CN101448856A - 肿瘤的诊断和治疗 - Google Patents

Abstract

提供了使用包括抗VEGF抗体在内的组合疗法治疗癌症的方法。还提供了诊断抗性肿瘤的方法。

Description

肿瘤的诊断和治疗

相关申请

本申请要求2006年3月29日提交的美国临时申请No.60/787,720的权益。

发明领域

本发明涉及肿瘤生长和肿瘤类型的领域。本发明涉及肿瘤的抑制物和诊断标志物，以及它们用于癌症和肿瘤生长的诊断和治疗的用途。

发明背景

恶性肿瘤(癌)是在美国位居心脏病之后的第二位致死原因(参见例如Boring et al.，CA Cancel J.Clin.43：7(1993))。癌的特征为衍生自正常组织的异常或赘生性细胞的数目增加，所述细胞增殖形成肿瘤块；这些赘生性肿瘤细胞侵入邻近组织；及产生恶性细胞，所述恶性细胞最终经血液或淋巴系统传播至局部淋巴结并经称为转移的过程传播至远处。在癌性状态，细胞在正常细胞不会生长的条件下增殖。癌自身表现为极其多种形式，特征为不同程度的侵袭力和进攻性。

多种类型的疗法已经被用于治疗癌症。例如，使用手术方法来切除癌性的或死亡的组织。通过缩小实体瘤来起作用的放射疗法和快速杀死正在分裂的细胞的化学疗法被用作癌症疗法。此外，抗血管发生剂是一种有效的抗癌策略。这些疗法也在增强，同时其它疗法正在发展，例如免疫疗法。

现在完全确立了血管发生(angiogenesis)牵涉多种病症的发病机理。这些包括实体瘤和转移、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管疾病诸如增殖性视网膜病例如糖尿病性视网膜病、年龄相关黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜组织和其它组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、和银屑病。Folkman et al.，J.Biol.Chem.267：10931-34(1992)；Klagsbrun et al.，Annu.Rev.Physiol.53：217-39(1991)；及Garner A.，“Vascular diseases”，于《Pathobiology of Ocular Disease.A Dynamic Approach》，Garner A和Klintworth GK编，第2版，Marcel Dekker，NY，1994，pp 1625-1710。

在肿瘤生长的情况中，血管发生对于自增生至瘤形成的转换，及为肿瘤的生长和转移提供营养似乎是至关重要的。Folkman et al.，Nature 339：58(1989)。新血管形成(neovascularization)让肿瘤细胞获得了与正常细胞相比的生长优势和增殖自治。肿瘤通常开始于单个异常细胞，由于与可利用毛细管床的距离，该细胞只能增殖至几立方毫米的尺寸，而且它能在较长的一段时间里保持“休眠”状态而不进一步生长和传播。有些肿瘤细胞然后转向血管发生表型以激活内皮细胞，所述内皮细胞增殖并成熟成新的毛细血管。这些新形成的血管不仅让原发性肿瘤继续生长，而且让转移性肿瘤细胞传播并再建群(recolonization)。因而，在肿瘤切片中的微血管密度与乳腺癌及数种其它肿瘤的患者存活之间观察到了相关性。Weidner et al.，N.Engl.J.Med.324：1-6(1991)；Horak et al.，Lancet 340：1120-24(1992)；Macchiarini et al.，Lancet 340：145-46(1992)。尚未完全了解控制血管发生转换的精确机制，但是认为肿瘤块的新血管形成源自众多血管发生刺激物与抑制物的净平衡。Folkman，Nat Med 1(1)：27-31(1995)。

血管内皮生长因子(VEGF)作为病理学状况中血管发生的主要调节物的认识已经引起了许多尝试来阻断VEGF活性。VEGF是最好表征的和最强力的血管发生正调节物之一。参见例如Ferrara，N.& Kerbel，R.S.Angiogenesis as a therapeutic target.Nature 438：967-74(2005)。在作为血管发生和血管生成(vasculogenesis)中的血管发生因子之外，VEGF作为多效性生长因子展现了在其它生理学过程中的多种生物学效应，诸如内皮细胞存活、血管通透性和血管舒张、单核细胞趋化性和钙流入。Ferrara and Davis-Smyth，Endocrine Rev.18：4-25(1997)。此外，研究已经报导了VEGF对数种非内皮细胞类型，诸如视网膜色素上皮细胞、胰管细胞和施旺细胞的促有丝分裂效果。参见例如Guerrin et al.，J.Cell Physiol.164：385-394(1995)；Oberg-Welsh et al.，Mol.Cell.Endocrinol.126：125-132(1997)；及Sondell et al.，J.Neurosci.19：5731-5740(1999)。

已经有许多尝试来阻断VEGF活性。抑制性抗VEGF受体抗体、可溶性受体构建物、反义策略、针对VEGF的RNA适体和低分子量VEGF受体酪氨酸激酶(RTK)抑制物都被提出用于干扰VEGF信号传导。参见例如Siemeister etal.，Cancer Metastasis Rev.17：241-248(1998)。抗VEGF中和性抗体已经显示了在裸鼠中抑制多种人类肿瘤细胞系的生长(Kim et al.，Nature 362：841-844(1993)；Warren et al.，J.Clin.Invest.95：1789-1797(1995)；

 et al.，Cancer Res.56：4032-4039(1996)；及Melnyk et al.，Cancer Res.56：921-924(1996))，并且还在缺血性视网膜病症的模型中抑制了眼内血管发生。Adamiset al.，Arch.Ophthalmol.114：66-71(1996)。实际上，人源化抗VEGF抗体贝伐单抗(bevacizumab，，Genentech，South San Francisco，CA)已经被US FDA批准作为转移性结肠直肠癌的第一线疗法。参见例如Ferrara etal.，Nature Reviews Drug Discovery 3：391-400(2004)。

然而，治疗性化合物干扰肿瘤生长的长期能力经常受到药物抗性的发生/发展的限制。已经鉴定了和在功能上表征了针对多种细胞毒性化合物的抗性的数种机制，主要是在单细胞肿瘤模型中。参见例如Longley，D.B.&Johnston，P.G.，Molecular mechanisms of drug resistance.J Pathol 205：275-92(2005)。此外，宿主基质-肿瘤细胞相互作用可能牵涉药物抗性表型。基质细胞分泌多种促血管发生因子，而且不倾向于与肿瘤细胞相同的遗传不稳定性和在突变率方面的升高(Kerbel，R.S.，Inhibition of tumor angiogenesis as a strategy tocircumvent acquired resistance toanti-cancer therapeuticagents.Bioessays13：31-6(1991)。综述见Ferrara & Kerbel及Hazlehurst et al.于Ferrara，N.& Kerbel，R.S.，Angiogenesis as a therapeutic target.Nature438：967-74(2005)；及Hazlehurst，L.A.，Landowski，T.H.& Dalton，W.S.，Role of the tumor microenvironment in mediating de novo resistance to drugs and physiological mediators of cell death.Oncogene 22：7396-402(2003)。在临床前模型中，利用人源化单克隆抗体贝伐单抗(bevacizumab，

Genentech，South San Francisco，CA)或贝伐单抗的鼠前体(A4.6.1；产生A4.6.1的杂交瘤细胞系于91年3月29日保藏，ATCC HB-10709)阻断VEGF信号传导在所测试的大多数异种移植物模型中显著抑制了肿瘤生长并降低肿瘤血管发生(综述见Gerber & Ferrara于Gerber，H.P.& Ferrara，N.，Pharmacology and pharmacodynamics of bevacizumab as monotherapy or in combination with cytotoxic therapy in preclinical studies.Cancer Res 65：671-80(2005))。当在肿瘤生长早期阶段开始治疗时，单一药剂抗VEGF治疗的药理学效果是最显著的。如果治疗延迟到肿瘤很好地建立，那么抑制效果一般是短暂的，而且肿瘤最终发生/发展出抗性。参见例如Klement，G.et al.，Differences in therapeutic indexes of combination metronomic chemotherapy and an anti-VEGFR-2 antibody in multidrug-resistant human breast cancer xenografts.Clin Cancer Res 8：221-32(2002)。作为针对抗VEGF治疗的此类抗性的基础的细胞和分子事件是复杂的。参见例如Casanovas，O.，Hicklin，D.J.，Bergers，G.&Hanahan，D.，Drug resistance by evasion of antiangiogenic targeting of VEGF signaling in late-stage pancreatic islet tumors.Cancer Cell 8：299-309(2005)；及Kerbel，R.S.et al.，Possible mechanisms of acquired resistance to anti-angiogenic drugs：implications for the use of combination therapy approaches.CancerMetastasis Rev 20：79-86(2001)。可能牵涉多种因子。例如，与靶向VEGF和成纤维细胞生长因子(FGF)信号传导的化合物的组合治疗在胰岛癌发生的成因模型中改善了效力且延迟了晚期阶段肿瘤中抗性的发作。参见Casanovas，O.，Hicklin，D.J.，Bergers，G.& Hanahan，D.，Drug resistance by evasion of antiangiogenic targeting of VEGF signaling in late-stage pancreatic islet tumors.Cancer Cell 8：299-309(2005)。其他研究人员已经鉴定了肿瘤浸润性基质成纤维细胞作为可选择的促血管发生因子的有力来源。参见例如Dong，J.et al.，VEGF-null cells require PDGFR alpha signaling-mediated stromal fibroblast recruitment for tumorigenesis.Embo J 23：2800-10(2004)；及Orimo，A.etal.，Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion.Cell121：335-48(2005)。

炎性细胞可通过分泌炎性细胞因子参与血管发生，所述炎性细胞因子可影响内皮细胞活化、增殖、迁移和存活(综述见Albini et al.及Balkwill et al.于Albini，A.，Tosetti，F.，Benelli，R.& Noonan，D.M.，Tumor inflammatory angiogenesis and its chemoprevention.Cancer Res 65：10637-41(2005)；及Balkwill，F.，Charles，K.A.& Mantovani，A.，Smoldering and polarized inflammation in the initiation and promotion of malignant disease.Cancer Cell7：211-7(2005)。数种肿瘤浸润性炎性细胞分泌促血管发生因子，包括单核细胞/巨噬细胞(参见例如De Palma，M.et al.，Tie2 identifies a hematopoietic lineage of proangiogenic monocytes required for tumor vessel formation and a mesenchymal population of pericyte progenitors.Cancer Cell 8：211-26(2005)；及Yang，L.et al.，Expansion of myeloid immune suppressor Gr+CD11b+cells in tumor-bearing host directly promotes tumor angiogenesis.Cancer Cell 6：409-21(2004))、T和B淋巴细胞(参见例如Freeman，M.R.et al.，Peripheral blood T lymphocytes and lymphocytes infiltrating human cancers express vascular endothelial growth factor：a potential role for T cells in angiogenesis.Cancer Res55：4140-5(1995))、血管的白细胞(参见例如Conejo-Garcia，J.R.et al.，Vascular leukocytes contribute to tumor vascularization.Blood 105：679-81(2005))、树突细胞(参见例如Conejo-Garcia，J.R.et al.，Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A.Nat Med 10：950-8(2004))、嗜中性细胞(参见例如Coussens，L.M.，Tinkle，C.L.，Hanahan，D.& Werb，Z.，MMP-9 supplied by bone marrow-derived cells contributes to skin carcinogenesis.Cell 103：481-90(2000))、及肥大细胞(参见例如Coussens，L.M.et al.，Inflammatory mast cells up-regulate angiogenesis during squamous epithelial carcinogenesis.Genes Dev13：382-97(1999)；及综述见de Visser and Coussens于de Visser，K.E.，Eichten，A.& Coussens，L.M.，Paradoxical roles of the immune system during cancer development.Nat Rev Cancer 6：24-37(2006))。有提出骨髓衍生的内皮祖细胞(EPC)(参见例如Lyden，D.et al.，Impaired recruitment of bone-marrow-derived endothelial and hematopoietic precursor cells blocks tumor angiogenesis and growth.Nat Med 7：1194-201(2001))和血管周的祖细胞(参见例如Song，S.，Ewald，A.J.，Stallcup，W.，Werb，Z.& Bergers，G.，PDGFRbeta+ perivascular progenitor cells in tumours regulate pericyte differentiation and vascular survival.Nat Cell Biol 7：870-9(2005))在肿瘤生长的有些实验模型中促进血管发生(综述见Rafii et al.于Rafii，S.，Lyden，D.，Benezra，R.，Hattori，K.& Heissig，B.，Vascular and haematopoietic stem cells：novel targets for anti-angiogenesis therapy？Nat Rev Cancer 2：826-35(2002))。髓样谱系造血细胞，包括肿瘤相关巨噬细胞(TAM)，显示了直接地通过分泌血管发生因子或间接地通过产生细胞外基质降解蛋白酶、继而释放被隔离的血管发生因子来刺激血管生成(综述见Lewis，C.E.& Pollard，J.W.，Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.Cancer Research 66：605-612(2006)；及Naldini，A.&Carraro，F.，Role of inflammatory mediators in angiogenesis.Curr Drug TargetsInflamm Allergy 4：3-8(2005))。在髓样细胞谱系中，分离自携瘤小鼠脾脏的CD11b+Gr1+祖细胞在与肿瘤细胞共注射时促进血管发生(参见例如Yang，L.et al.，Expansion of myeloid immune suppressor Gr+CD11b+cells in tumor-bearing host directly promotes tumor angiogenesis.Cancer Cell 6：409-21(2004))，而且肿瘤浸润性巨噬细胞数目与有些人类肿瘤中的不良预后有关(综述见Balkwill et al.于Balkwill，F.，Charles，K.A.& Mantovani，A.，Smoldering and polarized inflammation in the initiation and promotion of malignant disease.Cancer Cell 7：211-7(2005))。然而，在另一项研究中，巨噬细胞抑制了小鼠中实验肿瘤的生长，表明它们作为抗癌疗法的潜力。参见例如Kohchi，C.et al.，Utilization of macrophages in anticancer therapy：the macrophage network theory.Anticancer Res 24：3311-20(2004)。

尽管髓样细胞的相对丰度和它们产生前血管生成因子的潜力，它们在针对抗VEGF治疗的肿瘤抗性中的作用仍然是未知的。需要发现并了解髓样细胞的生物学功能、抗性肿瘤、及它们产生的因子。本发明解决了这些和其它需要，在阅读以下公开内容后将变得显而易见。

发明概述

本发明提供了用于诊断和治疗抗性肿瘤的方法和组合物。进一步的，提供了使用组合治疗来治疗抗性肿瘤的方法。例如，一种方法包括向具有抗性肿瘤的受试者施用有效量的VEGF拮抗剂以及有效量的第二药剂，其中所述第二药剂包含髓样细胞减少剂。所述髓样细胞减少剂能降低或完全消融髓样细胞，例如CD11b+Gr1+髓样细胞。在本发明的某些实施方案中，髓样细胞减少剂包括但不限于例如Gr1拮抗剂、CD11b拮抗剂、CD18拮抗剂、弹性蛋白酶抑制剂、MCP-1拮抗剂、MIP-1α拮抗剂、氯膦酸盐等。在一个实施方案中，所述拮抗剂是抗体。

本发明还提供了用于诊断抗性肿瘤的方法和用于诊断抗性肿瘤的标志物集。在本发明的某些实施方案中，一种方法包括诊断受试者中的抗性肿瘤，所述方法包括从所述受试者提供来自所述受试者的肿瘤或所述受试者的血液的测试细胞群体；测量所述测试细胞群体中CD11b+Gr1+细胞的数目或百分比；与参考细胞群体(例如，来自抗VEGF敏感性肿瘤的细胞群体)中CD11b+Gr1+细胞的数目或百分比比较所述测试细胞群体中CD11b+Gr1+细胞的数目或百分比；并，检测与所述参考细胞群体相比在所述测试细胞群体中CD11b+Gr1+的数目或百分比的增加，其中CD11b+Gr1+的数目或百分比增加表明所述肿瘤是抗性肿瘤。

在一个实施方案中，所述方法进一步包括测量所述受试者的脾脏大小，并与参考脾脏大小(例如，当所述受试者没有肿瘤时或当所述受试者对VEGF拮抗剂治疗敏感时所述受试者的脾脏大小、或对VEGF拮抗剂治疗敏感的其他人的脾脏大小的数据库)比较所述受试者的脾脏大小，其中脾脏大小增大表明所述肿瘤是抗性肿瘤。在又一个实施方案中，所述方法进一步包括测量所述受试者施用VEGF拮抗剂之后所述受试者中肿瘤的血管表面积(VSA)的数目或百分比，与参考血管表面积(例如，来自抗VEGF敏感性肿瘤的血管表面积)比较所述受试者中肿瘤的血管表面积的数目或百分比，其中肿瘤的血管表面积的数目或百分比增加表明所述肿瘤是抗性肿瘤。在一个实施方案中，所述拮抗剂是抗体。

在本发明的另一个实施方案中，一种方法包括诊断受试者中的抗性肿瘤，所述方法包括：从所述受试者提供来自所述受试者的肿瘤的测试细胞群体；测量所述测试细胞群体中CD19 B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比；与参考细胞群体中CD19 B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比比较所述测试细胞群体中CD19 B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比；并，检测与所述参考细胞群体相比在所述测试细胞群体中CD19 B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比的降低，其中CD19 B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比降低表明所述肿瘤是抗性肿瘤。

在又一个实施方案中，一种方法包括诊断受试者中的抗性肿瘤，所述方法包括：从所述受试者提供来自所述受试者的骨髓的测试细胞群体；测量所述测试细胞群体中CD90 T-淋巴样细胞、CD19 B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比；与参考细胞群体中CD90 T-淋巴样细胞、CD19 B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比比较所述测试细胞群体中CD90 T-淋巴样细胞、CD19 B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比；并，检测与所述参考细胞群体相比在所述测试细胞群体中CD90 T-淋巴样细胞、CD19 B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比的降低，其中CD90 T-淋巴样细胞、CD19 B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比降低表明所述肿瘤是抗性肿瘤。

在本发明的另一个实施方案中，一种方法包括用组合治疗来治疗受试者中的抗性肿瘤，所述方法包括向具有抗性肿瘤的受试者施用有效量的VEGF拮抗剂以及有效量的髓样细胞减少剂和有效量的第三药剂，其中所述第三药剂是化疗剂。在一个实施方案中，所述拮抗剂是抗体。在本发明的某些实施方案中，髓样细胞减少剂包括但不限于例如Gr1拮抗剂、CD11b拮抗剂、CD18拮抗剂、弹性蛋白酶抑制剂、MCP-1拮抗剂、MIP-1α拮抗剂、氯膦酸盐等。在又一个实施方案中，所述化疗剂是5FU、吉西他滨或在本文中列出的化疗剂。

在本发明的一个实施方案中，本发明的方法包括从所述受试者提供来自所述受试者的肿瘤的测试细胞群体；测量所述测试细胞群体中分子的表达、水平或活性；与参考细胞群体中所述分子的表达和/或活性比较所述测试细胞群体中所述分子的表达、水平或活性；并，检测与所述参考细胞群体(例如，来自抗VEGF治疗敏感性肿瘤的细胞群体)相比在所述测试细胞群体中所述分子的表达和/或活性的改变，其中所述分子是编码蛋白质的核酸或由所述核酸编码的蛋白质，从而诊断或确定所述受试者中的抗性肿瘤。在某些实施方案中，具有改变的表达和/或活性的蛋白质包括但不限于例如IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13、IL-4R、THBS1、Crea7、MSCA、MIP2、IL-8R、G-CSF、IL10-R2、THBSP-4和JAM-2。在表达和/或活性方面的改变可以是一种或多种蛋白质、两种或更多、三种或更多、四种或更多、五种或更多、六种或更多、七种或更多、八种或更多、九种或更多、十种或更多、十一种或更多、十二种或更多、十三种或更多、十四种或更多、或所有的蛋白质。

在本发明的某些实施方案中，所述分子的表达被上调，所述蛋白质包括但不限于例如IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13、IL-4R、MSCA、MIP2、IL-8R和G-CSF。在本发明的某些实施方案中，所述分子的表达被下调，所述蛋白质包括但不限于例如THBS1、Crea7、IL10-R2、THBSP-4和JAM-2。

如上所述，在本发明的某些实施方案中，一种方法包括从所述受试者提供来自所述受试者的肿瘤或所述受试者的血液的测试细胞群体；测量所述测试细胞群体中CD11b+Gr1+细胞的数目或百分比；与参考细胞群体(例如，来自抗VEGF敏感性肿瘤的细胞群体)中CD11b+Gr1+细胞的数目或百分比比较所述测试细胞群体中CD11b+Gr1+细胞的数目或百分比；并，检测与所述参考细胞群体相比在所述测试细胞群体中CD11b+Gr1+的数目或百分比的增加，其中CD11b+Gr1+的数目或百分比增加表明所述肿瘤是抗性肿瘤。在一个实施方案中，所述方法进一步包括检测与所述参考细胞群体相比在所述测试细胞群体中分子的表达或活性的改变，其中所述分子是编码蛋白质的核酸或所述蛋白质，其中所述蛋白质包括但不限于例如IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13、IL-4R、THBS1和Crea7。在某些实施方案中，一种或多种、两种或更多、三种或更多、四种或更多、五种或更多、六种或更多、七种或更多、或所有的蛋白质的表达和/或活性方面存在改变。

本发明还提供了标志物集合来鉴定抗性肿瘤。例如，标志物集合可以包括两种或更多、三种或更多、四种或更多、五种或更多、六种或更多、七种或更多、八种或更多、九种或更多、十种或更多、十一种或更多、十二种或更多、十三种或更多、十四种或更多、或整个种集合的分子。所述分子是编码蛋白质的核酸或是蛋白质，所述蛋白质具有改变的表达和/或活性的且选自：IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13、IL-4R、THBS1、Crea7、MSCA、MIP2、IL-8R、G-CSF、IL10-R2、THBSP-4和JAM-2。在一个实施方案中，所述分子衍生自CD11b+Gr1+细胞，且包括例如IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13、IL-4R、THBS1和Crea7。在另一个实施方案中，所述分子衍生自抗性肿瘤，且包括例如MSCA、MIP2、IL-8R、G-CSF、IL10-R2、THBSP-4和JAM-2。

附图简述

附图1画面a-f说明了同基因的肿瘤细胞系针对抗VEGF治疗的抗性与它们募集BMMNC的潜力有关。(a)异种移植的LLC、EL4和B16F1肿瘤在用抗VEGF抗体G6-23或对照抗体(抗豚草)治疗的C57BL/6，GFP骨髓嵌合小鼠(n＝5)中的生长曲线。在第二天，通过10mg/kg的对照抗体、G-23的腹膜内(IP)施用来开始治疗，每周两次。显示的数据是来自三个独立实验的一个代表的平均值±标准偏差。(b)EL4肿瘤在用对照(10和50mg/kg，IP，每周两次)或G6-23(10和50mg/kg，IP，每周两次)治疗的米色裸XID小鼠(n＝10)中的生长。治疗在肿瘤细胞植入之后第1天开始。统计分析使用ANOVA程序来评估，^*p≤0.05，^**p<0.005。(c)LCC肿瘤(n＝10)在如(b)所描述的米色裸XID小鼠中的生长，分别每周两次地IP施用G6-23(10和100mg/kg)和对照(100mg/kg)。(d)治疗14天的B16F1、EL4和LLC肿瘤细胞悬浮液(n＝4)的FACS分析。在抗VEGF治疗的EL4和LLC肿瘤中鉴定出相对于B16F1肿瘤的提高的GFP+BMMNC数目。(e)在用对照或抗VEGF抗体治疗14天的EL4、LLC和B16F1肿瘤切片中CD31+和GFP+细胞的免疫荧光染色。与EL4和LCC肿瘤相比，鉴定出在B16F1肿瘤的基质中GFP+细胞的降低的存在和CD31+血管的数量的显著降低。显示的数据是来自三个独立实验的每个组的一个代表性切片。(f)在治疗14天的肿瘤异种移植物中血管表面积(VSA)的定量。抗VEGF治疗的B16F1肿瘤与LLC或EL4肿瘤相比显示了血管表面积的更显著的降低。显示的数据是每个治疗组中3到5个肿瘤的9到15个切片的平均值±平均值标准误差。

附图2画面a-d说明了肿瘤混合实验和与分离自GFP嵌合小鼠的骨髓和肿瘤的GFP+混合的B16F1肿瘤的生长曲线。(a)当与分离自带有EL4、LLC或B16F1肿瘤的小鼠的10⁶个BMMNC混合并用对照抗体处理时，2.5×10⁶个B16F1肿瘤细胞的生长。作为对照，显示了来自用matrigel植入的小鼠或对照小鼠的BMMNC。(n＝5)(b)与分离自带有EL4、LLC或B16F1肿瘤的小鼠并用抗VEGF抗体处理的GFP+BMMNC混合的B16F1肿瘤的肿瘤生长曲线。EL4和LLC肿瘤衍生的GFP+骨髓细胞显著地提高了抗VEGF敏感性B16F1肿瘤的生长(n＝4)。(a)和(b)中显示的数据来自至少两个独立实验的一个代表。(c和d)当与分离自用对照抗体(c)或抗VEGF G6-23(d)处理的14天龄、EL4、LLC或B16F1肿瘤的5×10⁵个GFP阳性细胞混合时，2×10⁶个B16F1肿瘤的生长。

附图3画面a-f说明了在体外的细胞迁移实验、体内的肿瘤和骨髓中CD11b、Gr1细胞的频率分析和它们在介导针对抗VEGF的抗性方面的功能作用。分离自带有EL4和LLC肿瘤的小鼠的CD11b+Gr1+细胞是介导针对抗VEGF治疗的抗性的主要BM细胞群体。(a)在暴露于来自对照或抗VEGF治疗的EL4、LLC或B16F1肿瘤的条件化培养基之后，来自新鲜分离的BMMNC的迁移CD11b+Gr1+阳性细胞的数目。两种抗VEGF抗性肿瘤(EL4、LLC)都诱导了独立于VEGF的迁移。(b)来自植入有EL4、LLC和B16F1肿瘤、并用对照或抗VEGF治疗的小鼠的肿瘤分离物的多谱系分析。EL4和LLC，而不是B16F1肿瘤，显示了CD11b+Gr1+细胞的显著增加。显示的数据来自两个独立实验的一个代表。(c)来自植入有EL4、LLC和B16F1肿瘤的小鼠的肿瘤和骨髓分离物的多谱系分析。与肿瘤分离物相反(附图3b)，在携瘤小鼠的骨髓中没有CD11b+或Gr1+细胞的一致提高。显示的数据来自两个独立实验的一个代表。(d)与EL4和LLC致敏的、骨髓衍生的CD11b+Gr1+细胞混合的、并用抗VEGF(G6-23，每组n＝5)处理的B16F1肿瘤的生长曲线。CD11b+Gr1+细胞是介导抗性所必需的且足够的，因为消减了CD11b+Gr1+细胞的BMMNC显示了介导抗性的降低的潜力。显示的数据来自两个独立实验的一个代表。(e和f)与分离自带有EL4(e)和LLC(f)肿瘤的小鼠的CD11b+Gr1+细胞相关的肿瘤混合的B16F1细胞的生长曲线。大约地，从带有EL4或LLC肿瘤的小鼠分离了3×10⁵个FACS分选的CD11b+Gr1+细胞，与3×10⁶个B16F1细胞混合并植入C57BL/6小鼠(n＝5)中。

附图4画面a-d说明了骨髓细胞和肿瘤分离物的基因表达分析。(a)分离自小鼠骨髓的CD11b+Gr1+细胞的基因表达数据的无监督聚类分析(unsupervised cluster analysis)，所述小鼠植入有抗VEGF抗性的EL4(ER1-3)、LLC(LR1-3)或抗VEGF敏感性B16F1肿瘤(BR1-3)，并用抗VEGF治疗。对于分级聚类(hierarchical clustering)方法，数据针对对照matrigel植入的小鼠来标准化。显示了下调的、不变的和上调的基因。可以鉴定出抗VEGF抗性肿瘤诱导的改变的特征集合，其不同于抗VEGF敏感性肿瘤所诱导的。(b)可能牵涉血管发生或髓样细胞分化和迁移的调节、在用抗VEGF处理17天的抗VEGF抗性和敏感性肿瘤之间，在骨髓CD11b+Gr1+细胞中表达水平显著改变的(p＝0.05，>2倍)基因的展示。(c)从分离自G6-23处理17天后的EL4、LLC和B16F1肿瘤的RNA产生的基因表达数据的无监督聚类分析。(d)潜在牵涉血管发生和/或髓样细胞分化和迁移的调节、在用G6-23处理17天之后，相对于B16F1肿瘤(BR1-3)在两种抗VEGF抗性肿瘤(EL4＝ER1-3，LLC＝LR1-3)中表达水平显著改变(p≤0.05，倍数变化>2)的基因的展示。

附图5画面a-f说明了组合抗VEGF与靶向Gr1+髓样细胞的抗体(抗Gr1)对EL4和LLC肿瘤生长的影响。(a)单独地或组合地(抗VEGF+抗Gr1；组合)用抗VEGF(n＝5)或抗Gr1(n＝4)处理的EL4肿瘤的生长曲线。这些组中动物的数目是3-4只。(b)如(a)中描述的治疗17天的EL4肿瘤的通过IHC的血管表面积(VSA)、通过FACS的外周部和肿瘤中的Gr1+细胞及CD31+内皮细胞(EC)的频率、以及末期肿瘤重量的定量。与循环的Gr1细胞中几乎完全降低相反，在抗Gr1治疗的小鼠的肿瘤中发现了2-3倍的降低。在使用单独的和与抗Gr1MAb组合的抗VEGF治疗的EL4肿瘤之间，鉴定出末期肿瘤重量方面的统计学显著差异。数据是来自至少两个独立实验的一个代表的平均值±SEM。(c)用单独的或组合(n＝4)的抗VEGF(n＝5)或抗Gr1(n＝4)处理的LLC肿瘤的生长曲线。(d)所治疗的动物中通过IHC的血管表面积(VSA)、通过FACS的外周部中的Gr1+细胞和肿瘤中的Gr1+和CD31+内皮细胞(EC)的频率、以及肿瘤重量的定量。在使用单独的和与抗GR1组合的抗VEGF治疗的LLC肿瘤(c)之间，肿瘤体积和VSA存在着统计学显著差异。数据是来自至少两个独立实验的一个代表的平均值±SEM。(e&f)与抗VEGF治疗组合的弹性蛋白酶抑制剂延迟了EL4(e)和LLC(f)肿瘤的肿瘤抗性。与抗VEGF群组相比，组合治疗中的肿瘤体积显著更小。附图5所示数据是来自至少两个独立实验的一个代表的平均值±标准偏差。通过ANOVA评估统计分析，^*表明p≤0.05。

附图6画面a-b说明了用于调查BMMNC在针对抗VEGF治疗有抗性的肿瘤中的作用的实验策略以及从实验动物的肿瘤或骨髓分离GFP+细胞。画面a示意性地说明了调查BMMNC在针对抗VEGF治疗有抗性的肿瘤中的作用的实验策略。为了监测异种移植物研究中BMMNC募集的动力学，将GFP+BMMNC IV注射入经致死照射的C57Bl/6小鼠(aI.)。接着，通过植入matrigel中的敏感性(B16F1)和抗性(EL4和LLC)肿瘤来使嵌合小鼠致敏(aII.)。自嵌合小鼠的骨髓(aIII.)和肿瘤(aIV.)分离GFP+细胞，与B16F1细胞混合并注射(SC)入C57BL/6小鼠。将植入有肿瘤的动物用抗VEGF或对照抗体(aV.)治疗以确定BMMNC在介导肿瘤针对抗VEGF治疗的抗性中的作用。画面b说明了从接受了植入的小鼠的肿瘤和骨髓中分离GFP+细胞。使用FACS分选，自接受了植入的小鼠的肿瘤和骨髓分离GFP+细胞(策略的步骤aII.)(bI.)。使用分选后分析(bII.)来测定从实验动物的肿瘤或骨髓分离的GFP+细胞的纯度。

附图7说明了从植入有EL4和LLC肿瘤的小鼠的骨髓中纯化CD11bGr1。从植入有EL4或LLC细胞的C57BL/6小鼠分离BMMNC。将BMMNC与抗CD11b偶联的珠子一起温育，并穿过大规模磁柱来分离CD11b+和CD11b-级分。将来自每个级分的细胞以及未分选细胞的等分试样用CD11b和Gr1荧光染料偶联的抗体染色，来测定细胞的纯度。

附图8说明了针对抗VEGF治疗有抗性的小鼠淋巴瘤肿瘤溶胞物的洗脱序型，所述溶胞物用抗VEGF抗体(G6-31)处理并加载到HiTrap HS柱上。所述柱用渐增的盐浓度以分步方式洗脱。

附图9说明了在尾静脉中接受一剂以下各项之后72小时，小鼠中EL4肿瘤大小的改变：1)PBS脂质体/豚草，2)PBS脂质体/G6-31；3)氯膦酸盐脂质体/G6-23，4)氯膦酸盐脂质体/G6-31，或5)氯膦酸盐脂质体/PBS。

附图10说明了当氯膦酸盐脂质体与抗VEGF(G6-23)组合施用给小鼠时，在具有针对抗VEGF治疗有抗性的肿瘤的小鼠中VEGF mRNA表达的降低。

附图11说明了在用氯膦酸盐脂质体和抗VEGF(G6-23)治疗的、具有针对抗VEGF治疗有抗性的肿瘤的小鼠中KC水平的降低。

附图12画面A和B说明了MIP-1α(画面A)和MCP-1(画面B)二者在针对抗VEGF治疗有抗性的肿瘤细胞系中表达，其中Dil(+)是内皮细胞，CD3(+)代表淋巴样细胞，F4/80(+)代表巨噬细胞。

附图13画面A和B说明了MIP-1α和MCP-1在血管发生性出芽和毛细管管腔形成测定法中具有血管发生活性。画面A说明了内皮细胞对照，其中珠子用VEGF和D551处理10天。画面B说明了用D551(阴性对照)(左上)、VEGF(阴性对照)(右上)、1.25μg/ml MCP-1和D551(左下)、和1.25μg/ml MIP-1α和D551(右下)处理的内皮细胞。

附图14说明了来自用对照或抗VEGF抗体G6-23治疗第7天(p1)和第14天(p2)的携瘤小鼠(B16F1(a)、EL4(b)和LL2(c))的BMNNC的谱系分析。插图代表对CD11b门选的细胞。抗VEGF治疗提高了CD11b+和Gr1+细胞的水平，但是所分析的其它细胞类型没有提高。在第7天和第14天之间提高的细胞类型是CXCR4+、CD11b+、CD31+和CD11b+、CD31+细胞。与之相反，发现在第7和14天之间LL2和EL4而不是B16F1肿瘤中CD19+(B淋巴细胞)和CD90+(T淋巴细胞)细胞降低了。

附图15说明了携带抗性和敏感性肿瘤的小鼠中肿瘤和BM中GFP+细胞的多谱系分析。给C57Bl/6小鼠植入TIB6、B16F1、EL4和LLC肿瘤，并用抗VEGF或对照抗体治疗，如所描述的。从每个小鼠收获BMMNC和肿瘤分离物，用针对CD19(B淋巴样)、CD90(T淋巴样)、CD11c(树突细胞)以及VEGF受体(R1和R2)的抗体染色。图表呈现了肿瘤(a)和骨髓(b)隔室中每种子集的频率。

附图16。脾脏是携带抗性肿瘤的小鼠中CD11b+Gr1+细胞的可选归巢位点。给C57B1/6-GFP嵌合小鼠植入TIB6、B16F1、EL4和LLC肿瘤，并用抗VEGF或对照抗体治疗17天，如所描述的。(a)携瘤动物的分析揭示了在携带抗性肿瘤的小鼠中脾脏大小有显著(p≤0.05)增大。(b)使用机械破碎从每个小鼠收获脾细胞，用裂解缓冲液处理来除去红细胞。然后将脾脏细胞用抗CD11b和抗Gr1抗体染色，在FACS仪器中分析来调查CD11b+Gr1+细胞的频率。数据分析表明携带抗性肿瘤的小鼠的脾脏中CD11b+Gr1+细胞的频率与敏感性肿瘤相比有显著提高(p≤0.05)。^*表明用抗VEGF治疗的携带EL4肿瘤的小鼠与相应的B16F1和TIB6处理动物相比的差异是显著的(p≤0.05)。+表明用抗VEGF治疗的携带LLC肿瘤的小鼠与B16F1和TIB6处理动物相比有显著差异(p≤0.05)。

附图17说明了(a)只有从用抗性肿瘤致敏的小鼠分离的髓样细胞能够介导针对抗VEGF的抗性。图表呈现了与用B16F1或matrigel致敏的骨髓衍生的CD11b+Gr1+细胞混合、并用抗VEGF治疗的B16F1肿瘤的生长曲线(每组n＝5)。如所描述的测量肿瘤体积达21天。(b)血管发生的诱导是CD11b+Gr1+细胞发生针对抗VEGF治疗的抗性的一种机制。在带有B16F1和CD11b+Gr1+或CD11b-Gr1-细胞的混合物的小鼠中分析了VSA。^*表明在比较B16F1与来自EL4或LLC致敏的小鼠的CD11b+Gr1+细胞的混合物和从同样致敏的动物分离的CD11b-Gr1-细胞的B16F1混合物时有显著差异(p≤0.05)。

附图18说明了不同机制控制针对抗VEGF和化疗剂的抗性。给C57BL/6小鼠(n＝5)植入EL4(a)、LLC(b)、TIB6(c)和B16F1(d)肿瘤，并用抗VEGF抗体、对照抗体、吉西他滨和5FU治疗，如所描述的。每周两次测量肿瘤体积，在第17天分析所有的小鼠。^*表明在比较抗VEGF治疗的小鼠与5FU或吉西他滨治疗的动物时有显著差异。(e)从每个小鼠分离BM细胞，用CD11b和Gr1荧光染料偶联的抗体来染色。图表呈现了每种处理中BMCD11b+Gr1+细胞的数目。(f)在17天后收获来自每个小鼠的肿瘤分离物，用相同的抗体染色，来查看每个肿瘤中CD11b+Gr1+细胞的频率和数目。柱条代表平均值±SEM。^*表明用抗VEGF治疗的携带EL4肿瘤的小鼠与相应的B16F1和TIB6处理动物相比的差异是显著的(p≤0.05)。+表明用抗VEGF治疗的携带LLC肿瘤的小鼠与相应的B16F1和TIB6处理动物相比有显著差异(p≤0.05)。

发明详述

定义

在详细描述本发明之前，应当理解，本发明不限于具体的组合物或生物学系统，其当然可以有所变化。还应当理解，本文中所使用的术语仅仅是出于描述具体实施方案的目的，并非意图限制。在用于本说明书和所附权利要求书时，单数形式“一个”、“一种”和“所述”包括复数称谓，除非另有明确说明。如此，例如，“一个/一种分子”任选包括两个或多个/两种或多种所述分子的组合，诸如此类。

术语“VEGF”和“VEGF-A”可互换使用，指165个氨基酸的血管内皮细胞生长因子及相关的121个、145个、183个、189个和206个氨基酸的血管内皮细胞生长因子，如Leung et al.Science，246：1306(1989)；Houck et al.Mol.Endocrin.，5：1806(1991)；及Robinson & Stringer，Journal of Cell Science，144(5)：853-865(2001)所记载的，及其天然存在等位形式和加工形式。VEGF-A是包括VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E、VEGF-F和P1GF在内的基因家族的一部分。VEGF-A主要结合两种高亲和力受体酪氨酸激酶，即VEGFR-1(Flt-1)和VEGFR-2(Flk-1/KDR)，后者是VEGF-A血管内皮细胞有丝分裂信号的主要递质。术语“VEGF”或“VEGF-A”还指来自非人物种(诸如小鼠、大鼠或灵长类动物)的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF表示如下，诸如hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的多肽截短形式或片段。本申请中可能通过例如“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”或“VEGF₁₆₅”来鉴别任何此类形式VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示的编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸(甲硫氨酸)也是天然VEGF中的第17位(甲硫氨酸)。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。

“VEGF拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性(包括其与一种或多种VEGF受体的结合)的分子(肽基或非肽基)。VEGF拮抗剂包括抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子及衍生物(例如可溶性VEGF受体蛋白质或其VEGF结合片段、或嵌合VEGF受体蛋白质)、抗VEGF受体抗体和VEGF受体拮抗剂(诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂)、及融合蛋白(例如VEGF-Trap(Regeneron)、VEGF₁₂₁-gelonin(Peregine))。VEGF拮抗剂还包括VEGF的拮抗性变体、针对VEGF的反义分子、RNA适体(aptamer)、和针对VEGF或VEGF受体的核酶(ribozyme)。可用于本发明方法的VEGF拮抗剂进一步包括特异性结合VEGF的肽基或非肽基化合物，诸如抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF的多肽或其片段；至少与编码VEGF多肽的核酸分子的片段互补的反义核碱基(nucleobase)寡聚物；至少与编码VEGF多肽的核酸分子的片段互补的小RNA；靶向VEGF的核酶；针对VEGF的肽体(peptibody)；及VEGF适体。在一个实施方案中，VEGF拮抗剂将VEGF的表达水平或生物学活性降低或抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或更多。在另一个实施方案中，受到VEGF拮抗剂抑制的VEGF是VEGF(8-109)、VEGF(1-109)或VEGF₁₆₅。

术语“抗VEGF抗体”或“结合VEGF的抗体”指能够以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体，该抗体在靶向VEGF中可用作诊断剂和/或治疗剂。例如，本发明的抗VEGF抗体可在靶向和干预其中牵涉VEGF活性的疾病或疾患中用作治疗剂。参见例如美国专利6,582,959，6,703,020；WO98/45332；WO96/30046；WO94/10202；WO2005/044853；EP0666868B1；美国专利申请20030206899，20030190317，20030203409，20050112126，20050186208和20050112126；Popkov et al.，Journal of Immunological Methods 288：149-164(2004)；及WO2005012359。所选择的抗体通常具有针对VEGF的足够强的结合亲和力，例如所述抗体可以以介于100nM-1pM之间的K_d值结合hVEGF。抗体亲和力可以通过例如基于表面等离振子共振的测定法(诸如BIAcore测定法，如PCT申请公开号WO2005/012359所记载的)；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法(例如RIA)来测定。所述抗体可以进行其它生物学活性测定法，例如为了评估其作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的，而且依赖于所述抗体的靶抗原和预期用途。例子包括HUVEC抑制测定法；肿瘤细胞生长抑制测定法(如例如WO89/06692所记载的)；抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定法(美国专利5,500,362)；及激动性活性或造血测定法(参见WO 95/27062)。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同源物，诸如VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或VEGF-E，也不会结合其它生长因子，诸如PlGF、PDGF或bFGF。在一个实施方案中，抗VEGF抗体包括与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体；依照Presta et al.(1997)CancerRes.57：4593-4599生成的重组人源化抗VEGF单克隆抗体，包括但不限于称为贝伐单抗即“bevacizumab(BV)”、也称为“rhuMAb VEGF”或

的抗体。贝伐单抗包含突变的人IgG1框架区和来自鼠抗hVEGF单克隆抗体A.4.6.1(其阻断人VEGF结合其受体)的抗原结合互补决定区。贝伐单抗大约93％的氨基酸序列(包括大部分框架区)衍生自人IgG1，而大约7％的序列衍生自鼠抗体A4.6.1。贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量，而且是糖基化的。贝伐单抗和其它人源化抗VEGF抗体进一步记载于2005年2月26日公告的美国专利No.6,884,879。别的优选的抗体包括G6或B20系列抗体(例如G6-23、G6-31、B20-4.1)，如PCT申请公开号WO2005/012359所记载的。别的优选的抗体参见美国专利No.7,060,269，6,582,959，6,703,020；6,054,297；WO98/45332；WO96/30046；WO94/10202；EP0666868B1；美国专利申请公开号2006009360，20050186208，20030206899，20030190317，20030203409和20050112126；及Popkov et al.，Journal of Immunological Methods 288：149-164(2004)。

依照本发明的“G6系列抗体”指衍生自依照PCT申请公开号WO2005/012359的图7、24-26、和34-35任一的G6抗体或G6衍生抗体之序列的抗VEGF抗体

“造血干细胞/祖细胞”或“原始造血细胞”指能够分化形成更定型的或成熟的血细胞类型的细胞。“淋巴样血细胞谱系”指能够分化形成淋巴细胞(B细胞或T细胞)的造血祖细胞。类似的，“淋巴细胞生成”指淋巴细胞的形成。“红细胞样血细胞谱系”指能够分化形成红细胞(红血球)的造血祖细胞，而“红细胞生成”指红细胞的形成。

短语“髓(细胞)样血细胞谱系”在用于本文时涵盖上文所述淋巴样和红细胞样血细胞谱系以外的所有造血祖细胞，而“髓细胞生成”牵涉血细胞(淋巴细胞和红细胞以外的)的形成。

髓样细胞群体可以在Gr1+/CD11b+(或CD11b+Gr1+)或Gr1+/Mac-1+的髓样免疫细胞中富集。这些细胞表达巨噬细胞谱系的髓样细胞的标志物即CD11b，和粒细胞的标志物即Gr1。Gr1+/CD11b+可以通过免疫粘附淘选例如用针对Gr1+的抗体来选择。

“髓样细胞减少剂”指能减少或消融髓样细胞群体的药剂。典型的是，髓样细胞减少剂将会减少或消融髓样细胞、CD11b+Gr1+、单核细胞、巨噬细胞等。髓样细胞减少剂的例子包括但不限于Gr1+拮抗剂、CD11b拮抗剂、CD18拮抗剂、弹性蛋白酶抑制剂、MCP-1拮抗剂、MIP-1α拮抗剂等。

术语“Gr1拮抗剂”在用于本文时指能结合Gr1并抑制或实质性降低Gr1生物学活性的分子。Gr1拮抗剂的非限制性例子包括抗体、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药用药剂及其代谢物、转录和翻译控制序列、诸如此类。在本发明的一个实施方案中，所述Gr1拮抗剂是抗体，尤其是能结合人Gr1的抗Gr1抗体。

术语“CD11b拮抗剂”在用于本文时指能结合CD11b并抑制或实质性降低CD11b生物学活性的分子。正常情况下，所述拮抗剂将会(部分或完全)阻断细胞(例如未成熟髓样细胞)在其细胞表面上表达CD11b亚基以结合内皮的能力。CD11b拮抗剂的非限制性例子包括抗体、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药用药剂及其代谢物、转录和翻译控制序列、诸如此类。在本发明的一个实施方案中，所述CD11b拮抗剂是抗体，尤其是能结合人CD11b的抗CD11b抗体。例示性的CD11b抗体包括MY904(美国专利No.4,840,793)；1B6c(参见Zhang et al.，Brain Research 698：79-85(1995))；CBRN1/5和CBRM1/19(WO94/08620)。

术语“CD18拮抗剂”在用于本文时指能结合CD18(优选人CD18)并抑制或实质性降低CD18生物学活性的分子。正常情况下，所述拮抗剂将会(部分或完全)阻断细胞(例如嗜中性细胞)在其细胞表面上表达CD18亚基以结合内皮的能力。CD18拮抗剂的非限制性例子包括抗体、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药用药剂及其代谢物、转录和翻译控制序列、诸如此类。在本发明的一个实施方案中，所述CD18拮抗剂是抗体。

抗CD18抗体的例子包括MHM23(Hildreth et al.，Eur.J.Immunol.13：202-208(1983))；M18/2(IgG_2a；Sanches-Madrid et al.，J.Exp.Med.158：586-602(1983))；H52(美国典型培养物保藏中心(ATCC)保藏物HB10160)；Mas191c和lOT18(Vermot Desroches et al.，Scand.J.Immunol.33：277-286(1991))；及NA-8(WO 94/12214)。在一个实施方案中，所述抗体是能结合MHM23或H52所结合的CD18表位的抗体。在本发明的一个实施方案中，所述抗体具有针对CD18多肽的高亲和力。在某些实施方案中，所述抗体可以结合CD18胞外结构域中与CD11b相结合的区域，而且所述抗体还可解离a和P链(例如所述抗体可解离CD11b和CD18复合物，正如MHM23抗体的情况)。

单核细胞趋化蛋白(MCP-1)指牵涉先天免疫和Th2效应器应答，及CD4+T细胞分化的化学因子。参见例如Paul，W.E.，Fundamental Immunology，5^thEdition，Lippincott Williams & Wilkins，(Philadelphia，2003)pp 801-840。

术语“MCP-1拮抗剂”在用于本文时指能结合MCP-1并抑制或实质性降低MCP-1生物学活性的分子。MCP-1拮抗剂的非限制性例子包括抗体、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药用药剂及其代谢物、转录和翻译控制序列、诸如此类。在本发明的一个实施方案中，所述MCP-1拮抗剂是抗体，尤其是能结合人MCP-1的抗MCP-1抗体。

巨噬细胞炎性蛋白α和β(MIP-1α和β)是已知的化学因子。MIP-1α牵涉先天免疫和Th1效应器应答，及CD4+T细胞分化。参见例如Paul，W.E.，Fundamental Immunology，5^th Edition，Lippincott Williams & Wilkins，(Philadelphia，2003)pp 801-840。

术语“MIP-1α拮抗剂”在用于本文时指能结合MIP-1α并抑制或实质性降低MIP-1α生物学活性的分子。MIP-1α拮抗剂的非限制性例子包括抗体、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药用药剂及其代谢物、转录和翻译控制序列、诸如此类。在本发明的一个实施方案中，所述MIP-1α拮抗剂是抗体，尤其是能结合人MIP-1α的抗MIP-1α抗体。

术语“拮抗剂”在用于本文时指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰本发明蛋白质的活性(包括其与一种或多种受体的结合(在配体的情况中)或与一种或多种配体的结合(在受体的情况中)的分子。拮抗剂包括抗体及其抗原结合片段、蛋白质、肽、糖蛋白、糖肽、糖脂、多糖、寡糖、核酸、生物有机分子、肽模拟物、药用药剂及其代谢物、转录和翻译控制序列、诸如此类。拮抗剂还包括本发明蛋白质的小分子抑制剂、和融合蛋白、能特异性结合蛋白质由此使其隔绝与其靶物结合的受体分子及衍生物、蛋白质的拮抗性变体、针对本发明蛋白质的反义分子、RNA适体、和针对本发明蛋白质的核酶。

“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。某些阻断性抗体或拮抗性抗体实质或完全抑制抗原的生物学活性。

“URCGP”指在来自抗VEGF抗性肿瘤的CD11b+Gr1+细胞中上调的蛋白质。URCGP包括但不限于嗜中性细胞弹性蛋白酶、CD14、expi、Il-13R、LDLR、TLR-1、RLF、Endo-Lip、SOCS13、FGF13、IL-4R、IL-11R、IL-1RII、IFN TM1、TNFRSF18、WNT5A、分泌载体膜(Secretory carrier membrane)1、HSP86、EGFR、EphRB2、GPCR25、HGF、血管生成素样-6、Eph-RA7、脑信号蛋白(Semaphorin)Vlb、神经营养因子5、密蛋白(Claudin)-18、MDC15、ECM和ADAMTS7B。在某些实施方案中，所述URCGP指IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13和/或IL-4R。

“DRCGP”指在来自抗VEGF抗性肿瘤的CD11b+Gr1+细胞中下调的蛋白质。DRCGP包括但不限于THBS1、Crea7、水通道蛋白(Aquaporin)-1、溶质载体家族蛋白(SCF38)、载脂蛋白E(APOE)、脂肪酸结合蛋白(FABP)、NCAM-140、III型纤连蛋白、WIP、CD74、ICAM-2、Jagged1、ltga4、ITGB7、TGF-BII-R、TGFb IEP、Smad4、BMPR1A、CD83、Dectin-1、CD48、E-选择蛋白、IL-15、细胞因子信号传导抑制物4、Cytor4和CX3CR1。在某些实施方案中，所述DRCGP指THBS1和/或Crea7。

“URRTP”指在抗VEGF抗性肿瘤中上调的蛋白质。URRTP包括但不限于Notch2、DMD8、MCP-1、ITGB7、G-CSF、IL-8R、MIP2、MSCA、GM-CSF、IL-1R、Meg-SF、HSP1A、IL-1R、G-CSFR、IGF2、HSP9A、FGF18、ELM1、Ledgfa、A型清除受体、巨噬细胞C型凝集素、Pigr3、巨噬细胞SRT-1、G蛋白偶联受体、ScyA7、IL-1R2、IL-1可诱导蛋白质、IL-1β和ILIX Precuror。在某些实施方案中，所述URRTP指MSCA、MIP2、IL-8R和/或G-CSF。

“DRRTP”指在抗VEGF抗性肿瘤中下调的蛋白质。DRRTP包括但不限于IL10-R2、Erb-2.1、窖蛋白(Caveolin)3、Semcap3、INTG4、THBSP-4、ErbB3、JAM、Eng、JAM、Eng、JAM-2、Pecam1、Tlr3、TGF-B、FIZZ1、Wfs1、TP14A、EMAP、SULF-2、胞外基质2、CTFG、TFPI、XCP2、Ramp2、ROR-α、肝配蛋白(Ephrin)B1、SPARC样1、和脑信号蛋白A。在某些实施方案中，所述DRRTP指IL10-R2、THBSP-4和/或JAM-2。

“天然序列”多肽包括与衍生自自然界的多肽具有相同氨基酸序列的多肽。如此，天然序列多肽可以具有来自任何哺乳动物的天然存在多肽的氨基酸序列。此类天然序列多肽可以从自然界分离，或者可以通过重组或合成手段来生产。术语“天然序列”多肽明确涵盖该多肽的天然存在的截短或分泌形式(例如胞外结构域序列)、天然存在的变体形式(例如可变剪接形式)、及天然存在的等位变体。

“多肽链”指其中其每个结构域通过肽键(不同于非共价相互作用或二硫键)与其它结构域相连的多肽。

多肽“变体”指与相应的天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性的生物学活性多肽。此类变体包括例如其中在多肽的N和/或C末端添加或删除一个或多个氨基酸(天然存在氨基酸和/或非天然存在氨基酸)残基的多肽。通常，变体将会与天然序列多肽具有至少约80％氨基酸序列同一性，或至少约90％氨基酸序列同一性，或至少约95％或更多氨基酸序列同一性。变体还包括天然序列的多肽片段(例如亚序列、截短等)，通常是有生物学活性的。

本文中的“百分比(％)氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与选定序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序列同一性目的的对比可以以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN2或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定用于测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。然而，为了本发明的目的，％氨基酸序列同一性值是使用序列比较计算机程序ALIGN-2如下所述获得的。ALIGN-2序列比较计算机程序由Genentech公司编写，而且已经连同用户文档一起提交给美国版权局(USCopyright Office，Washington D.C.，20559)，并以美国版权注册号TXU510087注册，公众可通过Genentech公司(South San Francisco，California)获取。ALIGN2程序应当编译成在UNIX操作系统(优选数码UNIX V4.0D)上使用。所有序列比较参数由ALIGN-2程序设定且不变。

为了本发明的目的，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算：

分数X/Y  乘  100

其中X是由序列对比程序ALIGN-2在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列同一性。

术语“蛋白质变体”在用于本文时指上文所述变体和/或在天然蛋白质序列中包含一处或多处氨基酸突变的蛋白质。任选的是，所述一处或多处氨基酸突变包括氨基酸替代。用于本发明的蛋白质及其变体可通过本领域众所周知的多种方法来制备。蛋白质的氨基酸序列变体可通过蛋白质DNA中的突变来制备。此类变体包括例如蛋白质氨基酸序列内的残基删除、插入或替代。可以进行删除、插入和替代的任何组合以获得具有期望活性的最终构建物。将在编码变体的DNA中进行的突变绝不能将序列置于读码框之外，而且优选不会产生能产生二级mRNA结构的互补区。EP 75,444A。

蛋白质变体的制备任选通过编码天然蛋白质的DNA中的核苷酸定点诱变或噬菌体展示技术，由此产生编码变体的DNA，然后在重组细胞培养物中表达该DNA。

尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身不必预先决定。例如，为了优化给定位点处突变的后果，可以在目标密码子或区域进行随机诱变，并对所表达的蛋白质变体筛选期望活性的最佳组合。用于在具有已知序列的DNA中预先决定的位点进行替代突变的技术是众所周知的，诸如例如位点特异性诱变。本文所述蛋白质变体的制备可通过噬菌体展示技术来实现，诸如那些如PCT出版物WO 00/63380所记载的。

在选出这样的克隆后，可以取出突变后的蛋白质区并置入适用于蛋白质生产的载体，一般是可用于转化适宜宿主的那种类型的表达载体。

氨基酸序列删除的范围一般是约1-30个残基，任选1-10个残基，任选1-5个残基或更少，而且通常是连续的。

氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，从一个残基至长度本质上不受限制的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。序列内插入(即天然蛋白质序列内的插入)的范围一般可以是约1-10个残基，任选1-5个，或任选1-3个。末端插入的例子包括在N-末端融合信号序列(无论对宿主细胞是异源的或同源的)以便于由重组宿主分泌。

别的蛋白质变体有那些其中天然蛋白质的至少一个氨基酸残基已经消除并在它的位置插入了不同残基的。此类替代可依照表1所示进行。蛋白质变体还可包含本文所述的非天然氨基酸。

氨基酸可以根据其侧链特性的相似性如下分组(A.L.Lehninger，Biochemistry，第2版，pp.73-75，Worth Publishers，New York，(1975))：

(1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)

(2)不带电荷的、极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)

(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)

(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)

或者，天然存在残基可以基于共同的侧链特性如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性的、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性的：Asp、Glu；

(4)碱性的：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。

表1

 

原始残基	例示替代	优选替代
			Ala(A)	Val；Leu；Ile	Val
Arg(R)	Lys；Gln；Asn	Lys
			Asn(N)	Gln；His；Asp；Lys；Arg	Gln
Asp(D)	Glu；Asn	Glu
			Cys(C)	Ser；Ala	Ser
Gln(Q)	Asn；Glu	Asn
			Glu(E)	Asp；Gln	Asp
Gly(G)	Ala	Ala
			His(H)	Asn；Gln；Lys；Arg	Arg
Ile(I)	Leu；Val；Met；Ala；Phe；正亮氨酸	Leu
			Leu(L)	正亮氨酸；Ile；Val；Met；Ala；Phe	Ile
Lys(K)	Arg；Gln；Asn	Arg

 

Met(M)	Leu；Phe；Ile	Leu
			Phe(F)	Trp；Leu；Val；Ile；Ala；Tyr	Tyr
Pro(P)	Ala	Ala
			Ser(S)	Thr	Thr
Thr(T)	Val；Ser	Ser
			Trp(W)	Tyr；Phe	Tyr
Tyr(Y)	Trp；Phe；Thr；Ser	Phe
			Val(V)	Ile；Leu；Met；Phe；Ala；正亮氨酸	Leu

“天然存在的氨基酸残基”(即由遗传密码编码的氨基酸残基)可以选自：丙氨酸(Ala)；精氨酸(Arg)；天冬酰胺(Asn)；天冬氨酸(Asp)；半胱氨酸(Cys)；谷氨酰胺(Gln)；谷氨酸(Glu)；甘氨酸(Gly)；组氨酸(His)；异亮氨酸(Ile)；亮氨酸(Leu)；赖氨酸(Lys)；甲硫氨酸(Met)；苯丙氨酸(Phe)；脯氨酸(Pro)；丝氨酸(Ser)；苏氨酸(Thr)；色氨酸(Trp)；酪氨酸(Tyr)；和缬氨酸(Val)。“非天然存在的氨基酸残基”指上文所列天然存在氨基酸残基以外的，能够在多肽链中与邻近氨基酸残基共价结合的残基。非天然存在氨基酸残基的例子包括例如正亮氨酸、鸟氨酸、正缬氨酸、高丝氨酸和其它氨基酸残基类似物，诸如那些Ellman et al.，Meth.Enzym.202：301-336(1991)及美国专利申请出版物20030108885和20030082575中所记载的。简言之，这些规程牵涉用非天然存在氨基酸残基活化阻抑型tRNA，接着在体外或在体内转录并翻译RNA。参见例如美国专利申请出版物20030108885和20030082575；Noren etal.，Science 244：182(1989)；及Ellman et al.，见上文。

“分离的”多肽指已经鉴定且与/由其天然环境的一种成分分开和/或回收的多肽。多肽的天然环境的污染性成分指将会干扰其诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在某些实施方案中，将多肽纯化至(1)根据Lowry法的测定，多肽重量超过95％或重量超过99％，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据使用考马斯蓝或银染色的还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE，达到同质。既然多肽的天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的多肽包括重组细胞内的原位多肽。然而，分离的多肽通常通过至少一个纯化步骤来制备。

术语“抗体”以最广义使用，明确涵盖单克隆抗体(包括全长的或完整的单克隆抗体)、多克隆抗体、多价抗体、由至少两种完整抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)、及抗体片段(见下文)，只要它们展现出期望的生物学活性。

除非另有说明，表述“多价抗体”贯穿本说明书用于指包含三个或更多抗原结合位点的抗体。多价抗体通常改造成具有三个或更多抗原结合位点，而且一般不是天然序列IgM或IgA抗体。

“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，一般包括完整抗体的抗原结合位点，如此保留了与抗原结合的能力。此定义所涵盖的抗体片段的例子包括：(i)Fab片段，其具有VL、CL、VH和CH1结构域；(ii)Fab′片段，其是在CH1结构域的C-末端具有一个或多个半胱氨酸残基的Fab片段；(iii)Fd片段，其具有VH和CH1结构域；(iv)Fd′片段，其具有VH和CH1结构域及CH1结构域C-末端的一个或多个半胱氨酸残基；(v)Fv片段，其具有抗体单臂的VL和VH结构域；(vi)dAb片段(Ward et al.，Nature 341：544-546(1989))，其由VH结构域组成；(vii)分离的CDR区；(viii)F(ab′)₂片段，即包含通过铰链区的二硫桥相连的两个Fab′片段的二价片段；(ix)单链抗体分子(例如单链Fv；scFv)(Bird et al.，Science242：423-426(1988)和Huston et al.，PNAS(USA)85：5879-5883(1988))；(x)“双抗体”，其具有两个抗原结合位点，包含在同一条多肽链中相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)(参见例如EP404,097；WO 93/11161；和Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：6444-6448(1993))；(xi)“线性抗体”，其包含一对串联的Fd区段(VH-CH1-VH-CH1)，与互补的轻链多肽一起形成一对抗原结合区(Zapata etal.，Protein Eng.8(10)：1057-1062(1995)和美国专利5,641,870)。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的，除了可以以极小量存在的可能突变(例如天然存在突变)外。如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是不同抗体混合物的特征。单克隆抗体是针对单一抗原高度特异性的。在某些实施方案中，单克隆抗体典型的包括包含能结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆(诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合)中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性之外，单克隆抗体制备物的优点在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。

修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler and Milstein，Nature 256：495-97(1975)；Hongo et al.，Hybridoma，14(3)：253-260(1995)；Harlow et al.，Antibodies：ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2nd ed.1988；Hammerling et al.，于：Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas，563-681，Elsevier，N.Y.，1981)、重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)；Sidhu et al.，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee et al.，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee et al.，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893；WO 1996/34096；WO 1996/33735；WO1991/10741；Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362：255-258(1993)；Bruggemann et al.，Year inImmuno.7：33(1993)；美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016；Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonbergetal.，Nature368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-813(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnol.14：845-851(1996)；Neuberger，NatureBiotechnol.14：826(1996)；及Lonberg and Huszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995))。

单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No.4,816,567和Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：6851-6855(1984))。

非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在极大程度上，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变区残基用具有期望特异性、亲和力和能力的非人物种(供体抗体)(诸如小鼠、大鼠、家兔或非人灵长类动物)的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体中或在供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下的可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见Jones et al.，Nature321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature 332：323-329(1988)；及Presta，Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。还可参见例如Vaswani and Hamilton，Ann.Allergy，Asthma & Immunol.1：105-115(1998)；Harris，Biochem.Soc.Transactions 23：1035-1038(1995)；Hurle and Gross，Curr.Op.Biotech.5：428-433(1994)；及美国专利No.6,982,321和7,087,409。还可参见van Dijkand van de Winkel，Curr.Opin.Pharmacol.，5：368-74(2001)。人抗体可以如下制备，即将抗原施用于转基因动物，其经修饰而应答抗原挑战生成此类抗体，但是其内源基因座已经失去能力，例如经免疫的异种移植小鼠(xenomice)(参见例如美国专利No.6,075,181和6,150,584，关于XENOMOUSE^TM技术)。还可参见例如Li et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，103：3557-3562(2006)，关于经人B细胞杂交瘤技术生成的人抗体。

“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成。在一个实施方案中，人抗体是从噬菌体文库选择的，该噬菌体文库表达人抗体(Vaughan et al.，Nature Biotechnology 14：309-314(1996)；Sheets et al.，PNAS(USA)95：6157-6162(1998)；Hoogenboom andWinter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581(1991))。人抗体还可通过将人免疫球蛋白基因座导入内源免疫球蛋白基因已经部分或完全灭活的转基因动物(例如小鼠)来生成。在受到攻击时，观察到人抗体生成，它在所有方面与在人体中看到的极其相似，包括基因重排、装配和抗体全集。这种方法记载于例如美国专利No.5,545,807；5,545,806；5,569,825；5,625,126；5,633,425；5,661,016，及以下科学出版物：Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)；Lonberg et al.，Nature 368：856-859(1994)；Morrison，Nature 368：812-13(1994)；Fishwild et al.，Nature Biotechnology14：845-51(1996)；Neuberger，Nature Biotechnology 14：826(1996)；Lonberg andHuszar，Intern.Rev.Immunol.13：65-93(1995)。或者，人抗体可通过生成针对靶抗原的抗体的人B淋巴细胞的永生化来制备(此类B淋巴细胞可从个体回收，或者可在体外免疫)。参见例如Cole et al.，Monoclonal Antibodies andCancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)；Boerner et al.，J.Immunol.147(1)：86-95(1991)；及美国专利No.5,750,373。

术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作高变区的三个区段。可变域中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个高变区连接。每条链中的高变区通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版，Public Health Service，National Institute of Health，Bethesda，MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体在抗体依赖性细胞的细胞毒性中的参与。

术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体中负责抗原结合的氨基酸残基。例如，术语高变区指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中(H1、H2、H3)，三个在VL中(L1、L2、L3)。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al.Immunity 13：37-45(2000)；Johnson and Wu于：Methods in Molecular Biology 248：1-25(Lo，ed.，Human Press，Totowa，NJ，2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al.Nature 363：446-448(1993)；Sheriff et al.Nature Struct.Biol.3：733-736(1996)。

本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat et al.，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes ofHealth，Bethesda，MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and LeskJ.Mol.Biol.196：901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。

环      Kabat         AbM            Chothia         接触

---     -----------   -----------    ------------    ---------

L1      L24-L34       L24-L34        L26-L32         L30-L36

L2      L50-L56       L50-L56        L50-L52         L46-L55

L3      L89-L97       L89-L97        L91-L96         L89-L96

H1      H31-H35B      H26-H35B       H26-H32         H30-H35B

        (Kabat编号方式)

H1      H31-H35       H26-H35        H26-H32         H30-H35

        (Chothia编号方式)

H2      H50-H65       H50-H58        H53-H55         H47-H58

H3      H95-H102      H95-H102       H96-H101        H93-H101

HVR可包括如下“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变域残基是依照Kabat等，见上文编号的。

“框架区”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的高变区残基之外的那些残基。

术语“依照Kabat的可变域残基编号方式”或“依照Kabat的氨基酸位置编号方式”及其变化形式指Kabat et al.，见上文中的用于抗体重链可变域或轻链可变域编辑的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入(依照Kabat为残基52a)及重链FR残基82后的插入残基(例如依照Kabat为残基82a、82b和82c等)。给定抗体的Kabat残基编号方式可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。

贯穿本说明书和权利要求书，Kabat编号系统一般在提及可变域中的残基(大约是轻链残基1-107和重链残基1-113)时使用(例如Kabat et al.，Sequences of Immunological Interest.5th Ed.Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。“EU编号系统”或“EU索引”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如Kabat et al.，Sequences of Proteins of Immunological Interest，5th Ed.Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD(1991)中报道的EU索引，明确收入本文作为参考)。除非本文中另有说明，提及抗体可变域中的残基编号指根据Kabat编号系统的残基编号方式。除非本文中另有说明，提及抗体恒定域中的残基编号指根据EU编号系统的残基编号方式(例如参见美国临时申请No.60/640,323，EU编号方式的图)。

根据其重链恒定域的氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG₁(包括非A和A同种异型)、IgG₂、IgG₃、IgG₄、IgA₁和IgA₂。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类别免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，一般性记载于例如Abbas et al.，Cellular and Mol.Immunology，4th ed.(W.B.Saunders，Co.，2000)。抗体可以是抗体与一种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价结合而形成的更大融合分子的一部分。

根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

术语“Fc区”用于定义免疫球蛋白重链的C端区，其可以是通过木瓜蛋白酶消化完整抗体生成的。Fc区可以是天然序列Fc区或变异Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为Fc区自大约Cys226位置或大约Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。Fc区的C-末端赖氨酸(残基447，依照EU编号系统)可以消除，例如在生产或纯化抗体的过程中，或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程改造。因而，完整抗体的组合物可包括所有K447残基都被消除的抗体群、无一K447残基被消除的抗体群、或者混合了有和无K447残基的抗体的抗体群。免疫球蛋白的Fc区一般包含两个恒定域，即CH2结构域和CH3结构域，任选包含CH4结构域。

除非本文另有说明，免疫球蛋白重链的残基编号方式是如Kabat et al.，见上文中的EU索引的编号方式。“如Kabat中的EU索引”指人IgG1 EU抗体的残基编号方式。

“Fc区链”在本文中指Fc区两条多肽链之一。

人IgG Fc区的“CH2结构域”(也称为“Cg2”结构域)通常自约第231位氨基酸残基延伸至约第340位氨基酸残基。CH2结构域的独特之处在于它没有与另一结构域紧密配对。而是，有两个N-连接的分支的碳水化合物链介于完整天然IgG分子的两个CH2结构域之间。推测碳水化合物可能提供结构域-结构域配对的替代且有助于稳定CH2结构域。Burton，Molec.Immunol.22：161-206(1985)。CH2结构域在本文中可以是天然序列CH2结构域或变异CH2结构域。

“CH3结构域”包含Fc区中CH2结构域C端的一段残基(即自IgG的约第341位氨基酸残基至约第447位氨基酸残基)。CH3区在本文中可以是天然序列CH3结构域或变异CH3结构域(例如在其一条链中具有引入的“隆起”(protroberance)而在其另一条链中具有相应引入的“空腔”(cavity)的CH3结构域；参见美国专利No.5,821,333，明确收入本文作为参考)。此类变异CH3结构域可用于生成本文所述多特异性(例如双特异性)抗体。

“铰链区”通常定义为自人IgG1的约Glu216或约Cys226至约Pro230的区段(Burton，Molec.Immunol.22：161-206(1985))。其它IgG同种型的铰链区可以通过将第一个和最后一个形成重链间S-S键的半胱氨酸残基置于相同位置而与IgG1序列对比。铰链区在本文中可以是天然序列铰链区或变异铰链区。变异铰链区的两条多肽链通常每条多肽链保留至少一个半胱氨酸残基，使得变异铰链区的两条多肽链可在两条链之间形成二硫键。本文中优选的铰链区是天然序列人铰链区，例如天然序列人IgG1铰链区。

“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的至少一项“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括C1q结合、补体依赖性细胞毒性(CDC)、Fc受体结合、抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、吞噬作用、细胞表面受体(例如B细胞受体；BCR)下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合域(例如抗体可变域)结合，而且可使用本领域已知的用于评估此类抗体效应器功能的多种测定法来评估。

“天然序列Fc区”包含与自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区(非A和A同种异型)、天然序列人IgG2 Fc区、天然序列人IgG3 Fc区、及天然序列人IgG4 Fc区，及其天然存在变体。

“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。在某些实施方案中，变异Fc区具有与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比至少一处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代。典型的是，变异Fc区在本文中将与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约80％序列同一性，或至少约90％序列同一性，或至少约95％或更多序列同一性。

抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、嗜中性细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞即NK细胞只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估感兴趣分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.，PNAS(USA)95：652-656(1998)中所披露的。

“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。在某些实施方案中，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性细胞，一般优选PBMC和NK细胞。效应细胞可以从其天然来源(例如从血液或PBMC)分离，如本文所述。

“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。在有些实施方案中，FcR是天然人FcR。在有些实施方案中，FcR是结合IgG抗体的FcR(γ受体)，包括属于FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括那些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA(“活化受体”)和FcγRIIB(“抑制受体”)，它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在于其胞质结构域。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见例如，Annu.Rev.Immunol.15：203-234(1997))。FcR的综述参见例如Ravetch and Kinet，Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)；Capel et al.，Immunomethods 4：25-34(1994)；及de Haas et al.，J.Lab.Clin.Med.126：330-41(1995)。术语“FcR”在本文中涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。

术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.，J.Immunol.117：587(1976)和Kim et al.，J.Immunol.24：249(1994))并调节免疫球蛋白的体内稳态。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie 1997，Hinton 2004)。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie and Ward.，Immunol.Today 18(12)：592-598(1997)；Ghetie etal.，Nature Biotechnology，15(7)：637-640(1997)；Hinton et al.，J.Biol.Chem.279(8)：6213-6216(2004)；WO 2004/92219(Hinton et al.))。

可测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染人细胞系中，或者在施用了具有变异Fc区的多肽的灵长类动物中。WO00/42072(Presta)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。还可参见例如Shields et al.，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001)。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合抗体(适宜亚类的)起始的，该抗体已结合至其关联抗原。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.，J.Immunol.Methods 202：163(1996)中所记载的。具有更改的Fc区氨基酸序列(具有变异Fc区的多肽)及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于例如美国专利No.6,194,551 B1和WO1999/51642。还可参见例如Idusogie et al.，J.Immunol.164：4178-4184(2000)。

“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个CDR中具有一处或多处改变、导致该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在一个实施方案，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Markset al.，Bio/Technology 10：779-783(1992)记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了CDR和/或框架残基的随机诱变：Barbas et al.，Proc.Nat.Acad.Sci.USA 91：3809-3813(1994)；Schier et al.，Gene 169：147-155(1995)；Yelton et al.，J.Immunol.155：1994-2004(1995)；Jackson et al.，J.Immunol.154(7)：3310-9(1995)；及Hawkins et al.，J.Mol.Biol.226：889-896(1992)。

“柔性接头”在本文中指包含两个或更多通过肽键相连的氨基酸残基且为由其连接的两段多肽(诸如两个Fd区)提供更多旋转自由的肽。所述旋转自由容许由柔性接头连接的两个或更多抗原结合位点各自更高效的接近靶抗原。合适的柔性接头肽序列的例子包括gly-ser、gly-ser-gly-ser、ala-ser、和gly-gly-gly-ser。

“二聚化结构域”是由至少两个氨基酸残基(一般是半胱氨酸残基)或者至少两个肽或多肽(其可以具有相同或不同的氨基酸序列)结合形成的。所述肽或多肽可以经由共价和/或非共价结合而彼此相互作用。本文中的二聚化结构域的例子包括Fc区；铰链区；CH3结构域；CH4结构域；CH1-CL对；具有“结节”(knob)和/或“突起”(protruberance)的“界面”，如美国专利No.5,821,333中所记载的，明确收入本文作为参考；亮氨酸拉链(例如jun/fos亮氨酸拉链，参见Kostelney et al.，J.Immunol.，148：1547-1553(1992)；或酵母GCN4亮氨酸拉链)；异亮氨酸拉链；受体二聚体对(例如白介素-8受体(IL-8R)；和整联蛋白异二聚体，诸如LFA-1和GPIIIb/IIIa)或其二聚化区；二聚体配体多肽(例如神经生长因子(NGF)、神经营养因子-3(NT-3)、白介素-8(IL-8)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D、PDGF成员、和脑衍生神经营养性因子(BDNF)；参见Arakawa et al.J.Biol.Chem.269(45)：27833-27839(1994)及Radziejewski et al.Biochem.32(48)：1350(1993))或其二聚化区；一对能够形成二硫键的半胱氨酸残基；一对肽或多肽，各自包含至少一个半胱氨酸残基(例如约1个、2个或3个到约10个半胱氨酸残基)使得可以在所述肽或多肽之间形成二硫键(下文的“合成铰链”)；及抗体可变域。本文中最优选的二聚化结构域是Fc区或铰链区。

抗体的“功能性抗原结合位点”指能够结合靶抗原的位点。抗原结合位点的抗原结合亲和力不必像衍生该抗原结合位点的亲本抗体那样强，但是结合抗原的能力必须是使用已知用于评估抗体对抗原结合的多种方法之任一可测量到的。此外，本文中多价抗体的每个抗原结合位点的抗原结合亲和力不必定量相同。对于本文中的多聚体抗体，功能性抗原结合位点的数目可以使用超速离心分析来评估。依照这种分析方法，将靶抗原与多聚体抗体以不同比例混合，并计算复合物的平均分子量，其中假设不同数目的功能性结合位点。将这些理论值与得到的实际实验值进行比较以评估功能性结合位点的数目。

具有指定抗体的“生物学特征”的抗体指拥有该指定抗体区别于其它结合相同抗原的抗体的一项或多项生物学特征的抗体。

为了筛选能结合抗原上感兴趣抗体所结合的表位的抗体，可以实施常规交叉阻断测定法，诸如Antibodies，A Laboratory Manual，Cold Spring HarborLaboratory，Ed Harlow and David Lane(1988)中所记载的。

与一种或多种其它治疗剂“组合”施用包括同时(共同)施用和/或任何次序的序贯施用。

为了治疗目的，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人，家畜和牲畜，及动物园、运动或宠物动物，诸如犬、马、猫、牛、绵羊、猪等。典型的是，哺乳动物指人。

“病症”指任何会受益于使用本发明分子的治疗的疾患。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括任何形式的肿瘤，良性和恶性肿瘤；血管化肿瘤；肥大；白血病和淋巴样恶性肿瘤；神经元、神经胶质、星形胶质细胞、下丘脑和其它腺体、巨噬细胞、上皮、基质和囊胚腔病症；及炎性、血管发生性和免疫学病症，源自不当、异常、过度和/或病理性血管形成和/或血管通透性的血管病症。

术语“有效量”或“治疗有效量”指在哺乳动物中有效治疗疾病或病症的药物量。在癌症的情况中，有效量的药物可减少癌细胞的数目；缩小肿瘤的尺寸；抑制(即一定程度的减缓，典型的是阻止)癌细胞浸润入周围器官；抑制(即一定程度的减缓，典型的是阻止)肿瘤转移；一定程度的抑制肿瘤生长；容许治疗抗性肿瘤；和/或一定程度的减轻一种或多种与病症有关的症状。根据药物可阻止现有癌细胞生长和/或杀死现有癌细胞的程度，它可以是细胞抑制性的和/或细胞毒性的。对于癌症疗法，体内功效可以通过例如评估存活持续时间、距疾病进展的时间(TTP)、响应率(RR)、响应持续时间、和/或生活质量来测量。

“处理”和“治疗”(treatment)指治疗性处理和预防性或防范性措施二者。需要治疗的受试者包括那些早就患有病症的以及要预防病症的。在本发明的某些实施方案中，治疗可以指抑制肿瘤血管发生和/或生长，或者延迟抗VEGF抗性发作。

术语“生物学活性”和“有生物学活性的”就本发明的多肽而言指分子特异性结合并调节细胞应答(例如增殖、迁移等)的能力。细胞应答还包括那些经由受体介导的，包括但不限于迁移和/或增殖。在此语境中，术语“调控”包括促进和抑制二者。

术语“癌症”和“癌性”指或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长不受调节的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤、和白血病或淋巴样恶性肿瘤。此类癌症的更具体例子包括肾癌(kidney or renalcancer)、乳腺癌、结肠癌、直肠癌、结肠直肠癌、肺癌(包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺的腺癌和肺的鳞癌)、鳞状细胞癌(例如上皮鳞状细胞癌)、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric or stomach cancer)(包括胃肠癌、胃肠基质肿瘤(GIST))、胰腺癌、头颈癌、成胶质细胞瘤、成视网膜细胞瘤、星形细胞瘤、泡膜细胞瘤、男性细胞瘤、肝瘤(hepatoma)、血液学恶性肿瘤(包括非何杰金(Hodgkin)氏淋巴瘤(NHL)、多发性骨髓瘤和急性血液学恶性肿瘤)、子宫内膜癌或子宫癌、子宫内膜异位症、纤维肉瘤、绒毛膜癌、唾液腺癌、外阴癌、甲状腺癌、食管癌、肝癌(hepatic carcinoma)、肛门癌、阴茎癌、鼻咽癌、喉癌、卡波西(Kaposi)氏肉瘤、黑素瘤、皮肤癌、许旺氏细胞瘤、少突神经胶质瘤、成神经细胞瘤、横纹肌肉瘤、骨源性肉瘤、平滑肌肉瘤、尿道癌、甲状腺癌、维尔姆斯(Wilm)氏肿瘤、以及B细胞淋巴瘤(包括低级/滤泡性非何杰金氏淋巴瘤(NHL)、小淋巴细胞性(SL)NHL、中级/滤泡性NHL、中级弥漫性NHL、高级成免疫细胞性NHL、高级成淋巴细胞性NHL、高级小无核裂细胞性NHL、贮积病(bulkydisease)NHL、套细胞淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、和瓦尔登斯特伦氏(Waldenstrom)巨球蛋白血症)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、毛细胞性白血病、慢性成髓细胞性白血病、和移植后淋巴增殖性病症(PTLD)、以及与瘢痣病(phakomatoses)、水肿(诸如与脑瘤有关的水肿)和梅格斯氏(Meigs)综合征有关的异常血管增殖。“肿瘤”在用于本文时指所有赘生性细胞生长和增殖，无论是恶性的或者是良性的，及所有癌前的和癌性的细胞和组织。

术语“抗性肿瘤”指对至少包含VEGF拮抗剂的癌症疗法在癌症治疗疗程上完全没有响应、或者丧失或显示降低的响应的癌、癌性细胞、或肿瘤。抗性肿瘤还指在本文中诊断为有抗性的肿瘤(在本文中也称为“抗VEGF抗性肿瘤”)。在某些实施方案中，与对至少包括VEGF拮抗剂的疗法敏感的肿瘤相比，抗性肿瘤中CD11b+Gr1+细胞增加。

术语“抗肿瘤组合物”指可用于治疗癌症的组合物，其包含至少一种活性治疗剂，例如“抗癌剂”。治疗剂(抗癌剂)的例子包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、毒素、和其它用于治疗癌症的药剂，例如抗VEGF中和性抗体、VEGF拮抗剂、抗HER-2、抗CD20、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂(例如酪氨酸激酶抑制剂)、HER1/EGFR抑制剂、erlotinib、COX-2抑制剂(例如塞来考昔(celecoxib))、干扰素、细胞因子、能与ErbB2、ErbB3、ErbB4、或VEGF受体中的一种或多种结合的拮抗剂(例如中和性抗体)、血小板衍生生长因子(PDGF)和/或干细胞因子(SCF)的受体酪氨酸激酶的抑制剂(例如甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)(Gleevec 

 Novartis))、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有机化学剂等。本发明还包括它们的组合。

术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如²¹¹At、¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹²Bi、³²P和Lu的放射性同位素)、化疗剂、和毒素(诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体)。

“生长抑制剂”在用于本文时指在体外和/或在体内抑制细胞生长的化合物或组合物。如此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置)的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)(长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、

、和拓扑异构酶II抑制剂，诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类，诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨喋呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见The Molecular Basis of Cancer，Mendelsohn and Israel编，第1章，题为“Cell cycle regulation，oncogenes，and antineoplastic drugs”，Murakamiet al.，WB Saunders，Philadelphia(1995)，尤其是第13页。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的例子包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和

环磷酰胺(cyclophosphamide)；磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenins)(尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone))；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)(屈大麻酚(dronabinol)，MARINOL

)；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)(包括合成类似物托泊替康(topotecan)(HYCAMTIN

)、CPT-11(伊立替康(irinotecan)，CAMPTOSAR

)、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱)；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物)；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)(特别是隐藻素1和隐藻素8)；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin(包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)(例如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1(参见例如Agnew，Chem.Intl.Ed.Engl.33：183-186(1994))；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团)、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)(包括ADRIAMYCIN

、吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂(DOXIL

)和脱氧多柔比星)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、potfiromycin、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨喋呤(methotrexate)、吉西他滨(gemcitabine)(GEMZAR

)、替加氟(tegafur)(UFTORAL

)、卡培他滨(capecitabine)(XELODA

)、埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨喋呤(methotrexate)、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷(azauridine)、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptiniumacetate)；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK

多糖复合物(JHS Natural Products，Eugene，OR)；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西佐喃(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2，2′，2＂-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)(尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin))；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)(ELDISINE

，FILDESIN

)；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露莫司汀(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)(“Ara-C”)；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇类(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)(TAXOL

)、帕利他塞的清蛋白改造的纳米颗粒剂型(ABRAXANE^TM)和多西他塞(doxetaxel)(TAXOTERE

))；苯丁酸氮芥(chlorambucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨喋呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)和卡铂(carboplatin)；长春碱(vinblastine)

；铂(platinum)；依托泊苷(etoposide)(VP-16)；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；长春新碱(vincristine)

；奥沙利铂(oxaliplatin)；亚叶酸(leucovorin)；长春瑞滨(vinorelbine)

；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视黄酸类(retinoids)，诸如视黄酸(retinoic acid)；任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或更多上述物质的组合，诸如CHOP(环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙组合疗法的缩写)和FOLFOX(奥沙利铂(ELOXATIN^TM)组合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写)。

该定义还包括作用为调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果的抗激素剂，且常常是系统或全身治疗的形式。它们自身可以是激素。例子包括抗雌激素类和选择性雌激素受体调控物类(SERM)，包括例如他莫昔芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX

他莫昔芬)、雷洛昔芬(raloxifene)

屈洛昔芬(droloxifene)、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮(onapristone)和托瑞米芬(toremifene)

；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；功能为抑制或关闭卵巢的药剂，例如促黄体生成激素释放激素(LHRH)激动剂，诸如醋酸亮丙瑞林(leuprolide acetate)(LUPRON

和ELIGARD

)、醋酸戈舍瑞林(goserelinacetate)、醋酸布舍瑞林(buserelin acetate)和曲普瑞林(triptorelin)；其它抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及抑制在肾上腺中调节雌激素生成的芳香酶的芳香酶抑制剂，诸如例如4(5)-咪唑、氨鲁米特(aminoglutethimide)、醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)(MEGASE)、依西美坦(exemestane)(AROMASIN

)、福美坦(formestane)、法倔唑(fadrozole)、伏氯唑(vorozole)(RIVISOR

)、来曲唑(letrozole)(FEMARA)和阿那曲唑(anastrozole)(ARIMIDEX

)。另外，化疗剂的这种定义包括二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)(例如BONEFOS

或OSTAC

)、依替膦酸钠(etidronate)(DIDROCAL

)、NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronic acid/zoledronate)(ZOMETA

)、阿伦膦酸盐(alendronate)(FOSAMAX

)、帕米膦酸盐(pamidronate)(AREDIA)、替鲁膦酸盐(tiludronate)(SKELID

)或利塞膦酸盐(risedronate)(ACTONEL)；以及曲沙他滨(troxacitabine)(1，3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物)；反义寡核苷酸，特别是那些抑制牵涉异常(abherant)细胞增殖的信号传导途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如THERATOPE疫苗和基因疗法疫苗，例如ALLOVECTIN

疫苗、LEUVECTIN

疫苗和VAXID疫苗；拓扑异构酶1抑制剂(例如LURTOTECAN

)；rmRH(例如ABARELIX)；lapatinibditosylate(ErbB-2和EGFR双重酪氨酸激酶小分子抑制剂，也称为GW572016)；COX-2抑制剂，诸如塞来考昔(CELEBREX

；4-(5-(4-甲基苯基)-3-(三氟甲基)-1H-吡唑-1-基)苯磺酰胺；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物。

术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素、和牛生长激素；甲状旁腺素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；穆勒氏(Mullerian)抑制性物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子(例如VEGF、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、VEGF-E)；胎盘衍生生长因子(PlGF)；血小板衍生生长因子(PDGF)(例如PDGFA、PDGFB、PDGFC、PDGFD)；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-α；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子(osteoinductive factor)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)，诸如巨噬细胞CSF(M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF(GM-CSF)和粒细胞CSF(G-CSF)；白介素(IL)，诸如IL-1、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20-IL-30；分泌珠蛋白(secretoglobin)/子宫珠蛋白；制瘤素M(OSM)；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β；及其它多肽因子，包括LIF和kit配体(KL)。在用于本文时，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。

术语“前体药物”在用于本申请时指与母药(parent drug)相比对肿瘤细胞的细胞毒性较小并能够酶促活化或转变为更具活性母药形式的前体或衍生物形式药用活性物质。参见例如Wilman，“Prodrugs in Cancer Chemotherapy”，Biochemical Society Transactions，14，pp.375-382，615th Meeting Belfast(1986)和Stella et al.，“Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery”，Directed Drug Delivery，Borchardt et al.，ed.，pp.247-267，Humana Press(1985)。本发明的前体药物包括但不限于含磷酸盐/酯前体药物、含硫代磷酸盐/酯前体药物、含硫酸盐/酯前体药物、含肽前体药物、D-氨基酸修饰前体药物、糖基化前体药物、含β-内酰胺前体药物、含任选取代苯氧基乙酰胺的前体药物或含任选取代苯乙酰胺的前体药物、可转变为更具活性而无细胞毒性的药物的5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前体药物。可衍生为本发明使用的前体药物形式的细胞毒性药物的例子包括但不限于上文描述的那些化疗剂。

“血管发生因子”或“血管发生剂”指刺激血管发育，例如促进血管发生(angiogenesis)、内皮细胞生长、血管稳定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生长因子。例如，血管发生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成员、PlGF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGF)、TIE配体(血管生成素)、肝配蛋白、ANGPTL3、ANGPTL4等。它还包括加速伤口愈合的因子，诸如生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF及其家族成员、及TGF-α和TGF-β。参见例如Klagsbrun andD’Amore，Annu.Rev.Physiol.53：217-39(1991)；Streit and Detmar，Oncogene22：3172-3179(2003)；Ferrara & Alitalo，Nature Medicine 5(12)：1359-1364(1999)；Tonini et al.，Oncogene 22：6549-6556(2003)(例如列举血管发生因子的表1)；和Sato，Int.J.Clin.Oncol.8：200-206(2003)。

“抗血管发生剂”或“血管发生抑制剂”指或是直接或是间接抑制血管发生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体、或其偶联物或融合蛋白。例如，抗血管发生剂是上文定义的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂，例如VEGF的抗体、VEGF受体的抗体、阻断VEGF受体信号传导的小分子(例如PTK787/ZK2284、SU6668、SUTENT/SU11248(sunitinib malate)、AMG706)。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如血管他丁(angiostatin)、内皮他丁(endostatin)等。参见例如Klagsbrun and D’Amore Annu.Rev.Physiol.53：217-39(1991)；Streit and Detmar Oncogene 22：3172-3179(2003)(例如列举恶性黑素瘤中抗血管发生疗法的表3)；Ferrara & AlitaloNature Medicine 5(12)：1359-1364(1999)；Tonini等Oncogene 22：6549-6556(2003)(例如列举抗血管发生因子的表2)；及Sato，Int.J.Clin.Oncol.8：200-206(2003)(例如列举临床试验中所使用的抗血管发生剂的表1)。

术语“免疫抑制剂”在用于本文时指作用于抑制或掩盖本文所治疗哺乳动物的免疫系统的物质。这将包括抑制细胞因子生成、下调或抑制自身抗原表达、或掩盖MHC抗原的物质。此类药剂的例子包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶(见美国专利No.4,665,077)；非类固醇抗炎药(NSAID)；更昔洛韦(ganciclovir)、他克莫司(tacrolimus)、糖皮质激素诸如皮质醇(cortisol)或醛甾酮(aldosterone)、抗炎药诸如环加氧酶抑制剂、5-脂加氧酶抑制剂、或白三烯受体拮抗剂；嘌呤拮抗剂，诸如硫唑嘌呤(azathioprine)或麦考酚酸吗乙酯(mycophenolate mofetil，MMF)；烷化剂，诸如环磷酰胺；溴隐亭(bromocryptine)；达扎唑(danazol)；氨苯砜(dapsone)；戊二醛(其掩盖MHC抗原，如美国专利No.4,120,649中所记载的)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A；类固醇，诸如皮质类固醇或糖皮质类固醇或糖皮质激素类似物，例如泼尼松(prednisone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)和地塞米松(dexamethasone)；二氢叶酸还原酶抑制剂，诸如甲氨蝶呤(methotrexate)(口服或皮下)；羟氯喹(hydroxycloroquine)；柳氮磺吡啶(sulfasalazine)；来氟米特(leflunomide)；细胞因子或细胞因子受体抗体，包括抗干扰素-α、-β或-γ抗体、抗肿瘤坏死因子-α抗体(infliximab或adalimumab)、抗TNFα免疫粘附素(依那西普(etanercept))、抗肿瘤坏死因子-β抗体、抗白介素-2抗体和抗IL-2受体抗体；抗LFA-1抗体，包括抗CD11a和抗CD18抗体；抗L3T4抗体；异源抗淋巴细胞球蛋白；泛T抗体(pan-Tantibody)，优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合域的可溶性肽(1990年7月26日公布的WO 1990/08187)；链激酶；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素(deoxyspergualin)；雷帕霉素(rapamycin)；T细胞受体(Cohen et al.，美国专利No.5,114,721)；T细胞受体片段(Offner et al.，Science 251：430-432(1991)；WO 1990/11294；Ianeway，Nature 341：482(1989)；及WO 1991/01133)；及T细胞受体抗体(EP340,109)，诸如T10B9。

“非类固醇抗炎药”或“NSAID”的例子有乙酰水杨酸(acetylsalicylicacid)、布洛芬(ibuprofen)、萘普生(naproxen)、吲哚美辛(indomethacin)、舒林酸(sulindac)、托美丁(tolmetin)，包括其盐和衍生物，等。

术语“标记物”在用于本文时指与多肽直接或间接偶联的可检测化合物或组合物。标记物自身可以是可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。

“分离的”核酸分子指已经鉴定且与多肽核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该多肽的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。

抗性肿瘤

本发明部分地基于导致肿瘤对至少包含VEGF拮抗剂的癌症疗法产生抗性的细胞和分子事件的发现。本文中显示了在造血骨髓衍生细胞的募集和肿瘤针对抗VEGF治疗的抗性的发生之间的关联。

免疫系统包括造血细胞，其包括红细胞、淋巴细胞和髓样谱系细胞。这些细胞类型都来自于相同的多能干细胞。在成人中，血细胞生成在骨髓中发生，在那里干细胞偶尔分裂以产生更多的干细胞(自我更新)和多种定型的祖细胞。正是定型的祖细胞将响应特定的调节因子而产生造血细胞。这些调节因子主要由周围的基质细胞和在其它组织中产生，包括例如集落刺激因子(CSF)、促红细胞生成素(EPO)、白介素3(IL3)、粒细胞/巨噬细胞CSF(GM-CSF)、粒细胞CSF(G-CSF)、巨噬细胞CSF(M-CSF)和STEEL因子。已经提出在癌症患者中免疫系统的改变促进了免疫系统发起对癌症的成功攻击的能力丧失或降低，因而容许肿瘤生长的进展。参见例如Gabrilovich etal.，Antibodies to Vascular Endothelial Growth Factor Enhances the Efficacy of Cancer Immunotherapy by Improving Endogenous Dendritic Cell Function.Clinical Cancer Research 5：2963-2970(1999)。

肿瘤产生的因子可以导致异常的髓细胞生成，而且可导致对针对肿瘤的免疫应答的抑制。参见例如Kusmartsev and Gabrilovich，Immature myeloid cells and cancer-associated immune suppression.Caner Immunol Immunothera.51：293-298(2002)。本发明提供了来自肿瘤抗性细胞和CD11b+Gr1+细胞、可牵涉针对VEGF拮抗剂治疗的肿瘤抗性的特定因子。例如，抗性肿瘤的盐分级也产生了可以直接地或间接地提供抗性的因子。参见例如本文中的附图8和实施例2。CD11b+Gr1+髓样细胞的动员(mobilization)和活化可代表针对抗VEGF治疗的抗性发生中的两个步骤。

本发明还提供了组合治疗方法和组合物，其与抗VEGF一起使用了靶向髓样细胞的药剂和化疗剂，如本文所述。这些组合治疗可以抑制肿瘤血管发生和生长，和/或延迟抗VEGF抗性的发作。

CD11b+Gr1+细胞

CD11/CD18家族在结构和遗传上与更大的、调控细胞粘附相互作用的、受体的整联蛋白家族相关，所述细胞粘附相互作用包括胚胎发生、对细胞外基质的粘附、和细胞分化(Hynes，R.O.，Cell 48：549-554(1987)；Kishimotoetal.，Adv.Immunol.46：149-182(1989)；Kishimoto et al.，Cell 48：681-690(1987)；及Ruoslahti et al.，Science 238：491-497(1987))。整联蛋白是一类跨膜异二聚体，其包含非共价相结合的α亚基和β亚基。β亚基一般能够与超过一种α亚基结合，而且享有共同β亚基的异二聚体已经被分类为整联蛋白群体中的亚家族(Larson and Springer，Structure and function of leukocyte integrins，Immunol.Rev.114：181-217(1990))。

已经发现了CD11/CD18家族的整联蛋白分子和它们的细胞配体介导多种细胞-细胞相互作用，尤其是在炎症中。这些蛋白质已经被证明对免疫系统中的粘附功能是关键的(Kishimoto et al.，Adv.Immunol.46：149-182(1989))。针对LFA-1的单克隆抗体已经显示了阻断白细胞对内皮细胞的粘附(Dustin et al.，J.Cell.Biol.107：321-331(1988)；Smith et al.，J.Clin.Invest.83：2008-2017(1989))以及抑制T细胞活化(Kuypers et al.，Res.Immunol.，140：461(1989))、抗原特异性CTL杀伤所需的偶联物(conjugate)形成(Kishimoto et al.，Adv.Immunol.46：149-182(1989))、T细胞增殖(Davignonetal.，J.Immunol.127：590-595(1981))和NK细胞杀伤(Krensky et al.，J.Immunol.131：611-616(1983))。

粘附受体分子的CD11/CD18家族包括四种高度相关的细胞表面糖蛋白：LFA-1(CD11a/CD18)、Mac-1(CD11b/CD18)、p150.95(CD11c/CD18)和(CD11d/CD18)。这些异二聚体的每一种具有独特的α链(CD11a、b、c或d)和不变的β链(CD18)。位于白细胞上的CD18整联蛋白可以结合在血管内皮和其它细胞上表达的细胞间粘附分子-1(ICAM-1)，从而介导白细胞粘附和跨内皮迁移(transendothelial migration)。LFA-1存在于除了巨噬细胞的子集之外的所有成熟白细胞的表面，而且被认为是主要的淋巴样整联蛋白。Mac-1、p150.95和CD11d/CD18的表达主要限于髓样谱系的细胞(其包括嗜中性细胞、单核细胞、巨噬细胞和肥大细胞)。CD11b+Gr1+是也见于髓样细胞上的标志物。已经提出，在成熟的和不成熟的髓样细胞之间的平衡是癌症的指标，而且在渐进性肿瘤生长中，平衡朝向不成熟的髓样细胞移动，伴有树突细胞的数目和功能的降低。参见例如Kusmartsev and Gabrilovich，Immature myeloid cells and cancer-associated immune suppression.Caner Immunol Immunothera.51：293-298(2002)。例如，通过在携瘤小鼠中使不成熟的髓样细胞分化来移动平衡，改善了癌症疫苗的效果。参见Kusmartsev et al.，All-trans-Retinoic Acid Eliminates Immature Myeloid Cells from Tumor-bearing Mice and Improves the Effect of Vaccination.Cancer Research 63：4441-4449(2003)。还观察到，在癌症患者中，循环中的VEGF水平与不成熟髓样细胞数目增加有关。参见Almand et al.，Clinical significance of defective dendritic cells differentiation in cancer.Clin.Cancer Res.6：1755(2000)。

本文显示了，CD11b+Gr1+髓样细胞的动员和活化可导致针对抗VEGF治疗的抗性。还显示了，从携瘤小鼠分离的骨髓衍生CD11b+Gr1+髓样细胞可以赋予肿瘤以针对抗VEGF治疗的抗性，而且来自抗VEGF抗性(而不是抗VEGF敏感性肿瘤)的条件化培养基刺激CD11b+Gr1+细胞的迁移。

诊断学

本发明还提供了用于诊断对VEGF拮抗剂治疗有抗性的肿瘤的方法和组合物。在本发明的某些实施方案中，本发明的方法比较测试和参考细胞群体中一种或多种CD11b+Gt1+或肿瘤抗性核酸的表达水平。本文公开的序列信息，与本领域已知的核酸检测方法一起，容许检测和比较各种已公开的转录物。在另一个实施方案中，本发明的方法比较具有抗性肿瘤的受试者的脾脏大小和参考脾脏大小。在一个实施方案中，所述参考脾脏大小是当所述受试者没有肿瘤时或当所述受试者对VEGF拮抗剂治疗敏感时所述受试者的脾脏大小。在另一个实施方案中，所述参考脾脏大小是没有肿瘤的其他受试者的平均脾脏大小或具有敏感性肿瘤的其他受试者的平均脾脏大小。脾脏大小可以使用本领域已知的方法来测量，包括但不限于非侵入性的成像技术，诸如超声波、超声波照相术、一维超声波照相术(US)、放射性核素扫描、计算断层照相术(CT)和磁共振成像。参见例如Yang et al.，West J Med.155(1)：47-52(1991)。在又一个实施方案中，本发明的方法比较具有抗性肿瘤的受试者中肿瘤的血管表面积和参考血管表面积。

在本发明的某些实施方案中，本发明包括提供测试细胞群体，其包括至少一个能够表达一种或多种如下分子的细胞，所述分子是编码蛋白质的核酸或是所述蛋白质，其中所述蛋白质是Gr1、嗜中性细胞弹性蛋白酶、MCP-1、MIP-1α、URCGP、DRCGP、URRTP和/或DRRTP。“能够表达”意思是所述基因以完整的形式存在于所述细胞中并且可以被表达。如果存在，那么然后检测一种、一些或所有序列的表达，并测量。使用已知序列的数据库条目或芯片制造商提供的序列信息，可以使用本领域普通技术人员公知的技术来检测(如果表达)和测量序列。例如，与编码Gr1、嗜中性细胞弹性蛋白酶、MCP-1、MIP-1α、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP的核酸对应的序列数据库条目内的序列可以用于构建探针，用于在例如Northern印迹杂交分析或特异性地且优选定量地扩增特定核酸序列的方法中检测相应的RNA序列。又例如，所述序列可以用于构建引物，用于在例如基于扩增的检测方法诸如基于反转录的聚合酶链式反应中特异性地扩增编码Gr1、嗜中性细胞弹性蛋白酶、MCP-1、MIP-1α、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列的核酸。当基因表达方面的改变与基因扩增或删除有关时，测试和参考群体中的序列比较可以通过比较测试和参考细胞群体中所检查的DNA序列的相对量来进行。

表达也可以在蛋白质水平来测量，即通过测量本文所述基因产物所编码的多肽的水平。此类方法是本领域公知的，包括例如基于针对基因所编码的蛋白质的抗体的免疫测定法。然后，将测试细胞群体中Gr1、嗜中性细胞弹性蛋白酶、MCP-1、MIP-1α、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列的一种或多种的表达水平与来自参考细胞群体的一种或多种细胞中所述序列的表达水平相比较。测试和对照细胞群体中序列的表达可以使用任何本领域公认的用于比较核酸序列表达的方法来进行比较。例如，表达可以使用GENECALLING.RTM.方法来比较，记载于美国专利No.5,871,697和Shimketset al.，Nat.Biotechnol.17：798-803。在本发明的某些实施方案中，测量编码Gr1、嗜中性细胞弹性蛋白酶、MCP-1、MIP-1α、URCGP、DRCGP、URRTP和/或DRRTP的一种、两种或更多、三种或更多、四种或更多、五种或更多、六种或更多、七种或更多、八种或更多、九种或更多、十种或更多、十一种或更多、十二种或更多、十三种或更多、十四种或更多、十五种或更多、20种或更多、25种或更多、或所有的序列的表达。

参考细胞群体包括一个或多个能够表达所测量的Gr1、嗜中性细胞弹性蛋白酶、MCP-1、MIP-1α、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列、且其所比较的参数(例如对VEGF拮抗剂的敏感性)是已知的细胞。在本发明的某些实施方案中，如果其表达水平在参考细胞群体中的Gr1、嗜中性细胞弹性蛋白酶、MCP-1、MIP-1α、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP转录物的水平的小于或等于2.0倍的因数之内变动，那么测试细胞群体中的Gr1、嗜中性细胞弹性蛋白酶、MCP-1、MIP-1α、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列被认为是在表达水平上与参考细胞群体中的Gr1、嗜中性细胞弹性蛋白酶、MCP-1、MIP-1α、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列的表达水平相当。在多种实施方案中，如果其表达水平相对于参考细胞群体的变动超过参考细胞群体中相应Gr1、嗜中性细胞弹性蛋白酶、MCP-1、MIP-1α、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列的表达水平的2.0倍，那么测试细胞群体中的Gr1、嗜中性细胞弹性蛋白酶、MCP-1、MIP-1α、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列可以被认为是在表达水平上有改变。

任选地，比较测试细胞群体和参考细胞群体之间差异表达的序列可以针对对照核酸来进行，所述对照核酸的表达独立于所测量的参数或条件。测试和参考核酸中对照核酸的表达水平可以用于标准化所比较群体中的信号水平。适合的对照核酸可以由本领域普通技术人员容易地确定。

测试细胞群体可以是任何数目的细胞，即一个或多个细胞，而且可以是体外、体内或离体提供的。

在某些实施方案中，参考细胞群体中的细胞衍生自与测试细胞(例如肿瘤细胞)尽可能相似的组织类型。在某些实施方案中，对照细胞衍生自与测试细胞相同的受试者，例如衍生自测试细胞的来源区域邻近的区域，或衍生自所述受试者对VEGF拮抗剂治疗敏感时的时间点。在本发明的一个实施方案中，参考细胞群体衍生自多种细胞。例如，参考细胞群体可以是来自早先测试的细胞的表达样式的数据库，所述细胞的VEGF拮抗剂的肿瘤敏感性治疗是已知的。

评估肿瘤敏感性

CD11b+GR1+髓样细胞的募集、及本文所述URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP序列的一些的表达与肿瘤对VEGF拮抗剂治疗的抗性有关。因而，在一个方面，本发明提供了评估受试者中VEGF拮抗剂敏感性的方法，其中VEGF拮抗剂敏感性是指用抗VEGF治疗肿瘤的能力。在本发明的一个实施方案中，一种方法包括提供来自所述受试者的一种或多种测试细胞群体，其包括能够表达一种或多种与编码URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP的核酸同源的核酸序列的细胞。将序列的表达与参考细胞群体相比较。可以使用任何参考细胞群体，只要所述参考细胞群体中的细胞的VEGF拮抗剂敏感性状态是已知的。比较可以对同时地或在时间上不同的时间测量的测试和参考样品来进行。后者的例子是使用汇编的表达信息，例如序列数据库，其集合了关于敏感性状态已知的细胞中已知序列的表达水平的信息。在本发明的某些实施方案中，参考细胞群体是对CD11b+Gr1+髓样细胞富集的。在本发明的某些实施方案中，参考细胞群体是对肿瘤细胞富集的。

诊断或标志物集合

本发明还提供了标志物集合来鉴定抗性肿瘤。在某些实施方案中，这些标志物集合在试剂盒中提供，用于评估肿瘤对VEGF拮抗剂治疗的敏感性或抗性。例如，标志物集合可以包括两种或更多、三种或更多、四种或更多、五种或更多、六种或更多、七种或更多、八种或更多、九种或更多、十种或更多、十一种或更多、十二种或更多、十三种或更多、十四种或更多、十五或更多、二十种或更多、或整种集合的分子。所述分子是编码蛋白质的核酸或是蛋白质，所述蛋白质具有改变的表达和/或活性且选自以下：Notch2、DMD8、MCP-1、ITGB7、G-CSF、IL-8R、MIP2、MSCA、GM-CSF、IL-1R、Meg-SF、HSP1A、IL-1R、G-CSFR、IL10-R1、Erb-2.1、窖蛋白3、Semcap3、INTG4、THBSP-4、ErbB3、JAM、Eng、JAM、Eng、JAM-2、Pecam1、Tlr3、嗜中性细胞弹性蛋白酶、CD14、expi、Il-13R、LDLR、TLR-1、RLF、Endo-Lip、SOCS13、FGF13、IL-4R、THBS1、Crea7、水通道蛋白-1、SCF38、APOE、FABP、IL-11R、IL-1RII、IFN TM1、TNFRSF18、WNT5A、分泌载体膜1、HSP86、EGFR、EphRB2、GPCR25、HGF、血管生成素样-6、Eph-RA7、脑信号蛋白Vlb、神经营养因子5、密蛋白-18、MDC15、ECM、ADAMTS7B、NCAM-140、纤连蛋白III型、WIP、CD74、ICAM-2、Jagged1、ltga4、ITGB7、TGF-BII-R、TGFb IEP、Smad4、BMPR1A、CD83、Dectin-1、CD48、E-选择素、IL-15、细胞因子信号传导的抑制物4、Cytor4、CX3CR1、IGF2、HSP9A、FGF18、ELM1、Ledgfa、清除受体A型、巨噬细胞C-型凝集素、Pigr3、巨噬细胞SRT-1、G蛋白偶联受体、ScyA7、IL-1R2、IL-1可诱导蛋白、IL-1β、ILIX前体(ILIX Precuror)、TGF-B、FIZZ1、Wfs1、TP14A、EMAP、SULF-2、细胞外基质2、CTFG、TFPI、XCP2、Ramp2、ROR-α、肝配蛋白B1、SPARC样1和脑信号蛋白A。在本发明的一个实施方案中，提供了检测蛋白质的抗体。在一个实施方案中，所述分子衍生自CD11b+Gr1+细胞，而且包括例如IL-13R、TLR-1、Endo-Lip、FGF13、IL-4R、THBS1和Crea7。在另一个实施方案中，所述分子衍生自抗性肿瘤，而且包括例如MSCA、MIP2、IL-8R、G-CSF、IL10-R2、THBSP-4和JAM-2。

调控物及其用途

VEGF、Gr1、嗜中性细胞弹性蛋白酶、MCP-1、MIP-1α、CD11b、CD18、URCGP、DRCGP、URRTP和DRTRP的调控物指调控这些蛋白质的活性的分子，例如激动剂和拮抗剂。术语“激动剂”用于指本发明蛋白质的肽和非肽类似物，以及特异性结合此类本发明蛋白质的抗体，只要它们具有提供激动剂信号的能力。术语“激动剂”是在蛋白质的生物学作用的环境中定义的。在某些实施方案中，激动剂具有本发明的天然蛋白质的生物学活性，例如对于VEGF。术语“拮抗剂”用于指具有抑制本发明蛋白质的生物学活性的能力的分子。拮抗剂可以通过例如对蛋白质活性的抑制来评估。

治疗用途

根据本发明期待的是，调控物的组合(包括VEGF拮抗剂、髓样细胞减少剂和其它药剂)可以用于治疗多种赘生物或非赘生性疾患。在一个实施方案中，调控物(例如VEGF拮抗剂、髓样细胞减少剂、URCGP和URRTP的拮抗剂(“本发明的拮抗剂”))用于抑制抗性肿瘤的癌细胞或肿瘤生长。在本发明的某些实施方案中，调控物(例如DRCGP和DRRTP的激动剂(“本发明的激动剂))用于抑制癌细胞或肿瘤生长。根据本发明期待的是，本发明的拮抗剂也可以用于抑制肿瘤的转移。在某些实施方案中，一种或多种抗癌剂可以与本发明的拮抗剂和/或本发明的激动剂一起施用来抑制癌细胞或肿瘤生长。还参见本文中标题为组合疗法的小节。

待治疗的赘生性病症的例子包括但不限于本文中术语“癌症”和“癌性”下所记载的那些。可以用本发明的拮抗剂治疗的非赘生性疾患包括但不限于例如不良或异常肥大、关节炎、类风湿性关节炎(RA)、银屑病、银屑病斑块、结节病、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化斑块、来自心肌梗死的水肿、糖尿病性和其它增殖性视网膜病(包括早产儿视网膜病、晶状体后纤维组织增生症、新生血管性青光眼、年龄相关的黄斑变性、糖尿病性黄斑水肿、角膜新血管形成、角膜移植片新血管形成、角膜移植片排斥、视网膜/脉络膜新血管形成、角(angle)的新血管形成(虹膜)、眼的新血管病、血管的再狭窄、动静脉畸形(AVM)、脑膜瘤、血管瘤、血管纤维瘤、甲状腺增生(包括格雷夫斯氏病(Grave′s disease))、角膜和其它组织移植、慢性炎症、肺部炎症、急性肺损伤/ARDS、败血病、原发性肺动脉高压、恶性肺部积液(malignantpulmonary effusion)、脑水肿(例如，与急性中风/闭合头部损伤/外伤相关的)、滑液的炎症、RA中的血管翳形式、骨化性肌炎、肥厚性骨形成(hypertropicbone formation)、骨关节炎(OA)、顽固性腹水、多囊性卵巢病、子宫内膜异位症、第三体液分区疾病(3rd spacing of fluid diseases)(胰腺炎、间隔综合征、烧伤、肠病)、子宫的类纤维瘤(uterine fibroid)、早产、慢性炎症诸如IBD(克罗恩氏病(Crohn′s disease)和溃疡性结肠炎)、肾脏同种移植物排斥、炎性肠病、肾病综合征、不良或异常组织块生长(tissue mass growth)(非癌症)、肥胖、脂肪组织块生长、血友病关节、肥厚性瘢痕、毛发生长的抑制、Osler-Weber综合症、脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生症、硬皮病、沙眼、血管粘连、滑膜炎、皮炎、先兆子痫、腹水、心包积液(诸如与心包炎相关的)和合胸腔积液。

组合疗法

如上所述，本发明提供了组合疗法，其中VEGF拮抗剂与另一种疗法组合施用。例如，VEGF拮抗剂与本发明的不同药剂或拮抗剂(和/或本发明的激动剂)组合施用来治疗针对抗VEGF治疗有抗性的肿瘤。在某些实施方案中，别的药剂(例如髓样细胞减少剂、抗癌症剂或治疗剂、抗血管发生剂、或抗新血管形成治疗剂)也可以与抗VEGF和本发明的不同拮抗剂组合施用来治疗多种赘生性或非赘生性疾患。在一个实施方案中，所述赘生性或非赘生性疾患的特征在于与针对VEGF拮抗剂治疗有抗性的异常或不良血管发生有关的病理性疾患。本发明的拮抗剂可以与对那些目的有效的另一种药剂连续地或组合地施用，或是在同一组合物中或是作为分开的组合物。或者/另外，可以施用本发明的多种拮抗剂、药剂和/或激动剂。

本发明的拮抗剂和/或药剂(例如髓样细胞减少剂)的施用可以同时进行，例如作为单一组合物或作为使用相同或不同施用路径的两种或多种不同组合物。或者/另外，施用可以连续地、按任何次序进行。在某些实施方案中，范围从数分钟到数天、到数周、到数月的间隔可以存在于两个或多个组合物的施用之间。例如，可以先施用VEGF拮抗剂，接着是本发明的不同的拮抗剂或药剂(例如髓样细胞减少剂)(除了VEGF拮抗剂之外)。然而，还涵盖同时施用或先施用本发明的不同的拮抗剂或药剂。

与VEGF拮抗剂组合施用的治疗剂的有效量将处于医师或兽医的判断之内。进行剂量施用和调整来实现待治疗疾患的最大管理。剂量将另外取决于这些因素，诸如待使用的治疗剂的类型和所治疗的特定的患者。VEGF拮抗剂的合适剂量就是当前使用的那些，而且由于VEGF拮抗剂和本发明的不同拮抗剂的组合作用(协同作用)可以降低。在某些实施方案中，抑制物的组合强化了单一抑制物的效力。术语“强化”是指在其常用的或批准的剂量下治疗剂的效力方面的改善。还参见本文中标题为药物组合物的小节。

与癌症相关的抗血管发生疗法是一种癌症治疗策略，针对抑制肿瘤血管的发育，肿瘤血管是提供营养物以支持肿瘤生长所需的。由于血管发生牵涉原发性肿瘤生长和转移二者，本发明所提供的抗血管发生治疗能够抑制肿瘤在原发位点的赘生性生长以及预防肿瘤在继发位点的转移，因而容许用其它治疗剂攻击肿瘤。在本发明的一个实施方案中，抗癌剂或治疗剂是抗血管发生剂。在另一个实施方案中，抗癌剂是化疗剂。

许多抗血管发生剂已经被鉴定并且是本领域已知的，包括本文中列出的那些，例如在定义中列出的，以及由例如Carmeliet and Jain，Nature407：249-257(2000)；Ferrara et al.，Nature Reviews：Drug Discovery 3：391-400(2004)；及Sato，Int.J.Clin.Oncol.8：200-206(2003)所列出的。还参见美国专利申请US20030055006。在一个实施方案中，本发明的拮抗剂与抗VEGF中和性抗体(或片段)和/或另一种VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂组合使用，所述VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂包括但不限于例如可溶性VEGF受体(例如VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、神经毡蛋白(neuropillin)(例如NRP1、NRP2))片段、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、中和性抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶(RTK)的低分子量抑制物、针对VEGF的反义策略、针对VEGF或VEGF受体的核酶、VEGF的拮抗性变体；以及它们的任何组合。或者/另外，在VEGF拮抗剂和其他本发明药剂之外，两种或更多血管发生抑制剂可以任选地共施用给患者。在某些实施方案中，一种或多种别的治疗剂(例如抗癌剂)可以与本发明的药剂、VEGF拮抗剂和/或抗血管发生剂组合施用。

在本发明的某些方面，可用于使用本发明拮抗剂的组合肿瘤治疗的其它治疗剂包括其它癌症疗法(例如手术、放射治疗(例如牵涉照射或施用放射性物质)、化学疗法、使用本文所列的和本领域已知的抗癌剂的治疗、或其组合)。或者/另外，结合本文公开的相同的或两种或更多不同的抗原的两种或更多抗体可以共施用给患者。有时，可能有益的是还向患者施用一种或多种细胞因子。

化疗剂

在某些方面，本发明提供了阻断或降低抗性肿瘤生长或癌细胞生长的方法，其通过向易患癌症或诊断有癌症的患者施用有效量的VEGF拮抗剂和本发明的拮抗剂以及一种或多种化疗剂。多种化疗剂可以在本发明的组合治疗方法中使用。所涵盖的化疗剂的例示性的和非限制性的列表在本文“定义”中提供。

本领域普通技术人员将理解的是，适合剂量的化疗剂一般将接近临床疗法中所早就采用的那些，在所述临床疗法中化疗剂被单独地或与其它化疗剂组合地施用。剂量的变异将有可能存在，这取决于所治疗的疾患。施行治疗的医师将能够确定各个受试者的适合剂量。

复发性肿瘤生长

本发明还提供了用于抑制或预防复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法和组合物。复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长用于描述这样一种状况，其中正在接受一种或多种当前可用疗法或者用一种或多种当前可用疗法(例如癌症疗法，诸如化疗、放疗、手术、激素疗法和/或生物学疗法/免疫疗法、抗VEGF抗体疗法，特别是针对特定癌症的标准治疗方案)治疗过的患者在临床上不足以治疗该患者，或者该患者不再从治疗中接受任何有益效果，使得这些患者需要别的有效疗法。在用于本文时，该用语也可以指“非响应性/不应性”患者的状况，例如这描述了对治疗有响应但遭遇副作用的患者、发生抗性的患者、对治疗不响应的患者、对治疗的响应不令人满意的患者等。在各种实施方案中，当癌细胞的数目没有显著减少或癌细胞的数目增加了，或者肿瘤的大小没有显著缩小或肿瘤的大小增大了，或者癌细胞的数目或大小未能进一步减少或缩小时，则癌症是复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长。癌细胞是否是复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的确定可以通过用于分析治疗对癌细胞的有效性的本领域已知的任何方法、在体内或在体外进行，在上下文中使用“复发性”或“不应性”或“非响应性”的本领域接受的含义。针对抗VEGF治疗有抗性的肿瘤是复发性肿瘤生长的例子。

本发明提供了阻断或降低受试者中复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法，其通过施用本发明的一种或多种拮抗剂来阻断或降低所述受试者中的复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长。在某些实施方案中，所述拮抗剂可以在癌症治疗剂之后施用。在某些实施方案中，本发明的拮抗剂与癌症治疗(例如化疗)同时地施用。或者/另外，拮抗剂治疗与另一种癌症治疗交替，其可以以任何次序进行。本发明还涵盖施用一种或多种抑制性抗体来抑制倾向于患上癌症的患者中癌症的发作或复发的方法。一般而言，所述受试者正在接受癌症治疗。在一个实施方案中，所述癌症治疗是使用抗血管发生剂(例如VEGF拮抗剂)的治疗。抗血管发生剂包括本领域已知的那些和本文定义中所见的那些。在一个实施方案中，所述抗血管发生剂是抗VEGF中和性抗体或片段(例如人源化A4.6.1，AVASTIN

(Genentech，South San Francisco，CA)、Y0317、M4、G6、B20、2C3等)。参见例如美国专利6,582,959、6,884,879、6,703,020；WO98/45332；WO96/30046；WO94/10202；EP 0666868B1；美国专利申请20030206899、20030190317、20030203409和20050112126；Popkovet al.，Journal of Immunological Methods 288：149-164(2004)；及WO2005012359。别的药剂可以与VEGF拮抗剂和本发明拮抗剂组合施用，用于阻断或降低复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长，例如参见本文中标题为组合疗法的小节。

在一个实施方案中，本发明的拮抗剂或降低Gr1、嗜中性细胞弹性蛋白酶、MCP-1、MIP-1α、URCGP或URRTP的表达的其它治疗剂被施用来反转癌细胞对某些生物学的(例如拮抗剂，其是抗VEGF抗体)、激素的、放射的或化学治疗的药剂的抗性或降低的敏感性，从而使所述癌细胞对一种或多种这些药剂重新敏感，其然后可以被施用(或继续施用)来治疗或管理癌症，包括预防转移。

抗体

本发明的抗体包括本发明蛋白质的抗体和本发明蛋白质的抗体的抗体片段。本发明的多肽或蛋白质包括但不限于VEGF、Gr1、MCP-1、MIP-1α、CD11b、CD18、嗜中性细胞弹性蛋白酶、URCGP、DRCGP、URRTP和DRRTP。在某些方面，本发明的多肽或蛋白质是针对例如VEGF、Gr1、MCP-1、MIP-1α、CD11b、CD18、URCGP、DRCGP、URRTP和DRRTP的抗体，见本文中提供的一般性多肽或蛋白质信息。

本发明的抗体进一步包括作为抗血管发生剂或血管发生抑制剂的抗体，作为髓样细胞减少剂的抗体，VEGF、Gr1、嗜中性细胞弹性蛋白酶、MCP-1、MIP-1α、CD11b、CD18、URCGP、DRCGP、URRTP和DRRTP的抗体，作为抗癌剂的抗体，或本文所述其它抗体。例示性的抗体包括例如多克隆抗体、单克隆抗体、人源化抗体、抗体片段、多特异性抗体、异源偶联抗体、多价抗体、效应器功能工程改造的抗体等。

多克隆抗体

本发明的抗体可以包括多克隆抗体。制备多克隆抗体的方法是熟练技术人员知道的。例如，本发明的多克隆抗体通过在动物中一次或多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射相关抗原和佐剂来生成。使用双功能或衍生化药剂(例如马来酰亚胺苯甲酰磺基琥珀酰亚胺酯(通过半胱氨酸残基偶联)、N-羟基琥珀酰亚胺(通过赖氨酸残基)、戊二醛、琥珀酸酐、SOCl₂、或R¹N＝C＝NR(其中R和R¹是不同的烃基))将相关抗原与在待免疫物种中有免疫原性的蛋白质(例如匙孔

血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状腺球蛋白或大豆胰蛋白酶抑制剂)偶联可能是有用的。

通过将例如100μg或5μg蛋白质或偶联物(分别用于家兔或小鼠)与3倍体积的弗氏完全佐剂混和并将该溶液皮内注射于多个部位，将动物针对本发明的分子、免疫原性偶联物或衍生物进行免疫。一个月后，通过多个部位的皮下注射，用弗氏完全佐剂中初始量1/5-1/10的肽或偶联物对动物进行加强免疫。7-14天后，采集动物的血液，并测定血清的抗体滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateau)。典型的是，将动物用相同抗原但与不同蛋白质和/或通过不同交联剂偶联得到的偶联物进行加强免疫。偶联物还可在重组细胞培养中作为蛋白质融合物来制备。同样，适当使用凝聚剂(诸如明矾)来增强免疫应答。

单克隆抗体

针对本文所述抗原的单克隆抗体可以使用最初由Kohler et al.，Nature256：495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)来制备。

在杂交瘤方法中，如上所述免疫小鼠或其它适宜的宿主动物(诸如仓鼠或短尾猴(macaque monkey))以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体将特异性结合用于免疫的蛋白质。或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂(诸如聚乙二醇)将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，Academic Press，1986)。

将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基典型的含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(HAT培养基)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。

典型的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基的培养基敏感的。在这些骨髓瘤细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(Salk Institute Cell Distribution Center，San Diego，California，USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(AmericanType Culture Collection，Rockville，Maryland，USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已记载用于生成人单克隆抗体(Kozbor，J.Immunol.133：3001(1984)；Brodeur et al.，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，pp.51-63，MarcelDekker，Inc.，New York，1987)。

对杂交瘤细胞正在其中生长的培养液测定针对例如VEGF、Gr1、嗜中性细胞弹性蛋白酶、MCP-1、MIP-1α、CD11b、CD18、URCGP、DRCGP、URRTP、DRRTP、或血管发生分子的单克隆抗体的生成。可通过免疫沉淀或通过体外结合测定法(诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA))测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。此类技术和测定法是本领域知道的。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson and Pollard，Anal.Biochem.107：220(1980)的Scatchard分析来测定。

在鉴定到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行培养(Goding，Monoclonal Antibodies：Principles and Practice，pp.59-103，AcademicPress，1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。

通过常规免疫球蛋白纯化规程(诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析)将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养基、腹水或血清适当分开。单克隆抗体还可以通过重组DNA方法来制备，诸如美国专利No.4,816,567中所记载的。编码单克隆抗体的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如通过使用能够特异性结合编码单克隆抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。杂交瘤细胞可充当此类DNA的来源。一旦分离，可将DNA置入表达载体，然后将该表达载体转染入原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞(诸如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞)以在重组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。抗体的重组生产在下文中有更详细的描述。

在另一个实施方案中，可以从使用McCafferty et al.，Nature 348：552-554(1990)所记载的技术构建的噬菌体抗体库分离抗体或抗体片段。Clackson etal.，Nature 352：624-628(1991)和Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)分别记载了使用噬菌体文库分离鼠和人抗体。后续出版物记载了通过链改组(Marks et al.，Bio/Technology 10：779-783(1992))，以及组合感染和体内重组作为构建非常大的噬菌体文库的策略(Waterhouse et al.，Nuc.Acids Res.21：2265-2266(1993))，生成高亲和力(nM范围)的人抗体。如此，这些技术是用于分离单克隆抗体的传统单克隆抗体杂交瘤技术的可行替代方法。

还可以修饰DNA，例如通过替代即用人重链和轻链恒定域的编码序列替换同源鼠序列(美国专利No.4,816,567；Morrison et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA81：6851(1984))，或通过将非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列与免疫球蛋白编码序列共价连接。

典型的是，用此类非免疫球蛋白多肽替代抗体的恒定域，或者用它们替代抗体的一个抗原结合位点的可变域，以产生嵌合二价抗体，其包含对一种抗原具有特异性的一个抗原结合位点和对不同抗原具有特异性的另一个抗原结合位点。

人源化抗体和人抗体

本发明的抗体可以包括人源化抗体或人抗体。人源化抗体具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作“输入”残基，它们典型的取自“输入”可变域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方法进行(Jones et al.，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann et al.，Nature332：323-327(1988)；Verhoeyen et al.，Science 239：1534-1536(1988))，通过用啮齿类CDR序列替代人抗体的相应序列。因而，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No.4,816,567)，其中基本上少于整个人可变域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体典型的是其中一些CDR残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。

用于构建人源化抗体的人可变域(包括轻链和重链二者)的选择对于降低抗原性非常重要。依照所谓的“最适”(best-fit)方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。然后接受与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架(FR)(Sims et al.，J.Immunol.151：2296(1993)；Chothia et al.，J.Mol.Biol.196：901(1987))。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。同一框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：4285(1992)；Presta et al.，J.Immunol.151：2623(1993))。

更为重要的是，抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力及其它有利的生物学特性。为了实现这一目标，依照一种典型的方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是公众可获得的，且为本领域技术人员所熟悉。可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可从受体和输入序列中选出FR残基并进行组合，从而获得期望抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。一般而言，CDR残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。

或者，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(J_H)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：2551(1993)；Jakobovits et al.，Nature 362：255-258(1993)；Bruggermannetal.，Year in Immuno.7：33(1993)；及Duchosal et al.Nature 355：258(1992)。人抗体也可以衍生自噬菌体展示库(Hoogenboom et al.，J.Mol.Biol.，227：381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.，222：581-597(1991)；Vaughan et al.NatureBiotech 14：309(1996))。

人抗体还可以使用本领域已知的多种技术来生产，包括噬菌体展示库(Hoogenboom and Winter，J.Mol.Biol.227：381(1991)；Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581(1991))。依照这种技术，将抗体V结构域基因以符合读码框的方式克隆入丝状噬菌体(诸如M13或fd)的主要或次要外壳蛋白基因，并在噬菌体颗粒表面上展示为功能性抗体片段。因为丝状噬菌体颗粒包含噬菌体基因组的单链DNA拷贝，以抗体的功能特性为基础进行的选择也导致编码展示那些特性的抗体的基因的选择。如此，噬菌体模拟B细胞的一些特性。噬菌体展示可以以多种格式进行，综述参见例如Johnson，K S.and Chiswell，D J.，Cur Opin in Struct Biol 3：564-571(1993)。V基因区段的数种来源可用于噬菌体展示。例如，Clackson et al.，Nature 352：624-628(1991)从衍生自经免疫小鼠脾的小型V基因随机组合文库分离得到大量不同的抗噁唑酮抗体。例如通过基本上遵循Marks et al.，J.Mol.Biol.222：581-597(1991)或Griffith et al.，EMBO J.12：725-734(1993)记载的技术，可以自未免疫人供体构建V基因全集和分离针对大量不同抗原(包括自身抗原)的抗体。还可参见美国专利No.5,565,332和5,573,905。Cole等人和Boerner等人的技术也可用于制备人单克隆抗体(Cole et al.，Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy，Alan R.Liss，p.77(1985)及Boerner et al.，J.Immunol.147(1)：86-95(1991))。还可以由体外激活的B细胞来生成人抗体(参见美国专利No.5,567,610和5,229,275)。

抗体片段

本发明还包括抗体片段。已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto et al.，Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24：107-117(1992)；Brennan etal.，Science 229：81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。例如，可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab′-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)₂片段(Carter et al.，Bio/Technology 10：163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab′)₂片段。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员将是显而易见的。在其它实施方案中，选择的抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO93/16185；美国专利No.5,571,894；及美国专利No.5,587,458。Fv和sFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型；如此，它们适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建sFv融合蛋白以生成效应器蛋白质在sFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering，Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体片段可以是单特异性的或双特异性的。

多特异性抗体(例如双特异性的)

本发明的抗体还包括例如多特异性抗体，其具有对至少两种不同抗原的结合特异性。尽管此类分子通常只会结合两种抗原(即双特异性抗体，BsAb)，但是此表述在用于本文时涵盖具有额外特异性的抗体(诸如三特异性抗体)。BsAb的例子包括一个臂针对肿瘤细胞抗原而另一个臂针对细胞毒性触发分子的BsAb，诸如抗FcγRI/抗CD15、抗p185^HER2/FcγRIII(CD16)、抗CD3/抗恶性B细胞(1D10)、抗CD3/抗p185^HER2、抗CD3/抗p97、抗CD3/抗肾细胞癌、抗CD3/抗OVCAR-3、抗CD3/L-D1(抗结肠癌)、抗CD3/抗黑色素细胞刺激激素类似物、抗EGF受体/抗CD3、抗CD3/抗CAMA1、抗CD3/抗CD19、抗CD3/MoV18、抗神经细胞粘附分子(NCAM)/抗CD3、抗叶酸结合蛋白(FBP)/抗CD3、抗泛癌相关抗原(AMOC-31)/抗CD3；一个臂特异性结合肿瘤抗原而一个臂结合毒素的BsAb，诸如抗皂草素/抗Id-1、抗CD22/抗皂草素、抗CD7/抗皂草素、抗CD38/抗皂草素、抗CEA/抗蓖麻毒蛋白A链、抗干扰素-α(IFN-α)/抗杂交瘤独特型、抗CEA/抗长春花生物碱类；用于转变酶活化的前体药物的BsAb，诸如抗CD30/抗碱性磷酸酶(其催化磷酸丝裂霉素前体药物转变成丝裂霉素醇)；可用作溶纤剂的BsAb，诸如抗血纤维蛋白/抗组织型纤溶酶原激活物(tPA)、抗血纤维蛋白/抗尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)；用于将免疫复合物靶向细胞表面受体的BsAb，诸如抗低密度脂蛋白(LDL)/抗Fc受体(例如FcγRI、FcγRII或FcγRIII)；用于传染病治疗的BsAb，诸如抗CD3/抗单纯疱疹病毒(HSV)、抗T细胞受体：CD3复合物/抗流感、抗FcγR/抗HIV；用于体外或体内肿瘤检测的BsAb，诸如抗CEA/抗EOTUBE、抗CEA/抗DPTA、抗p185HER2/抗半抗原；作为疫苗佐剂的BsAb；及作为诊断工具的BsAb，诸如抗家兔IgG/抗铁蛋白、抗辣根过氧化物酶(HRP)/抗激素、抗促生长素抑制素/抗物质P、抗HRP/抗FITC、抗CEA/抗β-半乳糖苷酶。三特异性抗体的例子包括抗CD3/抗CD4/抗CD37、抗CD3/抗CD5/抗CD37和抗CD3/抗CD8/抗CD37。双特异性抗体可以制备成全长抗体或抗体片段(例如F(ab’)₂双特异性抗体)。

用于生成双特异性抗体的方法是本领域已知的。全长双特异性抗体的传统生产基于两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种链具有不同的特异性(Millstein et al.，Nature 305：537-539(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程披露于WO93/08829及Traunecker et al.，EMBO J.10：3655-3659(1991)。

依照一种不同的方法，将具有期望结合特异性(抗体-抗原结合位点)的抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。优选的是，与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。优选在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必需的位点的第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和需要时的免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染入合适的宿主生物体。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了很大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。

在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将想要的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh et al.，Methods in Enzymology 121：210(1986)。

依照WO96/27011中记载的另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的异二聚体的百分比最大化。优选的界面包含抗体恒定域的至少部分C_H3结构域。在该方法中，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链大小相同或相似的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物(诸如同二聚体)提高异二聚体产量的机制。

文献中还记载了由抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan et al.，Science 229：81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab′)₂片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠时还原，以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab′-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab′-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab′-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。

最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab′-SH片段，这些片段可化学偶联以形成双特异性抗体。Shalaby et al.，J.Exp.Med.175：217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab′)₂分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab′片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达VEGF受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳瘤靶物的溶解活性。

还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny et al.，J.Immunol.148(5)：1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab′部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了生成双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因而，迫使一个片段上的V_H和V_L结构域与另一个片段上的互补V_L和V_H结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体生成双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber et al.，J.Immunol.152：5368(1994)。

涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt et al.，J.Immunol.147：60(1991)。

异源偶联抗体

双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体，它们是本发明的抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体已经建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360，WO 92/200373和EP03089)。可使用任何便利的交联方法来生成异源偶联抗体。合适的交联剂是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于美国专利No.4,676,980。

多价抗体

本发明的抗体包括多价抗体。多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化(和/或异化)。本发明的抗体可以是可容易的通过重组表达编码抗体多肽链的核酸而生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(IgM类别以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。优选的二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体将包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。本文中优选的多价抗体包含(或由其组成)三个至约八个但优选四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(优选两条多肽链)，其中所述多肽链包含两个或更多可变域。例如，多肽链可包含VD1-(X1)_n-VD2-(X2)_n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体优选进一步包含至少两条(优选四条)轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文涵盖的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL结构域。

效应器功能工程改造

可能希望在效应器功能方面修饰本发明的抗体，从而增强例如抗体在治疗癌症中的效力。例如，可向Fc区中引入半胱氨酸残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。如此生成的同二聚体抗体可具有改善的内在化能力和/或提高的补体介导的细胞杀伤和抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。参见Caronet al.，J.Exp.Med.176：1191-1195(1992)和Shopes，B.，J.Immunol.148：2918-2922(1992)。具有增强的抗肿瘤活性的同二聚体抗体还可使用如Wolff et al.，Cancer Research 53：2560-2565(1993)中记载的异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成具有双重Fc区，由此可具有增强的补体溶解和ADCC能力。参见Stevenson et al.，Anti-Cancer Drug Design 3：219-230(1989)。为了延长抗体的血清半衰期，可如例如美国专利No.5,739,277中记载的将补救受体结合表位掺入抗体(尤其是抗体片段)。在用于本文时，术语“补救受体结合表位”指IgG分子(例如IgG₁、IgG₂、IgG₃或IgG₄)的Fc区中负责延长IgG分子体内血清半衰期的表位。

免疫偶联物

本发明还涵盖包含本文所述抗体且其偶联至细胞毒剂的免疫偶联物，所述细胞毒剂诸如化疗剂、毒素(例如细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段)或放射性同位素(即放射偶联物)。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。例子包括但不限于例如²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。

可用于生成此类免疫偶联物的化疗剂上文已有描述。例如，BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱、5-氟尿嘧啶、统称为LL-E33288复合物的药剂家族(美国专利5,053,394，5,770,710)、埃斯波霉素类(美国专利5,877,296)等(还可见本文中化疗剂的定义)可以偶联至本发明的抗体或其片段。

为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联的抗体或其片段。例子包括但不限于例如²¹¹At、¹³¹I、¹²⁵I、⁹⁰Y、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re、¹⁵³Sm、²¹²Bi、³²P、²¹²Pb、¹¹¹In、Lu的放射性同位素等。在将偶联物用于诊断时，它可包含放射性原子以用于闪烁照相研究，例如^99mtc或¹²³I，或自旋标记物以用于核磁共振(NMR)成像(也称为磁共振成像(MRI))，诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可以以已知方式将放射性标记物或其它标记物掺入偶联物。例如，肽可以生物合成，或者可以通过化学氨基酸合成法合成，其中使用牵涉例如以氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可以经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如^99mtc或¹²³I、¹⁸⁶Re、¹⁸⁸Re和¹¹¹In。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法(Fraker et al.，Biochem.Biophys.Res.Commun.80：49-57(1978))可用于掺入碘-123。参见例如Chatal，Monoclonal Antibodies inImmunoscintigraphy，CRC Press，1989，其详细记载了其它方法。

可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合性活性片段、外毒素A链(来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹毒蛋白(dianthinprotein)、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白(PAPI、PAPII和PAP-S)、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、新霉素(neomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO93/21232。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)-乙二胺)、二异硫氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。例如，可以如Vitetta et al.，Science 238：1098(1987)中所记载的制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒性药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头或含二硫化物接头(Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)；美国专利No.5,208,020)。

或者，可通过例如重组技术或肽合成来生成包含抗VEGF和/或抗本发明蛋白质抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可以包含各自编码偶联物两部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，所述接头肽不破坏偶联物的期望特性。

在某些实施方案中，将抗体与“受体”(诸如链霉亲合素)偶联以用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂(例如放射性核苷酸)偶联的“配体”(例如亲合素)。在某些实施方案中，在抗体与具有核酸降解活性的化合物(例如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶)之间形成免疫偶联物。

美登素和美登木素生物碱类

本发明提供了偶联至一个或多个美登木素生物碱类分子的本发明抗体。美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白聚合来起作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木(Maytenus serrata)分离到(美国专利No.3,896,111)。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯(美国专利No.4,151,042)。合成的美登醇及其衍生物和类似物披露于例如美国专利No.4,137,230；4,248,870；4,256,746；4,260,608；4,265,814；4,294,757；4,307,016；4,308,268；4,308,269；4,309,428；4,313,946；4,315,929；4,317,821；4,322,348；4,331,598；4,361,650；4,364,866；4,424,219；4,450,254；4,362,663；及4,371,533。

本发明的抗体可以偶联至美登木素生物碱类分子且不显著削弱抗体或美登木素生物碱类分子的生物学活性。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱类分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示出功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利No.5,208,020及上文提及的其它专利和非专利出版物中披露了合适的美登木素生物碱类。在一个实施方案中，美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。

本领域知道许多连接基团可用于生成抗体-美登木素生物碱类偶联物，包括例如美国专利No.5,208,020或欧洲专利0 425 235 B1及Chari et al.，Cancer Research 52：127-131(1992)中所披露的。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团或酯酶不稳定基团，正如上述专利中所披露的，优选二硫化物和硫醚基团。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体与美登木素生物碱类的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯(诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯)、活性酯类(诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯)、醛类(诸如戊二醛)、双叠氮化合物(诸如双(对叠氮苯甲酰基)己二胺)、双重氮衍生物(诸如双(对重氮苯甲酰基)乙二胺)、二异氰酸酯(诸如甲苯2，6-二异氰酸酯)和双活性氟化合物(诸如1，5-二氟-2，4-二硝基苯)的双功能衍生物。典型的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)(Carlsson et al.，Biochem.J.173：723-737(1978))和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，以提供二硫化物连接。

根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱类分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯连接。反应可发生在具有羟基的C-3位置、用羟甲基修饰的C-14位置、用羟基修饰的C-15位置和具有羟基的C-20位置。在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成连接。

加利车霉素

另一种感兴趣的免疫偶联物包含与一个或多个加利车霉素分子偶联的本发明抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度产生双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利No.5,712,374；5,714,586；5,739,116；5,767,285；5,770,701；5,770,710；5,773,001；5,877,296(都属于美国Cyanamid公司)。可使用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ₁ ^I、α₂ ^I、α₃ ^I、N-乙酰基-γ₁ ^I、PSAG和θ^I ₁(Hinman et al.，Cancer Research 53：3336-3342(1993)；Lode et al.，Cancer Research 58：2925-2928(1998)；及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利)。可以与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些药剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒性效果。

其它抗体修饰

本文还涵盖抗体的其它修饰。例如，可将抗体与多种非蛋白质性质聚合物之一连接，例如聚乙二醇、聚丙二醇、聚氧化烯、或聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物。还可将抗体包载入例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶状药物投递系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或粗滴乳状液。此类技术披露于Remington′s Pharmaceutical Sciences，第16版，Osol，A.编，1980。

脂质体和纳米颗粒

本发明的多肽可以配制成脂质体。例如，本发明的抗体可以配制成免疫脂质体。含有抗体的脂质体通过本领域已知方法来制备，诸如Epstein et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：3688(1985)；Hwang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4030(1980)；及美国专利No.4,485,045和4,544,545中所记载的。循环时间延长的脂质体披露于美国专利No.5,013,556。一般而言，脂质体的配制和使用是本领域技术人员所知道的。

可以用包含磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法生成特别有用的脂质体。将脂质体挤过具有限定孔径的滤器，以产生具有期望直径的脂质体。可以如Martin et al.，J.Biol.Chem.257：286-288(1982)中所述，将本发明抗体的Fab’片段经二硫化物交换反应与脂质体偶联。任选在脂质体中包含化疗剂(诸如多柔比星)。参见Gabizon et al.，J.National Cancer Inst.81(19)：1484(1989)。

其它用途

本发明的抗体具有多种功用。例如，本发明的抗体可用于诊断测定法，例如用于检测特定细胞、组织或血清中的蛋白质表达，用于癌症检测(例如在检测抗性肿瘤中)等。在一个实施方案中，抗体用于选择用本文提供的方法治疗的患者群，例如用于检测具有改变的Gr1、嗜中性细胞弹性蛋白酶、MCP-1、MIP-1α、URCGP、DRCGP、URRTP或DRRTP表达的患者。可以使用本领域已知的多种诊断测定技术，诸如竞争性结合测定法、直接或间接三明治测定法、和免疫沉淀测定法，以异相或同相进行(Zola，MonoclonalAntibodies：A Manual of Techniques，CRC Press，Inc.，1987，pp.147-158)。诊断测定法中所使用的抗体可以用可检测模块(moiety)标记。可检测模块应当能够直接或间接产生可检测信号。例如，可检测模块可以是放射性同位素，诸如³H、¹⁴C、³²P、³⁵S或¹²⁵I；荧光或化学发光化合物，诸如异硫氰酸荧光素、罗丹明或萤光素；或酶，诸如碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或辣根过氧化物酶。可以采用本领域知道的用于将抗体与可检测模块偶联的任何方法，包括Hunter et al.，Nature 144：945(1962)；David et al.，Biochemistry 13：1014(1974)；Pain et al.，J.Immunol.Meth.40：219(1981)；及Nygren，J.Histochem.AndCytochem.30：407(1982)中所记载的那些方法。

本发明的抗体还可用于从重组细胞培养物或天然来源亲和纯化本发明的蛋白质或蛋白质片段。在该过程中，使用本领域众所周知的方法将针对蛋白质的抗体固定化在合适的支持物上，诸如Sephadex树脂或滤纸。然后使固定化抗体接触含有待纯化蛋白质的样品，此后用合适的溶剂清洗支持物，所述溶剂将会基本上清除样品中除结合至固定化抗体的蛋白质以外的所有物质。最后，用另一种合适的溶剂清洗支持物，所述溶剂将会从抗体上释放蛋白质。

对本发明多肽的共价修饰

本发明多肽(例如本发明的蛋白质、本发明蛋白质的抗体、多肽拮抗剂片段、融合分子(例如免疫融合分子)等)的共价修饰包括在本发明的范围内。如果适用，它们可通过化学合成或者通过酶促或化学切割所述多肽来生成。多肽的其它类型共价修饰如下引入分子，即通过将多肽的目标氨基酸残基与能够与选定侧链或N-或C-末端残基反应的有机衍生化试剂起反应，或者通过将经修饰的氨基酸或非天然的氨基酸掺入正在增长的多肽链，例如Ellman et al.，Meth.Enzym.202：301-336(1991)；Noren et al.，Science 244：182(1989)；及美国专利申请出版物20030108885和20030082575。

半胱氨酰残基最常见的是与α-卤代乙酸(盐/酯)(和相应的胺)起反应，诸如氯乙酸或氯乙酰胺，以得到羧甲基或羧酰氨甲基(carboxyamidomethyl)衍生物。半胱氨酰残基还可以通过与溴代三氟丙酮、α-溴代-β-(5-imidozoyl)丙酸、氯乙酰基磷酸(盐/酯)、N-烷基马来酰亚胺、3-硝基-2-吡啶基二硫化物、甲基2-吡啶基二硫化物、对氯汞苯甲酸(盐/酯)、2-氯汞基-4-硝基酚或(4-)氯-7-硝基苯并-2-氧-1，3-二唑起反应而衍生化。

组氨酰残基通过与二乙基焦碳酸(盐/酯)在pH5.5-7.0起反应而衍生化，因为此试剂相对特异于组氨酰侧链。对溴苯甲酰甲基溴也是有用的；此反应通常在pH6.0的0.1M二甲胂酸钠中进行。

赖氨酰和氨基末端残基与琥珀酸酐或其它羧酸酐起反应。用这些试剂的衍生化具有逆转赖氨酰残基电荷的效果。适于衍生化含α-氨基的残基的其它试剂包括亚氨基酯，诸如皮考啉亚氨酸甲酯(methyl picolinimidate)、磷酸吡哆醛酯、吡哆醛、氯硼氢化物、三硝基苯磺酸、邻甲基异脲、2，4-戊二酮、和转氨酶催化的与乙醛酸(glyoxylate)的反应。

精氨酰残基通过与一种或数种常规试剂起反应来修饰，其中有苯甲酰甲醛(phenylglyoxal)、2，3-丁二酮、1，2-环己二酮和茚三酮。精氨酸残基的衍生化由于胍官能基的高pK_a所以需要在碱性条件下进行反应。此外，这些试剂可以与赖氨酸的基团以及精氨酸ε-氨基起反应。

酪氨酰残基可以进行特异性修饰，对在酪氨酰残基中引入光谱标记物特别感兴趣，其通过与芳香族重氮化合物或四硝基甲烷起反应。最常见的是，使用N-乙酰基咪唑和四硝基甲烷分别形成邻乙酰基酪氨酰种类和3-硝基衍生物。用¹²⁵I或¹³¹I碘化酪氨酰残基以制备带标记物的蛋白质以用于放射免疫测定法。

羧基侧基团(天冬氨酰或谷氨酰)通过与碳二亚胺(R-N＝C＝N-R’)起反应而进行选择性修饰，碳二亚胺中的R和R’是不同的烃基，诸如1-环己基-3-(2-吗啉基-4-乙基)碳二亚胺或1-乙基-3-(4-氮阳离子-4，4-二甲基戊基)碳二亚胺。此外，通过与铵离子起反应将天冬氨酰和谷氨酰残基转变成天冬酰胺酰和谷酰胺酰残基。

谷酰胺酰和天冬酰胺酰残基常常脱酰胺，分别成为相应的谷氨酰和天冬氨酰残基。这些残基在中性或碱性条件下脱酰胺。这些残基的脱酰胺形式落入本发明的范围。

其它修饰包括脯氨酸和赖氨酸的羟基化，丝氨酰或苏氨酰残基羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链α-氨基的甲基化(T.E.Creighton，Proteins：Structure and Molecular Properties，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，pp.79-86(1983))，N-末端胺的乙酰化，及任何C-末端羧基的酰胺化。

另一类共价修饰牵涉向本发明的多肽化学或酶促偶联糖苷。这些规程的优点在于它们不需要在具有N-或O-连接糖基化的糖基化能力的宿主细胞中生成多肽根据所使用的偶联模式，可以将糖附着于(a)精氨酸和组氨酸，(b)游离羧基，(c)游离巯基，诸如半胱氨酸的游离巯基，(d)游离羟基，诸如丝氨酸、苏氨酸或羟脯氨酸的游离羟基，(e)芳香族残基，诸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸的，或(f)谷氨酰胺的酰胺基。这些方法记载于1987年9月11日公布的WO 87/05330和Aplin and Wriston，CRC Crit.Rev.Biochem.pp.259-306(1981)。

本发明多肽上存在的任何碳水化合物模块的消除可通过化学或酶促方法实现。化学的脱糖基化作用需要将多肽暴露于化合物三氟甲磺酸或等效化合物。此处理导致除连接糖(linking sugar)(N-乙酰葡糖胺或N-乙酰半乳糖胺)之外的大部分或全部糖得到切除，而多肽保持完整。化学的脱糖基化作用记载于Hakimuddin et al.，Arch.Biochem.Biophys.259：52(1987)和Edge et al.，Anal.Biochem.118：131(1981)。碳水化合物模块(例如抗体上的)的酶促切割可通过使用多种内切和外切糖苷酶来实现，记载于Thotakura et al.，Meth.Enzymol.138：350(1987)。

本发明多肽的另一类共价修饰包括将多肽连接至多种非蛋白质性质聚合物之一，例如聚乙二醇、聚丙二醇或聚氧化烯，以美国专利No.4,640,835；4,496,689；4,301,144；4,670,417；4,791,192或4,179,337所列方式。

载体、宿主细胞和重组方法

本发明的多肽可以使用易于获得的技术和材料而重组生产。

为了重组生产本发明的多肽，例如本发明的蛋白质，本发明蛋白质的抗体，例如抗VEGF抗体，分离编码它的核酸，并插入可复制载体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。编码本发明多肽的DNA易于使用常规规程分离和测序。例如，对编码单克隆抗体的DNA分离和测序，例如通过使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针。可以获得许多载体。载体构件通常包括但不限于下列一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子和转录终止序列。

信号序列构件

本发明的多肽不仅可以直接重组生产，而且可以作为与异源多肽的融合多肽，所述异源多肽典型的是成熟蛋白质或多肽的N-末端处的信号序列或具有特异性切割位点的其它多肽。所选择的异源信号序列典型的是受到宿主细胞识别并加工(即受到信号肽酶切割)的。对于不识别和加工天然多肽信号序列的原核宿主细胞，所述信号序列用例如选自下组的原核信号序列替代：碱性磷酸酶、青霉素酶、lpp或热稳定肠毒素II前导序列。为了酵母分泌，天然信号序列可以用例如酵母转化酶前导序列、α因子前导序列(包括糖酵母属和克鲁维氏酵母属α因子前导序列)、酸性磷酸酶前导序列、白色假丝酵母葡萄糖淀粉酶前导序列、或WO 90/13646中记载的信号替代。在哺乳动物细胞表达中，可以利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导序列，例如单纯疱疹gD信号。

将此类前体区(precursor region)的DNA以符合读码框的方式与编码本发明多肽的DNA连接。

复制起点构件

表达和克隆载体都包含能够使载体在一种或多种所选择的宿主细胞中复制的核酸序列。通常，在克隆载体中，这种序列是能够使载体不依赖于宿主染色体DNA而复制的序列，包括复制起点或自主复制序列。众所周知多种细菌、酵母和病毒的此类序列。来自质粒pBR322的复制起点适合于大多数革兰氏阴性细菌，2μ质粒起点适合于酵母，而各种病毒起点(SV40、多瘤病毒、腺病毒、VSV或BPV)可用于哺乳动物细胞中的克隆载体。一般而言，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件(SV40起点的使用通常可能只是因为它包含早期启动子)。

选择基因构件

表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足营养缺陷型的缺陷；或(c)提供不能由复合培养基获得的必需营养物，例如用于芽孢杆菌的编码D-丙氨酸消旋酶的基因。

选择方案的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞的生长。用异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的例子使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。

适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是那些能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和-II(典型的是灵长类金属硫蛋白基因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。

例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx)(DHFR的一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系。

或者，可以通过细胞在含有针对选择标志的选择剂(诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、新霉素或G418)的培养基中的生长来选择经编码本发明多肽、野生型DHFR蛋白质和另一种选择标志(诸如氨基糖苷3′-磷酸转移酶(APH))的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包含内源DHFR的野生型宿主)。参阅美国专利No.4,965,199。

适用于酵母的选择基因是存在于酵母质粒Yrp7中的trp1基因(Stinchcomb et al.，Nature 282：39(1979))。trp1基因为缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株(例如ATCC No.44076或PEP4-1)提供了选择标志。Jones，Genetics 85：12(1977)。酵母宿主细胞基因组中存在trp1损伤随之提供了用于通过在缺乏色氨酸时的生长来检测转化的有效环境。类似的，用携带Leu2基因的已知质粒补足Leu2缺陷型酵母菌株(ATCC 20,622或38,626)。

此外，衍生自1.6μm环状质粒pKD1的载体可用于转化克鲁维氏酵母属酵母。或者，报导了用于在乳酸克鲁维氏酵母中大规模生产重组小牛凝乳酶的表达系统。Van den Berg，Bio/Technology 8：135(1990)。还披露了用于由克鲁维氏酵母属的工业用菌株分泌成熟重组人血清清蛋白的稳定多拷贝表达载体。Fleer et al.，Bio/Technology 9：968-975(1991)。

启动子构件

表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，而且它与编码本发明多肽的核酸可操作连接。适用于原核宿主的启动子包括phoA启动子、β-内酰胺酶和乳糖启动子系统、碱性磷酸酶、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子(诸如tac启动子)。然而，其它已知的细菌启动子也是合适的。用于细菌系统的启动子还将包含与编码本发明多肽的DNA可操作连接的Shine-Dalgarno(S.D.)序列。

已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处找到的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3′端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3′端添加polyA尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体。

适用于酵母宿主的启动序列的例子包括3-磷酸甘油酸激酶或其它糖酵解酶的启动子，诸如烯醇酶、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、己糖激酶、丙酮酸脱羧酶、磷酸果糖激酶、葡萄糖-6-磷酸异构酶、3-磷酸甘油酸变位酶、丙酮酸激酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸葡萄糖异构酶和葡糖激酶。

作为具有通过生长条件控制转录的额外优点的诱导型启动子的其它酵母启动子是醇脱氢酶2、异细胞色素C、酸性磷酸酶、与氮代谢有关的降解酶、金属硫蛋白、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、及负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。适用于酵母表达的载体和启动子进一步记载于EP 73,657。酵母增强子也可以有利的与酵母启动子一起使用。

在哺乳动物宿主细胞中由载体转录本发明多肽受到例如从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒(诸如腺病毒2)、牛乳头瘤病毒、禽肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒和典型的猿猴病毒40(SV40))基因组、异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子)、及热休克启动子获得的启动子的控制，倘若此类启动子与宿主细胞系统相容的话。

方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIIIE限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利No.4,419,446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利No.4,601,978中记载了该系统的一种改良。关于在小鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β-干扰素cDNA还可参见Reyes et al.，Nature 297：598-601(1982)。或者，可以使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。

增强子元件构件

常常通过将增强子序列插入载体来提高高等真核细胞对编码本发明多肽的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因(球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、甲胎蛋白和胰岛素)的许多增强子序列。典型的是，使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起点晚期一侧的增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期一侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv，Nature297：17-18(1982)。可以将增强子剪接入载体，位于多肽编码序列的5′或3′位置，但是典型的位于启动子的5′位点。

转录终止构件

用于真核宿主细胞(酵母、真菌、昆虫、植物、动物、人或来自其它多细胞生物体的有核细胞)的表达载体还将包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可以从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5′端和偶尔的3′端获得。这些区域包含在编码本发明多肽的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO 94/11026及其中披露的表达载体。

宿主细胞的选择和转化

适于克隆或表达本文载体中的编码本发明多肽的DNA的宿主细胞是上文描述的原核生物、酵母或高等真核细胞。适于此目的的原核生物包括真细菌，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体，例如肠杆菌科，诸如埃希氏菌属(Escherichia)例如大肠埃希氏菌或大肠杆菌(E.coli)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文氏菌属(Erwinia)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、沙门氏菌属(Salmonella)例如鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、沙雷氏菌属(Serratia)例如粘质沙雷氏菌(Serratia marcescans)、志贺氏菌属(Shigella)、以及芽孢杆菌属(Bacilli)诸如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)和地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)(例如1989年4月12日公布的DD 266,710中披露的地衣芽孢杆菌41P)、假单胞菌属(Pseudomonas)诸如铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、和链霉菌属(Streptomyces)。典型的是，大肠杆菌克隆宿主是大肠杆菌294(ATCC31,446)，尽管其它菌株诸如大肠杆菌B、大肠杆菌X1776(ATCC 31,537)和大肠杆菌W3110(ATCC 27,325)也是合适的。这些例子是例示性的，而不是限制性的。

在原核生物以外，真核微生物(诸如丝状真菌或酵母)也是编码本发明多肽的载体的合适克隆或表达宿主。酿酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)或常用的面包酵母在最常用的低等真核宿主微生物之中。然而，通常可获得许多其它属、种和菌株且可用于本发明，诸如粟酒裂殖糖酵母(Schizosaccharomyces pombe)；克鲁维酵母属(Kluyveromyces)宿主，诸如例如乳酸克鲁维酵母(K.lactis)、脆壁克鲁维酵母(K.fragilis)(ATCC12,424)、保加利亚克鲁维酵母(K.bulgaricus)(ATCC 16,045)、威克克鲁维酵母(K.wickeramii)(ATCC 24,178)、K.waltii(ATCC 56,500)、果蝇克鲁维酵母(K.drosophilarum)(ATCC 36,906)、耐热克鲁维酵母(K.thermotolerans)和马克思克鲁维酵母(K.marxianus)；亚罗酵母属(Yarrowia)(EP 402,226)；巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)(EP 183,070)；假丝酵母属(Candida)；瑞氏木霉(Trichoderma reesia)(EP 244,234)；粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)；许旺酵母属(Schwanniomyces)，诸如Schwanniomyces occidentalis；和丝状真菌，诸如例如脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、弯颈霉属(Tolypocladium)、和曲霉属(Aspergillus)宿主诸如构巢曲霉(A.nidulans)和黑曲霉(A.niger)。

适于表达糖基化本发明多肽的宿主细胞衍生自多细胞生物体。无脊椎动物细胞的例子包括植物和昆虫细胞。已经鉴定了许多杆状病毒株和变体及相应的允许昆虫宿主细胞，它们来自诸如草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)(毛虫)、埃及伊蚊(Aedes aegypti)(蚊子)、白纹伊蚊(Aedes albopictus)(蚊子)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)(果蝇)和家蚕(Bombyx mori)等宿主。公众可获得多种病毒株用于转染，例如苜蓿尺蠖Autographa californica NPV的L-1变体和家蚕Bombyx mori NPV的Bm-5株，而且此类病毒可依照本发明用作本文中的病毒，特别是用于转染草地夜蛾细胞。还可利用棉、玉米、马铃薯、大豆、矮牵牛、番茄和烟草的植物细胞培养物作为宿主。

然而，脊椎动物细胞得到最多关注，而且培养(组织培养)中脊椎动物细胞的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的例子是用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚肾系(293或为了在悬浮培养中生长而亚克隆的293细胞，Graham et al.，J.Gen Virol.36：59(1977))；幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaubet al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；小鼠塞托利(sertoli)细胞(TM4，Mather，Biol.Reprod.23：243-251(1980))；猴肾细胞(CV1，ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1587)；人宫颈癌细胞(HELA，ATCCCCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；牛鼠(buffalo rat)肝细胞(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB8065)；小鼠乳瘤(MMT 060562，ATCC CCL 51)；TRI细胞(Mather et al.，AnnalsN.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)；MRC5细胞；FS4细胞；和人肝瘤系(Hep G2)。

用上文所述用于生产本发明多肽的表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当更改的常规营养培养基中进行培养。

培养宿主细胞

可以在多种培养基中培养用于生产本发明多肽的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10(Sigma)、极限必需培养基(MEM，Sigma)、RPMI-1640(Sigma)、和Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可以使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.，Meth.Enz.58：44(1979)；Barnes et al.，Anal.Biochem.102：255(1980)；美国专利No.4,767,704；4,657,866；4,927,762；4,560,655；或5,122,469；WO 90/03430；WO 87/00195；或美国专利Re.30,985。任何这些培养基可以根据需要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如GENTAMYCIN^TM药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、和葡萄糖或等效能源。还可以以适宜浓度包含本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件(诸如温度、pH等)就是先前为表达而选择用于宿主细胞的，这对于普通技术人员而言是显而易见的。

多肽纯化

本发明的多肽或蛋白质可以从受试者中回收。在使用重组技术时，可以在细胞内、在周质空间中生成本发明的多肽，或者直接分泌入培养基。可以从培养物的培养液或者从宿主细胞溶胞液回收本发明的多肽。如果是膜结合的，那么可以用合适的去污剂溶液(例如Triton-X 100)或通过酶促切割从膜上释放它。本发明多肽的表达中所采用的细胞可通过各种物理或化学手段破碎，诸如冻融循环、超声处理、机械破碎或细胞裂解剂。

以下规程是合适的蛋白质纯化规程的例子：通过离子交换柱上的分级；乙醇沉淀；反相HPLC；硅土上的层析，肝素SEPHAROSE^TM上的层析，阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱、DEAE等)上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；利用例如Sephadex G-75的凝胶过滤；用蛋白ASepharose柱去除杂质诸如IgG；及用金属螯合柱结合带表位标签形式的本发明多肽。可以采用多种蛋白质纯化方法，此类方法是本领域已知的，而且记载于例如Deutscher，Methods in Enzymology，182(1990)；Scopes，ProteinPurification：Principles and Practice，Springer-Verlag，New York(1982)。所选择的纯化步骤取决于例如所用纯化方法的本质和所生成的具体本发明多肽。

例如，可以使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化由细胞制备的抗体组合物，典型的纯化技术是亲和层析。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2或γ4重链的抗体(Lindmark et al.，J.Immunol.Meth.62：1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3(Guss et al.，EMBOJ.5：1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可以使用其它基质。物理稳定的基质(诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯)容许获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含C_H3结构域，则可使用Bakerbond ABX^TM树脂(J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术，例如上文所述的。还可参见Carter et al.，Bio/Technology 10：163-167(1992)，其记载了用于分离分泌到大肠杆菌周质空间的抗体的规程。

药用配制剂

通过将具有期望纯度的分子(例如多肽)与任选的药学可接受载体、赋形剂或稳定剂(《Remington′s Pharmaceutical Sciences》，第16版，Osol，A.编，1980)混合来制备本文所述和依照本发明使用的本发明药剂(VEGF拮抗剂、髓样细胞减少剂、URCGP拮抗剂、URRTP拮抗剂、DRCGP激动剂、DRRTP激动剂、或抗癌剂)及其组合的治疗用配制剂，以冻干剂型或水溶液的形式贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

活性成分还可包载入例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊(例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、胶状药物投递系统(例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或粗滴乳状液。此类技术披露于例如《Remington′s PharmaceuticalSciences》，第16版，Osol，A.编，1980。

用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。

可制备持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有本发明多肽的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM(由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体)及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定化。还可参见例如美国专利No.6,699,501，其记载了具有聚电解质覆盖物的胶囊。

还涵盖可以通过基因疗法将本发明的药剂(例如VEGF拮抗剂、髓样细胞减少剂、化疗剂或抗癌剂)导入受试者。基因疗法指通过给受试者施用核酸进行的疗法。在基因疗法的应用中，为了实现治疗上有效的基因产物的体内合成，例如为了替换缺陷基因，将基因引入细胞。“基因疗法”包括通过单次处理实现持久效果的传统基因疗法及牵涉一次或重复施用治疗上有效的DNA或mRNA的基因治疗剂施用二者。反义RNA和DNA可作为治疗剂用于阻断某些基因的体内表达。早已显示可以将短反义寡核苷酸输入细胞，在那里它们起抑制剂的作用，尽管由于细胞膜对它们的摄取受限制因而它们的胞内浓度低(Zamecnik et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83：4143-4146(1986))。可以修饰寡核苷酸以增强它们的摄取，例如通过用不带电荷的基团取代它们带负电荷的磷酸二酯基团。关于基因疗法的方法的一般性综述参阅例如Goldspiel et al.，Clinical Pharmacy 12：488-505(1993)；Wu and Wu，Biotherapy3：87-95(1991)；Tolstoshev，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.32：573-596(1993)；Mulligan，Science260：926-932(1993)；Morgan and Anderson，Ann.Rev.Biochem.62：191-217(1993)；及May，TIBTECH 11：155-215(1993)。重组DNA技术领域普遍知道的、可以使用的方法记载于Ausubel等人编(1993)CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，NY和Kriegler(1990)GeneTransfer and Expression，A Laboratory Manual，Stockton Press，NY。有多种技术可用于将核酸引入活细胞。所述技术可根据核酸是在体外转移入培养的细胞还是在体内转移入预期宿主的细胞而变化。适于在体外将核酸转移入哺乳动物细胞的技术包括使用脂质体、电穿孔、显微注射、细胞融合、DEAE-右旋糖苷、磷酸钙沉淀法等。当前优选的体内基因转移技术包括用病毒(典型的是逆转录病毒)载体进行的转染和病毒外壳蛋白-脂质体介导的转染(Dzau et al.，Trends in Biotechnology 11：205-210(1993))。例如，体内核酸转移技术包括用病毒载体(诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒、慢病毒、逆转录病毒或腺伴随病毒)和基于脂质的系统(可用于脂质介导的基因转移的脂类有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol)进行的转染。在基因疗法中使用病毒载体的例子可参阅Clowes et al.，J.Clin.Invest.93：644-651(1994)；Kiemet al.，Blood 83：1467-1473(1994)；Salmons and Gunzberg，Human GeneTherapy 4：129-141(1993)；Grossman and Wilson，Curr.Opin.in Genetics andDevel.3：110-114(1993)；Bout et al.，Human Gene Therapy 5：3-10(1994)；Rosenfeld et al.，Science 252：431-434(1991)；Rosenfeld et al.，Cell 68：143-155(1992)；Mastrangeli et al.，J.Clin.Invest.91：225-234(1993)；及Walsh et al.，Proc.Soc.Exp.Biol.Med.204：289-300(1993)。

在有些情况中希望与靶向靶细胞的药剂(诸如对细胞表面膜蛋白或靶细胞特异性的抗体、针对靶细胞上受体的配体等)一起提供核酸来源。若采用脂质体，则可以使用与胞吞作用有关的细胞表面膜蛋白结合的蛋白质靶向和/或促进摄取，例如对特定细胞类型有向性的衣壳蛋白或其片段、针对在循环中经历内在化的蛋白质的抗体、靶向胞内定位并延长胞内半衰期的蛋白质。受体介导的胞吞作用的技术记载于例如Wu et al.，J.Biol.Chem.262：4429-4432(1987)和Wagner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：3410-3414(1990)。关于基因标记和基因疗法方案的综述参阅Anderson et al.，Science256：808-813(1992)。

剂量和施用

依照已知方法将本发明的药剂(VEGF拮抗剂、髓样细胞减少剂、化疗剂或抗癌剂)施用于人类患者，诸如静脉内施用(像推注或持续一段时间的连续输注)、肌肉内、腹膜内、脑脊髓内、皮下、关节内、滑膜内、鞘内、口服、表面、或吸入路径，和/或皮下施用。

在某些实施方案中，本发明的治疗牵涉组合施用VEGF拮抗剂和一种或多种髓样细胞减少剂或化疗剂。在一个实施方案中，存在别的抗癌剂，例如一种或多种不同的抗血管发生剂、一种或多种化疗剂等。本发明还涵盖施用多种抑制剂，例如针对同一抗原的多种抗体或针对本发明不同蛋白质的多种抗体。在一个实施方案中，与VEGF拮抗剂和/或一种或多种髓样细胞减少剂一起施用不同化疗剂的混合物。组合施用包括使用分开的配制剂或单一药物配制剂的共施用，和/或任一次序的顺次施用。例如，VEGF拮抗剂可以在施用髓样细胞减少剂或化疗剂之前、之后、交替，或者可以同时给予。在一个实施方案中，有一段时间所有(两种或更多)活性剂同时发挥其生物学活性。

对于疾病的预防或治疗，本发明药剂的适宜剂量取决于上文定义的待治疗疾病的类型、疾病的严重程度和病程、施用抑制剂是用于预防还是治疗目的、先前的疗法、患者的临床史和对抑制剂的响应、及主治医师的判断。将抑制剂一次性或者在一系列治疗中适当的施用于患者。在组合治疗方案中，本发明的组合物以治疗有效量或治疗协同量施用。在用于本文时，治疗有效量指导致所针对疾病或疾患得到减轻或抑制的本发明组合物的施用量和/或VEGF拮抗剂和一种或多种其它治疗剂的共施用量。药剂组合的施用效果可以是叠加的。在一个实施方案中，施用的效果是协同效应。治疗协同量指协同的或显著的减轻或消除与特定疾病有关的状况或症状所必需的VEGF拮抗剂和一种或多种其它治疗剂(例如髓样细胞减少剂、化疗剂或抗癌剂)的量。

根据疾病的类型和严重程度，大约1μg/kg到50mg/kg(例如0.1-20mg/kg)VEGF拮抗剂或髓样细胞减少剂、化疗剂、或抗癌剂是施用于患者的初始候选剂量，无论是例如通过一次或多次分开施用，或者是通过连续输注。典型每日剂量的范围可以为大约1μg/kg到大约100mg/kg或者更多，取决于上述因素。对于持续数天或更长时间的重复给药，根据疾患，治疗维持到直至发生期望的疾病症状抑制。然而，其它剂量方案可能也是有用的。典型的是，临床医师将会施用本发明的分子，直至剂量达到提供所需生物学效应。可以通过常规技术和测定法来容易的监测本发明疗法的进展。

例如，血管发生抑制剂(例如抗VEGF抗体，诸如AVASTIN

(Genentech))的制备和剂量给药方案可以依照制造商的说明书使用，或者由熟练从业人员凭经验确定。在另一个例子中，此类化疗剂的制备和剂量给药方案可以依照制造商的说明书使用，或者由熟练从业人员凭经验确定。化疗的准备和剂量给药方案还记载于Chemotherapy Service Ed.，M.C.Perry，Williams & Wilkins，Baltimore，MD(1992)。

治疗功效

本发明治疗的功效可以通过评估赘生性或非赘生性病症中常用的多种终点来测量。例如，癌症治疗可以通过例如但不限于肿瘤消退、肿瘤重量或大小收缩、距进展的时间、存活持续时间、无进展存活、整体响应率、响应持续时间、生活质量、蛋白质表达和/或活性来评估。因为本文所述抗血管发生剂靶向肿瘤血管结构而不必是赘生性细胞本身，所以它们代表了一类独特的抗癌药，并因此可以要求独特的对药物的临床应答的测量和定义。例如，二维分析中大于50％的肿瘤收缩是宣告响应的标准截留。然而，本发明的抑制剂可以引起对转移性扩散的抑制而没有原发瘤的收缩，或者可以仅仅发挥抑制肿瘤效果。因而，可采用测定治疗功效的方法，包括例如测量血管发生的血浆或尿液标志物和通过放射学成像测量响应。

制品

在本发明的另一个实施方案中，提供了包含可用于治疗或诊断上文所述病症的物质的制品。所述制品包括容器、标签和包装插页。合适的容器包括例如药瓶、药管、注射器等。所述容器可以用多种材料制成，诸如玻璃或塑料。在一个实施方案中，所述容器装有有效治疗所述疾患的组合物，可以具有无菌存取口(例如所述容器可以是带有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或药瓶)。所述组合物中的至少一种活性药剂是VEGF调控剂，且至少一种第二活性剂是髓样细胞减少剂和/或化疗剂。容器上或与容器有关的标签指明该组合物用于治疗所选择的疾患。所述制品可进一步包括第二容器，其中装有药学可接受的缓冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。在另一个实施方案中，所述容器装有作为检测抗性肿瘤的诊断剂的标志物集合。所述组合物中的至少一种药剂是用于检测Gr1、嗜中性细胞弹性蛋白酶、CD19、CD90、CD11c、URCGP、URRTP、DRCGP和/或DRRTP的标志物。容器上或与容器有关的标签指明该组合物用于诊断对VEGF拮抗剂治疗有抗性的肿瘤。本发明的制品可进一步包括从商业和用户立场出发需要的其它物质，包括别的活性剂、其它缓冲液、稀释剂、滤器、针头和注射器。

实施例

应当理解，在此描述的实施例和实施方案仅用于例示目的，根据这些将为本领域技术人员提供各种修改或变化，它们包括在本申请的精神和范围、以及所附权利要求的范围内。

实施例1：通过CD11b+Gr1+髓样细胞赋予的针对抗VEGF治疗的肿瘤抗性

调查了导致实验性肿瘤针对抗血管内皮生长因子(VEGF)治疗的抗性的细胞和分子事件。发现了在骨髓衍生细胞的募集和针对抗VEGF治疗的肿瘤抗性的发生之间的相关性。肿瘤混合实验证明了从携带抗VEGF抗性(但不是抗VEGF敏感性)肿瘤的小鼠的骨髓或肿瘤分离的CD11b+Gr1+细胞足以赋予针对抗VEGF治疗的抗性。在体外，来自抗VEGF抗性(但不是抗VEGF敏感性肿瘤)的条件化培养基刺激了CD11b+Gr1+细胞的迁移。CD11b+Gr1+细胞向原发性肿瘤的募集代表了介导针对抗VEGF治疗的抗性的细胞机制。肿瘤致敏的CD11b+Gr1+细胞的基因表达分析鉴定了由抗性肿瘤调节的独特基因集合。CD11b+Gr1+髓样细胞的动员和活化可能代表了针对抗VEGF治疗的抗性的发生中的两个步骤。抗VEGF和靶向髓样细胞的化合物的组合治疗进一步抑制了肿瘤血管法生和生长，并延迟了抗VEGF抗性的发作，证明组合靶向髓样细胞和VEGF的化合物有治疗效益。

方法

细胞系。EL4、LLC、B16F1和TIB6(J558)肿瘤细胞系得自美国典型培养物保藏所(ATCC)，并在补充有10％胎儿牛血清(FBS)和2mM谷氨酰胺的高葡萄糖Dulbecco氏改良的培养基(DMEM)中在组织培养中维持。术语“B16F1”和“B16”在此可互换使用，指相同的黑素瘤细胞系。

抗体。抗VEGF(诸如G6-23)是结合并中和鼠型和人型VEGF的抗体。衍生自噬菌体展示技术，IgG部分包含鼠同种型IgG2a(参见例如Malik，A.K.etal.Redundant roles of VEGF-B and PlGF during selective VEGF-A blockade in mice.Blood 107：550-7(2006))，除非另有说明，以10mg/kg的剂量每周两次IP给药。同种型匹配的对照抗体是抗人类豚草-IgG2a(Genentech，Inc.)。抗CD11b+抗体(eBioSciences)、抗L-选择素(BD Biosciences)和抗CXCR4(Torrey Pines Lab)被用于FACS实验中。抗Gr1MAb(eBioSciences，CA或BD BioSciences，CA)以10mg/kg每周两次IP施用。弹性蛋白酶抑制剂(1mg/小鼠；eBiosciences，San Diego，CA)在植入5×10⁶个EL4或LLC细胞之后一天开始向C57Bl/6小鼠(n＝5)每天IP施用。两次/周进行肿瘤测量，测量末期肿瘤重量，如上所述。

C57BL/6 GFP嵌合小鼠模型。年龄6-8周的C57BL/6和增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转基因小鼠(C57BL/6-TgN；ACTbEGFP；1Osb；JAX stock#_003291)分别得自Charles River Laboratories和Jackson Laboratories。EGFP由β-肌动蛋白启动子控制，其在EGFP转基因小鼠中的所有细胞中是丰富的(参见例如Okabe，M.，Ikawa，M.，Kominami，K.，Nakanishi，T.& Nishimune，Y.′Green mice′as a source of ubiquitous green cells.FEBS Lett 407：313-9(1997))。通过致死照射(11Gy，Cs-辐射体)C57BL/6小鼠以消融内源骨髓、接着用分离自EGFP转基因小鼠的5×10⁶个BMMNC拯救，来产生C57BL/6 GFP嵌合小鼠。如早先所述制备BMMNC(参见Gerber，H.P et al.VEGF regulates haematopoietic stem cell survival by an internal autocrine loop mechanism.Nature 417：954-8.(2002))。嵌合小鼠中的所有肿瘤异种移植物实验在造血重建之后至少4周进行。对于肿瘤生长实验，将5×10⁶个鼠EL4或LLC肿瘤细胞皮下注射在背部区域。对于在XID小鼠中的实验，植入1×10⁷个LLC或EL4肿瘤细胞。

B16F1混合实验。在米色裸XID(Harlan Sprague Dawley)或C57BL/6小鼠(Jackson Lab，Bar Harbor)或者GFP骨髓嵌合小鼠中进行肿瘤生长研究。将5×10⁶个或10⁷个肿瘤细胞(如标明的)重悬浮于200μl MatriGel(生长因子减低的；BD BioSciences，CA)，并皮下注射在小鼠的背部侧翼区域。对于骨髓混合实验，将10⁶个分离自骨髓的BMMNC或CD11b+Gr1+与2.5×10⁶个B16F1细胞在200μl matrigel(BD BioSciences)中混合，并立即植入C57BL/6小鼠的侧部。对于肿瘤GFP+/CD11b+Gr1+混合实验，将2×10⁶个B16F1细胞与3×10⁵个GFP+细胞混合并如所述地植入。抗VEGF(G6-23)或对照(抗豚草)抗体治疗在肿瘤细胞接种以后4天启动。在肿瘤达到可触知的大小之后每周2-3次使用游标卡尺评估肿瘤大小。使用公式Pi/6×L×W×W确定肿瘤体积，其中L是最长的直径，W是在垂直于L的位置的直径。

化学疗法。给C57B1/6小鼠植入TIB6、B16F1、EL4和LLC细胞系。在植入后的前4天小鼠不接受任何治疗以容许肿瘤细胞的建立。包括5-氟尿嘧啶(5FU，American Pharmaceutical Partner，IL；50mg/kg每周一次)和吉西他滨(Eli Lilly Co，IN，120mg/kg每周两次)的化疗剂IP施用。每周两次测量肿瘤体积，如所描述的计算。

免疫组织化学(IHC)。对于免疫荧光分析，收获肿瘤，在最佳切割温度(OCT)介质中冷冻用于低温切片。总共6μm肿瘤低温切片在室温干燥1小时，并在-20℃在丙酮中固定10分钟。在室温风干4分钟之后，通过将它们在室温在20％正常山羊血清(NGS，GIBCO #16210-064；在磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)中配制)中温育1小时来封闭非特异性结合位点。切片用在DAKO封闭液(DakoCytomation，CA)中稀释的以下抗体连续染色，家兔抗GFPAlexaFluor 488偶联物(Molecular Probes)保持在20μg/ml稀释度在室温1小时，山羊抗家兔AlexaFluor 488偶联物(Molecular Probes)保持1:500稀释度在室温1小时，大鼠抗小鼠PECAM-1(克隆MEC13.3；BD Pharmingen)在1:100稀释度在4℃保持过夜，以及山羊抗大鼠AlexaFluor 594偶联物(Molecular Probes)保持在1:500稀释度在室温1小时。洗涤载玻片并在DAKO荧光制片介质中制片，在装备有Plan-Neofluar 20x物镜的Nikon显微镜上收集免疫荧光图像，并数字合并。

血管表面积(VSA)测量。从CD31染色切片使用20×物镜的数字图象测定肿瘤血管表面积。一般地，通过使用ImageJ软件，使用设置在50-70的预定阈值作为截留，选择与染色的血管对应的像素。消除污染的(非血管的)离群像素。除非另有说明，每个组分析总共3-5个肿瘤。从每个肿瘤切片采集总共15个图像，每个图像覆盖1502μm²的面积。除非另有说明，每个组的背景染色通过使用带标记物的对照抗体来确定，并从总血管计数中减去。相对于总图象面积和总分析面积的聚集血管像素面积报告为％血管/表面积。在一个实施方案中，血管表面积可以使用非侵入性定量方法来定量，包括但不限于磁共振成像、动态对比强化的磁共振成像、计算断层照相术(CT)和电子发射断层照相术(PET)。参见例如O’Connor et al.，British Journal of Cancer96：189-195(2007)。在某些实施方案中，钆造影药剂及其衍生物和复合物可以用于磁共振成像。

流式细胞术。分离对照和抗VEGF治疗的小鼠的肿瘤，通过切碎肿瘤组织、接着用细胞匀浆器(VWR)处理来产生单细胞悬浮液。BMMNC从植入动物的股骨和胫骨冲洗下，使用ACK裂解缓冲液(Cambrex，MA)进行RBC裂解。通过眼窝后采血收集外周血，取40μl外周血用ACK缓冲液预处理用于红细胞裂解。

来自BM、肿瘤或外周血的细胞用一系列单克隆抗体染色，包括CD11b、Gr1、CD19、CD90、VEGFR2、CXCR4、L-选择素2(全部来自BD BioSciences，CA)、VEGFR1(R & D，CA)、Tie2(eBioSciences，CA)以及合适的同种型对照，来研究每个隔室中的髓样和淋巴样级分。FACS数据在FACS calibur上获得，通过Cell Quest Pro软件(BD Biosciences)来分析。

为了分离GFP+细胞和/或CD11b+Gr1+，从植入小鼠的骨髓或肿瘤提供单细胞悬浮液。细胞用偶联有APC的抗CD11b和偶联有PE的抗Gr1来染色。GFP、GFP-、CD11b+Gr1+和CD11b-Gr1-细胞的群体在FACS Vantage机器中分离，分选后分析确保每个隔室中感兴趣群体的纯度。

微阵列。使用qiagen Rneasy试剂盒(Qiagen)自骨髓衍生CD11b+Gr1+细胞分离RNA。互补RNA(cRNA)的制备和阵列的杂交/扫描的方法由Affymetrix(Affymetrix，Inc.)提供。将5μg总RNA使用cDNA合成试剂盒(SuperScript Choice，GIBCO/BRL)和T7-(dT)₂₄寡聚物引物(BiosearchTechnologies，Inc.，Custom Synthesis)转变成双链cDNA。双链cDNA在亲和树脂(样品清洁模块试剂盒，Affymetrix，Inc.)上并通过乙醇沉淀来纯化。在第二链合成之后，使用T7 RNA聚合酶和生物素标记的核苷酸在体外转录反应(Enzo Biochem，Inc.)中从cDNA样品产生带标记物的cRNA。带标记物的cRNA在亲和树脂(样品清洁模块试剂盒，Affymetrix)上纯化。带标记物的cRNA的量通过测量260nm吸光度，并使用260nm处的1 OD对应于40μg/ml RNA的换算关系来测定。取20μg cRNA通过在40mM tris-乙酸盐(pH8.1)、100mM乙酸钾和30mM乙酸镁中在94℃温育30分钟来片段化。然后将样品在设置在60rpm的电热轮转烘箱中在45℃与小鼠基因组4302.0阵列杂交19小时。将阵列在Affymetrix Fluidics工作站和扫描器中洗涤，染色，扫描。使用Affymetrix GeneChip分析软件或Spotfire软件(Sportfire，MA)来进行数据分析。选择信号强度比参考RNA高至少1.5倍的基因用于进一步的分析。然后，选择与相应的B16F1组相比在EL4和LLC样品中显著(p≤0.05)差异(在CD11b分析中超过1.5倍以及在肿瘤分析中超过2倍)表达的基因用于最终的分析。对所有肿瘤和CD11b数据使用Spotfire(Spotfire)软件中的算法进行分级基因聚类分析。

细胞迁移测定法。如关于FACS分析所述分离肿瘤细胞，以1×10⁶个细胞/ml在DMEM、10％ FCS和4mM谷氨酰胺培养基中平铺，在CO₂组织培养温箱中温育4天。使用Amicon离心柱(Millipore)将培养基按与原始体积的比例来浓缩。取600μl一式三份样品用于穿孔(transwell)细胞迁移平板(Corning)。将分离自C57BL/6小鼠的2.5×10⁴个新鲜分离的BMMNC重悬浮在DMEM中，并置于穿孔平板的上室，随后在37℃温育9小时，通过对下室内的细胞计数来测量BMMNC的迁移能力。

统计。使用ANOVA来确定显著差异。认为≤0.05的p值是显著的。

结果

针对抗VEGF治疗的抗性不是由次最佳给药引起的，并且是不依赖于淋巴细胞的

为了建立允许评估抗VEGF治疗的肿瘤中骨髓衍生细胞(BMC)的身份和相对丰度的实验模型，将绿色荧光蛋白标记的(GFP+)骨髓单个核细胞(BMMNC)过继性地转移给经过致死照射的C57BL/6小鼠(参见例如Okabe，M.et al.，′Green mice′as a source of ubiquitous green cells.FEBS Lett407：313-9(1997))。将C57BL/6同基因肿瘤细胞系植入GFP+骨髓嵌合小鼠中，评估VEGF中和性抗体(G6-23)(参见例如Malik，A.K.et al.，Redundant roles of VEGF-B and PlGF during selective VEGF-A blockade in mice.Blood(2005))对肿瘤生长和血管发生的影响。这些细胞系包括黑素瘤细胞系(B16F1)、两种T细胞淋巴瘤细胞系(EL4和TIB6)、和Lewis肺癌(LLC)细胞系。术语“B16F1”和“B16”在本文中可互换使用，指相同的黑素瘤细胞系。B16F1肿瘤的生长被抗VEGF(G6-23)阻断了(附图1a)。在独立的实验中，TIB6肿瘤的生长也被抗VEGF显著地阻断了。然而，EL4和LLC肿瘤仅短暂地被抑制，而且在起初的生长延迟之后，肿瘤开始快速扩展(附图1a)。类似地，植入免疫受损的米色裸X连锁的免疫缺陷(XID)小鼠中的EL4(附图1b)和LLC肿瘤(附图1c)的G6-23治疗在所有测试的剂量引起了仅仅短暂的肿瘤生长延滞。这些发现表明，针对抗VEGF治疗的抗性以不依赖T和B淋巴细胞的方式发生。在这个模型中，EL4和LLC肿瘤的抗性不是由次最佳剂量的抗VEGF抗体引起的(附图1b和1c)。

在抗VEGF敏感性和抗性肿瘤的血管结构中缺乏骨髓衍生的内皮细胞祖代(BM-EPC)

EL4和LLC肿瘤分离物的荧光活化的细胞分选(FACS)分析揭示了与抗VEGF敏感性肿瘤相比，在抗VEGF和对照二者治疗的小鼠中GFP+骨髓细胞在抗性肿瘤中的频率提高了(p≤0.05)，表明针对抗VEGF治疗的抗性与BMMNC的募集有关(附图1d)。为了阐明浸润性BMMNC是否直接促进肿瘤血管结构，使用血小板内皮细胞粘附分子(CD31，PECAM)/GFP双重染色来定量肿瘤切片中的微血管表面积和GFP+/CD31+(PECAM)EPC的数目。在治疗的第14天，不论肿瘤类型，在抗VEGF或对照治疗的肿瘤中绝大多数的CD31+血管结构缺乏GFP+表达(附图1e)。这些发现表明，BM-EPC向肿瘤血管结构的募集不直接促进抗VEGF抗性或敏感性肿瘤中的肿瘤血管结构的形成。抗VEGF治疗的EL4和LLC肿瘤显示了与对照治疗的肿瘤相比血管表面积方面2-3倍降低(附图1f)，与肿瘤重量方面类似的降低相关。与抗VEGF抗性的EL4和LLC肿瘤中相比，在抗VEGF敏感性B16F1肿瘤中在抗VEGF治疗之后CD31+血管的降低更大。此外，血管表面积(VS)的分析显示了与抗性肿瘤相比，在敏感性肿瘤中抗VEGF治疗之后在CD31⁺血管方面显著的(p≤0.05)降低(附图1f)。

BMMNC的募集和致敏对于抗VEGF抗性是重要的

用抗VEGF敏感性B16F1肿瘤进行肿瘤混合实验来评估GFP+BMMNC在针对抗VEGF治疗的抗性的发生中的功能关联性(relevance)。对于实验设计和细胞纯度，参见附图6a和b以及附图7。为了进行骨髓和肿瘤嵌合实验，从植入有抗性和敏感性肿瘤的小鼠的肿瘤或骨髓分离GFP+细胞。分选后分析确保了在每个隔室中GFP+细胞的纯度。B16F1与抗性肿瘤致敏的BMMNC混合显示了显著的(p≤0.05)生长刺激效应(附图2a，b)。与之相反，当与B16F1肿瘤或对照matrigel植入物致敏的BMMNC混合时，B16F1肿瘤的生长速率没有显著改变(附图2a，b)。与来自植入有matrigel或对照的小鼠的BMMNC相比，从携带EL4和LLC肿瘤的小鼠的胫骨分离的BMMNC在与B16F1肿瘤混合后显著提高了肿瘤生长速率(附图2a)。与对照抗体治疗的组(附图2a)相比，肿瘤生长速率方面的差异在抗VEGF治疗的组(附图2b)中是更显著的。与之相反，当与用B16F1肿瘤或对照matrigel致敏的BMMNC混合时，不论治疗，B16F1肿瘤中的生长速率没有显著提高(附图2a，b)。类似地，当与抗VEGF敏感性B16F1肿瘤混合时，在生长14天之后分离自EL4和LLC肿瘤的GFP+细胞足以介导针对抗VEGF治疗的抗性(附图2c，d)。当单独地植入时，GFP+BMMNC或CD11b+Gr1+细胞不产生肿瘤，证明了不存在污染性肿瘤细胞。BMMNC和抗VEGF敏感性肿瘤在物理上的接近本身不足以诱导抗性，而且用抗VEGF抗性肿瘤使骨髓细胞致敏是介导肿瘤抗性所需的。组合起来，这些数据表明，BMMNC向肿瘤的募集和通过抗性肿瘤的致敏二者是引起针对抗VEGF治疗的抗性发生的事件级联中的两个步骤。

由抗性肿瘤致敏的CD11b+Gr1+细胞是介导抗VEGF抗性的主要骨髓群体

BMMNC包含异质性群体，其包括原始的、髓样的和淋巴样的谱系的细胞。Morrison，S.J.et al.，Annu Rev Cell Dev Biol，11：35-71(1995)。

附图3a-d中显示的数据表明，代表髓样群体的CD11b+Gr1+细胞是抗VEGF抗性的发生中主要的BMMNC子集。参见例如Onai，N.et al.，Blood，96：2074-2080(2000)。开发了体外细胞迁移测定法来测试暴露于获自抗性或敏感性肿瘤的可溶性提取物的BMMNC。将肿瘤在用抗VEGF或对照抗体治疗的小鼠中培养14天。体外迁移测定法表明了BM CD11b+Gr1+细胞朝向抗性肿瘤而不是敏感性肿瘤的可溶性提取物的迁移能力更大(p≤0.05)(附图3a)。因此，髓样化学吸引因子存在于对照或抗VEGF治疗的肿瘤的可溶性提取物中，而且当抗VEGF(10μg/ml)被添加到培养基中时，保持不受影响。这些发现表明，髓样细胞募集是肿瘤固有的，不依赖于VEGF，而且不是由治疗诱导的。这些发现与来自肿瘤生长实验的数据(附图1d)一致，其中抗VEGF治疗不能有效地阻断BMMNC向抗性肿瘤的归巢，进一步支持了如下观念，即髓样细胞募集是肿瘤固有的而不是治疗诱导的。

考虑到CD11b+Gr1+细胞迁移方面响应于来自抗VEGF抗性肿瘤的条件化培养基而表现出的提高(附图3a)，使用FACS分析来研究向小鼠中生长的EL4和LLC肿瘤募集的造血的、淋巴样的和髓样的谱系。当对于CD11b+子集门选时，与B16F1肿瘤相比，EL4和LLC肿瘤显示了CD11b+Gr1+细胞的富集(附图3b)。在抗VEGF治疗的肿瘤中，差异是最显著的。在B16F1肿瘤中，CD11b+Gr1+细胞群体在抗VEGF治疗中显著降低，而它们在EL4或LLC肿瘤中保持了不受影响(附图3b)。在另一个实验中，使用FACS仪器和针对CD11b与Gr1的单克隆抗体来分析携带TIB6、B16F1、EL4和LLC肿瘤的小鼠中的髓样隔室。EL4和LLC肿瘤分离物中浸润性BMMNC的流式细胞术分析显示了与TIB6和B16F1肿瘤相比CD11b+Gr1+细胞的显著的(p≤0.05)富集。这些结果与抗VEGF敏感性肿瘤中BMMNC水平降低一致(附图1d)，而且提供了在CD11b+Gr1+细胞向肿瘤的募集和药物抗性的发生之间相关性的进一步支持。与来自肿瘤中分离的CD11b+Gr1+的数据相反，在携瘤小鼠的骨髓CD11b+子集中发现了较不显著的改变(附图3c)。这些数据表明，在携带抗性肿瘤的小鼠中的骨髓和肿瘤之间有独特的串话(cross-talk)，因为它们募集更多的CD11b+Gr1+而且还指示骨髓产生更多的髓样细胞。

抗性和敏感性肿瘤中CD11b+Gr1+细胞的进一步分析揭示了，已知牵涉髓样细胞的归巢和穿内皮迁移的分子(例如分别是CXCR4和L-选择素)有更高的表达。携瘤小鼠的BMMNC中CD11b+CD31+(EPC)和CD11b+CXCR4+细胞(嗜中性细胞)、CD19(B细胞)、CD90(T细胞)、CD11c(树突细胞)和VEGFR-2的相对数目在治疗组和肿瘤类型之间是相似的，除了有些肿瘤中的CD19之外(附图14)。

在CD11b和Gr1之外，调查了携瘤小鼠中其它造血谱系(诸如B和T淋巴样、CD11c、以及VEGFR1和VEGFR2)的表达(附图15)。抗性肿瘤中B淋巴样细胞和树突细胞的频率方面的显著降低(p≤0.05)是值得注意的(附图15a)。此外，数据表明了，在携带抗性肿瘤的小鼠的BM中与携带相应敏感性肿瘤的小鼠的BM相比B和T淋巴细胞以及树突细胞的频率方面有显著差异(附图15b)。这些观察结果表明，抗性肿瘤中髓样细胞频率的提高与其它造血谱系的降低有关。在BM和肿瘤之外，调查了携瘤小鼠的脾脏，因为早先的研究表明脾脏的CD11b+Gr1+细胞促进肿瘤扩展。参见例如Kusmartsev，S.& Gabrilovich，D.I.，Cancer Immunol Immunother，51：293-298(2002)；Bronte，V.et al.，Blood，96：3838-3846(2000)。作为对BM和肿瘤数据的支持，发现了与植入有敏感性肿瘤的小鼠相比，在植入有抗性肿瘤的小鼠中CD11b+Gr1+在脾脏中的频率有提高(p≤0.05)且脾脏大小有扩大(p≤0.05)(附图16a和b)。结合在一起，这些观察结果表明了CD11b+Gr1+细胞作为介导针对抗VEGF治疗的抗性中的主要细胞群体之一的功能性作用。

为了调查髓样细胞在抗VEGF抗性中的功能关联性，从用EL4和LLC肿瘤致敏的小鼠的骨髓分离CD11b+Gr1+和CD11b-Gr1-亚群(附图17)，并将它们与B16F1肿瘤细胞混合。

如附图3d所示，CD11b+Gr1+细胞足以介导针对抗VEGF治疗的抗性。然而，消减了CD11b+Gr1+细胞的BMMNC和肿瘤衍生GFP+细胞未能介导抗性。来自用抗VEGF抗性肿瘤致敏的小鼠的骨髓的CD11b+Gr1+细胞可以介导针对抗VEGF治疗的抗性。因而，附图3d表明，由抗性肿瘤而不是敏感性肿瘤致敏的CD11b+Gr1+细胞介导了针对抗VEGF治疗的抗性。然而，与CD11b-Gr1-群体相比，B16F1与从B16F1或matrigel致敏的小鼠分离的CD11b+Gr1+细胞的混合物不能促进针对抗VEGF治疗的抗性(附图17a)。这进一步证明了如下假说，即与敏感性肿瘤相比，抗性肿瘤具有与髓样隔室的独特串话。为了调查CD11b+Gr1+细胞对肿瘤血管结构的影响，分析了B16F1与CD11b+Gr1+和CD11b-Gr1-细胞的混合物中的血管表面积(VSA)(附图17b)。这些发现表明，CD11b+Gr1+混合物中的VSA显著(p≤0.05)大于单独的B16F1或与CD11b-Gr1-细胞的混合物，表明当混合敏感性细胞系和CD11b+Gr1+细胞时，血管结构的发育是针对抗VEGF的抗性的主要原因之一。当测试自抗性肿瘤分离的肿瘤相关CD11b+Gr1+细胞赋予敏感性肿瘤以抗性的能力时，获得了相似的结果(附图3e，f)。因而，当在细胞获取功能(cellular-gain-of-function)方法中测试时，BM相关的和肿瘤相关的CD11b+Gr1+细胞都足以赋予针对抗VEGF的抗性。

抗VEGF抗性肿瘤在骨髓CD11b+Gr1+细胞中诱导了特定的基因集合

为了检测携瘤小鼠的骨髓中CD11b+Gr1+细胞的活化状态方面的潜在差异，使用DNA阵列进行了基因表达分析。抗VEGF抗性EL4或LLC肿瘤致敏的CD11b+Gr1+细胞的无监督聚类分析鉴定了差异调节基因的特征性集合，其不同于抗VEGF敏感性B16F1肿瘤致敏的细胞(附图4a)。基因本体分析揭示了抗VEGF抗性肿瘤对炎性细胞因子和巨噬细胞/髓样细胞分化标志物的的富集以及促血管发生和抗血管发生因子水平方面的改变。鉴定了由两种抗VEGF抗性肿瘤普遍上调的基因集合，其中数种已知牵涉血管发生调节、松弛素样因子(RLF)(参见例如Silvertown，J.D.，Summerlee，A.J.& Klonisch，T.Relaxin-like peptides in cancer.Int J Cancer 107：513-9(2003))、和磷脂乱序酶(scramblase)(Endo-Lip)(参见例如Favre，C.J.et al.Expression of genes involved in vascular development and angiogenesis in endothelial cells of adult lung.Am J Physiol Heart Circ Physiol 285：H1917-38(2003))。

与髓样细胞的分化和/或活化相关的另一类基因在CD11b+Gr1+细胞中被抗VEGF抗性肿瘤显著上调，包括TLR-1(参见例如Edfeldt，K.，Swedenborg，J.，Hansson，G.K.& Yan，Z.Q.Expression of toll-like receptors in human atherosclerotic lesions：a possible pathway for plaque activation.Circulation 105：1158-61(2002))、CD14(参见例如Scott，C.S.et al.Flow cytometric analysis of membrane CD11b，CD11c and CD14 expression in acute myeloid leukaemia：relationships with monocytic subtypes and the concept of relative antigen expression.Eur J Haematol 44：24-9(1990))、IL-13(参见例如Roy，B.et al.IL-13 signal transduction in human monocytes：phosphorylation of receptor components，association with Jaks，and phosphorylation/activation of Stats.J Leukoc Biol 72：580-9(2002))和IL-4(参见例如Palmer-Crocker，R.L.，Hughes，C.C.& Pober，J.S.IL-4 and IL-13 activate the JAK2 tyrosine kinase and Stat6 in cultured human vascular endothelial cells through a common pathway that does not involve thegamma c chain.J Clin Invest 98：604-9(1996))的受体(附图4)。反之，凝血栓蛋白-1(thrombospondin-1)，一种强力的血管发生抑制剂(参见例如Good，D.et al.A tumor suppressor-dependent inhibitor of angiogenesis is immunologically and functionally indistinguishable from a fragment of thrombospondin.Proc.Nat.Acad.Sci.USA 87：6624-6628(1990)；及Iruela-Arispe，M.L，Bornstein，P.& Sage，H.Thrombospondin exerts an antiangiogenic effect on cord formation by endothelial cells in vitro.Proc NatlAcad Sci USA 88：5026-30(1991))处在被两种抗VEGF抗性肿瘤显著下调的基因中。

在又一个微阵列中显示了，抗性肿瘤表现了不同的基因表达序型。对自植入有EL4(E1-3)、LLC(L1-3)、B16F1(B1-3)和TIB6(T1-3)肿瘤并用抗VEGF治疗的小鼠的骨髓分离的CD11b+Gr1+细胞进行了基因树分析。鉴定了下调的、不变的和上调的基因。鉴定了由抗VEGF抗性肿瘤诱导的改变的特征性集合，其不同于抗VEGF敏感性肿瘤所诱导的。对自携带TIB6、B16F1、EL4和LLC肿瘤并用抗VEGF治疗17天的小鼠的骨髓分离的CD11b+Gr1+细胞中差异表达的基因进行了阵列分析。鉴定了潜在牵涉血管发生或髓样细胞分化和迁移的调节、在抗性与敏感性肿瘤中的表达水平显著改变(p≤0.05，>1.5倍)的基因。已知牵涉血管发生的调节的上调基因包括白介素-11受体(IL-11R)、白介素-1受体II(IL-1RII)、干扰素跨膜1(IFN TM1)、肿瘤坏死因子受体超家族成员18(TNFRSF18)、无翅整合5A(Wingless integration 5A，WNT5A)、分泌载体膜1、热休克蛋白(HSP86)、表皮生长因子受体(EGFR)、Eph受体B2(EphRB2)、G蛋白偶联受体25(GPCR25)、肝瘤衍生的生长因子(HGF)、血管生成素样-6、肝配蛋白受体RA7(Eph-RA7)、脑信号蛋白V1b、神经营养蛋白5、密蛋白-18、金属蛋白酶-解联蛋白MDC15(MDC15)、细胞外基质(ECM)、以及具有凝血栓蛋白基序7B的解联蛋白和金属蛋白酶(ADAMTS7B)。下调的基因包括神经元细胞粘附分子(NCAM-140)、纤连蛋白III型、Wiskott-Aldrich综合症蛋白相互作用蛋白(WIP)、CD74、细胞间粘附分子2(ICAM-2)、Jaggedl、整联蛋白α-4(Itga4)、整联蛋白β-7(ITGB7)、转化生长因子-β II型受体(TGF-BII-R)、TGFb可诱导的早期蛋白(TGFbIEP)、针对decapentaplegic的母亲(MAD)和华丽线虫(C.elegans)蛋白SMA-4(Smad4)、骨形态发生蛋白受体1A(BMPR1A)、CD83、Dectin-1、CD48、E-选择素、白介素-15(IL-15)、细胞因子信号传导的抑制物4、细胞因子受体相关蛋白质4(Cytor4)和趋化因子(C-X3-C)受体1(CX3CR1)。

鉴定了由两种抗性肿瘤普遍上调的基因集合，其中数种已知牵涉血管发生的调节，包括松弛素样因子(RLF)(Ho，R.L.et al.Immunological responses critical to the therapeutic effects of adriamycin plus interleukin 2 in C57BL/6 mice bearing syngeneic EL4 lymphoma，Oncol Res，5：363-372(1993))、神经营养蛋白5(Lazarovici，P.et al.，Nerve growth factor(NGF)promotes angiogenesis in the quail chorioallantoic membrane，Endothelium，13：51-59(2006))、磷脂乱序酶(Endo-Lip)(Favre，C.J.et al.，Expression of genes involved in vascular development and angiogenesis in endothelial cells of adult lung，Am J Physiol Heart Circ Physiol，285：H1917-1938(2003))、血管生成素样-6、脑信号蛋白VIb、Eph RA7、Eph RB2和FGF13。此外，与髓样细胞的分化和/或活化相关的GM-CSF(Rapoport，A.P.et al.，Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)and granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF)：receptor biology，signal transduction，and neutrophil activation，Blood Rev，6：43-57(1992))也在自携带抗性肿瘤的小鼠分离的CD11b+Gr1+BM细胞中上调。已知牵涉树突细胞的活化/产生的数种基因在分离自抗性肿瘤的BM CD11b+Gr1+中完全下调。这包括CD83、CD48、Crea7和Dectin-1(参见例如Lechmann，M et al.，CD83 on dendritic cells： more than just a marker for maturation，Trends Immunol 23：273-275(2002))、IL-15(参见例如Feau，S.et al.，Dendritic cell-derived IL-2 production is regulated by IL-15 in humans and in mice，Blood 105：697-702(2005))和CX3CR1(参见例如Niess，J.H.et al.，CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance，Science 307：254-258(2005))。分子数据符合BMMNC的多谱系分析(附图15)，其中在携带抗性肿瘤的小鼠中的BM和肿瘤中CD11c+细胞的频率方面存在显著(p≤0.05)降低。此外，TGF-β超家族的数个成员(参见例如Derynck，R et al.，TGF-beta signaling in tumor suppression and cancer progression，Nat Gene t29：117-129(2001))(包括Smad4和BMPR1A)处于下调的基因之中，表明在携带抗性肿瘤的小鼠中TGF-β途径在调节CD11b+Gr1+细胞的活化/分化方面的作用。

此外，进行了来自LL2、EL4和B16F1肿瘤的基因表达分析，分析了在抗VEGF治疗的抗性(EL4+LL2)而不是敏感性(B16F1)肿瘤中特异性上调或下调的基因。在所有肿瘤类型之间总体基因表达样式是不同的。如附图4d所示，在抗VEGF抗性和敏感性肿瘤之间其表达改变的许多基因属于趋化因子和细胞因子的类别，表明炎性细胞在抗VEGF抗性肿瘤中的存在。此外，鉴定了多种促血管发生因子或抗血管发生因子。

类似地，在抗VEGF治疗的TIB6、B16F1、EL4和LLC肿瘤中的其它基因表达分析表明了在所有肿瘤类型之中基因表达的不同序型。上调的基因包括胰岛素样生长因子2、结合蛋白3(IGF2BP3)、热休克蛋白9A(HSP9A)、成纤维细胞生长因子18(FGF18)、结缔组织生长因子相关蛋白WISP-1(ELM1)、晶状体上皮衍生的生长因子a(Ledgfa)、清除受体A型、巨噬细胞C型凝集素、聚合的免疫球蛋白受体3前体(Pigr3)、巨噬细胞清除受体I型(巨噬细胞SRT-1)、G蛋白偶联受体、小的可诱导的细胞因子A7(ScyA7)、白介素-1受体2(IL-1R2)、白介素-1可诱导蛋白(IL-1可诱导蛋白)、白介素-1β(IL-1β)、LIX(LPS诱导的CXC趋化因子(Scyb5)基因|趋化因子(C-X-C基序)配体5)。下调的基因包括转化生长因子β(TGF-B)、Frizzled(FIZZ1)、Wolfram综合征1同系物(Wfs1)、跨膜蛋白14A(TP14A)、细胞外基质相关蛋白(EMAP)、硫酸酯酶2(SULF-2)、细胞外基质2、结缔组织生长因子(CTFG)、组织因子途径抑制物(TFPI)、抵抗素样分子αmRNA|株系C57BL/6XCP2蛋白(Xcp2)基因(XCP2)、受体活性修饰蛋白2(Ramp2)、RAR相关的孤儿受体α(ROR-α)、肝配蛋白B1、分泌的蛋白酸性和富含半胱氨酸样1(SPARC-样1)、脑信号蛋白A。在抗性与敏感性(TIB6+B16F1)肿瘤中差异表达的基因(超过2倍，p≤0.05)的分析鉴定了数种已知牵涉BMMNC向外周血动员的细胞因子，包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)(参见例如Rapoport，A.P etal.，Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)and granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF)：receptor biology，signal transduction，and neutrophil activation，Blood Rev 6：43-57(1992))和单核细胞化学吸引蛋白(MCP-1)(参见例如Leonard，E.J.et al.，Secretion of monocyte chemoattractant protein-1(MCP-1)by human mononuclear phagocytes，Adv ExpMed Biol 351：55-64(1993))。此外，牵涉炎症的因子诸如巨噬细胞炎性蛋白(MIP-2)(参见例如Cook，D.N.，The role of MIP-1 alpha in inflammation and hematopoiesis，J Leukoc Biol，59：61-66(1996))和IL-1R(参见例如Dinarello，C.A.，Blocking IL-1 in systemic inflammation，J Exp Med，201：1355-1359(2005)处在差异表达的基因之中。大多数上述细胞因子诸如G-CSF也已知牵涉造血祖细胞向髓样细胞的分化(参见例如McNiece，I.K.et al.，Recombinant human stem cell factor synergises with GM-CSF，G-CSF，IL-3 and epo to stimulate human progenitor cells of the myeloid and erythroid lineages，Exp Hematol，19：226-231(1991))和增殖(参见例如Lemoli，R.M.et al.，Proliferative response of human acute myeloid leukemia cells and normal marrow enriched progenitor cells to human recombinant growth factors IL-3， GM-CSF and G-CSF alone and in combination，Leukemia，5：386-391(1991))。因而，在致敏和促进造血细胞向外周部动员之外，携带抗性肿瘤的小鼠可能享有刺激髓样细胞分化的能力。

这些发现支持了来自CD11b+、Gr1+细胞中的基因表达研究的结论，表明通过抗VEGF抗性肿瘤对促血管发生活性或抗血管发生活性以及炎性细胞因子和趋化因子的差异调节可能潜在促进抗VEGF抗性肿瘤的抗性。

组合抗VEGF和干扰髓样细胞功能的药剂抑制肿瘤血管发生和生长

在EL4(附图5a-b)和LL2肿瘤(附图5c-d)的环境中单独地或与抗VEGF组合地测试了降低外周循环中Gr1+髓样细胞的数目的抗Gr1抗体。当单独施用时，抗Gr1治疗在降低外周的和肿瘤的Gr1+细胞的数目方面是有效的，然而，它不显著地影响EL4肿瘤的肿瘤生长和血管形成(附图5a-b)。然而，当抗Gr1抗体与G6-23组合时，我们观察到与抗VEGF-A治疗单独诱导的效果相比，组合治疗组中存在EL4(附图5b)或LL2(附图5d)肿瘤朝向延长的肿瘤生长延迟和肿瘤抗性发作的倾向。LL2肿瘤的组织学分析揭示了通过FACS和血管表面积(VSA)测得的朝向Gr1+髓样细胞降低的倾向，其与组合治疗组中肿瘤生长速率降低(附图5c和d)相关。

基因表达分析揭示了抗VEGF抗性肿瘤细胞系对肿瘤和CD11b、Gr1+骨髓细胞中嗜中性细胞弹性蛋白酶表达的显著增加(附图4b)。嗜中性细胞产生的弹性蛋白酶据记载促进肿瘤细胞增殖、运动性，并且刺激多种肿瘤类型的生长。参见例如Sun，Z.& Yang，P.Role of imbalance between neutrophil elastase and alpha 1-antitrypsin in cancer development and progression.LancetOncol5：182-90(2004)。此外，提出了嗜中性细胞弹性蛋白酶在调节嗜中性细胞动员和血管发生中的作用。参见例如Shamamian，P.et al.Activation of progelatinase A(MMP-2)by neutrophil elastase，cathepsin G，and proteinase-3： a role for inflammatory cells in tumor invasion and angiogenesis.J Cell Physiol189：197-206(2001)。将抗VEGF治疗与弹性蛋白酶抑制剂组合。组合治疗引起了LLC和EL4肿瘤的肿瘤体积和末期肿瘤重量的显著降低(附图5e和f)。类似于抗Gr1抗体治疗(附图5a-d)，弹性蛋白酶抑制剂诱导了几乎完全消融的循环髓样细胞，然而，在肿瘤之内发现了与对照治疗相比时2到3倍的降低。根据这一点，我们猜测缺乏CD11b或Gr1表达的某些髓样祖细胞可能不受治疗的影响。或者，祖细胞可以潜在地浸润肿瘤和原位分化成髓样细胞。在抗VEGF治疗的肿瘤内诱导更深刻的髓样细胞消融的策略可以进一步提高组合治疗的治疗效果。组合起来，这些发现表明，抗VEGF与靶向髓样细胞功能的化合物的组合改善了治疗效力，并提供了第一证据，髓样细胞的促血管发生功能可能促进针对抗VEGF治疗的抗性的发生。此外，这些发现支持了如下观点，即数种途径可能牵涉髓样细胞向抗VEGF抗性肿瘤的募集和活化。

抗性肿瘤中CD11b+Gr1+的表型特征

根据抗性肿瘤中CD11b+Gr1+细胞的独特功能特征，调查了它们的细胞特性。检查了已知牵涉造血细胞的动员(CXCR4)(参见例如Orimo，A.et al.，Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion，Cell，121：335-348(2005)))和穿内皮迁移(L-选择素)(参见例如Simon，S.I.et al.，L-selectin(CD62L)cross-linking signals neutrophil adhesive functions via the Mac-1(CD11b/CD18)beta 2-integrin，J Immunol，155：1502-1514(1995)))的分子的表达。此外，通过F480的表达认识到的TAM已经被描述为具有提高肿瘤生长的潜力的髓样细胞子集(参见例如Luo，Y.et al.，Targeting tumor-associated macrophages as a novel strategy against breast cancer，J ClinInvest，116：2132-2141(2006))。使用氯膦酸盐的TAM消减在携带抗性肿瘤的小鼠中改善了抗VEGF治疗的效力。并且，Tie2阳性TAM被发现定位在肿瘤血管之内以及介导血管发生(参见例如De Palma，M.et al.，Tie2 identifies a hematopoietic lineage of proangiogenic monocytes required for tumor vessel formation and a mesenchymal population of pericyte pro genitors，Cancer Cell，8：211-226(2005))。因而，调查了CXCR4、L-选择素、F4/80和Tie-2在抗VEGF治疗的抗性和敏感性肿瘤中的髓样级分中的表达。

给C57BL/6小鼠(n＝5)植入TIB6、B16F1、EL4和LLC肿瘤，并用抗VEGF或对照抗体治疗，如所述的。在17天后收获来自每只小鼠的肿瘤分离物，用针对CD11b、Gr1、CXCR4、F480、L-选择素和Tie2的抗体染色。当比较携带抗性肿瘤和相应敏感性肿瘤的小鼠中肿瘤相关的CD11b+Gr1+时，观察到CXCR4、F480、L-选择素和Tie2子集的表达有显著差异(p≤0.05)。自携瘤的小鼠分离BMMNC，用如上所述相同的标志物染色。与肿瘤分析一致，在抗性和相应敏感性肿瘤群体中，CXCR4、F480、L-选择素和Tie2子集在GFP+CD11b+Gr1+细胞中的频率有显著差异(p≤0.05)。

流式细胞术分析揭示了，抗性肿瘤中肿瘤相关的CD11b+Gr1+对于CXCR4、F480、L-选择素和Tie2的表达是高度富集的(p≤0.05)。当分析自带携瘤小鼠分离的BM CD11b+Gr1+细胞时，获得了类似的图片。这些观察结果表明，抗性肿瘤中的CD11b+Gr1+在动员、穿内皮迁移和归巢至肿瘤方面是更有力的。

控制针对抗VEGF和化疗剂的抗性的不同机制

对针对抗VEGF的抗性的细胞机制的了解提出了如下问题，即髓样细胞是否也介导针对其它抗癌化合物的抗性。因而，我们调查了肿瘤针对两种常用化疗剂(包括5-氟尿嘧啶(5FU)和吉西他滨)的抗性(参见例如Pasetto，L.M.et al.，Old and new drugs in systemic therapy of pancreatic cancer，Crit RevOncol Hematol，49：135-151(2004))。抗VEGF抗性和敏感性肿瘤显示了对化疗的不同响应。如附图18a和b所示，两种抗VEGF抗性肿瘤(即EL4和LLC)显示了对5FU的完全响应和对吉西他滨的部分抗性，后者在稍晚的时间点且比针对抗VEGF治疗的抗性轻微得多。在抗VEGF敏感性细胞系中，发现TIB6肿瘤对两种化合物完全敏感，与对抗VEGF治疗的响应相比没有显著差异(附图18c)。然而，与抗VEGF治疗相比，B16F1肿瘤显示了针对5FU和吉西他滨两者的抗性(附图18d)。因此，数据清楚地表明了，针对抗VEGF的抗性的序型不对应于抗性和敏感性肿瘤中的化疗，表明抗血管发生方法与化疗剂中抗性的发生牵涉不同的机制。BM细胞的分析显示了在所有5FU治疗的小鼠中CD11b+Gr1+细胞的完全耗尽，在吉西他滨治疗的动物中达到较低的程度(附图6e)。然而，在用吉西他滨或5FU治疗的B16F1肿瘤中CD11b+Gr1+细胞的缺乏最小化了髓样细胞在针对化疗的抗性的发生中的牵涉(附图6f)。

CD11b+Gr1+细胞向原发肿瘤的募集代表了在小鼠的实验肿瘤子集之内调节针对抗VEGF治疗的抗性的细胞机制。基因表达序型分析允许鉴定与抗VEGF敏感性肿瘤相比，在携带抗VEGF抗性肿瘤的小鼠的骨髓中的CD11b+Gr1+细胞中差异调节的基因集合。在它们之中，发现了在肿瘤致敏期间变得上调的数种促血管发生因子或抗血管发生因子和髓样细胞活化的标志物。髓样细胞向肿瘤的募集牵涉药物抗性的发生，并且代表了事件级联中最早的步骤之一。靶向肿瘤衍生的因子、调节髓样细胞的募集和/或活化的化合物可以与抗血管发生化合物组合。当与全身性髓样细胞消融策略相比时，肿瘤衍生的化学吸引物对髓样细胞的选择性阻断可能是有益的，例如避免延长部分先天免疫系统全身性抑制的潜在并发症(参见例如Lewis，C.E.&Pollard，J.W.Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments.Cancer Research 66：605-612(2006))。肿瘤浸润性髓样细胞分泌的促血管发生因子的拮抗剂可以用于与抗VEGF化合物的组合治疗。调节髓样细胞的特定功能的靶向因子可以间接地影响肿瘤血管发生并降低肿瘤对抗VEGF治疗的抗性。参见附图5。

抗VEGF单克隆抗体贝伐单抗的临床评估显示了在多种人类癌症(包括肾癌和卵巢癌)中的显著单药剂活性(参见例如Ferrara，N.，Hillan，K.J.，Gerber，H.P.& Novotny，W.Discovery and development of bevacizumab，an anti-VEGF antibody for treating cancer.Nat Rev Drug Discov 3：391-400(2004)；及Jain，R.K.，Duda，D.G.，Clark，J.W.& Loeffler，J.S.Lessons from phase III clinical trials on anti-VEGF therapy for cancer.Nat Clin Pract Oncol 3：24-40(2006))。在贝伐单抗在大多数人类肿瘤类型的广泛临床开发期间，变得清楚的是，在许多肿瘤中，与化疗剂组合时获得了强烈的治疗效果。正在检验在与细胞毒性化合物的组合治疗中引起提高的治疗效益的基础分子和细胞事件的本质。已经提出的是，作为血管正常化的结果而提高的肿瘤药物摄取(综述见Jain et al.于Jain，R.K.Normalizing tumor vasculature with anti-angiogenic therapy：a new paradigm for combination therapy.Nat Med7：987-9(2001))和/或在肿瘤血管结构的细胞毒性破坏之后干扰内皮细胞再生(综述见Ferrara et al.于Ferrara，N.，Hillan，K.J.，Gerber，H.P.& Novotny，W.Discovery and development of bevacizumab，an anti-VEGF antibody for treating cancer.Nat Rev Drug Discov 3：391-400(2004))可以说明提高的治疗效益(综述见Ferrara & Kerbel于Ferrara，N.& Kerbel，R.S.，Angiogenesis as a therapeutic target.Nature 438：967-74(2005))。不限于单一的理论，髓样细胞在引起针对抗VEGF治疗的抗性的机制方面的作用的鉴定提供了对如下观点的进一步支持，即与大多数细胞毒性化合物相关的骨髓抑制效果可能促进提高的肿瘤生长抑制。观察到的是，在用化疗治疗的患者中的原发肺肿瘤内髓样细胞数目的降低与存活有关(参见例如Di Maio，M.et al.Chemotherapy-induced neutropenia and treatment efficacy in advanced non-small-cell lung cancer：a pooled analysis of three randomised trials.LancetOncol 6：669-77(2005))。

CD11b+Gr1+细胞的DNA阵列分析鉴定出基因表达方面的改变，其在抗VEGF抗性和敏感性肿瘤之间是不同的，证明了在小鼠的侧部生长的肿瘤和在骨髓中的细胞子集之间有显著的串话(附图4a)。

实施例2：来自针对抗VEGF治疗有抗性的肿瘤模型的别的因子

鉴定了来自肿瘤的、可能向肿瘤直接或间接地帮助或提供抗性的其它因子。将针对抗VEGF治疗有抗性的小鼠淋巴瘤肿瘤溶胞物(例如EL4和L1210)用抗VEGF抗体(G6-31)以5mg/kg/周、两次/周处理2周。在处理之后，将肿瘤合并，并在含有蛋白酶抑制剂的6ml RIPA缓冲液2X(Roche)中均化。将均化物在eppendorf离心机中在14,000rpm离心2×15分钟。将上清液在20mMTris、pH7.5、50mM NaCl中1:1稀释，施加至1ml HiTrap HS。将柱用起始缓冲液(20mMTris、pH7.5，50mM NaCl)洗涤，然后用约5倍柱体积的分步提高的NaCl浓度(0.25M NaCl、0.5M NaCl、1M NaCl，和3M NaCl)洗脱。收集每个步骤的峰级分。参见附图8。

在来自EL4和L1210的高盐级分中发现了多种因子，其促进趋化活性(例如通过单核细胞迁移测定法)或增殖测定法(例如HUVEC增殖测定法)。例如，bFGF发现于在高盐级分中，在HUVEC增殖测定法中显示了促进HUVEC细胞增殖，但是在单核细胞迁移测定法中显示了没有趋化活性。在高盐级分中发现的其它因子被发现具有朝向单核细胞的趋化活性。

在针对抗VEGF治疗有抗性的肿瘤(EL4)中使用减少/消减巨噬细胞的药剂与抗VEGF治疗(G6-23)的组合，发现了该组合延迟肿瘤生长。将小鼠中的EL4肿瘤在尾静脉中用以下各项治疗：1)PBS脂质体/豚草；2)PBS脂质体/G6-31；3)氯膦酸盐脂质体/G6-23；4)氯膦酸盐脂质体/G6-31；或5)氯膦酸盐脂质体/PBS治疗。附图9显示了在最后一次给药之后72小时EL4肿瘤体积(通过卡尺测量)的改变。在用氯膦酸盐脂质体、巨噬细胞消减剂和抗VEGF(G6-23)治疗的小鼠中存在着肿瘤体积的降低。在来自氯膦酸盐-脂质体/抗VEGF治疗的动物的血液中也检测到了巨噬细胞的降低。参见附图9的底部。根据定量实时PCR(Taqman)的测量，当与抗VEGF(G6-23)组合施用给小鼠时，氯膦酸盐脂质体也降低了VEGF表达。参见附图10。根据ELISA(RD Systems)的测量，在如上所述用氯膦酸盐脂质体和抗VEGF(G6-23)治疗的小鼠中，KC(CXCL1)蛋白表达也降低了。参见附图11。KC(CXCL1)是通过它在鼠单核细胞和巨噬细胞中的过量表达而鉴定出的蛋白质。它的合成被TNFα诱导。KC牵涉嗜中性细胞趋化性/活化和翻滚中的(rolling)单核细胞在内皮表面的捕获(arrest)。血管内皮细胞中KC的合成由凝血酶诱导。KC受体和IL-8B型受体是同系物。所述受体能够结合KC和MP-2(巨噬细胞炎性蛋白-2)二者。KC由对抗VEGF治疗敏感的肿瘤细胞系和对抗VEGF治疗有抗性的肿瘤细胞系二者分泌。

在来自抗性肿瘤细胞系的高盐级分中发现了其它促炎性细胞因子，例如MIP-1α、MCP-1、IL-1α、IL-1β、IL-7、IL-9、IL-10和IL-13。MCP-1是单核细胞化学吸引蛋白-1(CCL2或JE)，它由巨噬细胞、成纤维细胞和内皮细胞分泌。它由M-CSF、IL-1、IFNγ和TGFβ诱导。MIP-1α是巨噬细胞炎性蛋白-1a(CCL3)，它由巨噬细胞在响应局部炎症时分泌，它活化嗜中性细胞而产生超氧化物。它还由淋巴细胞和单核细胞分泌。在肝细胞癌发生的小鼠模型中，MIP-1α和MCP-1由新血管分泌，并且通过它们的关联受体以自分泌方式刺激增殖。参见例如Cancer Res.66(1)：198-211(2006)。MCP-1和MIP-1α二者都在对抗VEGF治疗有抗性的肿瘤细胞系中表达。参见附图12，画面A和B，其中Dil(+)是内皮细胞，CD3(+)代表淋巴样细胞，F4/8(+)代表巨噬细胞。Dil代表Dil-Ac-LDL(用高氯酸1，1′-二十八烷基-3，3，3′，3′-四甲基吲哚-羰花青(Dil)标记的乙酰化低密度脂蛋白)(Biomedical Technologies Inc)。任何内皮细胞具有摄取这种染料的能力。

MIP-1α和MCP-1还被发现在血管发生性出芽和毛细管管腔形成测定法中具有血管发生活性。参见附图13，画面A和画面B第10天。在该测定法中，将HUVEC细胞在之前一天在低传代数(passage number)解冻，之后将细胞包被在珠子上。将细胞在大约80％汇合时脱离，在37℃以400个细胞/珠子包被cytodex微珠(交联右旋糖苷基质)4小时。将珠子和游离的HUVEC细胞转移到烧瓶中并培养过夜。将珠子脱离，将它们与纤维蛋白原(牛血浆)(250μg/ml)混合。然后通过添加凝血酶将纤维蛋白原转变成不溶性纤维蛋白凝胶。约有100个珠子/12孔板。将珠子与40,000个D551成纤维细胞和VEGF(作为阳性对照)、D551或VEGF(作为阴性对照)、MCP-1和D551、或MIP-1α和D551一起培养。每天更换培养基。将培养物用生物素化的抗人类CD31和Cy3链霉亲合素染色过夜，广泛洗涤。在60小时、6天和10天采集图片。

单核细胞迁移测定法：步骤1：自人类PBMC分离单核细胞。将血液用PBS 1:1(v/v)稀释。将稀释的血液慢慢添加到Ficoll的顶部，在室温(RT)不间断地在3000rpm离心15分钟。除去血浆，收集白细胞(9-5ml中间相)。将细胞在含有具有0.5％ BSA(低内毒素)的PBS的迁移缓冲液中洗涤，在RT在1850rpm(9～800g)离心10分钟，计数细胞。步骤2：细胞的磁标记。将细胞团粒重悬浮在含有具有0.5％BSA(低内毒素)和2mM EDTA的PBS的MACS缓冲液中，30μl每107个细胞。添加FcR封闭剂和生物素-抗体混合物并混匀。然后将细胞在4℃温育10分钟，之后每10⁷个细胞再添加30μl MACS缓冲液，添加抗生物素微珠。混匀，在4℃温育10分钟。通过再添加10-20倍的标记体积，将细胞用MACS缓冲液洗涤，在300g(1250rpm)离心10分钟。将细胞以多至10⁸个细胞悬浮在2ml缓冲液中。步骤3：使用LS柱的磁分离。将LS柱(Miltenyi Biotec)置于磁场支架中。将柱用MACS缓冲液清洗。将细胞悬浮液施加到柱上。收集未标记的流出液，其代表富集的单核细胞级分。将柱用缓冲液洗涤3次，收集流出液，合并。然后将合并液在300g(1250rpm)离心5分钟。步骤4：用含有具有0.5％BSA(低内毒素)加上2mM L-谷氨酰胺和抗生素的RPMI的迁移培养基洗涤细胞。将10⁶个细胞添加到具有5微米孔径的24孔Transwell平板(Corning)中。向外室中添加各种生长因子、细胞因子/趋化因子或其它测试样品。在37℃温育2.5小时之后，小心除去滤器，将细胞彻底混匀并转移到10ml ZPAK溶液中来计数。

HUVEC增殖测定法：将低于8次传代的HUVEC用于该研究中。第1天：将3000个细胞/孔(96孔板)在具有1.5％FBS的测定培养基(DMEM：F1250:50)中平铺在1％明胶包被的平板上。第2天：更换培养基，将细胞用各种生长因子或条件化培养基处理。第3天：以0.5μCi/孔添加³H-胸苷。第4天：在早上添加250mM EDTA/孔来停止反应。将细胞收获到96孔滤板上，并用水洗涤3次。将³H样品用TOPCOUNT液体闪烁计数器来计数。

体内治疗来检查巨噬细胞消减和肿瘤表达：使用鼠淋巴细胞白血病细胞系EL4。治疗在裸鼠中植入EL4肿瘤细胞(5×10⁶，在matrigel中0.1ml体积)之后48小时开始。治疗如下：组1，8只小鼠，每周两次，PBS-脂质体200μlIV和豚草IgG 2 x 5mg/kg/周100μl ip.；组2，8只小鼠，每周两次，PBS-脂质体200μl IV和G6-31 2×5mg/kg/周100μl ip.；组3，8只小鼠，每周两次，氯膦酸盐-脂质体200μl IV.豚草IgG 2×5mg/kg/周100μl ip.；组4，8只小鼠，每周两次，氯膦酸盐-脂质体200μl IV.G6-31 2×5mg/kg/周100μl ip.；组5，8只小鼠，每周两次，氯膦酸盐-脂质体200μl IV.PBS每周两次100μl ip.。每个组的3只小鼠预先放出50μl全血用于FACS巨噬细胞群体评估。每个组的3只小鼠在每次PBS-脂质体或氯膦酸盐-脂质体注射之后1小时放血(眼)100μl全血用于FACS分析。继续研究直到充分的肿瘤生长(不超过5周)。如果肿瘤长度大于20mm，那么肿瘤生长被定义为充分的。每周测量肿瘤大小(1×w×h)。至少每周两次地观察动物。在实验的终点处死小鼠，肿瘤测量最后一次，然后提取、称重、然后固定。从所有动物中采集血液、脾脏和肝脏用于进一步的分析，例如FACS分析、RNA分析等。

血液、脾脏和肝脏中巨噬细胞群体的检测，作为巨噬细胞消减的指标：在氯膦酸盐脂质体的第一次i.v.注射之后92小时之后，施用CO₂来杀死小鼠(FV6转基因小鼠vs米色裸XID小鼠)(2只来自氯膦酸盐治疗的FV6，2只来自氯膦酸盐治疗的米色裸XID小鼠，1只未治疗的米色裸XID小鼠)，收集来自心室的150μl血液，并置入装有肝素的试管中，在RT保存。如下加工血液：1)采集150μl血液样品并添加1ml ACK红细胞裂解缓冲液(BiosourceP304-100)；2)在RT裂解5分钟；3)在RT在5000rpm离心2分钟；4)用FACS缓冲液(PBS+2％FCS)洗涤并再次离心；和5)在60μl FACS缓冲液中重悬浮，通过70μm筛过滤。如下加工脾脏：1)在FACS缓冲液中使用盖玻片(VWR微玻片48312-002，25×75mm)的磨砂表面制备单细胞悬浮液；2)在1200rpm离心5分钟；3)用5ml ACK(ACK缓冲液：0.15M NH₄Cl，10.0mMKHCO₃，0.1mM Na₂EDTA，pH7.2-7.4，通过0.22μm过滤除菌，保存在RT)悬浮团粒并在RT温育5分钟或更久，任选偶尔摇动；4)在温育之后，添加FACS培养基到15ml；5)再次离心并在0.5-1ml FACS缓冲液中重悬浮细胞(对于FV6小鼠用1ml，对于米色裸XID小鼠用0.5ml)；和6)过滤。如下加工肝脏：1)在FACS缓冲液中切碎肝脏(整块的1/8)成小块(在50ml锥形管中)并用45ml PBS洗涤小块；2)将小块在1200rpm离心5分钟并将小块小心移到磨砂表面来产生单细胞；3)用3ml FACS缓冲液洗涤并离心；和4)在0.5ml FACS缓冲液中重悬浮并过滤。将10μl血细胞稀释到90μl FACS缓冲液中用于总细胞计数。对于总细胞计数，采集脾脏样品并1:10稀释。来自血液、脾脏和肝脏的50μl样品放入V形底、具有盖子的96孔细胞培养簇(Costar 3894)中，以1μl/样品添加封闭用抗体(CD16/32)达15分钟。将细胞与F4/80-PE抗体(10μl/样品；Serotec，大鼠抗小鼠F4/80，MCA497PE，1101B)一起温育来检测巨噬细胞。用铝箔覆盖，将细胞与抗体在冰上温育20分钟，之后添加200μl FACS缓冲液，将细胞在4℃、1500rpm离心5分钟。除去缓冲液，使用200μl FACS缓冲液重悬浮细胞，再次离心。最后将细胞重悬浮到130μlFACS缓冲液中，转移到小试管(202032202-12)并在BD FACS仪器上读取。

自肿瘤样品制备单细胞悬浮液：解剖肿瘤来除去脂肪组织和皮肤，将它放入含有PSGF的EL4培养基中，置于冰上；通过添加15mL/肿瘤用相同的培养基洗涤肿瘤，在180rpm离心10分钟；除去上清液，再次洗涤组织；并且，将肿瘤切碎成小块(<1mm)，放入10cm组织培养皿中的2ml冷的EL4培养基中。通过添加8ml培养基并过滤通过40μm尼龙滤网，将来自EL4肿瘤的单细胞收集到50ml Falcon试管中；将含有胶原酶IV、DNA酶和弹性蛋白酶的50ml细胞解离缓冲液/肿瘤添加到细胞，使用2个10cm皮氏培养皿在37℃温育1.5小时。通过每15分钟将组织上下吸移来破坏组织。任选地，在半小时后可以添加12.5ml含有Liberase Blendyme I的细胞解离缓冲液，例如12.5ml中含200μl，以及在1小时后添加额外的胶原酶IV。将组织消化物连续地过滤通过不同大小的尼龙滤网(100、70和40μm)；将样品用EL4培养基洗涤两次，在4℃在2000rpm离心5分钟。对细胞进行计数并收集。在一个实验中，裂解细胞，分离总RNA(例如其可以通过Taqman来分析)。任选地，将细胞以多至1000000个细胞/100μl使用EL4培养基(1.4ml)来重悬浮；对于1000000个细胞，将细胞用2μg FcI/II封闭30分钟，在RT用F4/80、CD3抗体或CD31标记的抗体来标记1小时，以从样品分离巨噬细胞、EL4淋巴细胞和其它造血细胞和内皮细胞；将细胞用EL4培养基洗涤两次，以1000000个细胞/0.5ml重悬浮用于细胞分选。根据FSC/SSC和荧光强度来门选细胞。所分选的细胞也可以离心，放入适合的培养基，计数并测量细胞生存力。通过使用EL4培养基将细胞平铺在1％明胶包被的或Matrigel包被(30分钟)的4孔细胞培养载玻片室中并培养过夜，可以制备细胞用于形态学/免疫荧光研究。可以将细胞疏松和裂解(<500000个细胞)来分离RNA。任选地，可以从分选仪器中分离另一种类型的细胞(例如成纤维细胞、肌细胞等)，计数，并测量细胞生存力，以及进一步分析。任选地，可以裂解这些细胞和分离RNA。

氯膦酸盐脂质体的制备和施用：将75-95mg L-α-磷脂酰胆碱添加至装有10ml甲醇和10ml氯仿的500ml烧瓶(其早先已经用甲醇和氯仿漂洗过)。添加10-15mg胆固醇。将烧瓶在37℃水浴中旋转蒸发(Rotovapor)，即旋转(130-150rpm)和低真空(从200mbar逐渐降低到150mbar)直到液体消失和薄膜形成，～10分钟。将薄膜溶于10ml氯仿，再次旋转蒸发以除去氯仿，在烧瓶的内壁周围形成乳白色磷脂薄膜，～15分钟。在有些情况中，即使液体蒸发掉了也不形成薄膜。将磷脂薄膜分散在10ml PBS或2.0g氯膦酸盐/10mlPBS中，手动旋转和/或漩涡直到薄膜溶解，其中形成乳白色悬浮液。将乳白色悬浮液在N₂气体中在RT保持1.5-2小时。轻轻地摇动悬浮液，在水浴超声发生器中超声处理3分钟。将悬浮液在N₂气体中在RT保持2小时，或在4℃保持过夜，用于脂质体膨胀。通过10,000×g、15分钟、16℃(11,600rpm 70Ti转子)的脂质体离心，除去未封装的氯膦酸盐。脂质体在悬浮液的顶部形成白色带。使用移液器除去脂质体之下的氯膦酸盐溶液。将脂质体用无菌PBS洗涤2-3次，手动漩涡来破坏团粒。将脂质体离心25,000×g，30分钟，16℃(18,400rpm，使用70Ti转子)。将团粒重悬浮在4ml无菌PBS中，在N₂中保存，可长达4周。在施用给动物之前，轻轻地摇动脂质体，将200μl脂质体药剂通过尾静脉施用给每个动物，每周两次。

认为本说明书足以使得本领域技术人员实施本发明。根据以上说明，本发明在本文所显示的和描述的之外的各种修饰对于本领域技术人员而言是显而易见的，并且落入所附的权利要求的范围之内。将本文中引用的所有出版物、专利和专利申请收入本文作为参考以用于各种目的。

Claims (13)

1.一种使用组合治疗来治疗受试者中的抗性肿瘤的方法，所述方法包括：向具有抗性肿瘤的受试者施用有效量的VEGF拮抗剂以及有效量的第二药剂，其中所述第二药剂包含髓样细胞减少剂。

2.权利要求1的方法，其中所述髓样细胞减少剂包含Gr1拮抗剂、弹性蛋白酶抑制剂、MCP-1拮抗剂或MIP-1α拮抗剂。

3.权利要求2的方法，其中所述拮抗剂是抗体。

4.一种诊断受试者中的抗性肿瘤的方法，所述方法包括：

从所述受试者提供来自所述受试者的肿瘤的测试细胞群体；

测量所述测试细胞群体中CD11b+Gr1+细胞的数目或百分比；

与参考细胞群体中CD11b+Gr1+细胞的数目或百分比比较所述测试细胞群体中CD11b+Gr1+细胞的数目或百分比；并

检测与所述参考细胞群体相比所述测试细胞群体中CD11b+Gr1+细胞的数目或百分比的增加，其中CD11b+Gr1+细胞的数目或百分比增加表明所述肿瘤是抗性肿瘤。

5.权利要求4的方法，进一步包括测量所述受试者的脾脏大小，并与参考脾脏大小比较所述受试者的脾脏大小，其中脾脏大小增大表明所述肿瘤是抗性肿瘤。

6.权利要求4的方法，进一步包括在所述受试者已经施用VEGF拮抗剂之后测量所述受试者中肿瘤的血管表面积(VSA)的数目或百分比，并与参考血管表面积比较所述受试者中肿瘤的血管表面积的数目或百分比，其中肿瘤的血管表面积的数目或百分比增加表明所述肿瘤是抗性肿瘤。

7.权利要求6的方法，其中所述拮抗剂是抗体。

8.权利要求4的方法，进一步包括：

从所述受试者提供来自所述受试者的肿瘤的测试细胞群体；

测量所述测试细胞群体中CD19B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比；

与参考细胞群体中CD19B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比比较所述测试细胞群体中CD19B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比；并，

检测与所述参考细胞群体相比所述测试细胞群体中CD19B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比的降低，其中CD19B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比降低表明所述肿瘤是抗性肿瘤。

9.权利要求4的方法，进一步包括：

从所述受试者提供来自所述受试者的骨髓的测试细胞群体；

测量所述测试细胞群体中CD90T-淋巴样细胞、CD19B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比；

与参考细胞群体中CD90T-淋巴样细胞、CD19B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比比较所述测试细胞群体中CD90T-淋巴样细胞、CD19B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比；并，检测与所述参考细胞群体相比所述测试细胞群体中CD90T-淋巴样细胞、CD19B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比的降低，其中CD90T-淋巴样细胞、CD19B-淋巴样细胞或CD11c树突细胞的数目或百分比降低表明所述肿瘤是抗性肿瘤。

10.一种使用组合治疗来治疗受试者中的抗性肿瘤的方法，所述方法包括：向具有抗性肿瘤的受试者施用有效量的VEGF拮抗剂以及有效量的髓样细胞减少剂和有效量的第三药剂，其中所述第三药剂是化疗剂。

11.权利要求10的方法，其中所述拮抗剂是抗体。

12.权利要求10的方法，其中所述髓样细胞减少剂包含Gr1拮抗剂、弹性蛋白酶抑制剂、MCP-1拮抗剂或MIP-1α拮抗剂。

13.权利要求10的方法，其中所述化疗剂是5FU或吉西他滨。

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