CN109870576A

CN109870576A - Usp10蛋白的定量检测在原发性肝癌预后判断试剂盒中的应用

Info

Publication number: CN109870576A
Application number: CN201711269310.3A
Authority: CN
Inventors: 许国旺; 宁振; 卢畅; 朴海龙
Original assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Current assignee: Dalian Institute of Chemical Physics of CAS
Priority date: 2017-12-05
Filing date: 2017-12-05
Publication date: 2019-06-11
Anticipated expiration: 2037-12-05
Also published as: CN109870576B

Abstract

本发明属于分子生物学、临床预后判断领域，涉及USP10蛋白表达水平在原发性肝癌预后判断中的应用。具体地，本发明涉及USP10蛋白的定量检测在原发性肝癌预后判断中的应用、原发性肝癌预后判断试剂盒的制备，以及检测原发性肝癌组织USP10蛋白表达水平的方法。本发明通过检测原发性肝癌组织中USP10蛋白相对表达量并结合生存期随访明确USP10蛋白的相对表达量与原发性肝癌患者复发风险及预后相关。USP10蛋白低表达提示原发性肝癌高复发风险且预后欠佳，对在术后监测及预后判断方面具有良好的临床应用前景。

Description

USP10蛋白的定量检测在原发性肝癌预后判断试剂盒中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学、临床预后判断领域，具体涉及USP10蛋白的定量检测在制备原发性肝癌预后判断中的应用、原发性肝癌预后判断试剂盒，以及检测原发性肝癌组织USP10蛋白表达水平的方法。

背景技术

肝癌是病死率最高的恶性肿瘤之一。截止2013年世界卫生组织宣布原发性肝癌引发全球745517人死亡，我国每年约有38.3万人死于肝癌，占全球肝癌死亡病例数的51％。

近年来随着诊治手段的进步，手术、介入、放疗、化疗、生物靶向治疗的综合应用，使得原发性肝癌患者的预后得到改善。其中，外科手术是早期肝癌患者最重要的首选治疗手段，然而单纯肝癌切除术后的5年复发率高，术后复发的有效监测与预后判断对于延长肝癌患者的总生存期至关重要。然而，迄今为止，肝癌术后仍缺乏有效的病情监测及预后判断分子标记物，目前临床上亟需一种能够预测患者术后复发风险和预后的标志物。

泛素-蛋白酶体途径(Ubiquitin-Proteasome Pathway，UPP)是真核生物大多数细胞内蛋白质的降解方式，其过程即泛素化，是指目标蛋白结合泛素并进入蛋白酶体降解或改变活性。然而，泛素化作为重要的蛋白翻译后修饰，是一个动态和可逆的过程。去泛素化酶(Deubiquitinating enzyme，DUB)是可使泛素从泛素化的蛋白底物上脱离。DUBs的功能涉及四个方面：代谢与应激、肿瘤与癌症、感染与免疫、干细胞与发育调控。泛素化和去泛素化动态平衡所参与的基因表达调控充分渗透到上述四个方面。

USP10是一种新发现的DUBs家族成员，主要定位在细胞质，属于半胱氨酸蛋白酶，其在人体组织内分布广泛，可以参与细胞内多种蛋白质的去泛素化过程，从而调控细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、自噬以及DNA损伤修复等多项重要的生理过程。

目前研究表明，USP10是一种抑癌因子，一方面可通过去泛素化作用稳定P53等抑癌因子的表达从而抑制肿瘤的发生(Jian Yuan et al,cell,2010February 5；140(3):384；Jia Sun et al,Mol Cell Biochem.2017Aug 29)，另一方面，它可通过去泛素化AMPK并促进其磷酸化进而抑制肿瘤的增殖(Min Deng et al,Mol Cell.2016Feb 18；61(4):614-624)。前期研究中，我们通过对TCGA数据库中肝癌样本的转录组数据分析显示USP10在肝癌癌旁正常组织中明显高于癌组织，这也提示我们USP10可能成为肝癌判断预后的潜在标志物。

发明内容

在此背景之下，本发明系统的研究了USP10在肝癌组织及癌旁正常组织中的差异表达，进而在一个独立样本中验证了该蛋白低表达与肝癌的不良预后有关，其最终目的是提供一种可用于肝癌预后检测的特异标志物。

在本发明中提供了一种用于肝癌预后检测的试剂盒，其中所述的USP10蛋白定量检测的方法为本领域常用的蛋白定量检测方法，例如免疫组织化学法。在本发明的实施方案中，所述的USP10蛋白的定量检测方法是免疫组织化学法。

根据本发明的用途，其中所述试剂盒(含容器)中含USP10蛋白的定量检测试剂及免疫组织化学相关试剂。

根据本发明的用途，其中所述的USP10蛋白的定量检测试剂包括与USP10蛋白特异性结合的抗体，所述抗体为可进行免疫组化检测的单克隆或多克隆抗体；任选地，还包括检测缓冲液。

根据本发明的用途，其中所述的免疫组化试剂盒中包括二甲苯、乙醇、3％H₂O₂溶液、5％山羊血清封闭液、EDTA抗原修复缓冲液、DAB显色试剂、苏木素和山羊抗兔/鼠HRP标记聚合物。任选地，还包括检测缓冲液。

根据本发明的用途，USP10蛋白的定量方法为组织化学评分法(histochemistryscore)即H-SCORE。H-score＝Σpi(i+1)，式中pi表示阳性细胞数量占切片中所有细胞数量的百分数；i代表着色强度(0-3)。

根据本发明的用途，组织中USP10蛋白表达高于104分时定义为USP10蛋白高表达，低于104分时定义为USP10蛋白低表达。USP10低表达，则肝癌患者的术后生存期短。

在本发明的一个实施方案中，所检测样品为人的肝癌组织及对应的癌旁正常组织的石蜡切片(已签署知情同意书)。

在本发明的一个实施方案中，其中所述的抗体为USP10的多克隆抗体，购于Abcam公司，其货号为ab72486。

在本发明的一个实施方案中，其中所述山羊抗兔/鼠HRP标记聚合物，购于Proteintech公司，其货号为KIHC-5。

在本发明的一个实施方案中，所述的免疫组织化学法的具体步骤包括：先将组织切片于65℃烤箱烘烤4h，接着二甲苯脱蜡3次，每次15min。然后依次在100％，95％，80％和60％乙醇，每级放置5min。后置于蒸馏水中浸洗3次，每次3min。之后将切片加入EDTA缓冲液中，并于微波炉中火修复30min。结束后在EDTA缓冲液自然冷却至室温，然后用TBS冲洗3次，每次1min。加入3％H₂O₂，室温10min以灭活内源性酶。TBS冲洗3次，每次1min。用5％山羊血清封闭液，室温封闭60min。滴加1:150稀释的USP10抗体4℃过夜孵育。TBS冲洗3次，每次1min。之后滴加75μL抗兔/鼠HRP标记聚合物，37℃孵育30min，TBS冲洗3次，每次1min。滴加预制好的显色剂DAB工作液75μL，显色后蒸馏水洗涤。苏木素复染2-3分钟，然后蒸馏水冲洗。各级酒精(60-100％)脱水，每级5min。取出后置于二甲苯10min，2次。用封片胶封片、显微镜观察。

在本发明的一个实施方案中，对肝癌组织和癌旁正常组的染色切片中染色细胞计数采用的是ImageJ软件进行细胞计数，具体实施方案为：在400倍光学显微镜下进行读片，使用组织化学评分法(H-scores)对切片进行USP10的定量评分。H-score＝Σpi(i+1)，式中pi表示视野下阳性细胞数量占切片中所有细胞数量的百分数；i代表着色强度(0：未着色；1：轻度黄染；2：黄染；3：重度黄染)，最后取4个视野下的平均值。

在本发明中，所述的肝癌的临床分期为TNM分期，具体如下：

T-原发病灶：

Tx：原发肿瘤不能测定

T0：无原发肿瘤的证据

T1：孤立肿瘤没有血管受侵

T2：孤立肿瘤，有血管受侵或多发肿瘤直径≤5cm

T3a：多发肿瘤直径>5cm

T3b:孤立肿瘤或多发肿瘤侵及门静脉或肝静脉主要分支

T4：肿瘤直接侵及周围组织，或致胆囊或脏器穿孔

N-区域淋巴结：

Nx：区域内淋巴腺不结能测定

N0：无淋巴结转移

N1：区域淋巴结转移

M-远处转移：

Mx：远处转移不能测定

M0：无远处转移

M1：有远处转移

肝癌分期：

I期：T1N0M0

II期：T2N0M0

IIIA期：T3aN0M0

IIIB期：T3bN0M0

IIIC期：T4，N0M0

IVA期：任何T，N1M0

IVB期：任何T，任何N，M1

另外，其中所述的肝癌预后判断是指对肝癌患者的生存期进行预测或判断，在本发明实施方案中，所述肝细胞肝癌患者为肿瘤切除术后。

发明的有益效果：本发明提供了一种可以有效判断肝细胞肝癌患者术后生存期的分子标志物，该标志物具有以下特征：存在USP10蛋白低表达的肝癌患者较USP10蛋白高表达的患者生存期短。

统计学分析结果表明USP10蛋白低表达可以用于肝癌患者的预后判断，为肝癌预后的判断提供了新途径，为临床医生对肝癌患者的病情分析提供了新的参考依据。

附图说明

图1显示了74例肝癌患者的癌组织和癌旁组织石蜡切片中USP10的表达情况(应用免疫组织化学法)

图2显示了USP10的低表达与肝癌的预后相关性

具体实施方式

下面将结合实例对本发明的实施方案进行详述，本方案中所述免疫组织化学法对USP10进行定量检测，本领域内技术人员能够理解。实施方案中未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议条件进行。所用试剂或仪器未注明生产商者，均为常规试剂或仪器。

本发明中蛋白表达水平与肝细胞肝癌患者的生存时间关系采用SPSS软件生存分析模块中的Kaplan-Meier法来分析，在附图中用OS(总生存期)、DFS(无病生存期)表示。

回顾性研究：切取大连医科大学附属第一医院肝胆外科74例肝细胞肝癌的癌组织及癌旁组织的石蜡样本，制备病理切片，用免疫组织化学法检测USP10蛋白的表达水平，并进行分析。

首先用10％福尔马林固定肝癌组织48h，分别用石蜡包埋、切HE染色，明辨肿瘤病理类型，再切取4μm/张白片，用于免疫组织化学检测。

上述切片65℃烘箱中烤片4h，接着二甲苯脱蜡15min×3次，然后依次在100％，100％，95％，80％，60％乙醇中，每级放置5min。后置于蒸馏水中浸洗3min×3次。之后将切片加入EDTA(PH＝9.0)缓冲液中，并于微波炉中中火修复30min。结束后在EDTA缓冲液自然冷却至室温，然后用TBS冲洗1min×3次。加入3％H₂O₂，室温10min以灭活内源性酶，TBS冲洗1min×3次。用5％山羊血清封闭液，室温封闭60min。向盒中滴加已经稀释150倍的USP10抗体(ab72486)置于湿盒中4℃过夜孵育。

次日取出湿盒恢复至室温，TBS冲洗1min×3次。之后滴加75μL抗兔/鼠HRP标记聚合物，置于37℃温箱中孵育30min，TBS冲洗1min×3次。滴加预制好的显色剂DAB工作液75μL，显色后蒸馏水洗涤。苏木素复染45s，然后蒸馏水冲洗。各级酒精(60-100％)脱水，每级5min。取出后置于二甲苯10min×2次。用封片胶封片、显微镜观察。

最后进行显微镜观察及评分。具体实施方案为：在400倍光学显微镜下进行读片，并随机取4个视野进行拍摄，然后应用Image J软件对切片中的阳性染色细胞数量进行计数，后使用组织化学评分法(H-scores)对切片进行USP10的定量评分。H-score＝Σpi(i+1)，式中pi表示视野下阳性细胞数量占切片中所有细胞数量的百分数；i代表着色强度(0：未着色；1：轻度黄染；2：黄染；3：重度黄染)，最后取4个摄片下的平均值。结果如图1所示。

在本发明的实施方案中，癌旁组织的评分高于104分时定义为USP10蛋白高表达，低于104分时定义为USP10蛋白低表达，

为进一步研究USP10的表达水平与临床病理参数及生存期的关系，根据随访资料，纳入统计分析的临床病理参数的指标有：性别、年龄、HBV感染史、肝硬化史、肿瘤数量、AFP水平、临床分期、肿瘤大小、血管侵犯；生存函数的指标有：总生存期(OS)，无病生存期(DFS)，结果如表1、图2所示。

从结果可以看出，USP10与肿瘤大小、血管侵犯和临床分期有统计学差异，即USP10低表达患者的平均肿瘤大小明显大于高表达患者，血管侵犯潜能明显高于高表达患者，另外，USP10低表达患者的术后OS及DFS均比高表达患者短。

USP10高表达组总生存期(OS)为：88.467(月)，低表达组(OS)为：37.200(月)；USP10高表达组无疾病进展生存期(DFS)为：79.333(月)，低表达组(DFS)为：25.333(月)，USP10在癌旁组织中高表达组生存期优于低表达组，这表明USP10可以作为判断肝细胞肝癌患者术后预后水平的分子标志物。

Claims

1.USP10蛋白的定量检测在原发性肝癌预后判断试剂盒中的应用。

2.一种用于原发性肝癌预后判断的试剂盒，包括USP10蛋白抗体。

3.根据权利要求2所述的原发性肝癌预后判断的试剂盒，其特征在于：还包括有免疫组化实验试剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于：所述免疫组化实验试剂是指二甲苯、乙醇、3％H₂O₂溶液、5％山羊血清封闭液、DAB显色试剂、苏木素和山羊抗兔/鼠HRP标记聚合物。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述蛋白抗体为兔USP10多克隆抗体。

6.根据权利要求2～5所述的任一所述试剂盒判断受试者原发性肝癌预后判断的方法，其特征在于：

使用所述的试剂盒在体外检测USP10蛋白在肝癌及癌旁组织中的表达量，包括如下步骤：

1)获自对象的新鲜肝癌及癌旁组织或福尔马林固定或石蜡包埋的肝癌及癌旁组织；

2)免疫组织化学法处理步骤1)中获得的组织；

3)组织化学评分法进行评分。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：高于120分时定义为USP10蛋白高表达，低于120分时定义为USP10蛋白低表达。