CN103499694A - 检测结直肠癌及其恶性程度的免疫组化试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种结直肠癌及其恶性程度的免疫组化诊断试剂盒，该试剂盒包含：内源性过氧化物酶阻断剂、非特异性结合位点阻断剂、一抗、二抗、酶、显色剂；其中一抗为人源抗S100A9单克隆抗体或鼠源抗S100A9单克隆抗体，二抗为生物素标记的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。通过该试剂盒可以方便快捷地检测样本结直肠病理组织表面S100A9抗原的表达水平，从而可为快速诊断结直肠癌提供帮助，尤其对待测结直肠癌病理组织样本的恶性程度评估提供帮助。

Description

检测结直肠癌及其恶性程度的免疫组化试剂盒
技术领域
本发明涉及结直肠肿瘤免疫诊断试剂盒，尤其涉及用于诊断结直肠肿瘤及判断其恶性程度的免疫组化试剂盒。
背景技术
 S100蛋白是由小分子量蛋白（10-14 kDa）组成的钙结合蛋白家族，因其在中性 pH 条件下能溶解于 100% 饱和度硫酸铵中而得名。研究发现，此类蛋白仅在脊柱动物中表达，目前已发现23种S100 蛋白家族成员。S100A9蛋白是S100 蛋白家族的重要成员，具有S100 蛋白家族特征性的保守EF 手型结构和4-螺旋环形，与Ca2+、Zn2+及Cu2+等不同金属离子结合发生结构变异，暴露与靶蛋白的结合位点进而通过与相应的效应靶蛋白相互作用参与系列反应。其主要在粒细胞、单核细胞、巨噬细胞等免疫细胞中高表达，通常与S100A8蛋白共表达形成异二聚体—S100A8/9钙卫蛋白，结合TLR4、RAGE、CD36和细胞外基质金属蛋白酶诱导因子（EMMPRIN）等受体后激活NF-κB、AP-1及其他转录因子，参与急慢性炎症反应、免疫调节、肿瘤生长、增殖及侵袭转等系列生物学效应。国内外目前虽有研究表明S100A9与肿瘤相关，但对于S100A9与特定类型肿瘤细胞发生发展的关系，以及其应用于特定类型肿瘤的诊断与治疗，尚缺少研究。
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）是消化道常见的恶性肿瘤，据2008年国际癌症机构（IARC）研究统计，世界范围内每年约有一百万人发生结直肠癌，全球结直肠癌死亡率占肿瘤总死亡率8%，肿瘤致死率排名第四，且我国结直肠癌病死率高达45.5%，而结直肠肿瘤的恶性程度与肿瘤致死率密切相关。因此，寻找一种对结直肠癌进行诊断并对其恶性程度进行判断的方法至关重要。
发明内容
本发明的目的在于提供一种结直肠癌诊断及恶性程度判断的S100A9免疫组化检测试剂盒，通过该试剂盒可以方便快捷地检测样本结直肠病理组织表面S100A9抗原的表达水平，从而可以为结直肠癌诊断及其恶性程度的判断提供帮助。
为达到上述发明目的，本发明提供的诊断试剂盒包含：内源性过氧化物酶阻断剂、非特异性结合位点阻断剂、一抗、二抗、酶、显色剂；其中一抗为人源抗S100A9 单克隆抗体或鼠源抗S100A9 单克隆抗体，二抗为生物素标记的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。
本发明中，常规各种用于免疫组化试验的内源性过氧化物酶阻断剂、非特异性结合位点阻断剂、酶、显色剂均可用于本发明试验盒，但作为最佳选择，内源性过氧化物酶阻断剂为3wt% H2O2；非特异性结合位点阻断剂为动物非免疫血清，其中优选非免疫羊血清；酶优选链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶；显色剂优选DAB显色剂，包括：DAB缓冲液（20×），DAB底物（20×），DAB色原（20×）。
更进一步地，作为本发明试剂盒的优化，还可以在试剂盒中设置用于参照的比对色卡，以方便对待测样本的染色结果进行比对，或者设置对待测样本切片中染色细胞百分数进行计算的计数器，以便于对样本染色结果做快速分析。
 发明人通过研究发现：S100A9在结直肠癌中的表达水平明显高于正常结直肠组织，并且，S100A9蛋白的表达水平在不同分化程度结直肠癌组织中表达强度存在显著差别，高、中、低分化结直肠癌组织中，S100A9蛋白表达的强阳性率呈明显递增趋势，即分化程度越低，强阳性表达水平越高，分化程度越高，表达水平越低。因此，检测受试者结直肠组织表面S100A9的表达水平，可以作为结直肠癌的恶性程度诊断的分子标志物。因此，发明人提供上述免疫组化试剂盒，利用该试剂盒，通过检测结直肠病理组织表面S100A9抗原的表达，能快速准确地判断结直肠癌恶性程度的临床诊断提供帮助。试剂盒中设置比对色卡和染色细胞计数器，能方便对染色结果做快速准确地分析，提高试剂盒的易用性和方便性。
附图说明
图1：NCBI GEO DataSets系列GSE37364中探针203535_at所对应的S100A9在38例正常结直肠组织和27例结直肠癌组织的RNA表达结果图。
图2：免疫组化检测正常结直肠组织及高、低分化结直肠癌组织中S100A9蛋白的表达结果图A-E图均为显微镜下放大200倍的组织结构图，其中：
A：正常结直肠组织阴性对照（未加S100A9一抗）；
B：结直肠癌组织阴性对照（未加S100A9一抗）；
C：正常结直肠组织；
D：高分化结直肠癌组织；
E：低分化结直肠癌组织。
图3：S100A9蛋白在正常结直肠组织及癌组织中表达的IHC结果比较。
图4：S100A9蛋白在不同分化程度的结直肠癌组织中表达的IHC结果比较。
具体实施方式
实施例1 结直肠癌及其恶性程序诊断试剂盒的制备
发明人利用NCBI 高通量基因表达数据库GEO DataSets(gene expression omnibus)，对系列GSE37364中27例结直肠癌组织和38例正常结直肠组织进行S100A9 RNA水平芯片数据分析，结果发现S100A9在结直肠癌中的表达水平明显高于正常结直肠组织，p<0.0001，差异具有统计学意义，详见附图1。因此研究表明，S100A9参与了结直肠癌复杂的演进过程，可作为结直肠癌诊断的标志蛋白。
发明人进一步研究表明： S100A9蛋白的表达水平在高、低分化结直肠癌组织中的表达强度上存在显著差别。高、低分化结直肠癌组织中S100A9蛋白的表达强阳性率呈明显递增趋势，即结直肠癌组织分化程度越低，强阳性表达水平越高。这一结果进一步表明：S100A9可作为结直肠癌恶性程度判断的分子标志物。
在上述研究结果的基础上，发明人提供一种结直肠癌及其恶性程序诊断试剂盒，该试剂盒包含：内源性过氧化物酶阻断剂、非特异性结合位点阻断剂、一抗、二抗、酶、显色剂；其中一抗为人源抗S100A9 单克隆抗体或鼠源抗S100A9 单克隆抗体，二抗为生物素标记的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。
作为优选，所述内源性过氧化物酶阻断剂为3wt% H2O2，非特异性结合位点阻断剂选为动物非免疫血清，其中优选非免疫羊血清；酶为链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶；显色剂为DAB显色剂，包括： DAB缓冲液（20×），DAB底物（20×），DAB色原（20×）。
作为试剂盒更进一步地改进，在试剂盒中设置用于参照的比对色卡，分别为淡黄色、黄色和棕褐色。并设置一个扫描计数器，该计数器包括一个能对切片的显微图片进行拍照或扫描的单元，并包含一个对所扫描到的图片进行细胞计数的分析单元。用该计数器，能对待所测样本切片中染色细胞百分数进行自动计算，以便于对样本染色结果做快速分析。
实施例2 用制备的试剂盒对待测样本进行检测
（1）烤片脱蜡：待染色的组织切片放入60℃烤箱内烘烤60-90分钟，视切片质量而定，后迅速放入二甲苯（I、II）中浸泡10分钟×2次进行脱蜡；
（2）水化：切片按顺序置于以下梯度酒精中：100%乙醇中浸泡5分钟--90%乙醇中浸泡5分钟--75%乙醇中浸泡5分钟--50%乙醇中浸泡5分钟-- 蒸馏水中浸泡3分钟--PBS洗涤3分钟×3次；
（3）抗原修复：0.01M pH6.0的柠檬酸抗原修复液在微波炉中煮沸，切片放入其中，乳胶手套封住容器口，继续在沸水中加热15-20分钟，使温度保持在100℃，完毕容器自然冷却至室温，不要将切片从修复液中取出，后再用1×PBS缓冲液摇床上漂洗3分钟×3次；
（4）阻断内源性过氧化物酶：将切片置于孵育盒中，用蜡笔将组织圈起来，以免滴加后的试剂扩散，吸水纸将切片上的水稍吸去，不要碰到组织，内源性过氧化物酶阻断剂溶液3% H2O2  100μl覆盖组织后室温孵育30分钟，以清除内源性过氧化物酶，然后用1×PBS缓冲液摇床上漂洗3分钟×3次；
（5）非特异性结合位点血清封闭：吸水纸将切片上的水稍吸去，滴加100μl动物非免疫羊血清，封闭30分钟，轻轻甩去上清，不漂洗；
（6）一抗孵育：在孵育盒中，滴加1×PBS稀释后的鼠源抗S100A9 单克隆抗体溶液稀释成1：500的浓度，每张切片约滴加100μl均匀覆盖组织， 4℃过夜（>12小时），然后1×PBS缓冲液摇床上3分钟×3次漂洗，阴性对照采用 PBS代替一抗； 
（7）二抗孵育：吸水纸将切片上的水稍吸去，滴加100μl生物素标记的羊抗鼠IgG，室温15分钟，1×PBS缓冲液摇床上3分钟×3次进行漂洗；
（8）吸水纸将切片上的水稍吸去，每张切片滴加100μl链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，室温孵育15分钟，再用1×PBS缓冲液摇床上3分钟×3次进行漂洗；
（9）显色及终止：吸水纸将切片上的水稍吸去，勿干片，滴加DAB显色液，DAB缓冲液（20×）、DAB底物（20×）、DAB色原（20×）各50μl滴加至850μl双蒸水中配制成1mL新鲜显示液，有效使用时间为30分钟进行显色，显微镜下控制显色时间，染色均为50秒，完毕自来水中终止反应；
（10）复染：吸水纸将切片上的水稍吸去，滴加苏木素复染15秒，迅速用自来水冲洗终止反应，自来水返蓝10分钟； 
（11）脱水透明：晾干后依次入50wt%乙醇、75 wt%乙醇、90 wt%乙醇、100 wt%乙醇各2分钟快速脱水。再入二甲苯中2分钟进行透明；
（12）封片：待切片自然晾干后，滴加中性树胶及盖玻片封片。
 实施例 3  试剂盒的临床验证
用上述实施例1制备的试剂盒，依据实施例2的检测步骤与方法，检测了54例正常和104例结直肠癌大体标本中S100A9蛋白的表达。所有组织标本在手术后经中南大学湘雅二医院病理科进行病理证实；104例结直肠肿瘤标本中14例为高分化癌， 33例低分化癌。
依据蛋白在细胞内的定位，分别以蛋白表达阳性信号强度和阳性表达细胞数两种观测标准进行综合评分。判断阳性表达结果标准：（1）参照比对色卡，根据阳性染色强度判断：细胞无染色记0分；细胞染成淡黄色，记1分；黄色，记2分；棕褐色，记3分。（2）根据阳性细胞表达数记分：阳性细胞数＜5%，记0分；5%~25%，记1分；26%~50%，记2分；51%~75%，记3分，>75%，记4分。最终计分结果为上述两种判断标准得分相加。结果评估：0分为阴性表达（-）；1、2分为弱阳性表达（+）；3~5分为中等阳性（+）；6、7分为强阳性表达（+）。Fisher确切概率法分析组织中S100A9免疫组化的结果表明，S100A9蛋白在100%（104/104）的结直肠癌组织和58.62%（34/58）的正常结直肠组织中表达阳性，见附图3和附图2，即在结直肠癌组织中S100A9蛋白表达水平明显高于正常结直肠组织（p=0.00）。Kruskal-Wallis H检验统计分析发现，S100A9蛋白的表达水平在高、低分化结直肠癌组织中的表达强度上有显著差别，X  2 =4.72，P=0.03，差异有统计学意义。高、低分化癌强阳性率分别为28.57%和63.64%，呈明显递增趋势，即分化程度越低，强阳性表达水平越高，见附图4及附图2。
上述临床验证的结果进一步表明：S100A9可以作为结直肠癌诊断和恶性程度判断的分子标志物。运用本发明提供的试剂盒，检测人体结直肠组织表面S100A9的表达水平，根据S100A9表达水平可以方便快捷地为结直肠癌诊断提供帮助，并对肿瘤的恶性程度判断提供帮助。
应理解，在阅读了本发明的上述公开内容之后，本领域技术人员可以对本发明做各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请的权利要求书所限定的范围。

Claims (6)

1.检测结直肠癌及其恶性程度的免疫组化试剂盒，包含：内源性过氧化物酶阻断剂、非特异性结合位点阻断剂、一抗、二抗、酶、显色剂，其特征在于：所述一抗为人源抗S100A9 单克隆抗体或鼠源抗S100A9 单克隆抗体，二抗为生物素标记的羊抗鼠IgG或兔抗鼠IgG。
2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于：所述内源性过氧化物酶阻断剂为3wt% H2O2，非特异性结合位点阻断剂为动物非免疫血清，酶为链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶，显色剂为DAB显色剂，由DAB缓冲液、DAB底物、DAB色原组成。
3. 如权利要求2所述的试剂盒，其特征在于：所述非特异性结合位点阻断剂为非免疫羊血清。
4. 根据权利要求1-3所述之一的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中设置用于染色参照的比对色卡，所述比对色卡有三张，分别为淡黄色、黄色和棕褐色。
5.根据权利要求1-3所述之一的试剂盒，其特征在于：试剂盒中设置对待测样本切片中染色细胞百分数进行自动计算的计数器。
6.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：试剂盒中设置对待测样本切片中染色细胞百分数进行自动计算的计数器。
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