CN102137939A - 不依赖vegf的肿瘤的诊断和治疗 - Google Patents

Abstract

提供鉴定或诊断不依赖VEGF的肿瘤的方法和治疗不依赖VEGF的肿瘤的方法。

Description

不依赖VEGF的肿瘤的诊断和治疗

相关申请

该申请是在37CFR 1.53(b)(1)下提交的非临时申请，其在35USC 119(e)下要求2008年8月29日提交的临时申请号61/093,161的优先权，将其内容结合在本文作为参考。

发明领域

本发明涉及肿瘤生长和肿瘤类型的领域。本发明涉及肿瘤的抑制剂和诊断标志，并且涉及其用于诊断和治疗癌症和肿瘤生长的应用。

发明背景

恶性肿瘤(癌症)是美国仅次于心脏病的主要死亡原因(见，例如Boring等，CA Cancel J.Clin.(加拿大癌症临床杂志)43：7(1993))。癌症的特征在于来自正常组织的异常、或赘生性细胞的数量增加(所述细胞增殖形成肿瘤块)，这些赘生性肿瘤细胞对邻近组织的侵入，和产生最终通过血液或淋巴系统扩散到局部淋巴结和通过被称为转移的过程扩散到远端位点的恶性细胞。在癌性状态中，细胞在其中正常细胞不会生长的条件下增殖。癌症的表现形式多种多样，特征在于不同程度的侵袭力和侵占性。

根据癌症类型，患者一般可获得一些治疗选择，包括化学疗法、辐射和基于抗体的药物。用于预测不同治疗方案的临床效果的诊断方法将极大地有利于这些患者的临床管理。一些研究已经研究了基因表达与特定癌症类型的鉴定之间的关联，例如通过突变-特异性测定法，微阵列分析，qPCR等。这些方法可以用于对患者表现的癌症进行鉴定和分类。

目前充分了解的是，血管发生涉及多种疾病的发病机理。这些包括实体瘤和转移瘤、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、晶体后纤维增生症(retrolental fibroplasias)、血管瘤(hemangiomas)、慢性炎症、眼内新血管疾病如增殖性视网膜病(proliferative retinopathies)，例如糖尿病性视网膜病(diabetic retinopathy)，年龄相关的黄斑变性(age-related macular degeneration，AMD)，新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)，移植的角膜组织和其它组织的免疫排斥，类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)和银屑病(psoriasis)。Folkman等，生物化学杂志(J.Biol. Chem.)，267：10931-10934(1992)；Klagsbrun等，生理学年评(Annu.Rev.Physiol).53：217-239(1991)；和Garner A.，″血管疾病(Vascular diseases)″，在：眼病的病理生物学(Pathobiology of Ocular Disease)中.A Dynamic Approach，Garner A.，Klintworth GK，编辑，第2版(Marcel Dekker，NY，1994)，第1625-1710页。

在肿瘤生长的情形中，血管发生看来对于由过度增生向瘤形成的转变和给肿瘤的生长和转移提供营养是关键的。Folkman等，自然(Nature)339：58(1989)。与正常细胞相比，新血管形成使肿瘤细胞获得生长益处和增殖自主性。肿瘤开始时通常是单一的异常细胞，其可以由于与可及的毛细血管床的距离而仅增殖为几个立方毫米的大小，并且其可以“以静止状态”存在，而在较长的时间内不进一步生长和扩散。一些肿瘤细胞接着转化为生血管表型以激活内皮细胞，所述内皮细胞增殖并且成熟为新的毛细血管。这些新形成的血管不仅允许原发性肿瘤的持续生长，还允许转移性肿瘤细胞的扩散和再建群(recolonization)。因此，已经观察到在肿瘤切片的微血管密度和乳腺癌以及数种其它肿瘤患者的存活之间的关联。Weidner等，新英格兰医学杂志(N.Engl.J.Med)324：1-6(1991)；Horak等柳叶刀(Lancet)340：1120-1124(1992)；Macchiarini等，柳叶刀(Lancet)340：145-146(1992)。控制血管生成开关的精确机制尚未被充分了解，但是认为肿瘤块的新血管形成由多种血管发生刺激剂和抑制剂之间的净平衡导致(Folkman，1995，(自然医学)Nat Med 1(1)：27-31)。

识别在病理条件下作为血管发生的主要调节剂的血管内皮细胞生长因子(VEGF)促进了阻断VEGF活性的许多尝试。VEGF是一种血管发生的最佳表征和最有效的正向调节剂。见，例如Ferrara，N.& Kerbel，R.S.血管 发生作为治疗剂靶标(Angiogenesis as a therapeutic target).自然(Nature)438：967-74(2005)。除了在血管发生和血管生成中作为生血管因子之外，VEGF还作为多效生长因子在其它生理过程中显示了多种生物学效应，如内皮细胞存活，血管渗透性和血管舒张，单核细胞趋化作用和钙流入。Ferrara和Davis-Smyth(1997)内分泌学综述(Endocrine Rev).18：4-25。而且，研究已经报道了VEGF对于数种非内皮细胞类型，如视网膜色素上皮细胞、胰管细胞和许旺细胞的促有丝分裂作用。见，例如，Guerrin等.细胞生理学杂志(J.Cell Physiol.)164：385-394(1995)；Oberg-Welsh等.分子细胞内分泌学(Mol.Cell.Endocrinol).126：125-132(1997)；和，Sondell等.神经科学杂志(J.Neurosci.)19：5731-5740(1999)。

存在许多试图阻断VEGF活性的尝试。还提议将抑制性抗-VEGF受体抗体、可溶性受体构建体、反义策略、针对VEGF的RNA适配体和低分子量的VEGF受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂用于干扰VEGF信号传导。见，例如，Siemeister等.癌症转移综述(Cancer Metastasis Rev).17：241-248(1998)。已经在裸鼠中证明抗-VEGF中和抗体抑制多种人肿瘤细胞系的生长(Kim等.自然(Nature)362：841-844(1993)；Warren等.J.Clin.Invest.95：1789-1797(1995)；

等.癌症研究(Cancer Res).56：4032-4039(1996)；和Melnyk等.癌症研究(Cancer Res).56：921-924(1996))并且还在缺血性视网膜疾病模型中抑制眼内血管发生(Adamis等.Arch.Ophthalmol.114：66-71(1996))。事实上，一种人源化的抗-VEGF抗体，贝伐珠单抗(AVASTIN

，Genentech，South San Francisco，CA)是首个被设计用于抑制血管发生的U.S.FDA-批准的治疗方法。见，例如，Ferrara等.，天然药物开发综述(Nature Reviews Drug Discovery)，3：391-400(2004)。其适应于与静脉内基于5-氟尿嘧啶-的化学疗法组合用于患有转移结肠直肠癌的患者的一线或二线治疗；与卡铂和紫杉醇化学疗法组合用于患有不能切除的、局部晚期、复发或转移性非鳞状细胞癌、非小细胞肺癌(NSCLC)的一线治疗；和与紫杉醇化学疗法组合，用于治疗对于其转移性HER2-阴性乳腺癌没有接受化学疗法的患者的应用。

然而，治疗化合物干扰肿瘤生长的长期能力有时受到药物抗性发展的限制。对于各种细胞毒性化合物的一些抗性机制主要在单细胞肿瘤模型中得到鉴定和功能性表征。见，例如，Longley，D.B.& Johnston，P.G.药物抗 性的分子机制(Molecular mechanisms of drug resistance).病理学杂志(JPathol)205：275-92(2005)。此外，宿主基质-肿瘤细胞相互作用可能涉及药物抗性表型。基质细胞分泌多种促-生血管因子并且不倾向于相同的遗传不稳定性，增加突变率，与肿瘤细胞一样(Kerbel，R.S.抑制肿瘤血管发生作 为阻止获得对抗癌治疗剂的抗性的策略(Inhibition of tumor angiogenesis as  astrategy tocircumventacquiredresistancetoanti-cancertherapeuticagents).生物测定法(Bioessays)13：31-6(1991).Ferrara&Kerbel和Hazlehurst等，在Ferrara，N.& Kerbel，R.S.血管发生作为治疗靶标(Angiogenesis as a  therapeutic target).自然（Nature)438：967-74(2005)；和，Hazlehurst，L.A.，Landowski，T.H.&Dalton，W.S.肿瘤微环境在调节对药物和细胞死亡的生 理调节剂的重新的抗性中的作用(Role of the tumor microenvironment in  mediating de novo resistance to drugs and physiological mediators of cell  death).致癌基因(Oncogene)22：7396-402(2003)进行综述。在临床前模型中，用人源化的单克隆抗体贝伐珠单抗(AVASTIN

，Genentech，South San Francisco，CA)或贝伐珠单抗的鼠前体(A4.6.1(在3/29/91保藏的产生A4.6.1的杂交瘤细胞系，ATCC HB-10709))阻断VEGF信号传导在测试的大多数异种移植模型中显著抑制肿瘤生长并且减少肿瘤血管发生(Gerber&Ferrara在Gerber，H.P.& Ferrara，N.贝伐珠单抗在 临床前模型中作为单一疗法或与细胞毒性疗法组合的药理学和药物代谢 动力学(Pharmacology and pharmacodynamics of bevacizumab as  monotherapy or in combination with cytotoxic therapy in preclinical studies).癌症研究(Cancer Res)65：671-80(2005)中综述)。当治疗在肿瘤生长的早期阶段开始时，单一药剂抗-VEGF治疗的药理学效应是最显著的。如果治疗延迟到肿瘤已经充分建立才开始，抑制效应典型地是暂时的，并且肿瘤最终会发展抗性。见，例如，Klement，G.等.组合节律(metronomic)化学疗法 和抗-VEGFR-2抗体在多药物抗性人乳腺癌异种移植中治疗指数的差异 (Differences in therapeutic indexes of combination metronomic chemotherapy  and an anti-VEGFR-2 antibody in multidrug-resistant human breast cancer  xenografts.)临床癌症研究(Clin Cancer Res)8：221-32(2002)。关于抗-VEGF治疗的所述抗性潜在的细胞和分子事件是复杂的。见，例如，Casanovas，O.，Hicklin，D.J.，Bergers，G.& Hanahan，D.在晚期郎格罕氏岛肿瘤中通过逃 避VEGF信号传导的抗生血管靶向发展的药物抗性(Drug resistance by  evasion of antiangiogenic targeting of VEGF signaling in late-stage pancreatic  islet tumors).癌症细胞(Cancer Cell)8：299-309(2005)；和，Kerbel，R.S.等.获得对抗-生血管药物的抗性的可能机制：涉及使用组合疗法途径(Possible  mechanisms of acquired resistance to anti-angiogenic drugs：implications for  the use of combination therapy approaches)。癌症转移综述(Cancer Metastasis Rev)20：79-86(2001)。

因此，开发可以用于鉴定和治疗对抗VEGF治疗具有抗性的受试者的基于分子的诊断方法是高度有利的。本发明解决了这些和其它需要，在回顾了下面的公开内容后这是显而易见的。

发明概述

本发明的方法可以用于多种设定，包括，例如鉴定、诊断和治疗不依赖VEGF的肿瘤。在某些实施方案中，本发明提供用于鉴定不依赖VEGF的肿瘤的标志组(marker sets)。

本文提供在受试者中检测不依赖VEGF的肿瘤的方法。例如，方法包括确定一种或多种基因在获自受试者的测试样品中的表达水平，其中与参照样品比较在测试样品中的一种或多种基因的表达水平的变化指示在受试者中存在不依赖VEGF的肿瘤，其中至少一种基因选自由S100A8，S100A9，Tie-1，Tie-2，PDGFC，和HGF组成的组。

在某些实施方案中，表达水平是mRNA表达水平。在某些实施方案中，mRNA表达水平使用微阵列或qRT-PCR进行测量。在某些实施方案中，mRNA表达水平的变化是增加。在一个实施方案中，具有增加的mRNA表达水平的一个基因是S100A8或S100A9。在某些实施方案中，mRNA表达水平的改变是减少。在一个实施方案中，具有减少的mRNA表达水平的一个基因是PDGFC、Tie-1或Tie-2。在某些实施方案中，具有减少的mRNA表达水平的一个基因是Tie-1或Tie-2，并且所述方法还包括确定第二基因在测试样品中的mRNA表达水平，其中所述第二基因是CD31，CD34，VEGFR1，或VEGFR2。在某些实施方案中，CD31，CD34，VEGFR1或VEGFR2在测试样品中的mRNA表达水平与参照样品比较被减少。

在某些实施方案中，表达水平是蛋白表达水平。在某些实施方案中。蛋白表达水平使用免疫测定法进行测量。在某些实施方案中，所述免疫测定法是ELISA。在某些实施方案中，蛋白表达水平的变化是增加。在一个实施方案中，具有增加的蛋白表达水平的一个基因是HGF。

在某些实施方案中，检测不依赖VEGF的肿瘤的方法包括确定获自受试者的测试样品中的两种以上基因的表达水平，其中与参照样品比较测试样品中两种以上基因的表达水平的变化指示在受试者中存在不依赖VEGF的肿瘤，其中所述至少两种基因选自由S100A8，S100A9，CD31，Tie-1，Tie-2，IL-1β，PlGF，PDGFC，和HGF组成的组中。在某些实施方案中，检测不依赖VEGF的肿瘤的方法包括确定在获自受试者的测试样品中的五种以上基因的表达水平，其中与参照样品比较在测试样品中5种以上基因的表达水平变化指示在受试者中存在不依赖VEGF的肿瘤，其中至少5种基因选自由S100A8，S100A9，Tie-1，Tie-2，CD31，CD34，VEGFR1，VEGFR2，IL-1β，PlGF，PDGFC，和HGF组成的组中。

在某些实施方案中，表达水平是mRNA表达水平。在某些实施方案中，mRNA表达水平的变化是增加。在一个实施方案中，具有增加的mRNA表达水平的一个基因是S100A8，S100A9，PlGF或IL-1β。在某些实施方案中，mRNA表达水平的变化是减少。在一个实施方案中，具有减少的mRNA表达水平的基因中的一个、二个、三个、四个、五个、六个或七个是PDGFC，Tie-1，Tie-2，CD31，CD34，VEGFR1和/或VEGFR2。

在某些实施方案中，所述表达水平是蛋白表达水平。在某些实施方案中，蛋白表达水平的变化是增加。在一个实施方案中，具有增加的蛋白表达水平的一个基因是IL-1β，PlGF或HGF。在另一个实施方案中，具有增加的蛋白表达水平的两个基因是IL-1β和PlGF。

在某些实施方案中，上述方法还包括治疗具有不依赖VEGF的肿瘤的受试者，所述方法包括向所述受试者施用有效量的下列中的任一种：IL-1β拮抗剂、IL-6拮抗剂、LIF拮抗剂、PlGF拮抗剂、S100A8拮抗剂、S100A9拮抗剂，HGF拮抗剂或c-Met拮抗剂。在一个实施方案中，将有效量的c-Met拮抗剂施用于具有不依赖VEGF的肿瘤的受试者。在一个实施方案中，将有效量的HGF拮抗剂施用于具有不依赖VEGF的肿瘤的受试者。在某些实施方案中，上述方法还包括治疗具有不依赖VEGF的肿瘤的受试者，所述方法包括向受试者施用组合第二药剂的有效量的VEGF拮抗剂，其中所述第二药剂是下列中的任一种：IL-1β拮抗剂，IL-6拮抗剂，LIF拮抗剂，PlGF拮抗剂，S100A8拮抗剂，S100A9拮抗剂，HGF拮抗剂或c-Met拮抗剂。在一个实施方案中，所述第二药剂是c-Met拮抗剂。在一个实施方案中，所述第二药剂是HGF拮抗剂。在某些实施方案中，所述VEGF拮抗剂是抗-VEGF抗体。在某些实施方案中，所述抗-VEGF抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，所述抗-VEGF抗体是贝伐珠单抗。在某些实施方案中，c-Met拮抗剂是抗-c-Met抗体。在某些实施方案中，HGF拮抗剂是抗-HGF抗体。在某些实施方案中，方法还包括向受试者施用有效量的化疗剂。

本文还提供治疗受试者中不依赖VEGF的肿瘤的方法。在某些实施方案中，方法包括治疗受试者中不依赖VEGF的肿瘤，所述方法包括向受试者施用有效量的下列中的任一种：IL-1β拮抗剂，IL-6拮抗剂，LIF拮抗剂，PlGF拮抗剂，S100A8拮抗剂，S100A9拮抗剂，HGF拮抗剂或c-Met拮抗剂。在一个实施方案中，将有效量的c-Met拮抗剂施用于具有不依赖VEGF的肿瘤的受试者。在一个实施方案中，将有效量的HGF拮抗剂施用于具有不依赖VEGF的肿瘤的受试者。在另一个实施方案中，将有效量的IL-1β拮抗剂施用于具有不依赖VEGF的肿瘤的受试者。在某些实施方案中，方法包括治疗受试者中不依赖VEGF的肿瘤，所述方法包括向受试者施用组合第二药剂的有效量的VEGF拮抗剂，其中所述第二药剂是下列中的任一种：IL-1β拮抗剂，IL-6拮抗剂，LIF拮抗剂，PlGF拮抗剂，S100A8拮抗剂，S100A9拮抗剂，HGF拮抗剂或c-Met拮抗剂。在一个实施方案中，所述第二药剂是c-Met拮抗剂。在某些实施方案中，所述第二药剂是HGF拮抗剂。在某些实施方案中，所述第二药剂是IL-1β拮抗剂。在一个实施方案中，IL-1β拮抗剂是抗-IL-1β抗体。在另一个实施方案中，c-Met拮抗剂是抗-c-Met抗体。在另一个实施方案中，HGF拮抗剂是抗-HGF抗体。在某些实施方案中，所述抗-VEGF抗体是贝伐珠单抗。在某些实施方案中，方法还包括向具有不依赖VEGF的肿瘤的受试者施用有效量的化疗剂。

在某些实施方案中，受试者是人。在某些实施方案中，受试者被诊断患有癌症。在某些实施方案中，受试者被诊断具有不依赖VEGF的肿瘤。在一个实施方案中，癌症选自由下列各项组成的组中：非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer)、肾细胞癌(renal cell carcinoma)、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、乳腺癌(breast cancer)和结肠直肠癌(colorectal cancer)。

在某些实施方案中，本发明提供预测受试者中的肿瘤是否将对不同于或除了抗-生血管疗法之外的抗-癌疗法有效反应的方法，所述方法包括确定来自受试者的测试样品是否包括这样的细胞，所述细胞在测试样品中表达的一种或多种基因的表达水平比其在参照样品中表达所述基因的水平更高，其中至少一种基因选自由下列各项组成的组中：S100A8，S100A9，IL-1β，PlGF和HGF。在某些实施方案中，所述方法还包括向受试者施用有效量的IL-1β拮抗剂，PlGF拮抗剂，S100A8拮抗剂，S100A9拮抗剂，HGF拮抗剂，c-Met拮抗剂，LIF拮抗剂或其任何组合。在某些实施方案中，本发明提供预测受试者中的肿瘤是否将对不同于或除了抗-生血管疗法之外的抗-癌疗法有效反应的方法，所述方法包括确定来自受试者的测试样品中是否包括这样的细胞，所述细胞在测试样品中表达的一种或多种基因的水平比其在参照样品中的表达水平低，其中至少一种基因选自由下列各项组成的组中：Tie-1，Tie-2，CD31，CD34，PDGFC，VEGFR1和VEGFR2。在某些实施方案中，表达水平是mRNA表达水平。在某些实施方案中，所述表达水平是蛋白表达水平。在某些实施方案中，抗-生血管疗法包括VEGF拮抗剂。在某些实施方案中，VEGF拮抗剂是抗-VEGF抗体。在某些实施方案中，抗-VEGF抗体是贝伐珠单抗。

在某些实施方案中，本发明提供预测癌症患者对于抗-VEGF疗法的反应性的方法，所述方法包括在获自癌症患者的测试样品中确定上述一种或多种基因的表达水平，其中与参照样品比较，所述一种或多种基因在测试样品中的表达水平的显著变化指示癌症患者对抗-VEGF疗法减少的反应性或完全缺乏反应性。

在某些实施方案中，本发明提供用于监测癌症患者中抗-VEGF疗法的功效的方法，所述方法包括在抗-VEGF疗法的进程中确定上述一种或多种基因在获自癌症患者的测试样品中的表达水平，其中与参照样品比较，在测试样品中一种或多种基因的表达水平的显著变化指示抗-VEGF疗法的减少的功效或完全缺乏功效。

在某些实施方案中，本发明提供鉴定对抗-VEGF疗法具有抗性的癌症患者亚群体(subpopulation)的方法，所述方法包括在获自每个癌症患者的测试样品中确定如上所述的一种或多种基因的表达水平，其中与参照样品比较，一种或多种基因在测试样品中的表达水平的显著变化指示癌症患者属于对抗-VEGF疗法具有抗性的亚群体。

本文所述的任何实施方案或其任何组合应用于本文所述的本发明的任一种和所有的方法。

附图简述

图1组A-B举例说明乳腺发育。(A)来自8周龄未交配动物(virgin)VEGF+/+和(B)epiVEGF-/-乳腺的代表性乳腺完整载片。棒代表1000μm。

图2组A-D举例说明肿瘤发展和进展。(A)在PyMT.VEGF+/+(n＝24)和PyMT.epiVEGF-/-(n＝20)小鼠中，第一个可触知的肿瘤的时间。(B)累积肿瘤计数/来自8-16周龄的PyMT.VEGF+/+(n＝20)和PyMT.epiVEGF-/-(n＝15)小鼠的小鼠。(C)在PyMT.VEGF+/+(n＝20)和PyMT.epiVEGF-/-(n＝15)小鼠中的平均累积肿瘤体积。(D)在16周龄的小鼠的平均肿瘤重量。

*指示组之间的统计学显著(P＜0.05)差异。

图3组A-F举例说明肿瘤血管密度。(A)来自PyMT.VEGF+/+小鼠和(B)PyMT.epiVEGF-/-小鼠，(C)用对照IgG(GP120)处理的PyMT.VEGF+/+小鼠或(D)用抗-VEGF(G6.31mAb)处理的PyMT.VEGF+/+小鼠的肿瘤血管网络的代表性最大强度投影图象(E)在PyMT.VEGF+/+肿瘤和PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中血管体积相对于血管直径。(F)PyMT.VEGF+/+肿瘤中对比在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中的相对于血管直径的％血管体积(该半径的血管体积/总的血管体积)。

图4组A-C举例说明肿瘤微血管血流。(A)相对微血管血液流速。将数据表示为平均值±SEM。*表示在组之间的显著(P＜0.05)差异。对比增强的超声灌注分析的代表性图象，描述了在大小-匹配的(B)PyMT.VEGF+/+肿瘤和(C)PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中的微血管血流。

图5组A-H举例说明VEGFR1和VEGFR2mRNA在肿瘤中的定位。(A)原位杂交显示VEGFR1mRNA在PyMT.VEGF+/+肿瘤中与血管内皮强相关。(B)VEGFR1mRNA在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中还与血管内皮相关(箭头)，尽管信号通常比在PyMT.VEGF+/+肿瘤中更弱。用苏木精和曙红对来自(C)PyMT.VEGF+/+肿瘤和(D)PyMT.epiVEGF-/-肿瘤的平行图象的载玻片进行染色。(E)原位杂交显示VEGFR2mRNA与分离的细胞簇相关，所述分离的细胞簇与PyMT.VEGF+/+肿瘤中的血管内皮细胞一致。(F)VEGFR2 mRNA与PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中沿血管内皮的点簇(punctate clusters)相关(箭头)，尽管信号通常比其在PyMT.VEGF+/+肿瘤中更弱。用苏木精和曙红对来自(G)PyMT.VEGF+/+肿瘤和(H)PyMT.epiVEGF-/-肿瘤的平行图象的载玻片进行染色。取具有苏木精和曙红染色的载玻片的暗视野(A，B，E，F)或亮视野(C，D，G， H)强度的平行图象。比例尺是100μm。有意义的对照载玻片缺乏显著的信号(数据未显示)。

图6组A-B举例说明通过Taqman分析的VEGFR1和VEGFR2 mRNA在肿瘤中的相对水平。在PyMT.VEGF+/+和PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中相对(A)VEGFR1和(B)VEGFR2转录体水平。将数据表示为相对于PyMT.VEGF+/+的倍数变化(n＝9个肿瘤/组，在组之间具有绝对水平的显著差异(P＜0.05))。

图7组A-E举例说明在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤裂解物中减少的VEGF水平。(A)在来自PyMT.VEGF+/+或PyMT.epiVEGF-/-肿瘤的裂解物中的VEGF蛋白水平。(B-E)在下列各项中进行的关于VEGF的原位杂交(使用关于外显子3的核糖核酸探针检测缺失)：(B)PyMT.VEGF+/+肿瘤，其中在紧邻坏死区域的有生存力，但是可能是低氧的肿瘤组织中存在过度表达(箭头)或(C)PyMT.epiVEGF-/-肿瘤，其中表达主要在坏死肿瘤周围的低氧区域中缺乏。取具有苏木精和曙红染色的载玻片的暗视野(B，C)或亮视野(D，E)亮度的平行图象。比例尺是100μm。有义对照载玻片缺乏显著的信号(数据未显示)。

图8组A-B举例说明抗-VEGF治疗对携带PyMT.VEGF+/+肿瘤或PyMT.epiVEGF-/-肿瘤的小鼠的作用。每周用5mg/kg抗-VEGF(B204.1)或同种型对照抗体(IgG)处理小鼠2次并且(A)确定每只小鼠的肿瘤的平均累积数量或(B)平均累积肿瘤负担。将数据表示为平均值±SEM(n＝10-15只动物/组)。*表示在用B20或对照抗体处理的PyMT.VEGF+/+小鼠之间的显著差异(P＜0.05)。

图9组A-E举例说明在肿瘤中生血管和炎性相对mRNA水平。在PyMT.VEGF+/+对比PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中的鼠(A)PlGF，(B)IL-1β，(C)S100A8，(D)S100A9和(E)PDGFC mRNA表达水平的定量RT-PCR分析。将数据表示为相对于PyMT.VEGF+/+的倍数变化(n＝5-9肿瘤/组)，在组之间的绝对水平中具有显著差异(P＜0.05)。

图10组A-C举例说明在肿瘤中生血管和炎性因子的蛋白水平。在PyMT.VEGF+/+肿瘤中对比在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中(A)PlGF(B)IL-1β(C)HGF蛋白水平的ELISA或Luminex分析。将数据表示为平均值±SEM.。

*表示组之间的显著差异(P＜0.05)。

图11组A-D举例说明在肿瘤中CD31，CD34，Tie-1和Tie-2的相对mRNA表达水平。在PyMT.VEGF+/+和PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中(A)CD31，(B)CD34，(C)Tie-1和(D)Tie-2转录体水平。将数据表示为相对于PyMT.VEGF+/+的倍数变化(n＝5-7只肿瘤/组)，在组之间的绝对水平上具有显著差异(P＜0.05)。

图12：来自PyMT.epiVEGF-/-肿瘤的原代上皮细胞与来自PyMT.epiVEGF+/+肿瘤的原代上皮细胞比较，具有增加的体外对HGF的迁移反应。误差条表示SEM。

发明详述

本文所述或参考的技术和方法通常是充分了解的，并且由本领域技术人员使用常规方法一般应用，如例如，在下述参考文献中所述广泛使用的方法：Sambrook等.，分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning：ALaboratory Manual)，第3版(2001)冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.在分子生物学中目前使用的方法(CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY)(F.M.Ausubel，等.编辑，(2003))；酶学方法(Methods IN ENZYMOLOGY)系列(学术出版社公司)：PCR 2：实用方法(PCR 2：A PRACTICAL APPROACH)(M.J.MacPherson，B.D.Hames和G.R.Taylor编辑(1995))，Harlow和Lane，编辑(1988)抗体，实验室手册，和动物细胞培养(ANTIBODIES，A LABORATORY MANUAL，and ANIMAL CELL CULTURE)(R.I.Freshney，编辑(1987))；寡核苷酸合成(Oligonucleotide Synthesis)(M.J.Gait，编辑，1984)；分子生物学方法(Methods in Molecular Biology)，Humana出版社；细胞生物学：实验室笔记(Cell Biology：A Laboratory Notebook)(J.E.Cellis，编辑，1998)学术出版社；动物细胞培养(Animal Cell Culture)(R.I.Freshney)，编辑，1987)；细胞和组织培养介绍(Introduction to Cell and Tissue Culture)(J.P. Mather和P.E.Roberts，1998)Plenum出版社；细胞和组织培养：实验室方法(Cell and Tissue Culture：Laboratory Procedures)(A.Doyle，J.B.Griffiths，和D.G.Newell，编辑，1993-8)J.Wiley和Sons；实验室免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)(D.M.Weir和C.C.Blackwell，编辑)；哺乳动物细胞基因转移载体(Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells)(J.M.Miller和M.P.Calos，编辑，1987)；PCR：聚合酶链式反应(PCR：The Polymerase Chain Reaction)，(Mullis等.，编辑，1994)；免疫学目前使用的方法(Current Protocols in Immunology)(J.E.Coligan等.，编辑，1991)；分子生物学中的简便方法(Short Protocols in Molecular Biology)(Wiley和Sons，1999)；免疫生物学(Immunobiology)(C.A.Janeway和P.Travers，1997)；抗体(Antibodies)(P.Finch，1997)；抗体：实用方法(Antibodies：A Practical Approach)(D.Catty.，编辑，IRL出版社，1988-1989)；单克隆抗体：实用方法(Monoclonal Antibodies：A Practical Approach(P.Shepherd和C.Dean，编辑，牛津大学出版社，2000)；使用抗体：实验室手册(Using Antibodies：A Laboratory Manual)(E.Harlow和D.Lane(冷泉港实验室出版社，1999)；抗体(The Antibodies)(M.Zanetti和J.D.Capra，编辑，Harwood学术出版社，1995)；和癌症：肿瘤学的原理和实践(Cancer：Principles and Practice of Oncology)(V.T.DeVita等.，编辑，J.B.Lippincott公司，1993)。

除非另有说明，本文所用的技术和科技术语具有与本发明所属领域技术人员通常所知相同的含义。Singleton等.，微生物和分子生物学字典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)，第2版，J.Wiley&Sons(纽约，N.Y.1994)，和March，高级有机化学反应、机制和结构(Advanced Organic Chemistry Reactions，Mechanisms and Structure)，第4版，John Wiley&Sons(New York，N.Y.1992)，向技术人员提供了本申请所用的许多术语的一般指导。在本文提及的所有参考文献，包括专利申请和出版物，完整结合在本文作为参考。

定义

出于解释本说明书的目的，应用下面的定义，并且只要适合，以单数使用的术语也包括复数形式，并且反之亦然。要理解的是，本文所用的术语仅是出于描述特定实施方案的目的，并不意欲有任何限制。当在下面提出的任何定义与作为参考结合在本文中的任何文献冲突时，以下面的定义为准。

“测试样品”或“样品”在本文指从目标受试者获得或得到的组合物，其包含意欲例如基于物理、生化、化学和/或生理特征表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。在一个实施方案中，该定义包括血液和生物起源的其它液体样品，和组织样品如活组织检查样本或组织培养物或来自其中的细胞。组织样品的来源可以是来自新鲜、冷冻和/或保存的器官或组织样品的实体组织或活组织检查样品或抽吸物；血液或任何血液成分；体液；和来自受试者妊娠或发育的任何时候的细胞，或血浆。

在另一个实施方案中，该定义包括在获得它们后已经以任何方式进行处理的生物学样品，所述方式如通过用试剂处理，溶解，或富集某些成分，如蛋白或多核苷酸，或包埋在半固体或固体基质中用于切片目的。在本文中目的，组织样品的“切片”意为组织样品的单一部分或块，例如自组织样品切下的组织或细胞的薄切片。

样品包括，但不限于，原代或培养的细胞或细胞系，细胞上清液，细胞裂解物，血小板，血清，血浆，玻璃体液(vitreous fluid)，淋巴液，滑液，滤泡液，精液，羊膜液，乳，全血，尿液，脑脊液，口水(saliva)，痰(sputum)，泪液，汗液，粘液，肿瘤裂解物，和组织培养基，以及组织提取物如匀化的组织，肿瘤组织，和细胞提取物。

在一个实施方案中，所述测试样品是临床样品。在另一个实施方案中，所述测试样品用在诊断测定中。在一些实施方案中，所述测试样品获自原代或转移肿瘤。组织活组织检查通常用于获得肿瘤组织的代表块。备选地，肿瘤细胞可以以已知或被认为包含目的肿瘤细胞的组织或流体形式间接获得。例如，肺癌病灶的生物学样品可以通过切除术、支气管镜检、细针抽吸活检(fine needle aspiration)、支气管刷检(bronchial brushings)获得，或来自痰、胸膜液或血液。

在一个实施方案中，测试样品获自抗生血管疗法之前的受试者或患者。在另一个实施方案中，测试样品获自在VEGF拮抗剂疗法之前的受试者或患者。在另一个实施方案中，测试样品获自抗-VEGF抗体疗法之前的受试者或患者。在某个实施方案中，测试样品在抗生血管、VEGF拮抗剂或抗-VEGF抗体疗法过程中或之后获得。在某些实施方案中，测试样品在癌症已经转移后获得。

“参照样品”用于本文时，指用于比较目的的参照的任何样品、标准或水平。在一个实施方案中，参照样品获自相同受试者或患者的身体的健康和/或非患病部分。在另一个实施方案中，参照样品获自相同受试者或患者的身体的未处理的组织和/或细胞。

在某些实施方案中，参照样品包含对VEGF拮抗剂疗法有反应的肿瘤。在某些实施方案中，VEGF疗法包含抗-VEGF抗体。在某些实施方案中，抗-VEGF抗体是贝伐珠单抗。在某些实施方案中，参照样品包含肿瘤，其是不依赖VEGF的肿瘤。

在某些实施方案中，参照样品是在与获得测试样品的时间不同的一个或多个时间点获得的来自相同受试者或患者的单一样品或组合的多个样品。例如，参照样品在比获得测试样品时更早的时间点从相同的受试者或患者获得。如果参照样品在开始诊断癌症时获得，并且测试样品随后在癌症已经转移时获得，所述参照样品可以是有用的。

在一个实施方案中，参照样品获自非-受试者或患者的个体的身体的健康和/或非患病部分。在另一个实施方案中，参照样品获自非-受试者或患者的个体的身体未处理的组织和/或细胞部分。

在某些实施方案中，参照样品包括获自非-受试者或患者的一个或多个个体，在上述术语“样品”下定义的所有类型的生物学样品。在某些实施方案中，参照样品获自非-受试者或患者的患有癌症的一个或多个个体。

在某些实施方案中，参照样品是来自非-受试者或患者的一个或多个健康个体的合并的多个样品。在某些实施方案中，参照样品是来自非-受试者或患者的一个或多个患有癌症的个体的合并的多个样品。在某些实施方案中，参照样品是来自非-受试者或患者的一个或多个个体的正常组织的合并的RNA样品。在某些实施方案中，参照样品是来自非-受试者或患者的一个或多个患有癌症的个体肿瘤组织的合并的RNA样品。

“不依赖VEGF的肿瘤”，用于本文时，指在包括至少一种VEGF拮抗剂的癌症治疗过程中完全不反应，或失去反应或显示减少的反应的癌症、癌性细胞或肿瘤。在某些实施方案中，不依赖VEGF的肿瘤是对抗-VEGF抗体疗法有抗性的肿瘤。在一个实施方案中，所述抗-VEGF抗体是贝伐珠单抗。在某些实施方案中，不依赖VEGF的肿瘤是不可能对包含至少一种VEGF拮抗剂的癌症疗法有反应的肿瘤。在某些实施方案中，对癌症疗法的反应性是患者对如本文定义的癌症疗法的反应性。

基因或生物标志的表达水平/量可以基于本领域已知的任何适合的标准定性和/或定量地确定，包括但不限于mRNA，cDNA，蛋白，蛋白质片段和/或基因拷贝数。在某些实施方案中，与在第二样品中的表达/量比较，在第一样品中的基因或生物标志的表达/量增加。在某些实施方案中，与在第二样品中的表达/量比较，在第一样品中的基因或生物标志的表达/量减少。在某些实施方案中，所述第二样品是参照样品。

在某些实施方案中，术语“增加”指与参照样品比较，通过标准本领域已知方法如本文提及的那些检测的在蛋白水平或核酸水平上的5％，10％，15％，20％，25％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％以上的总的增加。在某些实施方案中，术语增加指基因或生物标志的表达水平/量在样品中的增加，其中增加是参照样品中各个基因或生物标志的表达水平/量的至少约1.25X，1.5X，1.75X，2X，3X，4X，5X，6X，7X，8X，9X，10X，25X，50X，75X，或100X。

在某些实施方案中，术语“减少”在本文指与参照样品比较，通过标准的本领域已知方法如本文所述的那些检测的，在蛋白或核酸水平上的5％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，96％，97％，98％，99％以上的总的减少。在某些实施方案中，术语减少指样品中基因或生物标志的表达水平/量的减少，其中减少是参照样品中各个基因或生物标志的表达水平/量的至少约0.9X，0.8X，0.7X，0.6X，0.5X，0.4X，0.3X，0.2X，0.1X，0.05X，或0.01X。

用于确定基因的表达水平/量的另外的公开内容在本文中本发明的方法下描述。

“检测”包括任何检测方式，包括直接或间接检测。

术语“标记”当用于本文时，指直接或间接与试剂如核酸探针或抗体缀合或融合并且有利于检测与其缀合或融合的试剂的化合物或组合物。所述标记本身可以是可检测的(例如放射性同位素标记或荧光标记)，或在酶促标记的情形中，可以催化可检测的底物化合物或组合物的化学变化。

在某些实施方案中，所谓“相关(correlate)”或“相关(correlating)”意味着以任何方式比较第一分析或流程的性能和/或结果与第二分析或流程的性能和/或结果。例如，可以使用第一分析或流程的结果进行第二流程和/或可以使用第一分析或流程的结果来确定是否应该进行第二分析或流程。关于基因表达分析或流程的实施方案，可以使用基因表达分析或流程的结果来确定是否应该进行具体的治疗方案。

术语“生物标志”用于本文时一般指，这样的分子，其包括，基因、蛋白、碳水化合物结构或糖脂，所述分子在哺乳动物组织或细胞中或在其上的表达可以通过标准方法(或本文公开的方法)检测，并且是对哺乳动物细胞或组织对基于抑制血管发生的治疗方案的敏感性的预测、诊断和/或预后，所述基于抑制血管发生的治疗方案，例如抗-血管发生药剂如VEGF-特异性抑制剂。

“小分子”在本文被定义为具有低于约500道尔顿的分子量。

“多核苷酸”或“核酸”可以在本文互换使用，指任何长度的核苷酸的聚合物，并包括DNA和RNA。所述核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、修饰的核苷酸或碱基，和/或它们的类似物，或可以通过DNA或RNA聚合酶或通过合成反应结合到聚合物中的任何底物。多核苷酸可以包括修饰的核苷酸，如甲基化的核苷酸和它们的类似物。

“寡核苷酸，”用于本文时，一般指短的、一般为单链的，一般为合成的多核苷酸，其一般，但不是必需地少于约200个核苷酸的长度。术语“寡核苷酸”和“多核苷酸”不相互排斥。上面关于多核苷酸的描述等同地并且充分地可应用于寡核苷酸。

“分离的”核酸分子是这样的核酸分子，其从至少一种污染核酸分子中鉴定和分离，核酸分子与所述污染核酸分子一般在多肽核酸的天然来源中缔合。分离的核酸分子不同于其中其以天然发现的形式或设置。因此，分离的核酸分子与存在于天然细胞中的核酸分子区分开来。然而，分离的核酸分子包括包含在正常表达多肽的细胞中的核酸分子，其中例如，核酸分子以不同于天然细胞的染色体定位定位在染色体上。

“引物”通常为短的单链多核苷酸，一般具有游离的3′-OH基团，其通过与靶序列杂交结合于可能存在于目的样品中的靶标，并且随后促进与靶标互补的多核苷酸的聚合。

术语“持家基因”指编码其活性对于维持细胞功能是必要的蛋白的一组基因。这些基因典型地在所有的细胞类型中类似地表达。

术语“阵列”或“微阵列”，用于本文时，指可杂交的阵列元件，优选地多核苷酸探针(例如，寡核苷酸)在基底上的有序排列。基底可以是固体基底，如玻璃载玻片，或半固体基底，如硝化纤维素膜。核苷酸序列可以是DNA、RNA或其任何变换。

“天然序列”多肽包含与来自自然的多肽具有相同的氨基酸序列的多肽。因此，天然序列多肽可以具有来自任何哺乳动物的天然存在的多肽的氨基酸序列。所述天然序列多肽可以从自然分离或可以通过重组或合成方式产生。术语“天然序列”多肽具体地包括多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如，细胞外结构域序列)，天然存在的变体形式(例如，可变剪接形式)和多肽的天然存在的等位基因变体。

“分离的”多肽或“分离的”抗体指已经鉴定且与其天然环境的成分分离和/或从其回收的多肽或抗体。多肽的天然环境的污染性成分指将会干扰其诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中，将多肽纯化至(1)根据Lowry法的测定，多肽重量超过95％或重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然多肽的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。

“多肽链”指其中其每个结构域通过肽键(不同于非共价相互作用或二硫键)与其它结构域相连的多肽。

多肽“变体”指与相应的天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物学活性多肽。此类变体包括例如其中在多肽的N末端和/或C末端添加或删除一个或多个氨基酸(天然存在氨基酸和/或非天然存在氨基酸)残基的多肽。通常，变体将会与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性，或至少约90％氨基酸序列同一性，或至少约95％或更多氨基酸序列同一性。变体还包括天然序列的多肽片段(例如亚序列、截短物等)，典型地是有生物学活性的。

术语“蛋白质变体”在用于本文时指上文所述变体和/或在天然蛋白质序列中包含一个或多个氨基酸突变的蛋白质。任选的是，所述一个或多个氨基酸突变包括氨基酸置换。用于本发明的蛋白质及其变体可通过本领域众所周知的多种方法来制备。蛋白质的氨基酸序列变体可通过蛋白质DNA中的突变来制备。此类变体包括例如，蛋白质氨基酸序列内的残基缺失、插入或置换。可以进行缺失、插入和置换的任何组合以获得具有期望活性的最终构建体。在编码变体的DNA中进行的突变绝不能将序列置于读码框之外，而且优选不会产生能产生二级mRNA结构的互补区。EP 75，444A。

术语“抗体”以最广义使用，具体地涵盖单克隆抗体(包括全长的或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段(见下文)，只要它们展现出期望的生物学活性。

除非另有说明，表述“多价抗体”贯穿本说明书用于指包含三个或更多抗原结合位点的抗体。多价抗体典型地被改造成具有三个或更多抗原结合位点，而且一般不是天然序列IgM或IgA抗体。

“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，一般包括完整抗体的抗原结合位点，并因此保留了与抗原结合的能力。此定义所涵盖的抗体片段的实例包括：(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1结构域；(ii)Fab′片段，其是在CH1结构域的C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1结构域；(iv)Fd′片段，其具有VH和CH1结构域及CH1结构域C-末端的一个或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，其具有抗体单臂的VL和VH结构域；(vi)dAb片段(Ward等，自然(Nature)341：544-546(1989))，其由VH结构域组成；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab′)₂片段，即包含通过铰链区的二硫桥键(disulphide bridge)相连的两个Fab′片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如单链Fv；scFv)(Bird等，科学(Science)242：423-426(1988)和Huston等，PNAS(USA)85：5879-5883(1988))；(x)“双抗体”，其具有两个抗原结合位点，包含在同一条多肽链中相连的重链可变结构域(VH)和轻链可变结构域(VL)(参见例如EP404,097；WO 93/11161；和Hollinger等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：6444-6448(1993))；(xi)“线性抗体”，其包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata等，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)和美国专利5,641,870)。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的，除了可以以极小量存在的可能突变(例如天然存在突变)外。因此，修饰语“单克隆”表明抗体不是不同抗体混合物的特征。单克隆抗体是针对单一抗原高度特异性的。在某些实施方案中，单克隆抗体典型地包括包含结合靶标的多肽序列的抗体，其中靶标结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶标结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择方法可以是从众多克隆(诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合)中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶标结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶标的亲和性、将靶标结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶标结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型地包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。除它们的特异性之外，单克隆抗体制备物的优点在于它们典型地未受到其它免疫球蛋白的污染。

修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler和Milstein，自然(Nature)256：495-97(1975)；Hongo等，杂交瘤(Hybridoma)，14(3)：253-260(1995)；Harlow等，抗体：实验室手册(Antibodies：A Laboratory Manual)，冷泉港实验室出版社，第2版.1988；Hammerling等，于：单克隆抗体和T-细胞杂交瘤(Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas)，563-681，Elsevier，N.Y.，1981)、重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson等，自然(Nature)352：624-628(1991)；Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：581-597(1991)；Sidhu等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)338(2)：299-310(2004)；Lee等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)284(1-2)：119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO1991/10741；Jakobovits等，美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)90：2551(1993)；Jakobovits等，自然(Nature)362：255-258(1993)；Bruggemann等，Year in Immuno.7：33(1993)；美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；Marks等，生物/技术(Bio/Technology)10：779-783(1992)；Lonberg等，自然(Nature)368：856-859(1994)；Morrison，自然(Nature)368：812-813(1994)；Fishwild等，自然生物技术(Nature Biotechnol.)14：845-851(1996)；Neuberger，自然生物技术(Nature Biotechnol.)14：826(1996)；及Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。

单克隆抗体在本文中具体地包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567和Morrison等，美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)USA 81：6851-6855(1984))。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指这样的人免疫球蛋白(受体抗体)，其中受体的高变区残基用具有期望特异性、亲和性和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类动物)的高变区残基替换。在有些情况中，将人免疫球蛋白的构架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有发现的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含基本上全部的至少一个、典型地两个可变结构域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，典型地是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones等，自然(Nature)321：522-525(1986)；Riechmann等，自然(Nature)332：323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还可参见例如Vaswani和Hamilton，Ann.Allergy，Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle和Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)；及美国专利号6,982,321和7,087,409。还可参见van Dijk和van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.，5：368-74(2001)。人抗体可以如下制备，即将抗原施用于转基因动物，其经修饰而应答抗原激发生成此类抗体，但是其内源基因座已经失去能力，例如经免疫的异种移植小鼠(xenomice)(参见例如美国专利号6,075,181和6,150,584，关于XENOMOUSE^TM技术)。还可参见例如Li等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)，103：3557-3562(2006)，关于经人B细胞杂交瘤技术产生的人抗体。

“人抗体”指这样的抗体，其具有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术产生。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成。在一个实施方案中，人抗体选自噬菌体文库，其中该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan等，自然生物技术(Nature Biotechnology)14：309-314(1996)；Sheets等，PNAS(USA)95：6157-6162(1998)；Hoogenboom和Winter，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)227：381(1991)；Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：581(1991))。人抗体还可通过将人免疫球蛋白基因座引入转基因动物来产生，所述转基因动物例如是其中内源免疫球蛋白基因已经部分或完全灭活的小鼠。在受到激发时，观察到人抗体产生，它在所有方面与在人中看到的极其相似，包括基因重排、装配和抗体所有组成成分。这种方法记载于例如美国专利号5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，及以下科学出版物中：Marks等，生物/技术(Bio/Technology)10：779-783(1992)；Lonberg等，自然(Nature)368：856-859(1994)；Morrison，自然(Nature)368：812-13(1994)；Fishwild等，自然生物技术(Nature Biotechnology)14：845-51(1996)；Neuberger，自然生物技术(Nature Biotechnology)14：826(1996)；Lonberg和Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。或者，人抗体可通过产生针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞的永生化来制备(此类B淋巴细胞可从个体回收，或者可在体外免疫)。参见例如Cole等，单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner等，免疫学杂志(J.Immunol.)147(1)：86-95(1991)；及美国专利号5,750,373。

术语“可变的”指可变结构域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变结构域。它集中于轻链和重链可变结构域中称作高变区的三个区段。可变结构域中更加高度保守的部分被称作构架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版，Public Health Service，国家健康研究所(National Institute of Health)，Bethesda，MD.(1991))。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞毒性中的参与。

术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。例如，术语高变区指抗体可变结构域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精细特异性中发挥独特作用。参见例如Xu等 免疫性(Immunity)13：37-45(2000)；Johnson 和Wu 于：分子生物学中的方法(Methods in Molecular Biology)248：1-25(Lo，编辑，Human出版社，Totowa，NJ，2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在骆驼科动物抗体(camelid antibody)在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman等自然(Nature)363：446-448(1993)；Sheriff等自然结构生物学(Nature Struct.Biol.)3：733-736(1996)。

本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补性决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版.Public Health Service，国家健康研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia和Lesk分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196：901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR与Chothia结构环之间的折衷，而且由Oxford Molecular的AbM抗体建模软件使用。“接触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。

HVR可包括如下“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变结构域残基是依照Kabat等，见上文编号的。

“构架区”或“FR”残基指除本文中所定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。

术语“依照Kabat的可变结构域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat等，见上文中的用于抗体重链可变结构域或轻链可变结构域编辑的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变结构域FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变结构域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。

贯穿本说明书和权利要求书，Kabat编号系统一般在提及可变结构域中的残基(大约是轻链残基1-107和重链残基1-113)时使用(例如Kabat等，免疫目的序列(Sequences of Immunological Interest).第5版.公众健康服务(Public Health Service)，国家健康研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，Md.(1991))。“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabat等，免疫目的蛋白序列(Sequences of Proteins of Immunological Interest)，第5版.公众健康服务(Public Health Service)，国家健康研究所(National Institutes of Health)，Bethesda，MD(1991)中报道的EU索引，明确收入本文作为参考)。除非本文中另有说明，提及抗体可变结构域中的残基编号指根据Kabat编号系统的残基编号方式。除非本文中另有说明，提及抗体恒定结构域中的残基编号指根据EU编号系统的残基编号方式(例如参见美国临时申请号60/640,323，EU编号方式的图)。

根据其重链恒定结构域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG₁(包括非A和A同种异型)、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定结构域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的，一般性记载于例如Abbas等，细胞和分子免疫学(Cellular and Mol.Immunology)，第4版.(W.B.Saunders，Co.，2000)。抗体可以是抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价结合而形成的更大融合分子的一部分。

根据其恒定结构域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)中的一种。

术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区，其可以是通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体生成的。Fc区可以是天然序列Fc区或变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为Fc区自大约Cys226位置或大约Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。Fc区的C-末端赖氨酸(依照EU编号系统的残基447)可以例如在生产或纯化抗体的过程中去除，或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程改造而去除。因而，完整抗体的组合物可包括所有K447残基都被去除的抗体群、无一K447残基被去除的抗体群、以及具有有和无K447残基的抗体混合物的抗体群。免疫球蛋白的Fc区一般包含两个恒定结构域，即CH2结构域和CH3结构域，任选包含CH4结构域。

除非本文另有说明，免疫球蛋白重链的残基编号方式是如Kabat等，见上文中的EU索引的编号方式。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号方式。

“Fc区链”在本文中指Fc区两条多肽链之一。

人IgG Fc区的“CH2结构域”(也称为“Cg2”结构域)通常自约第231位氨基酸残基延伸至约第340位氨基酸残基。CH2结构域的独特之处在于它没有与另一结构域紧密配对。而是，有两个N-连接的分支的碳水化合物链介于完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。推测碳水化合物可能提供结构域-结构域配对的替代物且有助于稳定CH2结构域。Burton，分子免疫学(Molec.Immunol.)22：161-206(1985)。CH2结构域在本文中可以是天然序列CH2结构域或变异CH2结构域。

“CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C端的一段残基(即自IgG的约第341位氨基酸残基至约第447位氨基酸残基)。CH3区在本文中可以是天然序列CH3结构域或变异CH3结构域(例如在其一条链中具有引入的“突出”(protroberance)而在其另一条链中具有相应引入的“空腔”(cavity)的CH3结构域；参见美国专利号5,821,333，明确收入本文作为参考)。此类变异CH3结构域可用于生成本文所述多特异性(例如双特异性)抗体。

“铰链区”通常定义为自人IgG1的约Glu216或约Cys226至约Pro230的区段(Burton，分子免疫学(Molec.Immunol.)22：161-206(1985))。其它IgG同种型的铰链区可以通过将第一个和最后一个形成重链间S-S键的半胱氨酸残基置于相同位置而与IgG1序列对比。铰链区在本文中可以是天然序列铰链区或变异铰链区。变异铰链区的两条多肽链通常每条多肽链保留至少一个半胱氨酸残基，使得变异铰链区的两条多肽链可在两条链之间形成二硫键。本文中优选的铰链区是天然序列人铰链区，例如天然序列人IgG1铰链区。

“功能性Fc区”具有天然序列Fc区的至少一种“效应子功能”。例示性的“效应子功能”包括Clq结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应子功能一般要求Fc区与结合域(例如抗体可变结构域)结合，而且可使用本领域已知的用于评估此类抗体效应子功能的多种测定法来评估。

“天然序列Fc区”包含与自然界中发现的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)、天然序列人IgG2 Fc区、天然序列人IgG3 Fc区、及天然序列人IgG4 Fc区，及其天然存在变体。

“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。在某些实施方案中，变异Fc区具有与天然序列Fc区或与母体多肽的Fc区相比至少一处氨基酸置换，例如在天然序列Fc区中或在母体多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸置换，优选约1处至约5处氨基酸置换，例如在天然序列Fc区中或在母体多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸置换，优选约1处至约5处氨基酸替代。典型的是，变异Fc区在本文中将与天然序列Fc区和/或母体多肽的Fc区例如具有至少约80％序列同一性，或至少约90％序列同一性，或至少约95％或更多序列同一性。

抗体“效应子功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应子功能的实例包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞即NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch和Kinet，免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利号5,500,362或5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。备选地/另外地，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes等，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。

“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应子功能的白细胞。在某些实施方案中，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞，一般优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源(例如从血液或PBMC)分离，如本文所述。

“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。在有些实施方案中，FcR是天然人FcR。在有些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括那些受体的等位基因变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见例如，免疫学年评(Annu.Rev.Immunol).15：203-234(1997))。FcR的综述参见例如Ravetch和Kinet，免疫学年评(Annu.Rev.Immunol.)9：457-492(1991)；Capel等，免疫方法(Immunomethods)4：25-34(1994)；及de Haas等，实验室临床医学杂志(J.Lab.Clin.Med.126)：330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。

术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer等，免疫学杂志(J.Immunol.)117：587(1976)和Kim等，免疫学杂志(J.Immunol.)24：249(1994))并调节免疫球蛋白的体内稳态。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie和Ward.，今日免疫学(Immunol.Today)18(12)：592-598(1997)；Ghetie等，自然生物技术(Nature Biotechnology)，15(7)：637-640(1997)；Hinton等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)279(8)：6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton等))。

可测定人FcRn高亲和性结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染人细胞系中，或者在施用了具有变异Fc区的多肽的灵长类动物中。WO00/42072(Presta)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。还可参见例如Shields等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)9(2)：6591-6604(2001)。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(Clq)结合抗体(适宜亚类的)起始的，该抗体已结合至其关联抗原。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro等，免疫方法杂志(J.Immunol.Methods)202：163(1996)中所记载的。具有更改的Fc区氨基酸序列(具有变异Fc区的多肽)及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于例如美国专利号6,194,551B1和WO1999/51642。还可参见例如Idusogie等，免疫学杂志(J.Immunol.)164：4178-4184(2000)。

“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和性与没有这些改变的母体抗体相比有所提高的抗体。在一个实施方案中，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和性。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知方法来生成。Marks等，生物/技术(Bio/Technology)10：779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和性成熟。以下文献记载了CDR和/或构架残基的随机诱变：Barbas等，美国国家科学院学报(Proc.Nat.Acad.Sci.USA)91：3809-3813(1994)；Schier等，基因(Gene)169：147-155(1995)；Yelton等，免疫学杂志(J.Immunol.)155：1994-2004(1995)；Jackson等，免疫学杂志(J.Immunol.)154(7)：3310-9(1995)；及Hawkins等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)226：889-896(1992)。

抗体的“功能性抗原结合位点”指能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和性不必像衍生该抗原结合位点的母体抗体那样强，但是结合抗原的能力必须是使用已知用于评估抗体对抗原结合的多种方法之任一可测量到的。此外，本文中多价抗体的每个抗原结合位点的抗原结合亲和性不必定量相同。对于本文中的多聚体抗体，功能性抗原结合位点的数目可以使用超速离心分析来评估。依照这种分析方法，将靶抗原与多聚体抗体以不同比例混合，并计算复合物的平均分子量，其中假设不同数目的功能性结合位点。将这些理论值与得到的实际实验值进行比较以评估功能性结合位点的数目。

具有指定抗体的“生物学特征”的抗体指具有该指定抗体区别于其它结合相同抗原的抗体的一项或多项生物学特征的抗体。

为了筛选这样的抗体，其结合由目的抗体结合的抗原的表位，可以实施常规交叉阻断测定法，诸如抗体，实验室手册(Antibodies，A Laboratory Manual)，冷泉港实验室，Ed Harlow和David Lane(1988)中所记载的。

术语“拮抗剂”在用于本文时指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰本发明蛋白质的活性(包括其与一种或多种受体的结合(在配体的情况中)或与一种或多种配体的结合(在受体的情况中)的分子。拮抗剂包括抗体及其抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药用药剂及其代谢物、转录和翻译控制序列等。拮抗剂还包括本发明蛋白质的小分子抑制剂、和融合蛋白、特异性结合蛋白质由此使其隔绝(sequester)与其靶标结合的受体分子及衍生物、蛋白质的拮抗性变体、针对本发明蛋白质的反义分子、RNA适配体、和针对本发明蛋白质的核酶。

“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。某些阻断性抗体或拮抗性抗体实质或完全抑制抗原的生物学活性。

术语“VEGF”和“VEGF-A”可互换使用，指165个氨基酸的血管内皮细胞生长因子及相关的121个、145个、183个、189个和206个氨基酸的血管内皮细胞生长因子，如Leung等科学(Science)，246：1306(1989)；Houck等分子内分泌学(Mol.Endocrin.)，5：1806(1991)；及Robinson&Stringer，细胞科学杂志(Journal of Cell Science)，144(5)：853-865(2001)所记载的，及其天然存在等位基因形式和加工形式。VEGF-A是包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和PIGF的基因家族的一部分。VEGF-A主要结合两种高亲和性受体酪氨酸激酶，即VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1/KDR)，后者是VEGF-A血管内皮细胞有丝分裂信号的主要递质。术语“VEGF”或“VEGF-A”还指来自非人物种(诸如小鼠、大鼠或灵长类动物)的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF用如下术语表示，诸如hVEGF表示人VEGF或mVEGF表示鼠VEGF。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的多肽截短形式或片段。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示的编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和性。

“VEGF拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性(包括其与一种或多种VEGF受体的结合)的分子(肽基或非肽基)。VEGF拮抗剂包括抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子及衍生物(例如可溶性VEGF受体蛋白质或其VEGF结合片段、或嵌合VEGF受体蛋白质)、抗VEGF受体抗体和VEGF受体拮抗剂(诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂)、及融合蛋白(例如VEGF-Trap(Regeneron)、VEGF₁₂₁-多花白树毒蛋白(Peregine))。VEGF拮抗剂还包括VEGF的拮抗性变体、针对VEGF的反义分子、RNA适配体、和针对VEGF或VEGF受体的核酶。可用于本发明方法的VEGF拮抗剂进一步包括特异性结合VEGF的肽基或非肽基化合物，诸如抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF的多肽或其片段；至少与编码VEGF多肽的核酸分子的片段互补的反义核碱基(nucleobase)寡聚物；至少与编码VEGF多肽的核酸分子的片段互补的小RNA；靶向VEGF的核酶；针对VEGF的肽体(peptibody)；及VEGF适配体。在一个实施方案中，VEGF拮抗剂将VEGF的表达水平或生物学活性降低或抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在另一个实施方案中，受到VEGF拮抗剂抑制的VEGF是VEGF(8-109)、VEGF(1-109)或VEGF₁₆₅。

术语“抗VEGF抗体”或“结合VEGF的抗体”指能够以足够亲和性和特异性结合VEGF的抗体，该抗体在靶向VEGF中可用作诊断剂和/或治疗剂。例如，本发明的抗VEGF抗体可在靶向和干预其中牵涉VEGF活性的疾病或疾患中用作治疗剂。参见例如美国专利6,582,959，6,703,020；WO98/45332；WO96/30046；WO94/10202；WO2005/044853；EP0666868B1；美国专利申请20030206899，20030190317，20030203409，20050112126，20050186208和20050112126；Popkov等，免疫学方法杂志(Journal of Immunological Methods)288：149-164(2004)；及WO2005012359。所选择的抗体通常具有针对VEGF的足够强的结合亲和性，例如所述抗体可以以介于100nM-1pM之间的K_d值结合hVEGF。抗体亲和性可以通过例如基于表面等离振子共振的测定法(诸如BIAcore测定法，如PCT申请公开号WO2005/012359所记载的)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法(例如RIA)来测定。所述抗体可以进行其它生物学活性测定法，例如为了评估其作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的，而且依赖于所述抗体的靶抗原和预期用途。实例包括HUVEC抑制测定法；肿瘤细胞生长抑制测定法(如例如WO89/06692所记载的)；抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定法(美国专利5,500,362)；及激动性活性或造血测定法(参见WO95/27062)。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同源物，诸如VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或VEGF-E，也不结合其它生长因子，诸如PlGF、PDGF或bFGF。在一个实施方案中，抗VEGF抗体包括与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体；重组人源化抗-VEGF单克隆抗体(见Presta等(1997)癌症研究(CancerRes.)57：4593-4599)，包括但不限于称为“贝伐珠单抗(BV)”、也称为“rhuMAb VEGF”或“AVASTIN

”的抗体。贝伐珠单抗包含突变的人IgG1构架区和来自鼠抗体A.4.6.1(其阻断人VEGF结合其受体)的抗原结合互补性决定区。贝伐珠单抗大约93％的氨基酸序列(包括大部分构架区)衍生自人IgG1，而大约7％的序列衍生自A4.6.1。贝伐珠单抗具有约149,000道尔顿的分子量，而且是糖基化的。贝伐珠单抗和其它人源化抗VEGF抗体进一步记载于2005年2月26日授权的美国专利号6,884,879。其它抗-VEGF抗体包括G6或B20系列抗体(例如G6-23、G6-31、B20-4.1)，如PCT申请公开号WO2005/012359所记载的。其它优选的抗体参见美国专利号7,060,269，6,582,959，6,703,020；6,054,297；WO98/45332；WO96/30046；WO94/10202；EP0666868B1；美国专利申请公开号2006009360，20050186208，20030206899，20030190317，20030203409和20050112126；及Popkov等，免疫学方法杂志(Journal of Immunological Methods)288：149-164(2004)。

术语“B20系列多肽”在本文指结合VEGF的多肽，包括结合VEGF的抗体。B20系列多肽包括，但不限于，在美国公开号20060280747，美国公开号20070141065和/或美国公开号20070020267中记载的衍生自B20抗体序列的抗体或B20-衍生的抗体，将这些专利申请的内容明确结合在本文作为参考。在一个实施方案中，B20系列多肽是在美国公开号20060280747，美国公开号20070141065和/或美国公开号20070020267中所记载的B20-4.1。在另一个实施方案中，B20系列多肽是在PCT公开号WO 2009/073160中记载的B20-4.1.1，将其全部内容明确结合在本文作为参考。

术语“G6系列多肽”用于本文时，指结合VEGF的多肽，包括结合VEGF的抗体。G6系列多肽包括，但不限于，衍生自G6抗体的序列的抗体，或G6-衍生的抗体，其记载在美国公开号20060280747，美国公开号20070141065和/或美国公开号20070020267中。在美国公开号20060280747，美国公开号20070141065和/或美国公开号20070020267中记载的G6系列多肽包括，但不限于G6-8，G6-23和G6-31。

“URVINAs”指在不依赖VEGF的肿瘤中被上调的核酸。URVINAs包括，但不限于S100A8(SEQ ID NO：1)，S100A9(SEQ ID NO：3)，PlGF(SEQID NO：5)，IL-1β(SEQ ID NO：7)，IL-6(SEQ ID NO：9)，和LIF(SEQ ID NO：11)。

“URVIPs”指在不依赖VEGF的肿瘤中被上调的蛋白。URVIPs包括，但不限于：S100A8(SEQ ID NO：2)，S100A9(SEQ ID NO：4)，PlGF(SEQ ID NO：6)，IL-1β(SEQ ID NO：8)，IL-6(SEQ ID NO：10)，LIF(SEQ ID NO：12)，和HGF(SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：20，SEQ ID NO：22)。

“DRVINAs”指在不依赖VEGF的肿瘤中被下调的核酸。DRVINAs包括，但不限于：Tie-1(SEQ ID NO：25)，Tie-2(SEQ ID NO：27)，VEGFR1(SEQID NO：29)，VEGFR2(SEQ ID NO：31)，CD31(SEQ ID NO：33)，CD34(SEQ ID NO：35)，和PDGFC(SEQ ID NO：37)。

“DRVIPs”指在不依赖VEGF的肿瘤中被下调的蛋白。在某些实施方案中，DRVIP是由在不依赖VEGF的肿瘤中被下调的核酸编码的蛋白，例如DRVINA。

术语″IL-1β拮抗剂″用于本文时指结合于IL-1β并抑制或大大减少IL-1β的生物活性的分子。IL-1β拮抗剂的非限制性实例包括抗体、蛋白、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡核苷酸、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药剂和它们的代谢物、转录和翻译控制序列等。在本发明的一个实施方案中，IL-1β拮抗剂是抗体，尤其是结合人IL-1β的抗-IL-1β抗体。在另一个实施方案中，IL-1β拮抗剂是白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1Ra)Kineret

(anakinra)(Amgen，Thousand Oaks，CA)。在又一个实施方案中，IL-1β拮抗剂是IL-1 Trap(Regeneron，Tarrytown，NY)。

术语″IL-6拮抗剂″用于本文时指结合IL-6并抑制或大大减少IL-6的生物学活性的分子。IL-6拮抗剂的非限制性实例包括抗体、蛋白、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药剂和它们的代谢物、转录和翻译控制序列等。在本发明的一个实施方案中，IL-6拮抗剂是抗体，尤其是结合人IL-6的抗-IL-6抗体。

术语″LIF拮抗剂″用于本文时指结合LIF并抑制或大大减少LIF的生物学活性的分子。LIF的拮抗剂的非限制性实例包括抗体、蛋白、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药剂和它们的代谢物、转录和翻译控制序列等。在本发明的一个实施方案中，LIF拮抗剂是抗体，尤其是结合人LIF的抗-LIF抗体。

术语″PlGF拮抗剂″用于本文时指结合PlGF并抑制或大大减少PlGF的生物学活性的分子。PlGF指胎盘生长因子。发现PlGF主要以两种剪接变体或同种型的形式存在，即149个氨基酸的PlGF-1或170个氨基酸的PlGF-2，其在羧基-端区域包含21个氨基酸插入，但是还发现了其它的同种型。PlGF拮抗剂的非限制性实例包括抗体、蛋白、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药剂和它们的代谢物、转录和翻译控制序列等。在本发明的一个实施方案中，PlGF拮抗剂是抗体，尤其是结合人PlGF的抗-PlGF抗体。在一个实施方案中，PlGF抗体是抗-PlGF TB-403(ThromboGenics NV，Leuven，Belgium)。见，例如，Fischer C，等.，抗-PlGF抑制VEGF(R)-抑制剂-抗性肿瘤的生长，而不影响健康血管(Anti-PlGF Inhibits Growth of VEGF(R)-Inhibitor-Resistant Tumors Without Affecting Healthy Vessels)，细胞(Cell)，131：463-475(2007)。在另一个实施方案中，PlGF拮抗剂是能够抑制PlGF与Flt-1受体结合的抗-PlGF抗体。

术语″HGF拮抗剂″用于本文时指结合HGF并抑制或大大减少HGF的生物学活性的分子。HGF拮抗剂的非限制性实例包括抗体、蛋白、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药剂和它们的代谢物、转录和翻译控制序列等。在本发明的一个实施方案中，HGF拮抗剂是抗体，尤其是结合人HGF的抗-HGF抗体。在另一个实施方案中，HGF拮抗剂是AMG 102，针对HGF/SF(分散因子)的人单克隆抗体。

“c-Met拮抗剂”(互换地称为“c-Met抑制剂”)是干扰c-Met活化或功能的药剂。在本文公开了c-Met的核酸和蛋白序列，分别为SEQ ID NO：23和SEQ ID NO：24。c-Met抑制剂的实例包括c-Met抗体；HGF抗体；小分子c-Met拮抗剂；c-Met酪氨酸激酶抑制剂；反义和抑制性RNA(例如，shRNA)分子(见例如，WO2004/87207)。在某些实施方案中，c-Met抑制剂是结合c-Met的抗体或小分子。在特定实施方案中，c-Met抑制剂与c-Met的结合亲和性(解离常数)约为1,000nM以下。在另一个实施方案中，c-Met抑制剂与c-Met的结合亲和性约为100nM以下。在另一个实施方案中，c-Met抑制剂与c-Met的结合亲和性约为50nM以下。在一个特定的实施方案中，c-Met抑制剂与c-Met共价结合。在一个特定的实施方案中，c-Met抑制剂以1,000nM以下的IC50抑制c-Met细胞传导。在另一个实施方案中，c-Met抑制剂以500nM以下的IC50抑制c-Met信号传导。在另一个实施方案中，c-Met抑制剂以50nM以下的IC50抑制c-Met信号传导。

“c-Met活化”指c-Met受体的活化或磷酸化。一般情况下，c-Met活化导致信号转导(例如，其由c-Met受体的细胞内激酶结构域磷酸化c-Met或底物多肽中的酪氨酸残基所导致)。c-Met活化可以由结合目的c-Met受体的c-Met配体(HGF)所介导。HGF结合于c-Met可以活化c-Met的激酶结构域并且由此导致在c-Met中的酪氨酸残基的磷酸化和/或在另外的底物多肽中的酪氨酸残基的磷酸化。

术语“S100A8拮抗剂″用于本文时指结合S100A8并且抑制或大大减少S100A8的生物学活性的分子。S100A8拮抗剂的非限制性实例包括抗体、蛋白、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药剂和它们的代谢物、转录和翻译控制序列等。在本发明的一个实施方案中，S100A8拮抗剂是抗体，尤其是结合人S100A8的抗-S100A8抗体。

术语“S100A9拮抗剂″用于本文时指结合S100A9并且抑制或大大减少S100A9的生物学活性的分子。S100A9拮抗剂的非限制性实例包括抗体、蛋白、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药剂和它们的代谢物、转录和翻译控制序列等。在本发明的一个实施方案中，S100A9拮抗剂是抗体，尤其是结合人S100A9的抗-S100A9抗体。

术语“生物学活性”和“有生物学活性的”就多肽而言指分子特异性结合并调节细胞应答(例如增殖、迁移等)的能力。细胞应答还包括那些经由受体介导的，包括但不限于迁移和/或增殖。在此语境中，术语“调节”包括促进和抑制二者。

“VEGF生物学活性”包括与任何VEGF受体的结合或任何VEGF信号传导活性如调节正常和异常生血管和血管发生二者(Ferrara和Davis-Smyth(1997)内分泌综述(Endocrine Rev.)18：4-25；Ferrara(1999)分子医学杂志(J.Mol.Med.)77：527-543)；促进胚胎血管发生和生血管(Carmeliet等.(1996)自然(Nature)380：435-439；Ferrara等.(1996)自然(Nature)380：439-442)；和调节雌性生殖道的周期性血管增殖，以及骨生长和软骨形成(Ferrara等.(1998)自然医学(Nature Med.)4：336-340；Gerber等.(1999)自然医学(Nature Med.)5：623-628)。除了作为血管发生和血管生成中的生血管因子之外，VEGF还作为多效生长因子在其它生理过程中显示了多种生物学效应，如内皮细胞存活，血管渗透性和血管舒张，单核细胞趋化作用和钙流入(Ferrara和Davis-Smyth(1997)，见上文，和Cebe-Suarez等，细胞分子生命科学(Cell.Mol.Life.Sci).63：601-615(2006)。而且，最近的研究已经报道了VEGF对于数种非内皮细胞类型，如视网膜色素上皮细胞、胰管细胞和许旺细胞的促有丝分裂作用。Guerrin等.(1995)细胞生理学杂志(J.Cell Physiol.)164：385-394；Oberg-Welsh等(1997).分子细胞内分泌学(Mol.Cell.Endocrinol).126：125-132(1997)；Sondell等.神经科学杂志(J.Neurosci.)19：5731-5740(1999)。

“生血管因子”或“血管发生剂”指刺激血管发育，例如促进血管发生、内皮细胞生长、血管稳定性和/或血管生成等的生长因子。例如，生血管因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成员、PlGF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGF)、TIE配体(促血管生成素(angiopoietins))、肝配蛋白、ANGPTL3、ANGPTL4等。它还包括加速伤口愈合的因子，诸如生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF及其家族成员、及TGF-α和TGF-β。参见例如Klagsbrun和D’Amore，生理学年评(Annu.Rev.Physiol.)53：217-39(1991)；Streit和Detmar，致癌基因(Oncogene)22：3172-3179(2003)；Ferrara&Alitalo，自然医学(Nature Medicine)5(12：1359-1364(1999)；Tonini等，致癌基因(Oncogene)22：6549-6556(2003)(例如列举生血管因子的表1)；和Sato，Int.J.Clin.Oncol.8：200-206(2003)。

“抗血管发生剂”或“血管发生抑制剂”指直接或是间接抑制血管发生、血管生成、或不想要的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体、或其缀合物或融合蛋白。例如，抗血管发生剂是上文定义的生血管药剂的抗体或其它拮抗剂，例如VEGF的抗体、VEGF受体的抗体、阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT/SU11248(苹果酸舒尼替尼(sunitinib malate))、AMG706)。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如制管张素、内皮生长抑素等。参见例如Klagsbrun和D’Amore生理学年评(Annu.Rev.Physiol.)53：217-39(1991)；Streit和Detmar致癌基因(Oncogene)22：3172-3179(2003)(例如列举恶性黑素瘤中抗生血管疗法的表3)；Ferrara&Alitalo自然药物(Nature Medicine)5(12)：1359-1364(1999)；Tonini等致癌基因(Oncogene)22：6549-6556(2003)(例如列举抗生血管因子的表2)；及Sato，Int.J.Clin.Oncol.8：200-206(2003)(例如列举临床试验中所使用的抗生血管药剂的表1)。

术语“抗-生血管疗法”指用于抑制血管发生的疗法，所述疗法包括施用至少一种如本文定义的抗-血管发生药剂。在某些实施方案中，抗-生血管疗法包括将VEGF拮抗剂施用于受试者。在一个实施方案中，抗-生血管疗法包括施用如本文定义的VEGF-拮抗剂。在一个实施方案中，VEGF拮抗剂是抗-VEGF抗体。在另一个实施方案中，抗-VEGF抗体是贝伐珠单抗。

术语“免疫抑制剂”用于本文时指作用于抑制或掩蔽本文所治疗哺乳动物的免疫系统的物质。这将包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩蔽MHC抗原的物质。此类药剂的实例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(见美国专利号4,665,077)；非类固醇抗炎药(NSAID)；更昔洛韦(ganciclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮质激素诸如皮质醇(cortisol)或醛甾酮(aldosterone)、抗炎药诸如环加氧酶抑制剂、5-脂加氧酶抑制剂、或白三烯受体拮抗剂；嘌呤拮抗剂，诸如硫唑嘌呤(azathioprine)或麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil，MMF)；烷化剂，诸如环磷酰胺；溴隐亭(bromocryptine)；达那唑(danazol)；氨苯砜(dapsone)；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美国专利号4,120,649中所记载的)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A；类固醇，诸如皮质类固醇或糖皮质类固醇或糖皮质激素类似物，例如泼尼松(prednisone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone)；二氢叶酸还原酶抑制剂，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)(口服或皮下)；羟氯喹(hydroxycloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；来氟米特(leflunomide)；细胞因子或细胞因子受体抗体，包括抗干扰素-α、-β或-γ抗体、抗肿瘤坏死因子-α抗体(英利昔单抗或阿达木单抗)、抗TNFα免疫粘附素(依那西普(etanercept))、抗肿瘤坏死因子-β抗体、抗白细胞介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛T抗体(pan-T antibody)，优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合域的可溶性肽(1990年7月26日公布的WO 1990/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T细胞受体(Cohen等，美国专利号5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等，科学(Science)251：430-432(1991)；WO 1990/11294；Ianeway，自然(Nature)341：482(1989)；和WO 1991/01133)；及T细胞受体抗体(EP340,109)，诸如T10B9。

“非类固醇抗炎药”或“NSAID”的实例有乙酰水杨酸(acetylsalicylicacid)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)，包括其盐和衍生物，等。

术语“细胞毒性药剂”用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如²¹¹At、¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹²Bi、³²P和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素(诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体)

“生长抑制剂”用于本文时指在体外和/或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的实例包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春花药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、TAXOL和II型拓扑异构酶抑制剂，诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类，诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨喋呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和阿糖胞苷(ara-C)。更多信息可参见癌症的分子基础(The Molecular Basis of Cancer)，Mendelsohn和Israel编，第1章，题为“细胞周期调节、致癌基因和抗肿瘤药物(Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplastic drugs)”，Murakami等(WB Saunders，Philadelphia(1995)，尤其是第13页。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和CYTOXAN

环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedopa)和乌瑞替派(uredopa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(trietylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethiylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL

)；β-拉帕醌(lapachone)；拉伯醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTIN)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；倍癌霉素(duocarmycin)(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素类，诸如enediyne抗生素类(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白enediyne抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomysin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycinis)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN

吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯啉代多柔比星(2-pyrrolino-doxorubicin)、盐酸多柔比星脂质体注射剂(DOXIL

)和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨喋呤(methotrexate)、吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR)、替加氟(tegafur)(UFTORAL

)、卡培他滨(capecitabine)(XELODA

)、埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；defosfamide；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidainine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidanmol)；二胺硝吖啶(nitraerine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK

多糖复合物(JHS天然产物，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verracurin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(ELDISINE

FILDESIN)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)，例如紫杉醇(paclitaxel)(TAXOL

)、紫杉醇的清蛋白改造的纳米颗粒剂型(ABRAXANE^TM)和多西他塞(doxetaxel)(TAXOTERE

))；苯丁酸氮芥(chloranbucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)(VELBAN

)；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)(ONCOVIN

)；奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovovin)；长春瑞滨(vinorelbine)(NAVELBINE

)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸类(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；任何上述物质的药用盐、酸或衍生物；以及两种或更多上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙组合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATIN^TM)组合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。

该定义还包括作用为调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。实例包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调控物类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)(EVISTA

)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)(FARESTON

)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHR)激动剂，诸如醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)(LUPRON

和ELIGARD

)、醋酸戈舍瑞林(goserelin acetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(tripterelin)；其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MEGASE

)、依西美坦(exemestane)(AROMASIN

)、福美坦(formestanie)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)(RIVISOR

)、来曲唑(letrozole)(FEMARA

)和阿那曲唑(anastrozole)(ARIMIDEX

)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如BONEFOS

或OSTAC

)、依替膦酸钠(etidronate)(DIDROCAL

)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)(ZOMETA

)、阿伦膦酸盐(alendronate)(FOSAMAX

)、帕米膦酸盐(pamidronate)(AREDIA

)、替鲁膦酸盐(tiludronate)(SKELID)或利塞膦酸盐(risedronate)(ACTONEL

)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制牵涉异常(abherant)细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如THERATOPE

疫苗和基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN

疫苗、LEUVECTIN

疫苗和VAXID

疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如LURTOTECAN

)；rmRH(例如ABARELIX

)；托西拉帕替尼(lapatinib ditosylate)(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；COX-2抑制剂，诸如塞来考昔(CELEBREX

4-(5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺；及任何上述物质的药用盐、酸或衍生物。

术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-蛋氨酰人生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(例如VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E)；胎盘衍生生长因子(PlGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)(例如PDGFA、PDGFB、PDGFC、PDGFD)；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-α；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF)；白细胞介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、IL-30；分泌珠蛋白(secretoglobin)/子宫珠蛋白；制瘤素M(OSM)；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。

“受试者”或“患者”意为哺乳动物，包括，但不限于：人或非人哺乳动物，如牛、马、犬、绵羊或猫。在一个实施方案中，受试者是人。在另一个实施方案中，受试者被诊断患有癌症。

为了治疗目的，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人，家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛、绵羊、猪等。在一个实施方案中，哺乳动物指人。

“病症”指任何会受益于治疗的疾病。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性实例包括任何形式的肿瘤，良性和恶性肿瘤；血管化肿瘤；肥大；白血病和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔病症；及炎性、生血管和免疫学病症，源自不当、异常、过度和/或病理性血管形成和/或血管通透性的血管病症。

用于本文时，“治疗(treatment)”(和变化如“治疗(treat)”或“treating”)指在尝试改变待治疗的个体或细胞的天然进程中的临床干预，并且可以为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的理想效果包括防止疾病发生或复发，缓和症状，消除疾病的任何直接或间接病理学后果，预防转移，减少疾病进展速率，改善或减轻疾病状态，和症状缓解或改善的预后。在一些实施方案中，将本发明的方法和组合物用于延缓疾病或病症的发展或减缓疾病或病症的进展。

术语“有效量”或“治疗有效量”指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物量。在癌症的情况中，有效量的药物可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即一定程度的减缓，典型的是阻止)癌细胞浸润入周围器官；抑制(即一定程度的减缓，典型的是阻止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；容许治疗不依赖VEGF的肿瘤；和/或一定程度的减轻一种或多种与病症有关的症状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，体内功效可以通过例如评估存活持续时间、距疾病进展的时间(TTP)、响应率(RR)、响应持续时间、和/或生活质量来测量。还见题为“治疗的功效”的部分。

“预防有效量”是指在需要的剂量和时间阶段，有效获得需要的预防效果的量。典型地，但不是必需地，由于预防剂量在疾病发生之前或疾病的早期阶段用于受试者，因此预防有效量将小于治疗有效量。

在癌前、良性肿瘤、早期或晚期肿瘤的情形中，生血管抑制剂的治疗有效量可以减少癌细胞的数量；减少原发肿瘤大小；抑制(即，在一定程度上减缓并且优选地阻止)癌细胞浸润到周围器官中；抑制(即，在一定程度上减缓并且优选地阻止)肿瘤转移；在一定程度上，抑制或减缓肿瘤生长或肿瘤进展；和/或在一定程度上减轻与病症相关的一种或多种症状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，体内功效可以通过例如评估存活持续时间、距疾病进展的时间(TTP)、响应率(RR)、响应持续时间、和/或生活质量来测量。还见题为“治疗的功效”的部分。

“减少或抑制”即与参照比较减少或降低活性、功能和/或量。在某些实施方案中，所谓“减少或抑制”意为导致总的减少20％以上的能力。在另一个实施方案中，“减少或抑制”意为导致总的减少50％以上的能力。在又一个实施方案中，所谓“减少或抑制”意为导致总的减少75％，85％，90％，95％以上的能力。减少或抑制可以指被治疗的病症的症状，转移瘤的存在或大小，原发肿瘤的大小，或在生血管疾病中的血管的尺寸或数量。

术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征典型地为细胞生长不受调节的生理病况。癌症的实例包括但不限于癌瘤(carcinoma)、淋巴瘤(lymphoma)、母细胞瘤(blastoma)、肉瘤(sarcoma)、和白血病或淋巴样恶性肿瘤(leukemia or lymphoid malignancies)。此类癌症的更具体实例包括肾癌(kidney or renal cancer)、乳腺癌(breast cancer)、结肠癌(colon cancer)、直肠癌(rectal cancer)、结肠直肠癌(colorectal cancer)、肺癌(lung cancer)(包括小细胞肺癌(small-cell lung cancer)、非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer)、肺的腺癌和肺的鳞癌、鳞状细胞癌(squamous cell cancer)(例如上皮鳞状细胞癌(epithelial squamous cell cancer))、宫颈癌(cervical cancer)、卵巢癌(ovarian cancer)、前列腺癌(prostate cancer)、肝癌(liver cancer)、膀胱癌(bladder cancer)、腹膜癌(cancer of the peritoneum)、肝细胞癌(hepatocellular cancer)、胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃肠癌(gastrointestinal cancer)、胃肠基质肿瘤(gastrointestinal stromal tumors)(GIST))、胰腺癌(pancreatic cancer)、头颈癌(head and neck cancer)、成胶质细胞瘤(glioblastoma)、成视网膜细胞瘤(retinoblastoma)、星形细胞瘤(astrocytoma)、泡膜细胞瘤(thecomas)、男性细胞瘤(arrhenoblastomas)、肝瘤(hepatoma)、血液学恶性肿瘤(hematologic malignancies)(包括非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkins lymphoma，NHL)、多发性骨髓瘤(multiple myeloma)和急性血液学恶性肿瘤(acute hematologic malignancies))、子宫内膜癌或子宫癌(endometrial or uterine carcinoma)、子宫内膜异位症(endometriosis)、纤维肉瘤(fibrosarcomas)、绒毛膜癌(choriocarcinoma)、唾液腺癌(salivary gland carcinoma)、外阴癌(vulval cancer)、甲状腺癌(thyroid cancer)、食管癌(esophageal carcinomas)、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌(anal carcinoma)、阴茎癌(penile carcinoma)、鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma)、喉癌(laryngeal carcinomas)、卡波西氏肉瘤(Kaposi′s sarcoma)、黑素瘤(melanoma)、皮肤癌(skin carcinomas)、神经鞘瘤(Schwannoma)、少突神经胶质瘤(oligodendroglioma)、成神经细胞瘤(neuroblastomas)、横纹肌肉瘤(rhabdomyosarcoma)、骨源性肉瘤(osteogenic sarcoma)、平滑肌肉瘤(leiomyosarcomas)、尿道癌(urinary tract carcinomas)、甲状腺癌(thyroid carcinomas)、维尔姆斯氏肿瘤(Wilm′s tumor)、以及B细胞淋巴瘤(B-cell lymphoma)(包括低级/滤泡性非霍奇金淋巴瘤(low grade/follicular non-Hodgkin′s lymphoma)(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL(small lymphocytic(SL)NHL)、中级/滤泡性NHL(intermediate grade/follicular NHL)、中级弥漫性NHL(intermediate grade diffuse NHL)、高级成免疫细胞性NHL(high grade immunoblastic NHL)、高级成淋巴细胞性NHL(high grade lymphoblastic NHL)、高级小无核裂细胞性NHL(high grade small non-cleaved cell NHL)、贮积病(bulky disease)NHL、套细胞淋巴瘤(mantle cell lymphoma)、AIDS相关淋巴瘤(AIDS-related lymphoma)、和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(Waldenstrom′s Macroglobulinemia))、慢性淋巴细胞性白血病(chronic lymphocytic leukemia)(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(acute lymphoblastic leukemia)(ALL)、毛细胞性白血病(Hairy cell leukemia)、慢性成髓细胞性白血病(chronic myeloblastic leukemia)、和移植后淋巴增殖性病症(post-transplant lymphoproliferative disorder)(PTLD)、以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿(edema)(诸如与脑瘤有关的水肿)和梅格斯氏综合征(Meigs′syndrome.)有关的异常血管增殖。

“肿瘤”在用于本文时指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的或者是良性的，及所有癌前的和癌性的细胞和组织。

待治疗的赘生性病症的实例包括但不限于本文中术语“癌症”和“癌性”下所记载的那些。可以用本发明的拮抗剂治疗的非赘生性病况包括但不限于，例如不良或异常肥大(undesired or aberrant hypertrophy)、关节炎(arthritis)、类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis)(RA)、银屑病(psoriasis)、银屑病斑块(psoriatic plaques)、结节病(sarcoidosis)、动脉粥样硬化(atherosclerosis)、动脉粥样硬化斑块(atherosclerotic plaques)、来自心肌梗死的水肿(edema from myocardial infarction)、糖尿病性和其它增殖性视网膜病(diabetic and other proliferative retinopathies)(包括早产儿视网膜病(retinopathy of prematurity)、晶状体后纤维组织增生症(retrolental fibroplasia)、新生血管性青光眼(neovascular glaucoma)、年龄相关的黄斑变性(age-related macular degeneration)、糖尿病性黄斑水肿(diabetic macularedema)、角膜新血管形成(corneal neovascularization)、角膜移植片新血管形成(corneal graft neovascularization)、角膜移植片排斥(corneal graft rejection)、视网膜/脉络膜新血管形成(retinal/choroidal neovascularization)、角的新血管形成(neovascularization of the angle)(虹膜(rubeosis))、眼的新血管病(ocular neovascular disease)、血管的再狭窄(vascular restenosis)、动静脉畸形(AVM)(arteriovenous malformations)、脑膜瘤(meningioma)、血管瘤(hemangioma)、血管纤维瘤(angiofibroma)、甲状腺增生(thyroid hyperplasias)(包括格雷夫斯氏病(Grave′s disease))、角膜和其它组织移植、慢性炎症、肺部炎症、急性肺损伤/ARDS、败血病(sepsis)、原发性肺动脉高压(primary pulmonary hypertension)、恶性肺部积液(malignant pulmonary effusion)、脑水肿(cerebral edema)(例如，与急性中风/闭合性头颅伤/外伤相关的)、滑膜性炎症(synovial inflammation)、RA中的血管翳形成(pannus formation in RA)、骨化性肌炎(myositis ossificans)、肥厚性骨形成(hypertropic bone formation)、骨关节炎(osteoarthritis)(OA)、顽固性腹水(refractory ascites)、多囊性卵巢病(polycystic ovarian disease)、子宫内膜异位症(endometriosis)、第三体液分区疾病(3rd spacing of fluid diseases)(胰腺炎(pancreatitis)、间隔综合征(compartment syndrome)、烧伤(burns)、肠病(bowel disease))、子宫的类纤维瘤(uterine fibroid)、早产(premature labor)、慢性炎症诸如IBD(局限性回肠炎(Crohn′s disease)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis))、肾脏同种移植物排斥(renal allograft rejection)、炎性肠病(inflammatory bowel disease)、肾病综合征(nephrotic syndrome)、不良或异常组织块生长(非癌症)、肥胖(obesity)、脂肪组织块生长、血友病关节(hemophilic joints)、肥厚性瘢痕(hypertrophic scars)、毛发生长的抑制、Osler-Weber综合症、脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生症(pyogenic granuloma retrolental fibroplasias)、硬皮病(scleroderma)、沙眼(trachoma)、血管粘连(vascular adhesions)、滑膜炎(synovitis)、皮炎(dermatitis)、先兆子痫(preeclampsia)、腹水(ascites)、心包积液(pericardial effusion)(诸如与心包炎(pericarditis)相关的)和胸腔积液(pleural effusion)。

术语“癌症疗法”指用于治疗癌症的疗法。术语“抗肿瘤组合物”指可用于治疗癌症的组合物，其包含至少一种活性治疗剂，例如“抗癌剂”。治疗剂(抗癌剂)的实例包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒性药剂、放射疗法中所使用的药剂、抗生血管药剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、毒素、和其它用于治疗癌症的药剂，例如抗VEGF中和抗体、VEGF拮抗剂、抗HER-2、抗CD20、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂、erlotinib(Tarceva

)、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))、干扰素、细胞因子、能与ErbB2、ErbB3、ErbB4、或VEGF受体中的一种或多种结合的拮抗剂(例如中和抗体)、血小板衍生生长因子(PDGF)和/或干细胞因子(SCF)的受体酪氨酸激酶的抑制剂(例如甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)(Gleevec

Novartis))、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有机化学剂等。本发明还包括它们的组合。

术语″诊断″用于本文时，指鉴定分子或病理状态、疾病或病况，如鉴定癌症，或指鉴定可以得益于特定治疗方案的癌症患者。在一个实施方案中，诊断指鉴定特定类型的肿瘤。在又一个实施方案中，诊断指鉴定受试者中的不依赖VEGF的肿瘤。

术语″预后″用于本文时指预测从抗癌疗法得到临床益处的可能性。

术语″预测″用于本文时，指患者对特定抗癌疗法响应良好或不良的可能性。在一个实施方案中，预测涉及那些响应的程度。在一个实施方案中，预测涉及患者在治疗(例如用特定治疗剂治疗)后是否在一定阶段存活或改善而不伴随疾病的复发和/或这样存活或改善的可能性。本发明的预测方法可以在临床上通过选择对于任何特定患者的最适合的治疗方式来做出治疗决定。如果患者可能对治疗方案(如给定的治疗方案，包括例如施用给定的治疗剂或组合，外科手术干预，类固醇治疗等)的响应良好，或在治疗方案后患者的长期存活是可能的，那么本发明的预测方法是预测的有价值的工具。

患者的反应性可以使用任何指示患者益处的终点来评估，所述终点包括，但不限于：(1)在一定程度上抑制疾病进展，包括延缓和彻底停滞；(2)减少病灶大小；(3)抑制(即，减少、减缓或彻底阻止)疾病细胞浸润到邻近的周围器官和/或组织中；(4)抑制(即，减少、延缓或完全阻止)疾病传播；(5)在一定程度上，减轻与病症相关的一种或多种症状；(6)增加治疗后没有表现疾病的长度；和/或(8)治疗后在给定时间点减少的死亡率。

临床益处可以通过评价各种终点来测量，例如在一定程度上抑制疾病进展，包括延缓和完全阻滞；减少疾病事件和/或症状的数量；减少病灶大小；抑制(即，减少、减缓或彻底阻止)疾病细胞浸润到邻近的周围器官和/或组织中；抑制(即，减少、延缓或完全阻止)疾病传播；减少自体免疫反应，其可以，但不必需导致疾病病灶的退化或消除；在一定程度上减轻与病症相关的一种或多种症状；增加治疗后没有疾病表现的长度，例如无(疾病)进展的存活；增加的总存活时间；更高的响应速率；和/或在治疗后的给定时间点减少的死亡率。

术语“益处”广义使用，并且指任何理想的效果，具体地包括如本文定义的临床益处。

术语“与一种或多种其它治疗剂组合”施用包括同时(同时发生)和/或以任何顺序连续施用。

术语″同时发生″用于本文时，指施用两种以上的治疗剂，其中至少施用的部分在时间上重叠。因此，同时发生的施用包括在中断一种或多种其它药剂后，继续施用一种或多种药剂的给药方案。

本发明的方法

本发明提供用于检测不依赖VEGF的肿瘤的方法和组合物。本文公开的序列信息，结合本领域已知的核酸检测方法，可以允许检测并比较各种公开的转录体。公开的方法还提供方便、有效和可能经济有效的方式来获得用于评估治疗患有不依赖VEGF肿瘤的癌症患者的适合或有效的疗法的数据和信息。

在某些实施方案中，本文提供标志组来检测不依赖VEGF的肿瘤并评估肿瘤对于VEGF拮抗剂治疗的肿瘤敏感性或抗性。例如，标志组可以包括一种以上，两种以上，三种以上，四种以上，五种以上，六种以上，七种以上，八种以上，九种以上，十种以上分子或全部的分子组。在某些实施方案中，分子是具有改变的表达的核酸，编码具有改变的表达和/或活性的蛋白的核酸，或具有改变的表达和/或活性的蛋白。具有改变的核酸和/或蛋白表达水平的基因包括，但不限于：IL-1β，PlGF，HGF，IL-6，LIF，S100A8，S100A9，PDGFC，Tie-1，Tie-2，CD31，CD34，VEGFR1和VEGFR2。

URVIP和DRVIP的调节剂，或由URVINA和DRVINA编码的蛋白的调节剂是调节这些蛋白活性的分子，例如激动剂和拮抗剂。术语“激动剂”涉及本发明的蛋白的肽和非肽类似物，并且涉及特异性结合本发明的此类蛋白的抗体，条件是它们具有提供激动剂信号的能力。术语“激动剂”在蛋白生物学作用的背景下定义。术语“拮抗剂”涉及具有抑制本发明蛋白的生物学活性能力的分子。可以例如通过抑制蛋白活性来评估拮抗剂。

使用由已知序列的数据库记录或芯片制造商提供的序列信息，可以使用本领域技术人员公知的技术检测(如果表达)和测量序列。基因或生物标志的表达水平/量可以基于本领域已知的任何适合的标准确定，所述标准包括，但不限于：mRNA，cDNA，蛋白，蛋白片段和/或基因拷贝数。

各种基因或生物标志在样品中的表达可以通过许多方法分析，其中多数方法是本领域已知的并且为技术人员所了解，包括，但不限于：免疫组化分析和/或蛋白质印迹分析、免疫沉淀、分子结合测定法、ELISA、ELIFA、荧光激活的细胞分选(FACS)等、定量的基于血液的测定法(例如血清ELISA)(用于例如检查蛋白表达的水平)、生化酶促活性测定法、原位杂交、RNA印迹分析和/或mRNA的PCR分析，以及可以通过基因和/或组织阵列分析进行的多种测定法中的任一种。评价基因和基因产物状态的典型方法见于例如Ausubel等.编辑，1995，当前分子生物学方法(Current Protocols In Molecular Biology)，单元2(RNA印迹(Northern Blotting))，4(DNA印迹(Southern Blotting))，15(免疫印迹(Immunoblotting)和18(PCR分析)。也可以使用多种免疫测定法如可获自Rules Based Medicine或Meso Scale Discovery(MSD)的那些免疫测定法。

在某些实施方案中，如果样品中的基因或生物标志的表达水平/量大于参照样品中的基因或生物标志的表达水平/量，那么与参照样品中的基因或生物标志的表达/量比较，样品中的基因或生物标志的表达水平/量是增加的。类似地，如果在样品中的基因或生物标志的表达水平/量少于参照样品中的基因或生物标志的表达水平/量，那么基因或生物标志在样品中的表达/量与在参照样品中的表达/量比较是减少的。

在某些实施方案中，参照样品包括一种或多种基因(例如，URVINA，DRVINA，URVIP和/或DRVIP分子)，并且已知关于所述基因的比较参数，例如肿瘤对VEGF拮抗剂的敏感性。

在某些实施方案中，将样品关于测定的RNA或蛋白的量的差异以及所用的RNA或蛋白样品的质量差异，以及在测定循环中的变异性进行标准化。所述标准化可以通过测量并且结合某些标准基因的表达进行，所述标准基因包括公知的持家基因如GAPDH或β肌动蛋白。备选地，标准化可以基于所有的测定基因或其较大的子集的平均或中位值信号进行(全面标准化方法((global normalization approach))。以逐个基因为基础，将患者肿瘤的mRNA或蛋白的测量的标准化量与在参照组中发现的量进行比较。可以将对于每个患者每个测试肿瘤的每种mRNA或蛋白的标准化表达水平表示为在参照组中测量的表达水平的百分比。在特定的待分析患者样品中测量的表达水平将以一定百分位数落入该范围中，这可以通过本领域公知的方法进行确定。

在某些实施方案中，基因的相对表达水平如下确定：

相对表达基因1_样品1＝2exp(Ct_持家基因-Ct_基因1)，Ct在样品1中确定

相对表达基因1_参照RNA＝2exp(Ct_持家基因-Ct_基因1)，Ct在参照RNA中确定。

标准化的相对表达基因1_样品1＝(相对表达基因1_样品1/相对表达基因1_参照RNA)

Ct是阈值循环。Ct是在反应中产生的荧光穿过阈值线的循环数。

将所有的实验关于参照RNA标准化，所述参照RNA是来自各种组织来源的RNA的综合(comprehesive)混合物(例如，参照RNA#636538，来自Clontech，Mountain View，CA)。在每个qRT-PCR循环中包含相同的参照RNA，允许对不同实验循环之间的结果进行比较。

在某些实施方案中，如果在测试样品中的URVINA分子的mRNA表达水平与参照样品比较增加约1.5倍以上，那么可以认为其mRNA表达水平与参照样品中的相应URVINA分子的mRNA表达水平比较是改变的。在一个实施方案中，mRNA表达水平增加约50％。

在某些实施方案中，如果在测试样品中的DRVINA分子的mRNA表达水平与参照样品比较减少约20％以上，那么可以认为其mRNA表达水平与参照样品中的相应DRVINA分子的基因表达水平相比是改变的。在一个实施方案中，mRNA表达水平减少约30％。在又一个实施方案中，mRNA表达水平减少约40％。

在某些实施方案中，如果在测试样品中的URVIP分子的蛋白表达水平与参照比较增加约20％以上，那么可以认为其蛋白表达水平与在参照样品中的相应URVIP分子的蛋白表达水平比较是改变的。在一个实施方案中，蛋白表达水平增加约30％。在又一个实施方案中，蛋白表达水平增加约40％。

在某些实施方案中，如果在测试样品中的DRVIP分子的蛋白表达水平与参照样品比较减少约25％以上，那么可以认为其蛋白表达水平与在参照样品中的相应URVIP分子的蛋白表达水平比较是改变的。在一个实施方案中，蛋白表达水平减少约30％。在一个实施方案中，蛋白表达水平减少约40％。在一个实施方案中，蛋白表达水平减少约50％。

在某些实施方案中，参照样品来自与生物学样品尽可能相似的组织类型，例如肿瘤细胞。在一些实施方案中，参照样品来自与生物学样品相同的受试者，例如来自与生物学样品来源区域接近的区域，或来自受试者对VEGF拮抗剂治疗敏感的时间点。在本发明的一个实施方案中，参照样品来自多个身体样品。例如，参照样品可以是来自以前测试的样品的表达模式的数据库，对于所述以前的测试样品，用VEGF拮抗剂进行的肿瘤敏感性治疗是已知的。

包含靶基因或生物标志的样品可以通过本领域公知的方法获得，并且适合于目的癌症的特定类型和定位。见定义部分。例如，癌性病灶的样品可以通过切除术、支气管镜检查法、细针抽吸活检、支气管刷检获得，或来自痰、胸膜液或血液。可以从癌症或肿瘤组织或从其它身体样品如尿液、痰液、血清或血浆中检测基因或基因产物。可以将上述关于检测癌性样品中的靶基因或基因产物所讨论的相同技术用于其它身体样品。癌细胞可以从癌症病灶脱落，并且出现在所述身体样品中。通过筛选这样的身体样品，对于这些癌症可以实现简单的早期诊断。此外，疗法的进程也可以通过测试所述身体样品的靶基因或基因产物更容易地监测。

富集癌细胞的组织制备物的方式是本领域已知的。例如，组织可以从石蜡或恒温箱切片分离。癌细胞也可以通过流式细胞术或激光捕获显微切割与正常细胞分离。这些技术，以及用于分离癌细胞和正常细胞的其它技术是本领域公知的。如果癌性组织被正常细胞高度污染，那么检测标志性的基因或蛋白表达图谱可能会较困难，尽管已知使污染和/或假阳性/假阴性结果降到最低程度的技术(其中一些在下面进行讨论)。例如，还可以对样品进行生物标志存在的评估，所述生物标志已知与目的癌细胞相关，但是与相应的正常细胞不相关，或反之亦然。

在某些实施方案中，使用免疫组织化学(“IHC”)和染色方法来检查样品的蛋白表达。组织切片的免疫组织化学染色显示是评估或检测样品中蛋白存在的可靠方法。免疫组织化学技术，通常通过生色法或荧光法，使用抗体原位探测和显现细胞抗原。

可以通过常规技术(见例如，“武装部队病理学研究所的组织学染色方法手册(Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology)，”第3版(1960)Lee G.Luna，HT(ASCP)编辑，McGraw-Hill Book公司Blakston分公司，纽约；武装部队病理学研究所：组织学和病理学的先进实验室方法(The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Method in Histology and Pathology)，(1994)Ulreka V.Mikel，编辑，武装部队病理学研究所(Armed Forces Institute of Pathology)，美国病理学登记处(American Registry of Pathology)，Washington，D.C.)对组织样品进行固定(即，保存)。技术人员将理解固定剂选择是根据样品进行组织学染色还是其它分析的目的来确定的。技术人员还将理解固定的长短取决于所用的组织样品的大小和固定剂。例如，可以将中性缓冲的福尔马林，布安溶液或低聚甲醛用于固定样品。

一般情况下，将样品首先固定，接着通过系列升高的醇进行脱水，渗透并用石蜡或其它可以使组织样品被切片的切片介质进行包埋。备选地，可以切割组织并且固定获得的切片。例如，可以将组织样品通过常规方法，在石蜡中包埋和处理(见例如，“武装部队病理学研究所的组织学染色方法手册(Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology)，上文)。可以使用的石蜡的实例包括，但不限于：Paraplast，Broloid，和Tissuemay。一旦组织样品被包埋，可以通过切片机等对样品进行切片(见，例如“武装部队病理学研究所的组织学染色方法手册(Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology)，上文)。作为这种方法的实例，切片的范围可以在约3微米到约5微米的厚度。一旦被切片，这些切片可以通过一些标准方法附于载玻片。载玻片胶黏剂的实例包括，但不限于：硅烷、明胶、聚-L-赖氨酸等。例如，可以将石蜡包埋的切片附于带正电荷的载玻片和/或用聚-L-赖氨酸包被的载玻片。

如果将石蜡用作包埋物质，那么通常对组织切片进行去石蜡(deparaffinize)并与水进行再水合。通过一些常规标准方法对组织切片进行去石蜡。例如，可以使用二甲苯和逐渐减少系列的醇(见，例如“武装部队病理学研究所的组织学染色方法手册(Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology)，上文)。备选地，可以使用商购的去石蜡非有机试剂如Hemo-De7(CMS，Houston，Texas)。

在某些实施方案中，样品制备后，可以使用IHC来分析组织切片。可以与其它的技术如形态学染色和/或荧光原位杂交结合进行IHC。可获得两种IHC通用方法；直接和间接测定法。根据第一种测定法，直接确定抗体与靶抗原的结合。这种直接测定法使用标记的试剂，如荧光标记或酶标记的初级抗体，其可以在没有进一步抗体相互作用的情况下显色。在典型的间接测定法中，未缀合的初级抗体结合于抗原并且接着，标记的次级抗体结合于初级抗体。如果所述次级抗体缀合于酶促标记，加入生色或荧光底物以提供抗原的显色。出现了信号放大，因为一些次级抗体可以与初级抗体上的不同表位反应。

用于免疫组织化学的初级抗体和/或次级抗体典型地用可检测的结构部分进行标记。可以获得许多标记，其通常被归为下面的类别中：

(a)放射性同位素，如³⁵S，¹⁴C，¹²⁵I，³H，和¹³¹I。抗体可以使用例如在当前的免疫学方法(Current Protocols in Immunology)，第1卷和第2卷，Coligen等.，编辑.Wiley-Interscience，纽约，New York Pubs.(1991)中所述的技术利用放射性同位素进行标记，并且可以使用闪烁计数法测量放射性。

(b)胶体金颗粒。

(c)荧光标记，包括，但不限于：稀土螯合物(铕螯合物)、德克萨斯红、罗丹明、荧光素、丹酰、丽丝胺、伞形酮、藻红蛋白、藻蓝蛋白或商购的荧光团如SPECTRUM ORANGE7和SPECTRUM GREEN7和/或上述任意一种或多种的衍生物。可以例如使用在当前免疫学方法(Current Protocols in Immunology)，见上文中公开的技术将荧光标记缀合于抗体。荧光可以使用荧光计来量化。

(d)可获得各种酶-底物标记并且美国专利号4,275,149提供其中一些的综述。酶通常催化可以使用各种技术测量的生色底物的化学变化。例如，酶可以催化底物的颜色变化，这可以通过分光光度计测量。备选地，酶可以改变底物的荧光或化学发光。用于量化荧光变化的技术如上所述。化学发光的底物通过化学反应被电激发，接着可以发射可测量(例如使用化学发光计)的光，或给荧光受体提供能量。酶促标记的实例包括萤光素酶(例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶，美国专利号4,737,456)、萤光素、2，3-二氢酞嗪二酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶如辣根过氧化物酶(HRPO)、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如，葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶)、杂环氧化酶(如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶)、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。用于将酶缀合于抗体的技术在O′Sullivan等，制备用于酶免疫测定法中的酶-抗体缀合物的方法(Mehods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay)，酶学方法(Method in Enzym)中.(J.Langone&H.Van Vunakis编辑)，学术出版社，纽约，73：147-166(1981)记载。

酶-底物组合的实例包括，例如：

(i)辣根过氧化物酶(HRPO)，以过氧化氢酶作为底物，其中过氧化氢酶氧化染料前体(例如，邻苯二胺(orthophenylene diamine)(OPD)或3，3′，5，5′-四甲基联苯胺盐酸盐(TMB))；

(ii)碱性磷酸酶(AP)，以对-硝基苯基磷酸酯作为生色底物；和

(iii)β-D-半乳糖苷酶(β-D-Gal)与生色底物(例如，对-硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶)或荧光底物(例如，4-甲基umbelliferyl-β-D-半乳糖苷酶)。

许多其它的酶-底物组合是本领域技术人员可获得的。关于这些的一般综述见美国专利号4,275,149和4,318,980。有时，所述标记可以间接与抗体缀合。技术人员知道实现所述缀合的各种技术。例如，抗体可以与生物素缀合并且上述四种广泛种类的标记的任一种可以与抗生物素蛋白缀合，或反之亦然。生物素选择性地结合抗生物素蛋白，并且因此，所述标记可以以这种间接的方式与抗体缀合。备选地，为了获得标记与抗体的间接缀合，所述抗体与小的半抗原缀合，并且上述不同类型的标记之一与抗-半抗原抗体缀合。由此，可以实现标记与抗体的间接缀合。

除了上述讨论的样品制备方法外，在IHC之前、过程中或之后进行组织切片的进一步处理可能也是需要的。例如，可以进行表位修复方法(epitope retrieval method)，如在柠檬酸盐缓冲液中加热组织样品(见，例如，Leong等.应用免疫组织化学(Appl.Immunohistochem.)4(3)：201(1996))。

在任选的封闭步骤后，在充足的时间阶段内和适合的条件下，将组织切片暴露于初级抗体，从而使初级抗体结合于组织样品中的靶蛋白抗原。用于实现所述结合的适合的条件可以通过常规实验确定。通过使用上述讨论的任一种可检测标记来确定抗体与样品结合的程度。在某些实施方案中，标记是催化生色底物如3，3’-二氨基联苯胺色素原的化学变化的酶促标记(例如HRPO)。在一个实施方案中，酶促标记缀合于特异性结合于初级抗体的抗体(例如，初级抗体是兔多克隆抗体并且次级抗体是山羊抗-兔抗体)。

由此制备的样本可以被封固并且用载玻片盖上。接着，例如使用显微镜确定载玻片评估，并且可以使用常规用于本领域的染色强度标准。可以如下评价染色强度标准：

表1

在一些实施方案中，约1+或更高的染色模式评分是诊断的和/或预后的。在某些实施方案中，在IHC测定法中约2+或更高的染色模式评分是诊断的和/或预后的。在其它实施方案中，约3以上的染色模式评分是诊断的和/或预后的。在一个实施方案中，要理解当使用IHC检查来自肿瘤或结肠腺瘤的细胞和/或组织时，染色通常在肿瘤细胞和/或组织中确定或评估(相对于可以在样品中存在的基质或周围组织)。

在备选方法中，样品可以在足以形成抗体-生物标志复合物的条件下与特异于所述生物标志的抗体接触，接着检测所述复合物。可以以多种方式，如通过测定多种组织和样品，包括血浆或血清的蛋白质印迹法和ELISA方法检测生物标志的存在。使用这样的测定形式的多种免疫测定技术见，例如，美国专利号4,016,043，4,424,279和4,018,653。这些包括非竞争类型的单点和两点或“夹心式”测定法，以及传统的竞争结合测定法。这些测定法还包括将标记的抗体直接结合于靶生物标志。

夹心式测定法是最有效和常用的测定法之一。存在夹心式测定法技术的许多变化，并且所有的变化都意欲涵盖在本发明中。简言之，在典型的正向测定法中，将未标记的抗体固定在固体基底上，并且使待测试的样品与结合的分子接触。在适合的温育阶段(足以形成抗体-抗原复合物的时间段)后，接着加入特异于抗原，并且用能够产生可检测信号的报道分子标记的第二抗体并进行温育，温育时间足以形成另一种抗体-抗原标记的抗体的复合物。任何未反应的物质被洗去，并且通过观察由报道分子产生的信号来确定抗原的存在。该结果可以是定性的，通过简单观察可视的信号进行，或可以是定量的，通过与包含已知量的生物标志的对照样品比较进行。

正向测定法的变化包括同时测定法，其中将样品和标记的抗体同时加入至结合的抗体。这些技术是本领域技术人员公知的，包括任何显而易见的微小变化。在典型的正向夹心式测定法中，特异于生物标志的第一抗体共价地或被动地结合于固体表面。固体表面典型地是玻璃的或聚合物的，最常用的聚合物是纤维素、聚丙烯酰胺、尼龙、聚苯乙烯、聚乙烯氯或聚丙烯。固体支持物可以以试管、珠、微型板的盘形式存在，或可以是适合于进行免疫测定法的任何其它表面。结合方法是本领域公知的并且通常由交联共价结合或物理吸附组成，聚合物-抗体复合物在测试样品的制备中进行洗涤。接着，将待测试的样品的等分试样加入固相复合物并以充足的时间阶段(例如2-40分钟或过夜，如果更方便的话)和在适合的条件(例如从室温-40℃，如25℃-32℃，包括端点)下温育从而允许抗体中存在的任何亚基的结合。在温育阶段后，洗涤抗体亚基固相并且干燥，与特异于生物标志的一部分的第二抗体一起温育。所述第二抗体连接于报道分子，所述报道分子用于指示第二抗体与分子标志的结合。

备选方法包括将靶生物标志固定在样品中，并且接着将固定的靶标暴露于可以或可以不用报道分子标记的特异性抗体。根据靶标的量和报道分子信号的强度，结合的靶标可以通过用抗体直接标记进行检测。备选地，将特异于第一抗体的第二标记抗体暴露于靶标-第一抗体复合物以形成靶标-第一抗体-第二抗体的三级复合物。复合物通过由报道分子发射的信号检测。所谓“报道分子”，在本发明中使用时，意为通过其化学性质提供在分析上可鉴定的信号的分子，所述信号允许检测抗原结合的抗体。在这种类型的测定法中的最常用的报道分子是酶、荧光团或包含放射性核素的分子(即，放射性同位素)和化学发光分子。

在酶免疫测定法的情形中，酶通常通过戊二醛或高碘酸的方式缀合于第二抗体。然而，如容易意识到的，存在多种技术人员容易得到的不同的缀合技术。常用的酶特别包括辣根过氧化物酶、葡糖氧化酶、-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶。通常对特定的酶所用的底物进行选择，从而在由相应的酶水解后，用于产生可检测的颜色变化。适合的酶的实例包括碱性磷酸酶和过氧化物酶。也可以使用荧光底物，其产生荧光产物而不是上述生色底物。在所有的情形中，将酶-标记的抗体加入第一抗体-分子标志复合物，进行结合，接着洗去过量的试剂。随后，将包含适合的底物的溶液加入抗体-抗原-抗体的复合物中。底物将与连接第二抗体的酶反应，提供定性的视觉信号，这还可以进一步量化(通常通过分光光度测定法)，从而提供关于样品中存在的生物标志的量的指示。或者，可以将荧光化合物，如荧光素和罗丹明化学偶联于抗体而不改变它们的结合能力。当通过用特定波长的光照明来激活时，荧光染料标记的抗体吸收光能量，诱导分子中的激发状态，随后发射在特征色的光，所述特征色可以用光学显微镜视觉检测。当在EIA中时，允许荧光标记的抗体结合于第一抗体-分子标志复合物。在洗去未结合的试剂后，接着使剩余的三级复合物暴露于适当波长的光，观察到的荧光指示目的分子标志的存在。免疫荧光和EIA技术都是本领域中充分建立的。然而，也可以使用其它的报道分子，如放射性同位素、化学发光或生物发光分子。

预期上述技术也可以用于检测一种或多种靶基因的表达。

本发明的方法还包括检查组织或细胞样品中一种或多种靶基因的mRNAs的存在和/或表达的方法。用于评价细胞中的mRNAs的方法是公知的，并且包括，例如使用互补DNA探针的杂交测定法(如使用特异于一种或多种基因的标记的核糖核酸探针的原位杂交，所述基因包括，但不限于：S100A8，S100A9，Tie-1，Tie-2，CD31，CD34，VEGFR1，VEGFR2，PDGFC，IL-1β，PlGF，HGF，IL-6，和LIF，RNA印迹和相关技术)和各种核酸扩增测定法(如使用特异于一种或多种基因的互补引物的RT-PCR和其它扩增类型的检测方法，如，例如分支DNA、SISBA、TMA等)。

可以使用RNA印迹法、斑点杂交或PCR分析方便地测定哺乳动物的组织或细胞样品的mRNA。例如，RT-PCR测定法，如定量PCR测定法是本领域中公知的。在本发明的举例说明的实施方案中，用于检测生物样品中的靶mRNA的方法包括通过使用至少一种引物的反转录从样品中产生cDNA；使用靶多核苷酸作为有义和反义引物扩增这样产生的cDNA以扩增其中的靶cDNA；和检测扩增的靶cDNA的存在。此外，所述方法可以包括使技术人员确定靶mRNA在生物学样品中的水平的一个或多个步骤(例如，通过同时检查“持家”基因如肌动蛋白家族成员的比较对照mRNA序列的水平)。任选地，可以确定扩增的靶cDNA的序列。

本发明的任选方法包括通过微阵列技术检查或检测组织或细胞样品中的mRNA，如靶mRNA的方法。使用核酸微阵列，对来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA样品进行反转录和标记以产生cDNA探针。所述探针接着与固定在固体支持物上的核酸阵列杂交。对所述阵列进行构造从而使阵列的每个成员的序列和定位是已知的。例如，可以将其表达与检测不依赖VEGF的肿瘤相关的基因选择物排列在固体支持物上。标记的探针与特定的阵列成员的杂交指示探针来自其中的样品表达该基因。疾病组织的差别基因表达分析可以提供有价值的信息。微阵列技术使用核酸杂交技术和计算机技术来在单一实验中评价数千基因的mRNA表达图谱(见，例如，在2001年10月11日公开的WO 01/75166)；(见例如，U.S.5,700,637，美国专利5,445,934，和美国专利5,807,522，Lockart，自然生物技术(Nature Biotechnology)，14：1675-1680(1996)；Cheung，V.G.等.，自然遗传学(Nature Genetics)21(增刊)：15-19(1999)，关于阵列制作的讨论)。DNA微阵列是包含基因片段的微型阵列，所述基因片段直接合成在或点样到玻璃或其它基底上。数千基因通常在单一阵列中展示。典型的微阵列实验包括下列步骤：1)制备从样品分离的RNA的荧光标记的靶标，2)将标记的靶标与微阵列杂交，3)洗涤、染色和扫描阵列，4)分析扫描的图像和5)产生基因表达图谱。目前使用两种主要类型的DNA微阵列：寡核苷酸(通常是25-70mers)阵列和包含从cDNAs制备的PCR产物的基因表达阵列。在形成阵列时，寡核苷酸可以是预制的并且点样到表面上或直接合成到所述表面上(原位)。

Affymetrix GeneChip

系统是商购的微阵列系统，其包括通过直接在玻璃表面上合成寡核苷酸而制备的阵列。探针/基因阵列：通常为25mers的寡核苷酸通过基于半导体的照相平版印刷术和固相化学合成技术的组合直接合成到玻璃板(glass wafer)上。每个阵列包含多到400,000个不同的低聚物，并且每种低聚物以百万个拷贝存在。由于寡核苷酸探针在阵列上的已知位置合成，杂交模式和信号强度可以由Affymetrix Microarray Suite软件，根据基因特性和相对表达水平进行解释。每个基因通过一系列不同的寡核苷酸探针展示在阵列上。每个探针对由完全匹配的寡核苷酸和错配的寡核苷酸组成。完全匹配的探针具有完全互补于特定基因并由此测量该基因表达的序列。错配的探针与完全匹配的探针不同之处在于中心碱基位置的单一碱基置换，所述碱基替代干扰了靶基因转录物的结合。这有助于确定背景杂交和非特异性杂交，其有助于关于完全匹配的低聚物所测量的信号。Microarray Suite软件将错配探针的杂交强度从完全匹配的探针的杂交强度中扣除从而确定关于每个探针组的绝对或特定强度值。基于目前来自Genbank和其它核苷酸所有组成成分(repositories)的信息选择探针。认为所述序列识别基因的3’端的独特区域。将基因芯片杂交炉(“rotisserie”烘箱)用于同时进行多到64个阵列的杂交。流控站进行探针阵列的洗涤和染色。所述流控站是完全自动化的并且包含四个组件，其中每个组件控制一个探针阵列。每个组件通过使用预先编程流控流程的Microarray Suite软件独立控制。扫描器是共焦激光荧光扫描器，其测量由结合于探针阵列的标记的cRNA发射的荧光强度。具有Microarray Suite软件的计算机工作站控制流控站和扫描器。Microarray Suite软件可以控制多到8个流控站，所述流控站使用预先编程的关于探针阵列的杂交、洗涤和染色流程。软件还获得杂交强度数据，并使用适合的算法将所述杂交强度数据转化为每个基因的存在/不存在。最终，软件通过比较分析检测实验之间基因表达的变化并将输出格式化为.txt文件，这可以用于其它的软件程序进行进一步的数据分析。

选定的基因或生物标志在组织或细胞样品中的表达也可以通过功能性测定法或基于活性的测定法进行检查。例如，如果生物标志是酶，那么可以进行本领域已知的测定法来确定或检测给定的酶促活性在组织或细胞样品中的存在。

治疗应用

预期：根据本发明，将调节剂，例如URVIP的拮抗剂，和/或由URVINA编码的蛋白的拮抗剂(在本文统称为“本发明的拮抗剂”)，用于抑制不依赖VEGF的肿瘤的癌细胞或肿瘤生长。在本发明的某些实施方案中，将调节剂，例如DRVIP的激动剂和/或由DRVINA编码的蛋白的激动剂(统称为“本发明的激动剂”)用于抑制不依赖VEGF的肿瘤的癌细胞或肿瘤生长。预期：根据本发明，还可以将本发明的拮抗剂用于抑制肿瘤的转移。在某些实施方案中，将一种或多种调节剂用于治疗各种赘生物或非赘生性病况。在某些实施方案中，可以将VEGF拮抗剂与本发明的拮抗剂，和/或本发明的激动剂一起施用以抑制不依赖VEGF的肿瘤的癌细胞或肿瘤生长。还见本文题为组合疗法的部分。在另一个实施方案中，可以将一种或多种抗癌剂与VEGF拮抗剂的组合与本发明的拮抗剂和/或本发明的激动剂一起施用从而抑制不依赖VEGF的肿瘤的癌细胞或肿瘤生长。

在某些实施方案中，本发明的拮抗剂是c-Met拮抗剂。在某些实施方案中，用于本发明方法中的c-Met拮抗剂包括特异性结合c-Met的多肽、抗-c-Met抗体、c-Met小分子、特异性结合于c-Met的受体分子和衍生物，以及融合蛋白。c-Met拮抗剂还包括c-Met多肽的拮抗性变体、RNA适配体和针对c-Met和HGF的肽体。用于本发明方法中作为c-Met拮抗剂的还包括抗-HGF抗体、抗-HGF多肽、c-Met受体分子和特异性结合HGF的衍生物。这些中的每个的实例在下面描述。

用于本发明方法中的抗-c-Met抗体包括这样的任何抗体，其以充分的亲和性和特异性结合于c-Met并且可以减少或抑制c-Met活性。选定的抗体在通常情况下具有足够强的关于c-Met的结合亲和性，例如，所述抗体可以以100nM-1pM之间的Kd值结合人c-Met。例如，抗体亲和性可以通过基于表面等离子体共振的测定法(如在PCT申请公开号WO2005/012359中所述的BIAcore测定法)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争性测定法(例如RIA’s)确定。在一个实施方案中，可以将本发明的抗-c-Met抗体用作靶向和干扰其中涉及c-Met/HGF活性的疾病和病况(包括治疗不依赖VEGF的肿瘤)的治疗剂。此外，例如可以对抗体进行其他的生物学活性测定法，从而评估其作为治疗剂的功效。所述测定法在本领域中是已知的并且取决于靶抗原和所述抗体意欲的应用。

抗-c-Met抗体在本领域中是已知的(见，例如，Martens，T，等(2006)临床癌症研究(Clin Cancer Res)12(20 Pt 1)：6144；US 6,468,529；WO2006/015371；WO2007/063816)。

在其它实施方案中，所述抗-c-Met抗体是由在美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)以登记号ATCC HB-11894(杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895(杂交瘤5D5.11.6)保藏的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体。在其它的实施方案中，所述抗体包含一种或多种由以美国典型培养物保藏中心登记号ATCC HB-11894(杂交瘤1A3.3.13)或HB-11895(杂交瘤5D5.11.6)保藏的杂交瘤细胞系产生的单克隆抗体的CDR序列。

在其它实施方案中，本发明的c-Met抗体特异性结合c-Met Sema结构域的至少一部分或其变体。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂抗体特异性结合由至少一种这样的序列的部分或全部形成的构象表位，所述序列选自由下列各项组成的组中：LDAQT(例如，c-Met的残基269-273，SEQ ID NO：24)，LTEKRKKRS(例如，c-Met的残基300-308，SEQ ID NO：24)，KPDSAEPM(例如，c-Met的残基350-357，SEQ ID NO：24)和NVRCLQHF(例如，c-Met的残基381-388，SEQ ID NO：24)。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂抗体特异性结合与序列LDAQT，LTEKRKKRS，KPDSAEPM和/或NVRCLQHF具有至少50％，60％，70％，80％，90％，95％，98％序列同一性或类似性的氨基酸序列。

抗-HGF抗体是本领域中公知的。见，例如，Kim KJ，等.临床癌症研究(Clin Cancer Res.)(2006)12(4)：1292-8；WO2007/115049。

可以将特异性结合HGF的C-Met受体分子或其片段用于本发明的方法中，例如用于结合并螯合HGF蛋白，由此阻止其进行信号传导。在某些实施方案中，c-Met受体分子，或其HGF结合片段是可溶性形式。在一些实施方案中，受体的可溶性形式通过结合HGF发挥对于c-Met蛋白的生物学活性的抑制效果，由此阻止其结合存在于靶细胞表面上的其天然受体。还包括c-Met受体融合蛋白，其实例如下所述。

本发明的可溶性c-Met受体蛋白或嵌合c-Met受体蛋白包括没有通过跨膜结构域固定在细胞表面上的c-Met受体蛋白。象这样，c-Met受体的可溶性形式，包括嵌合受体蛋白，尽管能够结合HGF并使其失活，但不包括跨膜结构域并且由此通常不与表达所述分子的细胞的细胞膜相关。见，例如，Kong-Beltran，M等.，癌细胞(Cancer Cell)(2004)6(1)：75-84。

可以将特异性结合c-Met并封闭或减少c-Met的激活，由此阻止其进行信号传导的HGF分子或片段用于本发明的方法中。

适配体是形成与靶分子(如HGF多肽)特异性结合的三级结构的核酸分子。适配体的产生和治疗性应用是本领域中充分建立的。见，例如，美国专利号5,475,096。HGF适配体是聚乙二醇化修饰的寡核苷酸，其采用能够使其结合于细胞外HGF的三维构象。关于适配体的另外的信息可以见于美国专利申请公开号20060148748。

肽体是连接于编码免疫球蛋白分子的片段或部分的氨基酸序列的肽序列。多肽可以衍生自通过特异性结合的任何方法选择的随机序列，所述方法包括，但不限于：噬菌体展示技术。在某些实施方案中，可以将选定的多肽连接于编码免疫球蛋白的Fc部分的氨基酸序列。还将特异性结合并拮抗HGF或c-Met的肽体用于本发明的方法中。

C-Met拮抗剂包括小分子，如已经报道的c-Met抑制剂中的化合物(US 5,792,783；US 5,834,504；US 5,880,141；US 6,297,238；US 6,599,902；US6,790,852；US 2003/0125370；US 2004/0242603；US 2004/0198750；US 2004/0110758；US 2005/0009845；US 2005/0009840；US 2005/0245547；US 2005/0148574；US 2005/0101650；US 2005/0075340；US 2006/0009453；US 2006/0009493；WO 98/007695；WO 2003/000660；WO 2003/087026；WO 2003/097641；WO 2004/076412；WO 2005/004808；WO 2005/121125；WO 2005/030140；WO 2005/070891；WO 2005/080393；WO 2006/014325；WO 2006/021886；WO 2006/021881，WO 2007/103308)。PHA-665752是小分子，一种ATP-竞争性的，c-Met的催化活性以及多种肿瘤细胞的表型如细胞生长、细胞运动性、侵入和形态的活性位点抑制剂(Ma等(2005)临床癌症研究(Clin.Cancer Res.)11：2312-2319；Christensen等(2003)癌症研究(Cancer Res).63：7345-7355)。

组合疗法

如上所述，本发明提供了组合疗法，其中VEGF拮抗剂与另一种疗法组合施用。例如，在某些实施方案中，VEGF拮抗剂与本发明的不同药剂或拮抗剂(和/或本发明的激动剂)组合施用来治疗不依赖VEGF的肿瘤如对VEGF拮抗剂治疗有抗性的肿瘤。在某些实施方案中，其它药剂(例如抗癌症剂或治疗剂、或抗血管发生剂)也可以与VEGF拮抗剂和本发明的不同拮抗剂组合施用来治疗多种赘生性或非赘生性病况。在一个实施方案中，所述赘生性或非赘生性病况的特征在于与针对VEGF拮抗剂治疗有抗性的异常或不良血管发生有关的病理性疾病。本发明的拮抗剂可以与对那些目的有效的另一种药剂连续地或组合地施用，或是在同一组合物中或是作为使用相同或不同的施用路径的分开的组合物。备选地/另外地，可以施用本发明的多种拮抗剂、药剂和/或激动剂。

在某些实施方案中，范围从数分钟到数天、到数周、到数月的间隔可以存在于两个或多个组合物的施用之间。例如，可以先施用VEGF拮抗剂，接着施用不同的拮抗剂或药剂。然而，还涵盖同时施用或先施用本发明的不同的拮抗剂或药剂。

与VEGF拮抗剂组合施用的治疗剂的有效量将处于医师或兽医的判断之内。进行剂量施用和调整来实现待治疗病况的最大管理。剂量将另外取决于这些因素，诸如待使用的治疗剂的类型和所治疗的特定的患者。VEGF拮抗剂的合适剂量就是当前使用的那些，而且由于VEGF拮抗剂和本发明的不同拮抗剂的组合作用(协同作用)可以降低。在某些实施方案中，抑制剂的组合强化了单一抑制物的效力。术语“强化”是指在其常用的或批准的剂量下治疗剂的效力方面的改善。还参见本文中标题为药物组合物的部分。

与癌症相关的抗生血管疗法是一种癌症治疗策略，针对抑制肿瘤血管的发育，肿瘤血管是提供营养物以支持肿瘤生长所需的。在某些实施方案中，由于血管发生牵涉原发性肿瘤生长和转移二者，本发明所提供的抗生血管治疗能够抑制肿瘤在原发位点的赘生性生长以及预防肿瘤在继发位点的转移，因而容许用其它治疗剂攻击肿瘤。在本发明的一个实施方案中，抗癌剂或治疗剂是抗生血管药剂。在另一个实施方案中，抗癌剂是化疗剂。

许多抗生血管药剂已经被鉴定并且是本领域已知的，包括本文中列出的那些，例如在定义中列出的，以及由例如Carmeliet和Jain，自然(Nature)407：249-257(2000)；Ferrara等，自然综述：药物开发(Nature Reviews：Drug Discovery)3：391-400(2004)；及Sato，Int.J.Clin.Oncol.8：200-206(2003)所列出的。还参见美国专利申请US20030055006。在一个实施方案中，组合使用本发明的拮抗剂与抗VEGF中和性抗体(或片段)和/或另一种VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂，包括但不限于例如可溶性VEGF受体(例如VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、神经毡蛋白(例如NRP1、NRP2))片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适配体、中和性抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶(RTK)的低分子量抑制剂、针对VEGF的反义策略、针对VEGF或VEGF受体的核酶、VEGF的拮抗剂变体；以及它们的任何组合。备选地或另外地，在VEGF拮抗剂和其他本发明药剂之外，两种或更多血管发生抑制剂可以任选地共同施用于患者。在某些实施方案中，一种或多种别的治疗剂(例如抗癌剂)可以与本发明的药剂、VEGF拮抗剂和/或抗血管发生剂组合施用。

在本发明的某些方面，可用于使用本发明拮抗剂的组合肿瘤治疗的其它治疗剂包括其它癌症疗法(例如手术、放射治疗(例如涉及辐射或施用放射性物质)、化学疗法、使用本文所列的和本领域已知的抗癌剂的治疗、或其组合)。备选地或另外地，结合本文公开的相同的或两种或更多不同的抗原的两种或更多抗体可以共同施用于患者。有时，可能有益的是还向患者施用一种或多种细胞因子。

化疗剂

在某些方面，本发明提供了阻断或降低不依赖VEGF的肿瘤生长或癌细胞的生长的方法，其通过向易患癌症或诊断有癌症的患者施用有效量的VEGF拮抗剂和本发明的拮抗剂以及一种或多种化疗剂。多种化疗剂可以在本发明的组合治疗方法中使用。所涵盖的化疗剂的例示性的和非限制性的列表在本文“定义”部分中提供。

本领域普通技术人员将理解的是，适合剂量的化疗剂一般将接近临床疗法中所早就采用的那些，在所述临床疗法中化疗剂被单独地或与其它化疗剂组合地施用。剂量的变化将有可能存在，这取决于所治疗的病况。施行治疗的医师将能够确定各个受试者的适合剂量。

复发性肿瘤生长

本发明还提供了用于抑制或预防复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法和组合物。复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长用于描述这样一种状况，其中正在接受一种或多种当前可用疗法或者用一种或多种当前可用疗法(例如癌症疗法，诸如化疗、放疗、手术、激素疗法和/或生物学疗法/免疫疗法、抗VEGF抗体疗法，特别是针对特定癌症的标准治疗方案)治疗过的患者是在临床上不适合治疗该患者，或者该患者不再从治疗中接受任何有益效果，使得这些患者需要别的有效疗法。在用于本文时，该用语也可以指“非反应性/不应性”患者的状况，例如这描述了对治疗有响应但遭遇副作用的患者、发生抗性的患者、对治疗不响应的患者、对治疗的响应不令人满意的患者等。在各种实施方案中，当癌细胞的数目没有显著减少或癌细胞的数目增加了，或者肿瘤的大小没有显著缩小或肿瘤的大小增大了，或者癌细胞的数目或大小未能进一步减少或缩小时，则癌症是复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长。癌细胞是否是复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的确定可以通过用于分析治疗对癌细胞的有效性的本领域已知的任何方法、在体内或在体外进行，在上下文中使用“复发性”或“难治的”或“非反应性”的本领域接受的含义。针对抗VEGF治疗有抗性的不依赖VEGF的肿瘤是复发性肿瘤生长的实例。

本发明提供了阻断或降低受试者中复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法，其通过施用本发明的一种或多种拮抗剂来阻断或降低所述受试者中的复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长。在某些实施方案中，所述拮抗剂可以在癌症治疗剂之后施用。在某些实施方案中，本发明的拮抗剂与癌症治疗(例如化疗)同时地施用。备选地或另外地，拮抗剂治疗与另一种癌症治疗交替，其可以以任何次序进行。本发明还涵盖施用一种或多种抑制性抗体来抑制倾向于患上癌症的患者中癌症的发作或复发的方法。一般而言，所述受试者已经或正在接受癌症治疗。在一个实施方案中，所述癌症治疗是使用抗血管发生剂(例如VEGF拮抗剂)的治疗。抗血管发生剂包括本领域已知的那些和本文定义部分中所见的那些。在一个实施方案中，所述抗血管发生剂是抗VEGF中和性抗体或片段(例如人源化A4.6.1，AVASTIN

(Genentech，South San Francisco，CA)、Y0317、M4、G6、B20、2C3等)。参见例如美国专利6,582,959、6,884,879、6,703,020；WO98/45332；WO 96/30046；WO94/10202；EP 0666868B1；美国专利申请20030206899，20030190317，20030203409和20050112126；Popkov等，免疫学方法杂志(Journal of Immunological Methods)288：149-164(2004)；及WO2005012359。另外的药剂可以与VEGF拮抗剂和本发明拮抗剂激动剂组合施用，用于阻断或降低复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长，例如参见本文中标题为组合疗法的部分。

在一个实施方案中，本发明的拮抗剂或降低URVIPs的表达或由URVINAs编码的蛋白的其它治疗剂被施用来反转癌细胞对某些生物学的(例如拮抗剂，其是抗VEGF抗体)、激素的、放射的或化学治疗的药剂的抗性或降低的敏感性，从而使所述癌细胞对一种或多种这些药剂重新敏感，其然后可以被施用(或继续施用)来治疗或管理癌症，包括预防转移。抗体

在某些实施方案中，本发明的抗体包括本发明蛋白质的抗体和本发明蛋白质的抗体的抗体片段。本发明的多肽或蛋白质包括但不限于VEGF、IL-1β、PlGF、HGF、IL-6、LIF、S100A8、S100A9和由URVINA和DRVINA编码的多肽。在一个实施方案中，本发明的蛋白来自不依赖VEGF的肿瘤并包括例如IL-1β、PlGF、HGF、S100A8、S100A9、IL-6、和LIF。

在某些方面中，本发明的多肽或蛋白包括针对VEGF、IL-1β、PlGF、HGF、S100A8、S100A9、IL-6、LIF或c-Met的抗体。在某些实施方案中，本发明的抗体包括URVIPs和DRVIPs的抗体，和由URVINAs或DRVINAs编码的蛋白的抗体。

本发明的抗体进一步包括作为抗血管发生剂或血管发生抑制剂的抗体，作为抗癌剂的抗体，或本文所述其它抗体。例示性的抗体包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、抗体片段、多特异性抗体、异源偶联抗体(heteroconjugate antibody)、多价抗体、效应子功能的抗体等。

多克隆抗体

本发明的抗体可以包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是熟练技术人员知道的。例如，针对本发明抗体的多克隆抗体通过在动物中一次或多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来产生。使用双功能或衍生化药剂(例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基缀合)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl₂、或R¹N＝C＝NR(其中R和R¹是不同的烷基))将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白质(例如匙孔血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)缀合可能是有用的。

通过将例如100μg或5μg蛋白质或缀合物(分别用于兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对本发明的分子、免疫原性缀合物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽或缀合物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateau)。典型的是，将动物用相同抗原但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂缀合得到的缀合物进行加强免疫。缀合物还可在重组细胞培养中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂(诸如明矾)来增强免疫应答。

单克隆抗体

针对本文所述抗原的单克隆抗体可以使用最初由Kohler等，自然(Nature)256：495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利号4,816,567)来制备。

在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物(诸如仓鼠或短尾猴(macaque monkey))以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，单克隆抗体：原理和实践(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，第59-103页，学术出版社，1986)。

将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基典型的含有一种或多种抑制未融合的母体骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，若母体骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。

典型的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基的培养基敏感的。在这些骨髓瘤细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collecti on，Rockville，Maryland，USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已记载用于生成人单克隆抗体(Kozbor，免疫学杂志(J.Immunol.)133：3001(1984)；Brodeur等，单克隆抗体产生技术和应用(Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications)，第51-63页，Marcel Dekker，Inc.，纽约，1987)。

对杂交瘤细胞正在其中生长的培养基测定针对例如IL-1β、PlGF、HGF、PDGFC、IL-6、LIF、S100A8、S100A9、c-Met、URVIP、或DRVIP、或血管发生分子的单克隆抗体的生成。可通过免疫沉淀或通过体外结合测定法(诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA))测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。此类技术和测定法是本领域知道的。单克隆抗体的结合亲和性可通过例如Munson和Pollard，Anal.Biochem.107：220(1980)的Scatchard分析来测定。

在鉴定到生成具有期望特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释方法进行亚克隆并通过标准方法进行培养(Goding，单克隆抗体：原理和实践(Monoclonal Antibodies：Principles and Practice)，第59-103页，学术出版社，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。

通过常规免疫球蛋白纯化方法(诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。单克隆抗体还可以通过重组DNA方法来制备，诸如美国专利号4,816,567中所记载的。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规方法分离和测序(例如通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞可充当此类DNA的来源。一旦分离，可将DNA置入表达载体，然后将该表达载体转染入不另外生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞(诸如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。抗体的重组生产在下文中有更详细的描述。

在另一个实施方案中，可以从使用McCafferty等，自然(Nature)348：552-554(1990)所记载的技术构建的噬菌体抗体库分离抗体或抗体片段。Clackson等，自然(Nature)352：624-628(1991)和Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：581-597(1991)分别记载了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物记载了通过链改组(Marks等，生物/技术(Bio/Technology)10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse等，核酸研究(Nuc.Acids Res.)21：2265-2266(1993))，生成高亲和性(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。

还可以修饰DNA，例如通过用人重链和轻链恒定结构域的编码序列置换同源鼠序列(美国专利号4,816,567；Morrison等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)81：6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价连接。

典型的是，用此类非免疫球蛋白多肽置换抗体的恒定域，或者用它们置换抗体的一个抗原结合位点的可变结构域，以产生嵌合二价抗体，其包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。

人源化抗体和人抗体

本发明的抗体可以包括人源化抗体或人抗体。人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们典型的取自“输入”可变结构域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法(Jones等，自然(Nature)321：522-525(1986)；Riechmann等，自然(Nature)332：323-327(1988)；Verhoeyen等，科学(Science)239：1534-1536(1988))，通过用啮齿类CDR或CDR序列置换人抗体的相应序列进行。因而，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利号4,816,567)，其中基本上少于整个人可变结构域用来自非人物种的相应序列置换。在实践中，人源化抗体典型的是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基置换的人抗体。

用于构建人源化抗体的人可变结构域(包括轻链和重链二者)的选择对于降低抗原性非常重要。依照所谓的“最适”(best-fit)方法，用啮齿类抗体的可变结构域序列对已知的人可变结构域序列的整个文库进行筛选。然后接受与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人构架(FR)(Sims等，免疫学杂志(J.Immunol.)151：2296(1993)；Chothia等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定构架。同一构架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad Sci.USA)89：4285(1992)；Presta等，免疫学杂志(J.Immunol.)151：2623(1993))。

更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和性及其它有利的生物学特性。为了实现这一目标，依照一种典型的方法，通过使用母体和人源化序列的三维模型分析母体序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是公众可获得的，且为本领域技术人员所熟悉。可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗体特征。一般而言，CDR残基直接且最实质的参与影响对抗原的结合。

或者，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(J_H)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移人种系免疫球蛋白基因阵列将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：2551(1993)；Jakobovits等，自然(Nature)362：255-258(1993)；Bruggermann等.，Year in Immuno.7：33(1993)；及Duchosal等自然(Nature)355：258(1992)。人抗体也可以衍生自噬菌体展示文库(Hoogenboom等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，227：381(1991)；Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)，222：581-597(1991)；Vaughan等自然生物技术(Nature Biotech)14：309(1996))。

人抗体还可以使用本领域已知的多种技术来生产，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom和Winter，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)227：381(1991)；Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：581(1991))。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆入丝状噬菌体(诸如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以多种形式进行，综述参见例如Johnson，K S和Chiswell，D J.，结构生物学的当前观点(Cur Opin in Struct Biol)3：564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。例如，Clackson等，自然(Nature)352：624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。例如通过基本上遵循Marks等，分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)222：581-597(1991)或Griffith等，EMBO J.12：725-734(1993)记载的技术，可以自未免疫人供体构建V基因全集和分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利号5,565,332和5,573,905。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole等，单克隆抗体和癌症治疗(Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy)，Alan R.Liss，p.77(1985)及Boerner等，免疫学杂志(J.Immunol.)147(1)：86-95(1991))。还可以由体外激活的B细胞来生成人抗体(参见美国专利号5,567,610和5,229,275)。

抗体片段

本发明还包括抗体片段。已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等，生物化学和生物物理方法杂志(Journal of Biochemical and Biophysical Methods)24：107-117(1992)；Brennan等，科学(Science)229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可从上文讨论的噬菌体抗体文库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab’-SH片段并化学偶联以形成F(ab’)₂片段(Carter等，生物/技术(Bio/Technology)10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab’)₂片段。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；美国专利号5,571,894；及美国专利号5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型；如此，它们适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以产生效应器蛋白质在sFv的氨基或羧基末端的融合。参见抗体改造(Antibody Engineering)，Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。

多特异性抗体(例如双特异性的)

本发明的抗体还包括例如多特异性抗体，其具有对至少两种不同抗原的结合特异性。尽管此类分子通常只会结合两种抗原(即双特异性抗体，BsAb)，但是此表述在用于本文时涵盖具有额外特异性的抗体，诸如三特异性抗体。BsAb的实例包括一个臂针对肿瘤细胞抗原而另一个臂针对细胞毒性触发分子的BsAb，诸如抗FcγRI/抗CD15、抗p185^HER2/FcγRIII(CD16)、抗CD3/抗恶性B细胞(1D10)、抗CD3/抗p185^HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗肾细胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗结肠癌)、抗CD3/抗黑色素细胞刺激激素类似物、抗EGF受体/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神经细胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗叶酸结合蛋白(FBP)/抗CD3、抗泛癌相关抗原(AMOC-31)/抗CD3；一个臂特异性结合肿瘤抗原而一个臂结合毒素的BsAb，诸如抗肥皂草毒蛋白/抗Id-1、抗CD22/抗肥皂草毒蛋白、抗CD7/抗肥皂草毒蛋白、抗CD38/抗肥皂草毒蛋白、抗CEA/抗蓖麻毒蛋白A链、抗干扰素-α(IFN-α)/抗杂交瘤独特型、抗CEA/抗长春花生物碱类；用于转变酶活化的前体药物的BsAb，诸如抗CD30/抗碱性磷酸酶(其催化磷酸丝裂霉素前体药物转变成丝裂霉素醇)；可用作溶纤剂的BsAb，诸如抗血纤维蛋白/抗组织型纤溶酶原激活物(tPA)、抗血纤维蛋白/抗尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)；用于将免疫复合物靶向细胞表面受体的BsAb，诸如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受体(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)；用于传染病治疗的BsAb，诸如抗CD3/抗单纯疱疹病毒(HSV)、抗T细胞受体：CD3复合物/抗流感、抗FcγR/抗HIV；用于体外或体内肿瘤检测的BsAb，诸如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗p185^HER2/抗半抗原；作为疫苗佐剂的BsAb；及作为诊断工具的BsAb，诸如抗家兔IgG/抗铁蛋白、抗辣根过氧化物酶(HRP)/抗激素、抗促生长素抑制素/抗物质P、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β-半乳糖苷酶。三特异性抗体的实例包括抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)₂双特异性抗体)。

用于生成双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein等，自然(Nature)305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的方法披露于WO93/08829及Traunecker等，EMBO J.10：3655-3659(1991)。

依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变结构域与免疫球蛋白恒定结构域序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链部、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定结构域进行融合。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和需要时的免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染入合适的宿主生物体。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。

在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将想要的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等，酶学方法(Methods in Enzymology)121：210(1986)。

依照WO96/27011中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含抗体恒定结构域的至少部分C_H3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)置换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)置换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链大小相同或相似的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物，诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。

文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等，科学(Science)229：81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab’)₂片段的方法。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠时还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab’-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab’-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab’-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。

最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab’-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby等，J.Exp.Med.175：217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab’)₂分子的生成。由大肠杆菌分别分泌每种Fab’片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达VEGF受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳瘤靶标的溶解活性。

还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等，免疫学杂志(J.Immunol.)148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab’部分连接。抗体同型二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同型二聚体。Hollinger等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)90：6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了生成双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变结构域(V_H)和轻链可变结构域(V_L)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因而，迫使一个片段上的V_H和V_L结构域与另一个片段上的互补V_L和V_H结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体生成双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，免疫学杂志(J.Immunol.)152：5368(1994)。

涵盖具有超过两种效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等，免疫学杂志(J.Immunol.)147：60(1991)。

异源偶联抗体

双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体，它们是本发明的抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与抗生物素蛋白偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体已经建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利号4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373和EP03089)。可使用任何便利的交联方法来生成异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于美国专利号4,676,980。

多价抗体

本发明的抗体包括多价抗体。多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化(和/或异化(catabolized))。本发明的抗体可以是可容易的通过重组表达编码抗体多肽链的核酸而生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(IgM类别以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体将包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或更多可变结构域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)_n-VD2-(X2)_n-Fc，其中VD1是第一可变结构域，VD2是第二可变结构域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条(优选四条)轻链可变结构域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变结构域多肽。本文涵盖的轻链可变结构域多肽包含轻链可变结构域，且任选进一步包含CL结构域。

效应子功能工程改造

可能希望在效应子功能方面修饰本发明的抗体，从而增强例如抗体在治疗癌症中的效力，例如，可向Fc区中引入半胱氨酸残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。如此生成的同型二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。参见Caron等，J.Exp.Med 176：1191-1195(1992)和Shopes，B.，免疫学杂志(J.Immunol.)148：2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同型二聚体抗体还可使用如Wolff等，癌症研究(Cancer Research)53：2560-2565(1993)中记载的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson等，抗癌药物设计(Anti-Cancer Drug Design)3：219-230(1989)。为了延长抗体的血清半衰期，可如例如美国专利5,739,277中记载的将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄)的Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位。

免疫缀合物

本发明还涵盖包含本文所述抗体且其缀合至细胞毒剂的免疫缀合物，所述细胞毒剂诸如化疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射缀合物)。多种放射性核素可用于生成放射性缀合抗体(radioconjugate antibody)。实例包括但不限于例如²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。

可用于生成此类免疫缀合物的化疗剂上文已有描述。例如，在美国专利5,053,394，5,770,710中所述的BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、统称为LL-E33288复合物的药剂家族、埃斯波霉素类(esperamicins)(美国专利5,877,296)等(还可见本文中化疗剂的定义)可以缀合至本发明的抗体或其片段。

为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射性缀合的抗体或其片段。实例包括但不限于例如²¹¹At、¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹²Bi、³²P、²¹²Pb、¹¹¹In、Lu的放射性同位素等。在将缀合物用于诊断时，它可包含放射性原子以用于闪烁照相研究，例如^99mtc或¹²³I，或自旋标记物以用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像(MRI))，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可以以已知方式将放射性标记物或其它标记物掺入缀合物。例如，肽可以生物合成，或者可以通过化学氨基酸合成法合成，其中使用涉及例如以氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可以经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如^99mtc或¹²³I、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re和¹¹¹In。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Fraker等(1978)，生物化学生物物理研究通讯(Biochem.Biophys.Res.Commun).80：49-57)可用于掺入碘-123。参见例如Chatal，免疫闪烁照相法中的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy)，(Chatal，CRC出版社，1989)，其详细记载了其它方法。

可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合性活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)蛋白、香石竹毒蛋白(dianthin protein)、美洲商陆(Phytolacca americana)蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制剂、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制剂、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、新霉素(neomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta等，科学(Science)238：1098(1987)中所记载的制备蓖麻毒素免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体缀合的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari等，癌症研究(Cancer Research)52：127-131(1992)；美国专利号5,208,020)。

或者，可通过例如重组技术或肽合成来生成包含抗-VEGF和/或抗本发明蛋白质的抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可以包含各自编码缀合物两部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，所述接头肽不破坏缀合物的期望特性。

在某些实施方案中，将抗体与“受体”(诸如链霉抗生物素蛋白)偶联以用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体缀合物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的缀合物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)缀合的“配体”(例如抗生物素蛋白)。在某些实施方案中，在抗体与具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成免疫缀合物。

美坦生(Maytansine)和美坦生类化合物(Maytansinoids)

本发明提供了缀合至一个或多个美坦生类化合物分子的本发明抗体。美坦生类化合物是通过抑制微管蛋白聚合来起作用的有丝分裂抑制剂。美坦生最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离到(美国专利号3,896,111)。随后发现某些微生物也产生美坦生类化合物，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利号4,151,042)。合成的美登醇及其衍生物和类似物披露于例如美国专利号.4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533中。

本发明的抗体可以缀合至美坦生类化合物分子且不显著削弱抗体或美坦生类化合物分子的生物学活性。每个抗体分子缀合平均3-4个美坦生类化合物分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示出功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美坦生类化合物在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利No.5,208,020及上文提及的其它专利和非专利出版物中披露了合适的美坦生类化合物。在一个实施方案中，美坦生类化合物是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。

本领域知道许多连接基团可用于生成抗体-美坦生类化合物缀合物，包括例如美国专利号5,208,020或欧洲专利0 425 235B1及Chari等，癌症研究(Cancer Research)52：127-131(1992)中所披露的那些。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团或酯酶不稳定基团，正如上述专利中所披露的，优选二硫化物和硫醚基团。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体与美坦生类化合物的缀合物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(iminothiolane)(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸二甲基己二亚酰胺化物)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双-重氮衍生物(诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。典型的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson等，生物化学杂志(Biochem.J.)173：723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，以提供二硫键。

根据连接的类型，可将接头附着于美坦生类化合物分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯连接。反应可发生在具有羟基的C-3位置、用羟甲基修饰的C-14位置、用羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置。在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成连接。

加利车霉素(Calicheamicin)

另一种目的免疫缀合物包含与一个或多个加利车霉素分子缀合的本发明抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。关于加利车霉素家族缀合物的制备参见美国专利5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；5,877,296(都属于美国Cyanamid公司)。可使用的加利车霉素结构类似物包括，但不限于γ₁ ^I、α₂ ^I、α₃ ^I、N-乙酰基-γ₁ ^I、PSAG和θ^I ₁(Hinman等，癌症研究(Cancer Research)53：3336-3342(1993)；Lode等，癌症研究(Cancer Research)58：2925-2928(1998)；及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可以与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些药剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒性效果。

其它抗体修饰

本文还涵盖抗体的其它修饰。例如，可将抗体与多种非蛋白质性质聚合物之一连接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。还可将抗体包载入例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别是羟甲基纤维素或明胶-微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶状药物递送系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或粗滴乳状液。此类技术披露于雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第16版，Osol，A.编，1980。

脂质体和纳米颗粒

本发明的多肽可以配制成脂质体。例如，本发明的抗体可以配制成免疫脂质体。含有抗体的脂质体通过本领域已知方法来制备，诸如Epstein等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)82：3688(1985)；Hwang等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77：4030(1980)；及美国专利号4,485,045和4,544,545中所记载的。循环时间延长的脂质体披露于美国专利号5,013,556。一般而言，脂质体的配制和使用是本领域技术人员所知道的。

可以用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有限定孔径的滤器，以产生具有期望直径的脂质体。可以如Martin等，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)257：286-288(1982)中所述，将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体缀合。任选在脂质体中包含化疗剂(诸如多柔比星)。参见Gabizon等，国家癌症研究杂志(J.National Cancer Inst).81(19)：1484(1989)。

其它用途

本发明的抗体具有多种功用。例如，本发明的抗体可用于诊断测定法，例如用于检测特定细胞、组织或血清中的蛋白质表达，用于癌症检测(例如在检测不依赖VEGF的肿瘤中)等。在一个实施方案中，抗体用于选择用本文提供的方法治疗的患者群，例如用于检测具有不依赖VEGF的肿瘤的患者。可以使用本领域已知的多种诊断测定技术，诸如竞争性结合测定法、直接或间接夹心式测定法、和免疫沉淀测定法，以异相或同相进行(Zola，单克隆抗体：技术手册(Monoclonal Antibodies：AManual of Techniques)，CRC出版社，Inc.，1987，第147-158页)。诊断测定法中所使用的抗体可以用可检测结构部分标记。可检测结构部分应当能够直接或间接产生可检测信号。例如，可检测结构部分可以是放射性同位素，诸如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S或¹²⁵I；荧光或化学发光化合物，诸如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；或酶，诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。可以采用本领域知道的用于将抗体与可检测结构部分缀合的任何方法，包括Hunter等，自然(Nature)144：945(1962)；David等，生物化学(Biochemistry)13：1014(1974)；Pain等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)40：219(1981)；及Nygren，组织化学和细胞化学杂志(J.Histochem.And Cytochem.)30：407(1982)中所记载的那些方法。

本发明的抗体还可用于从重组细胞培养物或天然来源亲和纯化本发明的蛋白质或蛋白质片段。在该过程中，使用本领域众所周知的方法将针对蛋白质的抗体固定化在合适的支持物上，诸如Sephadex树脂或滤纸。然后使固定化抗体接触含有待纯化蛋白质的样品，此后用合适的溶剂清洗支持物，所述溶剂将会基本上清除样品中除结合至固定化抗体的蛋白质以外的所有物质。最后，用另一种合适的溶剂清洗支持物，所述溶剂将会从抗体上释放蛋白质。

对本发明多肽的共价修饰

本发明多肽(例如本发明的蛋白质、本发明蛋白质的抗体、多肽拮抗剂片段、融合分子(例如免疫融合分子)等)的共价修饰包括在本发明的范围内。如果适用，它们可通过化学合成或者通过酶促或化学切割所述多肽来生成。多肽的其它类型共价修饰如下引入分子，即通过将多肽的目标氨基酸残基与能够与选定侧链或N-或C-末端残基反应的有机衍生化试剂起反应，或者通过将经修饰的氨基酸或非天然的氨基酸掺入正在增长的多肽链，例如Ellman等，酶学方法(Meth.Enzym.)202：301-336(1991)；Noren等，科学(Science)244：182(1989)；及美国专利申请出版物20030108885和20030082575。

半胱氨酰残基最常见的是与α-卤代乙酸(盐/酯)(和相应的胺)起反应，诸如氯乙酸或氯乙酰胺，以得到羧甲基或羧酰氨甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。半胱氨酰残基还可以通过与溴代三氟丙酮、α-溴代-β-(5-imidozoyl)丙酸、氯乙酰基磷酸(盐/酯)、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸(盐/酯)、2-氯汞基-4-硝基酚，或氯-7-硝基苯并-2-氧-1，3-二唑起反应而衍生化。

组氨酰残基通过与焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate)在pH5.5-7.0起反应而衍生化，因为此试剂相对特异于组氨酰侧链。对溴苯甲酰甲基溴化物也是有用的；此反应通常在pH6.0的0.1M二甲基胂酸钠中进行。

赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸酐或其它羧酸酐起反应。用这些试剂的衍生化具有逆转赖氨酰残基电荷的效果。适于衍生化含α-氨基的残基的其它试剂包括亚氨基酯，诸如皮考啉亚氨酸甲酯(methyl picolinimidate)、磷酸吡哆醛酯、吡哆醛、氯硼氢化物、三硝基苯磺酸、邻甲基异脲、2，4-戊二酮、和转氨酶催化的与乙醛酸(glyoxylate)的反应。

精氨酰残基通过与一种或数种常规试剂起反应来修饰，其中有苯甲酰甲醛(phenylglyoxal)、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生化由于胍官能基的高pK_a所以需要在碱性条件下进行反应。此外，这些试剂可以与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基起反应。

酪氨酰残基可以进行特异性修饰，对在酪氨酰残基中引入光谱标记物特别感兴趣，其通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷起反应来引入。最常见的是，使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别形成邻乙酰基酪氨酰种类和3-硝基衍生物。用¹²⁵I或¹³¹I碘化酪氨酰残基以制备带标记物的蛋白质以用于放射免疫测定法。

羧基侧基团(天冬氨酰或谷氨酰)通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R’)起反应而进行选择性修饰，碳二亚胺中的R和R’是不同的烷基，诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮鎓-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，通过与铵离子起反应将天冬氨酰和谷氨酰残基转变成天冬酰胺酰和谷氨酰胺酰残基。

谷氨酰胺酰和天冬酰胺酰残基常常脱酰胺，分别成为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。这些残基在中性或碱性条件下脱酰胺。这些残基的脱酰胺形式落入本发明的范围。

其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，蛋白：结构和分子性质(Proteins：Structure and Molecular Properties)，W.H.Freeman&Co.，San Francisco，pp.79-86(1983))，N-末端胺的乙酰化，及任何C-末端羧基的酰胺化。

另一类共价修饰涉及向本发明的多肽化学或酶促偶联糖苷。这些规程的优点在于它们不需要在具有N-或O-连接糖基化的糖基化能力的宿主细胞中生成多肽。根据所使用的偶联模式，可以将糖附着于(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基，诸如半胱氨酸的游离巯基，(d)游离羟基，诸如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的游离羟基，(e)芳香族残基，诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的芳香族残基，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法记载于1987年9月11日公布的WO 87/05330和Aplin和Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.第259-306页(1981)。

本发明多肽上存在的任何碳水化合物结构部分的消除可通过化学或酶促方法实现。化学的脱糖基化作用需要将多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此处理导致除连接糖(linking sugar)((N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部糖得到切除，而多肽保持完整。化学的脱糖基化作用记载于Hakimuddin等，生物化学和生物物理进展(Arch.Biochem.Biophys.)259：52(1987)和Edge等，Anal.Biochem.118：131(1981)。碳水化合物结构部分(例如抗体上的)的酶促切割可通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现，记载于Thotakura等，酶学方法(Meth.Enzymol.)138：350(1987)。

本发明多肽的另一类共价修饰包括将多肽连接至多种非蛋白质性质聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，以美国专利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所列方式进行。

载体、宿主细胞和重组方法

多肽可以使用易于获得的技术和材料而重组生产。

为了重组生产多肽，例如蛋白抗体，例如抗-IL-1β或抗-PlGF抗体，分离编码它的核酸，并插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。编码本发明多肽的DNA易于使用常规规程分离和测序。例如，对编码单克隆抗体的DNA分离和测序，例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针进行。可以获得许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。

信号序列构件

本发明的多肽不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽典型的是成熟蛋白质或多肽的N-末端处的信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。所选择的异源信号序列典型的是受到宿主细胞识别并加工(即受到信号肽酶切割)的。对于不识别和加工天然多肽信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列用例如选自下组的原核信号序列替代：碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导序列。对于酵母分泌，天然信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括糖酵母属(Saccharomyces)和克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)α因子前导序列)、酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母(C.albicans)葡萄糖淀粉酶前导序列、或WO 90/13646中记载的信号替代。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。

将此类前体区(precursor region)的DNA以符合读码框的方式与编码本发明多肽的DNA连接。

复制起点构件

表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是能够使载体不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。众所周知多种细菌、酵母和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动子)。

选择基因构件

表达和克隆载体可包含选择基因，也称为可选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足营养缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的必需营养物，例如用于芽孢杆菌(Bacilli)的编码D-丙氨酸消旋酶的基因。

选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素(neomycin)、霉酚酸(mycophenolic acid)和潮霉素(hygromycin)。

适于哺乳动物细胞的可选择标志的另一个实例是那些能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的可选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II(典型的是灵长类动物金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。

例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。

或者，可以通过细胞在含有针对可选择标志的选择剂(诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418)的培养基中的生长来选择经编码本发明多肽、野生型DHFR蛋白质和另一种可选择标志(诸如氨基糖苷3’-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参阅美国专利号4,965,199。

适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒Yrp7中的trp1基因(Stinchcomb等，自然(Nature)282：39(1979))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株(例如ATCC No.44076或PEP4-1)提供了选择标志。Jones，遗传学(Genetics)85：12(1977)。酵母宿主细胞基因组中存在trp1损伤随之提供了用于通过在缺乏色氨酸时的生长来检测转化的有效环境。类似的，用携带Leu2基因的已知质粒补足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC20,622或38,626)。

此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维氏酵母属(Kluyveromyces)酵母。或者，报导了用于在乳酸克鲁维氏酵母(K.lactis)中大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。Van den Berg，生物/技术(Bio/Technology)8：135(1990)。还披露了用于由克鲁维氏酵母属的工业用菌株分泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleer等，生物/技术(Bio/Technology)9：968-975(1991)。

启动子构件

表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，而且它与编码本发明多肽的核酸可操作连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子(诸如tac启动子)。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还将包含与编码本发明多肽的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。

已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处找到的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3’端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3′端添加polyA尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体。

适用于酵母宿主的启动序列的实例包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。

作为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步记载于EP73,657。酵母增强子也可以有利的与酵母启动子一起使用。

在哺乳动物宿主细胞中由载体转录本发明多肽受到例如从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和典型的猿猴病毒40(SV40))基因组、异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、及热休克启动子获得的启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。

方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIIIE限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利号4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利号4,601,978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes等，自然(Nature)297：598-601(1982)。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。

增强子元件构件

常常通过将增强子序列插入载体来提高高等真核细胞对编码本发明多肽的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。典型的是，使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括SV40复制起点晚期一侧(late side)的增强子(bp100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv，自然(Nature)297：17-18(1982)。可以将增强子剪接入载体，位于多肽编码序列的5’或3’位置，但是典型的位于启动子的5’位点。

转录终止构件

用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5’端和偶尔的3’端获得。这些区域包含在编码本发明多肽的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中披露的表达载体。

宿主细胞的选择和转化

适于克隆或表达本文载体中的编码本发明多肽的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科(Enterobacteriaceae)，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。典型的是，大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC27,325)也是合适的。这些实例是例示性的，而不是限制性的。

除了原核生物以外，真核微生物，诸如丝状真菌或酵母也是编码本发明多肽的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母最常用于低等真核宿主微生物之中。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株并可用于本发明，诸如粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC 12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如Schwanniomyces occidentalis；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

适于表达糖基化的本发明多肽的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的许可的昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖(Autographa californica)NPV的L-1变体和家蚕NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。

然而，脊椎动物细胞得到最多关注，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的实例是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham等，遗传病毒学杂志(J.Gen Virol.)36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)77：4216(1980))；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather，生物繁殖(Biol.Reprod.)23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCC CCL2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather等，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。

用上文所述用于生产本发明多肽的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。

培养宿主细胞

可以在多种培养基中培养用于生产本发明多肽的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(西格玛(Sigma))、极限必需培养基(MEM，西格玛(Sigma))、RPMI-1640(西格玛(Sigma))、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，西格玛(Sigma))适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham等，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes等，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利号4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCIN^TM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件(诸如温度、pH等)就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。

多肽纯化

本发明的多肽或蛋白质可以从受试者中回收。在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成本发明的多肽，或者直接分泌入培养基。可以从培养物的培养液或者从宿主细胞溶胞液回收本发明的多肽。如果是膜结合的，那么可以用合适的去污剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶促切割从膜上释放它。本发明多肽的表达中所采用的细胞可通过各种物理或化学手段破碎，诸如冻融循环、超声处理、机械破碎或细胞裂解剂。

以下规程是合适的蛋白质纯化规程的例子：通过离子交换柱上的分级；乙醇沉淀；反相HPLC；硅土上的层析，肝素SEPHAROSE^TM上的层析，阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱、DEAE等)上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；利用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；用蛋白A Sepharose柱去除污染物诸如IgG；及用金属螯合柱结合带表位标签形式的本发明多肽。可以采用多种蛋白质纯化方法，此类方法是本领域已知的，而且记载于例如Deutscher，酶学方法(Methods in Enzymology)，182(1990)；Scopes，蛋白质纯化：原理和实践(Protein Purification：Principles and Practice)，Springer-Verlag，New York(1982)。所选择的纯化步骤取决于例如所用纯化方法的本质和所生成的具体本发明多肽。

例如，可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，典型的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark等，免疫学方法杂志(J.Immunol.Meth.)62：1-13(1983))。蛋白G被推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss等，EMBO J.5：1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质，诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯，容许获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。如果抗体包含C_H3结构域，则可使用Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，例如上文所述的。还可参见Carter等，生物/技术(Bio/Technology)10：163-167(1992)，其记载了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的规程。

药物组合物

通过将具有期望纯度的分子(例如多肽)与任选的药用载体、赋形剂或稳定剂(雷明顿药物科学(Remington′s Pharmaceutical Sciences)，第16版，Osol，A.编，1980)混合来制备本文所述和依照本发明使用的本发明药剂(如VEGF拮抗剂、URVIP拮抗剂等)及其组合的治疗用制剂，以冻干剂型或水溶液的形式贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐平衡离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

活性成分还可包载入例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊，例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、包载入胶状药物递送系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或包载入粗滴乳状液。此类技术披露于例如雷明顿药物科学(Remington′s PharmaceuticalSciences)，第16版，Osol，A.编，1980。

用于体内施用的制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适实例包括含有本发明多肽的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。还可参见例如美国专利号6,699,501，其记载了具有聚电解质覆盖物的胶囊。

还涵盖可以通过基因疗法将本发明的药剂(例如VEGF拮抗剂、URVIPs拮抗剂、化疗剂或抗癌剂)导入受试者。基因疗法指通过给受试者施用核酸进行的疗法。在基因疗法的应用中，为了实现治疗上有效的基因产物的体内合成，例如为了替换缺陷基因，将基因引入细胞。“基因疗法”包括通过单次处理实现持久效果的传统基因疗法及涉及一次或重复施用治疗上有效的DNA或mRNA的基因治疗剂施用二者。反义RNA和DNA可作为治疗剂用于阻断某些基因的体内表达。早已显示可以将短反义寡核苷酸输入细胞，在那里它们起抑制剂的作用，尽管由于细胞膜对它们的摄取受限制因而它们的胞内浓度低(Zamecnik等，美国国家科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83：4143-4146(1986))。可以修饰寡核苷酸以增强它们的摄取，例如通过用不带电荷的基团取代它们带负电荷的磷酸二酯基团。关于基因疗法的方法的一般性综述参阅例如Goldspiel等，临床药物(Clinical Pharmacy)12：488-505(1993)；Wu和Wu，生物疗法(Biotherapy)3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，科学(Science)260：926-932(1993)；Morgan和Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；及May，TIBTECH 11：155-215(1993)。重组DNA技术领域普遍知道的、可以使用的方法记载于Ausubel等人编(1993)当前分子生物学方法(Current Protocols in Molecular Biology)，John Wiley & Sons，NY和Kriegler(1990)基因转移和表达，实验室手册(Gene Transfer and Expression，A Laboratory Manual)，Stockton出版社，NY。

有多种技术可用于将核酸引入活细胞。所述技术可根据核酸是在体外转移入培养的细胞还是在体内转移入预期宿主的细胞而变化。适于在体外将核酸转移入哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-葡聚糖、磷酸钙沉淀法等。当前优选的体内基因转移技术包括用病毒(典型的是逆转录病毒)载体进行的转染和病毒外壳蛋白-脂质体介导的转染(Dzau等，生物技术趋势(Trends in Biotechnology)11：205-210(1993))。例如，体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒、慢病毒、逆转录病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(可用于脂质介导的基因转移的脂类有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行的转染。在基因疗法中使用病毒载体的实例可参阅Clowes等，J.Clin.Invest.93：644-651(1994)；Kiem等，血液(Blood)83：1467-1473(1994)；Salmons和Gunzberg，人基因疗法(Human GeneTherapy)4：129-141(1993)；Grossman和Wilson，Curr.Opin.in Genetics and Devel.3：110-114(1993)；Bout等，人基因疗法(Human Gene Therapy)5：3-10(1994)；Rosenfeld等，科学(Science)252：431-434(1991)；Rosenfeld等，细胞(Cell)68：143-155(1992)；Mastrangeli等，J.Clin.Invest.91：225-234(1993)；及Walsh等，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300(1993)。

在有些情况中希望与靶向靶细胞的药剂(诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异性的抗体、针对靶细胞上受体的配体等)一起提供核酸来源。如果采用脂质体，则可以使用与胞吞作用有关的细胞表面膜蛋白结合的蛋白质靶向和/或促进摄取，例如对特定细胞类型有向性的衣壳蛋白或其片段、针对在循环中经历内在化的蛋白质的抗体、靶向胞内定位并延长胞内半衰期的蛋白质。受体介导的胞吞作用的技术记载于例如Wu et al.，生物化学杂志(J.Biol.Chem.)262：4429-4432(1987)和Wagner等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3410-3414(1990)。关于基因标记和基因疗法方案的综述参阅Anderson等，科学(Science)256：808-813(1992)。

剂量和施用

依照已知方法将本发明的药剂(如VEGF拮抗剂、URVIP拮抗剂、化疗剂或抗癌剂)施用于人类患者，诸如静脉内施用，像推注或持续一段时间的连续输注、肌内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、局部、或吸入路径，和/或皮下施用。

在某些实施方案中，本发明的治疗涉及组合施用VEGF拮抗剂和一种或多种如URVIP拮抗剂的药剂和/或化疗剂。在一个实施方案中，存在别的抗癌剂，例如一种或多种不同的抗血管发生剂、一种或多种化疗剂等。本发明还涵盖施用多种抑制剂，例如针对同一抗原的多种抗体或针对本发明不同蛋白质的多种抗体。在一个实施方案中，与VEGF拮抗剂和/或一种或多种URVIP拮抗剂一起施用不同化疗剂的混合物。在另一个实施方案中，不同化疗剂的混合物与VEGF拮抗剂和/或一种或多种针对由URVINAs编码的蛋白的抗体一起施用。组合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用，和/或任一次序的顺次施用。例如，VEGF拮抗剂可以在施用化疗剂之前、之后、交替，或者可以同时给予。在一个实施方案中，有一段时间两种(或所有)活性剂同时发挥其生物学活性。

对于疾病的预防或治疗，本发明药剂的适宜剂量取决于上文定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、施用抑制剂是用于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对抑制剂的响应、及主治医师的判断。将抑制剂一次性或者在一系列治疗中适当的施用于患者。在组合治疗方案中，本发明的组合物以治疗有效量或治疗协同量施用。在用于本文时，治疗有效量指导致所针对疾病或疾患得到减轻或抑制的本发明组合物的施用量和/或VEGF拮抗剂和一种或多种其它治疗剂的共施用量。药剂组合的施用效果可以是叠加的。在一个实施方案中，施用的效果是协同效应。治疗协同量指协同的或显著的减轻或消除与特定疾病有关的状况或症状所必需的VEGF拮抗剂和一种或多种其它治疗剂，例如化疗剂或抗癌剂的量。

根据疾病的类型和严重程度，大约1μg/kg到50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)VEGF拮抗剂或化疗剂、或抗癌剂是施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开施用，或者是通过连续输注。典型每日剂量的范围可以为大约1μg/kg到大约100mg/kg或者更多，取决于上述因素。对于持续数天或更长时间的重复给药，根据疾患，治疗维持到直至发生期望的疾病症状抑制。然而，其它剂量方案可能也是有用的。典型的是，临床医师将会施用本发明的分子，直至剂量达到提供所需生物学效应。可以通过常规技术和测定法来容易地监测本发明疗法的进展。

例如，血管发生抑制剂，例如抗VEGF抗体，诸如AVASTIN

(Genentech)的制备和剂量给药方案可以依照制造商的说明书使用，或者由熟练从业人员凭经验确定。在另一个实例中，此类化疗剂的制备和剂量给药方案可以依照制造商的说明书使用，或者由熟练从业人员凭经验确定。化疗的准备和剂量给药方案还记载于Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)。

治疗功效

本发明治疗的功效可以通过评估赘生性或非赘生性病症中常用的多种终点来测量。例如，癌症治疗可以通过例如但不限于肿瘤消退、肿瘤重量或大小收缩、距进展的时间、存活持续时间、无进展存活、整体响应率、响应持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性来评估。因为本文所述抗生血管药剂靶向肿瘤血管结构而不必是赘生性细胞本身，所以它们代表了一类独特的抗癌药，并因此可以要求独特的对药物的临床应答的测量和定义。例如，二维分析中大于50％的肿瘤收缩是宣告响应的标准截断值。然而，本发明的抑制剂可以引起对转移性扩散的抑制而没有原发瘤的收缩，或者可以仅仅发挥抑制肿瘤(tumouristatic)效果。因而，可采用测定治疗功效的方法，包括例如测量血管发生的血浆或尿液标志物和通过放射学成像测量响应。

制品

在本发明的另一个实施方案中，提供了包含可用于治疗上文所述病况/疾病或诊断上文所述的病况/疾病的物质的制品。所述制品包括容器、标签和包装插页。合适的容器包括例如药瓶、药管、注射器等。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。在一个实施方案中，所述容器装有有效治疗所述病况的组合物，可以具有无菌存取口(例如所述容器可以是带有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或药瓶)。在一个实施方案中，组合物中的至少一种活性剂是VEGF调节剂。在另一个实施方案中，所述组合物中的至少一种活性剂是VEGF调节剂，且至少第二活性剂是本发明的拮抗剂和/或化疗剂。在又一个实施方案中，所述组合物中的至少一种活性剂是VEGF调节剂，且至少第二活性剂是本发明的激动剂和/或化疗剂。容器上或与容器有关的标签指明该组合物用于治疗所选择的病况。所述制品可进一步包括第二容器，其中装有药用缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。在另一个实施方案中，所述容器装有作为检测不依赖VEGF的肿瘤的诊断剂的标志物集合。在某些实施方案中，所述组合物中的至少一种药剂是用于检测IL-1β，PlGF，HGF，IL-6，LIF，S100A8，S100A9，PDGFC，Tie-1，Tie-2，CD31，CD34，VEGFR1或VEGFR2的标志。在某些实施方案中，容器上或与容器有关的标签指明该组合物用于诊断不依赖VEGF的肿瘤。本发明的制品可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它物质，包括另外的活性剂、其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。

在本发明的某些实施方案中，提供包含容器、在所述容器上的标签和包含在所述容器中的组合物的试剂盒。所述组合物包含一种或多种与一种或多种基因的多核苷酸序列在严格条件下杂交的多核苷酸，所述基因包括，但不限于，URVINAs、DRVINAs、编码URVIPs和/或DRVIPs的核酸，所述容器上的标签指示组合物可以用于评价一种或多种靶基因在至少一种类型的哺乳动物细胞中的存在和/或表达水平，所述靶基因包括，但不限于S100A8，S100A9，Tie-1，Tie-2，CD31，CD34，VEGFR1，VEGFR2，PDGFC，IL-1β，PlGF，HGF，IL-6和/或LIF，以及使用多核苷酸来评价一种或多种靶RNAs或DNAs在至少一种类型的哺乳动物细胞中的存在和/或表达水平的说明书。在试剂盒中的其它任选的组分包括一种或多种缓冲剂(例如，封闭缓冲液、洗涤缓冲液、底物缓冲液等)，其它试剂如通过酶促标记化学改变的底物(例如，色原)，表位挽回溶液，对照样品(阳性对照和/或阴性对照)，对照载玻片等。

实施例

应当理解，在此描述的实施例和实施方案仅用于例示目的，根据这些将为本领域技术人员提供各种修改或变化，它们包括在本申请的精神和范围、以及所附权利要求的范围内。

实施例1：乳腺上皮细胞中的Vegf-基因的失活不影响正常的乳腺发育

为了检查在乳腺的上皮区室中特异的VEGF的生物学意义，将携带条件性Vegf-A等位基因(其中第三外显子侧邻loxP重组位点)(VEGF loxP+/+)的小鼠(Gerber HP等.，VEGF是新生小鼠的生长和存活所需要的(VEGF is required for growth and survival in neonatal mice)，发育(Development)1999，126：1149-1159)与在小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复启动子/增强子元件(MMTV-Cre)的转录控制下表达Cre重组酶的转基因小鼠(Wagner KU等.，Cre-介导的基因在乳腺中的缺失(Cre-mediated gene deletion in the mammary gland)，核酸研究(Nucleic Acids Res)1997，25：4323-4330，Wagner KU等.，Cre基因在不同的转基因小鼠系中在MMTV-LTR控制下的空间和时间表达(Spatial and temporal expression of the Cre gene under the control of the MMTV-LTR in different lines of transgenic mice)，转基因研究(Transgenic Res)2001，10：545-553)配种从而产生在VEGF基因座杂合(一个等位基因是VEGF loxP并且另一个等位基因是VEGF WT)并携带MMTV-Cre转基因的小鼠。将这些小鼠进一步与纯合的VEGF loxP小鼠配种从而获得这样的纯合VEGF loxP小鼠，所述纯合VEGF loxP小鼠也携带MMTV-Cre转基因，导致在乳腺上皮细胞中两种VEGF等位基因的exon3的缺失(在本文也称为epiVEGF-/-)。有活力的和健康的epiVEGF-/-小鼠在身体上与同窝出生的对照动物不可区分(在本文也称为VEGF+/+)并且以预期的孟德尔比率出生(数据未显示)。

将小鼠使用包含60mg/kg的氯胺酮和10mg/kg的赛拉嗪的腹膜内注射溶液麻醉。解剖腹股沟(第4位置)乳腺，将其涂布到预先清洁的superfrost

加显微镜玻片(VWR，West Chester，PA)上，并将其在Carnoy’s固定剂(6份100％乙醇，3份氯仿，1份冰醋酸)中固定过夜。将样品通过梯度乙醇系列(70％，50％，30％和10％)漂洗2次，达15分钟，最后一次漂洗在蒸馏水中进行5分钟。将样品在500ml水中的铝洋红(Carmine Alum)(1g洋红(西格玛-奥尔德里奇(Sigma-Aldrich)，St Louis，MO)2.5g的硫酸铝钾(西格玛-奥尔德里奇(Sigma-Aldrich)，St Louis，MO)染色过夜。使用梯度系列的乙醇(70％，95％，100％)漂洗使样品脱水并将其浸入二甲苯中达30分钟，或直到脂肪组织充分从所述腺体清除。使用Permount固定载玻片并用盖玻片盖上。使用Image Pro-Express软件(Media Cybernetics，IncBethesda，MD)给完整的封固片(mount)进行数字照相。给8周龄同窝出生的小鼠进行完整的封固片分析。

来自8周龄未交配雌性小鼠的腹股沟乳腺完整封固片的移去和制备揭示在epiVEGF-/-乳腺中具有特征性的导管分支旁枝的乳腺发育，类似于在VEGF+/+对照乳腺中的乳腺发育(图1A，1B)。类似地，相对于VEGF+/+乳腺的那些，发现在8周龄的epiVEGF-/-乳腺的苏木精和曙红染色的切片中没有明显的组织学改变(数据未显示)。这些结果提示上皮细胞来源的VEGF对于未交配小鼠中的正常乳腺发育不是必要的。

实施例2：上皮细胞来源的VEGF的失去延缓了PyMT肿瘤发作

为了促进在乳腺上皮中的肿瘤发生，将在MMTV-LTR启动子的转录调节下表达多瘤病毒中间T抗原(PyMT)的转基因小鼠(Guy CT等.，通过表达多瘤病毒中间T致癌基因诱导乳腺肿瘤：关于转移疾病的转基因小鼠(Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene：a transgenic mouse model for metastatic disease)，分子细胞生物学(Mol Cell Biol)1992，12：954-961)与epiVEGF-/-小鼠配种来产生PyMT.epiVEGF-/-动物。

将在MMTV-LTR(MMTV-PyMT)的控制下表达PyMT癌基因蛋白的转基因小鼠系用于驱使肿瘤在乳腺上皮中形成(Guy CT等.，通过表达多瘤病毒中间T致癌基因诱导乳腺肿瘤：关于转移性疾病的转基因小鼠模型(Induction of mammary tumors by expression of polymavirus middle T oncogene：a transgenic mouse model for metastatic disease)，分子细胞生物学(Mol Cell Biol)1992，12：954-961)。为了引入MMTV-PyMT转基因，将除了MMTV-Cre转基因之外关于VEGF loxP和VEGF WT杂合的雌性小鼠与雄性MMTV-PyMT转基因小鼠配种从而产生除了表达MMTV-Cre和MMTV-PyMT转基因之外，关于VEGF loxP和VEGF WT杂合的小鼠。接着，将关于VEGF loxP和VEGF WT等位基因杂合并具有MMTV-Cre和MMTV-PyMT转基因的雄性小鼠与雌性纯合的VEGF loxP小鼠配种从而获得携带MMTV-Cre和MMTV-PyMT转基因的纯合VEGF loxP小鼠。将还表达Cre和PyMT的纯合VEGF loxP小鼠或纯合的VEGF loxP小鼠在FVB/N背景上回交5代，之后杂交以产生表达MMTV-Cre和MMTV-PyMT转基因的纯合VEGF loxP小鼠(在本文称为PyMT.epiVEGF-/-)和表达PyMT转基因和WT VEGF的纯合VEGF loxP小鼠(在本文称为PyMT.VEGF+/+)，将其用作所有试验的对照动物。在所有的研究中使用雌性小鼠，除非另外指出。在4周龄开始，每周监测肿瘤形成和生长，通过圆规测量确定可触知肿瘤的体积。通过在每个小鼠中每周的肿瘤小节的数量相加来确定每只小鼠的累积的肿瘤数量。使用公式LxWxW/2＝肿瘤体积(mm3)(L＝以mm表示的更长的直径长度；W＝以mm表示的更短的直径宽度)来计算肿瘤体积(Blaskovich MA等.，(2000)，GFB-111的设计，具有针对小鼠中肿瘤的抗生血管和抗癌活性的血小板衍生的生长因子结合分子(Design of GFB-111，a platelet-derived growth factor binding molecule with antiangiogenic and anticancer activity against humantumor in mice)。自然生物技术(Nat Biotechnol)18：1065-1070)。通过在每只小鼠中对每个肿瘤结节的体积相加来确定每只小鼠的累积肿瘤体积。在指定的时间点从小鼠中移去肿瘤并称重。

与在PyMT.VEGF+/+乳腺中相比，在PyMT.epiVEGF-/-乳腺中的肿瘤潜伏期增加。更具体地，需要10周来检测在50％小鼠中的至少一个可触及的PyMT.VEGF+/+肿瘤，而需要12.3±0.51周(P值＝.003)用于检测PyMT.epiVEGF-/-肿瘤(图2A)。在检测可触及的肿瘤后，每周监测所有的小鼠来确定另外的可触及肿瘤在副乳中的时间(10个中)。在随后的时间点，相对于PyMT.VEGF+/+对照动物，在PyMT.epiVEGF-/-小鼠中的每只小鼠的可触及肿瘤的平均累积数量显著更少(图2B)。由于个体肿瘤生长在这种乳腺癌遗传模型中是高度可变的(Vartocovski等.，使用来自遗传改造的小鼠乳腺癌模型的移植肿瘤进行的加速临床前测试(Accelerated preclinical testing using transplanted tumors from genetically engineered mouse breast cancer models)，临床癌症研究(Clin Cancer Res)20071；13(7)：2168-77)，从第8周到第17周计算每只小鼠的平均累积肿瘤体积并对于每种基因型进行画图(图2C)。在11周，关于PyMT.VEGF+/+的平均累积肿瘤体积是～900mm3，而关于PyMT.epiVEGF-/-的平均累积肿瘤体积少于100mm3(图2C)。在17周，关于PyMT.VEGF+/+对照动物的平均累积肿瘤负荷体积是～7500mm3，而关于PyMT.epiVEGF-/-小鼠的平均累积肿瘤负荷体积是～3000mm3(图2C)。在16和17周之间收获的肿瘤显示，相对于PyMT.VEGF+/+，在PyMT.epiVEGF-/-中总的肿瘤重量/小鼠的减少(图2D)。这些观察显示表皮VEGF的损失限制了PyMT-驱动的乳腺肿瘤发生。

实施例3：在PyMT.epiVEGF-/-小鼠中肿瘤血管结构减少

已经将微型-CT血管造影术成功用于表征正常的血管结构(Garcia-Sanz A等.，在大鼠中肾血管结构的三维微型电子计算机化的X射线断层照片(Three-dimensional microcomputed tomography of renal vasculature in rats)，高血压(Hypertension)，1998；31[2]：440-444；Ritiman EL，肺和肺-血管系统的微型电子计算机化的X射线断层照片(Micro-computedtomography of the lungs and pulmonary-vascular system)，Proc Am Thorac Soc.2005；2：477-480)，生血管和动脉生成(arteriogenesis)的各种动物模型(Kwon HM等.在实验性的高胆固醇血症中增强的冠状动脉血管滋养管新血管化作用(Enhanced Corornary Vasa Vasorum Neovascularization in Experimental Hypercholesterolemia)，临床研究杂志(J.of Clinical Invest)，1998；101[8]，1551-1556；Kwon HM等经皮的跨心肌血管成形术诱导血管发生：组织学和3维微计算机化的X线断层照相术研究(Percutaneous Transmyocardial revascularization induces angiogenesis：A histologic and 3-dimensional micro computed tomography study)，韩国医学科学杂志(JKorean MedSci.)1999；14：502-510；Duvall CL等.局部缺血损伤后并行血管发育的定量微计算机化的X线断层摄影术分析(Quantitative microcomputed tomography analysis of collateral vessel development after ischemic injury)，Am J Physiol Heart Circ.Physiol.2004；287：H302-310)，并且最近应用于肿瘤血管系统的研究(Maehara N.，肿瘤的3D显微血管结构的实验性的计算机化的X线断层摄影术研究(Experimental microcomputed tomography study of the 3D microangioarchitecture of tumor)，Eur Radiol.2003；13(7)：1559-1565；Savai R等.通过荧光微球体分布分析在小鼠中的lewis肺癌瘤的肿瘤血管供应并且对微版和平版的计算机化的X线断层照片进行成像(Analysis oftumor vessel supply in lewis lung carcinoma in mice by fluorescent microsphere distribution and imaging of micro-and flat-panelcomputed tomography)，Amer J of Path.2005；167[4]：937-946；Shojaei F，等.(2007)Bv8调节髓细胞依赖性的肿瘤血管发生(Bv8 regulates myeloid cell-dependent tumor angiogenesis)，自然(Nature)450：825-831)。

简言之，在通过二氧化碳吸入来安乐死前，动物接受50μl的肝素15’的腹膜内注射。打开胸腔，并在心脏的顶部制造一个切口，将聚乙烯导管(id 0.58mm，od 0.96mm)通过左心室，并用5-0丝缝线将其固定在升主动脉中。将0.1mM硝普钠溶液以6ml/分钟的速率灌注从而提供最大血管舒张的状态。将MICROFIL

(Flowtech，Carver，MA)，一种商购的铬酸铅胶乳根据生产商的推荐制备并且以2ml/分钟的速率灌注8.5分钟。在肿瘤解剖前90分钟，在室温进行输注的胶乳混合物的聚合。将解剖的肿瘤浸入10％中性缓冲的福尔马林直到进行分析。用μCT40(SCANCO Medical，Basserdorf，Switzerland)x-射线微型计算机化的断层显像(micro-CT)系统来对肿瘤进行成像。获得了与常规平面x-射线比较的矢状检测图像以确定轴向获得一系列微型-CT图像切片的起点和终点。选择轴向图像的定位和数量来提供肿瘤的完全覆盖。以大豆油作为背景介质来使肿瘤成像。通过在50kV的能量水平，160μA的电流和300毫秒的整合时间操作x-射线管来产生微型-CT图像。在16μm的各向同性分辨率获得轴向图像。通过一系列图像加工步骤来得出血管网络和肿瘤。将强度阈值和形态滤波(腐蚀和膨胀)应用于体积微型-ct图像数据以算出血管体积。将1195亨斯菲尔德单位(Houndsfield Units)(HU)的阈值用于从肿瘤和豆油背景信号中得到MICROFIL

-填充的血管。通过应用-8HU的强度阈值随后进行形态滤波(腐蚀和膨胀)来抑制噪声从而从背景大豆油中确定肿瘤体积。通过视觉检查样品子集的分段结果来确定血管和肿瘤强度的阈值。基于简化算法来估计血管大小，所述简化算法使用边界-种子(boundary-seeded)和单种距离转化技术(Zhou Y和Toga AW，测定体积目标物的有效骨架算法(Efficientskeletonization of volumetric objects)，IEEE Trans.Visualization and Computer Graphics.1999；5[3]：196-209)。通过在C++中书写的内部图像分段算法和使用AVW图像加工软件库(AnalyzeDirect Inc.，Lenexa，KS)来进行图像分析。使用Analyze(AnalyzeDirect Inc.，Lenexa，KS)，一种图像分析软件包，从μCT数据产生三维(3D)表面透视图。对每周两次，以5mg/kg体重腹膜内注射了抗-VEGF G6.31或针对豚草的同种型对照抗体的PYMT.VEGF loxP+/+小鼠进行VEGF对肿瘤血管系统的药理学抑制作用的评估。

大小匹配的肿瘤的微型计算机断层显象(μCT)血管造影术揭示了相对于PyMT.VEGF+/+肿瘤(12.31±7.27mm3，n＝30，p＝0.032)，在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤(7.94±1.017mm3，n＝16)中减少的平均血管体积(VV)。类似地，相对于PyMT.VEGF+/+对照肿瘤(0.054±0.019)，在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤(0.034±.0027)中的平均血管密度(VV/TV)减少了(37％)(P＝0.004)。显示了代表性的三维最大强度投射(MIP)微型-CT血管造影照片(图3A，B)。相对于对照抗体治疗的小鼠，以类似于在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中观察到的方式，对患有PyMT.VEGF+/+肿瘤的小鼠的抗-VEGF治疗(一周三次)减少了血管密度(图3C，3D)。为了检查更小的血管是否可以在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中选择性地丧失，评估观察范围的血管半径内的血管体积。相对于PyMT.VEGF+/+肿瘤，在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中，在所有血管半径内的血管体积分布更低(图3E)。当关于PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中血管系统中总的减少校正时，即，当除以总的血管体积时，没有发现显著的差异(图3F)。因此，上皮VEGF的损失导致了肿瘤血管系统的明显减少，这看上去在很大程度上影响血管的不同尺寸。

实施例4：CD31，CD34，Tie-1和Tie-2的基因表达在PyMT.epiVEGF-/-小 鼠中减少

为了评估CD31，CD34，Tie-1和Tie-2表达的相对水平，我们使用定量的RT-PCR。

根据生产商的说明书，使用Trizol试剂(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)从实体瘤中分离总的RNA，随后用Turbo DNA-free(Ambion，Inc.，Carlsbad，CA)进行DNA酶处理，酚/氯仿/异戊醇25∶24∶1纯化和乙醇沉淀。将RNA重悬在无RNA酶的水(Ambion，Inc.，Carlsbad，CA)中并贮存在-80℃。通过吸光度光谱测定法确定RNA浓度。使用关于每种基因设计的TaqMan探针和引物组来确定目的基因的相对水平，并且使用ABI 7500实时PCR系统(应用生物系统(Applied Biosystem)，Foster City，CA)进行实时PCR。关于鼠CD31的引物和探针组：5′-CTC ATT GCG GTG GTT GTC ATT-3′(正向)，5′-GTT TGG CCT TGG CTT TCC T-3′(反向)，和5′-FAM-TGGTCA TCG CCA CCT TAA TAG TTG CAG C-TAMRA-3′(探针)。关于鼠CD34的引物和探针组5′-TTG TGA GGA GTT TAA GAA GGA AA-3′(正向)，5′-AGA CAC TAG CAC CAG CAT CAG-3′(反向)和5′-FAM-AGC CTC CTC CTT TTC ACA CAG TAT TTG-TAMRA-3′(探针)。关于鼠Tie-1的引物和探针组：5′-CCA GGA AGG CCT ACG TGAAC-3′(正向)，5′-CCTAGG CCT CCT CAG CTG TG-3′(反向)，和5′-FAM-TGT TTGAGA ACT TCA CCT ATG CGG GCA-TAMRA-3′(探针)。关于鼠Tie-2的引物和探针组：5′-CAA CAG TGA TGT CTG GTC CTA TGG-3′(正向)，5′-GCA CGT CAT GCC GCA GTA-3′(反向)，和5′-FAM-TGC TCTGGG AGA TTG TTA GCT TAG GAG GCA C-TAMRA-3′(探针)

还将RNA样品与完整的小鼠基因组430 2.0阵列在设定于60r.p.m的rotisserie炉中，在45℃杂交19小时。将阵列进行洗涤，染色，并在Affymetrix Fluidics站和扫描器中进行扫描。使用Genentech专用软件进行基因组分析。使用ABI 7500实时PCR系统(应用生物系统(Applied Biosystem)，Foster City，CA)，根据生产商的说明书(SuperArray Bioscience，Frederick，MD)，使用RT2 Profiler小鼠血管发生PCR阵列，关于每种肿瘤RNA样品分析血管发生-相关基因表达。

这些结果显示PyMT.epiVEGF-/-肿瘤具有减少的CD31，CD34，Tie-1和Tie-2的mRNA水平。(图11A-D).

相对于PyMT.VEGF+/+肿瘤，关于CD31，CD34Tie-1和Tie-2的RT-PCR量化在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中显著减少，这说明相对于对照，在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中的内皮细胞的总的减少(图11A-D)。

实施例5：在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中，相对血流没有被血管系统的减少 不利地影响

为了评价血管功能，我们使用了肿瘤灌流的对比度增强的超声波成像。

灌流成像：使用用流速为1L/sec的医疗气体递送的2％异氟烷使小鼠麻醉。使麻醉的小鼠仰卧在专用的小动物固定系统(VisualSonics Inc.，Toronto，ON，Canada)上。在所述流程的剩余步骤中监测体温和心率(THM150，Indus Instruments，Houston，TX，USA)。使用脱毛膏(Nair，Church&Dwight Co.，Princeton，NJ，USA)去除在肿瘤区域和颈静脉周围的毛发。使用注射器泵(哈弗大学装置(Harvard Apparatus)，Holliston，MA，USA)，将超声造影剂(Definity

，Bristol-Meyers Squibb Medical Imaging，Inc.Billerica，MA，USA)以3μl/min的恒定输注速率穿过颈静脉穿孔施用。在管线(tubing line)上使用搅拌器(Sonicare，Koninklij ke Philips Electronics，Eindhoven，荷兰)来防止由溶液中的沉降产生的微泡。将使用15L8-S探针的Acuson Sequoia C512系统(西门子医疗溶液(Siemens Medical Solutions)，Malvern，PA，USA)用于超声波成像。使用下面的参数进行谐波成像：P14MHz，-10dB，MI 0.21，34μm的轴向和横向分辨率和20帧/秒的帧频(frame rate)。将超声波探针与动物垂直对准并确定肿瘤的中心。以3μl/min的恒定速率释放微泡，达2分钟，以获得稳态。在获得稳态递送后，获得总共250帧的超声波数据进行分析。捕获20帧的稳态数据。接着，使用高功率脉冲(MI 1.9和5帧突发延续时间(frames burst duration))破坏微泡，并通过获得另外230帧的数据来监测微泡向视野中的回流。重复这种方法以获得距肿瘤的中心+/-1mm的两个以上的平面。

图像分析：使用Wei等.通过用超声诱导破坏作为恒定静脉输注施用的微泡来量化心肌血流(Quantification of myocardial blood flow with ultrasound-induced destruction of micro-bubbles administered as a constant venous infusion)，循环(Circulation)，1998；97：473-483所述的指数等式来对在破坏后，微泡向视野中的回流进行建模。

(1)            y＝A(1-e^-βt)

其中A代表图像强度并且β是速率常数。将紧接着破坏后的帧用于确定背景噪声强度，并且将其以像素-像素基础从回流数据中扣除。将每个像素的A估计为来自微泡破坏之前稳态帧的平均背景-校正的强度。通过在微泡破坏之后取强度值的自然log并在完整的回流阶段进行线性拟合来确定β。接着，将拟合的值用于在每个像素位置产生β值的图谱。使用下列由Wei等.通过用超声诱导破坏作为恒定静脉输注施用的微泡来量化心肌血流(Quantification of myocardial blood flow with ultrasound-induced destruction of micro-bubbles administered as a constant venous infusion)，循环(Circulation)，1998；97：473-483推导的等式来计算通过肿瘤的相对血流，f：

(2)             fαAβ

比较PyMT.epiVEGF-/-肿瘤与大小匹配的PyMT.VEGF+/+肿瘤揭示在相对血流中没有显著的差异(图4A-C)。因此，尽管在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中存在血管系统的减少，血液向肿瘤的相对递送似乎并没有被不利地影响。

实施例6：在PyMT乳腺上皮肿瘤上表达VEGFR1

除了内皮细胞之外，来自人和小鼠乳腺癌的肿瘤上皮细胞显示表达VEGF受体1(VEGFR1)和2(VEGFR2)(Price DJ等.，血管内皮生长因子在乳腺癌细胞的细胞侵入的刺激和信号传导中的作用(Role of vascular endothelial growth factor in the stimulation of cellular invasion and signaling of breast cancer cells).细胞生长差异(Cell Growth Differ.)2001；12：129-35，Wu Y等.，抗-血管内皮细胞生长因子受体-1拮抗剂抗体作为癌症的治疗剂(Anti-vascular endothelial growth factor receptor-1antagonist antibody as a therapeutic agent for cancer)，临床癌症研究(Clin Cancer Res)，2006，12：6573-6584)。

将所有的组织固定在4％福尔马林中并进行石蜡-包埋。对5μm厚的切片进行脱石蜡，在4μg/ml的蛋白酶K中于37℃脱蛋白30分钟，并且进一步加工用于原位杂交，如前所述(见，例如，Lu L.H.和Gillett，N.A.原位使用PCR产生的³³P-标记的核糖核酸探针进行优化方法(An optimizedprotocol for in situ using PCR generated ³³P-labeled riboprobes).细胞显象(Cell Vision)19941：169-176，Holcomb等.，FIZZ1，一种与肺部炎症相关的新的富含半胱氨酸的分泌蛋白，定义了一个新的基因家族(a novel cysteine-rich secreted protein associated with pulmonary inflammation，definesa new gene family).EMBO J.2000Aug 1；19(15)：4046-55)。将³³P-UTP标记的有义和反义探针与切片在55℃杂交过夜。通过在20μg/ml RNA酶A中在37℃温育30分钟，随后在0.1X SSC中，在55℃进行高严谨性的洗涤，达2小时，并且通过梯度乙醇系列进行脱水去除未杂交的探针。将载玻片浸入NBT2核示踪乳状液(Eastman Kodak，Rorchester，NY)中，在包含干燥剂的密封塑料载玻片盒中在4℃暴露4周，显影，并用苏木精和曙红进行复染。使用下述的引物对下面的探针模板进行PCR扩增。鼠VEGF外显子3，VEGFR1，和VEGFR2的上游引物和下游引物具有附于5′末端的27个核苷酸延伸，所述27个核苷酸延伸分别编码T7 RNA聚合酶和T3RNA聚合酶启动子，用于产生有义和反义转录体。鼠VEGF外显子3PCR探针模板：对应于NM_009505的nt 202-394的192nt，上游引物-5′-TGATCAAGTTCATGGACGTCTACC-3′，下游引物-5′-ATGGTGATGTTGCTCTCTGA CG-3′。鼠VEGFR1 PCR探针模板：对应于NM_010228的nt 1570-2191的622nt，上游引物-5′-CAAGCCCACC TCTCTATCC-3′，下游引物-5′-CTTCCCCTGT GTATATGTTC C-3′。鼠VEGFR2PCR探针模板：对应于NM_010612的nt 318-984的667nt，上游引物-5′-GCCTCTGTGGGTTTGACTG  -3′，下游引物-5′-CTCCGGCAGATAGCTCAATTT-3′。

将PyMT.epiVEGF-/-肿瘤与大小匹配的PyMT.VEGF+/+肿瘤进行比较。在相等大小的PyMT.VEGF+/+和PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中进行关于VEGFR1和VEGFR2转录体的原位杂交(ISH)分析。在对照PyMT.VEGF+/+肿瘤(图5A)中观察到关于VEGFR1 mRNA的中度表达，而在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中的VEGFR1 mRNA表达通常更弱和更易变(图5B)。在PyMT.VEGF+/+肿瘤(图5E)中发现与内皮细胞来源一致的相对均一的强烈的VEGFR2mRNA表达，而在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中的VEGFR2mRNA表达通常更弱和更易变(图5F)。

实施例7：在表皮VEGF缺陷型乳腺肿瘤中的VEGFR1和VEGFR2的基 因图谱

定量实时PCR分析显示与PyMT.VEGF+/+肿瘤比较，在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中的VEGFR1(图6A)和VEGFR2(图6B)mRNA的更低mRNA表达。

根据生产商的说明书，使用Trizol试剂(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)从实体瘤中分离总的RNA，随后用Turbo DNA-free(Ambion，Inc.，Carlsbad，CA)进行DNA酶处理，酚/氯仿/异戊醇25∶24∶1纯化和乙醇沉淀。将RNA重悬在无RNA酶的水(Ambion，Inc.，Carlsbad，CA)中并贮存在-80℃。通过吸光度光谱测定法确定RNA浓度。使用关于每种基因设计的TaqMan探针和引物组来确定目的基因的相对水平，并且使用ABI 7500实时PCR系统(应用生物系统(Applied Biosystem)，Foster City，CA)进行实时PCR。关于鼠VEGFR1的引物和探针组：5′-GTC GGC TGC AGT GTG TAA GT-3′(正向)，5′-TGC TGT TCT CAT CCG TTT CT-3′(反向)，和5′-FAM-CAGGCG ATG AGA CAG AGG CTA CCA-TAMRA-3′(探针)。关于鼠VEGFR2的引物和探针组：5′-TGT CAA GTG GCG GTA AAG G-3′(正向)，5′-CAC AAA GCT AAA ATA CTG AGG ACT T-3′(反向)和5′-FAM-CTGGTG TTC TTC CTC TAT CTC CAC TCC-TAMRA-3′(探针)。

还将RNA样品与完整的小鼠基因组430 2.0阵列在设定于60r.p.m的rotisserie炉中，在45℃杂交19小时。将阵列进行洗涤，染色，并在Affymetrix Fluidics站和扫描器中进行扫描。使用Genentech专用软件进行基因组分析。使用ABI 7500实时PCR系统(应用生物系统(Applied Biosystem)，Foster City，CA)，根据生产商的说明书(SuperArray Bioscience，Frederick，MD)，使用RT² Profiler小鼠血管发生PCR阵列，关于每种肿瘤RNA样品分析血管发生-相关基因表达。

这些结果显示PyMT.epiVEGF-/-肿瘤具有减少的VEGFR1和VEGFR2的mRNA水平(图6A-B)。

实施例8：在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中的残余VEGF对于肿瘤发生不是 关键的

与PyMT.VEGF+/+肿瘤比较，通过ELISA测量的PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中的VEGF蛋白水平减少～75％(图7A)，这说明肿瘤上皮细胞是该模型中VEGF的主要来源。人癌细胞系的异种移植模型显示浸润的基质细胞可以明显地有助于肿瘤发育和生长(Gerber等.，完全抑制横纹肌肉瘤异种移植物生长的新血管化需要封闭肿瘤和宿主血管内皮生长因子二者(Complete inhibition of rhabdomyosarcoma xenograft growth and neovascularization requires blockade of both tumor and host vascular endothelial growth factor).癌症研究(Cancer Res).2000年11月15日；60(22)：6253-8.)。

将切除的肿瘤在包含150mM氯化钠，1％Triton X-100，1％脱氧胆酸-钠盐，0.1％十二烷基硫酸钠，50mM Tris-HCl，pH 7.5，2mM EDTA(Teknova，Inc.，Hollister，CA)的RIPA缓冲液或具有2mM EDTA的50mMTris-HCL，pH 7.4中进行匀浆化。给两种裂解缓冲液补充Complete

蛋白酶抑制剂混合物片剂(罗氏(Roche)，Indianapolis，IN)并将其贮存在-80℃。根据生产商的说明书(Pierce，Rockford，IL)，使用BCA蛋白测定试剂盒来确定总的蛋白含量。如前所述进行小鼠的VEGF ELISA(Liang等，杂交物种血管内皮细胞生长因子(VEGF)-封闭抗体完全抑制人肿瘤异种移植物的生长并测量基质VEGF的贡献(Cross-species vascular endothelial growth factor(VEGF)-blocking antibody completely inhibit the growth of human tumor xenografts and measure the contribution of stromal VEGF)，生物化学杂志(J Biol Chem)，2006年1月13日；281(2)：951-61)。将所有的组织固定在4％福尔马林中并进行石蜡-包埋。对5μm厚的切片进行脱石蜡，在4μg/ml的蛋白酶K中于37℃脱蛋白30分钟，并且进一步加工用于原位杂交，如前所述(见，例如，Lu L.H.和Gillett，N.A.原位杂交使用PCR产生的³³P-标记的核糖核酸探针进行优化方法(An optimized protocol for in situ hybridization using PCR generated ³³P-labeled riboprobes).细胞显象(Cell Vision)19941：169-176，Holcomb等.，FIZZ1，一种与肺部炎症相关的新的富含半胱氨酸的分泌蛋白，定义了一个新的基因家族(a novel cysteine-rich secreted protein associated with pulmonary inflammation，defines a new gene family).EMBO J. 2000 Aug 1；19(15)：4046-55)。将³³P-UTP标记的有义和反义探针与切片在55℃杂交过夜。通过在20μg/ml RNA酶A中在37℃温育30分钟，随后在0.1XSSC中，在55℃进行高严谨性的洗涤，达2小时，并且通过梯度乙醇系列进行脱水去除未杂交的探针。将载玻片浸入NBT2核示踪乳状液(Eastman Kodak，Rorchester，NY)中，在包含干燥剂的密封塑料载玻片盒中在4℃暴露4周，显影，并用苏木精和曙红进行复染。使用下述的引物对下面的探针模板进行PCR扩增。鼠VEGF外显子3，VEGFR1，和VEGFR2的上游引物和下游引物具有附于5′末端的27个核苷酸延伸，所述27个核苷酸延伸分别编码T7 RNA聚合酶和T3 RNA聚合酶启动子，用于产生有义和反义转录体。鼠VEGF外显子3PCR探针模板：对应于NM_009505的nt 202-394的192nt，上游引物-5′-TGATCAAGTTCATGGACGTCTACC-3′，下游引物-5′-ATGGTGATGTTGCTCTCTGA CG-3′。

为了在PyMT乳腺肿瘤中定位表达VEGF，使用特异于VEGF外显子3的核糖核酸探针在相等大小的肿瘤上进行原位杂交分析。通过在每个小鼠中每周的肿瘤结节的数量相加来确定每只小鼠的累积的肿瘤数量。使用公式LxWxW/2＝肿瘤体积(mm³)(L＝以mm表示的更长的直径长度；W＝以mm表示的更短的直径宽度)来计算肿瘤体积(Blaskovich MA等.，(2000)，GFB-111的设计，具有针对小鼠中肿瘤的抗生血管和抗癌活性的血小板衍生的生长因子结合分子(Design of GFB-111，a platelet-derivedgrowth factor binding molecule with antiangiogenic and anticancer activityagainst human tumor in mice)。自然生物技术(Nat Biotechnol)18：1065-1070)。通过在每只小鼠中对每个肿瘤结节的体积相加来确定每只小鼠的累积肿瘤体积。

在PyMT.VEGF+/+肿瘤中，VEGF表达广泛分布在肿瘤中，其中在接近坏死区域具有最高的表达(图7B)。与此相对，在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤的peri-坏死区域中，VEGF表达明显更弱并且缺乏上调的证据(图7C)。这些结果，与平滑肌肌动蛋白染色(数据未显示)一起，显示增加的VEGF基质产生或募集对于PyMT.epiVEGF-/-肿瘤形成和生长不是可能的机制。在用抗-VEGF抗体处理的PyMT，VEGF+/+小鼠中观察到在可触及的肿瘤发育(图8A)和平均累积肿瘤体积(图8B)的明显延迟。在PyMT.epiVEGF-/-小鼠中没有发现治疗效果。这些结果显示在PyMT.epiVEGF-/-小鼠中的肿瘤生长不依赖于这些肿瘤中的残余VEGF的存在(图7A-G)。

实施例9：上皮VEGF缺陷型乳腺肿瘤的基因图谱

在鉴定涉及PyMT.epiVEGF-/-肿瘤发生的因子的尝试中，使用Affymetrix微阵列芯片分析和SuperArray RT² Profiler小鼠血管发生PCR阵列(数据未显示)进行大小匹配的PyMT.VEGF+/+和PyMT.epiVEGF-/-肿瘤的基因表达图谱。通过定量RT-PCR分析证实候选基因，即PlGF，IL-1β，PDGFC和化学引诱物S100A8和S100A9。

根据生产商的说明书，使用Trizol试剂(Invitrogen Corp，Carlsbad，CA)从实体瘤中分离总的RNA，随后用Turbo DNA-fress(Ambion，Inc.，Carlsbad，CA)进行DNA酶处理，酚/氯仿/异戊醇25∶24∶1纯化和乙醇沉淀。将RNA重悬在无RNA酶的水(Ambion，Inc.，Carlsbad，CA)中并贮存在-80℃。通过吸光度光谱测定法确定RNA浓度。

使用关于每种基因设计的TaqMan探针和引物组来确定目的基因的相对水平，并且使用ABI 7500实时PCR系统(应用生物系统(AppliedBiosystem)，Foster City，CA)进行实时PCR。关于鼠PlGF的引物和探针组：5′-GCA GTA GCC CGT GGA CTT TG-3′(正向)，5′-GGC TCA CTT CCCGTA GCT GTA-3′(反向)，和5′-FAM-TGG GTT GTG TGT CTTC-TAMRA-3′(探针)。关于鼠IL-1β的引物和探针组：5′-ACA TTA GGCAGC ACT CTC TAG AAC-3′(正向)，5′-GTG CAG GCT ATG ACC AATTC-3′(反向)，和5′-FAM-CCC CAC ACGTTG ACA GCT AGG TTCT-TAMRA-3′(探针)。关于鼠S100A8的引物和探针组：5′-TGT CCT CAGTTT GTG CAG AAT ATAAA-3′(正向)，5′-TCACCATCG CAAGGAACTCC-3′(反向)和5′-FAM-CGA AAA CTT GTT CAG AGA ATT GGA CATCAA TAG TGA-TAMRA-3′(探针)。关于鼠S100A9的引物和探针组：5′-GGT GGAAGC ACAGTT GGC A-3′(正向)，5′-GTG TCC AGG TCC TCCATG ATG-3′(反向)和5′-FAM-TGA AGA AAG AGA AGA GAA ATG AAGCCC TCA TAA ATG-TAMRA-3′(探针)。关于鼠PDGFC的引物和探针组：5′-CTT TAA ACT CTG CTC CAT ACA CTT G-3′(正向)，5′-CAG ATT AAGCAT TTA CAA GCA ATG-3′(反向)，和5′-FAM-TTG CAA TTG CCA AAGAGT ATA ATA AGT GAA CTC C-TAMRA-3′(探针)。关于鼠GAPDH的引物和探针组：5′-GGC ATT GCT CTC AAT GAC AA-3′(正向)，5′-CTG TTGCTG TAG CCG TAT TCA-3′(反向)，和5′-FAM-TGT CAT ACC AGG AAATGA GCT TGA CAA AG-TAMRA-3′(探针)。关于鼠β肌动蛋白的引物和探针组：5′-AGA TTA CTG CTC TGG CTC CTA-3′(正向)，5′-CAA AGAAAG GGT GTA AAA CG-3′(反向)，和5′-FAM-CGG ACT CAT CGT ACTCCT GCT TGC TG-TAMRA-3′(探针)。

还将RNA样品与完整的小鼠基因组4302.0阵列在设定于60r.p.m的rotisserie炉中，在45℃杂交19小时。将阵列进行洗涤，染色，并在Affymetrix Fluidics站和扫描器中进行扫描。使用Genentech专用软件进行基因组分析。使用ABI 7500实时PCR系统(应用生物系统(Applied Biosystem)，Foster City，CA)，根据生产商的说明书(SuperArray Bioscience，Frederick，MD)，使用RT² Profiler小鼠血管发生PCR阵列，关于每种肿瘤RNA样品分析血管发生-相关基因表达。

这些结果显示PyMT.epiVEGF-/-肿瘤具有增加的PlGF(图9A)，IL-1β(图9B)S100A8(图9C)和S100A9(图9D)的mRNA水平。PDGFC的mRNA水平(图9E)在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中减少。

实施例10：上皮VEGF缺陷型乳腺肿瘤的蛋白图谱

检查生血管和炎性因子在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤中的蛋白表达水平。

关于生长因子和细胞因子的ELISA测定法：将切除的肿瘤在包含150mM氯化钠，1％Triton X-100，1％脱氧胆酸-钠盐，0.1％十二烷基硫酸钠，50mM Tris-HCl，pH 7.5，2mM EDTA(Teknova，Inc.，Hollister，CA)的RIPA缓冲液或具有2mM EDTA的50mM Tris-HCL，pH 7.4中进行匀浆化。给两种裂解缓冲液补充Complete

蛋白酶抑制剂混合物片剂(罗氏(Roche)，Indianapolis，IN)并将其贮存在-80℃。根据生产商的说明书(Pierce，Rockford，IL)，使用BCA蛋白测定试剂盒来确定总的蛋白含量。如前所述进行小鼠的VEGF ELISA(Liang等，杂交物种血管内皮细胞生长因子(VEGF)-封闭抗体完全抑制人肿瘤异种移植物的生长并测量基质VEGF的贡献(Cross-species vascular endothelial growth factor(VEGF)-blockingantibody completely inhibit the growth of human tumor xenografts andmeasure the contribution of stromal VEGF)，生物化学杂志(J Biol Chem)，2006年1月13日；281(2)：951-61)。根据生产商的说明书(Upstate USA，Inc.，Chicago，IL)，使用在LUMINEX

100^TM系统上的BEADLYTE

小鼠多-细胞因子检测系统2确定IL-1β水平。根据生产商的说明书(R&D系统(R&D Systems)，Minneapolis，MN)，使用Quantikine小鼠PlGF-2免疫测定法(Quantikine Mouse PlGF-2 Immunoassay)确定PlGF水平。

与mRNA变化一致，PyMT.epiVEGF-/-肿瘤裂解物与PyMT.VEGF+/+肿瘤相比具有更高的PlGF(图10A)，和IL-1β(图10B)蛋白水平。此外，与对照肿瘤相比，肝细胞生长因子(HGF)水平在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤裂解物中增加(图10C)。

认为本说明书足以使得本领域技术人员实施本发明。根据以上说明，本发明在本文所显示的和描述的之外的各种修饰对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且落入所附的权利要求的范围之内。将本文中引用的所有出版物、专利和专利申请收入本文作为参考以用于各种目的。

实施例11：细胞迁移测定法

该研究尝试进一步研究细胞因子和生长因子在PyMT.epiVEGF-/-肿瘤生长和迁移中的作用。

原代上皮细胞，即KO.1，KO.2，KO.3和KO.4分离自PyMT.epiVEGF-/-肿瘤。原代上皮细胞，即WT.1，WT.2，WT.3，WT.4和WT.5分离自PyMT.epiVEGF+/+肿瘤中。WT.c是来自从PyMT.VEGF+/+.loxP肿瘤产生的细胞系的上皮细胞。KO.c是从PyMT.VEGF+/+.loxP肿瘤产生的细胞系的上皮细胞，其中VEGF通过体外感染表达Cre-重组酶的腺病毒(Adeno-Cre)被敲除。通过用抗-Cre重组酶抗体进行的免疫细胞化学证实上皮细胞-特异性Cre-loxP重组。在Ko.c细胞系中通过ELISA不可检测到VEGF表达水平。

使用BD Falcon^TM FluoroBlok^TM 24-Multiwell Insert System(多孔插入系统)，8um孔径(BD生物科学(BD Biosciences)，Bedford，MA)进行迁移测定法。将所述板用5ug/ml纤连蛋白(西格玛(Sigma))在37℃包被2小时。将在300μl测定培养基(0.5％FBS，DMEM/F12)中的细胞加入上室中。将在750ul测定培养基中的HGF 40ng/ml加入下室中，并将细胞在37℃温育18小时。将下表面上的细胞在MeOH中固定，并用YO-PRO-1(分子探针(Molecular Probes)，Eugene，Oregon)染色。使用ImageXpress Micro平台(MDS分析(MDS Analytical)；Sunnyvale，CA)获得并分析图像。将在Metamorph中的核计数应用(Count Nuclei application)用于鉴定和计数迁移的细胞。

关于来自PyMT.epiVEGF+/+小鼠的原发肿瘤的针对HGF的迁移反应的平均增加是1.8。关于来自PyMT.epiVEGF-/-小鼠的原发肿瘤的针对HGF的迁移反应的平均增加是2.5。双重诱导中的差异是统计学显著的(P＜0.05)。细胞系，即KO.c和WT.c在针对HGF的迁移反应中显示与上述原代肿瘤细胞中的那些类似的增加，即基线迁移更低，而相对于来自WT.c的细胞，关于来自KO.c的细胞用HGF治疗的迁移的倍数增加更高(2.3vs1.5)(图12)。

这些结果说明被剥夺了VEGF信号传导的肿瘤细胞对如HGF的其它因子的反应性更高，这可能是因为这些肿瘤细胞必需依赖于其它因子存活、生长和迁移。象这样，不依赖VEGF的肿瘤对使用封闭，例如HGF-cMet途径的拮抗剂的疗法更敏感。

Claims (45)

1.一种在受试者中检测不依赖VEGF的肿瘤的方法，所述方法包括在获自所述受试者的测试样品中确定一种或多种基因的表达水平，其中与参照样品比较在所述测试样品中一种或多种基因的表达水平的变化指示不依赖VEGF的肿瘤在所述受试者中的存在，其中至少一种基因选自由S100A8、S100A9、Tie-1、Tie-2、PDGFC和HGF组成的组中。

2.权利要求1的方法，其中所述表达水平是mRNA表达水平。

3.权利要求2的方法，其中所述mRNA表达水平是使用微阵列或qRT-PCR进行测量的。

4.权利要求2的方法，其中在所述mRNA表达水平上的变化是增加。

5.权利要求4的方法，其中所述基因的一种是S100A8或S100A9。

6.权利要求2的方法，其中在所述mRNA表达水平上的变化是减少。

7.权利要求6的方法，其中所述基因的一种是PDGFC，Tie-1或Tie-2。

8.权利要求1的方法，其中所述基因的一种是Tie-1或Tie-2，并且所述方法还包括确定所述测试样品中的第二种基因的mRNA表达水平，其中所述第二种基因是CD31、CD34、VEGFR1或VEGFR2。

9.权利要求8的方法，其中在所述测试样品中的CD31、CD34、VEGFR1或VEGFR2的mRNA表达水平与所述参照样品比较是减少的。

10.权利要求1的方法，其中所述表达水平是蛋白表达水平。

11.权利要求10的方法，其中所述蛋白表达水平是使用免疫测定法测量的。

12.权利要求11的方法，其中所述免疫测定法是ELISA。

13.权利要求10的方法，其中在所述蛋白表达水平上的变化是增加。

14.权利要求13的方法，其中所述基因的一种是HGF。

15.一种在受试者中检测不依赖VEGF的肿瘤的方法，所述方法包括在获自所述受试者的测试样品中确定两种以上基因的表达水平，其中与参照样品比较在所述测试样品中两种以上基因的表达水平的改变指示在所述受试者中不依赖VEGF的肿瘤的存在，其中至少两种基因选自由S100A8、S100A9、Tie-1、Tie-2、CD31、IL-1β、PlGF、PDGFC和HGF组成的组中。

16.权利要求15的方法，其中所述表达水平是mRNA表达水平。

17.权利要求16的方法，其中在所述mRNA表达水平上的变化是增加。

18.权利要求17的方法，其中所述基因的一种是S100A8，S100A9，PlGF或IL-1β。

19.权利要求16的方法，其中在所述mRNA表达水平上的变化是减少。

20.权利要求19的方法，其中所述基因的一种是PDGFC、Tie-1、Tie-2或CD31。

21.权利要求15的方法，其中所述表达水平是蛋白表达水平。

22.权利要求21的方法，其中在所述蛋白表达水平上的变化是增加。

23.权利要求22的方法，其中所述基因的一种是IL-1β、PlGF或HGF。

24.权利要求23的方法，其中所述基因的两种是IL-1β和PlGF。

25.权利要求1或15的方法，其中所述受试者是人。

26.权利要求25的方法，其中所述受试者被诊断患有癌症。

27.权利要求26的方法，其中所述癌症选自由非小细胞肺癌、肾细胞癌、成胶质细胞瘤、乳腺癌和结肠直肠癌组成的组中。

28.权利要求1或15的方法，所述方法还包括治疗患有不依赖VEGF的肿瘤的受试者，包括向所述受试者施用有效量的下列的至少一种：IL-1β拮抗剂、PlGF拮抗剂、S100A8拮抗剂、S100A9拮抗剂、HGF拮抗剂或c-Met拮抗剂。

29.权利要求28的方法，所述方法还包括向所述受试者施用有效量的化疗剂。

30.权利要求28的方法，所述方法还包括向所述受试者施用有效量的VEGF拮抗剂。

31.权利要求30的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗-VEGF抗体。

32.权利要求31的方法，其中所述抗-VEGF抗体是单克隆抗体。

33.权利要求32的方法，其中所述抗-VEGF抗体是贝伐珠单抗。

34.一种治疗受试者中的不依赖VEGF的肿瘤的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的下列中的任一种：IL-1β拮抗剂、PlGF拮抗剂、S100A8拮抗剂、S100A9拮抗剂、HGF拮抗剂或c-Met拮抗剂。

35.权利要求34的方法，所述方法还包括向所述受试者施用有效量的VEGF拮抗剂。

36.权利要求35的方法，其中所述VEGF拮抗剂是抗-VEGF抗体。

37.权利要求36的方法，其中所述抗-VEGF抗体是单克隆抗体。

38.权利要求37的方法，其中所述抗-VEGF抗体是贝伐珠单抗。

39.权利要求34的方法，其中所述IL-1β拮抗剂是抗-IL-1β抗体。

40.权利要求34的方法，其中所述c-Met拮抗剂是抗-c-Met抗体。

41.权利要求34的方法，其中所述HGF拮抗剂是抗-HGF抗体。

42.权利要求34的方法，其中所述受试者是人。

43.权利要求42的方法，其中所述受试者被诊断患有癌症。

44.权利要求43的方法，其中所述癌症选自由非小细胞肺癌、肾细胞癌、成胶质细胞瘤、乳腺癌和结肠直肠癌组成的组中。

45.权利要求34的方法，其中所述方法还包括向所述受试者施用有效量的化疗剂。

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