此，以CELSR3蛋白作为蛋白质分子标记对其表达量进行检测能预测肝癌手术后复发转移等事件，并判断预后。

序列表

<110> 福建师范大学

<120> CELSR3蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用、肝癌预后评估试剂盒及方法

<130> 1

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 3312

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Met Ala Arg Arg Pro Pro Trp Arg Gly Leu Gly Gly Arg Ser Thr

1 5 10 15

Pro Ile Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ser Leu Phe Pro Leu Ser Gln Glu

20 25 30

Glu Leu Gly Gly Gly Gly His Gln Gly Trp Asp Pro Gly Leu Ala Ala

35 40 45

Thr Thr Gly Pro Arg Ala His Ile Gly Gly Gly Ala Leu Ala Leu Cys

50 55 60

Pro Glu Ser Ser Gly Val Arg Glu Asp Gly Gly Pro Gly Leu Gly Val

65 70 75 80

Arg Glu Pro Ile Phe Val Gly Leu Arg Gly Arg Arg Gln Ser Ala Arg

85 90 95

Asn Ser Arg Gly Pro Pro Glu Gln Pro Asn Glu Glu Leu Gly Ile Glu

100 105 110

His Gly Val Gln Pro Leu Gly Ser Arg Glu Arg Glu Thr Gly Gln Gly

115 120 125

Pro Gly Ser Val Leu Tyr Trp Arg Pro Glu Val Ser Ser Cys Gly Arg

130 135 140

Thr Gly Pro Leu Gln Arg Gly Ser Leu Ser Pro Gly Ala Leu Ser Ser

145 150 155 160

Gly Val Pro Gly Ser Gly Asn Ser Ser Pro Leu Pro Ser Asp Phe Leu

165 170 175

Ile Arg His His Gly Pro Lys Pro Val Ser Ser Gln Arg Asn Ala Gly

180 185 190

Thr Gly Ser Arg Lys Arg Val Gly Thr Ala Arg Cys Cys Gly Glu Leu

195 200 205

Trp Ala Thr Gly Ser Lys Gly Gln Gly Glu Arg Ala Thr Thr Ser Gly

210 215 220

Ala Glu Arg Thr Ala Pro Arg Arg Asn Cys Leu Pro Gly Ala Ser Gly

225 230 235 240

Ser Gly Pro Glu Leu Asp Ser Ala Pro Arg Thr Ala Arg Thr Ala Pro

245 250 255

Ala Ser Gly Ser Ala Pro Arg Glu Ser Arg Thr Ala Pro Glu Pro Ala

260 265 270

Pro Lys Arg Met Arg Ser Arg Gly Leu Phe Arg Cys Arg Phe Leu Pro

275 280 285

Gln Arg Pro Gly Pro Arg Pro Pro Gly Leu Pro Ala Arg Pro Glu Ala

290 295 300

Arg Lys Val Thr Ser Ala Asn Arg Ala Arg Phe Arg Arg Ala Ala Asn

305 310 315 320

Arg His Pro Gln Phe Pro Gln Tyr Asn Tyr Gln Thr Leu Val Pro Glu

325 330 335

Asn Glu Ala Ala Gly Thr Ala Val Leu Arg Val Val Ala Gln Asp Pro

340 345 350

Asp Ala Gly Glu Ala Gly Arg Leu Val Tyr Ser Leu Ala Ala Leu Met

355 360 365

Asn Ser Arg Ser Leu Glu Leu Phe Ser Ile Asp Pro Gln Ser Gly Leu

370 375 380

Ile Arg Thr Ala Ala Ala Leu Asp Arg Glu Ser Met Glu Arg His Tyr

385 390 395 400

Leu Arg Val Thr Ala Gln Asp His Gly Ser Pro Arg Leu Ser Ala Thr

405 410 415

Thr Met Val Ala Val Thr Val Ala Asp Arg Asn Asp His Ser Pro Val

420 425 430

Phe Glu Gln Ala Gln Tyr Arg Glu Thr Leu Arg Glu Asn Val Glu Glu

435 440 445

Gly Tyr Pro Ile Leu Gln Leu Arg Ala Thr Asp Gly Asp Ala Pro Pro

450 455 460

Asn Ala Asn Leu Arg Tyr Arg Phe Val Gly Pro Pro Ala Ala Arg Ala

465 470 475 480

Ala Ala Ala Ala Ala Phe Glu Ile Asp Pro Arg Ser Gly Leu Ile Ser

485 490 495

Thr Ser Gly Arg Val Asp Arg Glu His Met Glu Ser Tyr Glu Leu Val

500 505 510

Val Glu Ala Ser Asp Gln Gly Gln Glu Pro Gly Pro Arg Ser Ala Thr

515 520 525

Val Arg Val His Ile Thr Val Leu Asp Glu Asn Asp Asn Ala Pro Gln

530 535 540

Phe Ser Glu Lys Arg Tyr Val Ala Gln Val Arg Glu Asp Val Arg Pro

545 550 555 560

His Thr Val Val Leu Arg Val Thr Ala Thr Asp Arg Asp Lys Asp Ala

565 570 575

Asn Gly Leu Val His Tyr Asn Ile Ile Ser Gly Asn Ser Arg Gly His

580 585 590

Phe Ala Ile Asp Ser Leu Thr Gly Glu Ile Gln Val Val Ala Pro Leu

595 600 605

Asp Phe Glu Ala Glu Arg Glu Tyr Ala Leu Arg Ile Arg Ala Gln Asp

610 615 620

Ala Gly Arg Pro Pro Leu Ser Asn Asn Thr Gly Leu Ala Ser Ile Gln

625 630 635 640

Val Val Asp Ile Asn Asp His Ile Pro Ile Phe Val Ser Thr Pro Phe

645 650 655

Gln Val Ser Val Leu Glu Asn Ala Pro Leu Gly His Ser Val Ile His

660 665 670

Ile Gln Ala Val Asp Ala Asp His Gly Glu Asn Ala Arg Leu Glu Tyr

675 680 685

Ser Leu Thr Gly Val Ala Pro Asp Thr Pro Phe Val Ile Asn Ser Ala

690 695 700

Thr Gly Trp Val Ser Val Ser Gly Pro Leu Asp Arg Glu Ser Val Glu

705 710 715 720

His Tyr Phe Phe Gly Val Glu Ala Arg Asp His Gly Ser Pro Pro Leu

725 730 735

Ser Ala Ser Ala Ser Val Thr Val Thr Val Leu Asp Val Asn Asp Asn

740 745 750

Arg Pro Glu Phe Thr Met Lys Glu Tyr His Leu Arg Leu Asn Glu Asp

755 760 765

Ala Ala Val Gly Thr Ser Val Val Ser Val Thr Ala Val Asp Arg Asp

770 775 780

Ala Asn Ser Ala Ile Ser Tyr Gln Ile Thr Gly Gly Asn Thr Arg Asn

785 790 795 800

Arg Phe Ala Ile Ser Thr Gln Gly Gly Val Gly Leu Val Thr Leu Ala

805 810 815

Leu Pro Leu Asp Tyr Lys Gln Glu Arg Tyr Phe Lys Leu Val Leu Thr

820 825 830

Ala Ser Asp Arg Ala Leu His Asp His Cys Tyr Val His Ile Asn Ile

835 840 845

Thr Asp Ala Asn Thr His Arg Pro Val Phe Gln Ser Ala His Tyr Ser

850 855 860

Val Ser Val Asn Glu Asp Arg Pro Met Gly Ser Thr Ile Val Val Ile

865 870 875 880

Ser Ala Ser Asp Asp Asp Val Gly Glu Asn Ala Arg Ile Thr Tyr Leu

885 890 895

Leu Glu Asp Asn Leu Pro Gln Phe Arg Ile Asp Ala Asp Ser Gly Ala

900 905 910

Ile Thr Leu Gln Ala Pro Leu Asp Tyr Glu Asp Gln Val Thr Tyr Thr

915 920 925

Leu Ala Ile Thr Ala Arg Asp Asn Gly Ile Pro Gln Lys Ala Asp Thr

930 935 940

Thr Tyr Val Glu Val Met Val Asn Asp Val Asn Asp Asn Ala Pro Gln

945 950 955 960

Phe Val Ala Ser His Tyr Thr Gly Leu Val Ser Glu Asp Ala Pro Pro

965 970 975

Phe Thr Ser Val Leu Gln Ile Ser Ala Thr Asp Arg Asp Ala His Ala

980 985 990

Asn Gly Arg Val Gln Tyr Thr Phe Gln Asn Gly Glu Asp Gly Asp Gly

995 1000 1005

Asp Phe Thr Ile Glu Pro Thr Ser Gly Ile Val Arg Thr Val Arg Arg

1010 1015 1020

Leu Asp Arg Glu Ala Val Ser Val Tyr Glu Leu Thr Ala Tyr Ala Val

1025 1030 1035 1040

Asp Arg Gly Val Pro Pro Leu Arg Thr Pro Val Ser Ile Gln Val Met

1045 1050 1055

Val Gln Asp Val Asn Asp Asn Ala Pro Val Phe Pro Ala Glu Glu Phe

1060 1065 1070

Glu Val Arg Val Lys Glu Asn Ser Ile Val Gly Ser Val Val Ala Gln

1075 1080 1085

Ile Thr Ala Val Asp Pro Asp Glu Gly Pro Asn Ala His Ile Met Tyr

1090 1095 1100

Gln Ile Val Glu Gly Asn Ile Pro Glu Leu Phe Gln Met Asp Ile Phe

1105 1110 1115 1120

Ser Gly Glu Leu Thr Ala Leu Ile Asp Leu Asp Tyr Glu Ala Arg Gln

1125 1130 1135

Glu Tyr Val Ile Val Val Gln Ala Thr Ser Ala Pro Leu Val Ser Arg

1140 1145 1150

Ala Thr Val His Val Arg Leu Val Asp Gln Asn Asp Asn Ser Pro Val

1155 1160 1165

Leu Asn Asn Phe Gln Ile Leu Phe Asn Asn Tyr Val Ser Asn Arg Ser

1170 1175 1180

Asp Thr Phe Pro Ser Gly Ile Ile Gly Arg Ile Pro Ala Tyr Asp Pro

1185 1190 1195 1200

Asp Val Ser Asp His Leu Phe Tyr Ser Phe Glu Arg Gly Asn Glu Leu

1205 1210 1215

Gln Leu Leu Val Val Asn Gln Thr Ser Gly Glu Leu Arg Leu Ser Arg

1220 1225 1230

Lys Leu Asp Asn Asn Arg Pro Leu Val Ala Ser Met Leu Val Thr Val

1235 1240 1245

Thr Asp Gly Leu His Ser Val Thr Ala Gln Cys Val Leu Arg Val Val

1250 1255 1260

Ile Ile Thr Glu Glu Leu Leu Ala Asn Ser Leu Thr Val Arg Leu Glu

1265 1270 1275 1280

Asn Met Trp Gln Glu Arg Phe Leu Ser Pro Leu Leu Gly Arg Phe Leu

1285 1290 1295

Glu Gly Val Ala Ala Val Leu Ala Thr Pro Ala Glu Asp Val Phe Ile

1300 1305 1310

Phe Asn Ile Gln Asn Asp Thr Asp Val Gly Gly Thr Val Leu Asn Val

1315 1320 1325

Ser Phe Ser Ala Leu Ala Pro Arg Gly Ala Gly Ala Gly Ala Ala Gly

1330 1335 1340

Pro Trp Phe Ser Ser Glu Glu Leu Gln Glu Gln Leu Tyr Val Arg Arg

1345 1350 1355 1360

Ala Ala Leu Ala Ala Arg Ser Leu Leu Asp Val Leu Pro Phe Asp Asp

1365 1370 1375

Asn Val Cys Leu Arg Glu Pro Cys Glu Asn Tyr Met Lys Cys Val Ser

1380 1385 1390

Val Leu Arg Phe Asp Ser Ser Ala Pro Phe Leu Ala Ser Ala Ser Thr

1395 1400 1405

Leu Phe Arg Pro Ile Gln Pro Ile Ala Gly Leu Arg Cys Arg Cys Pro

1410 1415 1420

Pro Gly Phe Thr Gly Asp Phe Cys Glu Thr Glu Leu Asp Leu Cys Tyr

1425 1430 1435 1440

Ser Asn Pro Cys Arg Asn Gly Gly Ala Cys Ala Arg Arg Glu Gly Gly

1445 1450 1455

Tyr Thr Cys Val Cys Arg Pro Arg Phe Thr Gly Glu Asp Cys Glu Leu

1460 1465 1470

Asp Thr Glu Ala Gly Arg Cys Val Pro Gly Val Cys Arg Asn Gly Gly

1475 1480 1485

Thr Cys Thr Asp Ala Pro Asn Gly Gly Phe Arg Cys Gln Cys Pro Ala

1490 1495 1500

Gly Gly Ala Phe Glu Gly Pro Arg Cys Glu Val Ala Ala Arg Ser Phe

1505 1510 1515 1520

Pro Pro Ser Ser Phe Val Met Phe Arg Gly Leu Arg Gln Arg Phe His

1525 1530 1535

Leu Thr Leu Ser Leu Ser Phe Ala Thr Val Gln Gln Ser Gly Leu Leu

1540 1545 1550

Phe Tyr Asn Gly Arg Leu Asn Glu Lys His Asp Phe Leu Ala Leu Glu

1555 1560 1565

Leu Val Ala Gly Gln Val Arg Leu Thr Tyr Ser Thr Gly Glu Ser Asn

1570 1575 1580

Thr Val Val Ser Pro Thr Val Pro Gly Gly Leu Ser Asp Gly Gln Trp

1585 1590 1595 1600

His Thr Val His Leu Arg Tyr Tyr Asn Lys Pro Arg Thr Asp Ala Leu

1605 1610 1615

Gly Gly Ala Gln Gly Pro Ser Lys Asp Lys Val Ala Val Leu Ser Val

1620 1625 1630

Asp Asp Cys Asp Val Ala Val Ala Leu Gln Phe Gly Ala Glu Ile Gly

1635 1640 1645

Asn Tyr Ser Cys Ala Ala Ala Gly Val Gln Thr Ser Ser Lys Lys Ser

1650 1655 1660

Leu Asp Leu Thr Gly Pro Leu Leu Leu Gly Gly Val Pro Asn Leu Pro

1665 1670 1675 1680

Glu Asn Phe Pro Val Ser His Lys Asp Phe Ile Gly Cys Met Arg Asp

1685 1690 1695

Leu His Ile Asp Gly Arg Arg Val Asp Met Ala Ala Phe Val Ala Asn

1700 1705 1710

Asn Gly Thr Met Ala Gly Cys Gln Ala Lys Leu His Phe Cys Asp Ser

1715 1720 1725

Gly Pro Cys Lys Asn Ser Gly Phe Cys Ser Glu Arg Trp Gly Ser Phe

1730 1735 1740

Ser Cys Asp Cys Pro Val Gly Phe Gly Gly Lys Asp Cys Gln Leu Thr

1745 1750 1755 1760

Met Ala His Pro His His Phe Arg Gly Asn Gly Thr Leu Ser Trp Asn

1765 1770 1775

Phe Gly Ser Asp Met Ala Val Ser Val Pro Trp Tyr Leu Gly Leu Ala

1780 1785 1790

Phe Arg Thr Arg Ala Thr Gln Gly Val Leu Met Gln Val Gln Ala Gly

1795 1800 1805

Pro His Ser Thr Leu Leu Cys Gln Leu Asp Arg Gly Leu Leu Ser Val

1810 1815 1820

Thr Val Thr Arg Gly Ser Gly Arg Ala Ser His Leu Leu Leu Asp Gln

1825 1830 1835 1840

Val Thr Val Ser Asp Gly Arg Trp His Asp Leu Arg Leu Glu Leu Gln

1845 1850 1855

Glu Glu Pro Gly Gly Arg Arg Gly His His Val Leu Met Val Ser Leu

1860 1865 1870

Asp Phe Ser Leu Phe Gln Asp Thr Met Ala Val Gly Ser Glu Leu Gln

1875 1880 1885

Gly Leu Lys Val Lys Gln Leu His Val Gly Gly Leu Pro Pro Gly Ser

1890 1895 1900

Ala Glu Glu Ala Pro Gln Gly Leu Val Gly Cys Ile Gln Gly Val Trp

1905 1910 1915 1920

Leu Gly Ser Thr Pro Ser Gly Ser Pro Ala Leu Leu Pro Pro Ser His

1925 1930 1935

Arg Val Asn Ala Glu Pro Gly Cys Val Val Thr Asn Ala Cys Ala Ser

1940 1945 1950

Gly Pro Cys Pro Pro His Ala Asp Cys Arg Asp Leu Trp Gln Thr Phe

1955 1960 1965

Ser Cys Thr Cys Gln Pro Gly Tyr Tyr Gly Pro Gly Cys Val Asp Ala

1970 1975 1980

Cys Leu Leu Asn Pro Cys Gln Asn Gln Gly Ser Cys Arg His Leu Pro

1985 1990 1995 2000

Gly Ala Pro His Gly Tyr Thr Cys Asp Cys Val Gly Gly Tyr Phe Gly

2005 2010 2015

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2020 2025 2030

Gly Ser Pro Thr Cys Gly Pro Cys Asn Cys Asp Val His Lys Gly Phe

2035 2040 2045

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2225 2230 2235 2240

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2245 2250 2255

Phe Asn Glu Asn Leu Leu Trp Ala Gly Ser Ala Leu Leu Ala Pro Glu

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Thr Gly Asp Leu Trp Ala Ala Leu Gly Gln Arg Ala Pro Gly Gly Ser

2275 2280 2285

Pro Gly Ser Ala Gly Leu Val Arg His Leu Glu Glu Tyr Ala Ala Thr

2290 2295 2300

Leu Ala Arg Asn Met Glu Leu Thr Tyr Leu Asn Pro Met Gly Leu Val

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Thr Pro Asn Ile Met Leu Ser Ile Asp Arg Met Glu His Pro Ser Ser

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Ser Pro Arg Pro Ser Pro Ser Glu Val Leu Pro Thr Ser Ser Ser Ile

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Gly Gly Leu Leu Pro Ala Gln Phe Gln Ala Glu Arg Arg Gly Ala Arg

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Leu Pro Gln Asn Pro Val Met Asn Ser Pro Val Val Ser Val Ala Val

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Phe His Gly Arg Asn Phe Leu Arg Gly Ile Leu Glu Ser Pro Ile Ser

2450 2455 2460

Leu Glu Phe Arg Leu Leu Gln Thr Ala Asn Arg Ser Lys Ala Ile Cys

2465 2470 2475 2480

Val Gln Trp Asp Pro Pro Gly Leu Ala Glu Gln His Gly Val Trp Thr

2485 2490 2495

Ala Arg Asp Cys Glu Leu Val His Arg Asn Gly Ser His Ala Arg Cys

2500 2505 2510

Arg Cys Ser Arg Thr Gly Thr Phe Gly Val Leu Met Asp Ala Ser Pro

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Arg Glu Arg Leu Glu Gly Asp Leu Glu Leu Leu Ala Val Phe Thr His

2530 2535 2540

Val Val Val Ala Val Ser Val Ala Ala Leu Val Leu Thr Ala Ala Ile

2545 2550 2555 2560

Leu Leu Ser Leu Arg Ser Leu Lys Ser Asn Val Arg Gly Ile His Ala

2565 2570 2575

Asn Val Ala Ala Ala Leu Gly Val Ala Glu Leu Leu Phe Leu Leu Gly

2580 2585 2590

Ile His Arg Thr His Asn Gln Leu Val Cys Thr Ala Val Ala Ile Leu

2595 2600 2605

Leu His Tyr Phe Phe Leu Ser Thr Phe Ala Trp Leu Phe Val Gln Gly

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Leu His Leu Tyr Arg Met Gln Val Glu Pro Arg Asn Val Asp Arg Gly

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Ala Met Arg Phe Tyr His Ala Leu Gly Trp Gly Val Pro Ala Val Leu

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Leu Gly Leu Ala Val Gly Leu Asp Pro Glu Gly Tyr Gly Asn Pro Asp

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Phe Cys Trp Ile Ser Val His Glu Pro Leu Ile Trp Ser Phe Ala Gly

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Pro Val Val Leu Val Ile Val Met Asn Gly Thr Met Phe Leu Leu Ala

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Ala Arg Thr Ser Cys Ser Thr Gly Gln Arg Glu Ala Lys Lys Thr Ser

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Ala Leu Thr Leu Arg Ser Ser Phe Leu Leu Leu Leu Leu Val Ser Ala

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Ser Trp Leu Phe Gly Leu Leu Ala Val Asn His Ser Ile Leu Ala Phe

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His Tyr Leu His Ala Gly Leu Cys Gly Leu Gln Gly Leu Ala Val Leu

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Leu Leu Phe Cys Val Leu Asn Ala Asp Ala Arg Ala Ala Trp Met Pro

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Ala Cys Leu Gly Arg Lys Ala Ala Pro Glu Glu Ala Arg Pro Ala Pro

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Gly Leu Gly Pro Gly Ala Tyr Asn Asn Thr Ala Leu Phe Glu Glu Ser

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Gly Leu Ile Arg Ile Thr Leu Gly Ala Ser Thr Val Ser Ser Val Ser

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Ser Ala Arg Ser Gly Arg Thr Gln Asp Gln Asp Ser Gln Arg Gly Arg

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Ser Tyr Leu Arg Asp Asn Val Leu Val Arg His Gly Ser Ala Ala Asp

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Ser Glu Asp Asn Gly Arg Thr Arg Gly Arg Phe Gln Arg Pro Leu Cys

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Arg Ala Ala Gln Ser Glu Arg Leu Leu Thr His Pro Lys Asp Val Asp

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Gly Asn Asp Leu Leu Ser Tyr Trp Pro Ala Leu Gly Glu Cys Glu Ala

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Asp Thr Ser Lys Asp Ala Ala Asn Asn Asn Gln Pro Asp Pro Ala Leu

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Thr Ser Gly Asp Glu Thr Ser Leu Gly Arg Ala Gln Arg Gln Arg Lys

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Pro Pro Pro Leu Pro Leu Ser Pro Gln Arg Gln Leu Ser Arg Asp Pro

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Gly Pro Ser His Gly Pro Ser Thr Glu Gln Leu Asp Ile Leu Ser Ser

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Ile Leu Ala Ser Phe Asn Ser Ser Ala Leu Ser Ser Val Gln Ser Ser

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Ser Thr Pro Leu Gly Pro His Thr Thr Ala Thr Pro Ser Ala Thr Ala

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Ser Val Leu Gly Pro Ser Thr Pro Arg Ser Ala Thr Ser His Ser Ile

3285 3290 3295

Ser Glu Leu Ser Pro Asp Ser Glu Val Pro Arg Ser Glu Gly His Ser

3300 3305 3310

Claims (4)

1.CELSR3蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，其特征在于：以CELSR3蛋白作为分子标记，利用人源CELSR3单克隆抗体或人源CELSR3多克隆抗体，结合免疫组化实验试剂，检测CELSR3蛋白在肝癌组织中的相对表达量。

2.根据权利要求1所述的CELSR3蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，其特征在于：所述人源CELSR3多克隆抗体由序列为SEQ ID NO.1所示的CELSR3蛋白免疫兔子获得。

3.根据权利要求1所述的CELSR3蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，其特征在于：所述试剂盒包括用于对肝癌组织中的CELSR3蛋白的相对表达量进行检测的人源CELSR3单克隆抗体或人源CELSR3多克隆抗体，以及免疫组化实验试剂。

4.根据权利要求3所述的CELSR3蛋白在制备肝癌术后预后评估试剂盒中的应用，其特征在于：所述试剂盒中的免疫组化实验试剂包括：二甲苯、乙醇、3%H₂O₂、3%BSA封闭液、DAB显色试剂、苏木素、辣根过氧化物酶、PBS以及0.01M EDTA修复液。