JP2009531463A

JP2009531463A - 腫瘍の診断と治療

Info

Publication number: JP2009531463A
Application number: JP2009503253A
Authority: JP
Inventors: メーガンボールドウィン，; ナポレオンフェララ，; ハンス−ピーターガーバー，; ファーボッドショジャエイ，; キュイリンチョン，
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 2006-03-29
Filing date: 2007-03-28
Publication date: 2009-09-03
Also published as: IL193842A0; AU2007233237A1; CR10325A; AR060228A1; WO2007115045A2; RU2008142775A; MA30348B1; ZA200807590B; TW200806322A; BRPI0709425A2; MX2008012279A; EP1999151A2; NO20084546L; US20100239568A1; CL2007000876A1; US20070264193A1; CA2647430A1; WO2007115045A3; KR20080106946A; CN101448856A

Abstract

抗ＶＥＧＦ抗体を含む併用療法によって癌を治療するための方法が提供される。また、耐性腫瘍を診断する方法が提供される。

Description

（関連出願）
本出願は、２００６年３月２９日に出願の米国仮特許出願第６０／７８７７２０号の優先権を主張する。

（発明の分野）
本発明は、腫瘍増殖及び腫瘍タイプの分野に関する。本発明は、腫瘍のためのインヒビター及び診断マーカー、並びに癌及び腫瘍増殖の診断及び治療のためのこの使用に関する。

（発明の背景）
悪性腫瘍(癌)は、米国において心臓疾患に続き第２の主要な死亡原因である(例としてBoring等, CA Cancel J. Clin. 43:7(1993)を参照)。癌は、正常な組織から誘導されて腫瘍塊を形成する異常な又は腫瘍形成性の細胞の数の増加、これらの腫瘍形成性腫瘍細胞による隣接組織の浸潤、及び最終的に血液やリンパ系を介して局所のリンパ節や遠くの部位に転移と呼ばれる過程を介して広がる悪性細胞の生成を特徴とする。癌性状態においては、正常細胞が増殖しない条件下で細胞が増殖する。癌自体は、異なる浸潤及び攻撃性の程度で特徴付けられる広範な種々の形態で顕現する。
癌の治療のために様々なタイプの療法が用いられている。例えば、癌性ないしは死んだ組織を除去するために外科的な方法が用いられる。癌の治療として、固形腫瘍を縮小することによって作用する放射線療法、及び迅速に分裂細胞を殺す化学療法が使われる。加えて、抗血管新生剤は有効な抗癌方策である。また、これらの療法は改良されており、例えば、免疫療法など他の療法が開発されてもいる。

現在のところ、血管新生が様々な疾患の病理に関係していることが確立されている。これらには、固形腫瘍及び転移、アテローム性動脈硬化、水晶体後繊維増殖、血管腫、慢性炎症、増殖性網膜症のような眼内新生血管疾患、例えば糖尿病性網膜症、年齢関連性黄斑変性(ＡＭＤ)、新血管性緑内障、移植された角膜組織及び他の組織の免疫拒絶反応、関節リウマチ及び乾癬が含まれる。Folkman等, J. Biol. Chem., 267:10931-10934 (1992)；Klagsbrun等, Annu. Rev. Physiol. 53:217-239 (1991)；及びGarner A., "Vascular diseases", In: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds., 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710。
腫瘍増殖の場合、血管新生は過形成から異常増殖への移行に、そして腫瘍の増殖と転移のための栄養物の供給に重要であるようだ。Folkman等, Nature 339:58 (1989)。血管新生によって、腫瘍細胞は正常細胞と比較して増殖の促進及び増殖的な自律性を獲得し得る。通常腫瘍は、利用できる毛細血管床から離れているため、２、３立方ミリメーターの大きさまでにした増殖できない単一の異常細胞として生じ、長い間さらに増殖や播種が起こらない「休止状態」となりうる。そして、腫瘍細胞の中には、内皮細胞を活性化するために血管形成表現型へ切り変わるものがあり、それは増殖して、新規な毛細血管に成熟する。これらの新しく形成された血管は原発性腫瘍の連続する増殖を生じさせるだけでなく、転移性腫瘍細胞の播種や再コロニー形成化も生じさせる。したがって、腫瘍部の微小血管の密度と乳癌並びに様々な他の腫瘍の患者生存との間に相関関係が観察されている。Weidner等, N. Engl. J. Med 324:1-6 (1991)；Horak等, Lancet 340:1120-1124 (1992)；Macchiarini等, Lancet 340:145-146 (1992)。血管形成の転換を制御する正確なメカニズムは十分に明らかとなっていないが、腫瘍質量の血管新生が多くの血管新生刺激因子とインヒビターの正味のバランスにより生じると考えられる(Folkman, 1995, Nat Med 1(1): 27-31)。

病理症状における血管新生の重要な調節因子として血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)を理解すると、ＶＥＧＦ活性をブロックするための多くの試みがもたらされる。ＶＥＧＦは最も特徴的なものであって血管新生のポジティブ調節因子として最も有力なものの一つである。例としてFerrara, N. & Kerbel, R.S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature 438:967-74 (2005)を参照。血管新生及び脈管形成の血管新生因子であることに加えて、多形質発現の増殖因子としてのＶＥＧＦは、他の生理学的プロセス、例として、内皮細胞生存、脈管透過性及び血管拡張、単球走化性及びカルシウム流入に複数の生物学的影響を表す。Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18: 4-25。さらに、研究は、いくつかの非内皮性細胞種類、例えば網膜色素上皮細胞、膵管細胞及びシュワン細胞に対するＶＥＧＦの分裂促進効果を報告している。例としてGuerrin等 J. Cell Physiol. 164:385-394 (1995)；Oberg-Welsh等 Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132 (1997)；及び、Sondell等 J. Neurosci. 19:5731-5740 (1999)を参照。
ＶＥＧＦ活性をブロックする多くの試みがある。阻害性抗ＶＥＧＦレセプター抗体、可溶性レセプターコンストラクト、アンチセンス方策、ＶＥＧＦに対するＲＮＡアプタマー及び低分子量ＶＥＧＦレセプターチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)インヒビターはすべて、ＶＥＧＦシグナル伝達を干渉する際での使用が提案されている。例としてSiemeister等 Cancer Metastasis Rev. 17: 241-248 (1998)を参照。抗ＶＥＧＦ中和抗体は、ヌードマウスにおける多様なヒト腫瘍細胞株の増殖を抑制すること(Kim等 Nature 362:841-844 (1993)；Warren等 J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995)；Borgstrom等 Cancer Res. 56: 4032-4039 (1996)；及びMelnyk等 Cancer Res. 56: 921-924 (1996))、及び虚血性網膜疾患のモデルにおける眼内血管新生を阻害すること(Adamis等 Arch. Ophthalmol. 114:66-71 (1996))が示唆されている。実際、ヒト化抗ＶＥＧＦ抗体であるベバシズマブ(ＡＶＡＳＴＩＮ(登録商標)、Genentech, South San Francisco, CA)は、転移性結腸直腸癌の第一選択療法として、米国ＦＤＡの承認を得ている。例としてFerrara等, Nature Reviews Drug Discovery, 3:391-400 (2004)を参照。

しかしながら、腫瘍増殖を干渉する治療的化合物の長期能力は、薬剤耐性の発達によって制限されることが多い。様々な細胞障害性化合物に対する耐性のメカニズムのいくつかが、主に単細胞の腫瘍モデルにおいて同定されており、機能的に特徴付けられている。例としてLongley, D.B. & Johnston, P.G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol 205:275-92 (2005)を参照。さらに、薬剤耐性表現型に宿主間質性腫瘍細胞の相互作用が伴いうる。間質性細胞は様々なプロ血管新生因子を分泌し、腫瘍細胞と同じ遺伝的安定性と突然変異率の増加にはつながらない(Kerbel, R.S. Inhibition of tumor angiogenesis as a strategy to circumvent acquired resistance to anti-cancer therapeutic agents. Bioessays 13:31-6 (1991)。Ferrara & Kerbel and Hazlehurst等 in Ferrara, N. & Kerbel, R.S. Angiogenesis as a therapeutic target. Nature 438:967-74 (2005)；及び、Hazlehurst, L.A., Landowski, T.H. & Dalton, W.S. Role of the tumor microenvironment in mediating de novo resistance to drugs and physiological mediators of cell death. Oncogene 22:7396-402 (2003)によって概説される。

臨床前モデルにおいて、ヒト化モノクローナル抗体ベバシズマブ(AVASTIN(登録商標)、Genentech, South San Francisco, CA)又はベバシズマブのマウス前駆物質(Ａ４.６.１ (１９９１年３月２９日に寄託したＡ４.６.１を産生するハイブリドーマ細胞株、ＡＴＣＣＨＢ-１０７０９))によるＶＥＧＦシグナル伝達の遮断は、試験したほとんどの異種移植モデルにおいて有意に腫瘍増殖を阻害し、腫瘍血管新生を減少する(Gerber & Ferrara in Gerber, H.P. & Ferrara, N. Pharmacology and pharmacodynamics of bevacizumab as monotherapy or in combination with cytotoxic therapy in preclinical studies. Cancer Res 65:671-80 (2005)によって概説される)。治療が腫瘍増殖の初期段階に始まる場合、単一薬剤抗ＶＥＧＦ治療の薬理的な効果が最も顕著に現れた。腫瘍が定着するまで治療が遅れた場合、阻害作用は一般的に一過性であり、腫瘍は結局耐性となった。例としてKlement, G.等 Differences in therapeutic indexes of combination metronomic chemotherapy and an anti-VEGFR-2 antibody in multidrug-resistant human breast cancer xenografts. Clin Cancer Res 8:221-32 (2002)を参照。抗ＶＥＧＦ治療に対してこのような耐性がある細胞性及び分子的現象は複雑である。例としてCasanovas, O., Hicklin, D.J., Bergers, G. & Hanahan, D. Drug resistance by evasion of antiangiogenic targeting of VEGF signaling in late-stage pancreatic islet tumors. Cancer Cell 8:299-309 (2005)；及び、Kerbel, R.S.等 Possible mechanisms of acquired resistance to anti-angiogenic drugs: implications for the use of combination therapy approaches. Cancer Metastasis Rev 20:79-86 (2001)を参照。様々な因子が伴いうる。例えば、ＶＥＧＦを標的とした化合物と線維芽増殖因子(ＦＧＦ)シグナル伝達による併用療法により、膵臓の膵島発現の遺伝子モデルの後期腫瘍において効果が改善し、耐性の発症が遅れた。Casanovas, O., Hicklin, D.J., Bergers, G. & Hanahan, D. Drug resistance by evasion of antiangiogenic targeting of VEGF signaling in late-stage pancreatic islet tumors. Cancer Cell 8, 299-309 (2005)を参照。他の研究者等は、代替のプロ血管新生因子の強力な供与源として腫瘍浸潤性間質線維芽細胞を同定した。例としてDong, J.等 VEGF-null cells require PDGFR alpha signaling-mediated stromal fibroblast recruitment for tumorigenesis. Embo J 23:2800-10 (2004)；及び、Orimo, A.等 Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell 121:335-48 (2005)を参照。

炎症細胞は、炎症性サイトカインを分泌することによって血管新生に関与しうる。この炎症性サイトカインは内皮細胞活性化、増殖、移動及び生存に影響しうる(Albini等 and Balkwill等 in Albini, A., Tosetti, F., Benelli, R. & Noonan, D.M. Tumor inflammatory angiogenesis and its chemoprevention. Cancer Res 65:10637-41 (2005)；及び、Balkwill, F., Charles, K.A. & Mantovani, A. Smoldering and polarized inflammation in the initiation and promotion of malignant disease. Cancer Cell 7:211-7 (2005)において概説される。いくつかの腫瘍浸潤性炎症細胞は、プロ血管新生因子、例えば単球／マクロファージ(例としてDe Palma, M.等 Tie2 identifies a hematopoietic lineage of proangiogenic monocytes required for tumor vessel formation and a mesenchymal population of pericyte progenitors. Cancer Cell 8:211-26 (2005)；及び、Yang, L.等 Expansion of myeloid immune suppressor Gr+CD11b+ cells in tumor-bearing host directly promotes tumor angiogenesis. Cancer Cell 6:409-21 (2004)を参照)、Ｔ-及びＢ-リンパ球(例としてFreeman, M.R.等 Peripheral blood T lymphocytes and lymphocytes infiltrating human cancers express vascular endothelial growth factor: a potential role for T cells in angiogenesis. Cancer Res 55:4140-5 (1995)を参照)、血管性白血球(例としてConejo-Garcia, J.R.等 Vascular leukocytes contribute to tumor vascularization. Blood 105:679-81 (2005)を参照)、樹状細胞(例としてConejo-Garcia, J.R.等 Tumor-infiltrating dendritic cell precursors recruited by a beta-defensincontribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A. Nat Med 10:950-8 (2004)を参照)、好中球(例としてCoussens, L.M., Tinkle, C.L., Hanahan, D. & Werb, Z. MMP-9 supplied by bone marrow-derived cells contributes to skin carcinogenesis. Cell 103:481-90 (2000)を参照)、及びマスト細胞(Coussens, L.M.等 Inflammatory mast cells up-regulate angiogenesis during squamous epithelial carcinogenesis. Genes Dev 13:382-97 (1999)；及び(de Visser and Coussens in de Visser, K.E., Eichten, A. & Coussens, L.M. Paradoxical roles of the immune system during cancer development. Nat Rev Cancer 6:24-37 (2006)において概説される))を分泌する。骨髄由来内皮始原(プロジェニター)細胞(ＥＰＣ(例としてLyden, D.等 Impaired recruitment of bone-marrow-derived endothelial and hematopoietic precursor cells blocks tumor angiogenesis and growth. Nat Med 7, 1194-201 (2001)を参照)、及び血管周囲始原細胞(例としてSong, S., Ewald, A.J., Stallcup, W., Werb, Z. & Bergers, G. PDGFRbeta+ perivascular progenitor cells in tumours regulate pericyte differentiation and vascular survival. Nat Cell Biol 7:870-9 (2005)を参照)は、腫瘍増殖のいくつかの実験モデルにおいて血管形成に関与することが示唆された(Rafii等in Rafii, S., Lyden, D., Benezra, R., Hattori, K. & Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy? Nat Rev Cancer 2:826-35 (2002)において概説される)。骨髄系統造血性細胞、例えば腫瘍関連のマクロファージ(ＴＡＭ)は血管新生因子を分泌することによって直接的に又は失われた血管新生因子を順に放出する細胞外基質分解プロテアーゼを生産することによって間接的に血管新生を刺激することが示された(Lewis, C.E. & Pollard, J.W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Research 66:605-612 (2006)；及び、Naldini, A. & Carraro, F. Role of inflammatory mediators in angiogenesis. Curr Drug Targets Inflamm Allergy 4:3-8 (2005)において概説される)。骨髄細胞系統の中で、腫瘍を有するマウスの脾臓から単離したＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋始原細胞は腫瘍細胞とともに注入されると血管新生を促進し(例としてYang, L.等 Expansion of myeloid immune suppressor Gr+CD11b+ cells in tumor-bearing host directly promotes tumor angiogenesis. Cancer Cell 6:409-21 (2004)を参照)、腫瘍浸潤性マクロファージ数は幾人かのヒト腫瘍の予後不良と相関した(Balkwill等 in Balkwill, F., Charles, K.A. & Mantovani, A. Smoldering and polarized inflammation in the initiation and promotion of malignant disease. Cancer Cell 7:211-7 (2005)において概説される)。しかしながら、他の研究では、マクロファージはマウスにおいて実験的腫瘍の増殖を阻害した。これは抗癌療法、としての可能性を示唆するものであった。例としてKohchi, C.等 Utilization of macrophages in anticancer therapy: the macrophage network theory. Anticancer Res 24:3311-20 (2004)を参照。

骨髄性細胞の相対的な量とプロ血管新生因子を生産するその能力にもかかわらず、抗ＶＥＧＦ治療に対する腫瘍耐性における役割は不明である。骨髄性細胞、耐性腫瘍及びそれらが産生する因子の生物学的機能を発見して、理解する必要がある。本発明はこれら及び他の必要性を解決するためのものであり、以下の開示内容の概要により明確になるであろう。

（発明の概要）
本発明は、耐性腫瘍を診断及び治療するための方法及び組成物を提供する。さらに、併用療法による耐性腫瘍の方法が提供される。例えば、ある方法は、有効量のＶＥＧＦアンタゴニストと有効量の第二薬剤を組み合わせて、耐性腫瘍を有する被検体に投与することを含み、この第二薬剤が骨髄性細胞減少薬剤を含むものである。骨髄性細胞減少薬剤は、骨髄性細胞、例えばＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄性細胞を減少させるか又は完全に除去する。本発明のある実施態様では、骨髄性細胞減少薬剤には、限定するものではないが、例えば、Ｇｒ１アンタゴニスト、ＣＤ１１ｂアンタゴニスト、ＣＤ１８アンタゴニスト、エラスターゼインヒビター、ＭＣＰ-１アンタゴニスト、ＭＩＰ-１αアンタゴニスト、クロドロネートなどが含まれる。一実施態様では、アンタゴニストは抗体である。
また、本発明は、耐性腫瘍を診断するための方法及び耐性腫瘍を診断するためのマーカーセットを提供する。本発明のある実施態様では、ある方法は被検体の耐性腫瘍を診断することを包含し、この方法は、被検体の腫瘍又は被検体の血液から試験細胞群を準備し、試験細胞群におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数ないしは割合を測定し、試験細胞群におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数ないしは割合を参照細胞群(例えば、抗ＶＥＧＦ感受性腫瘍からの細胞群)におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数ないしは割合と比較し、そして、参照細胞群と比較して試験細胞群におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数ないしは割合の増加を検出し、このとき、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋の数ないし割合が増加している場合に腫瘍が耐性腫瘍であることを示すことを含む。

一実施態様では、前記方法はさらに、被検体の脾臓サイズを測定し、被検体の脾臓サイズを参照脾臓サイズ(例えば、腫瘍がない被検体ないしはＶＥＧＦアンタゴニスト治療に感受性がある被検体の脾臓サイズ、又はＶＥＧＦアンタゴニスト治療に感受性がある脾臓サイズのデータベース)と比較し、このとき、脾臓サイズが拡張している場合に腫瘍が耐性腫瘍であることを示すことを含む。さらに他の実施態様では、前記方法はさらに、被検体にＶＥＧＦアンタゴニストが投与された後に、被検体の腫瘍の血管表面積(ＶＳＡ)の数ないしは割合を測定し、被検体の腫瘍の血管表面積数の数ないしは割合を参照血管表面積(例えば、抗ＶＥＧＦ感受性腫瘍の血管表面積)と比較し、このとき、腫瘍の血管表面積の数ないし割合が増加している場合に腫瘍が耐性腫瘍であることを示すことを含む。一実施態様では、アンタゴニストは抗体である。
本発明の他の実施態様では、ある方法は被検体の耐性腫瘍を診断することを包含し、この方法は、被検体の腫瘍から試験細胞群を準備し、試験細胞群におけるＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合を測定し、試験細胞群におけるＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合を参照細胞群におけるＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合と比較し、そして、参照細胞群と比較して試験細胞群におけるＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合の減少を検出し、このとき、ＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合が減少している場合に腫瘍が耐性腫瘍であることを示すことを含む。

さらに他の実施態様では、ある方法は被検体の耐性腫瘍を診断することを包含し、この方法は、被検体の骨髄から試験細胞群を準備し、試験細胞群におけるＣＤ９０Ｔ-リンパ系細胞、ＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合を測定し、試験細胞群におけるＣＤ９０Ｔ-リンパ系細胞、ＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合を、参照細胞群におけるＣＤ９０Ｔ-リンパ系細胞、ＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合と比較し、そして、参照細胞群と比較して試験細胞群におけるＣＤ９０Ｔ-リンパ系細胞、ＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合の減少を検出し、このとき、ＣＤ９０Ｔ-リンパ系細胞、ＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合が減少した場合に腫瘍が耐性腫瘍であることを示すことを含む。
本発明の他の実施態様では、ある方法は併用療法による被検体の耐性腫瘍を治療することを包含し、この方法は、有効量のＶＥＧＦアンタゴニストを有効量の骨髄性細胞減少薬剤と有効量の第三薬剤と組み合わせて、耐性腫瘍を有する被検体に投与することを含み、この第三薬剤が化学療法剤である。一実施態様では、アンタゴニストは抗体である。本発明のある実施態様では、骨髄性細胞減少薬剤には、限定するものではないが、例えば、Ｇｒ１アンタゴニスト、ＣＤ１１ｂアンタゴニスト、ＣＤ１８アンタゴニスト、エラスターゼインヒビター、ＭＣＰ-１アンタゴニスト、ＭＩＰ-１αアンタゴニスト、クロドロネートなどが含まれる。さらに他の実施態様では、化学療法剤は、本明細書中に挙げる５ＦＵ、ゲムシタビン又は化学療法剤である。

本発明の一実施態様では、ある方法は、被検体の腫瘍から試験細胞群を準備し、試験細胞群における分子の発現、レベル又は活性を測定し、試験細胞群における分子の発現、レベル又は活性を、参照細胞群における分子の発現及び／又は活性と比較し、そして、参照細胞群(例えば、抗ＶＥＧＦ治療感受性腫瘍の細胞群)と比較して試験細胞群における分子の発現及び／又は活性の変化を検出し、このとき該分子がタンパク質をコードする核酸又は核酸によってコードされるタンパク質であり、これによって該被検体の耐性腫瘍を診断又は決定することを含む。ある実施態様では、変化した発現及び／又は活性を有するタンパク質は、限定するものではないが、例えば、ＩＬ-１３Ｒ、ＴＬＲ-１、Ｅｎｄｏ-Ｌｉｐ、ＦＧＦ１３、ＩＬ-４Ｒ、ＴＨＢＳ１、Ｃｒｅａ７、ＭＳＣＡ、ＭＩＰ２、ＩＬ-８Ｒ、Ｇ-ＣＳＦ、ＩＬ１０-Ｒ２、ＴＨＢＳＰ-４及びＪＡＭ-２が含まれる。発現及び／又は活性の変化は、１以上のタンパク質、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１２以上、１３以上、１４以上、又はすべてのタンパク質によるものでありうる。
本発明のある実施態様では、分子の発現は上方制御され、このタンパク質には、限定するものではないが、例えば、ＩＬ-１３Ｒ、ＴＬＲ-１、Ｅｎｄｏ-Ｌｉｐ、ＦＧＦ１３、ＩＬ-４Ｒ、ＭＳＣＡ、ＭＩＰ２、ＩＬ-８Ｒ及びＧ-ＣＳＦが含まれる。本発明のある実施態様では、分子の発現は下方制御され、このタンパク質には、限定するものではないが、例えば、ＴＨＢＳ１、Ｃｒｅａ７、ＩＬ１０-Ｒ２、ＴＨＢＳＰ-４及びＪＡＭ-２が含まれる。

上記したように、本発明のある実施態様では、ある方法は、被検体の腫瘍又は被検体の血液から試験細胞群を準備し、試験細胞群におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数ないしは割合を測定し、試験細胞群におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数ないしは割合を参照細胞群(例えば、抗ＶＥＧＦ感受性腫瘍の細胞群)におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数ないしは割合と比較し、そして、参照細胞群と比較して試験細胞群におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数ないしは割合の増加を検出し、このとき、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋の数ないし割合が増加している場合に腫瘍が耐性腫瘍であることを示すことを含む。一実施態様では、前記方法はさらに、参照細胞群と比較して試験細胞群において分子の発現又は活性の変化を検出することを含み、この分子があるタンパク質又は該タンパク質をコードする核酸であり、該タンパク質には限定するものではないが、例えば、ＩＬ-１３Ｒ、ＴＬＲ-１、Ｅｎｄｏ-Ｌｉｐ、ＦＧＦ１３、ＩＬ-４Ｒ、ＴＨＢＳ１及びＣｒｅａ７が含まれる。ある実施態様では、１以上、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上又はすべてのタンパク質の発現及び／又は活性に変化がある。
また、本発明は、耐性腫瘍を識別するためのマーカーセットを提供する。例えば、マーカーセットには、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１２以上、１３以上、１４以上、又は全部のセットの分子が含まれうる。前記分子は、タンパク質又は発現及び／又は活性が変化しているタンパク質をコードする核酸であり、ＩＬ-１３Ｒ、ＴＬＲ-１、Ｅｎｄｏ-Ｌｉｐ、ＦＧＦ１３、ＩＬ-４Ｒ、ＴＨＢＳ１、Ｃｒｅａ７、ＭＳＣＡ、ＭＩＰ２、ＩＬ-８Ｒ、Ｇ-ＣＳＦ、ＩＬ１０-Ｒ２、ＴＨＢＳＰ-４及びＪＡＭ-２から選択される。一実施態様では、前記分子は、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞から得られ、例えば、ＩＬ-１３Ｒ、ＴＬＲ-１、Ｅｎｄｏ-Ｌｉｐ、ＦＧＦ１３、ＩＬ-４Ｒ、ＴＨＢＳ１及びＣｒｅａ７を含む。他の実施態様では、前記分子は、耐性腫瘍から得られ、例えば、ＭＳＣＡ、ＭＩＰ２、ＩＬ-８Ｒ、Ｇ-ＣＳＦ、ＩＬ１０-Ｒ２、ＴＨＢＳＰ-４及びＪＡＭ-２を含む。

（詳細な説明）
定義
本発明を詳細に記載する前に、本発明は、特定の組成物又は生物学的システムに限定されるものではなく、もちろん変更されてもよいことを理解されたい。また、本明細書中で用いられる用語は具体的な実施態様を記載する目的のためだけであって、制限することを目的とするものではないと理解されたい。本明細書で用いられる及び添付の特許請求の範囲中の単数形「ａ」、「ａｎ」及び「ｔｈｅ」は、明らかな記載がない限り複数形も含まれる。例えば、したがって、「分子」を指す言葉は場合によって該分子の２以上の組合せなどを包含する。

本明細書中で用いる「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ-Ａ」なる用語は、Leung等 Science, 246:1306 (1989)、Houck等 Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)、及びRobinson & Stringer, Journal of Cell Science, 144(5): 853-865 (2001)によって記載されているように、１６５アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子と、関連した１２１-、１４５-、１８３-、１８９-、及び２０６-アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子、並びにそれらの天然に生じる対立遺伝子型及びプロセシング型を意味する。ＶＥＧＦ-Ａは、ＶＥＧＦ-Ｂ、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ、ＶＥＧＦ-Ｅ、ＶＥＧＦ-Ｆ及びＰｌＧＦを含む遺伝子ファミリの一部である。ＶＥＧＦ-Ａは、ＶＥＧＦＲ-１(Ｆｌｔ-１)及びＶＥＧＦＲ-２(Ｆｌｋ-１／ＫＤＲ)の２つの高親和性レセプターチロシンキナーゼに主に結合する。この後者はＶＥＧＦ-Ａの血管内皮細胞分裂促進シグナルの主な伝達物質である。また、「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ-Ａ」なる用語は、マウス、ラット又は霊長類などの非ヒト動物腫由来のＶＥＧＦも意味する。特定の種由来のＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦはｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦはｍＶＥＧＦなどの用語で表されることが多い。また、「ＶＥＧＦ」なる用語は、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸８〜１０９、又は１〜１０９を含むポリペプチドの切断型ないしはその断片を意味する。そのようなＶＥＧＦ型を指すときは、本明細書では、例えば、「ＶＥＧＦ(８−１０９)」、「ＶＥＧＦ(１−１０９)」又は「ＶＥＧＦ_１６５」と表す。「切断した(切断型の)」天然のＶＥＧＦのアミノ酸位置は、天然のＶＥＧＦ配列に示される数で示す。例えば、切断型の天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置１７(メチオニン)は、天然のＶＥＧＦ中の位置１７(メチオニン)でもある。切断型の天然ＶＥＧＦは天然のＶＥＧＦに匹敵するＫＤＲ及びＦｌｔ−１レセプター結合親和性を有する。

「ＶＥＧＦアンタゴニスト」は、一又は複数のＶＥＧＦレセプターへの結合を含む、ＶＥＧＦ活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減又は干渉することができる分子(ペプチジル又は非ペプチジル)を指す。ＶＥＧＦアンタゴニストには、抗ＶＥＧＦ抗体及びその抗原結合性断片、ＶＥＧＦに特異的に結合することによって一又は複数のレセプターへの結合を隔離するレセプター分子及び誘導体(例えば、可溶性ＶＥＧＦレセプタータンパク質、又はそのＶＥＧＦ結合断片、又はキメラＶＥＧＦレセプタータンパク質)、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼの小分子インヒビターなどの抗ＶＥＧＦレセプター抗体及びＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト、及び融合タンパク質、例として、ＶＥＧＦ-Ｔｒａｐ(Regeneron)、ＶＥＧＦ_１２１-ゲロニン(Peregine)が含まれる。また、ＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦのアンタゴニスト変異体、ＶＥＧＦに対するアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、及びＶＥＧＦないしはＶＥＧＦレセプターに対するリボザイムが含まれる。さらに、本発明の方法に有用なＶＥＧＦアンタゴニストには、ＶＥＧＦを特異的に結合するペプチジルないしは非ペプチジル化合物、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体ないしその抗原結合性断片、ポリペプチド、又はＶＥＧＦに特異的に結合するその断片；ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも断片に相補性があるアンチセンス核酸塩基のオリゴマー；ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも断片に相補性がある小ＲＮＡ；ＶＥＧＦを標的とするリボザイム；ＶＥＧＦに対するペプチボディ；及び、ＶＥＧＦアプタマーが含まれる。一実施態様では、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦの発現レベル又は生物学的活性を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上低減するか、又は阻害する。他の実施態様では、ＶＥＧＦアンタゴニストによって阻害されるＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ(８−１０９)、ＶＥＧＦ(１−１０９)又はＶＥＧＦ_１６５である。

「抗ＶＥＧＦ抗体」又は「ＶＥＧＦに結合する抗体」なる用語は、抗体がＶＥＧＦを標的とした診断上の薬剤及び／又は治療上の薬剤として有用であるために十分な親和性と特異性を有してＶＥＧＦに結合することができる抗体を指す。例えば、本発明の抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が関与する疾患及び症状を標的とし、干渉する際の治療上の薬剤として有用でありうる。例として米国特許第６５８２９５９号、同第６７０３０２０号；国際公開第９８／４５３３２号；国際公開第９６／３００４６号；国際公開第９４／１０２０２号、国際公開第２００５／０４４８５３号；;欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１；米国特許公開第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、同第２００５０１１２１２６号、同第２００５０１８６２０８号及び同第２００５０１１２１２６号；Popkov等, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)；及び国際公開第２００５０１２３５９号を参照のこと。選択した抗体は通常、ＶＥＧＦに対して十分に強い結合親和性を有する。例えば、抗体は１００ｎＭ−１ｐＭの間のＫｄ値でｈＶＥＧＦを結合しうる。抗体親和性は、例えば、表面プラスモン共鳴をベースとしたアッセイ(ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９に記載のあるＢＩＡｃｏｒｅアッセイなど)；酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)；及び、競合アッセイ(例えばＲＩＡのもの)によって決定されうる。例えば治療としての有効性を評価するために、抗体を他の生物学的な活性アッセイに用いてもよい。このようなアッセイは当分野で公知であり、標的抗原と抗体の使用目的に依存する。例として、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ；腫瘍細胞増殖阻害アッセイ(例えば国際公開第８９／０６６９２号に記載のもの)；抗体依存性細胞傷害(ＡＤＣＣ)及び補体媒介性細胞障害(ＣＤＣ)アッセイ(米国特許第５５００３６２号)；及び、アゴニスト活性又は造血アッセイ(国際公開第９５／２７０６２号を参照)などがある。抗ＶＥＧＦ抗体は通常、ＶＥＧＦ-Ｂ、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ又はＶＥＧＦ-Ｅなどの他のＶＥＧＦホモログにも、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦなどの他の増殖因子にも結合しないだろう。一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体には、ハイブリドーマＡＴＣＣＨＢ１０７０９によって産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４.６.１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体；Presta等 (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599に従って産生される組み換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であり、限定するものではないが「ベバシズマブ(ＢＶ)」とも「ｒｈｕＭＡｂＶＥＧＦ」又は「ＡＶＡＳＴＩＮ(登録商標)」としても知られる抗体が含まれる。ベバシズマブは、ヒトＶＥＧＦのそのレセプターへの結合をブロックするマウスの抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ.４.６.１から、変異したヒトのＩｇＧ１フレームワーク領域と抗原結合性相補性決定領域を含む。フレームワーク領域のほとんどを含め、ベバシズマブのアミノ酸配列のおよそ９３％は、ヒトのＩｇＧ１に由来し、配列のおよそ７％はマウスの抗体Ａ４.６.１に由来する。ベバシズマブは、およそ１４９０００のダルトンの分子量を有し、グリコシル化されている。ベバシズマブ及び他のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は、２００５年２月２６日に発行の米国特許第６８８４８７９号にさらに記載されている。ＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９に記載のあるように、更なる好適な抗体には、Ｇ６又はＢ２０系列抗体(例えば、Ｇ６-２３、Ｇ６-３１、Ｂ２０-４.１)が含まれる。さらに好適な抗体については、米国特許第７０６０２６９号、同第６５８２９５９号、同第６７０３０２０号；同第６０５４２９７号；国際公開第９８／４５３３２号；国際公開第９６／３００４６号；国際公開第９４／１０２０２号；欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１；米国特許公開第２００６００９３６０号、同第２００５０１８６２０８号、同第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、及び同第２００５０１１２１２６号；及び、Popkov等, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)を参照のこと。

本発明に係る「Ｇ６系列抗体」は、ＰＣＴ出願公開第２００５/０１２３５９号の図７、２４−２６及び３４−３５のいずれか一によるＧ６由来の抗体又はＧ６抗体の配列に由来する抗ＶＥＧＦ抗体である。
「造血幹／始原細胞」又は「原始的造血細胞」は、より関係しているか、又は成熟した血液細胞種を形成するように分化することができるものである。「リンパ系の血液細胞系統」は、リンパ球(Ｂ細胞又はＴ細胞)を形成するように分化することができるそれらの造血前駆細胞である。同様に「リンパ球新生」はリンパ球の形成である。「赤血球血液細胞系統」は、赤血球(erythrocytes、red blood cells)を形成するように分化することができるそれらの造血前駆細胞であり、「赤血球新生」は赤血球の形成である。
本明細書中の目的のために、「骨髄血液細胞系統」なる表現は、上記のリンパ系及び赤血球血液細胞系統以外の、すべての造血始原細胞を包含し、「骨髄造血」は血液細胞(リンパ球及び赤血球以外の)の形成を伴う。

骨髄細胞群は、Ｇｒ１＋／ＣＤ１１ｂ＋(又はＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋)又はＧｒ１＋／Ｍａｃ-１＋である骨髄免疫細胞が豊富でありうる。これらの細胞は、マクロファージ系統の骨髄性細胞用のマーカーであるＣＤ１１ｂと、顆粒球用のマーカーであるＧｒ１を発現する。Ｇｒ１＋／ＣＤ１１ｂ＋は、例えばＧｒ１＋に対する抗体による免疫吸着パニングによって選択されてもよい。
「骨髄性細胞減少薬剤」又は「骨髄性細胞減少剤」は、骨髄性細胞群を減少させるか又は除去する薬剤を指す。一般的に、骨髄性細胞減少剤は、骨髄性細胞、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋、単球、マクロファージなどを減少させるか又は除去する。骨髄性細胞減少薬剤の例には、限定するものではないが、Ｇｒ１＋アンタゴニスト、ＣＤ１１ｂアンタゴニスト、ＣＤ１８アンタゴニスト、エラスターゼインヒビター、ＭＣＰ-１アンタゴニスト、ＭＩＰ-１αアンタゴニストなどが含まれる。
本明細書中で用いられる「Ｇｒ１アンタゴニスト」なる用語は、Ｇｒ１に結合して、Ｇｒ１の生物学的な活性を阻害するか又は実質的に減少させる分子を指す。Ｇｒ１アンタゴニストの非限定的な例には、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、バイオ有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。本発明の一実施態様では、Ｇｒ１アンタゴニストは、抗体、特にヒトのＧｒ１を結合する抗Ｇｒ１抗体である。

本明細書中で用いられる「ＣＤ１１ｂアンタゴニスト」なる用語は、ＣＤ１１ｂに結合して、ＣＤ１１ｂの生物学的活性を阻害するか又は実質的に減少させる分子を指す。通常、アンタゴニストは、細胞表面にＣＤ１１ｂサブユニットを発現する細胞(例えば未成熟骨髄性細胞)が持つ内皮へ結合する能力を(部分的にないしは完全に)ブロックするであろう。ＣＤ１１ｂアンタゴニストの非限定的な例には、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、バイオ有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。本発明の一実施態様では、ＣＤ１１ｂアンタゴニストは、抗体、特にヒトのＣＤ１１ｂを結合する抗ＣＤ１１ｂ抗体である。例示的なＣＤ１１ｂ抗体には、ＭＹ９０４ (米国特許第４８４０７９３号)；１Ｂ６ｃ(Zhang等, Brain Research 698:79-85 (1995)を参照)；ＣＢＲＮ１／５及びＣＢＲＭ１／１９(国際公開第９４／０８６２０号)が含まれる。
本明細書中で用いられる「ＣＤ１８アンタゴニスト」なる用語は、ＣＤ１８(好ましくはヒトのＣＤ１８)に結合して、ＣＤ１８の生物学的活性を阻害するか又は実質的に減少させる分子を指す。通常、アンタゴニストは、細胞表面にＣＤ１８サブユニットを発現する細胞(例えば好中球)が持つ内皮へ結合する能力を(部分的にないしは完全に)ブロックするであろう。ＣＤ１８アンタゴニストの非限定的な例には、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、バイオ有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。本発明の一実施態様では、ＣＤ１８アンタゴニストは抗体である。
抗ＣＤ１８抗体の例には、ＭＨＭ２３ (Hildreth等, Eur. J. Immunol. 13:202-208 (1983))；Ｍ１８／２(ＩｇＧ２ａ；Sanches-Madrid等, J. Exp. Med.158: 586-602 (1983))；Ｈ５２(アメリカ培養細胞系統保存機関(ＡＴＣＣ)寄託ＨＢ１０１６０)；Ｍａｓ１９１ｃ及びｌＯＴ１８ (Vermot Desroches等, Scand. J. Immunol. 33:277-286 (1991))；及び、ＮＡ-８(国際公開第９４／１２２１４号)が含まれる。一実施態様では、抗体は、ＭＨＭ２３又はＨ５２が結合するＣＤ１８エピトープに結合するものである。本発明の一実施態様では、抗体はＣＤ１８ポリペプチドに対して高親和性を有する。ある実施態様では、抗体は、ＣＤ１１ｂと結合するＣＤ１８の細胞外ドメインの領域に結合してもよいし、抗体は、ａ及びＰ鎖を解離してもよい(例えば、抗体は、ＭＨＭ２３抗体の場合のようにＣＤ１１ｂとＣＤ１８との複合体を解離してもよい)。

単球走化性タンパク質(ＭＣＰ-１)は、自然免疫及びＴｈ２エフェクター応答及びＣＤ４＋Ｔ細胞分化に関与するケモカインである。例として、Paul, W. E., Fundamental Immunology, 5th Edition, Lippincott Williams & Wilkins, (Philadelphia, 2003) at pages 801-840を参照。
本明細書中で用いられる「ＭＣＰ-１アンタゴニスト」なる用語は、ＭＣＰ-1に結合して、ＭＣＰ-1の生物学的活性を阻害するか又は実質的に低減させる分子を指す。ＭＣＰ-1アンタゴニストの非限定的な例には、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、バイオ有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。本発明の一実施態様では、ＭＣＰ-１アンタゴニストは、抗体、特にヒトのＭＣＰ-１を結合する抗ＭＣＰ-１抗体である。

マクロファージ炎症性タンパク質α及びβ(ＭＩＰ-１α及びβ)は公知のケモカインである。ＭＩＰ-１αは、自然免疫及びＴｈ１エフェクター応答及びＣＤ４＋Ｔ細胞分化に関与する。例として、Paul, W. E., Fundamental Immunology, 5th Edition, Lippincott Williams & Wilkins, (Philadelphia, 2003) at pages 801-840を参照。
本明細書中で用いられる「ＭＩＰ-１αアンタゴニスト」なる用語は、ＭＩＰ-１αに結合して、ＭＩＰ-１αの生物学的活性を阻害するか又は実質的に低減させる分子を指す。ＭＩＰ-１αアンタゴニストの非限定的な例には、抗体、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、バイオ有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。本発明の一実施態様では、ＭＩＰ-１αアンタゴニストは、抗体、特にヒトのＭＩＰ-１αを結合する抗ＭＩＰ-１α抗体である。

本明細書中で用いられる「アンタゴニスト」なる用語は、リガンドの場合には一又は複数のレセプターへの結合、又はレセプターの場合には一又は複数のリガンドへの結合を含む、本発明のタンパク質の活性を中和、遮断(ブロック)、阻害、抑止、低減又は干渉することができる分子を指す。アンタゴニストには、抗体及びその抗原結合断片、タンパク質、ペプチド、糖タンパク質、糖ペプチド、糖脂質、多糖類、オリゴ糖類、核酸、バイオ有機分子、ペプチド模倣薬、製薬的薬剤及びその代謝物、転写及び翻訳制御配列などが含まれる。また、アンタゴニストには、本発明のタンパク質の小分子インヒビター、及び融合タンパク質、タンパク質に特異的に結合することによってその標的への結合を隔離するレセプター分子及び誘導体、タンパク質のアンタゴニスト変異体、本発明のタンパク質に対するアンチセンス分子、ＲＮＡアプタマー、及び本発明のタンパク質に対するリボザイムが含まれる。
「遮断(ブロック)」抗体又は「アンタゴニスト」抗体は、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低減させるものである。特定の遮断抗体ないしアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を実質的に又は完全に阻害する。

「ＵＲＣＧＰ」は、抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ＋１細胞において上方制御されるタンパク質を指す。ＵＲＣＧＰには、限定するものではないが、好中球エラスターゼ、ＣＤ１４、ｅｘｐｉ、Ｉｌ-１３Ｒ、ＬＤＬＲ、ＴＬＲ-１、ＲＬＦ、Ｅｎｄｏ-Ｌｉｐ、ＳＯＣＳ１３、ＦＧＦ１３、ＩＬ-４Ｒ、ＩＬ-１１Ｒ、ＩＬ-１ＲＩＩ、ＩＦＮＴＭ１、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＷＮＴ５Ａ、分泌キャリア膜１、ＨＳＰ８６、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＲＢ２、ＧＰＣＲ２５、ＨＧＦ、アンギオポエチン様-６、Ｅｐｈ-ＲＡ７、セマフォリンＶｌｂ、ニューロトロフィン５、クローディン-１８、ＭＤＣ１５、ＥＣＭ及びＡＤＡＭＴＳ７Ｂが含まれる。ある実施態様では、ＵＲＣＧＰは、ＩＬ-１３Ｒ、ＴＬＲ-１、Ｅｎｄｏ-Ｌｉｐ、ＦＧＦ１３及び／又はＩＬ-４Ｒを指す。
「ＤＲＣＧＰ」は、抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞において下方制御されるタンパク質を指す。ＤＲＣＧＰには、限定するものではないが、ＴＨＢＳ１、Ｃｒｅａ７、アクアポリン-１、溶質キャリアファミリタンパク質(ＳＣＦ３８)、アポリポタンパクＥ(ＡＰＯＥ)、脂肪酸結合タンパク質(ＦＡＢＰ)、ＮＣＡＭ-１４０、フィブロネクチンＩＩＩ型、ＷＩＰ、ＣＤ７４、ＩＣＡＭ-２、Ｊａｇｇｅｄ１、ｌｔｇａ４、ＩＴＧＢ７、ＴＧＦ-ＢＩＩ-Ｒ、ＴＧＦｂＩＥＰ、Ｓｍａｄ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＤ８３、Ｄｅｃｔｉｎ-１、ＣＤ４８、Ｅ-セレクチン、ＩＬ-１５、サイトカインシグナル伝達４のサプレッサー、Ｃｙｔｏｒ４及びＣＸ３ＣＲ１が含まれる。ある実施態様では、ＤＲＣＧＰはＴＨＢＳ１及び／又はＣｒｅａ７を指す。

「ＵＲＲＴＰ」は、抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍において上方制御されるタンパク質を指す。ＵＲＲＴＰには、限定するものではないが、Ｎｏｔｃｈ２、ＤＭＤ８、ＭＣＰ-１、ＩＴＧＢ７、Ｇ-ＣＳＦ、ＩＬ-８Ｒ、ＭＩＰ２、ＭＳＣＡ、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＬ-１Ｒ、Ｍｅｇ-ＳＦ、ＨＳＰ１Ａ、ＩＬ-１Ｒ、Ｇ-ＣＳＦＲ、ＩＧＦ２、ＨＳＰ９Ａ、ＦＧＦ１８、ＥＬＭ１、Ｌｅｄｇｆａ、スカベンジャーレセプタータイプＡ、マクロファージＣ-タイプレクチン、Ｐｉｇｒ３、マクロファージＳＲＴ-１、Ｇプロテイン-結合レセプター、ＳｃｙＡ７、ＩＬ-１Ｒ２、ＩＬ-１誘導型タンパク質、ＩＬ-１β、及びＩＬＩＸ前駆物質が含まれる。ある実施態様では、ＵＲＲＴＰはＭＳＣＡ、ＭＩＰ２、ＩＬ-８Ｒ及び／又はＧ-ＣＳＦを指す。
「ＤＲＲＴＰ」は、抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍において下方制御されるタンパク質を指す。ＵＲＲＴＰには、限定するものではないが、ＩＬ１０-Ｒ２、Ｅｒｂ-２.１、カベオリン３、Ｓｅｍｃａｐ３、ＩＮＴＧ４、ＴＨＢＳＰ-４、ＥｒｂＢ３、ＪＡＭ、Ｅｎｇ、ＪＡＭ、Ｅｎｇ、ＪＡＭ-２、Ｐｅｃａｍ１、Ｔｌｒ３、ＴＧＦ-Ｂ、ＦＩＺＺ１、Ｗｆｓ１、ＴＰ１４Ａ、ＥＭＡＰ、ＳＵＬＦ-２、細胞外基質２、ＣＴＦＧ、ＴＦＰＩ、ＸＣＰ２、Ｒａｍｐ２、ＲＯＲ-α、エフリンＢ１、ＳＰＡＲＣ-様１及びセマフォリンＡが含まれる。ある実施態様では、ＤＲＲＴＰはＩＬ１０-Ｒ２、ＴＨＢＳＰ-４及び／又はＪＡＭ-２を指す。

「天然配列」ポリペプチドは、天然由来の対応するポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる。よって、天然配列ポリペプチドは任意の哺乳動物からの天然に生じるポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。このような天然配列ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、あるいは組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列」ポリペプチドという用語は特にポリペプチドの天然に生じる切断型又は分泌型(例えば細胞外ドメイン配列)、ポリペプチドの天然に生じる変異体型(例えば、選択的スプライシング型)及び天然に生じる対立遺伝子変異体を包含する。
「ポリペプチド鎖」は、その各ドメインが、非共有的相互作用又はジスルフィド結合とは対照的にペプチド結合(一又は複数)によって他のドメイン(一又は複数)に連結しているポリペプチドである。
ポリペプチド「変異体」は対応する天然配列ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば一又は複数のアミノ酸(天然に生じるアミノ酸及び／又は天然に生じないアミノ酸)残基が、ポリペプチドのＮ末端及び／又はＣ末端に付加され、又は欠失されたポリペプチドが含まれる。通常は、変異体は天然配列ポリペプチドと少なくともおよそ８０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９０％のアミノ酸配列同一性、又は少なくともおよそ９５％のアミノ酸配列同一性を有する。また、変異体には、典型的には生物学的に活性な天然配列のポリペプチド断片(例えば、サブ配列、切断型など)が含まれる。

本明細書中の「パーセント(％)アミノ酸配列同一性」は、配列を整列させ、最大のパーセント配列同一性を得るために必要ならば間隙を導入し、如何なる保存的置換も配列同一性の一部と考えないとして、選択した配列のアミノ酸残基と同一である候補配列中のアミノ酸残基のパーセントとして定義される。パーセントアミノ酸配列同一性を決定する目的のためのアラインメントは、当業者の技量の範囲にある種々の方法、例えばBLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGIN-2又はMegalign(DNASTAR)ソフトウエアのような公に入手可能なコンピュータソフトウエアを使用することにより達成可能である。当業者であれば、比較される配列の完全長に対して最大のアラインメントを達成するために必要な任意のアルゴリズムを含む、アラインメントを測定するための適切なパラメータを決定することができる。しかし、ここでの目的のためには、％アミノ酸配列同一性値は、配列比較プログラムALIGN-2を使用することによって以下に記載のように得られる。ALIGN-2配列比較コンピュータプログラムはジェネンテク社によって作製され、米国著作権事務所, ワシントンD.C., 20559に使用者用書類とともに提出され、米国著作権登録番号TXU510087の下で登録され、ジェネンテク社、サウスサンフランシスコ, カリフォルニアから好適に入手可能である。ALIGN-2プログラムは、UNIXオペレーティングシステム、例えばデジタルUNIX V4.0Dでの使用のためにコンパイルされる。全ての配列比較パラメーターは、ALIGN-2プログラムによって設定され変動しない。

ここでの目的のために、与えられたアミノ酸配列Ａの、与えられたアミノ酸配列Ｂとの、又はそれに対する％アミノ酸配列同一性(あるいは、与えられたアミノ酸配列Ｂと、又はそれに対して或る程度の％アミノ酸配列同一性を持つ又は含む与えられたアミノ酸配列Ａと言うこともできる)は次のように計算される：
分率Ｘ／Ｙの１００倍
ここで、Ｘは配列アラインメントプログラムALIGN-2のＡ及びＢのアラインメントによって同一であると一致したスコアのアミノ酸残基の数であり、ＹはＢの全アミノ酸残基数である。アミノ酸配列Ａの長さがアミノ酸配列Ｂの長さと異なる場合、ＡのＢに対する％アミノ酸配列同一性は、ＢのＡに対する％アミノ酸配列同一性とは異なることは理解されるであろう。

本明細書中で用いる「タンパク質変異体」なる用語は、上記の変異体及び／又は一又は複数のアミノ酸突然変異を天然のタンパク質配列に含むタンパク質を指す。場合によって、一又は複数のアミノ酸突然変異にはアミノ酸置換(一又は複数)が含まれる。本発明での使用のためのタンパク質及びその変異体は当分野で公知の様々な方法によって調製されうる。タンパク質のアミノ酸配列変異体はタンパク質ＤＮＡの突然変異によって調製されうる。このような変異体には、タンパク質のアミノ酸配列内の残基の例えば欠失、挿入又は置換が含まれる。欠失、挿入及び置換の何かを組み合わせて、所望の活性を有する最終コンストラクトに達成してもよい。変異体をコードするＤＮＡ中に作製される突然変異は、リーディングフレーム外の配列におくべきでなく、好ましくは二次的ｍＲＮＡ構造を生産しうる相補的な領域を作製しないであろう。欧州特許第７５４４４号Ａ。

場合によって、タンパク質変異体は、天然のタンパク質をコードするＤＮＡのヌクレオチド部位特異的突然変異誘発又はファージディスプレイ技術によって、変異体をコードするＤＮＡを産生し、その後組換え細胞培養物中でＤＮＡを発現することによって調整する。
アミノ酸配列変化を導入するための部位は予め決定されているが、突然変異自体は予め決定する必要はない。例えば、ある部位での突然変異のパフォーマンスを最適化するために、ランダムな突然変異誘発を標的コドン又は標的領域で行い、発現されたタンパク質変異体を所望の活性の最適な組合せについてスクリーニングしてもよい。公知の配列を有するＤＮＡの所定の部位に置換突然変異を作製する技術は、周知の、例えば部位特異的突然変異誘発である。本明細書中に記述されるタンパク質変異体の調製は、ＰＣＴ出願国際公開第００／６３３８０号に記載のものなどのファージディスプレイ技術によって達成されうる。
このようなクローンが選択されたあと、変異したタンパク質領域は取り除かれ、タンパク質産生のために好適なベクター、一般に好適な宿主の形質転換に用いられうる種類の発現ベクターに組み込まれてもよい。
アミノ酸配列欠失は、一般に１〜３０の残基、場合によって１〜１０の残基、場合によって１〜５の残基以下に変動し、一般的に隣接する。

アミノ酸配列の挿入には、１残基から基本的に制限しない長さのポリペプチドのアミノ末端及び／又はカルボキシル末端の融合、並びに単一又は複数のアミノ酸残基の配列内挿入が含まれる。配列内挿入(すなわち天然のタンパク質配列内の挿入)は、一般的におよそ１〜１０の残基、場合によって１〜５、又は場合によって１〜３に変動しうる。末端挿入の例は、組換え宿主からの分泌を促すためのＮ末端への、宿主細胞に異種性であるか相同的であるかにかかわらないシグナル配列の融合などである。
更なるタンパク質変異体は、天然のタンパク質内の少なくとも一のアミノ酸残基が取り除かれているもの及び、異なる残基がその位置に挿入されているものである。このような置換は、表１に示すものを考慮してなされうる。また、本明細書において記述されるように、タンパク質変異体は非天然のアミノ酸を含んでなってもよい。
アミノ酸はその側鎖の性質の類似性に応じて分類される( Biochemistry, 第２版., pp. 73-75, Worth Publishers, New York (1975)中のA. L. Lehninger)：
(1) 非極性：Ala (A), Val (V), Leu (L), Ile (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W), Met (M)
(2) 荷電のない極性：Gly (G), Ser (S), Thr (T), Cys (C), Tyr (Y), Asn (N), Gln (Q)
(3) 酸性：Asp (D), Glu (E)
(4) 塩基性：Lys (K), Arg (R), His(H)
あるいは、天然に生じる残基は共通の側鎖性質に基づいてグループに分類してもよい。
(1) 疎水性：ノルロイシン、met、ala、val、leu、ile；
(2) 中性の親水性：cys、ser、thr、asn、gln；
(3) 酸性：asp、glu；
(4) 塩基性：his、lys、arg；
(5) 鎖配向に影響する残基：gly、pro；
(6) 芳香族：trp、tyr、phe。

表１

「天然に生じるアミノ酸残基」(すなわち遺伝コードによってコードされるアミノ酸残基)は、アラニン(Ａｌａ)；アルギニン(Ａｒｇ)；アスパラギン(Ａｓｎ)；アスパラギン酸(Ａｓｐ)；システイン(Ｃｙｓ)；グルタミン(Ｇｌｎ)；グルタミン酸(Ｇｌｕ)；グリシン(Ｇｌｙ)；ヒスチジン(Ｈｉｓ)；イソロイシン(Ｉｌｅ)：ロイシン(Ｌｅｕ)；リジン(Ｌｙｓ)；メチオニン(Ｍｅｔ)；フェニルアラニン(Ｐｈｅ)；プロリン(Ｐｒｏ)；セリン(Ｓｅｒ)；スレオニン(Ｔｈｒ)；トリプトファン(Ｔｒｐ)；チロシン(Ｔｙｒ)；及び、バリン(Ｖａｌ)からなる群から選択されうる。「非天然に生じるアミノ酸残基」は、上記に挙げる天然に生じるアミノ酸残基以外の、ポリペプチド鎖内の隣接したアミノ酸残基(一又は複数)を共有結合することができる残基を指す。非天然に生じるアミノ酸残基の例には、例えば、ノルロイシン、オルニチン、ノルバリン、ホモセリン及び、例えば、Ellman等 Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)及び米国公開特許第２００３０１０８８８５号及び同第２００３００８２５７５号に記載されるものなどの他のアミノ酸残基類似体が含まれる。簡単に言うと、これらの手順は、ＲＮＡのインビトロ又はインビボの転写及び翻訳が続く非天然に生じるアミノ酸残基によるサプレッサーｔＲＮＡの活性化を伴う。例として、米国公開特許第２００３０１０８８８５号及び同第２００３００８２５７５号；Noren等 Science 244:182 (1989)；及び、上掲のEllman等を参照。

「単離された」ポリペプチドは、その自然環境の成分から同定され分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、ポリペプチドの診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質が含まれる。ある実施態様では、ポリペプチドは、(1)ローリー(Lowry)法により定量して、９５重量％のポリペプチドより多くなるほど、又は９９重量％より多くなるまで、 (2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに充分な程度にまで、あるいは(3)クーマシーブルー又は銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥによる均一性が得られるように十分な程度にまで精製される。ポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチドには、組換え細胞内にインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチドは少なくとも一の精製工程により調製される。

「抗体」という用語は最も広義に使用され、モノクローナル抗体(完全長又は無傷のモノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多価抗体、少なくとも２つのインタクト抗体から形成される多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、及びそれらが所望の生物活性を示す限り抗体断片(以下を参照)を具体的に包含する。
特に断らない限りは、本明細書全体を通して「多価抗体」という表現は３又はそれ以上の抗原結合部位を含む抗体を指すために使用される。多価抗体は典型的には３又はそれ以上の抗原結合部位を持つように遺伝子操作されたもので、一般には天然配列ＩｇＭ又はＩｇＡ抗体ではない。
「抗体断片」は、一般には無傷の抗体の抗原結合を含み、よって抗原に結合する能力を保持している無傷の抗体の一部のみを含む。本定義に包含される抗体断片の例には、(i)ＶＬ、ＣＬ、ＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦａｂ断片；(ii)ＣＨ１ドメインのＣ末端に一又は複数のシステイン残基を持つＦａｂ断片であるＦａｂ'断片；(iii)ＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦｄ断片；(iv)ＣＨ１ドメインのＣ末端に一又は複数のシステイン残基とＶＨ及びＣＨ１ドメインを持つＦｄ'断片；(v)抗体の単一アームのＶＬ及びＶＨドメインを持つＦｖ断片；(vi)ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片(Ward等, Nature 341, 544-546 (1989))；(vii)単離されたＣＤＲ領域；(viii)ヒンジ領域がジスルフィド架橋によって結合された２つのＦａｂ'断片を含む二価断片であるＦ(ａｂ')_２断片；(ix)単鎖抗体分子(例えば単鎖Ｆｖ；ｓｃＦｖ)(Bird等, Science 242:423-426 (1988)；及びHuston等, PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988))；(x)同一のポリペプチド鎖中で軽鎖可変ドメイン(ＶＬ)に結合した重鎖可変ドメイン(ＶＨ)を含む、２つの抗原結合部位を持つ「ダイアボディー(diabodies)」(例えば、欧州特許公報第４０４０９７号；国際公開第９３／１１１６１号；及びHollinger等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)を参照)；(xi)相補的軽鎖ポリペプチドと共に一対の抗原結合領域を形成する一対のタンデムＦｄセグメント(ＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１)を含む「線形抗体」(Zapata等, Protein Eng. 8(10):1057-1062(1995)；及び米国特許第５６４１８７０号)が含まれる。

ここで使用される「モノクローナル抗体」という用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を意味する、すなわち、集団に含まれる個々の抗体が、少量で存在しうる天然に生じる突然変異等の可能性のある突然変異を除いて、同一である。したがって、「モノクローナル」なる修飾語は、別の抗体の混合ではない抗体の性質を示す。モノクローナル抗体は非常に特異的で、単一抗原に対するものである。ある実施態様では、モノクローナル抗体は、一般に、標的に結合するポリペプチド配列を含む抗体を包含しており、この場合の標的に結合するポリペプチドは、複数のポリペプチド配列から単一の標的結合ポリペプチド配列を選択することを含むプロセスによって得られたものである。例えば、このような選択プロセスは、複数のクローン、例えばハイブリドーマクローン、ファージクローン又は組換えＤＮＡクローンのプールからの、独特のクローンの選択であり得る。選択された標的結合配列を更に変化させることにより、例えば標的に対する親和性を向上させる、標的結合配列をヒト化する、細胞培養液中でのその産生を向上させる、インビボでのその免疫原性を低減する、多特異性抗体を作製する等が可能であること、並びに、変化させた標的結合配列を含む抗体も本発明のモノクローナル抗体であることを理解されたい。一般に異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を含むポリクローナル抗体調製物と比べて、各モノクローナル抗体は、１の抗原上の単一の決定基に対するものである。その特異性に加えて、モノクローナル抗体調製物は、通常他の免疫グロブリンによって汚染されない点で有利である。
「モノクローナル」との修飾詞は、ほぼ均一な抗体の集団から得られるという抗体の特徴を示し、抗体を何か特定の方法で生成しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明において使用されるモノクローナル抗体は様々な技術によって作ることができ、それらの技術には例えばハイブリドーマ法（例えば、Kohler and Milstein, Nature, 256:495 (1975)；Hongo等, Hybridoma, 14 (3): 253-260 (1995), Harlow等, Antibodies: A loboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 第２版 1988)；Hammerling等: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681, (Elsevier, N.Y., 1981)）、組換えＤＮＡ法（例えば、米国特許第4,816,567号参照）、ファージディスプレイ法（例えば、Clarkson等, Nature, 352:624-628 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Sidhu等, J. Mol. Biol. 338(2):299-310 (2004)；Lee等, J. Mol. Biol. 340(5):1073-1093 (2004)；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34):12467-12472 (2004)；及びLee等, J. Immunol. Methods 284(1-2):119-132 (2004)参照）、及びヒト免疫グロブリン座位又はヒト免疫グロブリン配列をコードする遺伝子の一部又は全部を有する動物においてヒト又はヒト様抗体を産生する技術（例えば、WO1998/24893; WO1996/34096；WO1996/33735；WO1991/10741；Jackobovits等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature, 362:255-258 (1993)；Bruggemann等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；米国特許第5,545,807号；同第5,545,806号；同第5,569,825号；同第5,625,126号；同第5,633,425号；及び同第5,661,016号；Marks等, Bio/Technology, 10:779-783 (1992)；Longerg等, Nature, 368:856-859 (1994)；Morrison, Nature, 368:812-813 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology, 14:845-851 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology, 14:826 (1996)；及びLongerg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol., 13:65-93 (1995)）が含まれる。

ここに記載のモノクローナル抗体は、特に、重鎖及び／又は軽鎖の一部が、特定の種から由来するか、特定の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である一方、鎖の残りが、他の種から由来するか、他の抗体クラス又はサブクラスに属する抗体の対応する配列と同一か相同である「キメラ」抗体、並びにそれらが所望の生物活性を示す限りはそのような抗体の断片を含む(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984))。
非ヒト(例えばマウス)抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。大部分において、ヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域からの残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種の高頻度可変領域からの残基(ドナー抗体)によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。ある場合には、ヒト免疫グロブリンのフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。更に、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性を更に洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲｓがヒト免疫グロブリン配列のものである、少なくとも１つ、典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含む。ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部をまた含む。更なる詳細については、Jones等, Nature 321:522-525 (1986); Riechmann等, Nature 332:323-329 (1988);及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。また例として、Vaswani and Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998)；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995)；Hurle and Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994)；及び米国特許第 6,982,321号及び同第7,087,409号を参照。また、van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol., 5: 368-74 (2001)も参照のこと。抗原刺激に応答して抗体を産生するように修飾されているが、その内在性遺伝子座が無効になっているトランスジェニック動物、例えば免疫化ゼノマウスに抗原を投与することによってヒト抗体を調製することができる(例として、ＸＥＮＯＭＯＵＳＥ^ＴＭ技術に関する米国特許第６０７５１８１号及び同第６１５０５８４号を参照)。また、例えば、ヒトのＢ細胞ハイブリドーマ技術によって生成したヒト抗体に関するLi等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)も参照のこと。

「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここで開示されたヒト抗体を製造するための何れかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、当該分野で知られている様々な技術を使用することによって生産することが可能である。一実施態様では、ヒト抗体はファージライブラリーから選択され、ここでファージライブラリーがヒト抗体を発現する(Vaughan等, Nature Biotechnology 14:309-314 (1996):Sheets等, PNAS, (USA)95:6157-6162(1998)；Hoogenboom及びWinter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。また、ヒト抗体は、ヒト免疫グロブリン座位をトランスジェニック動物、例えば内在性免疫グロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されたマウス中に導入することにより産生することができる。暴露時に、遺伝子再構成、アセンブリ及び抗体レパートリーを含む、あらゆる点でヒトに見られるものと密接に類似しているヒト抗体の産生が観察される。このアプローチ法は、例えば米国特許第５５４５８０７号；第５５４５８０６号；第５５６９８２５号；第５６２５１２６号；第５６３３４２５号；第５６６１０１６号、及び次の科学文献：Marks等, Bio/Technology 10:779-783 (1992)；Lonberg等, Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison等, Nature 368: 812-13 (1994)；Fishwild等, Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996); Lonberg及びHuszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対して抗体を生産するヒトＢリンパ球の不死化によって調製されてもよい(そのようなＢリンパ球は、個体から回収されてもよいし、インビトロで免疫化されていてもよい)。例えば、Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss. p.77(1985)；Boerner等, J. Immunol., 147(1)：86-95(1991)；及び米国特許第５７５０３７３号を参照のこと。

「可変」という用語は、可変ドメインのある部位が、抗体の中で配列が広範囲に異なっており、その特定の抗原に対する各特定の抗体の結合性及び特異性に使用されているという事実を意味する。しかしながら、可変性は抗体の可変ドメインにわたって一様には分布していない。軽鎖及び重鎖の可変ドメインの両方の高頻度可変領域と呼ばれる３つのセグメントに濃縮される。可変ドメインのより高度に保持された部分はフレームワーク領域(ＦＲ)と呼ばれる。天然の重鎖及び軽鎖の可変ドメインは、βシート構造を結合し、ある場合にはその一部を形成するループ結合を形成する、３つの高頻度可変領域により連結されたβシート配置を主にとる４つのＦＲをそれぞれ含んでいる。各鎖の高頻度可変領域は、ＦＲによって近接して結合され、他の鎖の高頻度可変領域と共に、抗体の抗原結合部位の形成に寄与している(Kabat等, Sequence of Proteins ofImmunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, BEthesda, MD. (1991))。定常ドメインは、抗体の抗原への結合に直接関連しているものではないが、種々のエフェクター機能、例えば抗体依存性細胞毒性への抗体の関与を示す。
ここで使用される「高頻度可変領域」、「ＨＶＲ」又は「ＨＶ」なる用語は、抗原結合を担う抗体のアミノ酸残基を指す。例えば、高頻度可変領域は、配列において高頻度可変であり、及び／又は構造的に定まったループを形成する抗体可変ドメインの領域を意味する。一般に、抗体は６つのＨＶＲを含み；ＶＨに３つ(Ｈ１、Ｈ２、Ｈ３)、ＶＬに３つ(Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３)である。天然の抗体では、Ｈ３及びＬ３は６つのＨＶＲのうちで最も高い多様性を示す、特にＨ３は抗体に良好な特異性を与える際に特有の役割を果たすように思われる。例として、Xu等 (2000) Immunity 13:37-45；Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ)のJohnson and Wu (2003)を参照。実際、重鎖のみからなる天然に生じるラクダ科の抗体は機能的であり、軽鎖が無い状態で安定である。Hamers-Casterman等 (1993) Nature 363:446-448；Sheriff等 (1996) Nature Struct. Biol. 3:733-736。

多数のＨＶＲの描写が使用され、ここに含まれる。カバット相補性決定領域(ＣＤＲ)は配列変化に基づいており、最も一般的に使用されている(Kabat等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5版 Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991))。Chothiaは、代わりに構造的ループの位置に言及している(Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987))。ＡｂＭＨＶＲは、カバットＨＶＲとChothia構造的ループの間の妥協を表し、Oxford MolecularのＡｂＭ抗体モデリングソフトウェアにより使用される。「接触」ＨＶＲは、利用できる複合体結晶構造の分析に基づく。これらＨＶＲのそれぞれからの残基を以下に示す。
ループカバットＡｂＭ Chothia 接触
L1 L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36
L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55
L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96
H1 H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (カバット番号付け)
H1 H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Chothia番号付け)
H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47-H58
H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

ＨＶＲは、次のような「拡大ＨＶＲ」を含むことができる、即ち、ＶＬの２４−３６又は２４−３４(Ｌ１)、４６−５６又は５０−５６(Ｌ２)及び８９−９７又は８９−９６(Ｌ３)と、ＶＨの２６−３５(Ｈ１)、５０−６５又は４９−６５(Ｈ２)及び９３−１０２、９４−１０２、又は９５−１０２(Ｈ３)である。可変ドメイン残基には、これら各々を規定するために、Kabat等, 上掲に従って番号を付した。
「フレームワーク」又は「ＦＲ」残基は、ここで定義する高頻度可変領域残基以外の可変ドメイン残基である。

「カバット(Kabat)による可変ドメイン残基番号付け」又は「カバットに記載のアミノ酸位番号付け」なる用語及びその異なる言い回しは、上掲のKabat 等の抗体の編集の軽鎖可変ドメイン又は重鎖可変ドメインに用いられる番号付けシステムを指す。この番号付けシステムを用いると、実際の線形アミノ酸配列は、可変ドメインのＦＲ又はＨＶＲ内の短縮又は挿入に相当する２、３のアミノ酸又は付加的なアミノ酸を含みうる。例えば、重鎖可変ドメインには、重鎖ＦＲ残基８２の後に挿入された残基(例えばカバットによる残基８２ａ、８２ｂ及び８２ｃなど)と、Ｈ２の残基５２の後に単一アミノ酸の挿入(Kabatによる残基５２ａ)を含んでもよい。残基のKabat番号は、「標準の」カバット番号付け配列によって抗体の配列の相同領域でアライメントすることによって与えられる抗体について決定してもよい。
本明細書及び特許請求の範囲すべてにわたって、一般的に、可変ドメインの残基を指す場合にはカバット番号付けシステムを用いる(およそ、軽鎖の残基１−１０７と重鎖の残基１−１１３)(例として、Kabat 等, Sequences of Immunological Interest. 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991))。一般的に、イムノグロブリン重鎖定常領域内の残基を指す場合には、「ＥＵ番号付けシステム」又は「ＥＵインデックス」を用いる(ＥＵインデックスはKabat 等, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)において報告されており、出典明記によって本明細書中に特別に組み込まれる)。本明細書中で特に述べない限り、抗体の可変ドメイン内の残基の数の参照は、カバット番号付けシステムによって番号付けした残基を意味する。本明細書中で特に述べない限り、抗体の定常ドメイン内の残基の数の参照は、ＥＵ番号付けシステムによって番号付けした残基を意味する(例として、米国特許仮出願第６０／６４０３２３号、ＥＵ番号付けについての図を参照)。

イムノグロブリンの重鎖の定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、抗体(イムノグロブリン)は異なるクラスが割り当てられる。イムノグロブリンには５つの主なクラスがある：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭ、更にそれらは、ＩｇＧ_１(非Ａ及びＡアロタイプを含む)、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３、ＩｇＧ_４、ＩｇＡ_１、及びＩｇＡ_２等のサブクラス(アイソタイプ)に分かれる。イムノグロブリンの異なるクラスに対応する重鎖定常ドメインはそれぞれα、δ、ε、γ、及びμと呼ばれる。イムノグロブリンの異なるクラスのサブユニット構造及び三次元立体配位はよく知られており、一般に、例えばAbbas等 Cellular and Mol. Immunology, 4th ed. (W.B. Saunders, Co., 2000)に記載されている。抗体は、抗体と一又は複数の他のタンパク質ないしペプチドとの共有的ないしは非共有的結合によって形成される大きな融合分子の一部であってもよい。

任意の脊椎動物種からの抗体(イムノグロブリン)の「軽鎖」には、その定常ドメインのアミノ酸配列に基づいて、カッパ(κ)及びラムダ(λ)と呼ばれる２つの明確に区別される型の一つが割り当てられる。
「Ｆｃ領域」なる用語は、インタクト抗体のパパイン消化によって生成されうる免疫グロブリン重鎖のＣ末端領域を定義するために使用される。Ｆｃ領域は天然配列Ｆｃ領域又は変異形Ｆｃ領域であってもよい。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化するかも知れないが、通常、ヒトＩｇＧ重鎖Ｆｃ領域はおよそＣｙｓ２２６の位置又はおよそＰｒｏ２３０からの位置のアミノ酸残基からＦｃ領域のカルボキシル末端まで伸長すると定義される。Ｆｃ領域のＣ末端リジン(ＥＵ番号付けシステムによれば残基４４７)は、例えば、抗体の産生又は精製中に、又は抗体の重鎖をコードする核酸を組み換え遺伝子操作することによって取り除かれてもよい。したがって、インタクト抗体の組成物は、すべてのＫ４４７残基が除去された抗体群、Ｋ４４７残基が除去されていない抗体群、及びＫ４４７残基を有する抗体と有さない抗体の混合を含む抗体群を含みうる。免疫グロブリンのＦｃ領域は一般に、ＣＨ２ドメインとＣＨ３ドメインの２つの定常ドメインを含み、場合によってＣＨ４ドメインを含む。

特に明記しない限り、本明細書中の免疫グロブリン重鎖の残基の番号付けは、出典明記によって本明細書中に特別に援用される上掲のKabat等のＥＵインデックスのものである。「KabatのＥＵインデックス」はヒトＩｇＧ１ＥＵ抗体の残基番号を指す。
本明細書中の「Ｆｃ領域鎖」は、Ｆｃ領域の２つのポリペプチド鎖の１つを意味する。
ヒトＩｇＧＦｃ領域の「ＣＨ２ドメイン」(「Ｃｇ２」ドメインとも呼ばれる)は、通常、約２３１位のアミノ酸残基から約３４０位のアミノ酸残基まで延びている。ＣＨ２ドメインは、別のドメインと親密な対にならないという点で独特である。代わりに、２つのＮ結合分岐炭水化物鎖が、無傷の天然IgG分子の２つのＣＨ２ドメインの間に挿入される。炭水化物はドメイン−ドメイン対の代替物を提供し、ＣＨ２ドメインの安定化を助けることができると推測される。BurtonによるMolec. Immunol. 22:161-206 (1985)を参照のこと。ここで、ＣＨ２ドメインは天然配列のＣＨ２ドメイン又は変異体ＣＨ２ドメインとすることができる。
「ＣＨ３ドメイン」は、Ｆｃ領域におけるＣ末端からＣＨ２ドメインまでの範囲(つまり、ＩｇＧの約３４１位のアミノ酸から約４４７位のアミノ酸)を含む。ここでは、ＣＨ３領域は、天然配列のＣＨ３ドメインか、又は変異体ＣＨ３ドメイン(例えば、その一鎖に「protroberance」が導入され、それに対応して他の鎖に「空洞」が導入されたＣＨ３ドメイン：出典明記によって特別に本明細書中に援用される米国特許第５８２１３３３号参照)とすることができる。このような変異体ＣＨ３ドメインを使用して本明細書に開示する多重特異性(例えば二重特異性)抗体をつくることができる。

「ヒンジ領域」は、通常、ヒトＩｇＧ１の約Ｇｌｕ２１６又は約Ｃｙｓ２２６から約Ｐｒｏ２３０まで延びていると定義される(Burton, Molec. Immunol.22:161-206, 1985)。他のＩｇＧイソタイプのヒンジ領域は、同じ位置に内部重鎖Ｓ−Ｓ結合を形成する最初と最後のシステイン残基を配置することによりIgG1と整列させることができる。本明細書のヒンジ領域は、天然配列のヒンジ領域か、又は変異体ヒンジ領域とすることができる。変異体ヒンジ領域の２つのポリペプチド鎖は、通常、１つのポリペプチド鎖につき少なくとも１つのシステイン残基を保持しており、よって２つの変異体ヒンジ領域のポリペプチド鎖は２つの鎖の間にジスルフィド結合を形成することができる。本発明の好ましいヒンジ領域はは、天然配列のヒトヒンジ領域、例えば天然配列のヒトＩｇＧ１ヒンジ領域である。
「機能的Ｆｃ領域」は、天然配列Ｆｃ領域の少なくとも１つの「作動体機能」を有する。例示的「作動体機能」には、Ｃ１ｑ結合、補体依存性細胞障害作用(ＣＤＣ)、Ｆｃレセプター結合、抗体依存性細胞媒介性細胞障害作用(ＡＤＣＣ)、食作用、細胞表面レセプター(例えばＢ細胞レセプター；ＢＣＲ)の下方制御などが含まれる。そのような作動体機能は、通常、Ｆｃ領域が結合ドメイン(例えば、抗体可変ドメイン)と組み合わさることを必要とし、そのような抗体の作動体機能を評価するための当技術分野で既知の様々なアッセイを使用して評価される。
「天然配列のＦｃ領域」は、天然に見出されるＦｃ領域のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を包含する。天然配列のヒトＦｃ領域は、天然配列のヒトＩｇＧ１Ｆｃ領域(非Ａ-及びＡ-アロタイプ)；天然配列のヒトＩｇＧ２Ｆｃ領域；天然配列のヒトＩｇＧ３Ｆｃ領域；及び天然配列のヒトＩｇＧ４Ｆｃ領域；並びに、これらの自然に生じる変異体が含まれる。

「変異体Ｆｃ領域」は、少なくとも１つのアミノ酸修飾により、天然配列のＦｃ領域とは異なるアミノ酸配列を包含するものである。ある実施態様では、変異体Ｆｃ領域は、天然配列のＦｃ領域もしくは親ポリペプチドのＦｃ領域と比較した場合、少なくとも１つのアミノ酸置換、例えば、天然配列のＦｃ領域又は親のポリペプチドのＦＣ領域におよそ１からおよそ１０のアミノ酸置換、好ましくはおよそ１からおよそ５のアミノ酸置換を有する。本明細書中の変異体Ｆｃ領域は、典型的には、天然配列のＦｃ領域及び／又は親ポリペプチドのＦｃ領域と、例えば少なくともおよそ８０％の同一性を有するか、又は少なくともおよそ９０％の配列同一性を、又は少なくともおよそ９５％の配列又はそれ以上の同一性を有するものであろう。
抗体の「エフェクター機能」とは、抗体のＦｃ領域(天然配列Ｆｃ領域又はアミノ酸配列変異体Ｆｃ領域)に帰する生物学的活性を意味し、抗体のアイソタイプにより変わる。抗体のエフェクター機能の例には、Ｃ１ｑ結合及び補体依存性細胞障害(ＣＤＣ)；Ｆｃレセプター結合性；抗体依存性細胞媒介性細胞障害(ＡＤＣＣ)；貪食作用；細胞表面レセプター(例えば、Ｂ細胞レセプター)のダウンレギュレーション；及びＢ細胞活性化が含まれる。

「抗体依存性細胞媒介性細胞障害」又は「ＡＤＣＣ」とは、ある種の細胞障害細胞(例えば、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、好中球及びマクロファージ)上に存在するＦｃレセプター(ＦｃＲｓ)と結合した分泌Ｉｇにより、これらの細胞障害エフェクター細胞が抗原-担持標的細胞に特異的に結合し、続いて細胞毒により標的細胞を死滅させることを可能にする細胞障害性の形態を意味する。ＡＤＣＣを媒介する主要な細胞ＮＫ細胞はＦｃγＲＩＩＩのみを発現するのに対し、単球はＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩを発現する。造血細胞でのＦｃＲの発現は、Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol 9:457-92 (1991) の４６４頁の表３に要約されている。対象の分子のＡＤＣＣ活性をアッセイするために、米国特許第５５００３６２号又は同第５８２１３３７号に記載されているようなインビトロＡＤＣＣアッセイを実施することができる。このようなアッセイにおいて有用なエフェクター細胞には、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)及びナチュラルキラー細胞(ＮＫ細胞)が含まれる。代わりとして、もしくは付加的に、対象の分子のＡＤＣＣ活性は、例えば、Clynes等, (USA) 95:652-656 (1998)において開示されているような動物モデルにおいて、インビボで評価することが可能である。
「ヒトエフェクター細胞」とは、一又は複数のＦｃＲｓを発現し、エフェクター機能を実行する白血球のことである。ある実施態様では、その細胞が少なくともＦｃγＲＩＩＩを発現し、ＡＤＣＣエフェクター機能を実行する。ＡＤＣＣを媒介するヒト白血球の例として、末梢血液単核細胞(ＰＢＭＣ)、ナチュラルキラー(ＮＫ)細胞、単球、細胞障害性Ｔ細胞及び好中球が含まれるが、ＰＢＭＣとＮＫ細胞が一般的に好まれる。エフェクター細胞はその天然源、例えば本明細書中に記載の血液又はＰＢＭＣから単離してもよい。

「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」は、抗体のＦｃ領域に結合するレセプターを記載するものである。いくつかの実施態様では、ＦｃＲは天然ヒトＦｃＲである。いくつかの実施態様では、ＦｃＲは、ＩｇＧ抗体(ガンマレセプター)と結合するもので、ＦｃγＲＩ、ＦｃγＲＩＩ及びＦｃγＲＩＩＩサブクラスのレセプターを含み、これらのレセプターの対立遺伝子変異体、選択的にスプライシングされた形態のものも含まれる。ＦｃγＲＩＩレセプターには、ＦｃγＲＩＩＡ(「活性型レセプター」)及びＦｃγＲＩＩＢ(「阻害型レセプター」)が含まれ、主としてその細胞質ドメインは異なるが、類似のアミノ酸配列を有するものである。活性型レセプターＦｃγＲＩＩＡは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター活性化モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based activation motif ;ＩＴＡＭ)を含んでいる。阻害型レセプターＦｃγＲＩＩＢは、細胞質ドメインにチロシン依存性免疫レセプター阻害性モチーフ(immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif ;ＩＴＩＭ)を含んでいる(例としてDaeron, Annu. Rev. immunol. 15:203-234 (1997)を参照)。ＦｃＲsに関しては、例えばRavetch and Kinet, Annu.Rev. Immunol. 9:457-492 (1991); Capel等, Immunomethods 4:25-34 (1994); 及びde Haas等, J.Lab. Clin. Med. 126:330-41 (1995) に概説されている。将来的に同定されるものも含む他のＦｃＲsはここでの「ＦｃＲ」という言葉によって包含される。
また、「Ｆｃレセプター」又は「ＦｃＲ」なる用語には、母性ＩｇＧの胎児への移送(Guyer等, J. Immunol. 117:587 (1976) Kim等, J. Immunol.24:249 (1994))と、免疫グロブリンのホメオスタシスの調節を担う新生児性レセプターＦｃＲｎも含まれる。ＦｃＲｎへの結合の測定方法は公知である(例としてGhetie and Ward, Immunol. Today 18: 592-8 (1997)；Ghetie等, Nature Biotechnology, 15(7):637-640 (1997)；Hinton等, J. Biol. Chem. 279(8):6213-6216 (2004)；国際公開第2004/92219号 (Hinton等)を参照)。
インビボでのヒトＦｃＲｎへの結合とヒトＦｃＲｎ高親和性結合ポリペプチドの血清半減期は、例えばヒトＦｃＲｎを発現するトランスジェニックマウス又は形質転換されたヒト細胞株、又は変異形Ｆｃ領域を有するポリペプチドを投与された霊長類動物においてアッセイすることができる。国際公開公報２０００／４２０７２(Presta) にＦｃＲへの結合を向上又は減弱させた抗体変異型が述べられている。例としてShields等, J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001)も参照のこと。

「補体依存性細胞障害」もしくは「ＣＤＣ」は、補体の存在下で標的を溶解することを意味する。典型的な補体経路の活性化は補体系(Ｃｌｑ)の第１補体が、同族抗原と結合した(適切なサブクラスの)抗体に結合することにより開始される。補体の活性化を評価するために、ＣＤＣアッセイを、例えばGazzano-Santoro等, J. Immunol. Methods 202:163 (1996)に記載されているように実施することができる。Ｆｃ領域アミノ酸配列を変更してＣ１ｑ結合能力が増大又は減少したポリペプチド変異体(変異形Ｆｃ領域を有するポリペプチド)は、米特許第６１９４５５１号Ｂ１及び国際公開第１９９９／５１６４２号に記述される。また例としてIdusogie 等 J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)も参照のこと。
「親和性成熟」抗体は、その１つ以上のＣＤＲに１つ以上の変更を有する抗体であって、そのような変更を有しない親抗体と比較して、抗原に対する抗体の親和性を向上させる。一実施態様では、親和性成熟抗体は、標的抗原に対して、ナノモル単位の、さらにはピコモル単位の親和性を有する。親和成熟抗体は、当技術分野において既知の方法により生産できる。Marks他は、Bio/Technology, 10:779-783(1992年)において、ＶＨドメインとＶＬドメインのシャフリングによる親和成熟を開示している。ＣＤＲ及び／又はフレームワーク残基のランダムな突然変異誘発が、Barbas他、Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813(1994)；Schier他、Gene, 169:147-155 (1995)；Yelton他、J. Immunol., 155:1994-2004 (1995)；Jackson他, J. Immunol., 154(7):3310-9 (1995)；及びHawkins他, J. Mol. Biol., 226:889-896 (1992)に開示されている。

ここでの「可動(フレキシブル)リンカー」とはペプチド結合によって結合した２又はそれ以上のアミノ酸残基を含むペプチドを意味し、それによって結合された(例えば２つのＦｄ領域のような)２つのポリペプチドに対してより大なる回転自由度を提供する。そのような回転自由度により、可動リンカーによって結合された２又はそれ以上の抗原結合部位がそれぞれより効率的に標的抗原(一又は複数)に接近できるようになる。適切な可動リンカーペプチド配列の例には、gly-ser、gly-ser-gly-ser、ala-ser、及びgly-gly-gly-serが含まれる。
「二量体化ドメイン」は少なくとも２つのアミノ酸残基(一般にはシステイン残基)又は少なくとも２つのペプチド又はポリペプチド(これは同じか異なったアミノ酸配列を持ちうる)の結合(association)によって形成される。ペプチド又はポリペプチドは共有的及び／又は非共有的結合(一又は複数)によって互いに相互作用しうる。ここでの二量体化ドメインの例には、Ｆｃ領域；ヒンジ領域；ＣＨ３ドメイン；ＣＨ４ドメイン；ＣＨ１-ＣＬ対；出典明示によりここに取り込まれる米国特許第５８２１３３３号に記載されたような、遺伝子操作された「ノブ(knob)」及び／又は「隆起(protruberance)」を持つ「インターフェース」；ロイシンジッパー(例えば、ｊｕｎ／ｆｏｓロイシンジッパー、Kostelney等, J. Immunol., 148:1547-1553 (1992)を参照；又は酵母ＧＣＮ４ロイシンジッパー)；イソロイシンジッパー；レセプター二量体対(例えばインターロイキン-８レセプター(ＩＬ-８Ｒ)；及びインテグリンヘテロ二量体、例えばＬＦＡ-１及びＧＰＩＩＩｂ／ＩＩＩａ)、又はその二量体化領域(一又は複数)；二量体リガンドポリペプチド(例えば、神経成長因子(ＮＧＦ)、ニューロトロフィン-３(ＮＴ-３)、インターロイキン-８(ＩＬ-８)、血管内皮細胞成長因子(ＶＥＧＦ)、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ、ＰＤＧＦメンバー、及び脳由来神経栄養因子(ＢＤＮＦ)；Arakawa等, J. Biol. Chem. 269(45): 27833-27839 (1994)及びRadziejewski等 Biochem. 32(48): 1350 (1993)を参照)、又はその二量体化領域(一又は複数)；ジスルフィド結合を形成可能なシステイン残基対；ペプチド又はポリペプチドの間にジスルフィド結合が形成可能なようにそれぞれが少なくとも一つのシステイン残基(例えば約１、２又は３から約１０のシステイン残基)を有するペプチド又はポリペプチドの対(以下、「合成ヒンジ」)；及び抗体可変ドメインが含まれる。ここでの最も好適な二量体化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域である。

抗体の「機能的抗原結合部位」は標的抗原に結合可能なものである。抗原結合部位の抗原結合親和性は、抗原結合部位が由来する親抗体と必ずしも同じほどは強くはないが、抗原に結合する能力は、抗原に結合する抗体を評価するために知られている既知の様々な方法の何れか一つを使用して測定できるものでなければならない。更に、ここの多価抗体の抗原結合部位の各々の抗原結合親和性は定量的に同じである必要はない。ここの多量体抗体に対して、機能的抗原結合部位の数は超遠心分離分析法を使用して評価することができる。この分析法によれば、多量体抗体に対する標的抗原の異なった比を組み合わせ、複合体の平均分子量を、機能的結合部位の異なった数を仮定して算定する。これらの理論値を、機能的結合部位の数を評価するために得られた実際の実権値と比較する。
指定された抗体の「生物学的特性」を有する抗体は同じ抗原に結合する他の抗体とは区別されるその抗体の生物学的特性の一又は複数を保有するものである。
対象の抗体が結合する抗原上のエピトープに結合する抗体をスクリーニングするために、Antibodies, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow and David Lane (1988)に記載のものなどの常套的な交差遮断(cross-blocking)アッセイを行ってもよい。

一又は複数の更なる治療薬と「組み合わせた」投与とは、同時(同時期)及び／又は任意の順序での連続した投与を含む。
治療のための「哺乳動物」とは、哺乳動物に分類される任意の動物を意味し、ヒト、家畜用及び農場用動物、動物園、スポーツ、又は愛玩動物、例えばイヌ、ウマ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ブタなどを含む。典型的には、哺乳動物はヒトである。
「疾患」は本発明の分子による治療によって利益を得る任意の症状である。これには、哺乳動物が問題とする疾患に罹らしめる病理学的症状を含む、慢性及び急性の疾患ないし疾病が含まれる。本明細書中で治療される疾患の非限定的な例には、いずれかの形態の腫瘍、良性及び悪性の腫瘍；血管化の腫瘍；肥大；白血病及びリンパ系の悪性腫瘍；神経系疾患、膠細胞性疾患、星状性、視床下部及び他の腺性疾患、マクロファージ性疾患、上皮性疾患、間質性疾患、及び胚盤胞性疾患；及び、炎症性疾患、血管形成性及び免疫性疾患、不適当な、異常な、過剰な及び／又は病理学的脈管化及び／又は血管透過から生じる血管性疾患が含まれる。

「有効量」又は「治療的有効量」という用語は、哺乳類の疾病や疾患の治療のために有効な薬剤の量に相当する。癌の場合は、有効量の薬剤により、癌細胞の数を減少させ；腫瘍の大きさを小さくし；癌細胞の周辺器官への浸潤を阻害(すなわち、ある程度に遅く、典型的には止める)し；腫瘍の転移を阻害(すなわち、ある程度に遅く、典型的には止める)し；腫瘍の成長をある程度阻害し；耐性腫瘍の治療を可能にする；及び／又は疾患に関連する一又は複数の症状をある程度和らげることが可能である。ある程度、薬剤は、成長を妨げ及び／又は現存の癌細胞を殺すことが可能で、細胞分裂停止性及び／又は細胞障害性である。癌治療に対しては、インビボにおける効力は、例えば生存期間、病状の進行時間(ＴＴＰ)、応答速度(ＲＲ)、応答期間、及び／又は生活の質の測定により測定される。大腸腺腫の場合、治療的有効量の薬剤により、例えば、腺腫細胞数の減少；腺腫サイズの減少；腺腫数の減少；腺腫の成長のある程度の阻害；及び／又は本疾患に関係する一又は複数の症状のある程度の軽減しうる。
「治療」は、治療的処置及び予防的又は防止的な処置を指す。治療を必要とするものには、既に疾患を有するもの、並びに予防すべき疾患があるものが含まれる。本発明のある実施態様では、治療は、腫瘍の血管新生及び／又は増殖の抑制、又は抗ＶＥＧＦ耐性の発症の遅延を指してもよい。
本発明のポリペプチドに関して「生物学的活性」及び「生物学上活性な」なる用語は、特異的に結合して細胞の応答、例えば増殖、移動などを調節する分子の能力を指す。また、細胞性応答には、レセプターによって媒介されるもの、例えば限定するものではないが、移動及び／又は増殖が含まれる。ここでは「調節する」なる用語には促進及び阻害が含まれる。

「癌」及び「癌性」なる用語は、、一般的に調節されない細胞増殖に特徴がある哺乳動物の生理学的状態を指すか又は記述する。癌の例には、限定するものではないが、カルチノーマ、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病又はリンパ性悪性腫瘍が含まれる。このような癌のより具体的な例には、腎臓又は腎性癌、乳癌、大腸癌、直腸癌、結腸直腸癌、肺癌、例として小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌及び肺の扁平上皮癌、扁平細胞癌(例えば上皮の扁平細胞癌)、子宮頸癌、卵巣癌、前立腺癌、肝癌、膀胱癌、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃腸癌を含む胃(gastric、stomach)癌、消化管間質腫瘍(ＧＩＳＴ)、膵癌、頭頸部癌、神経膠芽腫、網膜芽細胞腫、星状細胞腫、莢膜細胞腫、男化腫瘍、肝細胞癌、非ホジキンリンパ腫を含む血液悪性腫瘍(ＮＨＬ)、多発性骨髄腫及び急性の血液系悪性腫瘍、子宮内膜ないし子宮カルチノーマ、子宮内膜症、線維肉腫、絨毛膜癌、唾液腺カルチノーマ、外陰部癌、甲状腺癌、食道カルチノーマ、肝癌、肛門部のカルチノーマ、陰茎カルチノーマ、上咽頭癌、喉頭のカルチノーマ、カポシ肉腫、メラノーマ、皮膚カルチノーマ、シュワン腫、乏突起細胞腫、神経芽細胞腫、横紋筋肉腫、骨原性肉種、平滑筋肉腫、尿路カルチノーマ、甲状腺カルチノーマ、ウィルムス腫瘍、並びにＢ細胞リンパ腫(例えば低グレード／濾胞性非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；小リンパ球性(ＳＬ)ＮＨＬ；中間グレード／濾胞性ＮＨＬ；中間グレード広汎性ＮＨＬ；高グレード免疫芽細胞ＮＨＬ；高グレードリンパ芽球ＮＨＬ；高グレード小型非分割細胞ＮＨＬ；巨大腫瘤病変(bulky disease)ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連のリンパ腫；及び、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症)；慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)；急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)；線毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び、移植後のリンパ増殖性疾患(ＰＴＬＤ)、並びに母斑症、浮腫(脳腫瘍と関係しているものなど)及びメイグス症候群と関係している異常な血管性増殖が含まれる。本明細書中で用いられる「腫瘍」は、悪性又は良性のいずれであっても、すべての腫瘍性細胞成長及び増殖、及びすべての前癌性及び癌性の細胞及び組織を指す。

「耐性腫瘍」なる用語は、少なくともＶＥＧＦアンタゴニストを含む癌治療に対して癌治療の間を通して十分に反応しない、又は反応がない、ないしは反応が低減している癌、癌細胞又は腫瘍を指す。また、耐性腫瘍は、本明細書中において耐性があると診断された腫瘍(また、本明細書中では「抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍」と称される)を指す。ある実施態様では、少なくともＶＥＧＦアンタゴニストを含む療法に感受性がある腫瘍と比較して、耐性腫瘍ではＣＤ11ｂ＋Ｇｒ1＋細胞の増加がある。
「抗新生物性組成物」なる用語は、少なくとも一の活性な治療剤、例えば「抗癌剤」を含む癌の治療に有用な組成物を指す。治療剤(抗癌剤)の例には、限定するものではないが、例えば化学療法剤、増殖阻害剤、細胞障害性剤、放射線療法において使用する薬剤、抗血管新生剤、アポトーシス剤、抗チューブリン剤、毒素、及び癌を治療するための他の薬剤、例えば抗ＶＥＧＦ中和抗体、ＶＥＧＦアンタゴニスト、抗ＨＥＲ-２、抗ＣＤ２０、上皮性増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)アンタゴニスト(例えば、チロシンキナーゼインヒビター)、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲインヒビター、エルロチニブ、ＣＯＸ-２インヒビター(例えば、セレコキシブ)、インターフェロン、サイトカイン、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４又はＶＥＧＦレセプターの一又は複数に結合するアンタゴニスト(例えば、中和抗体)、血小板由来増殖因子(ＰＤＧＦ)及び／又は幹細胞因子(ＳＣＦ)に対するレセプターチロシンキナーゼのインヒビター(例えば、メシル酸イマチニブ(Ｇｌｅｅｖｅｃ(登録商標) Novartis))、ＴＲＡＩＬ/Ａｐｏ２、及び他のバイオ活性がある有機化学的薬剤などが含まれる。それらの組合せも本発明に包含される。

ここで用いられる「細胞障害性剤」という用語は、細胞の機能を阻害又は阻止し及び／又は細胞破壊を生ずる物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えば、Ａｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２及びＬｕの放射性同位体)、化学治療薬、及び毒素、例えばその断片及び／又は変異体を含む小分子毒素又は細菌、糸状菌、植物又は動物起源の酵素的に活性な毒素を含むように意図されている。
ここで用いられる際の「増殖阻害剤」は、細胞の増殖をインビトロ及び／又はインビボで阻害する化合物又は組成物を意味する。よって、増殖阻害剤は、Ｓ期で細胞の割合を有意に減少させるものである。増殖阻害剤の例は、細胞周期の進行を(Ｓ期以外の位置で)阻害する薬剤、例えばＧ１停止又はＭ期停止を誘発する薬剤を含む。古典的なＭ期ブロッカーは、ビンカス(ビンクリスチン及びビンブラスチン)、タキソール(登録商標)、及びトポＩＩ阻害剤、例えばドキソルビシン、エピルビシン、ダウノルビシン、エトポシド、及びブレオマイシンを含む。またＧ１停止させるこれらの薬剤は、Ｓ期停止にも波及し、例えば、ＤＮＡアルキル化剤、例えば、タモキシフェン、プレドニゾン、ダカルバジン、メクロレタミン、シスプラチン、メトトレキセート、５-フルオロウラシル、及びアラ-Ｃである。更なる情報は、The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn及びIsrael, 編, Chapter 1, 表題「Cell cycle regulation, oncogene, and antineoplastic drugs」, Murakami等, (WB Saunders: Philadelphia, 1995)、特に１３頁に見出すことができる。

「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化合物である。化学療法剤の例には、チオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；デルタ−９−テトラヒドロカナビノール(ドロナビノール、MARINOL(登録商標)；βラパチョーネ；ラパコール；コルヒチン；ベツリン酸；カンプトテシン(合成アナログトポテカン(HYCAMTIN(登録商標)、CPT-11(イリノテカン、CAMPTOSAR(登録商標))、アセチルカンプトテシン、スコポレクチン(scopolectin)及び９−アミノカンプトテシンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；ポドフィロトキシン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；テニポシド；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照)；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ドキソルビシン(ADRIAMYCIN(登録商標)、モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、ドキソルビシンＨＣＩリポソーム注射剤(DOXIL(登録商標))及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート、ゲムシタビン(gemcitabine) (GEMZAR(登録商標))、テガフル(tegafur) (UFTORAL(登録商標))、カペシタビン(capecitabine) (XELODA(登録商標))、エポチロン(epothilone)、及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン(ELDISINE(登録商標)、FILDESIN(登録商標))；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；チオテパ；タキソイド類、例えばパクリタキセル(TAXOL(登録商標))、パクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(ABRAXANE^TM)、及びドキセタキセル(TAXOTERE(登録商標))；クロランブシル；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン(VELBAN(登録商標))；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン(ONCOVIN(登録商標))；オキサリプラチン；ロイコボビン(leucovovin)；ビノレルビン(ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ(登録商標))；ノバントロン(novantrone)；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；イバンドロナート(ibandronate)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；上述したもののいずれかの薬学的に許容可能な塩類、酸類又は誘導体：並びに上記のうち２以上の組み合わせ、例えば、シクロフォスファミド、ドキソルビシン、ビンクリスチン、及びプレドニソロン併用療法の略称であるＣＨＯＰ、及び５-ＦＵ及びロイコボビン(leucovovin)とオキサリプラチン(ELOXATIN^TM)を組み合わせた治療法の略称であるFOLFOXが含まれる。

またこの定義に含まれるものには、癌の増殖を助けるホルモンの作用を調節、低減、遮断又は阻害するように働き、多くの場合全身処置の形態で使用される抗ホルモン剤がある。それらはそれ自体がホルモンであってもよい。それらは例えば抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ(ＳＥＲＭ)を含み、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)(EVISTA(登録商標))、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びトレミフェン(FARESTON(登録商標))；抗プロゲステロン；エストロゲンレセプター下方調節剤(ERD)；卵巣を抑止又は停止させる機能がある作用剤、黄体形成ホルモン放出ホルモン(LHRH)アゴニスト、例えば酢酸リュープロリド(LUPRON(登録商標)及びELIGARD(登録商標))、酢酸ゴセレリン、酢酸ブセレリン及びトリプテレリン(tripterelin)；その他抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド；並びに副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、酢酸メゲストロール(MEGASE(登録商標))、エキセメスタン(AROMASIN(登録商標))、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、ボロゾール(RIVISOR(登録商標))、レトロゾール(FEMARA(登録商標))、及びアナストロゾール(ＡＲＩＭＩＤＥＸ(登録商標))である。加えて、このような化学療法剤の定義には、クロドロネート(例えばBONEFOS(登録商標)又はOSTAC(登録商標))、エチドロン酸(DIDROCAL(登録商標))、NE-58095、ゾレドロン酸／ゾレドロネート(ZOMETA(登録商標))、アレンドロネート(FOSAMAX(登録商標))、パミドロン酸(AREDIA(登録商標))、チルドロン酸(SKELID(登録商標))、又はリセドロン酸(ACTONEL(登録商標))、並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ、及び上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦ-Ｒ)；THERATOPE(登録商標)ワクチン及び遺伝子治療ワクチン等のワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)ワクチン、LEUVECTIN(登録商標)ワクチン、及びVAXID(登録商標)ワクチン；トポイソメラーゼ１阻害剤(例えばLURTOTECAN(登録商標))；ｒｍＲＨ(例えばABARELIX(登録商標))；ラパチニブ(lapatinib ditosylate)(GW572016としても知られるＥｒｂＢ-２及びＥＧＦＲ二重チロシンキナーゼ小分子阻害剤)；セレコシブ(celecoxib)などのＣＯＸ-２阻害剤(CELEBREX(登録商標)；４-(５-(４-メチルフェニル)-３-(トリフルオロメチル)-１Ｈ-ピラゾル-１-イル)ベンゼンスルホンアミド；及び上記のもののいずれかの製薬的に許容される塩類、酸類又は誘導体が含まれる。

「サイトカイン」という用語は、一つの細胞集団から放出されるタンパク質であって、他の細胞に対して細胞間メディエータとして作用するものの包括的な用語である。そのようなサイトカインの例は、リンフォカイン、モノカイン、及び伝統的なポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン、Ｎ-メチオニルヒト成長ホルモン、及びウシ成長ホルモン；副甲状腺ホルモン；チロキシン；インスリン；プロインスリン；リラクシン；プロリラクシン；卵胞刺激ホルモン(ＦＳＨ)、甲状腺刺激ホルモン(ＴＳＨ)、及び黄体形成ホルモン(ＬＨ)のような糖タンパク質ホルモン；肝増殖因子；線維芽細胞増殖因子；プロラクチン；胎盤ラクトゲン；腫瘍壊死因子-α及び-β；ミューラー阻害物質；マウス性腺刺激ホルモン関連ペプチド；インヒビン；アクチビン；血管内皮増殖因子(例えばＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ-Ｂ、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ、ＶＥＧＦ-Ｅ)；胎盤由来の増殖因子(ＰｌＧＦ)；血小板由来成長因子(ＰＤＧＦ、例えばＰＤＧＦＡ、ＰＤＧＦＢ、ＰＤＧＦＣ、ＰＤＧＦＤ)；インテグリン；トロンボポエチン(ＴＰＯ)；神経成長因子、例えばＮＧＦ-α；血小板増殖因子；ＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βのようなトランスフォーミング成長因子(ＴＧＦ)；インスリン様成長因子I及びII；エリスロポイエチン(ＥＰＯ)；オステオインダクティブ因子；インターフェロン、例えばインターフェロン−α、−β、−γ；コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、例えばマクロファージ-ＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)；顆粒球-マクロファージ-ＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)；及び顆粒球-ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)；ＩＬ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-１β、ＩＬ-２、ＩＬ-３、ＩＬ-４、ＩＬ-５、ＩＬ-６、ＩＬ-７、ＩＬ-８、ＩＬ-９、ＩＬ-１０、ＩＬ-１１、ＩＬ-１２、ＩＬ-１３、ＩＬ-１４、ＩＬ-１５、ＩＬ-１６、ＩＬ-１７、ＩＬ-１８、ＩＬ-１９、ＩＬ-２０、ＩＬ-３０のインターロイキン(ＩＬ)；セクレトグロビン／ウテログロビン；オンコスタチンＭ(ＯＳＭ)；ＴＮＦ-α又はＴＮＦ-βなどの腫瘍壊死因子；及びＬＩＦ及びキットリガンド(ＫＬ)を含む他のポリペプチド因子が含まれる。ここで使用される場合は、サイトカインなる用語は天然源由来あるいは組換え細胞培養由来のタンパク質及び天然配列サイトカインの生物的に活性な等価物を含む。

この出願で用いられる用語「プロドラッグ」は、親薬剤に比較して腫瘍細胞に対する細胞障害性が低く、酵素的に活性化又はより活性な親形態に変換される製薬的活性物質の前駆体又は誘導体形態を意味する。例えば、Wilman, 「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」, Biochemical Society Transactions, 14, :375-382, 615th Meeting, Belfast (1986)、及びStella 等, 「Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」、Directed Drug Delivery, Borchardt等(編), 247-267項, Humana Press (1985)参照。本発明のプロドラッグは、限定するものではないが、ホスファート含有プロドラッグ、チオホスファート含有プロドラッグ、スルファート含有プロドラッグ、ペプチド含有プロドラッグ、Ｄ-アミノ酸修飾プロドラッグ、グリコシル化プロドラッグ、β-ラクタム含有プロドラッグ、任意に置換されたフェノキシアセトアミド含有プロドラッグ又は任意に置換されたフェニルアセトアミド含有プロドラッグ、より活性のある細胞毒のない薬剤に転換可能な５-フルオロシトシン及び他の５-フルオロウリジンプロドラッグを含む。限定はしないが、本発明で使用されるプロドラッグ形態に誘導体化可能な細胞障害性剤の例には、前記の化学療法剤が含まれる。

「血管新生因子又は薬剤」は、血管の発達を刺激する、例えば、血管新生、血管内皮細胞増殖、血管及び／又は脈管形成の安定性などを促進する増殖因子である。例えば、血管新生因子には、限定するものではないが、例えば、ＶＥＧＦ及びＶＥＧＦファミリのメンバー、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリ、線維芽細胞増殖因子ファミリ(ＦＧＦ)、ＴＩＥリガンド(アンギオポイエチン)、エフリン、ＡＮＧＰＴＬ３、ＡＮＧＰＴＬ４などが含まれる。また、創傷治癒を促す因子、例として、成長ホルモン、インスリン様成長因子-Ｉ(ＩＧＦ-Ｉ)、ＶＩＧＦ、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、ＣＴＧＦ、及びそのファミリのメンバー、及びＴＧＦ-α及びＴＧＦ-βが含まれる。例としてKlagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)；Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)；Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)；Tonini等, Oncogene, 22:6549-6556 (2003)(例えば、血管新生因子を列挙する表１)；及びSato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)を参照。
「抗血管新生剤」又は「血管新生インヒビター」は、小分子量物質、ポリヌクレオチド、ポリペプチド、単離されたタンパク質、組換えタンパク質、抗体、又はこれらのコンジュゲートないし融合タンパク質を指し、直接又は間接的に、血管新生、脈管形成又は望ましくない血管透過を阻害するものである。例えば、抗血管新生剤は、上記に定義するように、血管新生剤に対する抗体又は他のアンタゴニスト、例えばＶＥＧＦに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターに対する抗体、ＶＥＧＦレセプターシグナル伝達を遮断する小分子(例えばＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８、ＳＵＴＥＮＴ／ＳＵ１１２４８(リンゴ酸スニチニブ)、ＡＭＧ７０６)である。また抗血管新生剤には、天然の血管新生インヒビター、例えばアンジオスタチン、エンドスタチンなどが含まれる。例としてKlagsbrun and D'Amore, Annu. Rev. Physiol., 53:217-39 (1991)；Streit and Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003)(例えば、悪性メラノーマの抗血管新生療法を列挙する表３)；Ferrara & Alitalo, Nature Medicine 5(12): 1359-1364 (1999)；Tonini等, Oncogene, 22:6549-6556 (2003)(例えば、抗血管新生因子を列挙する表２)；及び、Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)(例えば、臨床試験で用いられる抗血管新生剤を挙げる表１)を参照。

本明細書中で用いる「免疫抑制剤」なる用語は、本明細書において治療される哺乳動物の免疫系を抑制するか又は隠すために作用する物質を指す。これには、サイトカイン産生を抑制する物質、自己抗原発現を下方制御は又は抑制する物質、又は、ＭＨＣ抗原をマスキングする物質が含まれる。このような薬剤の例には、２-アミノ-６-アリル-５-置換ピリミジン(米国特許第４６６５０７７号を参照)；非ステロイド性抗炎症薬(ＮＳＡＩＤ)；ガンシクロビル、タクロリムス、糖質コルチコイド、例として、コルチゾール又はアルドステロン、抗炎症剤、例として、シクロオキシゲナーゼインヒビター、５-リポキシゲナーゼインヒビター又はロイコトリエンレセプターアンタゴニスト；プリンアンタゴニスト、例として、アザチオプリン又はミコフェノール酸モフェチル(ＭＭＦ)；アルキル化剤、例として、シクロホスファミド；ブロモクリプチン；ダナゾール；ダプソン；グルタールアルデヒド(ＭＨＣ抗原をマスキングするもの、米国特許第４１２０６４９号に記載)；ＭＨＣ抗原及びＭＨＣ断片に対する抗イディオタイプ抗体；シクロスポリンＡ；ステロイド、例として、副腎皮質ステロイド又は糖質副腎皮質ステロイド又は糖質コルチコイド類似体、例えばプレドニゾン、メチルプレドニゾロン及びデキサメサゾン；ジヒドロ葉酸レダクターゼインヒビター、例えばメトトレキセート(経口又は皮下)；ヒドロキシクロロキン；スルファサラジン；レフルノミド；サイトカインないしはサイトカインレセプター抗体、例えば抗インターフェロン-α、-β又は-γ抗体、抗腫瘍壊死因子-α抗体(インフリキシマブ又はアダリムマブ)、抗ＴＮＦ-αイムノアドヘシン(エタネルセプト)、抗腫瘍壊死因子-β抗体、抗インターロイキン２抗体及び抗ＩＬ-２レセプター抗体；抗ＣＤ１１ａ及び抗ＣＤ１８抗体を含む抗ＬＦＡ-１抗体；抗Ｌ３Ｔ４抗体；異種性の抗リンパ球グロブリン；パン-Ｔ抗体、好ましくは抗ＣＤ３又は抗ＣＤ４／ＣＤ４ａ抗体；ＬＦＡ-３結合ドメインを含む可溶性ペプチド(１９９０年７月２６日に発行の国際公開第１９９０／０８１８７号)；ストレプトキナーゼ；ＴＧＦ-β；ストレプトドルナーゼ；宿主のＲＮＡ又はＤＮＡ；ＦＫ５０６；ＲＳ-６１４４３；デオキシスペルグアリン；ラパマイシン；Ｔ細胞レセプター(Cohen等、米国特許第５１１４７２１号)；Ｔ細胞レセプター断片(Offner等, Science, 251: 430-432 (1991)；国際公開第１９９０／１１２９４号；Ianeway, Nature, 341: 482 (1989)；及び国際公開第１９９１／０１１３３号)；及び、Ｔ細胞レセプター抗体(欧州特許第３４０１０９号)、例えばＴ１０Ｂ９が含まれる。
「非ステロイド系抗炎症薬」又は「ＮＳＡＩＤ」の例は、アセチルサリチル酸、イブプロフェン、ナプロキセン、インドメタシン、スリンダク、トルメチン、これらの塩類及び誘導体などが含まれる。

ここで使用される「標識」なる語句は、ポリペプチドに直接的に又は間接的に抱合した検出可能な化合物又は組成物を意味する。標識はそれ自体が検出可能(例えば、放射性標識又は蛍光標識)であり得、あるいは酵素標識の場合には、検出可能な基質化合物又は組成物の化学変化を触媒しうる。
「単離された」核酸分子は、同定され、ポリペプチド核酸の天然源に通常付随している少なくとも一の汚染核酸分子から分離された核酸分子である。単離された核酸分子は、天然に見出される形態あるいは設定以外のものである。故に、単離された核酸分子は、天然の細胞中に存在する核酸分子とは区別される。しかし、単離された核酸分子は、例えば、核酸分子が天然の細胞のものとは異なった染色体位置にあるポリペプチドを通常発現する細胞に含まれる核酸分子を含む。

耐性腫瘍
本発明は、少なくともＶＥＧＦアンタゴニストを含有する、癌治療に対して腫瘍の耐性を引き起こす細胞性事象及び分子事象の発見にある程度基づくものである。造血性骨髄由来細胞の動員と抗ＶＥＧＦ治療に対する腫瘍耐性の発達との間の相関性は、本明細書において示す。
免疫系には、赤血球、リンパ球及び骨髄系統の細胞を含む造血細胞が含まれる。これら細胞種のすべては同じ多能性幹細胞から生じる。成体では、幹細胞がまれにより多くの幹細胞(自己複製)と様々な関係する始原細胞を産生するように分化しうる骨髄で造血発生が起こる。特定の調節因子に応答して造血細胞を生産するのが関係する始原細胞である。これらの調整因子は、主に周囲の間質細胞によって、そして他の組織において生産され、例えば、コロニー刺激因子(ＣＳＦ)、エリスロポイエチン(ＥＰＯ)、インターロイキン３(ＩＬ３)、顆粒球／マクロファージＣＳＦ(ＧＭ-ＣＳＦ)、顆粒球ＣＳＦ(Ｇ-ＣＳＦ)、マクロファージＣＳＦ(Ｍ-ＣＳＦ)及びＳＴＥＥＬ因子が含まれる。癌患者の免疫系の変更は、癌に対する攻撃を上手く増加させる免疫系の能力の低下又は無能力化に寄与し、それによって腫瘍増殖の進行を促すと考えられている。例として、Gabrilovich等, Antibodies to Vascular Endothelial Growth Factor Enhances the Efficacy of Cancer Immunotherapy by Improving Endogenous Dendritic Cell Function, Clinical Cancer Research 5:2963-2970 (1999)を参照。

腫瘍によって生産される因子は、異常な骨髄造血を引き起こし、腫瘍に対する免疫応答の抑制を引き起こしうる。例として、Kusmartsev and Gabrilovich, Immature myeloid cells and cancer-associated immune suppression. Caner Immunol Immunothera. 51:293-298 (2002)を参照。本発明は、ＶＥＧＦアンタゴニスト治療に耐性がある腫瘍に関与しうる腫瘍耐性細胞及びＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の特定の因子を提供する。例えば、耐性腫瘍の塩分画によっても、耐性を直接又は間接的に与える因子が生じた。例えば本明細書中の図８及び実施例２を参照。ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄性細胞の動員及び活性化は、抗ＶＥＧＦ治療に対する耐性の発達において２つの工程を表しうる。
また、本発明は、抗ＶＥＧＦと本明細書中に記載の骨髄性細胞を標的とする薬剤及び化学療法剤を使用する併用治療方法及び組成物を提供する。これらの併用治療は腫瘍血管新生及び増殖を抑制し、及び／又は抗ＶＥＧＦ耐性の発症を遅らせうる。

ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞
ＣＤ１１／ＣＤ１８ファミリは、構造的及び遺伝的に、細胞接着相互作用を調整するレセプターのより大きなインテグリンファミリに関連がある。このインテグリンファミリには、胚発生、細胞外基質に対する接着、及び細胞分化が含まれる(Hynes, R. O., Cell 48: 549-554 (1987); Kishimoto等, Adv. Immunol. 46: 149-182 (1989)；Kishimoto等, Cell 48: 681-690 (1987)；及び、Ruoslahti等, Science 238: 491-497 (1987))。インテグリンは、βサブユニットと非共有結合したαサブユニットを含む膜貫通ヘテロダイマーのクラスである。βサブユニットは通常、複数のαサブユニットと結合することができ、共通のβサブユニットを有するヘテロダイマーはインテグリン集団内のサブファミリとして分類されている(Larson and Springer, Structure and function of leukocyte integrins, Immunol. Rev. 114: 181-217 (1990))。
ＣＤ１１／ＣＤ１８ファミリのインテグリン分子及びそれらの細胞性リガンドは、特に炎症において様々な細胞間相互作用を媒介することが明らかとされている。これらのタンパク質は、免疫系の接着機能に重要であることが示されている(Kishimoto等, Adv. Immunol. 46: 149-182 (1989))。ＬＦＡ-１に対するモノクローナル抗体は、内皮細胞への白血球の接着を遮断すること(Dustin等, J. Cell. Biol. 107: 321-331 (1988)；Smith等, J. Clin. Invest. 83: 2008-2017 (1989))及びＴ細胞活性化を阻害すること(Kuypers等, Res. Immunol., 140: 461 (1989))、抗原特異的ＣＴＬ殺傷(Kishimoto等, Adv. Immunol. 46: 149-182 (1989))、Ｔ細胞増殖(Davignon等, J. Immunol. 127: 590-595 (1981))及びＮＫ細胞殺傷(Krensky等, J. Immunol. 131: 611-616 (1983))に必要とされる形態をコンジュゲートすることが示されている。

接着レセプター分子のＣＤ１１／ＣＤ１８ファミリは、４つの非常に関連した細胞表面糖タンパク質；ＬＦＡ-１(ＣＤ１１ａ／ＣＤ１８)、Ｍａｃ-１(ＣＤ１１ｂ／ＣＤ１８) ｐ１５０.９５(ＣＤ１１ｃ／ＣＤ１８)、及び(ＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８)を含む。各々これらのヘテロダイマーは、特有のα-鎖(ＣＤ１１ａ、ｂ、ｃ又はｄ)及び変化しないβ-鎖(ＣＤ１８)を有する。白血球上に位置するＣＤ１８インテグリンは、血管内皮細胞及び他の細胞上に発現することによって白血球接着と経内皮移動を媒介する細胞内接着分子-１(ＩＣＡＭ-１)に結合しうる。ＬＦＡ-１は、マクロファージのサブセットを除き、すべての成熟白血球の表面上に存在し、主なリンパ系インテグリンと考えられている。Ｍａｃ-１、ｐ１５０.９５及びＣＤ１１ｄ／ＣＤ１８の発現は、好中球、単球、マクロファージ及びマスト細胞を含む骨髄系統の細胞に主に限定される。ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋は、骨髄性細胞上にも見られるマーカーである。成熟及び未成熟の骨髄性細胞のバランスは癌の徴候であり、進行性腫瘍増殖においてはこのバランスは未成熟骨髄性細胞に対して変化し、樹状細胞の機能が減少する。例として、Kusmartsev and Gabrilovich, Immature myeloid cells and cancer-associated immune suppression. Caner Immunol Immunothera. 51:293-298 (2002)を参照。例えば、腫瘍を有するマウスの未成熟骨髄性細胞を分化することによってバランス変化させることによって、癌ワクチンの作用が向上した。Kusmartsev等, All-trans-Retinoic Acid Eliminates Immature Myeloid Cells from Tumor-bearing Mice and Improves the Effect of Vaccination. Cancer Research 63:4441-4449 (2003)を参照。また、癌患者では、循環中のＶＥＧＦのレベルは未成熟骨髄性細胞の数の増加に相関することが観察された。Almand等, Clinical significance of defective dendritic cells differentiation in cancer. Clin. Cancer Res. 6: 1755 (2000)を参照。
ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄性細胞の動員及び活性化によって抗ＶＥＧＦ治療に対する耐性が生じうることを本明細書中に示す。また、腫瘍を有するマウスから単離した骨髄由来のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄性細胞が、抗ＶＥＧＦ治療に対して腫瘍に耐性を与え、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の移動を促した(抗ＶＥＧＦ感受性でなく)抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍の条件培地にも耐性を与えうることを示す。

診断法
また、本発明は、ＶＥＧＦアンタゴニスト治療に耐性がある腫瘍を診断するための方法及び組成物を提供する。本発明のある実施態様では、本発明の方法は、試験及び参照細胞群における一又は複数のＣＤ１１ｂ＋Ｇｔ１＋又は腫瘍耐性核酸の発現のレベルを比較する。当分野で公知の核酸検出方法とともに、本明細書中で開示した配列情報によって様々な開示した転写物の検出と比較が可能となる。他の実施態様では、本発明の方法は、参照脾臓サイズと比較して耐性腫瘍を有する被検体の脾臓サイズを比較する。一実施態様では、参照脾臓サイズは、腫瘍がない被検体、又はＶＥＧＦアンタゴニスト治療に感受性がある被検体の脾臓サイズである。他の実施態様では、参照脾臓サイズは、腫瘍のない他の被検体の平均脾臓サイズ、又は感受性腫瘍を有する他の被検体の平均脾臓サイズである。脾臓サイズは、当分野で公知の方法、例えば、限定するものではないが、非侵襲性の画像技術、例えば超音波、超音波検査法、一次元の超音波検査法(ＵＳ)、放射性核種スキャニング、コンピューター断層装置(ＣＴ)及び磁気共鳴画像を用いて測定することができる。例として、Yang等, West J Med.; 155(1): 47-52 (1991)を参照。さらに他の実施態様では、本発明の方法は、耐性腫瘍を有する被検体の腫瘍の血管表面積を参照血管表面積と比較する。

本発明のある実施態様では、本発明は、タンパク質をコードする核酸であるか又はそのタンパク質である分子の一又は複数を発現することができる少なくとも一の細胞を含む試験細胞群を準備することを含み、このときのタンパク質はＧｒ１、好中球エラスターゼ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ及び／又はＤＲＲＴＰである。「発現することができる」とは、遺伝子が細胞中に完全な形態で存在し、発現されうることを意味する。そして、存在する場合には、配列の１つ、いくつか又はすべての発現を検出し、測定する。公知の配列についてのデータベースエントリー及びチップ製造業者によって提供される配列情報を用いて、(発現されている場合には)配列を検出し、当分野の技術者のうちの１人に周知の技術を用いて測定されうる。例えば、Ｇｒ１、好中球エラスターゼ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ又はＤＲＲＴＰをコードする核酸に対応する配列データベースエントリー内の配列を用いて、例えばノーザンブロットハイブリダイゼーション分析又は特定の核酸配列を特異的、好適に、量的に増幅する方法において対応するＲＮＡ配列を検出するためのプローブを構築することができる。他の例として、前記配列を用いて、例えば逆転写ベースのポリメラーゼ連鎖反応などの増幅をベースとする検出方法において、Ｇｒ１、好中球エラスターゼ、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ又はＤＲＲＴＰ配列をコードする核酸を特異的に増幅するためのプライマーを構築することができる。遺伝子発現の変更が遺伝子増幅又は欠失と関係する場合、試験及び参照群の配列の比較は、試験及び参照の細胞群において試験したＤＮＡ配列の相対的な量を比較することによって行うことができる。

また、発現はタンパク質のレベルで、すなわち、本明細書中に記載の遺伝子産物によってコードされるポリペプチドのレベルを測定することによって、測定されうる。このような方法は当分野で周知であり、例えば該遺伝子によってコードされるタンパク質に対する抗体をベースとした免疫アッセイが含まれる。次いで、試験細胞群におけるＧｒｌ、好中球エラスターゼ、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ又はＤＲＲＴＰ配列の一又は複数の発現レベルを、参照細胞群の一又は複数の細胞の配列の発現レベルと比較する。試験及びコントロールの細胞群における配列の発現は、核酸配列の発現を比較するための任意の当分野で認められる方法を用いて比較することができる。例えば、米国特許第５８７１６９７号及びShimkets等, Nat. Biotechnol. 17:798-803に記載のGENECALLING.RTM.法を用いて比較することができる。本発明のある実施態様では、Ｇｒｌ、好中球エラスターゼ、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ及び／又はＤＲＲＴＰをコードする配列の１、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１１以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、２０以上、２５以上、又はすべての発現が測定される。
参照細胞群には、測定されたＧｒ１、好中球エラスターゼ、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ又はＤＲＲＴＰ配列を発現することができる一又は複数の細胞が含まれ、この比較したパラメーターが例えばＶＥＧＦアンタゴニストに対する腫瘍感受性などの既知なものである。本発明のある実施態様では、試験細胞群におけるＧｒ１、好中球エラスターゼ、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ又はＤＲＲＴＰ配列は、その発現レベルが参照細胞群におけるＧｒ１、好中球エラスターゼ、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１ α、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ又はＤＲＲＴＰ転写産物のレベルの２．０倍ないしはそれより少ない範囲内で変化する場合に、参照細胞群におけるＧｒ１、好中球エラスターゼ、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１ α、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ又はＤＲＲＴＰ配列の発現レベルに対して比較可能な発現レベルであるとみなす。様々な実施態様では、試験細胞群におけるＧｒ１、好中球エラスターゼ、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ又はＤＲＲＴＰ配列は、その発現レベルが参照細胞群における対応するＧｒ１、好中球エラスターゼ、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ又はＤＲＲＴＰ配列の発現レベルの２．０倍以上参照細胞群から異なる場合に、発現レベルが変更しているとみなすことができる。

場合によって、試験細胞群と参照細胞群との間の差次的に発現する配列の比較は、発現が測定するパラメーターや条件に依存しないコントロール核酸に関して行ってもよい。試験及び参照核酸配列におけるコントロール核酸の発現レベルは、比較する細胞群におけるシグナルレベルを規準化するために用いてもよい。好適なコントロール核酸は当業者によって容易に決定することができる。
試験細胞群は、任意の数の細胞、すなわち一又は複数の細胞であってもよく、インビトロ、インビボ又はエクスビボで準備されてもよい。
ある実施態様では、参照細胞群の細胞は、できる限り試験細胞、例えば腫瘍細胞と同種の組織種類から得る。いくつかの実施態様では、コントロール細胞は、試験細胞と同じ被検体から、例えば試験細胞の元の領域に近い領域から、又は被検体がＶＥＧＦアンタゴニスト治療に感受性であった時期から得る。本発明の一実施態様では、参照細胞群は複数の細胞から得られる。例えば、参照細胞群は、ＶＥＧＦアンタゴニストによる治療に感受性がある腫瘍であることが既知の既に試験した細胞から得た発現パターンのデータベースであってもよい。

腫瘍感受性を評価すること
ＣＤ１１ｂ＋ＧＲ１＋骨髄性細胞の動員、及び本明細書中に記載したＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ又はＤＲＲＴＰ配列のいくつかの発現は、ＶＥＧＦアンタゴニスト治療に対する腫瘍耐性と相関する。ゆえに、一態様では、本発明は、被検体のＶＥＧＦアンタゴニスト感受性を評価する方法を提供するものであって、ここでＶＥＧＦアンタゴニスト感受性は抗ＶＥＧＦによる腫瘍の治療能を指す。本発明の一実施態様では、ある方法は、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ又はＤＲＲＴＰをコードする核酸に相同な一又は複数の核酸配列を発現することができる細胞を含む、被検体から一又は複数の試験細胞群を準備することを含む。前記配列の発現は参照細胞群と比較する。参照細胞群における細胞のＶＥＧＦアンタゴニスト感受性状態が既知である限り、いずれの参照細胞群が使われてもよい。同時又は時間的に異なる時に測定された試験試料及び参照試料に対して比較を行ってもよい。例えば、後者の例では、コンパイルした発現情報、例えば感受性状態が既知となっている細胞における既知の配列の発現レベルについての情報を集積した配列データベースが用いられる。本発明のある実施態様では、参照細胞群は、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄性細胞についてエンリッチ(enrich)されている。本発明のある実施態様では、参照細胞群は腫瘍細胞についてエンリッチされている。

診断用又はマーカーセット
また、本発明は、耐性腫瘍を識別するためのマーカーセットを提供する。ある実施態様では、これらのマーカーセットは、ＶＥＧＦアンタゴニスト治療に対する腫瘍感受性又は耐性を評価するためのキットとして提供される。例えば、マーカーセットには、２以上、３以上、４以上、５以上、６以上、７以上、８以上、９以上、１０以上、１２以上、１３以上、１４以上、１５以上、２０以上、又はすべての分子セットが含まれる。前記分子は、タンパク質又は発現及び／又は活性が変更しているタンパク質をコードする核酸であり、Ｎｏｔｃｈ２、ＤＭＤ８、ＭＣＰ-１、ＩＴＧＢ７、Ｇ-ＣＳＦ、ＩＬ-８Ｒ、ＭＩＰ２、ＭＳＣＡ、ＧＭ-ＣＳＦ、ＩＬ-１Ｒ、Ｍｅｇ-ＳＦ、ＨＳＰ１Ａ、ＩＬ-１Ｒ、Ｇ-ＣＳＦＲ、ＩＬ１０-Ｒ１、Ｅｒｂ-２.１、カベオリン３、Ｓｅｍｃａｐ３、ＩＮＴＧ４、ＴＨＢＳＰ-４、ＥｒｂＢ３、ＪＡＭ、Ｅｎｇ、ＪＡＭ、Ｅｎｇ、ＪＡＭ-２、Ｐｅｃａｍ１、Ｔｌｒ３、好中球エラスターゼ、ＣＤ１４、ｅｘｐｉ、Ｉｌ-１３Ｒ、ＬＤＬＲ、ＴＬＲ-１、ＲＬＦ、Ｅｎｄｏ-Ｌｉｐ、ＳＯＣＳ１３、ＦＧＦ１３、ＩＬ-４Ｒ、ＴＨＢＳ１、Ｃｒｅａ７、アクアポリン-１、ＳＣＦ３８、ＡＰＯＥ、ＦＡＢＰ、ＩＬ-１１Ｒ、ＩＬ-１ＲＩＩ、ＩＦＮＴＭ１、ＴＮＦＲＳＦ１８、ＷＮＴ５Ａ、分泌キャリア膜１、ＨＳＰ８６、ＥＧＦＲ、ＥｐｈＲＢ２、ＧＰＣＲ２５、ＨＧＦ、アンギオポエチン様-６、Ｅｐｈ-ＲＡ７、セマフォリンＶｌｂ、ニュートロフィン５、クローディン-１８、ＭＤＣ１５、ＥＣＭ、ＡＤＡＭＴＳ７Ｂ、ＮＣＡＭ-１４０、フィブロネクチンタイプＩＩＩ、ＷＩＰ、ＣＤ７４、ＩＣＡＭ-２、Ｊａｇｇｅｄ１、ｌｔｇａ４、ＩＴＧＢ７、ＴＧＦ-ＢＩＩ-Ｒ、ＴＧＦｂＩＥＰ、Ｓｍａｄ４、ＢＭＰＲ１Ａ、ＣＤ８３、Ｄｅｃｔｉｎ-１、ＣＤ４８、Ｅ-セレクチン、ＩＬ-１５、サイトカインシグナル伝達４のサプレッサー、Ｃｙｔｏｒ４、ＣＸ３ＣＲ１、ＩＧＦ２、ＨＳＰ９Ａ、ＦＧＦ１８、ＥＬＭ１、Ｌｅｄｇｆａ、スカベンジャーレセプタータイプＡ、マクロファージＣタイプレクチン、Ｐｉｇｒ３、マクロファージＳＲＴ-１、Ｇプロテイン結合レセプター、ＳｃｙＡ７、ＩＬ-１Ｒ２、ＩＬ-１誘導型タンパク質、ＩＬ-１β、ＩＬＩＸ前駆物質、ＴＧＦ-Ｂ、ＦＩＺＺ１、Ｗｆｓ１、ＴＰ１４Ａ、ＥＭＡＰ、ＳＵＬＦ-２、細胞外基質２、ＣＴＦＧ、ＴＦＰＩ、ＸＣＰ２、Ｒａｍｐ２、ＲＯＲ-α、エフリンＢ１、ＳＰＡＲＣ-様１及びセマフォリンＡから選択される。本発明の一実施態様では、タンパク質を検出する抗体が提供される。一実施態様では、前記分子は、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞から得られ、例えば、ＩＬ-１３Ｒ、ＴＬＲ-１、Ｅｎｄｏ-Ｌｉｐ、ＦＧＦ１３、ＩＬ-４Ｒ、ＴＨＢＳ１及びＣｒｅａ７を含む。他の実施態様では、前記分子は、耐性腫瘍から得られ、例えば、ＭＳＣＡ、ＭＩＰ２、ＩＬ-８Ｒ、Ｇ-ＣＳＦ、ＩＬ１０-Ｒ２、ＴＨＢＳＰ-４及びＪＡＭ-２を含む。

モジュレーター及びその使用
ＶＥＧＦ、Ｇｒ１、好中球エラスターゼ、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ及びＤＲＴＲＰのモジュレーターは、これらタンパク質の活性を調節する分子、例えばアゴニスト及びアンタゴニストである。「アゴニスト」なる用語は、アゴニストシグナルを与えることができる限りにおける、本発明のタンパク質のペプチド及び非ペプチドアナログ、及び本発明のタンパク質を特異的に結合する抗体を指す。「アゴニスト」なる用語は、タンパク質の生物学的役割に関して定義される。ある実施態様では、アゴニストは、本発明の天然タンパク質、例えばＶＥＧＦの生物学的活性を有する。「アンタゴニスト」なる用語は、本発明のタンパク質の生物学的活性の阻害能を有する分子を指すために用いる。アンタゴニストは、例えばタンパク質の活性を阻害することによって評価されてもよい。

治療上の使用
本発明に係る、ＶＥＧＦアンタゴニスト、骨髄性細胞減少薬剤、及び他の治療上の薬剤を含むモジュレーターの組合せを用いて、様々な新生物ないし非新生物の状態を治療することができることを考慮する。一実施態様では、モジュレーター、例えばＶＥＧＦのアンタゴニスト、骨髄性細胞減少薬剤、ＵＲＣＧＰ及びＵＲＲＴＰのアンタゴニスト(「本発明のアンタゴニスト)が、癌細胞又は耐性腫瘍の腫瘍増殖の阻害に使われる。本発明のある実施態様では、モジュレーター、例えばＤＲＣＧＰ及びＤＲＲＴＰのアゴニスト(「本発明のアゴニスト)を用いて、癌細胞又は腫瘍増殖を阻害するために用いる。また、本発明に係る、本発明のアンタゴニストを用いて、腫瘍の転移を阻害することもできることを考慮する。ある実施態様では、一又は複数の抗癌剤は、本発明のアンタゴニスト、及び／又は癌細胞ないしは腫瘍増殖を阻害する本発明のアゴニストとともに投与されてもよい。また、本明細書中で併用療法と題したセクションを参照のこと。治療する新生物性疾患の例には、限定するものではないが、「癌」及び「癌性」なる用語で本明細書中に記載したものが含まれる。本発明のアンタゴニストによる治療に影響を受けやすい非新生物性状態には、限定するものではないが、望ましくない又は異常な肥大、関節炎、関節リウマチ(ＲＡ)、乾癬、乾癬のプラーク、サルコイドーシス、アテローム性動脈硬化、アテローム硬化性プラーク、心筋梗塞による浮腫、糖尿病及び他の増殖性網膜症、例えば未熟児の網膜症、水晶体後繊維増殖、血管新生緑内障、加齢性黄斑変性、糖尿病性黄斑浮腫、角膜血管新生、角膜移植片血管新生、角膜移植片拒絶、網膜／脈絡叢血管新生、アングル(angle)の血管新生(ルベオーシス)、眼性新生血管疾患、血管性再狭窄、動静脈奇形(ＡＶＭ)、髄膜腫、血管腫、血管線維腫、甲状腺の過形成(グレーブス病を含む)、角膜及び他の組織移植、慢性炎症、肺炎症、急性の肺損傷／ＡＲＤＳ、敗血症、原発性肺高血圧症、悪性の肺滲出、大脳浮腫(例えば、急性の脳卒中／非開放性頭部損傷／外傷と関係する)、滑液炎症、ＲＡのパンヌス形成、骨化性筋炎、肥大型骨形成、骨関節炎(ＯＡ)、抵抗性腹水、多嚢胞性卵巣疾患、子宮内膜症、第３スペーシングの体液疾患(膵炎、コンパートメント症候群、熱傷、腸疾患)、子宮類線維腫、早産、慢性炎症、例としてＩＢＤ(クローン病及び潰瘍性大腸炎)、腎臓同種異系移植片拒絶反応、炎症性腸疾患、ネフローゼ症候群、望ましくない又は異常な組織塊成長(非癌)、肥満、脂肪組織質量成長、血友病関節、肥大した瘢痕、体毛成長の阻害、オスラー-ウェーバー症候群、化膿肉芽腫水晶体後繊維増殖、強皮症、トラコーマ、血管癒着、関節滑膜炎、皮膚炎、子癇前症、腹水、心嚢貯留液(心外膜炎と関係するものなど)及び胸水貯留が含まれる。

併用療法
上記のように、本発明は、ＶＥＧＦアンタゴニストが他の療法と組み合わされて投与される併用療法を提供する。例えば、ＶＥＧＦアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ治療に耐性がある腫瘍を治療するために本発明のアンタゴニスト又は異なる薬剤(及び／又は本発明のアゴニスト)と組み合わされて投与される。ある実施態様では、付加的な薬剤、例えば骨髄性細胞減少薬剤、抗癌剤ないし療法、抗血管新生剤、又は抗脈管新生療法が、様々な腫瘍性又は非腫瘍性の症状を治療するために、本発明の抗ＶＥＧＦ及び異なるアンタゴニストと組み合わされて投与されうる。一実施態様では、腫瘍性又は非腫瘍性の症状は、ＶＥＧＦアンタゴニスト治療に耐性がある異常ないしは望ましくない血管新生に関連する病的状態に特徴がある。抗エフリンＢ２抗体は、同じ組成物中で又は別々の組成物として、これらの目的のために有効である他の薬剤と組み合わせて、又は連続的に投与されうる。あるいは又はさらに、本発明の複数のアンタゴニスト、薬剤及び／又はアゴニストが投与されうる。
本発明のアンタゴニスト及び／又は薬剤、例えば骨髄性細胞減少薬剤の投与は、例えば単一の組成物として、又は、２以上の異なる組成物として、同じないしは異なる投与経路を使用して、同時になされうる。あるいは又はさらに、前記投与はいずれかの順序で経時的になされうる。ある実施態様では、２以上の組成物の投与の間には数分から数日、数週から数か月の範囲の間隔がありうる。例えば、ＶＥＧＦアンタゴニストがまず投与され、その後本発明の(ＶＥＧＦアンタゴニスト以外の)異なるアンタゴニストないしは薬剤、例えば骨髄性細胞減少薬剤が投与されてもよい。しかしながら、本発明の異なるアンタゴニストないしは薬剤の同時投与又は第一投与も考慮される。

ＶＥＧＦアンタゴニストと組み合わせて投与される治療薬の有効量は医師又は獣医の裁量である。治療される症状を最大限管理するために用量投与及び調整がなされる。用量は、さらに、使用される治療薬の種類及び治療される特定の患者などの因子に依存するであろう。ＶＥＧＦアンタゴニストの好適な用量は現在用いられているものであり、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び本発明の異なるアンタゴニストの組合せ作用(相乗作用)のために低くてもよい。ある実施態様では、阻害薬の組合せは単一の阻害薬の有効性を増強する。「増強」なる用語は、その一般的又は認可された用量での治療薬の有効性の改善を指す。本明細書中の「製薬的組成物」と題した項目も参照のこと。
癌との関連の抗血管新生療法は、腫瘍増殖を支える栄養分の供給に必要な腫瘍血管の発達を阻害することを目的とした癌治療方略である。血管新生が原発性腫瘍増殖と転移の療法に伴うので、本発明によって提供される抗血管新生療法は、原発部位での腫瘍の新生物性増殖の阻害と二次部位での腫瘍の転移の予防が可能であり、ゆえに他の療法によって腫瘍の攻撃がなされる。本発明の一実施態様では、抗癌剤又は膠癌療法は抗血管新生剤である。他の実施態様では、抗癌剤は化学療法剤である。

多くの抗血管新生剤が同定されており、当分野で公知であり、本明細書中に挙げるもの、例えば定義の項目に挙げるもの、例えばCarmeliet and Jain, Nature 407:249-257 (2000)；Ferrara等, Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004)；及びSato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003)に挙げるものなどがある。また、米国特許公開第２００３００５５００６号を参照。ある実施態様では、本発明のアンタゴニストは、抗ＶＥＧＦ中和抗体(又は断片)及び／又は他のＶＥＧＦアンタゴニストないしはＶＥＧＦレセプターアンタゴニスト、例として、限定するものではないが、例えば、可溶性ＶＥＧＦレセプター(例えば、ＶＥＧＦＲ-１、ＶＥＧＦＲ-２、ＶＥＧＦＲ-３、ニューロピリン(例えば、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２))断片、ＶＥＧＦないしはＶＥＧＦＲを遮断することができるアプタマー、中和抗ＶＥＧＦＲ抗体、ＶＥＧＦＲチロシンキナーゼ(ＲＴＫ)の低分子量インヒビター、ＶＥＧＦのアンチセンス方略、ＶＥＧＦないしはＶＥＧＦレセプターに対するリボザイム、ＶＥＧＦのアンタゴニスト変異体、及びこれらのいずれかの組み合わせと組み合わせて用いられる。あるいは又はさらに、２つ以上の血管新生インヒビターは、場合によってＶＥＧＦアンタゴニストと本発明の他の薬剤に加えて患者に同時に投与されてもよい。ある実施態様では、一又は複数の更なる治療薬、例えば抗癌剤は、本発明の薬剤、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は抗血管新生剤と組み合わせて投与されてもよい。
本発明のある態様では、本発明のアンタゴニストによる併用腫瘍療法に有用な他の治療剤には、他の癌療法(例えば、外科的治療、放射線処置(例えば、放射活性物質の照射又は投与を伴う)、化学療法、本明細書中に挙げる抗癌剤及び当分野で公知の抗癌剤、又はこれらの組み合わせ)が含まれる。あるいは又はさらに、本明細書中に開示した同じ又は２以上の異なる抗原を結合する２以上の抗体が患者に同時に投与されてもよい。また、患者に一又は複数のサイトカインを投与することが有益であることもある。

化学療法剤
ある態様では、本発明は、有効量のＶＥＧＦのアンタゴニスト及び本発明のアンタゴニストと一又は複数の化学療法剤を、癌に罹りやすい患者又は癌と診断された患者に投与することによって、耐性腫瘍増殖又は癌細胞の増殖を遮断する又は低減する方法を提供する。様々な化学療法剤が本発明の併用治療方法で用いられてもよい。考慮する化学療法剤の例示的及び非限定的リストを本明細書中の「定義」の項目に示す。
当業者によって理解されるように、化学療法剤の適切な用量は、一般的に、化学療法剤が単独ないしは他の化学療法剤と組み合わせて投与される臨床治療に既に用いられる用量の程度であろう。用量の変更はおそらく治療する症状に応じて行うであろう。治療を行う医師は、個々の被検体ごとに適当な用量を決定することが可能であろう。

再発性腫瘍増殖
また、本発明は、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を阻害するか又は予防するための方法及び組成物を提供する。再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖は、一又は複数の現在利用可能な治療法(例えば、癌治療、例として化学療法、放射線療法、外科治療、ホルモン療法及び／又は生物学的療法／免疫療法、抗ＶＥＧＦ抗体療法、特に特定の癌のための標準的な治療投薬計画)を施されている患者ないしはこれらによって治療された患者が臨床的に治療に不十分であるか、又は患者がこのような治療からもはやいかなる有用な効果を得ておらず更なる有効な治療を求める場合の症状を表すために用いられる。本明細書中で用いるように、この表現も「非応答性／再発性の」患者の症状を指すものであり、例えば、副作用に苦しむ治療に応答する患者、耐性を生じる患者、治療に応答しない患者、治療に満足に応答しない患者などを表す。様々な実施態様では、癌は、癌細胞の数が有意に低減しなかった、又は増加した、又は腫瘍の大きさが有意に減少しなかった、又は大きくなった、又は癌細胞のサイズないしは数に何らかの減少が生じなかった、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖である。癌細胞が再発性腫瘍増殖であるか再発性癌細胞増殖であるかの決定は、文脈上で「再発」又は「難治性」又は「非応答性」の当分野で容認される意味を用いて、癌細胞に対する治療の有効性をアッセイするための当分野で公知の任意の方法によってインビトロないしはインビボでなされうる。再発性腫瘍増殖のある例は抗ＶＥＧＦ治療に耐性のある腫瘍である。

本発明は、一又は複数の本発明のアンタゴニストを投与して、被検体の再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を遮断又は低減することによって、被検体の再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を遮断又は低減する方法を提供する。ある実施態様では、アンタゴニストは癌治療剤に続いて投与されてもよい。ある実施態様では、本発明のアンタゴニストは癌療法、例えば化学療法と同時に投与される。あるいは又はさらに、アンタゴニスト療法は他の癌療法と交互に行い、いずれの順序でも実施可能である。また、本発明は、癌を有する傾向にある患者の癌の発症や再発を予防するために一又は複数の阻害性抗体を投与するための方法も包含する。通常、被検体は、癌療法を施されたか同時に施されている。一実施態様では、癌療法は、抗血管新生剤、例えばＶＥＧＦアンタゴニストによる治療である。抗血管新生剤は当分野で公知のものや本明細書中の定義の項目に見られるものなどがある。一実施態様では、抗血管新生剤は、抗ＶＥＧＦ中和抗体ないしは断片(例えば、ヒト化Ａ４.６.１、アバスチン(登録商標)(Genentech, South San Francisco, CA)、Ｙ０３１７、Ｍ４、Ｇ６、Ｂ２０、２Ｃ３など)である。例として、米国特許第６５８２９５９号、同第６８８４８７９号、同第６７０３０２０号、国際公開第９８／４５３３２号、同第９６／３００４６号、同第９４／１０２０２号、欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１、米国公開特許第２００３０２０６８９９号、同第２００３０１９０３１７号、同第２００３０２０３４０９号、同第２００５０１１２１２６号、Popkov等, Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)、及び国際公開第２００５０１２３５９号を参照。更なる薬剤は、再発性腫瘍増殖又は再発性癌細胞増殖を遮断又は低減するために、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び本発明のアンタゴニストと組み合わせて投与することができる。例として本明細書中の「併用療法」と題する項目を参照のこと。
一実施態様では、本発明のアンタゴニスト、又はＧｒ１、好中球エラスターゼ、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＵＲＣＧＰ又はＵＲＲＴＰの発現を減らす他の療法が投与され、ある生物学的(例えば、抗ＶＥＧＦ抗体であるアンタゴニスト)、ホルモン、放射線及び化学療法剤に対する癌細胞の耐性又は感受性の低下を逆転させ、それによって癌細胞を、癌を治療ないしは管理する、例えば転移を予防するために投与されうる一又は複数のこれら薬剤に再感作させる。

抗体
本発明の抗体には、本発明のタンパク質の抗体、及び本発明のタンパク質の抗体の抗体断片が含まれる。本発明のポリペプチドないしタンパク質には、限定するものではないが、ＶＥＧＦ、Ｇｒ１、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、好中球エラスターゼ、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ及びＤＲＲＴＰが含まれる。ある態様では、本発明のポリペプチドないしタンパク質は、例えば、本明細書中に示される一般的なポリペプチドないしはタンパク質の情報について、ＶＥＧＦ、Ｇｒ１、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ及びＤＲＲＴＰに対する抗体である。
さらに、本発明の抗体には、抗血管新生剤又は血管新生インヒビターである抗体、骨髄性細胞減少剤である抗体、ＶＥＧＦ、Ｇｒ１、好中球エラスターゼ、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＣＤ１１ｂ、ＣＤ１８、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ及びＤＲＲＴＰの抗体、抗癌剤である抗体又は本明細書中に記載の他の抗体が含まれる。例示的な抗体には、例えば、ポリクローナル、モノクローナル、ヒト化、断片、多特異性、ヘテロコンジュゲート、多価性、エフェクト機能などの抗体が含まれる。

ポリクローナル抗体
本発明の抗体はポリクローナル抗体を含みうる。ポリクローナル抗体の調製方法は当業者に公知である。例えば本発明の抗体に対するポリクローナル抗体は、関連する抗原とアジュバントを一又は複数回皮下(sc)又は腹腔内(ip)注射することにより、動物に産生される。それは、免疫化されるべき種において免疫原性であるタンパク質、例えば、キーホールリンペットヘモシアニン、血清アルブミン、ウシサイログロブリン、又は大豆トリプシンインヒビターへ、二重官能性又は誘導体形成剤、例えばマレイミドベンゾイルスルホスクシンイミドエステル(システイン残基を介する抱合)、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミド(リジン残基を介する抱合)、グルタルアルデヒド、及び無水コハク酸、ＳＯＣｌ_２、又はＲ及びＲ^１が異なるアルキル基であるＲ^１Ｎ＝Ｃ＝ＮＲへ、関連する抗原をコンジュゲートさせるために有用である。。
動物を、例えばタンパク質又はコンジュゲート１００μｇ又は５μｇ(それぞれウサギ又はマウスの場合)を完全フロイントアジュバント３容量と併せ、この溶液を複数部位に皮内注射することによって、本発明の分子、免疫原性コンジュゲート、又は誘導体に対して免疫する。１ヶ月後、該動物を、完全フロイントアジュバントに入れた初回量の１／５ないし１／１０のペプチド又はコンジュゲートを用いて複数部位に皮下注射することにより、追加免疫する。７ないし１４日後に動物を採血し、抗体価について血清を検定する。動物は、力価がプラトーに達するまで追加免疫する。典型的には、動物を、同じ抗原であるが異なるタンパク質にコンジュゲートさせた、及び／又は異なる架橋剤によってコンジュゲートさせたコンジュゲートにより追加免疫する。コンジュゲートはまた、タンパク融合として組換え細胞培養中で調製することができる。また、ミョウバンのような凝集化剤が、免疫反応の増強のために好適に使用される。

モノクローナル抗体
本明細書中に記載の抗原に対するモノクローナル抗体は、Kohler等, Nature, 256:495 (1975)により最初に記載されたハイブリドーマ法、又は組換えＤＮＡ法(米国特許第４８１６５６７号)によって作成することができる。
ハイブリドーマ法においては、マウス又はその他の適当な宿主動物、例えばハムスター又はマカクザルを上記のように免疫し、免疫化に用いられたタンパク質と特異的に結合する抗体を産生する、又は産生することのできるリンパ球を導き出す。別法として、リンパ球をインビトロで免疫することもできる。次いで、リンパ球をポリエチレングリコールのような適当な融合剤を用いて骨髄腫細胞と融合させ、ハイブリドーマ細胞を形成させる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。
このようにして調製されたハイブリドーマ細胞を、融合していない親の骨髄腫細胞の増殖又は生存を阻害する一又は複数の物質を典型的には含む適当な培地に蒔き、増殖させる。例えば、親の骨髄腫細胞が酵素ヒポキサンチングアニンホスホリボシルトランスフェラーゼ(ＨＧＰＲＴ又はＨＰＲＴ)を欠失するならば、ハイブリドーマのための培地は、典型的には、ＨＧＰＲＴ−欠失細胞の増殖を妨げる物質であるヒポキサンチン、アミノプテリン、及びチミジンを含有するであろう(ＨＡＴ培地)。

典型的な骨髄腫細胞は、効率的に融合し、選択された抗体産生細胞による抗体の安定な高レベルの発現を支援し、ＨＡＴ培地などの培地に対して感受性である細胞である。これらの中でも、好ましい骨髄腫株化細胞は、マウス骨髄腫ライン、例えば、ソーク・インスティテュート・セル・ディストリビューション・センター、サンディエゴ、カリフォルニア、ＵＳＡより入手し得るＭＯＰＣ-２１及びＭＰＣ-１１マウス腫瘍、及び、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション、ロックビル、メリーランド、ＵＳＡより入手し得るＳＰ-２又はＸ６３-Ａｇ８-６５３細胞から誘導されるものである。ヒト骨髄腫及びマウス−ヒトヘテロ骨髄腫株化細胞もまたヒトモノクローナル抗体の産生のために開示されている(Kozbor, J.Immunol., 133:3001 (1984)；Brodeur等, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, 51-63頁、(Marcel Dekker, Inc., New York, 1987))。
ハイブリドーマ細胞が生育している培地を、例えばＶＥＧＦ、Ｇｒ1、好中球エラスターゼ、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＣＤ11ｂ、ＣＤ18、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ又はＤＲＲＴＰ、又は血管新生分子に対するモノクローナル抗体の産生について検定する。ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体の結合特異性は、免疫沈降又はインビトロ結合検定、例えばラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)又は酵素結合免疫吸着検定(ＥＬＩＳＡ)によって測定する。このような技術及びアッセイは当分野で公知である。

例えば、モノクローナル抗体の結合親和性は、Munson and Pollard, Anal. Biochem., 107:220(1980)のスキャッチャード分析によって測定することができる。
所望の特異性、親和性、及び／又は活性な抗体を産生するハイブリドーマ細胞が確定された後、そのクローンを限界希釈法によりサブクローニングし、標準的な方法により増殖させることができる(Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, 59-103頁(Academic Press, 1986))。この目的に対して好適な培地は、例えば、Ｄ-ＭＥＭ又はＲＰＭＩ-１６４０培地を包含する。また、このハイブリドーマ細胞は、動物の腹水症腫瘍として、インビボで増殖させることができる。
サブクローンにより分泌されたモノクローナル抗体は、例えばプロテインＡ-セファロース、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、ゲル電気泳動、透析又はアフィニティクロマトグラフィーのような常套的なイムノグロブリン精製法によって、培地、腹水、又は血清から上手く分離される。また、モノクローナル抗体は、米国特許第４８１６５６７号に記載のもののような組み換えＤＮＡ法によって作製されうる。モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、常法を用いて(例えば、モノクローナル抗体の重鎖及び軽鎖をコードしている遺伝子に特異的に結合できるオリゴヌクレオチドプローブを用いることにより)即座に分離されて、配列決定される。ハイブリドーマ細胞は、このようなＤＮＡの供給源となる。ひとたび分離されたならば、ＤＮＡを発現ベクター中に入れ、ついでこれを、この状況以外ではイムノグロブリンタンパク質を産生しない大腸菌細胞、サルＣＯＳ細胞、チャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)細胞、又は骨髄腫細胞のような宿主細胞中に形質移入し、組換え宿主細胞におけるモノクローナル抗体の合成を獲得することができる。抗体の組み換え産生を以下に詳細に記載する。

他の実施態様では、抗体又は抗体断片は、McCafferty等, Nature, 348:552-554 (1990)に記載された技術を使用して産生される抗体ファージライブラリから分離することができる。Clackson等, Nature, 352:624-628 (1991)及び Marks等, J.Mol.Biol., 222:581-597 (1991)は、ファージライブラリを使用したマウス及びヒト抗体の分離を記述している。続く刊行物は、鎖シャフリングによる高親和性(ｎＭ範囲)のヒト抗体の生成(Marks等, Bio/Technology, 10:779-783[1992])、並びに非常に大きなファージライブラリを構築するための方策としてコンビナトリアル感染とインビボ組換え(Waterhouse等, Nuc.Acids.Res., 21:2265-2266[1993])を記述している。従って、これらの技術はモノクローナル抗体の分離に対する伝統的なモノクローナル抗体ハイブリドーマ法に対する実行可能な別法である。
また、ＤＮＡは、例えば、ヒト重鎖及び軽鎖定常ドメイン(Ｃ_Ｈ及びＣ_Ｌ)のコード配列を、相同的マウス配列に代えて置換することによって(米国特許第４８１６５６７号；Morrison等, Proc.Nat.Acad.Sci., USA, 81:6851(1984))、又は免疫グロブリンコード配列に非免疫グロブリンポリペプチドのコード配列の全部又は一部を共有結合させることによって修飾することができる。
典型的には、前記の非免疫グロブリンポリペプチドは、抗体の定常ドメインと置き代わることができるか、又は抗体の１つの抗原結合部位の可変ドメインが置換されて、抗原に対する特異性を有する１つの抗原結合部位と異なる抗原に対する特異性を有するもう一つの抗原結合部位とを含むキメラ二価抗体を作り出す。

ヒト及びヒト化抗体
本発明の抗体はヒト化抗体又はヒト抗体を含みうる。一般的に、ヒト化抗体には非ヒト由来の一又は複数のアミノ酸残基が導入される。これら非ヒトアミノ酸残基は、しばしば、典型的には「移入」可変ドメインから得られる「移入」残基と称される。ヒト化は基本的にウィンター(Winter)及び共同研究者［Jones等, Nature, 321:522-525 (1986)；Riechmann等, Nature, 332:323-327 (1988)；Verhoeyen等, Science, 239:1534-1536 (1988)］の方法に従って、齧歯類ＣＤＲ又はＣＤＲ配列をヒト抗体の対応する配列に置換することにより実施される。よって、このような「ヒト化」抗体は、無傷のヒト可変ドメインより実質的に少ない分が非ヒト種由来の対応する配列で置換されたキメラ抗体(米国特許第４，８１６，５６７号)である。実際には、ヒト化抗体は典型的には幾つかのＣＤＲ残基及び場合によっては幾つかのＦＲ残基が齧歯類抗体の類似する部位からの残基によって置換されたヒト抗体である。
抗原性を低減するには、ヒト化抗体を生成する際に使用するヒトの軽重両方のヒト可変ドメインの選択が非常に重要である。いわゆる「ベストフィット法」では、齧歯動物抗体の可変ドメインの配列を、既知のヒト可変ドメイン配列のライブラリ全体に対してスクリーニングする。次に齧歯動物のものと最も近いヒト配列を、ヒト化抗体のヒトフレームワーク(ＦＲ)として受け入れる(Sims等, J. Immunol., 151:2296 (1993)；Chothia等, J. Mol. Biol., 196:901(1987))。他の方法では、軽又は重鎖の特定のサブグループのヒト抗体全てのコンセンサス配列から誘導される特定のフレームワーク領域を使用する。同じフレームワークをいくつかの異なるヒト化抗体に使用できる(Carter等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992)；Presta等, J. Immunol., 151:2623(1993))。

更に、抗体を、抗原に対する高親和性や他の好ましい生物学的性質を保持してヒト化することが重要である。この目標を達成するべく、典型的な方法では、親及びヒト化配列の三次元モデルを使用して、親配列及び様々な概念的ヒト化産物の分析工程を経てヒト化抗体を調製する。三次元免疫グロブリンモデルは一般的に入手可能であり、当業者にはよく知られている。選択された候補免疫グロブリン配列の推測三次元立体配座構造を図解し、表示するコンピュータプログラムは購入可能である。これら表示を見ることで、候補免疫グロブリン配列の機能における残基のありそうな役割の分析、すなわち候補免疫グログリンの抗原との結合能力に影響を及ぼす残基の分析が可能になる。このようにして、例えば標的抗原に対する親和性が高まるといった、望ましい抗体特性が達成されるように、ＦＲ残基をレシピエント及び移入配列から選択し、組み合わせることができる。一般的に、ＣＤＲ残基は、直接かつ最も実質的に抗原結合性に影響を及ぼしている。
あるいは、現在では、免疫化することで、内因性免疫グロブリンの産生がなく、ヒト抗体の全レパートリーを産生することのできるトランスジェニック動物(例えば、マウス)を作ることが可能である。例えば、キメラ及び生殖細胞系突然変異体マウスにおける抗体重鎖結合領域(Ｊ_Ｈ)遺伝子のホモ接合体欠失によって、結果として内因性抗体産生の完全な阻害が起こることが説明されてきた。ヒト生殖系列免疫グロブリン遺伝子配列の、このような生殖細胞系突然変異体マウスへの転移によって、結果として抗原投与時にヒト抗体の産生がおこる。Jakobovits等, Proc.Natl.Acad.Sci.USA, 90:2551 (1993)；Jakobovits等, Nature 362:255-258 (1993); Bruggeman等, Year in Immuno., 7:33 (1993)；及びDuchosal等 Nature 355:258 (1992)を参照されたい。また、ヒト抗体はファージディスプレイライブラリからも得られる(Hoogenboom等, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991)；Vaughan等 Nature Biotech 14:309 (1996))。

また、ヒト抗体は、ファージディスプレイライブラリを含む当分野で公知の様々な技術を用いて産生することができる(Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks等, J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。この技術によれば、抗体Ｖドメイン遺伝子を、フレーム単位で、繊維状バクテリオファージ、例えばＭ１３又はｆｄの大きい又は小さいコートタンパク質遺伝子のどちらかでクローンし、ファージ粒子の表面で機能的抗体断片として表示させる。繊維状粒子がファージゲノムの一本鎖ＤＮＡコピーを含むので、抗体の機能特性に基づいた選択に基づいても、結果としてこれらの特性を示す抗体をコードする遺伝子の選択が成される。よって、このファージはＢ細胞のいくつかの特性を模倣している。ファージディスプレイは多様な形式で行うことができる；例えばJohnson, Kevin S. 及びChiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3：564-571(1993)を参照せよ。Ｖ-遺伝子セグメントのいくつかの供給源を、ファージディスプレイのために使用できる。例えば、Clackson等, Nature, 352：624-628(1991)は、免疫化したマウス脾臓由来のＶ遺伝子の小さいランダムなコンビナトリアルライブラリから、多様で多くの抗-オキサゾロン抗体を単離した。非免疫化ヒトドナーのＶ遺伝子のレパートリーが構成可能であり、多様で多くの抗原(自己抗原を含む)に対する抗体は、例えばMarks等, J. Mol. Biol. 222：581-597(1991)、又はGriffith等, EMBO J. 12：725-734(1993)に記載の技術に基本的に従うことで単離することができる。また、米国特許第５５６５３３２号及び同５５７３９０５号を参照のこと。また、Cole等及びBoerner等の技術はヒトモノクローナル抗体の調製に有用である(Cole等, Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) and Boerner等, J. Immunol., 147(1):86-95 (1991))。また、ヒト抗体はインビトロで活性化したＢ細胞により産生することができる(米国特許第５５６７６１０号及び同５２２９２７５号)。

抗体断片
また、抗体断片も本発明に包含される。抗体断片を産生するために様々な技術が開発されている。伝統的には、これらの断片は、無傷の抗体のタンパク分解性消化によって誘導された(例えば、Morimoto等, Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992)及びBrennan等, Science, 229:81(1985)を参照されたい)。しかし、これらの断片は、現在は組換え宿主細胞により直接産生することができる。例えば、抗体断片は、上で論じた抗体ファージライブラリから単離することができる。別法として、Ｆａｂ'-ＳＨ断片は大腸菌から直接回収することができ、化学的に結合させてＦ(ａｂ')_２断片を形成することができる(Carter等, Bio/Technology 10:163-167(1992))。他のアプローチ法では、Ｆ(ａｂ')_２断片を組換え宿主細胞培養から直接分離することができる。抗体断片を生成するのための他の方法は、当業者には明らかであろう。他の実施態様では、選択する抗体は単鎖Ｆｖ断片(ｓｃＦｖ)である。国際公開９３／１６１８５号；米国特許第５５７１８９４号；及び米国特許第５５８７４５８号を参照のこと。Ｆｖ及びｓＦｖは、定常領域を欠く無傷の連結部位を有する唯一の種である；従って、インビボで使用している間の減少した非特異的結合に適している。ｓＦｖ融合タンパク質は、ｓＦｖのアミノ又はカルボキシ末端のどちらかで、エフェクタータンパク質の融合体が生成されるように構成されてもよい。上掲のAntibody Engineering, Borrebaeck編を参照のこと。また、抗体断片は、例えば米国特許第５６４１８７０号に記載されているような「直鎖状抗体」であってもよい。そのような直鎖状抗体断片は単一特異性又は二重特異性であってもよい。

多重特異性抗体(例えば二重特異性)
また、本発明の抗体には、例えば、少なくとも２つの異なる抗原に対する結合特異性を有する多重特異性抗体が含まれる。このような分子は通常２つの抗原を結合するだけであるが(すなわち二重特異性抗体、ＢｓＡｂ)、本明細書中で用いられる場合には三重特異性抗体などの更なる特異性を有する抗体がこの表現に包含される。ＢｓＡｂの例には、腫瘍細胞抗原に対する一アームと細胞障害トリガー分子に対するもう一つのアームを有するもの、例えば抗ＦｃγＲＩ／抗ＣＤ１５、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／ＦｃγＲＩＩＩ(ＣＤ１６)、抗ＣＤ３／抗悪性Ｂ細胞(１Ｄ１０)、抗ＣＤ３／抗ｐ１８５ＨＥＲ２、抗ＣＤ３／抗ｐ９７、抗ＣＤ３／抗腎臓細胞カルチノーマ、抗ＣＤ３／抗ＯＶＣＡＲ-３、抗ＣＤ３／Ｌ-Ｄ１(抗大腸カルチノーマ)、抗ＣＤ３／抗メラニン細胞刺激ホルモン類似体、抗ＥＧＦレセプター／抗ＣＤ３、抗ＣＤ３／抗ＣＡＭＡ１、抗ＣＤ３／抗ＣＤ１９、抗ＣＤ３／ＭｏＶ１８、、抗神経細胞付着分子(ＮＣＡＭ)／抗ＣＤ３、抗葉酸剤結合タンパク質(ＦＢＰ)／抗ＣＤ３、抗パンカルチノーマ結合抗原(ＡＭＯＣ-３１)／抗ＣＤ３；腫瘍抗原に特異的に結合する一アームと毒素に結合する一アームを有するＢｓＡｂ、例として抗サポリン／抗Ｉｄ-１、抗ＣＤ２２／抗サポリン、抗ＣＤ７／抗サポリン、抗ＣＤ３８／抗サポリン、抗ＣＥＡ／抗リシンＡ鎖、抗インターフェロン-α(ＩＦＮ-α)／抗ハイブリドーマイディオタイプ、抗ＣＥＡ／抗ビンカアルカロイド；酵素活性化プロドラッグを転換するためのＢｓＡｂ、例として抗ＣＤ３０／抗アルカリホスファターゼ(マイトマイシンアルコールへのマイトマイシンリン酸塩プロドラッグの変換を触媒する)；線維素溶解剤として用いられうるＢｓＡｂ、例として抗フィブリン／抗組織プラスミノーゲン活性化因子(ｔＰＡ)、抗フィブリン／抗ウロキナーゼタイププラスミノーゲン活性化因子(ｕＰＡ)；細胞表面レセプターに免疫複合体をターゲティングするためのＢｓＡｂ、例として抗低密度リポプロテイン(ＬＤＬ)／抗Ｆｃレセプター(例えばＦｃγＲI、ＦｃγＲII又はＦｃγＲIII)；感染症の治療に用いるためのＢｓＡｂ、例として、抗ＣＤ３／抗単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)、抗Ｔ細胞レセプター：ＣＤ３複合体／抗インフルエンザ、抗ＦｃγＲ／抗ＨＩＶ；インビトロ又はインビボで腫瘍を検出するためのＢｓＡｂ、例えば抗ＣＥＡ／抗ＥＯＴＵＢＥ、抗ＣＥＡ／抗ＤＰＴＡ、抗ｐ１８５ＨＥＲ２／抗ハプテン；ワクチンのアジュバントとしてのＢｓＡｂ；そして、診断用ツールとしてのＢｓＡｂ、例として抗ウサギＩｇＧ／抗フェリチン、抗西洋ワサビペルオキシダーゼ(ＨＲＰ)／抗ホルモン、抗ソマトスタチン／抗物質Ｐ、抗ＨＲＰ／抗ＦＩＴＣ、抗ＣＥＡ／抗β-ガラクトシダーゼが含まれる。三重特異性抗体の例には、抗ＣＤ３／抗ＣＤ４／抗ＣＤ３７、抗ＣＤ３／抗ＣＤ５／抗ＣＤ３７及び抗ＣＤ３／抗ＣＤ８／抗ＣＤ３７が含まれる。二重特異性抗体は、完全長抗体又は抗体断片(例えばＦ(ａｂ')_２二重特異性抗体)として調製されてもよい。
二重特異性抗体を作成する方法は当該分野において既知である。完全長二重特異性抗体の伝統的な産生は二つの免疫グロブリン重鎖-軽鎖対の同時発現に基づき、ここで二つの鎖は異なる特異性を持っている(Millstein等, Nature, 305:537-539(1983))。免疫グロブリン重鎖及び軽鎖が無作為に取り揃えられているため、これらのハイブリドーマ(四部雑種)は１０個の異なる抗体分子の可能性ある混合物を産生し、そのうちただ一つが正しい二重特異性構造を有する。通常、アフィニティークロマトグラフィー工程により行われる正しい分子の精製は、かなり煩わしく、生成物収率は低い。同様の方法が国際公開第９３／０８８２９号及びTraunecker等, EMBO J. 10:3655-3659(1991)に開示されている。

異なったアプローチ法では、所望の結合特異性を有する抗体可変ドメイン(抗原-抗体結合部位)を免疫グロブリン定常ドメイン配列と融合させる。該融合は好ましくは、少なくともヒンジの一部、ＣＨ２及びＣＨ３領域を含むイムノグロブリン重鎖定常ドメインである。軽鎖の結合に必要な部位を含む第一の重鎖定常領域(ＣＨ１)を、融合の少なくとも一つに存在させることが望ましい。免疫グロブリン重鎖の融合、望まれるならば免疫グロブリン軽鎖をコードしているＤＮＡを、別個の発現ベクター中に挿入し、適当な宿主生物に同時トランスフェクトする。これにより、組立に使用される３つのポリペプチド鎖の等しくない比率が抗体の最適な収率をもたらす態様において、３つのポリペプチド断片の相互の割合の調節に大きな(フレキシビリティ)が与えられる。しかし、少なくとも２つのポリペプチド鎖の等しい比率での発現が高収率をもたらすとき、又はその比率があまり影響がないときは、２又は３個全てのポリペプチド鎖のためのコード化配列を一つの発現ベクターに挿入することが可能である。
この手法の一実施態様では、二重特異性抗体は、第一の結合特異性を有する一方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖と他方のアームのハイブリッド免疫グロブリン重鎖-軽鎖対(第二の結合特異性を提供する)とからなる。二重特異性分子の半分にしか免疫グロブリン軽鎖がないと容易な分離法が提供されるため、この非対称的構造は、所望の二重特異性化合物を不要な免疫グロブリン鎖の組み合わせから分離することを容易にすることが分かった。このアプローチ法は、国際公開第９４／０４６９０号に開示されている。二重特異性抗体を産生する更なる詳細については、例えばSuresh等, Methods in Enzymology, 121:210 (1986)を参照されたい。

国際公開第９６／２７０１１号に記載された他の手法によれば、一対の抗体分子間の界面を操作して組換え細胞培養から回収されるヘテロダイマーのパーセントを最大にすることができる。好適な界面は抗体の定常ドメインのＣ_Ｈ３ドメインの少なくとも一部を含む。この方法では、第１抗体分子の界面からの一又は複数の小さいアミノ酸側鎖がより大きな側鎖(例えばチロシン又はトリプトファン)と置き換えられる。大きな側鎖と同じ又は類似のサイズの相補的「キャビティ」を、大きなアミノ酸側鎖を小さいもの(例えばアラニン又はスレオニン)と置き換えることにより第２の抗体分子の界面に作り出す。これにより、ホモダイマーのような不要の他の最終産物に対してヘテロダイマーの収量を増大させるメカニズムが提供される。
抗体断片から二重特異性抗体を産生する技術もまた文献に記載されている。例えば、化学結合を使用して二重特異性抗体を調製することができる。Brennan等, Science, 229:81 (1985) は無傷の抗体をタンパク分解性に切断してＦ(ａｂ')_２断片を産生する手順を記述している。これらの断片は、ジチオール錯体形成剤、亜砒酸ナトリウムの存在下で還元して近接ジチオールを安定化させ、分子間ジスルフィド形成を防止する。産生されたＦａｂ'断片はついでチオニトロベンゾアート(ＴＮＢ)誘導体に変換される。Ｆａｂ'-ＴＮＢ誘導体の一つをついでメルカプトエチルアミンでの還元によりＦａｂ'-チオールに再変換し、他のＦａｂ'-ＴＮＢ誘導体の等モル量と混合して二重特異性抗体を形成する。作られた二重特異性抗体は酵素の選択的固定化用の薬剤として使用することができる。

最近の進歩により、大腸菌からのＦａｂ'-ＳＨ断片の直接の回収が容易になり、これは化学的に結合して二重特異性抗体を形成することができる。Shalaby等,J.Exp.Med., 175:217-225 (1992)は完全にヒト化された二重特異性抗体Ｆ(ａｂ')_２分子の製造を記述している。各Ｆａｂ'断片は大腸菌から別個に分泌され、インビトロで定方向化学共役を受けて二重特異性抗体を形成する。このようにして形成された二重特異性抗体は、正常なヒトＴ細胞、及びＥｒｂＢ２レセプターを過剰発現する細胞に結合可能で、ヒト乳房腫瘍標的に対するヒト細胞障害性リンパ球の細胞溶解活性の誘因となる。
組換え細胞培養から直接的に二重特異性抗体断片を作成し分離する様々な技術もまた記述されている。例えば、二重特異性抗体はロイシンジッパーを使用して生成されている。Kostelny等, J.Immunol. 148(5):1547-1553 (1992)。Ｆｏｓ及びＪｕｎタンパク質からのロイシンジッパーペプチドを遺伝子融合により二つの異なった抗体のＦａｂ'部分に結合させる。抗体ホモダイマーをヒンジ領域で還元してモノマーを形成し、ついで再酸化して抗体ヘテロダイマーを形成する。この方法はまた抗体ホモダイマーの生成に対して使用することができる。Hollinger等, Proc.Natl.Acad.Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)により記述された「ダイアボディ」技術は二重特異性抗体断片を作成する別のメカニズムを提供した。断片は、同一鎖上の２つのドメイン間の対形成を可能にするには十分に短いリンカーにより軽鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｌ)に重鎖可変ドメイン(Ｖ_Ｈ)を結合してなる。従って、一つの断片のＶ_Ｈ及びＶ_Ｌドメインは他の断片の相補的Ｖ_Ｌ及びＶ_Ｈドメインと強制的に対形成させられ、よって２つの抗原結合部位を形成する。単鎖Ｆｖ(ｓＦｖ)ダイマーの使用により二重特異性抗体断片を製造する他の方策もまた報告されている。Gruber等, J.Immunol. 152:5368 (1994)を参照されたい。
二価より多い抗体も考えられる。例えば、三重特異性抗体を調製することができる。Tutt等 J.Immunol. 147:60(1991)。

ヘテロコンジュゲート抗体
二重特異性抗体には、本発明の抗体である架橋された又は「ヘテロコンジュゲート」抗体が含まれる。例えば、ヘテロコンジュゲートの抗体のうちの１つは、アビジンに結合し、他方はビオチンに結合しうる。このような抗体は、例えば、望ましくない細胞に免疫系細胞をターゲティングすること(米国特許第4676980号)、そしてＨＩＶ感染の治療のため(国際公開第91/00360号、国際公開第92/200373号及び欧州特許第03089号)が考えられている。ヘテロコンジュゲート抗体は、任意の簡便な架橋結合方法を用いて作られてもよい。好適な架橋剤は当分野で公知であり、多くの架橋技術とともに、米国特許第4676980号に開示されている。

多価抗体
本発明の抗体には多価抗体が含まれる。多価抗体は、抗体が結合する抗原を発現する細胞により、二価抗体よりも早くインターナリゼーション(及び／又は異化)されうる。本発明の抗体は、３又はそれ以上の結合部位を有する多価抗体(ＩｇＭクラス以外のもの)であり得(例えば四価抗体)、抗体のポリペプチド鎖をコードする核酸の組換え発現により容易に生成することができる。多価抗体は二量化ドメインと３又はそれ以上の抗原結合部位を有する。好ましい二量化ドメインはＦｃ領域又はヒンジ領域を有する(又はそれらからなる)。このシナリオにおいて、抗体はＦｃ領域と、Ｆｃ領域のアミノ末端に３又はそれ以上の抗原結合部位を有しているであろう。ここで、好ましい多価抗体は３ないし８、好ましくは４の抗原結合部位を有する(又はそれらからなる)。多価抗体は少なくとも１つのポリペプチド鎖(好ましくは２つのポリペプチド鎖)を有し、ポリペプチド鎖(類)は２又はそれ以上の可変ドメインを有する。例えば、ポリペプチド鎖(類)はＶＤ１-(Ｘ１)_ｎ-ＶＤ２-(Ｘ２)_ｎ-Ｆｃを有し、ここでＶＤ１は第１の可変ドメインであり、ＶＤ２は第２の可変ドメインであり、ＦｃはＦｃ領域のポリペプチド鎖の一つであり、Ｘ１及びＸ２はアミノ酸又はポリペプチドを表し、ｎは０又は１である。例えば、ポリペプチド鎖(類)は：ＶＨ-ＣＨ１-柔軟なリンカー-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖；又はＶＨ-ＣＨ１-ＶＨ-ＣＨ１-Ｆｃ領域鎖を有し得る。ここで多価抗体は、好ましくは少なくとも２つ(好ましくは４つ)の軽鎖可変ドメインポリペプチドをさらに有する。ここで多価抗体は、例えば約２〜約８の軽鎖可変ドメインポリペプチドを有する。ここで考察される軽鎖可変ドメインポリペプチドは軽鎖可変ドメインを有し、場合によってはＣＬドメインを更に有する。

エフェクター機能の加工
本発明の抗体をエフェクター機能について改変し、例えば癌を治療する際の抗体の有効性を向上させることは望ましい。例えば、システイン残基をＦｃ領域に導入し、それにより、この領域に鎖間ジスルフィド結合を形成するようにしてもよい。そのようにして生成された同種二量体抗体は、向上したインターナリゼーション能力及び／又は増加した補体媒介細胞殺傷及び抗体−依存細胞性細胞障害性(ＡＤＣＣ)を有する可能性がある。Caron等, J. Exp. Med. 176: 1191-1195 (1992)及びShopes, B. J. Immunol. 148: 2918-2922 (1992)参照。また、向上した抗腫瘍活性を持つ同種二量体抗体は、Wolff等, Cancer Research 53: 2560-2565 (1993)に記載されている異種二官能性架橋を用いて調製することができる。あるいは、抗体は、２つのＦｃ領域を有するように加工して、それにより補体溶解及びＡＤＣＣ能力を向上させることもできる。Stevenson等, Anti-Cancer Drug Design 3: 219-230 (1989)参照。抗体の血清半減期を増大させるために、例えば米国特許第５７３９２７７号に記載のように、抗体(特に抗体断片)へサルベージレセプター結合エピトープを導入してもよい。ここで使用される場合の「サルベージレセプター結合エピトープ」なる用語は、ＩｇＧ分子のインビボ血清半減期を増加させる原因であるＩｇＧ分子(例えば、ＩｇＧ_１、ＩｇＧ_２、ＩｇＧ_３又はＩｇＧ_４)のＦｃ領域のエピトープを意味する。

イムノコンジュゲート
また、本発明は、化学療法薬、毒素(例えば、細菌、真菌、植物又は動物由来の酵素活性毒素、又はその断片)などの細胞障害性剤、あるいは放射性同位体(即ち、放射性コンジュゲート)とコンジュゲートしている本明細書中に記載の抗体を含むイムノコンジュゲートに関する。例には、限定するものではないがＢｉ^２１２、Ｉ^１３１、Ｉｎ^１３１、Ｙ^９０、及びＲｅ^１８６が含まれる。
このようなイムノコンジュゲートの生成に有用な化学療法薬は上記した。例えば、ＢＣＮＵ、ストレプトゾイシン、ビンクリスチン、５-フルオロウラシル、米国特許第５０５３３９４号、同５７７０７１０号に記載されており、集合的にＬＬ-Ｅ３３２８８複合体として公知の薬剤のファミリー、並びにエスペラマイシン(esperamicine)(米国特許第５８７７２９６号)など(本明細書中の「化学療法薬」の定義も参照のこと)が本発明の抗体ないしその断片にコンジュゲートされうる。
腫瘍を選択的に破壊するため、抗体は高い放射性を有する原子を含有してよい。放射性コンジュゲートした抗体ないしその断片を生成するために、種々の放射性同位体が利用される。例には、限定するものではないがＡｔ^２１１、Ｉ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８、Ｓｍ^１５３、Ｂｉ^２１２、Ｐ^３２、Ｐｂ^２１２、Ｉｎ^１１１及びＬｕの放射性同位体などが含まれる。コンジュゲートが診断用に使用される場合、それはシンチグラフィー研究用の放射性原子、例えばｔｃ^９９ｍ又はＩ^１２３、又は核磁気共鳴(ＮＭＲ)映像(磁気共鳴映像、ＭＲＩとしても公知)用のスピン標識、例えばヨウ素-１２３、ヨウ素-１３１、インジウム-１１１、フッ素-１９、炭素-１３、窒素-１５、酸素-１７、ガドリニウム、マンガン又は鉄を含有し得る。

放射-又は他の標識が、公知の方法でコンジュゲートに導入される。例えば、ペプチドは生物合成されるか、又は水素の代わりにフッ素-１９を含む適切なアミノ酸前駆体を使用する化学的なアミノ酸合成により合成される。標識、例えばｔｃ^９９ｍ又はＩ^１２３、Ｒｅ^１８６、Ｒｅ^１８８及びＩｎ^１１１は、ペプチドのシステイン残基を介して結合可能である。イットリウム-９０はリジン残基を介して結合可能である。IODOGEN法(Fraker等(1978) Biochem. Biophys. Res. Commun. 80：49-57)は、ヨウ素-１２３の導入に使用することができる。他の方法の詳細は、例として「Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy」(Chatal, CRC Press 1989)に記載されている。
使用可能な酵素活性毒及びその断片には、ジフテリアＡ鎖、ジフテリア毒素の非結合性活性断片、外毒素Ａ鎖(シュードモナス・アエルギノーサ(Pseudomonas aeruginosa))、リシンＡ鎖、アブリンＡ鎖、モデシン(modeccin)Ａ鎖、アルファ-サルシン(sarcin)、アレウライツ・フォルディイ(Aleurites fordii)プロテイン、ジアンシン(dianthin)プロテイン、フィトラッカ・アメリカーナ(Phytolaca americana)プロテイン(ＰＡＰＩ、ＰＡＰＩＩ及びＰＡＰ-Ｓ)、モモルディカ・キャランティア(momordica charantia)インヒビター、クルシン(curcin)、クロチン、サパオナリア(sapaonaria)オフィシナリスインヒビター、ゲロニン(gelonin)、マイトゲリン(mitogellin)、レストリクトシン(restrictocin)、フェノマイシン、エノマイシン及びトリコセセンス(tricothecenes)が含まれる。例えば、１９９３年１０月２８日公開の国際公開第９３／２１２３２号を参照のこと。

抗体と細胞障害性剤のコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トリエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。例えば、リシン免疫毒素は、Vitetta等, Science 238:1098(1987)に記載されているようにして調製することができる。炭素-１４標識１-イソチオシアナトベンジル-３-メチルジエチレン-トリアミン五酢酸(ＭＸ-ＤＴＰＡ)が抗体に放射性ヌクレオチドをコンジュゲートするためのキレート剤の例である。国際公開第９４／１１０２６号を参照されたい。リンカーは細胞中の細胞障害性剤の放出を容易にするための「切断可能リンカー」であってよい。例えば、酸不安定性リンカー、ペプチダーゼ過敏性リンカー、光不安定性リンカー、ジメチルリンカー又はジスルフィド含有リンカーが使用され得る(Chari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)；米国特許第５２０８０２０号)。

別法として、抗ＶＥＧＦ及び／又は本発明の抗体の抗たんぱく質と細胞障害性剤を含有する融合タンパク質は、例えば組換え技術又はペプチド合成により作製される。ＤＮＡの長さは、コンジュゲートの所望する特性を破壊しないリンカーペプチドをコードする領域により離間しているか、又は互いに隣接しているコンジュゲートの２つの部分をコードする領域をそれぞれ含有する。
ある実施態様において、腫瘍の事前ターゲティングに利用するために、「レセプター」(例えばストレプトアビジン)に抗体をコンジュゲートし、ここで抗体-レセプターコンジュゲートを患者に投与し、続いて清澄剤を使用し、循環から未結合コンジュゲートを除去し、細胞障害性剤にコンジュゲートする「リガンド」(例えばアビジン)を投与する。

メイタンシン及びメイタンシノイド
本発明は、一又は複数のメイタンシノイド分子にコンジュゲートしている本発明の抗体を提供する。メイタンシノイドは、チューブリン重合を阻害するように作用する分裂阻害剤である。メイタンシンは、最初、東アフリカシラブMaytenus serrataから単離されたものである(米国特許第３８９６１１１号)。その後、ある種の微生物がメイタンシノイド類、例えばメイタンシノール及びＣ-３メイタンシノールエステルを生成することが発見された(米国特許第４１５１０４２号)。合成メイタンシノール及びその誘導体及び類似体は、例えば米国特許第４１３７２３０号；同４２４８８７０号；同４２５６７４６号；同４２６０６０８号；同４２６５８１４号；同４２９４７５７号；同４３０７０１６号；同４３０８２６８号；同４３０８２６９号；同４３０９４２８号；同４３１３９４６号；同４３１５９２９号；同４３１７８２１号；同４３２２３４８号；同４３３１５９８号；同４３６１６５０号；同４３６４８６６号；同４４２４２１９号；同４４５０２５４号；同４３６２６６３号；及び同４３７１５３３号に開示されている。
本発明の抗体は、抗体又はメイタンシノイド分子のいずれの生物学的活性もほとんど低減することなく、メイタンシノイド分子にコンジュゲートすることができる。１分子の毒素／抗体は、ネイキッド抗体の使用において細胞障害性を高めることが予期されているが、抗体分子当たり、平均３−４のメイタンシノイド分子が結合したものは、抗体の機能又は溶解性に悪影響を与えることなく、標的細胞に対する細胞障害性を向上させるといった効力を示す。メイタンシノイドは当該技術分野でよく知られており、公知の技術で合成することも、天然源から単離することもできる。適切なメイタンシノイドは、例えば米国特許第５２０８０２０号、及び他の特許、及び上述した特許ではない刊行物に開示されている。一実施態様では、メイタンシノイドは、メイタンシノール、及び種々のメイタンシノールエステル等の、メイタンシノール分子の芳香環又は他の位置が修飾されたメイタンシノール類似体である。
例えば、米国特許第５２０８０２０号又は欧州特許第０４２５２３５Ｂ１号、及びChari等, Cancer Research, 52：127-131(1992)に開示されているもの等を含む、抗体-メイタンシノイドコンジュゲートを作製するために、当該技術で公知の多くの結合基がある。結合基には、上述した特許に開示されているようなジスルフィド基、チオエーテル基、酸不安定性基、光不安定性基、ペプチターゼ不安定性基、又はエステラーゼ不安定性基が含まれるが、ジスルフィド及びチオエーテル基が好ましい。

抗体とメイタンシノイドとのコンジュゲートは、種々の二官能性タンパク質カップリング剤、例えばＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)、スクシンイミジル-４-(Ｎ-マレイミドメチル)シクロヘキサン-１-カルボキシラート、イミノチオラン(ＩＴ)、イミドエステル類の二官能性誘導体(例えばジメチルアジピミダートＨＣＬ)、活性エステル類(例えば、スベリン酸ジスクシンイミジル)、アルデヒド類(例えば、グルタルアルデヒド)、ビスアジド化合物(例えば、ビス(ｐ-アジドベンゾイル)ヘキサンジアミン)、ビス-ジアゾニウム誘導体(例えば、ビス-(ｐ-ジアゾニウムベンゾイル)エチレンジアミン)、ジイソシアネート(例えば、トルエン-２,６-ジイソシアネート)、及び二活性フッ素化合物(例えば、１,５-ジフルオロ-２,４-ジニトロベンゼン)を使用して作製することができる。典型的なカップリング剤には、ジスルフィド結合を提供するためのＮ-スクシンイミジル-４-(２-ピリジルチオ)ペンタノアート(ＳＰＰ)及びＮ-スクシンイミジル-３-(２-ピリジルジチオ)プロピオナート(ＳＰＤＰ)(Carlsson等, Biochem. J. 173：723-737[1978])が含まれる。
リンカーは結合の種類に応じて、種々の位置でメイタンシノイド分子に結合し得る。例えば、従来からのカップリング技術を使用してヒドロキシル基と反応させることによりエステル結合を形成することができる。反応はヒドロキシル基を有するＣ-３位、ヒドロキシメチルで修飾されたＣ-１４位、ヒドロキシル基で修飾されたＣ-１５位、及びヒドロキシル基を有するＣ-２０位で生じる。結合はメイタンシノール又はメイタンシノールの類似体のＣ-３位で形成される。

カリケアマイシン
対象の他の免疫コンジュゲートには、一又は複数のカリケアマイシン分子とコンジュゲートした本発明の抗体が含まれる。抗生物質のカリケアマイシンファミリーはサブ-ピコモルの濃度で二重鎖ＤＮＡ破壊を生じることができる。カリケアマイシンファミリーのコンジュゲートの調製については、米国特許第５７１２３７４号、同５７１４５８６号、同５７３９１１６号、同５７６７２８５号、同５７７０７０１号、同５７７０７１０号、同５７７３００１号、同５８７７２９６号(全て、American Cyanamid Company)を参照のこと。使用可能なカリケアマイシンの構造類似体には、限定するものではないが、γ_１ ^Ｉ、α_２ ^Ｉ、α_３ ^Ｉ、Ｎ-アセチル-γ_１ ^Ｉ、ＰＳＡＧ及びθ^Ｉ _１(Hinman等, Cancer Research, 53：3336-3342(1993)、Lode等 Cancer Research, 58：2925-2928(1998)及び上述したAmerican Cyanamidの米国特許)が含まれる。抗体が結合可能な他の抗腫瘍剤は、葉酸代謝拮抗薬であるＱＦＡである。カリケアマイシン及びＱＦＡは双方共、細胞内に作用部位を有し、原形質膜を容易に通過しない。よって抗体媒介性インターナリゼーションによるこれらの薬剤の細胞への取込により、細胞障害効果が大きく向上する。

他の抗体修飾
本明細書において抗体の他の修飾が意図される。例えば、抗体は、様々な非タンパク質性ポリマーの一つ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、ポリオキシアルキレン、ポリエチレングリコール及びポリプロピレングリコールのコポリマーに連結されうる。また、抗体は、例えば、コアセルベーション技術によって又は界面重合法(例えば、それぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチン-マイクロカプセル及びポリ-(メチルメタキレート)マイクロカプセル)によって調製されるマイクロカプセルに、コロイド薬物送達系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、ミクロエマルジョン、ナノ粒子及びナノカプセル)に、又はマイクロエマルジョンに内包されうる。このような技術は、Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, Oslo, A., Ed., (1980)に開示される。

リポソーム及びナノ粒子
本発明のポリペプチドはリポソームとして処方することができる。例えば本発明の抗体はイムノリポソームとして処方することができる。抗体を含有するリポソームは、例えばEpstein等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688(1985)；Hwang等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77:4030(1980)；及び米国特許第４４８５０４５号及び同４５４４５４５号に記載されているように、当該分野において既知の方法により調製される。循環時間が増したリポソームは米国特許第５０１３５５６号に開示されている。一般的に、製剤とリポソームの使用は当業者に公知である。
特に有用なリポソームは、ホスファチジルコリン、コレステロール及びＰＥＧ-誘導体化ホスファチジルエタノールアミン(ＰＥＧ-ＰＥ)を含有する脂質組成物を用いた逆相蒸発法により作製することができる。リポソームは孔径が定められたフィルターを通して押し出され、所望の直径を有するリポソームが得られる。本発明の抗体のＦａｂ'断片は、ジスルフィド交換反応を介して、Martin等, J. Biol. Chem. 257:286-288(1982)に記載されているようにしてリポソームにコンジュゲートすることができる。場合によっては、化学療法剤(ドキソルビジンなど)はリポソーム内に包含される。Gabizon等, J. National Cancer Inst. 81(19)1484(1989)を参照されたい。

他の用途
本発明の抗体は様々な有用性を有している。例えば、本発明の抗体は、癌の検出(例えば耐性腫瘍を検出する際)のために特定の細胞、組織又は血清におけるタンパク質の発現を検出するための診断用アッセイなどに用いられうる。一実施態様では、抗体は、本明細書中に記載の方法による治療のための患者集団を選別するため、例えばＧｒ１、好中球エラスターゼ、ＭＣＰ-１、ＭＩＰ-１α、ＵＲＣＧＰ、ＤＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ及びＤＲＲＴＰの発現が変更している患者を検出するために用いられる。競合的結合アッセイ、直接又は間接サンドウィッチアッセイ及び不均一又は均一相で行われる免疫沈降アッセイ［Zola,MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques,CRCPress,Inc.(1987)pp.147-158］等のこの分野で知られた種々の診断アッセイ技術が使用される。診断アッセイで用いられる抗体は、検出可能な部位で標識される。検出可能な部位は、直接又は間接に、検出可能なシグナルを発生しなければならない。例えば、検出可能な部位は、^３Ｈ、^１４Ｃ、^３２Ｐ、^３５Ｓ又は^１２５Ｉ等の放射性同位体、フルオレセインイソチオシアネート、ローダミン又はルシフェリン等の蛍光又は化学発光化合物、あるいはアルカリホスファターゼ、ベータ-ガラクトシダーゼ又はセイヨウワサビペルオキシダーゼ等の酵素であってよい。抗体に検出可能な部位を抱合させるためにこの分野で知られた任意の方法が用いられ、それにはHunter等, Nature144:945(1962)；David等, Biochemistry,13:1014(1974)；Pain等, J.Immunol.Meth.,40:219(1981)；及びNygren,J.Histochem.andCytochem.,30:407(1982)に記載された方法が含まれる。
また、本発明の抗体は、組換え細胞培地又は天然の供給源からの本発明のタンパク質ないしタンパク質の断片の親和性精製に利用できる。この方法において、たんぱく質に対する抗体を、当分野でよく知られた方法を用いてSephadex樹脂又は濾紙等の適した支持体に固定化する。次いで、固定化した抗体をタンパク質を含む試料と接触させて精製し、その後、固定化した抗体と結合したタンパク質以外の試料中の実質的には全ての物質を取り除きうる適した溶媒で、支持体を洗浄する。最後に、支持体を抗体からタンパク質を引き離しうる他の適した溶媒で洗浄する。

本発明のポリペプチドに対する共有的修飾
本発明のポリペプチド、例えば本発明のタンパク質、本発明のタンパク質の抗体、ポリペプチドアンタゴニスト断片、融合分子(例えば免疫融合分子)などの共有結合による修飾は本発明の範囲内に包含される。それらは、適当であれば、化学合成により、又は抗体の酵素的又はポリペプチドの化学的切断によりなされうる。他の種類のポリペプチドの共有的修飾は、選択される側鎖又はＮ末端ないしはＣ末端残基と反応可能な有機誘導体化剤とポリペプチドの標的とするアミノ酸残基を反応させることによって、又は、修飾アミノ酸ないしは非天然のアミノ酸を発達するポリペプチド鎖に組み込むことによって、分子内に導入される。例えばEllman等 Meth. Enzym. 202:301-336 (1991)；Noren等 Science 244:182 (1989)；及び、米国公開特許第２００３０１０８８８５号及び同第２００３００８２５７５号。
最も一般的には、システイニル残基は、α-ハロアセタート(及び対応するアミン)、例えば、クロロ酢酸又はクロロアセトアミドと反応し、カルボキシメチル又はカルボキシアミドメチル誘導体を生じる。システイン残基もまたブロモトリフルオロアセトン；α-ブロモ-β-(５-イミドゾイル)プロピオン酸；クロロアセチルホスフェート；Ｎ-アルキルマレイミド類；３-ニトロ-２-ピリジルジスルフィド；メチル-２-ピリジルジスルフィド；ｐ-クロロ水銀安息香酸；２-クロロ水銀-４-ニトロフェノール；又はクロロ-７-ニトロベンゾ-２-オキサ-１,３-ジアゾールとの反応によって誘導体化される。
ヒスチジル残基は、ｐＨ５．５−７．０でジエチルピロカルボナートとの反応によって誘導体化されるが、この薬剤はヒスチジル側鎖に対して比較的特異的である。パラ-ブロモフェナシルブロミドもまた有用である；この反応は、典型的にはｐＨ６．０で０．１Ｍのカコジル酸ナトリウム中で行われる。

リジニル及びアミノ末端残基はコハク酸又は他のカルボン酸無水物と反応させられる。これらの試薬を用いた誘導体形成は、リシニル残基の電荷を逆転させる効果を有する。α-アミノ含有残基を誘導体化する他の適当な試薬には、イミドエステル、例えば、メチルピコリンイミデート、リン酸ピリドキサル、ピリドキサル、クロロボロヒドリド、トリニトロベンゼンスルホン酸、Ｏ-メチルイソ尿素、２,４-ペンタンジオン、及びグリオキシレートを用いたトランスアミナーゼにより触媒される反応である。
アルギニル残基は一あるいは幾つかの従来の試薬との反応によって修飾され、とりわけ、フェニルグリオキサール、２,３-ブタンジオン、１,２-シクロヘキサンジオン及びニンヒドリンがある。アルジニン残基の誘導体化は、グアニジン官能基の高いｐＫ_ａのために反応がアルカリ性条件下で行われることを必要とする。更に、これらの試薬はリジンの基並びにアルギニンε-アミノ基と反応しうる。
チロシル残基の特異的修飾は、芳香族ジアゾニウム化合物又はテトラニトロメタンとの反応によるチロシル残基内へのスペクトル標識の導入に特に興味をもって、なされる。最も一般的には、Ｎ-アセチルイミジゾールとテトラニトロメタンを使用して、それぞれがＯ-アセチルチロシル種と３-ニトロ誘導体を形成する。チロシル残基はラジオイムノアッセイでの使用のための標識化タンパク質を調製するために^１２５Ｉ又は^１３１Ｉを用いてヨウ素化される。

カルボキシル側基(アスパルチル又はグルタミル)がカルボジイミド(Ｒ-Ｎ=Ｃ=Ｎ-Ｒ')(ここで、ＲとＲ'は異なったアルキル基である)、例えば、１-シクロヘキシル-３-(２-モルホリニル-４-エチル)カルボジイミド又は１-エチル-３-(４-アゾニア-４,４-ジメチルペンチル)カルボジイミドとの反応によって選択的に修飾される。更に、アスパルチル及びグルタミル残基は、アンモニウムイオンとの反応によってアスパラギニル及びグルタミニル残基へ変換される。
グルタミニル及びアスパラギニル残基は、それぞれ対応するグルタミル及びアスパルチル残基へしばしば脱アミド化される。これらの残基は中性又は塩基性条件下で脱アミド化される。これらの残基の脱アミド化形態は本発明の範囲内に入る。
その他の修飾には、プロリンとリジンのヒドロキシル化、セリル又はスレオニル残基のヒドロキシル基のリン酸化、リジン、アルギニン、及びヒスチジン側鎖のα-アミノ基のメチル化(T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, 79-86頁 (1983))、Ｎ末端アミンのアセチル化、及び任意のＣ末端カルボキシル基のアミド化が含まれる。

他のタイプの共有的修飾は本発明のポリペプチドに対してグリコシドを化学的又は酵素的にカップリングさせることを含む。これらの手順は、それらがＮ-又はＯ-結合グリコシル化のためのグリコシル化能を有する宿主細胞中でのポリペプチドの生産を必要としない点で有利である。用いられるカップリング態様に応じて、糖(類)は、(a)アルギニンとヒスチジンに、(b)遊離のカルボキシル基に、(c)遊離のスルフヒドリル基、例えばシステインのものに、(d)セリン、スレオニン又はヒドロキシプロリンのもののような遊離のヒドロキシル基に、(e)フェニルアラニン、チロシン又はトリプトファンのような芳香族残基、又は(f)グルタミンのアミド基に結合させることができる。これらの方法は１９８７年９月１１日公開の国際公開第８７／０５３３０号並びにAplin及びWriston, CRC Crit. Rev. Biochem., 259-306頁 (1981)に記載されている。
本発明のポリペプチドに存在するあらゆる炭水化物部分の除去は、化学的又は酵素的になすことができる。化学的脱グリコシル化には、ポリペプチドを化合物トリフルオロメタンスルホン酸、又は等価化合物に暴露することを必要とする。この処理により、ポリペプチドをインタクトなままにしながら、結合糖(Ｎ-アセチルグルコサミン又はＮ-アセチルガラクトサミン)を除く殆どの又は全ての糖の切断が生じる。化学的脱グリコシル化は、Hakimuddin等, Arch. Biochem. Biophys., 259:52 (1987)により、及びEdge等, Anal. Biochem., 118: 131 (1981)により記載されている。例えば抗体上の炭水化物部分の酵素的切断は、Thotakura等, Meth. Enzymol. 138:350 (1987)に記載されているように、種々のエンド及びエキソグリコシダーゼを用いることにより達成できる。
本発明のポリペプチドの共有結合的修飾の他のタイプは、ポリペプチドを、種々の非タンパク質様ポリマーの一つ、例えばポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、又はポリオキシアルキレンへ、米国特許第４６４０８３５号；第４４９６６８９号；第４３０１１４４号；第４６７０４１７号；第４７９１１９２号又は第４１７９３３７号に記載された方法で結合させることを含む。

ベクター、宿主細胞及び組換え法
本発明のポリペプチドは直ぐに得られる技術と材料を使用して組換え的に製造することができる。
本発明のポリペプチド、例えば本発明のタンパク質、本発明のタンパク質の抗体、例えば抗ＶＥＧＦ抗体の組換え生産のために、それをコードする核酸が単離され、更なるクローニング(ＤＮＡの増幅)又は発現のために、複製可能なベクター内に挿入される。本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡは、従来の手順を用いて容易に単離して配列決定される。例えば、モノクローナル抗体をコードするＤＮＡは、例えば、抗体の重鎖及び軽鎖をコードする遺伝子に特異的に結合可能であるオリゴヌクレオチドプローブを用いて単離し、配列決定される。多くのベクターが利用可能である。ベクター成分には一般に、限定するものではないが、シグナル配列、複製起点、一又は複数のマーカー遺伝子、エンハンサーエレメント、プロモーター、及び転写終末配列の一又は複数が含まれる。

シグナル配列成分
本発明のポリペプチドは直接的に組換え手法によって生産されるだけではなく、典型的にはシグナル配列あるいは成熟タンパク質あるいはポリペプチドのＮ末端に特異的切断部位を有する他のポリペプチドである異種性ポリペプチドとの融合ポリペプチドとしても産生される。典型的に選択された異種シグナル配列は宿主細胞によって認識され加工される(すなわち、シグナルペプチダーゼによって切断される)ものである。天然ポリペプチドシグナル配列を認識せずプロセシングしない原核生物宿主細胞に対しては、シグナル配列は、例えばアルカリホスファターゼ、ペニシリナーゼ、ｌｐｐあるいは熱安定なエンテロトキシンIIリーダーの群から選択される原核生物シグナル配列により置換される。酵母の分泌に関しては、天然シグナル配列は、例えば酵母インベルターゼリーダー、α因子リーダー(酵母菌属(Saccharomyces)及びクルイベロマイシス(Kluyveromyces)α因子リーダーを含む)、又は酸ホスフォターゼリーダー、白体(C.albicans)グルコアミラーゼリーダー、又は国際公開第９０／１３６４６号に記載されているシグナルにより置換されうる。哺乳動物細胞の発現においては、哺乳動物のシグナル配列並びにウイルス分泌リーダー、例えば単純ヘルペスｇＤシグナルが利用できる。
このような前駆体領域のＤＮＡは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡに読み枠を一致させて結合される。

複製開始点成分
発現及びクローニングベクターは共に一又は複数の選択された宿主細胞においてベクターの複製を可能にする核酸配列を含む。一般に、この配列はクローニングベクターにおいて、宿主染色体ＤＮＡとは独立にベクターが複製することを可能にするものであり、複製開始点又は自律的複製配列を含む。そのような配列は様々な細菌、酵母及びウイルスに対してよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２に由来する複製開始点は大部分のグラム陰性細菌に好適であり、２μプラスミド開始点は酵母に適しており、様々なウイルス開始点(ＳＶ４０、ポリオーマ、アデノウイルス、ＶＳＶ又はＢＰＶ)は哺乳動物細胞におけるクローニングベクターに有用である。一般には、哺乳動物の発現ベクターには複製開始点成分は不要である(ＳＶ４０開始点が典型的には初期プロモーターを有しているため用いられる)。

選択遺伝子成分
発現及びクローニングベクターは、選択可能マーカーとも称される選択遺伝子を含みうる。典型的な選択遺伝子は、(ａ)アンピシリン、ネオマイシン、メトトレキセートあるいはテトラサイクリンのような抗生物質あるいは他の毒素に耐性を与え、(ｂ)栄養要求性欠陥を補い、又は(ｃ)例えばバシラス菌に対する遺伝子コードＤ-アラニンラセマーゼのような、複合培地から得られない重要な栄養素を供給する、タンパク質をコードする。
選択技術の一例においては、宿主細胞の成長を抑止する薬物が用いられる。異種性遺伝子で首尾よく形質転換されるこれらの細胞は、抗薬物性を付与し、選択療法を生存するタンパク質を生産する。このような優性選択の例としては、薬物ネオマイシン、ミコフェノール酸又はハイグロマイシンが使用される。
哺乳動物細胞に適切な選択可能なマーカーの他の例は、抗体核酸を捕捉することのできる細胞成分を同定することのできるもの、例えばＤＨＦＲ、チミジンキナーゼ、メタロチオネインＩ及びＩＩ、典型的には、霊長類メタロチオネイン遺伝子、アデノシンデアミナーゼ、オルニチンデカルボキシラーゼ等である。
例えば、ＤＨＦＲ選択遺伝子によって形質転換された細胞は、先ず、ＤＨＦＲの競合的アンタゴニストであるメトトリキセート(Ｍｔｘ)を含む培地において形質転換物の全てを培養することで同定される。野生型ＤＨＦＲを用いた場合の好適な宿主細胞は、ＤＨＦＲ活性に欠陥のあるチャイニーズハムスター卵巣(ＣＨＯ)株化細胞である。

あるいは、本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、野生型ＤＨＦＲタンパク質、及びアミノグリコシド３'-ホスホトランスフェラーゼ(ＡＰＨ)のような他の選択可能マーカーで形質転換あるいは同時形質転換した宿主細胞(特に、内在性ＤＨＦＲを含む野生型宿主)は、カナマイシン、ネオマイシンあるいはＧ４１８のようなアミノグリコシド抗生物質のような選択可能マーカーの選択剤を含む培地における細胞増殖により選択することができる。米国特許第４９６５１９９号を参照。
酵母中での使用に好適な選択遺伝子は酵母プラスミドＹＲｐ７に存在するｔｒｐ１遺伝子である(Stinchcomb等, Nature, 282：39(1979))。ｔｒｐ１遺伝子は、例えば、ＡＴＣＣ第４４０７６号あるいはＰＥＰ４-１のようなトリプトファン内で成長する能力に欠ける酵母の突然変異株に対する選択マーカーを提供する。Jones, Genetics, 85：12 (1977)。酵母宿主細胞ゲノムにｔｒｐ１破壊が存在することは、トリプトファンの不存在下における成長による形質転換を検出するための有効な環境を提供する。同様に、Ｌｅｕ２欠陥酵母株(ＡＴＣＣ２０６２２あるいは３８６２６)は、Ｌｅｕ２遺伝子を有する既知のプラスミドによって補完される。
また、１．６μｍの円形プラスミドｐＫＤ１由来のベクターは、クルイヴェロマイシス(Kluyveromyces)酵母の形質転換に用いることができる。あるいは、組換え子ウシのキモシンの大量生産のための発現系がＫ.ラクティス(lactis)に対して報告されている。Van den Berg, Bio/Technology, 8：135 (1990)。クルイヴェロマイシスの工業的な菌株からの、組換えによる成熟したヒト血清アルブミンを分泌する安定した複数コピー発現ベクターも開示されている。Fleer 等, Bio/Technology,9：968-975 (1991)。

プロモーター成分
通常、発現及びクローニングベクターは、宿主生体により認識され、本発明のポリペプチドをコードする核酸に作用可能に結合するプロモーターを含む。原核生物宿主での使用に好適なプロモーターは、ｐｈｏＡプロモーター、βラクタマーゼ及びラクトースプロモーター系、アルカリホスファターゼ、トリプトファン(ｔｒｐ)プロモーター系、及びハイブリッドプロモーター、例えばｔａｃプロモーターを含む。しかし、他の既知の細菌プロモーターも好適である。細菌系で使用するプロモーターもまた本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡと作用可能に結合したシャイン・ダルガーノ(Ｓ.Ｄ.)配列を有する。
真核生物に対してもプロモーター配列が知られている。事実上、全ての真核生物の遺伝子は、転写開始部位からおよそ２５ないし３０塩基上流に位置するＡＴ富化領域を有する。多数の遺伝子の転写開始位置から７０ないし８０塩基上流に見出される他の配列は、Ｎが任意のヌクレオチドであるＣＮＣＡＡＴ領域である。大部分の真核生物遺伝子の３'末端には、コード配列の３'末端へのポリＡ尾部の付加に対するシグナルであるＡＡＴＡＡＡ配列がある。これらの配列は全て真核生物の発現ベクターに適切に挿入される。
酵母宿主と共に用いて好適なプロモーター配列の例としては、３-ホスホグリセラートキナーゼ又は他の糖分解酵素、例えばエノラーゼ、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、ヘキソキナーゼ、ピルビン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース-６-リン酸イソメラーゼ、３-ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオセリン酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、及びグルコキナーゼが含まれる。

他の酵母プロモーターは、成長条件によって転写が制御される更なる利点を有する誘発的プロモーターであり、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソチトクロムＣ、酸ホスファターゼ、窒素代謝と関連する分解性酵素、メタロチオネイン、グリセルアルデヒド-３-リン酸デヒドロゲナーゼ、及びマルトース及びガラクトースの利用を支配する酵素のプロモーター領域がある。酵母の発現に用いられる好適なベクターとプロモーターは欧州特許第７３６５７号に更に記載されている。また酵母エンハンサーも酵母プロモーターと共に好適に用いられる。
哺乳動物の宿主細胞におけるベクターからの本発明のポリペプチドの転写は、例えば、ポリオーマウイルス、伝染性上皮腫ウイルス、アデノウイルス(例えばアデノウイルス２)、ウシ乳頭腫ウイルス、トリ肉腫ウイルス、サイトメガロウイルス、レトロウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス及び典型的にはサルウイルス４０(ＳＶ４０)のようなウイルスのゲノムから得られるプロモーター、異種性哺乳動物プロモーター、例えばアクチンプロモーター又は免疫グロブリンプロモーター、ヒートショックプロモーターによって、提供されるこのようなプロモーターが宿主細胞系に適合し得る限り、調節される。
ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーターは、ＳＶ４０ウイルスの複製起点を更に含むＳＶ４０制限断片として簡便に得られる。ヒトサイトメガロウイルスの最初期プロモーターは、ＨｉｎｄIIIＥ制限断片として簡便に得られる。ベクターとしてウシ乳頭腫ウイルスを用いて哺乳動物宿主でＤＮＡを発現する系が、米国特許第４４１９４４６号に開示されている。この系の変更例は米国特許第４６０１９７８号に開示されている。また、単純ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼプロモーターの調節下でのマウス細胞におけるヒトβインターフェロンｃＤＮＡの発現について、Reyes等, Nature, 297：598-601(1982)を参照されたい。あるいは、ラウス肉腫ウイルス長末端反復をプロモーターとして使用することができる。

エンハンサーエレメント成分
より高等の真核生物による本発明のポリペプチドをコードしているＤＮＡの転写は、ベクター中にエンハンサー配列を挿入することによって増強され得る。哺乳動物の遺伝子由来の多くのエンハンサー配列が現在知られている(グロビン、エラスターゼ、アルブミン、α-フェトプロテイン及びインスリン)。典型的には、真核細胞ウイルス由来のエンハンサーが用いられるであろう。例としては、複製開始点の後期側のＳＶ４０エンハンサー(１００−２７０塩基対)、サイトメガロウイルス初期プロモーターエンハンサー、複製開始点の後期側のポリオーマエンハンサー及びアデノウイルスエンハンサーが含まれる。真核生物のプロモーターの活性化のための増強要素については、Yaniv, Nature, 297：17-18 (1982)もまた参照のこと。エンハンサーは、ポリペプチドコード配列の５'又は３'位でベクター中にスプライシングされ得るが、典型的にはプロモーターから５'位に位置している。

転写終結成分
真核生物宿主細胞(酵母、真菌、昆虫、植物、動物、ヒト、又は他の多細胞生物由来の有核細胞)に用いられる発現ベクターは、また転写の終結及びｍＲＮＡの安定化に必要な配列を含む。このような配列は、真核生物又はウイルスのＤＮＡ又はｃＤＮＡの５'、時には３'の非翻訳領域から一般に取得できる。これらの領域は、本発明のポリペプチドをコードしているｍＲＮＡの非翻訳部分にポリアデニル化断片として転写されるヌクレオチドセグメントを含む。一つの有用な転写終結成分はウシ成長ホルモンポリアデニル化領域である。国際公開第９４／１１０２６号とそこに開示した発現ベクターを参照されたい。

宿主細胞の選択及び形質転換
ここに記載のベクターに本発明のポリペプチドをコードするＤＮＡをクローニングあるいは発現するために適切な宿主細胞は、上述の原核生物、酵母、又は高等真核生物細胞である。この目的にとって適切な原核生物は、真正細菌、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物体、例えばエシェリチアのような腸内菌科、例えば大腸菌、エンテロバクター、エルウィニア(Erwinia)、クレブシエラ、プロテウス、サルモネラ、例えばネズミチフス菌、セラチア属、例えばセラチア・マルセスキャンス及び赤痢菌属、並びに桿菌、例えば枯草菌及びＢ．リチェフォルミス(licheniformis)(例えば、１９８９年４月１２日に公開されたＤＤ２６６７１０に開示されたバシリ・リチェニフォルミス４１Ｐ)、シュードモナス属、例えば緑膿菌及びストレプトマイセス属を含む。典型的には大腸菌クローニング宿主は大腸菌２９４(ＡＴＣＣ３１４４６)であるが、他の大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６(ＡＴＣＣ３１５３７)及び大腸菌Ｗ３１１０(ＡＴＣＣ２７３２５)のような株も好適である。これらの例は限定するものではなく例示的なものである。
原核生物に加えて、糸状菌又は酵母菌のような真核微生物は、本発明のポリペプチドをコードするベクターのための適切なクローニング又は発現宿主である。サッカロミセス・セレヴィシア、又は一般的なパン酵母は下等真核生物宿主微生物のなかで最も一般的に用いられる。しかしながら、多数の他の属、種及び菌株も、一般的に入手可能で、ここで使用でき、例えば、シゾサッカロマイセスポンベ；クルイベロマイセス宿主、例えばＫ.ラクティス、Ｋ．フラギリス(ＡＴＣＣ１２４２４)、Ｋ．ブルガリカス(ＡＴＣＣ１６０４５)、Ｋ．ウィッケラミイ(ＡＴＣＣ２４１７８)、Ｋ．ワルチイ(ＡＴＣＣ５６５００)、Ｋ．ドロソフィラルム(ＡＴＣＣ３６９０６)、Ｋ．サーモトレランス、及びＫ．マルキシアナス；ヤローウィア(欧州特許第４０２２２６号)；ピチア・パストリス(欧州特許第１８３０７０号)；カンジダ；トリコデルマ・リーシア(欧州特許第２４４２３４号)；アカパンカビ；シュワニオマイセス、例えばシュワニオマイセス・オクシデンタリス；及び糸状真菌、例えばパンカビ属、アオカビ属、トリポクラジウム、及びコウジカビ属(Aspergillus)宿主、例えば偽巣性コウジ菌(A. nidulans)及びクロカビ(A. niger)が使用できる。

本発明のグリコシル化ポリペプチドの発現に適切な宿主細胞は、多細胞生物から誘導される。無脊椎動物細胞の例には、植物及び昆虫細胞が含まれる。多数のバキュロウイルス株及び変異体及び対応する許容可能な昆虫宿主細胞、例えばスポドプテラ・フルギペルダ(毛虫)、アエデス・アエジプティ(蚊)、アエデス・アルボピクトゥス(蚊)、ドゥロソフィラ・メラノガスター(ショウジョウバエ)、及びボンビクス・モリが同定されている。トランスフェクションのための種々のウイルス株、例えば、オートグラファ・カリフォルニカＮＰＶのＬ-１変異体とボンビクス・モリＮＰＶのＢｍ-５株が公に利用でき、このようなウイルスは本発明においてここに記載したウイルスとして使用でき、特にスポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)細胞のトランスフェクションに使用できる。綿花、コーン、ジャガイモ、大豆、ペチュニア、トマト、及びタバコのような植物細胞培養を宿主として利用することもできる。
しかしながら、脊椎動物細胞におけるものが最も興味深く、培養(組織培養)中での脊椎動物細胞の増殖は常套的な手順になった。有用な哺乳動物宿主株化細胞の例は、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓ＣＶ１株 (ＣＯＳ-７, ＡＴＣＣＣＲＬ１６５１)；ヒト胚腎臓株(２９３又は懸濁培養での成長のためにサブクローン化された２９３細胞、Graham等, J. Gen Virol., 36：59 (1977))；ハムスター乳児腎細胞(ＢＨＫ, ＡＴＣＣＣＣＬ１０)；チャイニーズハムスター卵巣細胞／-ＤＨＦＲ(ＣＨＯ, Urlaub等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77：4216 (1980))；マウスのセルトリ細胞(ＴＭ４, Mather, Biol. Reprod., 23：243-251 (1980))；サルの腎細胞 (ＣＶＩＡＴＣＣＣＣＬ７０)；アフリカミドリザルの腎細胞(ＶＥＲＯ-７６, ＡＴＣＣＣＲＬ-１５８７)；ヒト子宮頸癌細胞 (ＨＥＬＡ, ＡＴＣＣＣＣＬ２)；イヌ腎細胞 (ＭＤＣＫ, ＡＴＣＣＣＣＬ３４); バッファローラット肝細胞 (ＢＲＬ３Ａ, ＡＴＣＣＣＲＬ１４４２)；ヒト肺細胞 (Ｗ１３８, ＡＴＣＣＣＣＬ７５)；ヒト肝細胞 (ＨｅｐＧ２, ＨＢ８０６５)；マウス乳房腫瘍(ＭＭＴ０６０５６２, ＡＴＴＣＣＣＬ５１)；ＴＲＩ細胞(Mother等, Annals N.Y. Acad. Sci., 383：44-68 (1982))；ＭＲＣ５細胞；ＦＳ４細胞；ヒト肝癌株(ＨｅｐＧ２)である。
宿主細胞は、本発明のポリペプチド生産のための上述した発現又はクローニングベクターで形質転換し、プロモーターを誘導し、形質転換体を選択し、又は所望の配列をコードしている遺伝子を増幅するために適当に修飾された常套的栄養培地で培養する。

宿主細胞の培養
本発明のポリペプチドを生成するために用いられる宿主細胞は種々の培地において培養することができる。市販培地、例えばハム(Ham)のＦ１０(Sigma)、最小必須培地((ＭＥＭ), Sigma)、ＲＰＭＩ-１６４０(Sigma)、及びダルベッコの改良イーグル培地((ＤＭＥＭ), Sigma)が宿主細胞の培養に好適である。また、Ham等, Meth. Enz. 58：44 (1979), Barnes等, Anal. Biochem. 102：255 (1980), 米国特許第４７６７７０４号；同４６５７８６６号；同４９２７７６２号；同４５６０６５５号；又は同５１２２４６９号；国際公開第９０／０３４３０；国際公開第８７／００１９５；又は米国特許再発行第３０９８５号に記載された任意の培地も宿主細胞に対する培地として使用できる。これらの培地はいずれも、ホルモン及び／又は他の成長因子(例えばインスリン、トランスフェリン、又は表皮成長因子)、塩類(例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム及びリン酸塩)、バッファー(例えばＨＥＰＥＳ)、ヌクレオチド(例えばアデノシン及びチミジン)、抗生物質(例えば、ゲンタマイシン^ＴＭ薬)、微量元素(最終濃度がマイクロモル範囲で通常存在する無機化合物として定義される)、及びグルコース又は同等のエネルギー源を必要に応じて補充することができる。任意の他の必要な補充物質もまた当業者に知られている適当な濃度で含むことができる。培養条件、例えば温度、ｐＨ等々は、発現のために選ばれた宿主細胞について以前から用いられているものであり、当業者には明らかであろう。

ポリペプチド精製
本発明のポリペプチドないしタンパク質は被検体から採取されうる。組換え技術を用いる場合、本発明のポリペプチドは、細胞内に、細胞膜周辺腔に、又は培地に直接分泌されうる。本発明のポリペプチドは、培養培地又は宿主細胞溶解物から回収されてもよい。膜結合である場合、適切な清浄液(例えばトリトン-Ｘ１００)を用いるか、又は酵素の切断によって膜から放出されうる。本発明のポリペプチドの発現に用いられる細胞は、様々な物理的又は化学的な手段、例として、凍結-解凍循環、超音波処理、物理的な破壊又は細胞溶解剤によって破壊されうる。
適切なタンパク質精製手順の例は以下の手順である：イオン交換カラムによる分画；エタノール沈殿；逆相ＨＰＬＣ；二酸化ケイ素によるクロマトグラフィ、ヘパリンＳＥＰＨＡＲＯＳＥ^ＴＭによるクロマトグラフィ、陰イオン又陽イオン交換樹脂(例えばポリアスパラギン酸カラム、ＤＥＡＥなど)によるクロマトグラフィ；等電点電気泳動；ＳＤＳ-ＰＡＧＥ；硫酸アンモニウム沈殿；例えば、セファデックスＧ-７５を用いたゲル濾過；ＩｇＧなどの混入物を除去するためのプロテインＡセファロースカラム；及び、本発明のポリペプチドのエピトープタグ付加形態を結合するための金属キレートカラム。タンパク質精製に様々な方法が用いられてもよく、このような方法は当分野で公知であり、例えばDeutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990)；Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982)の実施例に記述される。選択される精製工程(一又は複数)は、例えば、使用する生産プロセス及び生産される本発明の特定のポリペプチドの性質に依存するであろう。
例えば、細胞から調製されるＶＥＧＦ組成物は、例えば、ヒドロキシラパタイトクロマトグラフィ、ゲル電気泳動、透析及びアフィニティクロマトグラフィ、及び典型的な親和性技術であるアフィニティクロマトグラフィを用いて精製されうる。アフィニティーリガンドとしてのプロテインＡの適合性は、抗体中に存在する免疫グロブリンＦｃ領域の種及びアイソタイプに依存する。プロテインＡは、ヒトγ１、γ２、又はγ４重鎖に基づく抗体の精製に用いることができる(Lindmark等, J. immunol. Meth. 62: 1-13 (1983))。プロテインＧは、全てのマウスアイソタイプ及びヒトγ３に推奨されている(Guss等, EMBO J. 5: 16571575 (1986))。アフィニティーリガンドが結合されるマトリクスはアガロースであることが最も多いが、他の材料も使用可能である。孔制御ガラスやポリ(スチレンジビニル)ベンゼン等の機械的に安定なマトリクスは、アガロースで達成できるものより早い流速及び短い処理時間を可能にする。抗体がＣ_Ｈ３ドメインを含む場合、Bakerbond ABX^TM樹脂(J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)が精製に有用である。タンパク質精製のための他の技術、例えば上記のものも回収する抗体に依存して利用可能である。また、大腸菌の周辺腔に分泌される抗体を単離するための手順を記載しているCarter等, Bio/Technology 10:163-167 (1992)も参照のこと。

薬剤的組成物
本発明の薬剤の製薬的製剤(ＶＥＧＦアンタゴニスト、骨髄性細胞減少剤、ＵＲＣＧＰアンタゴニスト、ＵＲＲＴＰアンタゴニスト、ＤＲＣＧＰアゴニスト、ＤＲＲＴＰアゴニスト又は抗癌剤)とその組み合わせ及び本発明に関して用いられる本明細書中に記載のものは、所望の純度を持つ抗体と、場合によっては生理学的に許容される担体、賦形剤又は安定化剤を混合することにより(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.[1980])、凍結乾燥又は水溶液の形態に調製されて保存される。許容される担体、賦形剤又は安定化剤は、用いられる用量と濃度でレシピエントに非毒性であり、ホスフェート、シトレート、及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存料(例えばオクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；ヘキサメトニウムクロリド；ベンザルコニウムクロリド、ベンズエトニウムクロリド；フェノール、ブチル又はベンジルアルコール；メチル又はプロピルパラベン等のアルキルパラベン；カテコール；レゾルシノール；シクロヘキサノール；３-ペンタノール；及びｍ-クレゾール)；低分子量(約１０残基未満)のポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；グルコース、マンノース、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート化剤；スクロース、マンニトール、トレハロース又はソルビトール等の糖；ナトリウム等の塩形成対イオン；金属錯体(例えば、Ｚｎ-タンパク質複合体)；及び／又はTWEEN^TM、PLURONICS^TM又はポリエチレングリコール(ＰＥＧ)等の非イオン性界面活性剤を含む。

また活性成分は、例えばコアセルベーション技術あるいは界面重合により調製されたマイクロカプセル、例えばそれぞれヒドロキシメチルセルロース又はゼラチンマイクロカプセル及びポリ-(メタクリル酸メチル)マイクロカプセルに、コロイド状ドラッグデリバリー系(例えば、リポソーム、アルブミンミクロスフィア、マイクロエマルション、ナノ-粒子及びナノカプセル)に、あるいはマクロエマルションに捕捉させてもよい。このような技術は、Remington’s Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed.[1980]に開示されている。
インビボ投与に使用される製剤は無菌でなければならない。これは、滅菌濾過膜を通して濾過することにより容易に達成される。
徐放性調合物を調製してもよい。徐放性調合物の好ましい例は、本発明のポリペプチドを含む疎水性固体ポリマーの半透性マトリクスを含み、そのマトリクスは成形物、例えばフィルム又はマイクロカプセルの形態である。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ヒドロゲル(例えば、ポリ(２-ヒドロキシエチルメタクリレート)、又はポリ(ビニルアルコール))、ポリラクチド(米国特許第3773919号)、Ｌ-グルタミン酸とγエチル-Ｌ-グルタメートのコポリマー、非分解性エチレン-酢酸ビニル、分解性乳酸-グリコール酸コポリマー、例えばＬＵＰＲＯＮＤＥＰＯＴ^ＴＭ(乳酸-グリコール酸コポリマー及び酢酸ロイプロリドからなる注射可能なミクロスフィア)、及びポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸が含まれる。エチレン-酢酸ビニル及び乳酸-グリコール酸等のポリマーは、分子を１００日以上かけて放出することを可能にするが、ある種のヒドロゲルはタンパク質をより短い時間で放出する。カプセル化された抗体が体内に長時間残ると、３７℃の水分に曝露された結果として変性又は凝集し、生物活性を喪失させ免疫原性を変化させるおそれがある。合理的な戦略を、関与するメカニズムに応じて安定化のために案出することができる。例えば、凝集機構がチオ-ジスルフィド交換による分子間Ｓ-Ｓ結合の形成であることが見いだされた場合、安定化はスルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥させ、水分含有量を制御し、適当な添加剤を使用し、また特定のポリマーマトリクス組成物を開発することによって達成されうる。例として、高分子電解質被覆によるカプセルを記載している米国特許第６６９９５０１号も参照のこと。

さらに、本発明の薬剤(例えばＶＥＧＦアンタゴニスト、骨髄性細胞減少剤、化学療法剤又は抗癌剤)が遺伝子治療によって被検体に導入されうることを考慮する。遺伝子治療は、被検体への核酸の投与によって行われる治療を指す。遺伝子治療適用において、例えば欠損した遺伝子の置換のために、遺伝子を細胞に導入して、治療的に有効な遺伝子産物のインビボ合成を達成する。「遺伝子治療」には、永続的な効果が単一の治療によって達成される従来の遺伝子治療と遺伝子治療薬の投与の両方が含まれ、治療的に有効なＤＮＡ又はｍＲＮＡの１回の投与又は繰り返し投与を伴う。アンチセンスＲＮＡ及びＤＮＡはインビボのある遺伝子の発現を遮断するための治療剤として用いられる。短いアンチセンスオリゴヌクレオチドは、細胞膜による取り込みに制限されて細胞内濃度が低くなるが、インヒビターとして働く細胞内に移入することができることが既に報告されている(Zamecnik等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 (1986))。オリゴヌクレオチドは、例えば負に荷電するホスホジエステル基を非荷電基に置換することによって修飾して、それらの取り込みを上げることができる。遺伝子治療の方法の一般的な概念については、例として、Goldspiel等 Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993)；Wu and Wu Biotherapy 3:87-95 (1991)；Tolstoshev Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993)；Mulligan Science 260:926-932 (1993)；Morgan and Anderson Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993)；及び、May TIBTECH 11:155-215 (1993)を参照。用いられうる組換えＤＮＡ技術の当分野で公知の共通の方法は、Ausubel等 eds. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; and Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NYに記述される。

核酸を生細胞に導入するために利用可能な様々な技術がある。技術は、核酸がインビトロ又はインビボで意図した宿主の細胞の培養細胞にトランスファーされるかどうかによって異なる。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸のトランスファーに好適な技術には、リポソーム、エレクトロポレーション、マイクロインジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法などが含まれる。一般に好適なインビボ遺伝子導入技術には、ウイルス(一般的にレトロウイルス)ベクターによる形質移入及び、ウイルスコートタンパク質-リポソーム媒介性形質移入が含まれる(Dzau等, Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993))。例えば、インビボ核酸導入技術には、ウイルスベクター(例えばアデノウイルス、単純ヘルペスIウイルス、レンチウイルス、レトロウイルス又は、アデノ関連ウイルス)及び脂質ベースのシステム(遺伝子の脂質媒介トランスファーに有用な脂質は、例えばＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ-Ｃｈｏｌである)が含まれる。遺伝子治療にウイルスベクターを使用する例は、Clowes等 J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994)；Kiem等 Blood 83:1467-1473 (1994)；Salmons and Gunzberg Human Gene Therapy 4:129-141 (1993)；Grossman and Wilson Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993)；Bout等 Human Gene Therapy 5:3 -10 (1994)；Rosenfeld等 Science 252:431-434 (1991)；Rosenfeld等 Cell 68:143-155 (1992)；Mastrangeli等 J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993)；及び、Walsh等 Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204: 289-300 (1993)に見られる。
ある場合では、標的細胞を標的とする薬剤、例えば細胞表面膜タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターのリガンドなどを核酸供給源に供給することが望ましい。リポソームが使用される場合、エンドサイトーシスに関与する細胞表面膜タンパク質と結合するタンパク質は、例えばある種類の細胞に向性があるキャプシドタンパク質又はその断片、細胞周期への内部移行を行うタンパク質に対する抗体、細胞内局在化を標的とし、細胞内半減期を亢進するタンパク質のターゲティングのため及び／又はこれらの取り込みを容易にするために用いられうる。レセプター媒介性エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432 (1987)；及び、Wagner等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 3410-3414 (1990)に記載される。遺伝子マーキング及び遺伝子治療プロトコール野概要については、Anderson等, Science 256, 808-813 (1992)を参照のこと。

用量及び投与
本発明の薬剤(ＶＥＧＦアンタゴニスト、骨髄性細胞減少剤、化学療法剤又は抗癌剤)は、ヒト患者に、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路、及び／又は皮下投与などにより投与される。
ある実施態様では、本発明の治療はＶＥＧＦアンタゴニストと一又は複数の骨髄性細胞減少剤ないし化学療法剤との併用投与を伴う。一実施態様では、付加的な抗癌剤、例えば、一又は複数の異なる抗血管新生剤、一又は複数の化学療法剤などが存在する。また、本発明は、複数のインヒビター、例えば同じ抗原に対する複数の抗体又は本発明の異なるタンパク質に対する複数の抗体の投与を考慮する。一実施態様では、異なる化学療法剤の混合物が、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び／又は一又は複数の骨髄性細胞減少剤と投与される。併用投与は、別々の製剤又は単一の製薬的製剤による同時投与、及び／又はいずれかの順序での連続投与が含まれる。例えば、ＶＥＧＦアンタゴニストは、骨髄性細胞減少剤又は化学療法剤の投与の前、後、交互に行われるか、又はこれらと同時になされうる。一実施態様では、両方(又はすべて)の活性剤が同時にその生物学的活性を及ぼす一定時間がある。
疾患の予防又は治療のために、本発明の薬剤の好適な用量は、上記に定義した治療する疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及びインヒビターへの応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。インヒビターは一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。併用療法投与計画では、本発明の組成物は治療的有効量又は治療的相乗作用量で投与される。本明細書中で用いられるように、治療的有効量は、本発明の組成物の投与及び／又はＶＥＧＦアンタゴニスト及び一又は複数の他の治療剤の同時投与により標的とする疾患又は症状が減少又は阻害される量である。薬剤の組み合わせの投与効果は付加的であってもよい。一実施態様では、投与の結果は相乗効果である。治療的相乗作用量は、特定の疾患に関係する状態又は症状を相乗作用的に又は有意に減少ないし除去するために必要な、ＶＥＧＦアンタゴニスト及び一又は複数の他の治療剤、例えば骨髄性細胞減少剤、化学療法剤又は抗癌剤の量である。

疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ(例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ)のＶＥＧＦアンタゴニスト又は骨髄性細胞減少剤、化学療法剤、又は抗癌剤が、例えば一以上の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量である。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。しかしながら他の用量処方が有用であるかもしれない。典型的には、臨床医は、必要とされる生物学的な効果が生じる用量(一又は複数)が達成されるまで本発明の分子(一又は複数)を投与するであろう。本発明の治療の経過は従来の技術及びアッセイにより用意にモニターされる。
例えば、血管新生インヒビター、例えばアバスチン(登録商標)(Genentech)などの抗ＶＥＧＦ抗体の調製及び投与計画は製造者の指示に従って用いられても、当業者によって経験的に決定されてもよい。他の例では、このような化学療法剤の調製及び投与計画は製造者の指示に従って用いられても、当業者によって経験的に決定されてもよい。化学療法の調製及び投与計画はChemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載される。

治療の効果
本発明の治療の有効性は、新生物ないし非新生物疾患を治療する際に共通に用いられる様々なエンドポイントによって決定することができる。例えば、癌治療は、限定するものではないが、腫瘍再発、腫瘍重量ないしサイズの収縮、進行時間、生存期間、進行がない生存、全体の応答速度、応答の継続期間、生活の質、タンパク質の発現及び／又は活性などで評価されてもよい。本明細書に記載の抗血管新生剤は腫瘍の血管をターゲットとするのであって、新生物細胞自体をターゲットとする必要はないので、抗癌剤の特定のクラスを示し、それゆえに薬剤に対する臨床応答の特定の測定と定義を必要としうる。例えば、二次元分析において５０％より大きい腫瘍の収縮は応答を示す標準のカットオフである。しかし、本発明のインヒビターは原発性腫瘍を収縮することなく転移の拡がりを阻害するか、又は単に腫瘍抑制(tumouristatic)効果を及ぼしうる。したがって、例えば血管新生の血漿又は尿路マーカーの測定及び放射線画像法による応答の測定などの、治療の有効性を決定する手法が用いられうる。

製造品
本発明の他の実施態様では、上記の疾病の治療又は診断に有用な材料を具備する製造品が提供される。該製造品は容器、ラベル及びパッケージ挿入物を具備する。好適な容器には、例えば、ビン、バイアル、シリンジ等々が含まれる。容器は、様々な材料、例えばガラス又はプラスチックから形成されうる。一実施態様では、容器は、症状を治療するのに有効な組成物を収容し、滅菌アクセスポートを有しうる(例えば、容器は皮下注射針が貫通可能なストッパーを有するバイアル又は静脈内投与溶液バッグでありうる)。組成物中の少なくとも一つの活性剤はＶＥＧＦモジュレーターであり、少なくとも２つ目の活性剤は骨髄性細胞減少剤及び／又は化学療法剤である。容器に添付又は付属するラベルは、組成物が選択した症状の治療に使用されることを示す。さらに製造品は、薬学的に許容されるバッファー、例えばリン酸緩衝生理食塩水、リンガー液及びデキストロース溶液を含む第二の容器を更に具備してもよい。他の実施態様では、容器は耐性腫瘍を検出するための診断用であるマーカーセットを収容する。組成物内の少なくとも一薬剤は、Ｇｒ１、好中球エラスターゼ、ＣＤ１９、ＣＤ９０、ＣＤ１１ｃ、ＵＲＣＧＰ、ＵＲＲＴＰ、ＤＲＣＧＰ及び／又はＤＲＲＴＰを検出するためのマーカーである。容器に添付又は付属するラベルは、組成物がＶＥＧＦアンタゴニスト治療に耐性がある腫瘍の診断に使用されることを示す。さらに、本発明の製造品には、更なる活性剤、他のバッファー、希釈剤、フィルター、針、及びシリンジを含む、商業上及び使用者の見地から望ましい他の材料を含んでもよい。

本明細書に記載の実施例及び実施態様は例示的な目的のためだけであって、その見地への様々な修飾又は変更が当業者に示唆され、本出願の精神及び権限内及び添付の特許請求の範囲内に包含されるものであることは理解されるであろう。

実施例１：ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄性細胞によって与えられる抗ＶＥＧＦ治療に対する腫瘍の耐性
抗血管内皮増殖因子(ＶＥＧＦ)処置に対して実験的腫瘍の耐性を引き起こす細胞性かつ分子の現象を調べた。骨髄由来細胞の動員(recruitment)と抗ＶＥＧＦ処置に対する腫瘍耐性の発達との間の相関性が明らかとなった。腫瘍混合実験から、抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍を有する(が抗ＶＥＧＦ感受性腫瘍を有さない)マウスの骨髄又は腫瘍から単離したＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞は抗ＶＥＧＦ処置に対して十分耐性を与えることが示された。インビトロでは、(抗ＶＥＧＦ感受性腫瘍でなく)抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍の条件培地はＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の移動を促した。原発腫瘍に対するＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の動員は、細胞性メカニズムが抗ＶＥＧＦ処置に対する耐性を媒介することを表す。腫瘍で刺激したＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の遺伝子発現分析から、耐性腫瘍によって制御される遺伝子の異なった一群が同定された。ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋骨髄性細胞の流動化及び活性化は、抗ＶＥＧＦ処置に対する耐性の発達に２つの工程を表しうる。さらに抗ＶＥＧＦと骨髄性細胞をターゲティングする化合物との併用療法が腫瘍血管新生及び増殖を抑制し、抗ＶＥＧＦ耐性の発生を遅らせたことから、骨髄性細胞とＶＥＧＦとをターゲットとする化合物を組み合わせると治療的利益が生じることが示唆される。

方法
細胞株。ＥＬ４、ＬＬＣ、Ｂ１６Ｆ１及びＴＩＢ６(Ｊ５５８)腫瘍細胞株はアメリカ培養細胞系統保存機関(ＡＴＣＣ)から取得し、ダルベッコ変更培地(ＤＭＥＭ)の組織培地にて維持し、１０％ウシ胎仔血清(ＦＢＳ)と２ｍＭグルタミンを添加した。「Ｂ１６Ｆ１」及び「Ｂ１６」なる用語は本明細書中で交換可能に用いられ、同じメラノーマ細胞株を意味する。
抗体。抗ＶＥＧＦ、例えばＧ６-２３は、ＶＥＧＦのマウス及びヒトの形態に結合して、効力を消す抗体である。ファージディスプレイ技術から、ＩｇＧ部はマウスのアイソタイプＩｇＧ２ａを含み(例えば、Malik, A.K.等 Redundant roles of VEGF-B and PlGF during selective VEGF-A blockade in mice. Blood 107:550-7 (2006)を参照)、特に明記しない限り、週２回１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰで投与したアイソタイプが一致するコントロール抗体は、抗ヒトブタクサ-ＩｇＧ２ａ(Genentech, Inc.)とした。抗ＣＤ１１ｂ＋抗体(eBioSciences)、抗Ｌセレクチン(BD BioSciences)及び抗ＣＸＣＲ４ (Torrey Pines Lab)をＦＡＣＳ実験に用いた。抗Ｇｒ１ＭＡｂ(eBioSciences, CA or BD BioSciences, CA)を週に２回１０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰで投与した。Ｃ５７Ｂｌ／６マウス(ｎ＝５)に５×１０^６のＥＬ４又はＬＬＣ細胞を移植した後の１日目からエラスターゼインヒビター(１ｍｇ／マウス；eBiosciences, San Diego, CA)を、毎日ＩＰ投与した。腫瘍測定は週２回行い、最終腫瘍重量を上記の通りに測定した。

Ｃ５７ＢＬ／６ＧＦＰキメラマウスモデル。６〜８週齢のＣ５７ＢＬ／６と増強緑色蛍光タンパク質(ＥＧＦＰ)トランスジェニックマウス(Ｃ５７ＢＬ/６-ＴｇＮ；ＡＣＴｂＥＧＦＰ;１Ｏｓｂ; ＪＡＸｓｔｏｃｋ# ００３２９１)は、それぞれCharles River LaboratoriesとJackson Laboratoriesから入手した。ＥＧＦＰは、ＥＧＦＰトランスジェニックマウスのすべての細胞に多く存在するβ-アクチンプロモーターによって制御される(例として、Okabe, M., Ikawa, M., Kominami, K., Nakanishi, T. & Nishimune, Y. 'Green mice' as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett 407:313-9 (1997)を参照)。Ｃ５７ＢＬ／６ＧＦＰキメラマウスは、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに致死線量照射(１１Ｇｙ、Ｃｓ-発光体)を行い、内在性骨髄を切除した後に、ＥＧＦＰトランスジェニックマウスから単離した５×１０^６のＢＭＭＮＣを救出(rescue)して作製した。ＢＭＭＮＣは前述したように調製した(Gerber, H.P.等 VEGF regulates haematopoietic stem cell survival by an internal autocrine loop mechanism. Nature 417:954-8. (2002)を参照)。キメラマウスのすべての腫瘍異種移植片実験は、造血再構成の少なくとも４週後に行った。腫瘍増殖実験では、５×１０^６のマウスのＥＬ４又はＬＬＣ腫瘍細胞を、背面領域に皮下注入した。ＸＩＤマウスの実験では、１×１０^７のＬＬＣ又はＥＬ４腫瘍細胞を移植した。

Ｂ１６Ｆ１混合実験。ベージュヌードＸＩＤ(Harlan Sprague Dawley)又はC57BL/6マウス(Jackson Lab, Bar harbor)、又はＧＦＰ骨髄キメラマウスにおいて腫瘍増殖実験を行った。５×１０^６ないし１０^７の腫瘍細胞(示すように)を、２００μｌのマトリゲル(Growth Factor reduced；BD BioSciences, CA)に再懸濁し、マウスの背面の側腹領域に皮下注入した。骨髄混合実験では、骨髄から単離した１０^６のＢＭＭＮＣ又はＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞を、２．５×１０^６のＢ１６Ｆ１細胞を含む２００μｌのマトリゲル(BD BioSciences)と混合し、すぐにＣ５７ＢＬ／６マウスの側腹部に移植した。腫瘍ＧＦＰ＋／ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋混合実験では、記述したように、２×１０^６のＢ１６Ｆ１細胞を３×１０^５のＧＦＰ＋細胞と混合して、移植した。抗ＶＥＧＦ(Ｇ６-２３)又はコントロール(抗ブタクサ)抗体処置を、腫瘍細胞接種の４日後に開始した。腫瘍が触診可能なサイズに達した後に、腫瘍サイズを週に２〜３回、Ｖｅｒｎｉｅｒカリパスを用いて評価した。腫瘍体積は、最長の直径をＬ、Ｌに垂直位置にある直径をＷとしたＰｉ／６×Ｌ×Ｗ×Ｗ式を用いて決定した。

化学療法。Ｃ５７Ｂｌ／６マウスに、ＴＩＢ６、Ｂ１６Ｆ１、ＥＬ４及びＬＬＣ細胞株に移植した。マウスには、腫瘍細胞移植が定着した後の最初の４日間にはどんな処置も施さなかった。５-フルオロウラシル(５ＦＵ、American Pharmaceutical Partner, IL; ５０ｍｇ／ｋｇ、週に１回)とゲムシタビン(Eli Lilly Co, IN, １２０ｍｇ／ｋｇ、週に２回)を含む化学療法剤をＩＰ投与した。記述したように、腫瘍体積を週に２回測定し、算出した。

免疫組織化学(ＩＨＣ)。免疫蛍光分析では、腫瘍を回収して、凍結切片の最適切除温度(ＯＣＴ)培地にて凍結した。すべての６μｍの腫瘍凍結切片を室温で１時間かけて乾燥させ、−２０℃で１０分間かけてアセトンにて固定した。室温にて４分間風乾した後、２０％通常ヤギ血清(NGS, GIBCO #16210-064；リン酸緩衝生理食塩水(「ＰＢＳ」)にて調製)中で室温で１時間インキュベートすることによって非特異的な結合部位をブロックした。ＤＡＫＯブロック溶液(DakoCytomation, CA)にて以下の抗体、２０μｇ／ｍｌに希釈して室温に１時間置いたウサギ抗ＧＦＰＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ４８８コンジュゲート(Molecular Probes)、１：５００に希釈して室温に１時間置いたヤギ抗ウサギAlexaFluor４８８コンジュゲート(Molecular Probes)、１：１００に希釈して４℃に終夜置いたラット抗マウスＰＥＣＡＭ-１(クローンＭＥＣ１３.３；BD Pharmingen) 、及び１：５００に希釈して室温に１時間置いたヤギ抗ラットＡｌｅｘａＦｌｕｏｒ５９４コンジュゲート(Molecular Probes)にて切片を順に染色した。スライドを洗浄して、ＤＡＫＯ蛍光マウント培地に設置して、Ｐｌａｎ-Ｎｅｏｆｌｕａｒ２０×対物レンズを具備したＮｉｋｏｎ顕微鏡にて免疫蛍光画像を収集し、デジタル処理で統合した。

血管表面積(ＶＳＡ)測定値。２０×対物レンズを用いたＣＤ３１染色切片のデジタル画像から腫瘍血管表面積を定量した。典型的に、カットオフとして５０−７０に閾値を予め設定したＩｍａｇｅＪソフトウェアによって染色した血管に対応するピクセルを選別した。汚染(非血管)逸脱ピクセルを推定した。別段示さない限り、１群当たり合計３〜５の腫瘍を分析した。各々の腫瘍切片から合計１５の画像を撮り、各々の画像は１５０２μｍ^２の領域をカバーしていた。別段示さない限り、各群のバックグラウンド染色は標識したコントロール抗体を用いて決定し、総脈管カウントから減算した。分析した総領域と総画像領域に比較した集積血管ピクセル領域を％脈管／表面領域として表す。一実施態様では、血管表面積は、限定するものではないが、磁気共鳴画像、動力学的造影磁気共鳴画像、コンピュータ断層撮影(ＣＴ)及び陽電子放出断層撮影(ＰＥＴ)を含む非侵襲性定量法を用いて定量することができる。例として、O'Connor等, British Journal of Cancer 96:189-195 (2007)を参照。ある実施態様では、ガドリニウム造影剤及びその誘導体及び複合体が、磁気共鳴画像に用いられてもよい。

フローサイトメトリー。コントロール及び抗ＶＥＧＦにて処置したマウスの腫瘍を単離し、腫瘍組織を切り刻み、細胞ホモジナイザー(ＶＷＲ)にて処理することによって単個細胞浮遊液を生成した。移植した動物の大腿骨及び脛骨からＢＭＭＮＣを流し出し、ＡＣＫ溶解バッファ(Cambrex, MA)にてＲＢＣ溶解を行った。後眼窩血から末梢血を採取し、赤血球溶解のために４０μｌの末梢血をＡＣＫバッファにて前処理した。
ＢＭ、腫瘍又は末梢血からの細胞を、好適なアイソタイプコントロールとともに、一連のモノクローナル抗体、例えば、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ１、ＣＤ１９、ＣＤ９０、ＶＥＧＦＲ２、ＣＸＣＲ４、Ｌ-セレクチン２(すべてBD BioSciences, CAより)、ＶＥＧＦＲ１ (R&D, CA)、Ｔｉｅ２ (eBioSciences, CA)にて染色し、各々の区画の骨髄系リンパ系の分画を調査した。ＦＡＣＳデータをＦＡＣＣ内径にセットして、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔＰｒｏソフトウェア(BD Biosciences)により分析した。
ＧＦＰ＋細胞及び／又はＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋を単離するために、単個細胞浮遊液を、移植したマウスの骨髄又は腫瘍から準備した。細胞はＡＰＣにコンジュゲートした抗ＣＤ１１ｂとＰＥにコンジュゲートした抗Ｇｒ１にて染色した。ＧＦＰ、ＧＦＰ−、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋及びＣＤ１１ｂ−Ｇｒ１−細胞の集団をＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅ器にて単離し、分類後分析により各区画中の対象とする細胞群の純度を確認した。

マイクロアレイ。骨髄由来のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞のＲＮＡをＱｉａｇｅｎＲｎｅａｓｙキット(Qiagen)を用いて単離した。相補的ＲＮＡ(ｃＲＮＡ)の調製及びアレイのハイブリダイゼーション／スキャンのための方法は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ (Affymetrix, Inc.)によって提供された。５μｇの全ＲＮＡをｃＤＮＡ合成キット(SuperScript Choice, GIBCO/BRL)とＴ７-(ｄＴ)２４オリゴマープライマー(Biosearch Technologies, Inc., Custom Synthesis)を用いて二本鎖ｃＤＮＡに変換した。二本鎖ｃＤＮＡを親和性樹脂(試料精製部品キット、Affymetrix, Inc.)とエタノール沈殿にて精製した。二本目の鎖を合成した後、インビトロ転写反応(Enzo Biochem, Inc.)にてＴ７ＲＮＡポリメラーゼとビオチン標識ヌクレオチドを用いてｃＤＮＡ試料から標識したｃＲＮＡを生成した。標識したｃＲＮＡを親和性樹脂(試料精製部品キット、Affymetrix)にて精製した。標識したｃＲＮＡの量は、２６０ｎｍの１ＯＤが４０μｇ／ｍｌに相当する従来法を用いて２６０ｎｍの吸光度を測定することによって決定した。２０μｇのｃＲＮＡを、４０ｍＭトリス-アセテート(ｐＨ８．１)、１００ｍＭ酢酸カリウム及び３０ｍＭ酢酸マグネシウムにて９４℃で３０分間インキュベートすることによって断片化した。次いで、試料を６０回転数／分の回転式オーブンにて１９時間かけてマウスゲノム４３０２．０アレイにハイブリダイズさせた。アレイを洗浄し、染色し、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ流体観測点及びスキャナにてスキャンした。ＡｆｆｙｍｅｔｒｉｘＧｅｎｅＣｈｉｐ分析ソフトウェア又はＳｐｏｔｆｉｒｅソフトウェア(Sportfire, MA)を用いてデータ分析を行った。参照ＲＮＡの少なくとも１．５倍のシグナル強度を有する遺伝子を更なる分析のために選択した。次に、相当するＢ１６Ｆ１群と比較して、ＥＬ４及びＬＬＣ試料において有意差(ｐ≦０．０５)をもって発現した(ＣＤ１１ｂ分析では１．５倍以上、腫瘍分析では２倍以上)遺伝子を最終分析に選んだ。Spotfire (Spotfire)ソフトウェアのアルゴリズムを用いてすべての腫瘍及びＣＤ１１ｂデータについて階層的遺伝子クラスター分析を行った。

細胞移動アッセイ。ＦＡＣＳ分析について記載したように腫瘍細胞を単離し、ＤＭＥＭ、１０％ＦＣＳ及び４ｍＭグルタミン培地に１×１０^６細胞／ｍｌで播き、ＣＯ_２組織培養インキュベーターにて４日間置いた。Ａｍｉｃｏｎスピンカラム(Millipore)を用いて培地を元の容量と比例して濃縮した。６００μｌの３通りの試料を、トランスウェル細胞移動プレート(Corning)に用いた。Ｃ５７ＢＬ／６マウスから単離した２．５×１０^４の新しく単離したＢＭＭＮＣをＤＭＥＭに再懸濁して、トランスウェルプレートの上部チャンバーに設置し、その後３７℃で９時間インキュベートし、下部チャンバー中の細胞を数えることによってＢＭＭＮＣの移動能を測定した。
統計。ＡＮＯＶＡを用いて、有意差を決定した。≦０．０５のｐ値を有意とみなした。

結果
抗-ＶＥＧＦ処置に対する耐性は最適以下の投薬では引き起こされず、リンパ球に非依存性である
抗-ＶＥＧＦ処置腫瘍での骨髄由来細胞(ＢＭＣ)の同一性と相対的存在量の評価を可能にする実験モデルを確立するために、緑色蛍光タンパク質標識(ＧＦＰ＋)骨髄腫単核細胞(ＢＭＭＮＣ)を、致死的に照射したＣ５７ＢＬ／６マウスに養子移植した(例えばOkabe, M.等, 'Green mice' as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett 407:313-9 (1997)を参照)。Ｃ５７ＢＬ／６同系腫瘍細胞株をＧＦＰ＋骨髄腫キメラマウスに移植し、腫瘍増殖及び血管新生に対するＶＥＧＦ中和抗体(Ｇ６−２３(例えばMalik, A.K.等 Redundant roles of VEGF-B and PlGF during selective VEGF-A blockade in mice. Blood (2005)を参照)を評価した。これらの細胞株は、メラノーマ細胞株(Ｂ１６Ｆ１)、２種のＴ細胞リンパ腫細胞株(ＥＬ４及びＴＩＢ６)、及びルイス肺癌(ＬＬＣ)細胞株を含んでいた。「Ｂ１６Ｆ１」及び「Ｂ１６」なる用語はここでは交換可能に使用され、同じメラノーマ細胞株を意味する。Ｂ１６Ｆ１腫瘍の増殖は抗-ＶＥＧＦ(Ｇ６−２３)によってブロックされた(図１ａ)。別の実験では、ＴＩＢ６腫瘍の増殖は抗-ＶＥＧＦによってブロックされた。しかしながら、ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍は一過性に抑制されただけであり、初期の増殖遅延後は、腫瘍は急に広がり始めた(図１ａ)。同様に、免疫無防備状態のベージュヌードＸ連鎖免疫不全(ＸＩＤ)マウスに移植したＥＬ４腫瘍(図１ｂ)及びＬＬＣ腫瘍(図１ｃ)のＧ６−２３処置は、試験した全用量において一過性の腫瘍増殖遅延を生じただけであった。これらの知見は、抗-ＶＥＧＦ処置に対する耐性がＴリンパ球及びＢリンパ球依存的な形で生じることを示している。ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍の耐性はこのモデルでは最適以下の用量の抗-ＶＥＧＦ抗体では引き起こされなかった(図１ｂ及び１ｃ)。

抗-ＶＥＧＦ感受性及び耐性腫瘍の脈管構造における骨髄腫由来内皮細胞前駆細胞(ＢＭ-ＥＰＣ)の欠如
ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍摘出物の蛍光標識細胞分収取(ＦＡＣＳ)解析により、抗-ＶＥＧＦ感受性腫瘍と比較して、抗-ＶＥＧＦ及びコントロール処置マウス双方の耐性腫瘍においてＧＦＰ＋骨髄細胞の増加(ｐ≦０．０５)頻度が明らかになり、抗-ＶＥＧＦ処置に対する耐性がＢＭＭＮＣの補充に関連していることが示唆される(図１ｄ)。浸潤ＢＭＭＮＣが腫瘍脈管構造に直接的に寄与するか否かを解明するために、血小板内皮細胞接着分子(ＣＤ３１，ＰＥＣＡＭ)／ＧＦＰ二重染色法を使用して、腫瘍切片における微小血管表面積及びＧＦＰ＋／ＣＤ３１＋(ＰＥＣＡＭ)ＥＰＣの数を定量した。処置１４日目には、腫瘍型にかかわらず、抗-ＶＥＧＦ処置又はコントロール処置腫瘍における大多数のＣＤ３１＋脈管構造はＧＦＰ＋発現を欠いていた(図１ｅ)。これらの知見から、腫瘍脈管構造へのＢＭ-ＥＰＣの補充は、抗-ＶＥＧＦ耐性又は感受性腫瘍における腫瘍脈管構造の形成に直接的には寄与しないことが示唆される。抗-ＶＥＧＦ処置ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍は、コントロール処置腫瘍と比較して脈管表面積の２−３倍の減少を示し(図１ｆ)、腫瘍重さの同様の減少と相関している。抗-ＶＥＧＦ処置後のＣＤ３１＋血管の減少は、抗-ＶＥＧＦ耐性ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍よりも抗-ＶＥＧＦ感受性Ｂ１６Ｆ１腫瘍において大きかった。また、脈管表面積(ＶＳＡ)の解析により、耐性腫瘍と比較した感受性腫瘍における抗-ＶＥＧＦ処置後のＣＤ３１＋脈管の有意な(ｐ≦０．０５)減少が示された(図１ｆ)。

ＢＭＭＮＣの補充とプライミング(予備刺激)は抗-ＶＥＧＦ耐性に重要である
腫瘍混合実験を抗-ＶＥＧＦ感受性Ｂ１６Ｆ１腫瘍を用いて実施し、抗-ＶＥＧＦ処置に対する耐性の発生におけるＧＦＰ＋ＢＭＭＮＣの機能的関連性を評価した。実験計画及び細胞純度については図６ａ及びｂ並びに図７を参照のこと。骨髄及び腫瘍キメラ実験を実施するために、ＧＦＰ＋細胞を、耐性及び感受性腫瘍を移植したマウスの腫瘍又は骨髄から摘出した。選別後解析により各実験におけるＧＦＰ＋細胞の純度が確保された。耐性腫瘍によってプライミングされたＢＭＭＮＣとのＢ１６Ｆ１の混合により、有意な(ｐ≦０．０５)増殖刺激効果が明らかになった(図２ａ，ｂ)。これに対して、Ｂ１６Ｆ１腫瘍の増殖速度は、Ｂ１６Ｆ１腫瘍又はコントロールマトリゲル移植片によってプライミングされたＢＭＭＮＣと混合されたとき、有意には変わらなかった(図２ａ，ｂ)。Ｂ１６Ｆ１腫瘍と混合された、ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍を持つマウスの脛骨から単離されたＢＭＭＮＣは、マトリゲル移植又はコントロール移植マウス由来のＢＭＭＮＣと比較して有意に腫瘍増殖速度を増大させた(図２ａ)。腫瘍増殖速度の差は、コントロール抗体処置群(図２ａ)よりも抗-ＶＥＧＦ処置群(図２ｂ)においてより明白であった。これに対して、Ｂ１６Ｆ１腫瘍の増殖速度は、Ｂ１６Ｆ１腫瘍又はコントロールマトリゲルでプライミングされたＢＭＭＮＣと混合した場合、処置にかかわらず、有意には増加しなかった(図２ａ，ｂ)。同様に、１４日の増殖後にＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍から単離されたＧＦＰ＋細胞は、抗-ＶＥＧＦ感受性Ｂ１６Ｆ１腫瘍と混合された場合、抗-ＶＥＧＦ処置に対する耐性を媒介するのに十分であった(図２ｃ，ｄ)。ＧＦＰ＋ＢＭＭＮＣ又はＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞は、単独で移植された場合、腫瘍を生じず、これは混入腫瘍細胞がないことを実証している。ＢＭＭＮＣ及び抗-ＶＥＧＦ感受性腫瘍の物理的近接だけでは耐性の誘導には不十分で、抗-ＶＥＧＦ耐性腫瘍による骨髄細胞のプライミングが腫瘍耐性の媒介に必要とされている。総合すると、これらのデータは、腫瘍へのＢＭＭＮＣの補充と耐性腫瘍によるプライミングの双方が、抗-ＶＥＧＦ処置に対する耐性の発生に至るイベントカスケード中の工程の二つであることを示している。

耐性腫瘍によってプライミングされたＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞は抗-ＶＥＧＦ耐性を媒介する主要な骨髄集団である
ＢＭＭＮＣは未分化、骨髄、リンパ系列の細胞を含む不均一集団を含んでなる。Morrison, S.J.等, Annu Rev Cell Dev Biol, 11:35-71 (1995)。
図３ａ−ｄに示すデータは、骨髄集団を表すＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞が、抗-ＶＥＧＦ耐性の発生における主要なＢＭＭＮＣサブセットであることを示唆している。例えばOnai, N.等, Blood, 96:2074-2080 (2000)を参照のこと。インビトロ細胞遊走アッセイを開発して、耐性及び感受性腫瘍から収集した可溶性抽出物にさらしてＢＭＭＮＣを試験した。腫瘍は、抗-ＶＥＧＦ抗体かコントロール抗体の何れかで処置されたマウスで１４日間増殖させた。インビトロ遊走アッセイは、耐性腫瘍の可溶性抽出物に対してＢＭＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の大なる(ｐ≦０．０５)遊走能を示したが、感受性腫瘍に対してはそうではなかった(図３ａ)。従って、骨髄走化性因子がコントロール処置又は抗-ＶＥＧＦ処置腫瘍の可溶性抽出物中に存在しており、抗-ＶＥＧＦ(１０ｍｇ／ｍｌ)が媒質に添加された場合、影響を受けないで残る。これらの知見は、骨髄細胞の補充が腫瘍内因性、ＶＥＧＦ非依存性であり、処置によって誘導されないことを示唆している。これらの知見は、抗-ＶＥＧＦ処置がＢＭＭＮＣの耐性腫瘍へのホーミングを効果的に阻止することがなかった腫瘍増殖実験(図１ｄ)のデータと合致しており、骨髄細胞の補充が処置誘導ではなく腫瘍に内因性であるという考えを更に裏付けている。

抗-ＶＥＧＦ耐性腫瘍由来の条件培地に応答したＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞遊走が増加したので(図３ａ)、ＦＡＣＳ解析を使用して、マウスで増殖させたＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍に補充した造血、リンパ球、及び骨髄系統を研究した。ＣＤ１１ｂ＋サブセットでゲーティングした場合、ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍は、Ｂ１６Ｆ１腫瘍と比較して、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の富化を示した(図３ｂ)。差異は抗-ＶＥＧＦ処置腫瘍において最も顕著であった。Ｂ１６Ｆ１腫瘍では、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞集団は抗-ＶＥＧＦ処置で著しく減少する一方、ＥＬ４又はＬＬＣ腫瘍では影響を受けないままであった(図３ｂ)。別の実験では、ＴＩＢ６、Ｂ１６Ｆ１、ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍を持っているマウスの骨髄区画を、ＦＡＣＳ装置並びにＣＤ１１ｂ及びＧｒ１に対するモノクローナル抗体を使用して分析した。ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍摘出物中の浸潤ＢＭＭＮＣのフローサイトメトリー解析は、ＴＩＢ６及びＢ１６Ｆ１腫瘍と比較してＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の有意な(ｐ≦０．０５)富化を示した。これらの結果は、抗-ＶＥＧＦ感受性腫瘍中のＢＭＭＮＣレベルの減少と合致しており(図１ｄ)、腫瘍へのＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の補充と薬物耐性の発生の間の相関関係に対する更なる裏付けを提供する。腫瘍中の単離ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋からのデータとは異なり、腫瘍を有するマウスの骨髄ＣＤ１１ｂ＋サブセットに見出された変化はあまり明白ではなかった(図３ｃ)。これらのデータは、耐性腫瘍を有するマウスにおいて、それらはより多くのＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋を補充し、また骨髄により多くの骨髄細胞を生産することを指示するので、骨髄と腫瘍間の明確なクロストークを示唆している。

耐性及び感受性腫瘍中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の更なる分析により、それぞれＣＸＣＲ４及びＬ-セレクチンのような、骨髄細胞のホーミング及び経内皮遊走に関与していることが知られている分子の発現が増加していることが明らかになった。腫瘍があるマウスのＢＭＭＮＣ中のＣＤ１１ｂ＋ＣＤ３１＋(ＥＰＣ)及びＣＤ１１ｂ＋ＣＸＣＲ４＋細胞(好中球)、ＣＤ１９(Ｂ細胞)、ＣＤ９０(Ｔ細胞)、ＣＤ１１ｃ(樹状細胞)及びＶＥＧＦＲ-２の相対数は、処置群及び腫瘍型の間で同様であったが、ある腫瘍ではＣＤ１９は例外であった(図１４)。
ＣＤ１１ｂ及びＧｒ１に加えて、他の造血系統、例えばＢ及びＴリンパ球、ＣＤ１１ｃ、またＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２を腫瘍のあるマウスで調査した(図１５)。Ｂリンパ球細胞及び樹状細胞の頻度における有意な減少(ｐ≦０．０５)は耐性腫瘍において顕著であった(図１５ａ)。また、データは、対応する感受性腫瘍と比較して耐性腫瘍を有するマウスのＢＭ中のＢリンパ球及びＴリンパ球並びに樹状細胞の頻度の有意な差を示している。(図１５ｂ)。これらの知見は、耐性腫瘍における骨髄細胞の頻度の増加が他の造血系統の減少と関係していることを示唆している。脾臓ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞が腫瘍の拡大に寄与していると過去の研究が示唆していたので、ＢＭ及び腫瘍に加えて、腫瘍のあるマウス中の脾臓を調査した。例えばKusmartsev, S.及びGabrilovich, D.I., Cancer Immunol Immunother, 51:293-298 (2002)；Bronte, V.等, Blood, 96:3838-3846 (2000)を参照のこと。ＢＭ及び腫瘍のデータを裏付けて、感受性腫瘍と比較して耐性腫瘍を移植したマウス中の脾臓中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋の頻度の増加(ｐ≦０．０５)と肥大した脾臓サイズ(ｐ≦０．０５)が見出された(図１６ａ及びｂ)。総合すると、これらの知見は、抗-ＶＥＧＦ処置に対する耐性の媒介における主要細胞集団の一つとしてのＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の機能的役割を示唆している。

抗-ＶＥＧＦ耐性における骨髄細胞の機能的関連性を調査するために、ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍でプライミングしたマウスの骨髄由来のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋及びＣＤ１１ｂ−Ｇｒ１−亜集団を単離し(図１７)、それらをＢ１６Ｆ１腫瘍細胞と混合した。
図３ｄに示されるように、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞は抗-ＶＥＧＦ処置に対する耐性を媒介するのに十分であった。しかしながら、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞を欠損したＢＭＭＮＣ及び腫瘍由来ＧＦＰ＋細胞は耐性を媒介できなかった。抗-ＶＥＧＦ耐性腫瘍でプライミングされたマウスの骨髄由来のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞は抗-ＶＥＧＦ処置に対する耐性を媒介することができる。よって、図３ｄは、感受性腫瘍ではなく耐性腫瘍によってプライミングされたＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞が抗-ＶＥＧＦ処置に対する耐性を媒介することを示している。しかしながら、プライミングされたＢ１６Ｆ１又はマトリゲルから単離されたＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞とのＢ１６Ｆ１の混合は、ＣＤ１１ｂ-Ｇｒ１-集団と比較して抗-ＶＥＧＦ処置に対する耐性を促進しなかった(図１７ａ)。これは、耐性腫瘍が感受性腫瘍と比較して骨髄区画との別のクロストークを有しているという仮説を更に証明するものである。腫瘍脈管構造に対するＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の影響を調査するために、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋及びＣＤ１１ｂ−Ｇｒ１−細胞と混合したＢ１６Ｆ１中の脈管表面積(ＶＳＡ)を分析した(図１７ｂ)。これらの知見は、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋混合物中のＶＳＡは、Ｂ１６Ｆ１単独又はＣＤ１１ｂ−Ｇｒ１−細胞との混合物よりも有意に(ｐ≦０．０５)大きく、脈管構造の発生は、感受性細胞株をＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞と混合した場合に抗-ＶＥＧＦに対して耐性を生じる主要な原因の一つであることを示唆している。感受性腫瘍に対する耐性を付与するその能力について耐性腫瘍から単離した腫瘍関連ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞を試験して、同様の結果が得られた(図３ｅ，ｆ)。従って、ＢＭ関連及び腫瘍関連ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の双方が、機能獲得型細胞(cellular-gain-of-function)アプローチ法で試験した場合に、抗-ＶＥＧＦに対する耐性を付与するのに十分である。

抗-ＶＥＧＦ耐性腫瘍は骨髄ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞中に特異的遺伝子セットを誘導する
腫瘍のあるマウスの骨髄中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の活性化状態の潜在的な差を検出するために、ＤＮＡアレイを使用して遺伝子発現解析を実施した。抗-ＶＥＧＦ耐性ＥＬ４又はＬＬＣ腫瘍によってプライミングされたＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の教師なしのクラスター解析によって、差次的に調節された遺伝子の特徴的なセットが同定され、これは抗-ＶＥＧＦ感受性Ｂ１６Ｆ１腫瘍によってプライミングされた細胞とは異なっていた(図４ａ)。ジーンオントコロジー解析により、抗-ＶＥＧＦ耐性腫瘍による炎症性サイトカイン及びマクロファージ／骨髄細胞分化のマーカーの富化及び血管新生促進及び血管新生抑制因子のレベルの変更が明らかになった(図４ｂ)。双方の抗-ＶＥＧＦ耐性腫瘍によって共通してアップレギュレートされる遺伝子セットが同定されたが、その中の数種は血管新生の調節に関与していることが知られているレラキシン様因子(ＲＬＦ)(例えばSilvertown, J.D., Summerlee, A.J. & Klonisch, T. Relaxin-like peptides in cancer. Int J Cancer 107:513-9 (2003)を参照)、及びリン脂質スクランブラーゼ(Ｅｎｄｏ-Ｌｉｐ)(例えばFavre, C.J.等 Expression of genes involved in vascular development and angiogenesis in endothelial cells of adult lung. Am J Physiol Heart Circ Physiol 285:H1917-38 (2003)を参照)であった。

ＩＬ−４(例えばPalmer-Crocker, R.L., Hughes, C.C.及びPober, J.S. IL-4 and IL-13 activate the JAK2 tyrosine kinase and Stat6 in cultured human vascular endothelial cells through a common pathway that does not involve the gamma c chain. J Clin Invest 98:604-9 (1996)を参照)及びＩＬ−１３(例えばRoy, B.等 IL-13 signal transduction in human monocytes: phosphorylation of receptor components, association with Jaks, and phosphorylation/activation of Stats. J Leukoc Biol 72:580-9 (2002)を参照)、ＣＤ１４(例えばScott, C.S.等 Flow cytometric analysis of membrane CD11b, CD11c and CD14 expression in acute myeloid leukaemia: relationships with monocytic subtypes and the concept of relative antigen expression. Eur J Haematol 44:24-9 (1990)を参照)、ＴＬＲ−１(例えばEdfeldt, K., Swedenborg, J., Hansson, G.K.及びYan, Z.Q. Expression of toll-like receptors in human atherosclerotic lesions: a possible pathway for plaque activation. Circulation 105:1158-61 (2002)を参照)に対するレセプターを含む他の範疇の骨髄細胞の分化及び／又は活性化に関連した遺伝子は、抗-ＶＥＧＦ耐性腫瘍によってＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞中で顕著にアップレギュレートされた(図４)。逆に、強力な血管新生阻害剤のトロンボスポンジン-１(例えばGood, D.等 A tumor suppressor-dependent inhibitor of angiogenesis is immunologically and functionally indistinguishable from a fragment of thrombospondin. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:6624-6628 (1990)；及びIruela-Arispe, M.L., Bornstein, P.及びSage, H. Thrombospondin exerts an antiangiogenic effect on cord formation by endothelial cells in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A 88:5026-30 (1991)を参照)は、双方の抗-ＶＥＧＦ耐性腫瘍によって有意にダウンレギュレートされた遺伝子であった。

更に別のマイクロアレイ実験では、耐性腫瘍が異なった遺伝子発現プロファイルを表すことが示された。ＥＬ４(Ｅ１-３)、ＬＬＣ(Ｌ１-３)、Ｂ１６Ｆ１(Ｂ１-３)及びＴＩＢ６(Ｔ１-３)腫瘍が移植され抗-ＶＥＧＦで処置されたマウスの骨髄から単離されたＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の遺伝子ツリー解析を行った。ダウンレギュレートされた遺伝子、未変化の遺伝子及びアップレギュレートされた遺伝子が同定された。抗-ＶＥＧＦ感受性腫瘍によって誘導されたものとは異なる抗-ＶＥＧＦ耐性腫瘍によって誘導された変化の特徴的なセットを特定した。ＴＩＢ６、Ｂ１６Ｆ１、ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍を有し１７日間抗-ＶＥＧＦで処置されたマウスから単離された骨髄ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞中の差次的に発現された遺伝子のアレイ解析を実施した。耐性対感受性腫瘍における発現レベルに有意な変化(ｐ≦０．０５、＞１．５倍)を示す、血管新生又は骨髄細胞分化及び遊走の調節に潜在的に関与する遺伝子を同定した。血管新生の調節に関与することが知られているアップレギュレートされる遺伝子には、インターロイキン-１１レセプター(ＩＬ-１１Ｒ)、インターロイキン-１レセプターＩＩ(ＩＬ-１ＲＩＩ)、インターフェロン膜貫通型１(ＩＦＮＴＭ１)、腫瘍壊死因子レセプタースーパーファミリーメンバー１８(ＴＮＦＲＳＦ１８)、ウイングレスインテグレーション(Wingless integration)５Ａ(ＷＮＴ５Ａ)、分泌性キャリア膜(carrier membrane)１、熱ショックタンパク質(ＨＳＰ８６)、上皮増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)、ＥｐｈレセプターＢ２(ＥｐｈＲＢ２)、Ｇタンパク質共役型レセプター２５(ＧＰＣＲ２５)、肝細胞腫由来増殖因子(ＨＧＦ)、アンジオポエチン様-６、エフリンレセプターＲＡ７(Ｅｐｈ-ＲＡ７)、セマフォリンＶｌｂ、ニューロトロフィン５、クローディン-１８、メタロプロテアーゼ-ディスインテグリンＭＤＣ１５(ＭＤＣ１５)、細胞外マトリックス(ＥＣＭ)及びトロンボスポンジンモチーフ７Ｂ含有ディスインテグリン・メタロプロテアーゼ(a disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motif 7B)(ＡＤＡＭＴＳ７Ｂ)が含まれていた。ダウンレギュレートされた遺伝子には、神経細胞接着分子(ＮＣＡＭ−１４０)、フィブロネクチンＩＩＩ型、ウィスコット・アルドリッチ症候群タンパク質相互作用タンパク質(ＷＩＰ)、ＣＤ７４、細胞接着分子２(ＩＣＡＭ−２)、Ｊａｇｇｅｄ１、インテグリンα-４(Ｉｔｇａ４)、インテグリンＢＥＴＡ-７(ＩＴＧＢ７)、トランスフォーミング増殖因子βＩＩ型レセプター(ＴＧＦ-ＢＩＩ-Ｒ)、ＴＧＦｂ誘導性早期(early)タンパク質(ＴＧＦｂＩＥＰ)、デカペンタプレジックに対するマザー(mothers against decapentaplegic)(ＭＡＤ)及び線虫タンパク質ＳＭＡ-４(Ｓｍａｄ４)、骨形成タンパク質レセプター１Ａ(ＢＭＰＲ１Ａ)、ＣＤ８３、デクチン-１、ＣＤ４８、Ｅ-セレクチン、インターロイキン-１５(ＩＬ-１５)、サイトカインシグナル抑制因子４、サイトカインレセプター関連タンパク質４(Ｃｙｔｏｒ４)及びケモカイン(Ｃ-Ｘ３-Ｃ)レセプター１(ＣＸ３ＣＲ１)が含まれていた。

双方の耐性腫瘍によって共通してアップレギュレートされる遺伝子セットを同定したが、その数種は、リラクシン様因子(ＲＬＦ)(Ho, R.L.等 Immunological responses critical to the therapeutic effects of adriamycin plus interleukin 2 in C57BL/6 mice bearing syngeneic EL4 lymphoma, Oncol Res, 5:363-372 (1993))、ニューロトロフィン５(Lazarovici, P.等, Nerve growth factor (NGF) promotes angiogenesis in the quail chorioallantoic membrane, Endothelium, 13:51-59 (2006))、リン脂質スクランブラーゼ(Ｅｎｄｏ−Ｌｉｐ)(Favre, C.J.等, Expression of genes involved in vascular development and angiogenesis in endothelial cells of adult lung, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 285:H1917-1938 (2003))、アンジオポエチン様-６、セマフォリンＶＩｂ、ＥｐｈＲＡ７、ＥｐｈＲＢ２及びＦＧＦ１３を含む血管新生の調節に関与していることが知られている。更に、骨髄細胞の分化及び／又は活性化に関連するＧＭ-ＣＳＦ(Rapoport, A.P.等, Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF): receptor biology, signal transduction, and neutrophil activation, Blood Rev, 6:43-57 (1992))はまた耐性腫瘍のあるマウスから単離されたＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋ＢＭ細胞においてアップレギュレートされた。樹状細胞の活性化／生産に関与することが知られている数種の遺伝子は、耐性腫瘍から単離されたＢＭＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋において完全にダウンレギュレートされる。これには、ＣＤ８３、ＣＤ４８、Ｃｒｅａ７及びデクチン(Dectin)-１(例えばLechmann, M等, CD83 on dendritic cells: more than just a marker for maturation, Trends Immunol 23:273-275 (2002))、ＩＬ-１５ (例えばFeau, S.等, Dendritic cell-derived IL-2 production is regulated by IL-15 in humans and in mice, Blood 105:697-702 (2005)を参照)、及びＣＸ３ＣＲ１(例えばNiess, J.H.等, CX3CR1-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance, Science 307:254-258 (2005)を参照)が含まれる。分子データは、ＢＭＭＮＣの多系列解析(図１５)に沿ったものであり、耐性腫瘍を有するマウスのＢＭ及び腫瘍の双方においてＣＤ１１ｃ＋細胞の頻度の有意な(ｐ≦０．０５)減少が存在する。また、Ｓｍａｄ４及びＢＭＰＲ１Ａを含むＴＧＦ-βスーパーファミリーの数種のメンバー(例えばDerynck, R等, TGF-beta signaling in tumor suppression and cancer progression, Nat Genet 29:117-129 (2001)を参照)はダウンレギュレートされた遺伝子であり、耐性腫瘍を有するマウスにおいてＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の活性化／分化を調節する際のＴＧＦ-β経路に対する役割を示唆している。

また、ＬＬ２、ＥＬ４及びＢ１６Ｆ１腫瘍の遺伝子発現解析を実施し、抗-ＶＥＧＦ処置耐性(ＥＬ４＋ＬＬ２)において特異的にアップ又はダウンレギュレートされるが感受性(Ｂ１６Ｆ１)腫瘍ではされない遺伝子を分析した。遺伝子発現の全体パターンは全ての腫瘍型の間で異なっていた。図４ｄに示されているように、抗-ＶＥＧＦ耐性及び感受性腫瘍の間で発現が変化した遺伝子の多くはケモカイン及びサイトカインの部類に属しており、抗-ＶＥＧＦ耐性腫瘍における炎症性細胞の存在を示唆している。また、様々な血管新生促進又は血管新生抑制因子を同定した。

同様に、抗-ＶＥＧＦ処置ＴＩＢ６、Ｂ１６Ｆ１、ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍における更なる遺伝子発現解析は、全ての腫瘍型の間での遺伝子発現の異なったプロファイルを示した。アップレギュレートされた遺伝子には、インスリン様成長因子２、結合タンパク質３(ＩＧＦ２ＢＰ３)、熱ショックタンパク質９Ａ(ＨＳＰ９Ａ)、線維芽増殖因子１８(ＦＧＦ１８)、結合組織増殖因子関連タンパク質ＷＩＳＰ-１(ＥＬＭ１)、水晶体上皮誘導増殖因子ａ(Ｌｅｄｇｆａ)、スカベンジャーレセプターＡ型、マクロファージＣ型レクチン、多量体免疫グロブリンレセプター３前駆体(Ｐｉｇｒ３)、マクロファージスカベンジャーレセプターＩ型(マクロファージＳＲＴ-１)、Ｇタンパク質共役型レセプター、小誘導型サイトカインＡ７(ＳｃｙＡ７)、インターロイキン-１レセプター２(ＩＬ-１Ｒ２)、インターロイキン-１誘導性タンパク質(ＩＬ-１誘導性タンパク質)、インターロイキン-１β(ＩＬ-１β)、ＬＩＸ(ＬＰＳ誘導性ＣＸＣケモカイン(Ｓｃｙｂ５)遺伝子／ケモカイン(Ｃ−Ｘ−Ｃモチーフ)リガンド５)が含まれていた。ダウンレギュレートされた遺伝子には、トランスフォーミング増殖因子β(ＴＧＦ-Ｂ)、Ｆｒｉｚｚｌｅｄ(ＦＩＺＺ１)、ウルフラム症候群１ホモログ(Ｗｆｓ１)、膜貫通タンパク質１４Ａ(ＴＰ１４Ａ)、細胞外マトリックス関連タンパク質(ＥＭＡＰ)、スルファターゼ２(ＳＵＬＦ-２)、細胞外マトリックス２、結合組織増殖因子(ＣＴＦＧ)、組織因子経路阻害因子(ＴＦＰＩ)、レジスチン様分子αｍＲＮＡ／系統Ｃ５７ＢＬ／６ＸＣＰ２タンパク質(Ｘｃｐ２)遺伝子(ＸＣＰ２)、レセプター活性修飾タンパク質２(Ｒａｍｐ２)、ＲＡＲ関連オーファンレセプターα(ＲＯＲ-α)、エフリンＢ１、分泌タンパク質酸性システインリッチ様１(secreted protein acidic and rich in cysteine-like 1)(ＳＰＡＲＣ様１)、セマフォリンＡが含まれていた。耐性対感受性(ＴＩＢ６＋Ｂ１６Ｆ１)腫瘍において差次的に発現された遺伝子(２倍より大、ｐ≦０．０５)の分析により、顆粒球コロニー刺激因子(Ｇ-ＣＳＦ)(例えばRapoport, A.P.等, Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF): receptor biology, signal transduction, and neutrophil activation, Blood Rev 6:43-57 (1992)を参照)、及び単球走化性タンパク質(ＭＣＰ−１)(例えばLeonard, E.J.等, Secretion of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) by human mononuclear phagocytes, Adv Exp Med Biol 351:55-64 (1993)を参照)を含む末梢血へのＢＭＭＮＣの動員に関与することが知られている数種のサイトカインが同定された。更に、炎症に関与する因子、例えばマクロファージ炎症性タンパク質(ＭＩＰ-２)(例えばCook, D.N., The role of MIP-1 alpha in inflammation and hematopoiesis, J Leukoc Biol, 59:61-66 (1996)を参照)及びＩＬ-１Ｒ(例えばDinarello, C.A., Blocking IL-1 in systemic inflammation, J Exp Med, 201:1355-1359 (2005)を参照)が差次的に発現された遺伝子のものである。Ｇ-ＣＳＦのような上記サイトカインの大部分は、造血前駆細胞の骨髄細胞への分化(例えばMcNiece, I.K.等, Recombinant human stem cell factor synergises with GM-CSF, G-CSF, IL-3 and epo to stimulate human progenitor cells of the myeloid and erythroid lineages, Exp Hematol, 19:226-231 (1991)を参照)及び増殖(例えばLemoli, R.M.等, Proliferative response of human acute myeloid leukemia cells and normal marrow enriched progenitor cells to human recombinant growth factors IL-3, GM-CSF and G-CSF alone and in combination, Leukemia, 5:386-391 (1991)を参照)に関与していることがまた知られている。従って、造血細胞の末梢への移動のプライミング及び促進に加えて、耐性腫瘍を有するマウスは骨髄細胞分化の刺激能を共有しうる。

これらの知見は、ＣＤ１１ｂ＋、Ｇｒ１＋細胞における遺伝子発現解析からの結論を裏付け、抗-ＶＥＧＦ耐性腫瘍による血管新生促進又は血管新生抑制活性及び炎症性サイトカイン及びケモカインの差次的調節が抗-ＶＥＧＦ耐性腫瘍の耐性に潜在的に寄与しうることを示唆している。

骨髄細胞機能を妨害する薬剤との抗-ＶＥＧＦの併用は腫瘍血管新生及び増殖を抑制する。
末梢循環中のＧｒ１＋骨髄細胞の数を減少させる抗-Ｇｒ１抗体を、ＥＬ４(図５ａ−ｂ)及びＬＬ２腫瘍(図５ｃ−ｄ)について単独で又は抗-ＶＥＧＦとの併用で試験した。単独で投与された場合、抗-Ｇｒ１処置は末梢及び腫瘍Ｇｒ１＋細胞の数を減少させるのに効果的であったが、ＥＬ４腫瘍の腫瘍増殖及び血管新生に有意には影響を与えなかった(図５ａ−ｂ)。しかしながら、抗-Ｇｒ１抗体をＧ６-２３と組み合わせた場合、我々は、抗-ＶＥＧＦ-Ａ処置単独で誘導される効果と比較してＥＬ４(図５ｂ)又はＬＬ２(図５ｄ)腫瘍の何れかのより長い腫瘍増殖遅延化及び腫瘍耐性の発生の傾向が併用処置群において存在していることを知見した。ＬＬ２腫瘍の組織学的分析により、ＦＡＣＳ及び脈管表面積(ＶＳＡ)によるＧｒ１＋骨髄細胞の減少が明らかになったが、これは併用処置群における腫瘍増殖速度の減少と相関していた(図５ｃ及びｄ)。

遺伝子発現解析により、抗-ＶＥＧＦ耐性腫瘍細胞株による腫瘍及びＣＤ１１ｂ、Ｇｒ１＋骨髄細胞における好中球エラスターゼの発現の有意な増加が明らかになった(図４ｂ)。好中球により生産されるエラスターゼは腫瘍細胞増殖、運動性を促進し様々な腫瘍型の増殖を刺激すると記載されている。例えば、Sun, Z.及びYang, P. Role of imbalance between neutrophil elastase and alpha 1-antitrypsin in cancer development and progression. Lancet Oncol 5:182-90 (2004)を参照のこと。また、好中球動員及び血管新生の調節における好中球エラスターゼの役割が提案された。例えば、Shamamian, P.等 Activation of progelatinase A (MMP-2) by neutrophil elastase, cathepsin G, and proteinase-3: a role for inflammatory cells in tumor invasion and angiogenesis. J Cell Physiol 189:197-206 (2001)を参照のこと。抗-ＶＥＧＦ処置をエラスターゼ阻害剤と併用した。併用処置はＬＬＣ及びＥＬ４腫瘍の腫瘍体積及び最後の腫瘍重さに有意な減少を生じた(図５ｅ及びｆ)。抗-Ｇｒ１抗体での処置と同様に(図５ａ−ｄ)、エラスターゼ阻害剤はほぼ完全な切除循環骨髄細胞を誘導したが、腫瘍内では、コントロール処置と比較して２から３倍の減少が見出された。これに基づいて、我々は、ＣＤ１１ｂ又はＧｒ１の発現を欠くある種の骨髄前駆細胞は処置によって影響されないことがあると仮定する。あるいは、前駆細胞は潜在的に腫瘍に浸潤し得、インサイツで骨髄細胞に分化しうる。抗-ＶＥＧＦ処置腫瘍内に更に重度の骨髄細胞破壊を誘導する方策は併用処置の治療効果を更に増大させうる。総合すると、これらの知見は、骨髄細胞機能を標的にする化合物と抗-ＶＥＧＦを併用する場合に治療効果が改善されることを示唆し、骨髄細胞の血管新生促進機能が、抗-ＶＥＧＦ処置に対する耐性の発生に寄与しうるという最初の証拠を提供する。更に、これらの知見は、抗-ＶＥＧＦ耐性腫瘍への骨髄細胞の補充及び活性化には幾つかの経路が関与している可能性があるという考えを裏付けている。

耐性腫瘍中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋の表現型特性
耐性腫瘍におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の異なる機能特性に基づいて、その細胞特性を調べた。造血細胞の動員(ＣＸＣＲ４(例えばOrimo, A.等, Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion, Cell, 121:335-348 (2005)を参照))及び経内皮遊走(Ｌ-セレクチン(例えばSimon, S.I.等, L-selectin (CD62L) cross-linking signals neutrophil adhesive functions via the Mac-1 (CD11b/CD18) beta 2-integrin, J Immunol, 155:1502-1514 (1995)を参照))に関与していることが知られている分子の発現を調べた。また、Ｆ４８０の発現によって知られているＴＡＭは、腫瘍増殖を増加させる潜在性を持つ骨髄細胞のサブセットとして記載されている(例えばLuo, Y.等, Targeting tumor-associated macrophages as a novel strategy against breast cancer, J Clin Invest, 116:2132-2141 (2006)を参照)。クロドロン酸を使用するＴＡＭの枯渇化は、耐性腫瘍を有するマウスにおける抗-ＶＥＧＦ処置の効能を改善した。また、Ｔｉｅ２陽性ＴＡＭは腫瘍脈管内に局在化し、血管新生を媒介することが見出された(例えばDe Palma, M.等, Tie2 identifies a hematopoietic lineage of proangiogenic monocytes required for tumor vessel formation and a mesenchymal population of pericyte progenitors, Cancer Cell, 8:211-226 (2005)を参照)。従って、抗-ＶＥＧＦ処置耐性及び感受性腫瘍における骨髄画分におけるＣＸＣＲ４、Ｌ-セレクチン、Ｆ４／８０及びＴｉｅ-２の発現を調査した。

Ｃ５７ＢＬ／６マウス(ｎ＝５)にＴＩＢ６、Ｂ１６Ｆ１、ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍を移植し、抗-ＶＥＧＦ又はコントロール抗体で記載されたようにして処置した。各マウスからの腫瘍単離物を１７日後に収集し、ＣＤ１１ｂ、Ｇｒ１、ＣＸＣＲ４、Ｆ４８０、Ｌ-セレクチン及びＴｉｅ２に対する抗体で染色した。耐性腫瘍対対応の感受性腫瘍を有するマウス中の腫瘍関連ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋と比較した場合に、ＣＸＣＲ４、Ｆ４８０、Ｌ-セレクチン及びＴｉｅ２サブセットの発現における有意な差(ｐ≦０．０５)が観察された。ＢＭＭＮＣを腫瘍のあるマウスから単離し、上述のものと同じマーカーで染色した。腫瘍解析と合致し、耐性腫瘍対感受性腫瘍の対応集団のＧＦＰ＋ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞中のＣＸＣＲ４、Ｆ４８０、Ｌ-セレクチン及びＴｉｅ２サブセットの頻度に有意な差(ｐ≦０．０５)があった。

フローサイトメトリー解析は、耐性腫瘍中の腫瘍関連ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋が、ＣＸＣＲ４、Ｆ４８０、Ｌ-セレクチン及びＴｉｅ２の発現に対して高度に富化(ｐ≦０．０５)されていることを明らかにした。腫瘍を持つマウスから単離したＢＭＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞を分析したとき同様の写真が得られた。これらの知見は、耐性腫瘍中のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋が動員、経内皮遊走及び腫瘍へのホーミングにおいてより強力であることを示唆している。

抗ＶＥＧＦ及び化学療法剤に対する耐性を調整する異なるメカニズム
抗ＶＥＧＦに対する耐性の細胞性メカニズムを理解することにより、骨髄性細胞も他の抗癌化合物に対する耐性を媒介するか否かという疑問が生じる。したがって、発明者等は２つの一般的に用いられる化学療法剤、例えば５-フルオロウラシル(５ＦＵ)及びゲムシタビンに対する腫瘍耐性を調査した(例として、Pasetto, L.M.等, Old and new drugs in systemic therapy of pancreatic cancer, Crit Rev Oncol Hematol, 49:135-151 (2004)を参照)。抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍と抗ＶＥＧＦ感受性腫瘍は、化学療法に対して異なる応答を表した。図１８ａ及びｂに示すように、両方の抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍、すなわちＥＬ４とＬＬＣは、抗ＶＥＧＦ処置に対する耐性がよりわずかである遅い時点で、５ＦＵに対して完全な応答を示し、ゲムシタビンに対して部分的な耐性を示した。抗ＶＥＧＦ感受性細胞株では、ＴＩＢ６腫瘍は、抗ＶＥＧＦ処置への応答と比較して有意差がない両化合物に対して完全に感受性であることが明らかとなった(図１８)。しかしながら、Ｂ１６Ｆ１腫瘍は、抗ＶＥＧＦ処置と比較して５ＦＵ及びゲムシタビンへの耐性を示した(図１８ｄ)。したがって、データは明らかに、抗ＶＥＧＦに対する耐性の性質が耐性腫瘍及び感受性腫瘍において化学療法に対応しないことを示し、化学療法剤に対する抗血管新生のアプローチにおける耐性の発達には異なるメカニズムが関与していることを示唆する。ＢＭ細胞の分析から、５ＦＵにて処置したすべてのマウスにおいてＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞が完全に無くっていたことが示され、ゲムシタビンで処置した動物ではその程度小さいことが示された(図６ｅ)。しかしながら、ゲムシタビン又は５ＦＵで処置したＢ１６Ｆ１腫瘍におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の欠乏によって、化学療法に対する耐性の発達への骨髄性細胞の関与が最小化する(図６ｆ)。

原発腫瘍へのＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の動員は、細胞性メカニズムがマウスの実験的腫瘍のサブセット内で抗ＶＥＧＦ処置に対する耐性を媒介していることを表す。遺伝子発現プロファイリングにより、抗ＶＥＧＦ-感受性腫瘍と比較して抗ＶＥＧＦ-耐性腫瘍を有するマウスの骨髄のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞において差別的に制御される遺伝子の一セットが同定された。それらの中で、腫瘍刺激の間に上方制御される、骨髄性細胞活性化の血管新生促進性ないし抑制性の因子とマーカーがいくつか見つかった。腫瘍への骨髄性細胞の動員は、薬剤耐性の発達に関与し、事象のカスケードにおいて最も早い工程の一つである。骨髄性細胞の動員及び／又は活性化を制御している腫瘍由来の因子を目標とする化合物は、抗血管新生化合物と組み合わせてもよい。例えば、自然免疫系の一部を長期にわたって全身抑制した場合に起こりうる合併症を回避するための、全身骨髄性細胞除去計画と比較すると、骨髄性細胞について腫瘍由来の化学誘引物質を選択的に遮断することは有益となりうる(例としてLewis, C.E. & Pollard, J.W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments. Cancer Research 66:605-612 (2006)を参照)。腫瘍浸潤骨髄性細胞によって分泌される血管新生促進因子のアンタゴニストが、抗ＶＥＧＦ化合物との併用治療に使われてもよい。骨髄性細胞の特定機能を制御するターゲッティング因子は、間接的に腫瘍血管新生に作用し、抗ＶＥＧＦ治療に対する腫瘍耐性を低減しうる。図５を参照のこと。

抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体であるベバシズマブの臨床評価は、腎臓カルチノーマ及び卵巣カルチノーマを含む様々なヒトの癌において重要な単一薬剤活性を示した(例として、Ferrara, N., Hillan, K.J., Gerber, H.P. & Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov 3:391-400 (2004)；及び、Jain, R.K., Duda, D.G., Clark, J.W. & Loeffler, J.S. Lessons from phase III clinical trials on anti-VEGF therapy for cancer. Nat Clin Pract Oncol 3:24-40 (2006)を参照)。多くの種類のヒト腫瘍においてベバシズマブが広く臨床的効果を示す間、多くの腫瘍では、化学療法剤と組み合わせた場合に強い臨床効果が得られたことは明らかであった。細胞障害性化合物による治療と組み合わせた場合に治療的有効性を高める可能性がある分子及び細胞性の事象の性質は試験中である。血管の正常化の結果としての腫瘍の薬剤取り込みの増加(Jain等in Jain, R.K. Normalizing tumor vasculature with anti-angiogenic therapy: a new paradigm for combination therapy. Nat Med 7:987-9 (2001)に概説される)及び／又は腫瘍脈管構造の細胞障害性損傷後の内皮細胞回復の阻害(Ferrara等 in Ferrara, N., Hillan, K.J., Gerber, H.P. & Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cancer. Nat Rev Drug Discov 3:391-400 (2004)に概説される)が治療的有効性が上がる主な原因であることが提唱されている(Ferrara & Kerbel in Ferrara, N. & Kerbel, R.S., Angiogenesis as a therapeutic target. Nature 438:967-74 (2005)に概説される)。ある論理に縛られるものではないが、抗ＶＥＧＦ処置に対する耐性を引き起こすメカニズムにおける骨髄性細胞の役割を同定することによって、多くの細胞障害性化合物が関係する骨髄抑制効果が腫瘍増殖阻害を上げうるという考えが立証される。化学療法によって治療された患者における原発性肺腫瘍内の骨髄性細胞数の減少が生存と相関することが観察された(例として、Di Maio, M.等 Chemotherapy-induced neutropenia and treatment efficacy in advanced non-small-cell lung cancer: a pooled analysis of three randomised trials. Lancet Oncol 6:669-77 (2005)を参照)。
ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞のＤＮＡアレイ分析により、抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍と抗ＶＥＧＦ感受性腫瘍との間で異なる遺伝子発現の変化が同定されたことから、マウスの側腹での腫瘍増殖と骨髄の細胞サブセットとの間に著しいクロストークがあることが示唆された(図４ａ)。

実施例２：抗ＶＥＧＦ処置に耐性がある腫瘍モデルからの更なる因子
直接又は間接的に腫瘍に対する耐性を支援するか又は与えうる腫瘍からの更なる因子が同定された。抗ＶＥＧＦ処置に耐性があるマウスリンパ腫腫瘍溶解物(例えば、ＥＬ４及びＬ１２１０)を、５ｍｇ／ｋｇ／週の抗ＶＥＧＦ抗体(Ｇ６-３１)にて、週２回で２週間処置した。治療の後、腫瘍を回収して、プロテアーゼインヒビター(Roche)を含む６ｍｌのＲＩＰＡバッファ２×にてホモジナイズした。ホモジナイズしたものを、エッペンドルフ遠心機にて１４０００回転数／分で１５分、２回遠心分離した。上清を、２０ｍＭトリス, ｐＨ７.５、５０ｍＭＮａＣｌにて１:１に希釈し、１ｍｌのＨｉＴｒａｐＨＳにアプライした。カラムは、スタートバッファ(２０ｍＭトリス, ｐＨ７.５、５０ｍＭＮａＣｌ)にて洗浄し、次いで、ＮａＣｌ濃度を段階的に上げたおよそ５カラム容量(０.２５ＭＮａＣｌ、０.５ＭＮａＣｌ、１ＭＮａＣｌ、及び３ＭＮａＣｌ)にて溶出した。各々の処置のピークの分画を回収した。図８を参照のこと。
走化性活性(例えば、単球移動アッセイによる)又は増殖アッセイ(例えばＨＵＶＥＣ増殖アッセイ)に関与するＥＬ４及びＬ１２１０の高塩分画に、様々な因子が見つかった。例えば、ｂＦＧＦは高塩分画に見られ、単球移動アッセイにおける走化性活性でなくＨＵＶＥＣ増殖アッセイにおけるＨＵＶＥＣ細胞の増殖に関与することが示された。高塩分画に見られた他の因子は、単球への走化性活性があることが明らかとなった。

抗ＶＥＧＦ処置に耐性がある腫瘍(ＥＬ４)においてマクロファージを低減する／枯渇させる薬剤と抗ＶＥＧＦ処置(Ｇ６-２３)とを組み合わせて用いると、腫瘍増殖が遅延することが明らかとなった。マウスのＥＬ4腫瘍は、１) ＰＢＳリポソーム／ブタクサ、２) ＰＢＳリポソーム／Ｇ６-３１；３) クロドロネートリポソーム／Ｇ６-２３、４) クロドロネートリポソーム／Ｇ６-３１、又は５) クロドロネートリポソーム／ＰＢＳを尾静脈に投与して治療した。図９は、最後の投薬の７２時間後のＥＬ４腫瘍体積(カリパスで測定される)の変化を示す。クロドロネートリポソーム、マクロファージを減少する薬剤及び抗ＶＥＧＦ(Ｇ６-２３)で治療したマウスにおいて腫瘍体積の減少がある。また、クロドロネートリポソーム／抗ＶＥＧＦにて治療した動物の血液において検出されるマクロファージも減少していた。図９の下図を参照。定量的リアルタイムＰＣＲ(Taqman)で測定されるように、抗ＶＥＧＦ(Ｇ６-２３)と組み合わせてマウスに投与した場合に、クロドロネートリポソームもＶＥＧＦ発現を減少させた。図１０を参照のこと。また、上記の通りにクロドロネートリポソームと抗ＶＥＧＦ(Ｇ６-２３)にて治療したマウスにおいて、ＥＬＩＳＡ (ＲＤＳｙｓｔｅｍｓ)で測定されるように、ＫＣ(ＣＸＣＬ１)タンパク質発現も減少した。図１１を参照のこと。ＫＣ(ＣＸＣＬ１)は、マウスの単球及びマクロファージの過剰発現によって同定されるタンパク質である。その合成はＴＮＦαによって誘導される。ＫＣは、内皮表面のローリング(rolling)単球の静止及び／又は好中球走化性／活性化に関与する。血管内皮細胞におけるＫＣの合成は、トロンビンによって誘導される。ＫＣレセプターとＩＬ-８タイプＢレセプターはホモログである。レセプターは、ＫＣとＭＩＰ-２(マクロファージ炎症性タンパク質-２)の両方を結合することができる。ＫＣは、抗ＶＥＧＦ処置に感受性がある腫瘍細胞株及び抗ＶＥＧＦ処置に耐性がある腫瘍細胞株によって分泌される。

耐性腫瘍細胞株の高塩分画においてその他の炎症誘発性サイトカイン、例えば、ＭＩＰ-1α、ＭＣＰ-１、ＩＬ-１α、ＩＬ-１β、ＩＬ-７、ＩＬ-９、ＩＬ-１０及びＩＬ-１３が見られた。ＭＣＰ-１は単球化学誘引物質タンパク質-１(ＣＣＬ２又はＪＥ)であり、マクロファージ、線維芽細胞及び内皮細胞によって分泌される。それは、Ｍ-ＣＳＦ、ＩＬ-１、ＩＦＮγ及びＴＧＦβを誘引される。ＭＩＰ-１αはマクロファージ炎症性タンパク質-１ａ(ＣＣＬ３)であり、局所の炎症に応答してマクロファージによって分泌され、好中球を活性化しスーパーオキサイドを生産する。また、リンパ球及び単球によっても分泌される。肝細胞性発癌のマウスモデルにおいて、ＭＩＰ-１α及びＭＣＰ-１は新生血管によって分泌され、自己分泌様式で同族のレセプターによる増殖を刺激する。例としてCancer Res. 66(1): 198-211 (2006)を参照。ＭＣＰ-１とＭＩＰ-１αはともに、抗ＶＥＧＦ処置に耐性がある腫瘍細胞株において発現される。図１２のパネルＡ及びＢを参照のこと。ここでは、Ｄｉｌ(＋)は内皮細胞を表し、ＣＤ３(＋)はリンパ系細胞を表し、Ｆ４／８０(＋)はマクロファージを表す。ＤｉｌはＤｉｌ-Ａｃ-ＬＤＬ(１,１'-ジオクタデシル-３,３,３',３'-テトラメチルインド-カルボシアニン過塩素酸塩(Ｄｉｌ)により標識したアセチル化低密度リポプロテイン( Biomedical Technologies Inc))を表す。いずれの内皮細胞もこの色素を取り込むことができる。
また、ＭＩＰ-１α及びＭＣＰ-１は、血管形成出芽及び毛細血管の内腔形成アッセイにおいて血管形成活性を有することが明らかとされた。１０日目の図１３のパネルＡ及びパネルＢを参照のこと。アッセイでは、ＨＵＶＥＣ細胞はビーズにコートする前日に低継代数で解凍した。およそ８０％のコンフルエントで細胞を剥離し、ＨＵＶＥＣ(４００細胞／ビーズ)にて３７℃で４時間かけてｃｙｔｏｄｅｘマイクロビーズ(架橋デキストランマトリックス)にコートした。ビーズと遊離したＨＵＶＥＣ細胞をフラスコに移し、終夜培養した。ビーズを剥離し、フィブリノーゲン(ウシ血漿)(２５０μｇ／ｍｌ)と混合した。次いで、フィブリノーゲンにトロンビンを加えることによって不溶性フィブリンゲルに変換させた。およそ１００ビーズ／１２-ウェルプレートとした。ビーズは、ポジティブコントロールとして４００００のＤ５５１線維芽細胞とＶＥＧＦ、ネガティブコントロールとしてＤ５５１又はＶＥＧＦ、ＭＣＰ-１とＤ５５１又はＭＩＰ-１αとＤ５５１とともにインキュベートした。培地は毎日交換した。培養物は、たくさん洗浄しながらビオチン化した抗ヒトＣＤ３１とＣｙ３ストレプトアビジンにて終夜をかけて染色した。画像は６０時間、６日及び１０日に撮影した。

単球移動アッセイ：ステップ１：ヒトＰＢＭＣから単球の単離。血液を１:１(ｖ／ｖ)にＰＢＳにて希釈した。希釈した血液をフィコールの上にゆっくりと加え、室温(ＲＴ)、３０００回転／分にて１５分間中断することなく遠心した。血漿を除去し、白血球を回収した(９〜５ｍｌ静止期)。細胞を０．５％ＢＳＡを含むＰＢＳを含む移動バッファ(低エンドトキシン)で洗浄し、ＲＴ、１８５０回転数／分(９〜８００ｇ)にて１０分間回転させ、細胞を計数した。ステップ２：細胞の磁気標識。細胞ペレットを、０．５％ＢＳＡ(低エンドトキシン)及び２ｍＭＥＤＴＡを含むＰＢＳを含むＭＡＣＳバッファに１０^７細胞個当たり３０μｌで再懸濁した。ＦｃＲブロッキング試薬とビオチン-抗体反応混液を加え、十分に混合した。次いで、１０７細胞個当たり３０μｌ以上のＭＡＣＳバッファを添加して抗ビオチンマイクロビーズを添加した後の細胞を４℃で１０分間インキュベートした。これを十分に混合して、４℃で１０分間インキュベートした。１０〜２０倍より多い標識体積を加えることによってＭＡＣＳバッファにて細胞を洗浄し、３００ｇ(１２５０回転数／分)で１０分間回転させた。細胞は２ｍｌのバッファに最高１０^８細胞になるように再懸濁した。ステップ３：ＬＳカラムによる磁気的選別。ＬＳカラム(Miltenyi Biotec)を磁場ホルダーに配置した。カラムをＭＡＣＳバッファにてすすいだ。細胞懸濁液をカラムにアプライした。濃縮した単球分画を表す非標識流量を回収した。カラムは３回、バッファにて洗浄し、流量を回収して、組み合わせた。次いで３００ｇ(１２５０回転数／分)にて５分間、回転させた。ステップ４：０．５％ＢＳＡ(低エンドトキシン)と２ｍＭＬグルタミン及び抗生物質を含むＲＰＭＩを含有する移動培地にて細胞を洗浄。５μｍ細孔径(Corning)を有する２４ウェルトランスウェルプレートに１０^６の細胞を加えた。外側のチャンバーに、様々な増殖因子、サイトカイン／ケモカイン又はその他の試験試料を加えた。３７℃で２．５時間の後に、注意深くフィルターを取り除き、細胞を十分に混合し、１０ｍｌのＺＰＡＫ溶液に移して数を数えた。

ＨＵＶＥＣ増殖アッセイ：８未満の継代のＨＵＶＥＣを実験に用いた。１日目：１．５％ＦＢＳを含むアッセイ培地(ＤＭＥＭ:Ｆ１２５０:５０)の１％ゼラチン-コートプレートに３０００細胞／ウェル(９６ウェルプレート)を播いた。２日目：培地を交換し、細胞を様々な増殖因子又は条件培地にて処置した。３日目：０.５μＣｉ／ウェルの３Ｈチミジンを加えた。４日目：２５０ｍＭＥＤＴＡ／ウェルを加えて、朝に反応を止めた。細胞を９６ウェルフィルタープレートに回収し、水で３回洗浄した。３Ｈ試料は、ＴＯＰＣＯＵＮＴ液体シンチレーションカウンターにて計数した。

マクロファージ枯渇と腫瘍発現を調べるためのインビボ処置：マウスのリンパ球白血病細胞株であるＥＬ４を用いた。ヌードマウスにＥＬ４腫瘍細胞(マトリゲル中５×１０６、０．１ｍｌ容量)を移植して４８時間後に処置を開始した。処置は以下の通り行った：群１：８匹のマウス、週２回、ＰＢＳ-リポソーム２００μｌのＩＶと、ブタクサＩｇＧ２×５ｍｇ／ｋｇ／週、１００μｌのｉｐ；群２：８匹のマウス、週２回：ＰＢＳ-リポソーム２００μｌのＩＶと、Ｇ６-３１２×５ｍｇ／ｋｇ／週、１００μｌのｉｐ；群３：８匹のマウス、週に２回：クロドロネート-リポソーム２００μｌのＩＶ、ブタクサＩｇＧ２×５ｍｇ／ｋｇ／週、１００μｌのｉｐ；群４：８匹のマウス、週に２回：クロドロネート-リポソーム２００μｌのＩＶ、Ｇ６-３１２×５ｍｇ／ｋｇ／週、１００μｌのｉｐ。群５：８匹のマウス、週に２回：クロドロネート-リポソーム２００μｌのＩｖ、週に２回、ＰＢＳ１００μｌのｉｐ。ＦＡＣＳマクロファージ細胞群評価のために、５０μｌの全血を各群３匹のマウスから予め採血した。ＦＡＣＳ分析のために、各ＰＢＳ-リポソーム又はクロドロネート-リポソームを注入して１時間後に１００μｌの全血を採取した(眼)。十分に腫瘍が増殖するまで(５週を越えない)実験を続けた。腫瘍増殖は、腫瘍が２０ｍｍ長より大きい場合に、十分であると判断した。腫瘍サイズは毎週測定した(ｌ×ｗ×ｈ)。動物は、少なくとも週２回観察した。実験のエンドポイントで動物を屠殺し、取り出した最後の時間に測定し、重量を量り、固定した。更なる分析、例えば、ＦＡＣＳ分析、ＲＮＡ分析などのためにすべての動物から血液、脾臓及び肝臓を取り出した。

マクロファージ枯渇の指標としての血液、脾臓及び肝臓中のマクロファージ集団の検出：クロドロネートリポソームの最初のＩＶ注入の９２時間後に、ＣＯ_２を与えてマウスを殺し(ＦＶ６トランスジェニックマウス対ベージュヌードＸＩＤマウス)(クロドロネート処置ＦＶ６から２匹、クロドロネート処置ベージュヌードＸＩＤマウスから２匹、未処置ベージュヌードＸＩＤマウスから１匹)、心房から１５０μｌの血液を採取し、ヘパリン含有のチューブに置き、ＲＴで保存した。血液は以下のように処理した。１) 150μｌの血液サンプルを採取し、１ｍｌのＡＣＫ赤血球溶解バッファ(Biosource P304-100)を加える、２) ＲＴで５分間溶解させる、３) ＲＴ、５０００回転数／分にて２分間遠心する、４) ＦＡＣＳバッファ(ＰＢＳ＋２％ＦＣＳ)にて洗浄し、再度遠心する、そして、５) ６０μｌのＦＡＣＳバッファに再懸濁し、７０μｍメッシュにて濾過する。脾臓は以下のように処理した。１) ＦＡＣＳバッファのスライドグラス(ＶＷＲマイクロスライド４８３１２-００２、２５×７５ｍｍ)のフロスト表面を用いて単個細胞浮遊液を調製する、２) １２００回転数／分で５分間遠心分離する、３) ５ｍｌのＡＣＫ(ＡＣＫバッファ：０.１５ＭＮＨ_４Ｃｌ、１０.０ｍＭＫＨＣＯ_３、０.１ｍＭＮａ_２ＥＤＴＡ, ｐＨ７.２〜７.４、０．２２μｍにてフィルター滅菌、ＲＴで保存)にてペレットを懸濁し、場合によって時に振とうしながらＲＴで５分間以上インキュベートする、４) インキュベーションの後に、ＦＡＣＳ培地を加えて１５ｍｌにする、５) 再度遠心して、細胞を０．５〜１ｍｌ(ＦＶ６マウスには１ｍｌ、ベージュヌードＸＩＤマウスには０．５ｍｌ)のＦＡＣＳバッファに再懸濁する、そして、６) 濾過する。肝臓は以下のように処置した。１) (５０ｍｌの円錐体のチューブ中で)ＦＡＣＳバッファ中で肝臓(全体の１／８)を小切片に切り刻み、切片を４５ｍｌのＰＢＳにて洗浄する、２) 切片を１２００回転数／分にて５分間遠心して、注意深く小切片をフロスト表面上に移し、単一細胞にする、３) ３ｍｌのＦＡＣＳバッファにて洗浄し、遠心分離する、そして、４) ０．５ｍｌのＦＡＣＳバッファに再懸濁して濾過する。全細胞を数えるために１０μｌの血液細胞を９０μｌのＦＡＣＳバッファにて希釈した。全細胞を数えるために、脾臓試料を取り出し、１:１０に希釈した。血液、脾臓及び肝臓からの５０μｌの試料を９６ウェル細胞培養クラスター、蓋付きＶ底(Costar 3894)に移し、１μｌ／試料の遮断抗体(ＣＤ１６／３２)を加えて１５分置いた。細胞は、１０μｌ／試料のＦ４／８０-ＰＥ抗体(Serotec、ラット抗マウスＦ４／８０、ＭＣＡ４９７ＰＥ、１１０１Ｂ)とともにインキュベートし、マクロファージを検出した。細胞は抗体とともに氷上で２０分間、アルミ箔で覆ってインキュベートし、その後２００μｌのＦＡＣＳバッファを加え、細胞を４℃、１５００回転数／分にて５分間遠心分離した。バッファを取り除き、細胞を２００μｌのＦＡＣＳバッファに再懸濁し、再び遠心分離した。最後に、細胞を１３０μｌのＦＡＣＳバッファに再懸濁し、小チューブ(２０２０３２２０２-１２)に移し、ＢＤＦＡＣＳ機にて読み取った。

腫瘍試料からの単個細胞浮遊液の調製：腫瘍を切り裂いて脂肪組織と皮膚を取り除き、ＰＳＧＦを含有するＥＬ４培地に置き、氷上に置いた。１５ｍｌ／腫瘍の同じ培地にて腫瘍を洗浄し、１８０回転数／分で１０分間遠心分離した。上清を除去し、組織を再び洗浄した。そして、１０ｃｍの組織培養皿を用いて２ｍｌの冷却ＥＬ４培地中で、腫瘍を小切片(＜１ｍｍ)に細かく切り刻んだ。８ｍｌの培地を加えてＥＬ４腫瘍の単一細胞を５０ｍｌのファルコンチューブに回収し、４０μｍのナイロンフィルターメッシュにて濾過した。２１０ｃｍペトリ皿を用いてコラゲナーゼＩＶ、ＤＮアーゼ及びエラスターゼを含有する５０ｍｌの解離バッファ／腫瘍を細胞に加え、３７℃に１．５時間置いた。組織は、１５分ごとに上下にピペッティングして破壊した。場合によって、例えば３０分後に２００μｌの１２．５ｍｌのLiberase Blendyme I含有細胞解離バッファを１２．５ｍｌに加え、１時間後にさらにコラゲナーゼＩＶを加えてもよい。組織処理物を異なるサイズのナイロンフィルターメッシュ(１００、７０及び４０μｍ)にて順に濾過し、試料をＥＬ４培地にて２回洗浄して、４℃、２０００回転数／分にて５分間遠心分離した。細胞の数を数えて、回収した。ある実験では、細胞を溶解し、総ＲＮＡを単離した(例えば、Ｔａｑｍａｎによって分析されてもよい)。場合によって、ＥＬ４培地を用いて１００００００細胞／１００μｌまで細胞懸濁し、１００００００細胞の場合では、２μｇのＦｃＩ／ＩＩにて３０分かけて細胞をブロックし、Ｆ４／８０、ＣＤ抗体又はＣＤ３１標識抗体にてＲＴで１時間かけて標識し、マクロファージ、ＥＬ４リンパ球及び他の造血細胞及び内皮細胞を試料から単離し、細胞をＥＬ4培地にて２回洗浄し、細胞選別のために１００００００細胞／０．５ｍｌに懸濁した。ＦＳＣ／ＳＳＣ及び蛍光強度を基づいて細胞をゲートした。また、分類された細胞を遠心して、適切な培養液に取り、数を数えて、細胞生存度について測定してもよい。形態／免疫蛍光実験のために、１％ゼラチンコート又はマトリゲルコート(３０分)の４ウェル細胞培養スライドチャンバー上でＥＬ４培地を用いて細胞をプレーティングすることによって細胞を調製し、終夜培養した。細胞をバラバラにし、ＲＮＡを単離するために溶解させてもよい(＜５０００００細胞)。場合によって、例えば線維芽細胞や筋細胞などの他の種類の細胞を分類機から単離し、数を数えて、細胞生存率、及び更なる分析のために測定してもよい。場合によって、これらの細胞を溶解し、ＲＮＡを単離してもよい。

クロドロネートリポソームの調製と投与：７５〜９５ｍｇのＬαホスファツジルコリンを１０ｍｌのメタノールと１０ｍｌのクロロホルムを含む５００ｍｌフラスコに加えた(このフラスコは予めメタノールとクロロホルムにてすすいでおいた)。１０〜１５ｍｇのコレステロールを加えた。フラスコは、回転(１３０〜１５０回転数／分)と減圧(２００ｍｂａｒから１５０ｍｂａｒに徐々に減圧する)を施したロートベーパー(Rotovapor)であり、液体が溶解して薄膜が形成するまで(１０分以内)３７℃のウォーターバス中に置いた。薄膜は１０ｍｌのクロロホルムに溶解し、再びロートベーパー下に置き、クロロホルムを除去し、乳白色リン脂質膜をフラスコの内壁周辺に形成させた。１５分以内。液体が蒸発した場合であっても薄膜が形成しない場合があった。リン脂質膜を１０ｍｌのＰＢＳ又は２．０ｇのクロドロネート／１０ｍｌＰＢＳに分散し、膜が溶解するまで手で回転させるか、及び／又は旋回させ、乳白色懸濁液とした。乳白色懸濁液をＮ２大気下、ＲＴに１.５〜２時間置いた。懸濁液を穏やかに振とうして、ウォーターバス超音波処理器中で３分間超音波処理した。リポソームを膨張させるために懸濁液は、Ｎ_２大気下、ＲＴに２時間置くか、又は４℃に終夜置いた。被包していないクロドロネートは、リポソームを１００００×ｇ、１６℃にて１５分間遠心することによって除去した(１１６００回転数／分、７０Ｔｉローター)。リポソームは、懸濁液の上部で白いバンドを形成した。リポソームの下のクロドロネート溶液は、ピペットを用いて取り除いた。リポソームを滅菌ＰＢＳにて２〜３回洗浄し、手で撹拌してペレットを崩壊した。リポソームを２５０００×ｇ、１６℃にて３０分間遠心した(７０Ｔｉローターを用いて１８４００回転数／分)。ペレットを、４ｍｌの滅菌ＰＢＳに再懸濁し、ＰＢＳ中、Ｎ_２下にて最長４週間まで貯蔵した。動物に投与する前に、リポソームを穏やかに撹拌し、２００μｌのリポソーム試薬を各動物の尾静脈から週２回投与した。

本明細書は、当業者による本発明の実施を十分可能にするものであると考えられる。本明細書中で示すもの及び記載のものに加えて本発明への様々な修飾や変更は、前述の説明から当業者に明らかとなり、添付の特許請求の範囲内である。本明細書で引用したすべての出版物、特許及び特許出願は、あらゆる目的のためにその全体が出典明記によって援用される。

抗ＶＥＧＦ処置に対する同系の腫瘍細胞株の耐性が、該細胞株が有するＢＭＭＮＣを動員(recruit)する能力と相関することを示す。(a) 抗ＶＥＧＦ抗体であるＧ６-２３又はコントロール抗体(抗ブタクサ)によって治療したＣ５７ＢＬ／６のＧＦＰ骨髄キメラマウス(ｎ＝５)における異種移植したＬＬＣ、ＥＬ４及びＢ１６Ｆ１腫瘍の増殖曲線。１０ｍｇ／ｋｇのＧ６-２３、コントロール抗体の週２回の腹腔内(ＩＰ)投与により、２日目から処置を開始した。示されるデータは、３つの独立した実験のうちの代表的な１つの実験の平均±標準偏差である。 (b) コントロール(１０及び５０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、週２回)又はＧ６-２３(１０及び５０ｍｇ／ｋｇ、ＩＰ、週２回)により処置したベージュヌードＸＩＤマウス(ｎ＝１０)におけるＥＬ４腫瘍の増殖。腫瘍細胞移植後１日目に処置を始めた。統計学的分析は、ＡＮＯＶＡプログラム、＊ｐ≦０．０５、＊＊ｐ＜０．００５を使用して評価した。 (c) (b)について記載したベージュヌードＸＩＤマウスにおけるＬＬＣ腫瘍(ｎ＝１０)の増殖。Ｇ６-２３(１０及び１００ｍｇ／ｋｇ)及びコントロール(１００ｍｇ／ｋｇ)をそれぞれＩＰ、週２回投与した。 (d) １４日間処置したＢ１６Ｆ１、ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍細胞懸濁液のＦＡＣＳ分析(ｎ＝４)。抗ＶＥＧＦにて処置したＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍におけるＧＦＰ＋ＢＭＭＮＣの増加数をＢ１６Ｆ１腫瘍と比較して決定した。 (e) コントロール又は抗ＶＥＧＦ抗体にて１４日間処置したＥＬ４、ＬＬＣ及びＢ１６Ｆ１腫瘍切片におけるＣＤ３１＋及びＧＦＰ＋細胞の免疫蛍光染色。ＣＤ３１＋脈管の量の有意な減少とＢ１６Ｆ１腫瘍の間質におけるＧＦＰ＋細胞の存在の減少を、ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍と比較して決定した。示されるデータは、３つの独立した実験のうちの１つの代表的な１群当たりの切片である。 (f) １４日間処置した腫瘍異種移植片の血管表面積(ＶＳＡ)の定量化。抗ＶＥＧＦにて処置したＢ１６Ｆ１腫瘍は、ＬＬＣ又はＥＬ４腫瘍より顕著な血管表面積の減少を示した。示されるデータは、処置群当たり３〜５の腫瘍の９〜１５の切片の平均±標準誤差である。腫瘍混合実験と、骨髄から単離したＧＦＰ＋と混合したＢ１６Ｆ１腫瘍とＧＦＰ-キメラマウスの腫瘍の増殖曲線を示す。(a) ＥＬ４、ＬＬＣ又はＢ１６Ｆ１腫瘍を有するマウスから単離した１０^６ＢＭＭＮＣと混合した場合、及びコントロール抗体にて処置した場合の２．５×１０^６のＢ１６Ｆ１腫瘍細胞の増殖。コントロールとして、マトリゲルを移植したマウス又はコントロールマウスのＢＭＭＮＣを示す。(ｎ＝５)。 (b) ＥＬ４、ＬＬＣ又はＢ１６Ｆ１腫瘍を有するマウスから単離したＧＦＰ＋ＢＭＭＮＣと混合し、抗ＶＥＧＦ抗体にて処置したＢ１６Ｆ１腫瘍の腫瘍増殖曲線。ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍由来のＧＦＰ＋骨髄細胞は、抗ＶＥＧＦに感受性のあるＢ１６Ｆ１腫瘍の増殖を有意に増加した(ｎ＝４)。(a)及び(b)に示すデータは、少なくとも２つの独立した実験のうちの１つの代表的な実験からのものである。 (c及びd) コントロール抗体(c)又は抗ＶＥＧＦであるＧ６-２３(d)にて処置した１４日齢のＥＬ４、ＬＬＣ又はＢ１６Ｆ１腫瘍から単離した５×１０^５のＧＦＰ陽性細胞と混合した場合の２×１０^６のＢ１６Ｆ１腫瘍の増殖。 (c及びd) コントロール抗体(c)又は抗ＶＥＧＦであるＧ６-２３(d)にて処置した１４日齢のＥＬ４、ＬＬＣ又はＢ１６Ｆ１腫瘍から単離した５×１０^５のＧＦＰ陽性細胞と混合した場合の２×１０^６のＢ１６Ｆ１腫瘍の増殖。インビトロでの細胞移動実験、インビボでの腫瘍及び骨髄、及び抗ＶＥＧＦに対する耐性を媒介する際の機能的な役割におけるＣＤ１１ｂ、Ｇｒ１細胞の頻度分析を示す。ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍を有するマウスから単離したＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ1＋細胞は、抗ＶＥＧＦ処置に対する耐性を媒介する主要なＢＭ細胞群である。(a) コントロール又は抗ＶＥＧＦにて処置したＥＬ４、ＬＬＣ又はＢ１６Ｆ１腫瘍の条件培地に曝した後の新しく単離したＢＭＭＮＣの移動するＣＤ１１ｂ+Ｇｒ１陽性細胞の数。両方の抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍(ＥＬ４、ＬＬＣ)は、ＶＥＧＦに依存しない移動を誘導する。 (b) ＥＬ４、ＬＬＣ及びＢ１６Ｆ１腫瘍を移植して、コントロール又は抗ＶＥＧＦにて処置したマウスから単離した腫瘍の多系列分析。Ｂ１６Ｆ１腫瘍でなく、ＥＬ４及びＬＬＣは、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の有意な増加を示した。示されるデータは、２つの独立した実験のうちの１つの代表的な実験のものである。 (c) ＥＬ４、ＬＬＣ及びＢ１６Ｆ１腫瘍を移植したマウスから単離した腫瘍及び骨髄の多系列分析。腫瘍単離物(図３ｂ)とは異なり、腫瘍を有するマウスの骨髄におけるＣＤ１１ｂ+又はＧｒ１細胞の増加は一致しなかった。示されるデータは、２つの独立した実験のうちの１つの代表的な実験のものである。 (d) ＥＬ４及びＬＬＣにて刺激した、骨髄由来のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞と混合して、抗ＶＥＧＦ(Ｇ６-２３、１群当たりｎ＝５)にて処置したＢ１６Ｆ１腫瘍の増殖曲線。ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞が減少したＢＭＭＮＣが耐性媒介能の減少を示したので、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞は耐性を媒介するために必須かつ十分なものである。示されるデータは、２つの独立した実験のうちの１つの代表的な実験のものである。 (ｅ及びｆ) ＥＬ４(e)及びＬＬＣ(f)腫瘍を有するマウスから単離した腫瘍関連のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞と混合したＢ１６Ｆ１細胞の増殖曲線。およそ、３×１０^５のＦＡＣＳ分類ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞がＥＬ４又はＬＬＣ腫瘍を有するマウスから単離され、３×１０^６のＢ１６Ｆ１細胞と混合し、Ｃ５７ＢＬ／６マウス(ｎ＝５)に移植した。 (ｅ及びｆ) ＥＬ４(e)及びＬＬＣ(f)腫瘍を有するマウスから単離した腫瘍関連のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞と混合したＢ１６Ｆ１細胞の増殖曲線。およそ、３×１０^５のＦＡＣＳ分類ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞がＥＬ４又はＬＬＣ腫瘍を有するマウスから単離され、３×１０^６のＢ１６Ｆ１細胞と混合し、Ｃ５７ＢＬ／６マウス(ｎ＝５)に移植した。骨髄細胞及び腫瘍単離物の遺伝子発現分析を示す。(a) 抗ＶＥＧＦにて処置した抗ＶＥＧＦ-耐性ＥＬ４(ＥＲ１-３)、ＬＬＣ(ＬＲ１-３)又は抗ＶＥＧＦ-感受性Ｂ１６Ｆ１腫瘍(ＢＲ１-３)を移植したマウスの骨髄から単離したＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の遺伝子発現データの教師なしクラスター分析。階層的なクラスター手法では、データをコントロールのマトリゲル移植マウスに規準化した。下方制御した遺伝子、変化しない遺伝子、及び上方制御した遺伝子を示す。抗ＶＥＧＦ-感受性腫瘍によって誘導される変化の特徴とは異なる、抗ＶＥＧＦ-耐性腫瘍によって誘導される変化の特徴的な一群が同定されうる。 (b) 血管新生又は骨髄細胞分化及び移動の調節に関与しうる遺伝子のディスプレイ。１７日間抗ＶＥＧＦにて処置した抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍と抗ＶＥＧＦ感受性腫瘍との間の骨髄ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の発現レベルに有意な変化があった(ｐ＝０．０５、＞２倍)。 (c) １７日間、Ｇ６-２３にて処置した後、ＥＬ４、ＬＬＣ及びＢ１６Ｆ１腫瘍から単離したＲＮＡから得た遺伝子発現データの教師なしクラスター分析。 (d) 血管新生及び／又は骨髄細胞分化及び移動の調節に関与しうる遺伝子のディスプレイ。１７日間、Ｇ６-２３にて処置した後、Ｂ１６Ｆ１腫瘍(ＢＲ１-３)と比較して、両方の抗ＶＥＧＦ耐性腫瘍(ＥＬ４＝ＥＲ１-３、ＬＬＣ＝ＬＲ１-３)の発現レベルに有意な変化があった(ｐ≦０．０５、倍数変化＞２)。ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍の増殖に対する、Ｇｒ１＋骨髄性細胞をターゲットとする抗体(抗Ｇｒ１)と抗ＶＥＧＦとの組合せの効果を示す。(a) 抗ＶＥＧＦ(ｎ＝５)又は抗Ｇｒ１(ｎ＝４)を単独又は組み合わせて(抗ＶＥＧＦ＋抗Ｇｒ１；ｃｏｍｂｏ)用いて処理したＥＬ４腫瘍の増殖曲線。これらの群の動物の数は３〜４である。 (b) (a)に記載のように１７日間処置したＥＬ４腫瘍の、ＩＨＣによる血管表面積(ＶＳＡ)の定量化、ＦＡＣＳによる末梢及び腫瘍のＧｒ１＋細胞及びＣＤ３１＋内皮細胞(ＥＣ)の頻度、及び最終腫瘍重量。循環のＧｒ１細胞がほぼ完全に減少したのとは異なり、抗Ｇｒ１で処置したマウスの腫瘍では２〜３分の１の減少が観察された。抗ＶＥＧＦ単独によるＥＬ４腫瘍と抗ＶＥＧＦ及び抗Ｇｒ１ＭＡｂの組合せによるＥＬ４腫瘍との間の最終腫瘍重量に統計学的に有意な違いが見られた。データは、少なくとも２つの独立した実験のうちの１つの代表的な実験の平均±ＳＥＭである。 (c) 抗ＶＥＧＦ(ｎ＝５)又は抗Ｇｒ１(ｎ＝４)を単独又は組み合わせて(ｎ＝４)用いて処置したＬＬＣ腫瘍の増殖曲線。 (d) 処置した動物における、ＩＨＣによる血管表面積(ＶＳＡ)の定量化、ＦＡＣＳによる末梢中のＧｒ１＋細胞及び腫瘍中のＧｒ１＋及びＣＤ３１＋内皮細胞(ＥＣ)の頻度、及び腫瘍重量。抗ＶＥＧＦ単独にて処置したＬＬＣ腫瘍と抗ＶＥＧＦ及び抗ＧＲ１の組合せにて処置したＬＬＣ腫瘍との間で、腫瘍体積及びＶＳＡにおいて統計学的に有意な差があった。データは、少なくとも２つの独立した実験のうちの１つの代表的な実験の平均±ＳＥＭである。 (ｅ及びｆ) 抗ＶＥＧＦ処置と組み合わせたエラスターゼインヒビターは、ＥＬ4(e)及びＬＬＣ(f)腫瘍の腫瘍耐性を遅延させる。抗ＶＥＧＦコホートと比較した場合、組合せ処置の腫瘍体積は有意に小さかった。図５に示されるデータは、少なくとも２つの独立した実験のうちの１つの代表的な実験の平均±標準偏差である。統計学的分析はＡＮＯＶＡによって評価し、ｐ≦０．０５を示し、＊＊はp＜０．０１を示す。 (ｅ及びｆ) 抗ＶＥＧＦ処置と組み合わせたエラスターゼインヒビターは、ＥＬ4(e)及びＬＬＣ(f)腫瘍の腫瘍耐性を遅延させる。抗ＶＥＧＦコホートと比較した場合、組合せ処置の腫瘍体積は有意に小さかった。図５に示されるデータは、少なくとも２つの独立した実験のうちの１つの代表的な実験の平均±標準偏差である。統計学的分析はＡＮＯＶＡによって評価し、ｐ≦０．０５を示し、＊＊はp＜０．０１を示す。抗ＶＥＧＦ処置に耐性のある腫瘍におけるＢＭＭＮＣの役割と、実験動物の腫瘍又は骨髄からのＧＦＰ＋細胞の単離を調査するための実験計画を示す。パネルａは、抗ＶＥＧＦ処置に耐性のある腫瘍におけるＢＭＭＮＣの役割を調査するための実験計画を図で示す。異種移植片研究におけるＢＭＭＮＣの動員の動態をモニターするために、ＧＦＰ＋ＢＭＭＮＣを、致死のレベルの照射を受けたＣ５７Ｂｌ／６マウスにＩＶ注入した(ａＩ.)。次に、感受性(Ｂ１６Ｆ１)及び耐性(ＥＬ４及びＬＬＣ)の腫瘍をマトリゲルに移植することによってキメラマウスを刺激した(ａＩＩ.)。キメラマウスの骨髄(ａＩＩＩ.)及び腫瘍(ａＩＶ.)からＧＦＰ＋細胞を単離して、Ｂ１６Ｆ１細胞と混合し、Ｃ５７ＢＬ／６マウスに注入(ＳＣ)した。腫瘍を移植した動物を抗ＶＥＧＦ又はコントロール抗体(ａＶ.)にて処置し、抗ＶＥＧＦ処置に対する腫瘍の耐性を媒介する際のＢＭＭＮＣの役割を決定した。パネルｂは、移植したマウスの腫瘍及び骨髄からのＧＦＰ＋細胞の単離を示す。ＦＡＣＳ分類を使用して、移植したマウス(実験計画のステップａＩＩ.)の腫瘍及び骨髄からのＧＦＰ＋細胞を単離した(ｂＩ.)。分類後分析(ｂＩＩ.)を用いて、実験動物の腫瘍又は骨髄から単離したＧＦＰ＋細胞の純度を決定した。ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍を移植したマウスの骨髄からのＣＤ１１ｂＧｒ１精製を示す。ＢＭＭＮＣは、ＥＬ４又はＬＬＣ腫瘍を移植したＣ５７ＢＬ／６マウスから単離した。ＢＭＭＮＣは、抗ＣＤ１１ｂコンジュゲートビーズとともにインキュベートして、ＣＤ１１ｂ＋及びＣＤ１１ｂ−の分画を単離するために大規模な磁気カラムに通した。各々の分画からの細胞並びに分類していない細胞の一定量をＣＤ１１ｂとＧｒ１蛍光色素コンジュゲート抗体にて染色し、細胞の純度を決定した。抗ＶＥＧＦ抗体(Ｇ６-３１)にて処置し、ＨｉＴｒａｐＨＳカラムに流した、抗ＶＥＧＦ処置に耐性のあるマウスリンパ腫腫瘍溶解物の溶出特性を示す。カラムは、塩濃度を上げながら段階様式で溶出させた。 1) ＰＢＳリポソーム／ブタクサ、2) ＰＢＳリポソーム／Ｇ６-３１；3) クロドロネートリポソーム／Ｇ６-２３、4) クロドロネートリポソーム／Ｇ６-３１、又は5) クロドロネートリポソーム／ＰＢＳを尾静脈に投与して７２時間後のマウスにおけるＥＬ４腫瘍サイズの変化を示す。クロドロネートリポソームが抗ＶＥＧＦ(Ｇ６-２３)と組み合わせてマウスに投与される場合の、抗ＶＥＧＦ処置に耐性がある腫瘍を有するマウスにおけるＶＥＧＦｍＲＮＡ発現の減少を示す。クロドロネートリポソーム及び抗ＶＥＧＦ(Ｇ６-２３)にて処置した、抗ＶＥＧＦ処置に耐性がある腫瘍を有するマウスにおけるＫＣレベルの減少を示す。パネルＡ及びＢは、ＭＩＰ-１α(パネルＡ)及びＭＣＰ-１(パネルＢ)が抗ＶＥＧＦ処置に耐性がある腫瘍細胞株において発現することを示す。ここで、Ｄｉｌ(＋)が内皮細胞であり、ＣＤ３(＋)はリンパ系細胞を表し、Ｆ４／８０(＋)はマクロファージを表す。パネルＡ及びＢは、ＭＩＰ-１α及びＭＣＰ-１が血管形成出芽及び毛細血管の内腔形成アッセイにおいて血管形成活性を有することを示す。パネルＡは内皮細胞のコントロールを示す。ここで、ビーズは１０日間、ＶＥＧＦ及びＤ５５１にて処置した。パネルＢは、Ｄ５５１(ネガティブコントロール)(左上)、ＶＥＧＦ(ネガティブコントロール)(右上)、１．２５μｇ／ｍｌのＭＣＰ-１及びＤ５５１(左下)、及び１．２５μｇ／ｍｌのＭＩＰ-１α及びＤ５５１(右下)にて処置した内皮細胞を示す。コントロール又は抗ＶＥＧＦ抗体Ｇ６-２３のいずれかにて７日目(ｐ１)と１４日目(ｐ２)に処置した腫瘍保持マウス(Ｂ１６Ｆ１(a)、ＥＬ４(b)及びＬＬ２(c))からのＢＭＭＮＣの系列分析を示す。挿入図は、ＣＤ１１ｂについてゲートした細胞を表す。抗ＶＥＧＦ処置によりＣＤ１１ｂ＋細胞及びＧｒ１＋細胞のレベルが増加したが、分析した他の種類の細胞はいずれも増加しなかった。７日目と１４日目との間に増加があった細胞型は、ＣＸＣＲ４＋、ＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ３１＋及びＣＤ１１ｂ＋、ＣＤ３１＋細胞であった。それに対して、７日目と１４日目との間で、ＬＬ２及びＥＬ４においてＣＤ１９＋(Ｂリンパ球)とＣＤ９０＋(Ｔリンパ球)細胞の減少が観察されたが、Ｂ１６Ｆ１腫瘍においては観察されなかった。コントロール又は抗ＶＥＧＦ抗体Ｇ６-２３のいずれかにて７日目(ｐ１)と１４日目(ｐ２)に処置した腫瘍保持マウス(Ｂ１６Ｆ１(a)、ＥＬ４(b)及びＬＬ２(c))からのＢＭＭＮＣの系列分析を示す。コントロール又は抗ＶＥＧＦ抗体Ｇ６-２３のいずれかにて７日目(ｐ１)と１４日目(ｐ２)に処置した腫瘍保持マウス(Ｂ１６Ｆ１(a)、ＥＬ４(b)及びＬＬ２(c))からのＢＭＭＮＣの系列分析を示す。耐性及び感受性腫瘍を有するマウスの腫瘍及びＢＭにおけるＧＦＰ＋細胞の多系列分析を示す。記載したように、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにＴＩＢ６、Ｂ１６Ｆ１、ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍を移植し、抗ＶＥＧＦ又はコントロール抗体にて処置した。ＢＭＭＮＣ及び腫瘍単離物を各マウスから採取し、ＣＤ１９(Ｂリンパ性)、ＣＤ９０(Ｔリンパ性)、ＣＤ１１ｃ(樹状)、更にＶＥＧＦレセプター(Ｒ１及びＲ２)に対する抗体にて染色した。グラフは、腫瘍(a)及び骨髄(b)区画における各々のサブセットの頻度を表す。耐性及び感受性腫瘍を有するマウスの腫瘍及びＢＭにおけるＧＦＰ＋細胞の多系列分析を示す。記載したように、Ｃ５７Ｂｌ／６マウスにＴＩＢ６、Ｂ１６Ｆ１、ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍を移植し、抗ＶＥＧＦ又はコントロール抗体にて処置した。ＢＭＭＮＣ及び腫瘍単離物を各マウスから採取し、ＣＤ１９(Ｂリンパ性)、ＣＤ９０(Ｔリンパ性)、ＣＤ１１ｃ(樹状)、更にＶＥＧＦレセプター(Ｒ１及びＲ２)に対する抗体にて染色した。グラフは、腫瘍(a)及び骨髄(b)区画における各々のサブセットの頻度を表す。脾臓は、耐性腫瘍を有するマウスにおいてＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞のホーミングの代替部位である。記載したように、Ｃ５７Ｂｌ／６-ＧＦＰキメラマウスにＴＩＢ６、Ｂ１６Ｆ１、ＥＬ４及びＬＬＣ腫瘍を移植し、１７日間、抗ＶＥＧＦ又はコントロール抗体にて処置した。(a) 腫瘍を有するマウスの分析から、耐性腫瘍を有するマウスの脾臓の大きさに有意な(ｐ≦０．０５)増加が示された。(b) 物理的に破壊して各マウスから脾細胞を採取し、赤血球を取り除くために溶解バッファにて処置した。次いで、脾細胞を抗ＣＤ１１ｂと抗Ｇｒ１抗体にて染色し、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度を調査するために、ＦＡＣＳ機器にて分析した。データ分析から、感受性腫瘍と比較して耐性腫瘍を有するマウスの脾臓においてＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度に有意な増加(ｐ≦０．０５)があることが示された。＊は、対応するＢ１６Ｆ１及びＴＩＢ６にて処置した動物と比較して抗ＶＥＧＦにて処置したＥＬ4腫瘍を有するマウスに相違があることを示す(ｐ≦０．０５)。＋は、Ｂ１６Ｆ１及びＴＩＢ６にて処置した動物と比較して抗ＶＥＧＦにて処置したＬＬＣ-腫瘍保持マウスにおいて有意な相違があることを示す(ｐ≦０．０５)。耐性腫瘍にて刺激したマウスから単離した骨髄性細胞だけが抗ＶＥＧＦに対する耐性を媒介することができることを示す。グラフは、Ｂ１６Ｆ１又はマトリゲルにて刺激した、骨髄由来のＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞と混合して、抗ＶＥＧＦにて処置したＢ１６Ｆ１腫瘍の増殖曲線を示す(１群当たりｎ＝５)。記載したように、腫瘍体積を２１日間測定した。(b) 血管新生の誘導は、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞が抗ＶＥＧＦ処置に対する耐性を発達させる１つのメカニズムである。Ｂ１６Ｆ１及びＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋又はＣＤ１１ｂ-Ｇｒ１−細胞の混合物を保持するマウスにおいてＶＳＡを分析した。＊は、ＥＬ４又はＬＬＣ刺激マウスからのＢ１６Ｆ１とＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の混合物を、同じように刺激した動物から単離したＣＤ１１ｂ-Ｇｒ１−細胞とのＢ１６Ｆ１混合物に比較した場合に有意な相違があることを示す(ｐ≦０．０５)。異なるメカニズムが抗ＶＥＧＦ及び化学療法剤に対する耐性を調整することを示す。記載したように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス(ｎ＝５)に、ＥＬ４(a)、ＬＬＣ(b)、ＴＩＢ６(c)及びＢ１６Ｆ１(d)腫瘍を移植して、抗ＶＥＧＦ抗体、コントロール抗体、ゲムシタビン及び５ＦＵにて処置した。腫瘍体積は週２回測定し、すべてのマウスは１７日目に分析した。＊は、抗ＶＥＧＦにて処置したマウスを５ＦＵ又はゲムシタビンにて処置した動物と比較した場合に有意な差異があることを示す。異なるメカニズムが抗ＶＥＧＦ及び化学療法剤に対する耐性を調整することを示す。記載したように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス(ｎ＝５)に、ＥＬ４(a)、ＬＬＣ(b)、ＴＩＢ６(c)及びＢ１６Ｆ１(d)腫瘍を移植して、抗ＶＥＧＦ抗体、コントロール抗体、ゲムシタビン及び５ＦＵにて処置した。腫瘍体積は週２回測定し、すべてのマウスは１７日目に分析した。＊は、抗ＶＥＧＦにて処置したマウスを５ＦＵ又はゲムシタビンにて処置した動物と比較した場合に有意な差異があることを示す。異なるメカニズムが抗ＶＥＧＦ及び化学療法剤に対する耐性を調整することを示す。記載したように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス(ｎ＝５)に、ＥＬ４(a)、ＬＬＣ(b)、ＴＩＢ６(c)及びＢ１６Ｆ１(d)腫瘍を移植して、抗ＶＥＧＦ抗体、コントロール抗体、ゲムシタビン及び５ＦＵにて処置した。腫瘍体積は週２回測定し、すべてのマウスは１７日目に分析した。＊は、抗ＶＥＧＦにて処置したマウスを５ＦＵ又はゲムシタビンにて処置した動物と比較した場合に有意な差異があることを示す。異なるメカニズムが抗ＶＥＧＦ及び化学療法剤に対する耐性を調整することを示す。記載したように、Ｃ５７ＢＬ／６マウス(ｎ＝５)に、ＥＬ４(a)、ＬＬＣ(b)、ＴＩＢ６(c)及びＢ１６Ｆ１(d)腫瘍を移植して、抗ＶＥＧＦ抗体、コントロール抗体、ゲムシタビン及び５ＦＵにて処置した。腫瘍体積は週２回測定し、すべてのマウスは１７日目に分析した。＊は、抗ＶＥＧＦにて処置したマウスを５ＦＵ又はゲムシタビンにて処置した動物と比較した場合に有意な差異があることを示す。 (e) 各マウスからＢＭ細胞を単離し、ＣＤ１１ｂ及びＧｒ１蛍光色素コンジュゲート抗体にて染色した。グラフは、各処置におけるＢＭＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数を表す。＊は、対応するＢ１６Ｆ１及びＴＩＢ６にて処置した動物と比較して、抗ＶＥＧＦにて処置したＥＬ４腫瘍保持マウスにおいて有意な相違があることを示す(ｐ≦０．０５)。＋は、対応するＢ１６Ｆ１及びＴＩＢ６にて処置した動物と比較して、抗ＶＥＧＦにて処置したＬＬＣ腫瘍保持マウスにおいて有意な相違があることを示す(ｐ≦０．０５)。 (f) １７日後に各マウスから腫瘍単離物を回収し、同じ抗体にて染色し、各々の腫瘍におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の頻度と数に注目した。バーは平均±ＳＥＭを表す。＊は、対応するＢ１６Ｆ１及びＴＩＢ６にて処置した動物と比較して、抗ＶＥＧＦにて処置したＥＬ４腫瘍保持マウスにおいて有意な相違があることを示す(ｐ≦０．０５)。＋は、対応するＢ１６Ｆ１及びＴＩＢ６にて処置した動物と比較して、抗ＶＥＧＦにて処置したＬＬＣ腫瘍保持マウスにおいて有意な相違があることを示す(ｐ≦０．０５)。

Claims

併用療法によって被検体の耐性腫瘍を治療する方法であって、
有効量のＶＥＧＦアンタゴニストと有効量の第二薬剤を組み合わせて、耐性腫瘍を有する被検体に投与することを含み、この第二薬剤が骨髄性細胞減少薬剤を含むものである方法。
骨髄性細胞減少薬剤が、Ｇｒ１アンタゴニスト、エラスターゼインヒビター、ＭＣＰ-１アンタゴニスト又はＭＩＰ-１αアンタゴニストを含む、請求項１に記載の方法。
アンタゴニストが抗体である、請求項２に記載の方法。
被検体の耐性腫瘍を診断する方法であって、
被検体の腫瘍から試験細胞群を準備し、
試験細胞群におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数ないしは割合を測定し、
試験細胞群におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数ないしは割合を参照細胞群におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数ないしは割合と比較し、そして、参照細胞群と比較して試験細胞群におけるＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数ないしは割合の増加を検出し、このとき、ＣＤ１１ｂ＋Ｇｒ１＋細胞の数ないし割合が増加している場合に腫瘍が耐性腫瘍であることを示すことを含む方法。
さらに、被検体の脾臓サイズを測定し、被検体の脾臓サイズを参照脾臓サイズと比較し、このとき、脾臓サイズが拡張している場合に腫瘍が耐性腫瘍であることを示すことを含む、請求項４に記載の方法。
さらに、被検体にＶＥＧＦアンタゴニストが投与された後に、被検体の腫瘍の血管表面積(ＶＳＡ)の数ないしは割合を測定し、被検体の腫瘍の血管表面積数の数ないしは割合を参照血管表面積と比較し、このとき、腫瘍の血管表面積の数ないし割合が増加している場合に腫瘍が耐性腫瘍であることを示すことを含む、請求項４に記載の方法。
アンタゴニストが抗体である、請求項６に記載の方法。
さらに、
被検体の腫瘍から試験細胞群を準備し、
試験細胞群におけるＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合を測定し、
試験細胞群におけるＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合を参照細胞群におけるＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合と比較し、そして、参照細胞群と比較して試験細胞群におけるＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合の減少を検出し、このとき、ＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合が減少している場合に腫瘍が耐性腫瘍であることを示すことを含む、請求項４に記載の方法。
さらに、
被検体の骨髄から試験細胞群を準備し、試験細胞群におけるＣＤ９０Ｔ-リンパ系細胞、ＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合を測定し、試験細胞群におけるＣＤ９０Ｔ-リンパ系細胞、ＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合を、参照細胞群におけるＣＤ９０Ｔ-リンパ系細胞、ＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合と比較し、そして、参照細胞群と比較して試験細胞群におけるＣＤ９０Ｔ-リンパ系細胞、ＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合の減少を検出し、このとき、ＣＤ９０Ｔ-リンパ系細胞、ＣＤ１９Ｂ-リンパ系細胞又はＣＤ１１ｃ樹状細胞の数ないしは割合が減少した場合に腫瘍が耐性腫瘍であることを示すことを含む、請求項４に記載の方法。
併用療法によって被検体の耐性腫瘍を治療する方法であって、
有効量のＶＥＧＦアンタゴニストを有効量の骨髄性細胞減少薬剤と有効量の第三薬剤と組み合わせて、耐性腫瘍を有する被検体に投与することを含み、この第三薬剤が化学療法剤である方法。
アンタゴニストが抗体である、請求項１０に記載の方法。
骨髄性細胞減少薬剤がＧｒ１アンタゴニスト、エラスターゼインヒビター、ＭＣＰ-１アンタゴニスト又はＭＩＰ-１αアンタゴニストを含む、請求項１０に記載の方法。
化学療法剤が５ＦＵ又はゲムシタビンである、請求項１０に記載の方法。