CN113774135B - 一组用于预测高级别浆液性卵巢癌预后的标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一组用于预测高级别浆液性卵巢癌预后的标志物及其应用。该标志物包括以下基因中的至少两种：ERCC4、POLR2D、ERCC2、DDB2、XPC、CCNH、RPA2。该标志物是通过COX生存分析和LASSO回归模型分析筛选出来的，利用该标志物中的相关基因构建用于预测高级别浆液性卵巢癌预后的生存模型，该模型能够对高级别浆液性卵巢癌患者进行准确的预后和分类，对于预测肿瘤进展或复发转移风险，预测肿瘤预后，指导肿瘤治疗方式，进而延长高级别浆液性卵巢癌患者的生存期具有重要的临床意义。

Description

一组用于预测高级别浆液性卵巢癌预后的标志物及其应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一组用于预测高级别浆液性卵巢癌预后的标志物及其应用。

背景技术

卵巢癌在女性常见恶性肿瘤中占2.4-6.5％，在女性生殖系统癌瘤中排第三位，发病率仅次于子宫颈癌和子宫体癌，主要的治疗方式包括手术切除、药物治疗和放射治疗，但总体的预后较差。

在全部卵巢癌死亡病例中，高级别浆液性卵巢癌占70-80％，由于缺乏有效的卵巢癌早期筛查方法，近90％的高级别浆液性卵巢癌患者初诊时即被诊断为III-IV期，而晚期高级别浆液性卵巢癌患者的10年生存率仅为15％。到目前为止，手术仍然是最重要的卵巢癌治疗方法，手术后的化疗、靶向治疗、放疗和免疫治疗都被用于提高卵巢癌的疗效。

卵巢癌的分期是影响卵巢癌患者预后和治疗策略的重要因素，而卵巢癌的预后结局是每一个患者都密切关注的重要临床问题。目前临床最常用的卵巢癌恶性肿瘤的分期依据是国际妇产科联盟(Federation of Gynecologists and Obstetrics,FIGO)修订的“手术病理分期”，但其无法对III期和IV期患者的预后进行有效的判读，进而导致不能提供准确的信息来预测卵巢癌患者的预后或者指导医生的治疗策略。现代医学已进入精准医疗和分子医学时代，单纯的手术病理分期太过于粗略，同时由于复杂的生物学过程和尚且未知的分子机制，FIGO分期方法无法判断同处于III期高级别浆液性卵巢癌患者的预后差异，也无法解释IV期患者预后优于III期患者的临床现象。因此，迫切需要寻找新的可靠的预后分子标志物来预测高级别浆液性卵巢癌预后和指导合理的治疗策略。

近年来，全基因组表达谱检测可以有效地为癌症患者的预后评估提供详细的信息。在乳腺癌的临床治疗中，早已使用21基因检测和70基因MammaPrint检测等多基因检测手段用于检测复发、转移和指导个性化治疗策略，能够为患者的预后评估和治疗选择提供一些有价值的信息。虽然高级别浆液性卵巢癌与基底细胞样乳腺癌具有很高的分子相似性，但是在高级别浆液性卵巢癌的治疗中，相应的多基因监测的临床应用是缺乏的，也没有可用于临床的分子评估系统。

DNA损伤反应和修复通路在卵巢癌的发生和发展中起着至关重要的调节作用。高级别浆液性卵巢癌大多伴随着与核苷酸切除修复途径密切相关的p53突变。核苷酸切除修复是由不同的蛋白质协同作用完成的，是清除由电离辐射和其它诱变剂引起的大型DNA损伤的主要途径。此外，核苷酸切除修复途径还可以修复铂类药物(如顺铂和卡铂)造成的损伤，这些药物是目前在卵巢癌治疗中应用最广泛的药物。由此可见，核苷酸切除修复途径对卵巢癌的发生、发展和治疗效果都起着至关重要的作用。然而，目前缺乏关于高级别浆液性卵巢癌的核苷酸切除修复途径相关基因的系统研究。

传统的治疗方法如满意的肿瘤细胞减灭术，铂类方案化疗以及对疾病的复发监测等均有一定的限制。而现有技术缺乏足够的生物标志物以便对高级别浆液性卵巢癌患者的预后做出预测，尤其是对高级别浆液性卵巢癌晚期的患者。因此，临床上急需寻找合适的生物标志物对高级别浆液性卵巢癌患者的预后做出准确的预测，以指导有效的治疗方式和延长患者的生存期。

发明内容

本发明提供了一组用于预测高级别浆液性卵巢癌预后的标志物及其应用，从分子层面上对高级别浆液性卵巢癌患者的预后进行预测，为靶向治疗提供依据。

根据本发明的一个方面，提供了一组用于预测高级别浆液性卵巢癌预后的标志物，该标志物包括以下基因中的至少两种：ERCC4、POLR2D、ERCC2、DDB2、XPC、CCNH、RPA2。

优选地，上述标志物包括POLR2D。POLR2D基因与mRNA合成相关，其表达量与高级别浆液性卵巢癌患者的预后情况相关。

优选地，上述标志物包括ERCC4、POLR2D、ERCC2、DDB2、XPC、CCNH、RPA2。

本发明提供的标志物中的基因均为核苷酸切除修复途径相关基因，核苷酸切除修复途径对卵巢癌的发生发展和治疗效果起着至关重要的作用。在高级别浆液性卵巢癌患者的卵巢组织中，上述标志物中的相关基因的表达与患者预后之间存在显著差异。与低表达者相比，ERCC4、ERCC2、XPC、CCNH、RPA2在高级别浆液性卵巢癌组织中高表达的患者预后更差，而POLR2D、DDB2高表达的患者有更好的预后。因此本发明提供的标志物可用于预测高级别浆液性卵巢癌预后和指导治疗方式。

根据本发明的第二个方面，提供一个用于预测高级别浆液性卵巢癌预后的生存模型，该生存模型的风险评分关系式为Risk score＝a*ERCC4+b*POLR2D+c*ERCC2+d*DDB2+e*XPC+f*CCNH+g*RPA2，其中，关系式中ERCC4、POLR2D、ERCC2、DDB2、XPC、CCNH、RPA2分别表示各基因在参试样本中的mRNA表达量，通过LASSO分析确定关系式中的系数a、b、c、d、e、f、g，Risk score表示风险评分。风险评分与患者的生存期相关，风险评分高的患者生存期短、预后差，风险评分低的患者生存期相对较长、预后相对较好。

优选地，上述生存模型的关系式中，a、c、e、f、g均大于0，b、d均小于0。

优选地，上述生存模型的关系式中，0.00141＜a＜0.141，-0.649＜b＜-0.00649，0.00268＜c＜0.268，-0.725＜d＜-0.00725，0.00862＜e＜0.862，0.00771＜f＜0.771，0.00511＜g＜0.511。

优选地，上述生存模型由以下步骤构建得到：

(1)从TCGA、CTEx和GEO数据库中获得相关数据；

(2)将TCGA和GTEx两个数据库进行合并，并筛选出TCGA、CTEx和GEO数据集中共同存在的核苷酸切除修复途径相关基因；

(3)检测步骤(2)中的核苷酸切除修复途径相关基因的mRNA表达水平，并对其进行共识聚类分析；

(4)利用单因素COX生存分析和LASSO-Cox回归模型对步骤(2)中的相关基因进行筛选和鉴定，筛选出上述标志物；

(5)利用步骤(4)得到的标志物构建用于预测高级别浆液性卵巢癌预后的生存模型。

根据本发明的第三个方面，提供一种用于预测高级别浆液性卵巢癌预后的基因芯片，该基因芯片包括固相载体和固定在固相载体的表面的基因探针，该基因探针能够通过分子杂交与上述标志物中的基因结合产生杂交信号。本方案提供的基因芯片能够精确地检测上述标志物中的基因的表达水平，以便对高级别浆液性卵巢患者的预后进行预测，有利于指导后期的治疗、延长患者的生存期。

优选地，固相载体选自玻璃板、尼龙膜、硝酸纤维素膜中的一种。

根据本发明的第四个方面，提供一种用于预测高级别浆液性卵巢癌预后的试剂盒，该试剂盒包括基因探针或特异性引物，该基因探针能够通过分子杂交与上述标志物中的基因结合产生杂交信号，该特异性引物能够通过PCR技术对上述标志物中的基因进行扩增。

由于缺乏有效的分子标志物以对高级别浆液性卵巢癌患者的预后做出预测，不利于采取有效的治疗手段干扰疾病进展以延长患者生命。本发明筛选出一组用于预测高级别浆液性卵巢癌预后的标志物，该标志物中的基因均为核苷酸切除修复途径相关基因，通过研究得出其与高级别浆液性卵巢癌患者预后之间的相关性，同时通过检测这一组标志物中的基因的mRNA表达水平，结合生存模型中的风险评分，对早期、甚至晚期的高级别浆液性卵巢癌患者在5年内生存状态进行准确的预后和分类，还可以对化疗反应良好、进行了满意或不满意减瘤手术的患者进行进一步分类，以便对高级别浆液性卵巢癌患者的预后进行正确的评估和有效及时地指导临床用药。对于高危患者可采取更积极的治疗策略和复发监测，并对相应的患者预后有更可靠的判断和解释。

综上所述，本发明所提供的用于预测高级别浆液性卵巢癌预后的标志物和生存模型对于预测肿瘤进展或复发转移风险，预测肿瘤预后，指导肿瘤治疗方式，进而延长高级别浆液性卵巢癌患者的生存期具有重要的临床意义。

附图说明

图1为本发明的技术流程图。

图2为本发明的共识聚类分析结果图。

图3为本发明利用LASSO回归模型鉴定出的最大效能的7个基因和相关系数结果图。

图4为本发明利用TCGA数据库中的326例高级别浆液性卵巢癌患者的临床数据及RNA-Seq转录组数据绘制的高低风险组患者的Risk score图。

图5为本发明利用TCGA数据库中的326例高级别浆液性卵巢癌患者的临床数据及RNA-Seq转录组数据绘制的高低风险组患者的K-M plot生存曲线。

图6为本发明建模组的ROC曲线。

图7为本发明高级别浆液性卵巢癌患者生存时间和生存状态的散点图。

图8为本发明利用GEO数据库中的961例高级别浆液性卵巢癌患者的临床数据及基因芯片的mRNA表达谱数据绘制的高低风险组患者的K-M plot生存曲线。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明提供的技术方案中的技术特征作进一步清楚、完整的描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1

一种用于预测高级别浆液性卵巢癌预后的标志物，其筛选和鉴定过程如图1所示，具体包括以下步骤：

(1)从数据库获得数据

在TCGA数据库(https://portal.gdc.cancer.gov/)中下载326例高级别浆液性卵巢癌患者的临床数据以及高级别浆液性卵巢癌组织的RNA-Seq转录组数据，作为建模组。TCGA数据库中高级别浆液性卵巢癌患者的病理参数如表1所示；

由于TCGA数据库中不包含正常卵巢组织或癌旁组织，因此通过UCSC Xena(https://xenabrowser.net/datapages)下载GTEx数据库中88例正常卵巢组织的RNA-Seq转录组数据，作为对照组；

在GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)中下载961例高级别浆液性卵巢癌患者的临床数据及其基因芯片的mRNA表达谱数据，作为验证组。

表1 TCGA数据库中高级别浆液性卵巢癌患者的病理参数

(2)利用程序语言R进行数据库的合并

利用R语言将TCGA和GTEx两个数据集的基因表达形式统一为log2(x+1)，再利用“limma”包对重复基因数据进行平均值处理并将两个数据集进行归一化后合并为TCGA-GTEx联合数据集。使用程序语言R筛选出在TCGA、GTEx和GEO数据集中共同存在的31个核苷酸切除修复途径相关基因并对转录组数据进行进一步标准化使其可比以进行分析。

(3)共识聚类分析

检测TCGA-GTEx联合数据集中高级别浆液性卵巢癌组织和正常卵巢组织中的31个核苷酸切除修复途径相关基因的表达水平，表征高级别浆液性卵巢癌组织与正常人卵巢组织存在显著的基因表达差异。再利用R语言的“ConsensusClusterPlus”包对31个核苷酸切除修复途径相关基因进行共识聚类分析，结果如图2所示，累计分布函数及其曲线下面积和共识聚类矩阵均代表核苷酸切除修复途径相关基因为能够稳定区分2簇不同的样本特征(即根据31个核苷酸切除修复途径相关基因表达水平可将高级别浆液性卵巢癌患者区分为预后显著不同的两个人群Cluster 1和Cluster 2)。主成分分析代表了聚类样本的合理性。其中，K-M plot生存图代表了以31个核苷酸切除修复途径相关基因聚类的2簇样本存在显著的生存差异，并对其进行进一步的分析。上述结果说明，通过基因表达特征可以对高级别浆液性卵巢患者的临床预后信息进行判断。

(4)单因素COX生存分析

以|HR|≠1且P<0.1为标准筛选31个核苷酸切除修复途径的相关基因中可能影响高级别浆液性卵巢癌患者预后的基因。

(5)LASSO Cox回归模型分析

将步骤(4)中单因素COX生存分析筛选出的潜在预后基因纳入LASSO Cox回归模型并根据线性模型的最小二乘估计最终鉴定出了最大效能的7个基因(即本发明用于预测高级别浆液性卵巢癌预后的标志物)，结果如图3所示。由图3可知，ERCC4、POLR2D、ERCC2、DDB2、XPC、CCNH、RPA2为鉴定出的最大效能的7个基因，并且ERCC4、POLR2D、ERCC2、DDB2、XPC、CCNH、RPA2的LASSO系数分别为0.0141、-0.0649、0.0268、-0.0725、0.0862、0.0771、0.0511。

实施例2

一个用于预测高级别浆液性卵巢癌预后的生存模型，其构建方法为：

以实施例1中的LASSO分析结果筛选出来的7个效能最大的核苷酸切除修复途径相关基因ERCC4、POLR2D、ERCC2、DDB2、XPC、CCNH、RPA2及相应的LASSO系数作为模型中影响预后的因子构建一个用于预测高级别浆液性卵巢癌预后的生存模型。高级别浆液性卵巢癌患者的预后情况是由上述基因的表达量与对应系数的乘积之和构成的风险评分Risk score来表征：

Risk Score＝0.0141*ERCC4-0.0649*POLR2D+0.0268*ERCC2-0.0725*DDB2+0.0862*XPC+0.0771*CCNH+0.0511*RPA2

其中，上述公式中的ERCC4、ERCC2、DDB2、XPC、RPA2、POLR2D和CCNH分别表示各基因在高级别浆液性卵巢癌患者的卵巢组织中的mRNA表达量。上述风险评分与患者的生存期相关，风险评分高的患者生存期短、预后差，风险评分低的患者生存期相对较长、预后相对较好。

实施例3

对实施例2中的生存模型的特异性和准确性进行验证，具体包括以下步骤：

(1)利用TCGA数据库中高级别浆液性卵巢癌患者的K-M plot生存曲线内部验证预后生存模型的准确性

根据实施例2中的Risk score公式，计算每个患者的Risk score值，绘制高低风险组患者的Risk score图，如图4所示，然后按照患者的Risk score值的大小，从低到高对患者进行排序，以所有患者的Risk score值的中位值为分割点，将患者分为高Risk score组和低Risk score组，绘制高低风险组患者的K-M plot生存曲线，如图5所示，并以Log-rank的检验方法对比高低风险组患者的生存时间是否存在差异，以Logrank P value<0.05为标准判定两组之间是否存在差异，以验证所构建的预后生存模型的准确性。由图5可知，高Risk score组患者的生存期短，预后情况比低Risk score组的患者差，证明Risk score(预后风险评分)确实与患者的生存期相关，根据Risk score值可对高级别浆液性卵巢癌患者的预后进行区分。

(2)利用ROC曲线验证预后生存模型的准确性和特异性

根据实施例2中的Risk score公式，计算每个患者的Risk score值，然后按照患者的Risk score值的大小，从低到高对患者进行排序，以所有患者Risk score值的中位值为分割点，将患者分为高Risk score组和低Risk score组，绘制ROC曲线，如图6所示。通过计算求得ROC曲线下面积为0.693，证明该模型在预测高级别浆液性卵巢癌患者预后的过程中存在较好的准确性和特异性。

(3)通过对比预后生存模型不同分组的高级别浆液性卵巢癌患者的生存时间和生存状态验证所构建的预后模型的准确性

根据实施例2中的Risk score公式，计算每个患者的Risk score值，然后按照患者的Risk score值的大小，从低到高对患者进行排序，以所有患者Risk score值的中位值为分割点，将患者分为高Risk score组和低Risk score组，以患者的Risk score值为横坐标，以患者的生存时间为纵坐标，绘制患者的生存时间和生存状态的散点图，如图7所示。通过对比高Risk score组和低Risk score组患者之间的生存时间和生存状态可知，高Riskscore组患者的生存时间显著短于低Risk score组，并且高Risk score组患者的死亡人数也显著多于低Risk score组，这些结果均与前面的结果一致，这表明该模型用于预测患者预后的准确性高。

(4)利用GEO数据集中的高级别浆液性卵巢癌患者的K-M plot生存曲线外部验证所构建的预后生存模型的准确性

根据实施例2中的Risk score公式，计算每个患者的Risk score值，然后按照患者的Risk score值的大小，从低到高对患者进行排序，以所有患者Risk score值的中位值为分割点，将患者分为高Risk score组和低Risk score组，绘制高低风险组患者的K-M plot生存曲线，如图8所示，并以Log-rank(Mantel-Cox)的检验方法对比高低风险组患者的生存时间是否存在差异，以Logrank P value<0.05为标准判定两组之间是否存在差异。由图8的结果可知，高Risk score组患者的生存时间显著短于低Risk score组，这表明该预后生存模型通过基因分子表达水平对高级别浆液性卵巢癌患者的预后具有准确的预测性。

注：除特别说明外，所有统计分析均用程序语言R进行。对连续变量和二个类别变量的组间差异分别进行学生t检验或单因素方差分析和卡方检验。所有统计检验均为双侧，P＜0.05被认为是具有统计学意义的。

以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，但这些修改或替换均在本发明的保护范围之内。

Claims (1)

1.一组用于预测高级别浆液性卵巢癌预后的标志物组合，其特征在于，所述标志物组合由以下全部基因组成：ERCC4、POLR2D、ERCC2、DDB2、XPC、CCNH和RPA2。