MX2008012279A - Diagnostico y tratamientos para tumores. - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para el tratamiento del cáncer con terapias combinadas que incluyen anticuerpos anti-VEGF. También se proporcionan métodos para diagnosticar tumores resistentes.

Description

DIAGNÓSTICOS Y TRATAMIENTOS PARA TUMORES SOLICITUDES RELACIONADAS

[0001] Esta solicitud reivindica prioridad conforme a la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 60/787,720, presentada el 29 de marzo de 2006. ÁMBITO DE LA INVENCIÓN

[0002] La invención se relaciona con el ámbito de los tipos de tumores y del crecimiento tumoral. La invención se relaciona con los inhibidores y marcadores de diagnóstico de tumores y sus usos para el diagnóstico y tratamiento del cáncer y el crecimiento tumoral.

ANTECEDENTES

[0003] Los tumores malignos (cánceres) son una causa importante de muerte en Estados Unidos, después de la enfermedad cardiaca (véase, por ejemplo, Boring y col., CA Cancel J. Clin. 43:7(1993) ) . El cáncer se caracteriza por el aumento de la cantidad de células anormales, o neoplásicas, derivadas de un tejido normal que proliferan para formar una masa tumoral, la invasión de estas células tumorales neoplásicas a los tejidos adyacentes y la producción de células malignas que finalmente se distribuyen a través de la sangre o el sistema linfático hasta llegar a ganglios linfáticos regionales y sitios distantes mediante un proceso denominado metástasis. En un estado canceroso, una célula prolifera en condiciones en las que las células normales no crecerían. El cáncer se manifiesta de diversas maneras y se caracteriza por diferentes grados de invasividad y agresividad .

[0004] Se han utilizado diversos tipos de terapias para tratar el cáncer. Por ejemplo, para extirpar tejidos cancerosos o muertos se utilizan métodos quirúrgicos. La radioterapia, que actúa reduciendo el tamaño de los tumores sólidos, y la quimioterapia, que mata a las células que se dividen rápidamente, se utilizan como tratamientos para el cáncer. Además, los agentes antiangiogénicos constituyen una efectiva estrategia ant ineoplásica . Estas terapias también-se están mejorando, a la vez que se están desarrollando otras terapias, como por ejemplo, las inmunoterapias .

[0005] Se ha demostrado ampliamente que la angiogénesis interviene en la patogénesis de diversos trastornos. Estos trastornos incluyen tumores sólidos y metástasis, aterosclerosis , fibroplasia retrolental, hemangiomas, inflamación crónica, enfermedades neovasculares infraoculares, tales como retinopatías proliferativas, como por ejemplo, retinopatia diabética, degeneración macular asociada a la edad (DMAE) , glaucoma neovascular, rechazo inmunológico de tejido corneal trasplantado y de otros tejidos, artritis reumatoide y psoriasis. Folkman y col., J. Biol. Chem., 267:10931-10934 (1992) ; Klagsbrun y col., Annu . Rev. Physiol. 53:217-239 (1991) y Garner A., "Vascular diseases", en: Pathobiology of Ocular Disease. A Dynamic Approach, Garner A., Klintworth GK, eds . , 2nd Edition (Marcel Dekker, NY, 1994), pp 1625-1710.

[0006] En el caso del crecimiento tumoral, la angiogénesis parece ser fundamental para la transición de la hiperplasia a la neoplasia y para fomentar el crecimiento y la metástasis tumoral. Folkman y col., Nature 339:58 (1989) . La neovasculari zación permite que las células tumorales adquieran una ventaja de crecimiento y autonomía proliferativa en comparación con las células normales. Un tumor suele comenzar como una única célula anómala que puede proliferar sólo hasta alcanzar un tamaño de unos pocos milímetros cúbicos debido a la distancia desde los lechos capilares disponibles y puede permanecer ^inactiva' sin crecer ni diseminarse durante un período prolongado. Algunas células tumorales cambian posteriormente a un fenotipo angiogénico para activar las células endoteliales , que proliferan y maduran hasta convertirse en vasos sanguíneos capilares nuevos. Estos vasos sanguíneos recién formados no sólo permiten el crecimiento continuo del tumor primario, sino también la diseminación y recolonización de células tumorales metastásicas . Por esta razón, se ha observado una correlación entre la densidad de los microvasos en secciones de tumores y la supervivencia de pacientes con cáncer de mama, así como también con otros tipos de tumores. Weidner y col., N. Engl. J. Med 324:1-6 (1991) ; Horak y col., Lancet 340:1120-1124 (1992); Macchiarini y col., Lancet 340:145-146 (1992) . No se conocen bien los mecanismos exactos que controlan el cambio angiogénico, pero se cree que la neovascularización de la masa tumoral se produce como consecuencia del equilibrio neto de diversos estimuladores e inhibidores de la angiogénesis (Folkman, 1995, Nat Med 1(1) :27-31) .

[0007] La identificación del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) como regulador principal de la angiogénesis en dolencias patológicas ha llevado a numerosos intentos de bloquear la actividad de dicho factor. El VEGF es uno de reguladores positivos de la angiogénesis más potentes y mejor caracterizados. Véase, por ejemplo, Ferrara, N. & Kerbel, R.S. Angiogénesis as a therapeutic target . Nature 438:967-74 (2005) . Además de ser un factor angiogénico en la angiogénesis y en la vasculogénesis , el VEGF, como factor de crecimiento pleiotrópico, presenta múltiples efectos biológicos en otros procesos fisiológicos, como por ejemplo, la supervivencia de las células endoteliales , la permeabilidad de los vasos y la vasodilatación, la quimiotaxis de monocitos y el influjo de calcio. Ferrara y Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev . 18:4-25. Asimismo, algunos estudios han revelado los efectos mitogénicos del VEGF en unos pocos tipos de células no endoteliales, tales como las células epiteliales pigmentarias de la retina, las células de los conductos pancreáticos y las células de Schwann. Véase, por ejemplo, Guerrin y col., J. Cell Physíol. 164:385-394 (1995); Oberg-Welsh y col., Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132 (1997) y Sondell y col., J. Neurosci. 19:5731-5740 (1999) .

[0008] Se han realizado numerosos intentos por bloquear la actividad del VEGF. Se ha propuesto el uso de anticuerpos receptores anti-VEGF inhibidores, constructos receptores solubles, estrategias antisentido, aptámeros de ARN anti-VEGF e inhibidores de tirosina quinasa del receptor (RTK) de VEGF de bajo peso molecular para interferir en las señales del VEGF. Véase, por ejemplo, Siemeister y col., Cáncer Metástasis Rev . 17:241-248 (1998) . Se ha demostrado que los anticuerpos neutralizantes anti-VEGF inhiben el desarrollo de diferentes lineas de células tumorales humanas en ratones sin pelaje (nude) (Kim y col., Nature 362:841-844 (1993); Warren y col., J. Clin. Invest. 95:1789-1797 (1995) ; Borgstróm y col., Cáncer Res. 56:4032-4039 (1996) y Melnyk y col., Cáncer Res. 56:921-924 (1996)) y que también inhiben la angiogénesis infraocular en modelos de trastornos retínales isquémicos (Adamis y col., Arch . Ophthalmol. 114:66-71 (1996)) . De hecho, la FDA (Food and Drug Administration) de Estados Unidos ha aprobado un anticuerpo anti-VEGF humanizado, el bevacizumab (AVASTIN®, Genentech, South San Francisco, CA) , como terapia de primera línea para el tratamiento del cáncer colorrectal metastásico. Véase, por ejemplo, Ferrara y col., Nature Reviews Drug Discovery, 3:391-400 (2004) .

[0009] Sin embargo, el desarrollo de la resistencia a la droga frecuentemente limita la capacidad a largo plazo de los compuestos terapéuticos de interferir en el crecimiento tumoral. Se han identificado y caracterizado funcionalmente diversos mecanismos de resistencia a diferentes compuestos citotóxicos, principalmente en modelos de tumores unicelulares. Véase, por ejemplo, Longley, D.B. & Johnston, P.G. Molecular mechanisms of drug resistance. J Pathol 205:275-92 (2005) . Además, las interacciones entre las células tumorales y las células estromales huéspedes pueden verse involucradas en fenotipos resistentes a la droga. Las células estromales secretan diferentes factores proangiogénicos y no son propensas a la misma inestabilidad genética y a los incrementos en la tasa de mutación que las células tumorales (Kerbel, R.S. Inhibition of tumor angiogenesis as a strategy to circumvent acquired resistance to anti-cancer therapeutic agents. Bioessays 13:31-6 (1991) . Revisado por Ferrara & Kerbel y Hazlehurst y col. en Ferrara, N. & Kerbel, R.S. Angiogenesis as a therapeutic target . Nature 438:967-74 (2005) y Hazlehurst, L.A., Landowski, T.H. & Dalton, .S. Role of the tumor microenvironment in mediating de novo resistance to drugs and physiological mediators of cell death. Oncogene 22 : 7396-402 (2003) .

[0010] En los modelos preclinicos, el bloqueo de señalización del VEGF con el anticuerpo monoclonal humanizado bevacizumab (AVASTIN®, Genentech, South San Francisco, CA) o el precursor murino del bevacizumab (A4.6.1 (linea celular del hibridoma que produce A4.6.1, depositada el 29/3/91, ATCC HB-10709) ) inhibió considerablemente el crecimiento tumoral y redujo la angiogénesis tumoral en la mayoría de los modelos xenotransplantados evaluados (revisado por Gerber & Ferrara en Gerber, H.P. & Ferrara, N. Pharmacology and pharmacodynamics of bevacizumab as monotherapy or in combination with cytotoxic therapy in preclinical studies.

Cáncer Res 65:671-80 (2005)) . Los efectos farmacológicos de un tratamiento anti-VEGF con agente único fueron más notables cuando se comenzó el tratamiento en las etapas iniciales del crecimiento tumoral. Si el tratamiento se postergó hasta que los tumores se consolidaran, los efectos de la inhibición fueron generalmente transitorios y los tumores finalmente desarrollaron resistencia. Véase, por ejemplo, Klement, G. y col . , Differences in therapeutic indexes of combination metronomic chemotherapy and an anti-VEGFR-2 antibody in multidrug-resistant human breast cáncer xenografts. Clin Cáncer Res 8:221-32 (2002) . Las reacciones moleculares y celulares que subyacen dicha resistencia al tratamiento anti-VEGF son complejas. Véase, por ejemplo, Casanovas, O., Hicklin, D.J., Bergers, G. & Hanahan, D. Drug resistance by evasión of antiangiogenic targeting of VEGF signaling in late-stage pancreatic islet tumors. Cáncer Cell 8:299-309 (2005) y Kerbel, R.S. y col., Possible mechanisms of acquired resistance to ant i-angiogenic drugs: implications for the use of combination therapy approaches. Cáncer Metástasis Rev 20:79-86 (2001) . Diversos factores pueden verse involucrados. Por ejemplo, un tratamiento combinado con compuestos que actúan sobre el VEGF y señalización del factor de crecimiento de fibroblastos (FGF) mejoró la eficacia y retrasó el inicio de la resistencia en los tumores de la etapa tardía en un modelo genético de carcinogénesis del islote pancreático. Véase, Casanovas, 0., Hicklin, D.J., Bergers, G. & Hanahan, D. Drug resistance by evasión of antiangiogenic targeting of VEGF signaling in late-stage pancreatic islet tumors. Cáncer Cell 8, 299-309 (2005) . Otros investigadores han identificado a los fibroblastos estromales infiltrantes de tumores como una potente fuente de factores proangiogénicos alternativos. Véase, por ejemplo, Dong, J. y col., VEGF-null cells require PDGFR alpha signaling-mediated stromal fibroblast recruitment for tumorigenesis . Embo J 23:2800-10 (2004) y Orimo, A. y col., Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. Cell 121:335-48 (2005) .

[0011] Las células inflamatorias pueden formar parte de la angiogénesis a partir de la secreción de citoquinas inflamatorias, que pueden afectar la activación, proliferación, migración y supervivencia de las células endoteliales (revisado en Albini y col., and Balkwill y col., en Albini, A., Tosetti, F. , Benelli, R. & Noonan, D.M. Tumor inflammatory angiogenesis and its chemoprevention. Cáncer Res 65:10637-41 (2005) y Balkwill, F. , Charles, K.A. & antovani, A. Smoldering and polarized inflammation in the initiation and promotion of malignant disease. Cáncer Cell 7:211-7 (2005) . Diversas células inflamatorias infiltrantes de tumores secretan factores proangiogénicos , incluyendo monocitos/macrófagos (véase, por ejemplo, De Palma, M. y col., Tie2 identifies a hematopoietic lineage of proangiogenic monocytes required for tumor vessel formation and a mesenchymal population of pericyte progenitors . Cáncer Cell 8:211-26 (2005) y Yang, L. y col., Expansión of myeloid inmune suppressor Gr+CDllb+ cells in tumor-bearing host directly promotes tumor angiogenesis. Cáncer Cell 6:409-21 (2004)), linfocitos T y B (véase, por ejemplo, Freeman, M.R. y col., Peripheral blood T lymphocytes and lymphocytes infiltrating human cancers express vascular endothelial growth factor: a potential role for T cells in angiogenesis. Cáncer Res 55:4140-5 (1995)), leucocitos vasculares (véase, por ejemplo, Conej o-Garcia , J.R. y col., Vascular leukocytes contribute to tumor vascularization. Blood 105:679-81 (2005)), células dendriticas (véase, por ejemplo, Conejo-García, J.R. y col., Tumor-infiltrat ing dendritic cell precursors recruited by a beta-defensin contribute to vasculogenesis under the influence of Vegf-A. Nat Med 10:950-8 (2004)), neutrófilos (véase, por ejemplo, Coussens, L.M., Tinkle, C.L., Hanahan, D. & Werb, Z. MMP-9 supplied by bone marrow-derived cells contributes to skin carcinogenesis . CelJ 103:481-90 (2000)) y mastocitos (véase, por ejemplo, Coussens, L.M. y col., Inflammatory mast cells up-regulate angiogenesis during squamous epithelial carcinogenesis. Genes Dev 13:382-97 (1999); y (revisado en de Visser and Coussens en de Visser, K.E., Eichten, A. & Coussens, L.M. Paradoxical roles of the immune system during cáncer development. Wat Rev Cáncer 6:24-37 (2006)) . Se sugirió que las células progenitoras endoteliales derivadas de la médula ósea (CPE) (véase, por ejemplo, Lyden, D. y col., Impaired recruitment of bone-marrow-derived endothelial and hematopoiet ic precursor cells blocks tumor angiogenesis and growth. Na t Med 7, 1194-201 (2001) ) y las células progenitoras perivasculares (véase, por ejemplo, Song, S., Ewald, A.J., Stallcup, ., Werb, Z. & Bergers, G. PDGFRbeta+ perivascular progenitor cells in tumours regúlate pericyte different iat ion and vascular survival. Nat Cell Biol 7:870-9 (2005)) contribuyen a la formación de vasos en algunos modelos experimentales de crecimiento tumoral (revisado en Rafii y col., . en Rafii, S., Lyden, D. , Benezra, R., Hattori, K. & Heissig, B. Vascular and haematopoietic stem cells: novel targets for anti-angiogenesis therapy? Nat Rev Cáncer 2:826-35 (2002) ) . Se demostró que las células hematopoyéticas del linaje mieloide, incluyendo los macrófagos asociados a tumores (TAM) , estimulan la angiogénesis , ya sea directamente, a través de la secreción de factores angiogénicos , o indirectamente, a través de la producción de proteasas ext racelulares que degradan la matriz, que, a su vez, liberan factores angiogénicos secuestrados (revisado en Lewis, CE. & Pollard, J. W . Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments . Cáncer Research 66:605-612 (2006) y Naldini, A. & Carraro, F. Role of inflammatory mediators in angiogénesis . Curr Drug Targets Inflamm Allergy 4:3-8 (2005) ) . Entre los linajes de células mieloides, las células progenitoras CDllb+Grl+ aisladas de los bazos de ratones con tumores promovieron la angiogénesis cuando se las inyectó junto con células tumorales (véase, por ejemplo, Yang, L. y col., Expansión of myeloid immune suppressor Gr+CDllb+ cells in tumor-bearing host directly promotes tumor angiogénesis. Cáncer Cell 6:409-21 (2004)) y las cantidades de macrófagos infiltrantes de tumores se correlacionaron con un mal pronóstico en algunos tumores humanos (revisado en Balkwill y col., en Balkwill, F. , Charles, K.A. & Mantovani, A. Smoldering and polarized inflammation in the initiation and promotion of malignant disease. Cáncer Cell 7:211-7 (2005)) . Sin embargo, en otro estudio, los macrófagos inhibieron el crecimiento de tumores experimentales en ratones, lo cual sugirió su potencial como terapia antineoplásica . Véase, por ejemplo, Kohchi, C. y col., Utilization of macrophages in anticancer therapy: the macrophage network theory. Anticancer Res 2 : 3311-20 (2004) .

[0012] A pesar de la abundancia relativa de células mieloides y de su potencial para producir factores proangiogénicos , todavía se desconoce su rol en la resistencia de tumores al tratamiento anti-VEGF. Es necesario descubrir y comprender las funciones biológicas de las células mieloides, de los tumores resistentes y de los factores que éstos producen. La presente invención trata éstas y otras necesidades, tal como se manifestará al revisar la siguiente divulgación.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

[0013] La invención brinda métodos y composiciones para diagnosticar y tratar tumores resistentes. Además, ofrece métodos para tratar tumores resistentes con tratamiento combinado. Por ejemplo, un método comprende la administración a un sujeto con un tumor resistente de una cantidad eficaz de antagonista de VEGF en combinación con una cantidad eficaz de un segundo agente, que comprende un agente reductor de célula mieloide. El agente reductor de célula mieloide disminuye o elimina completamente las células mieloides, como por ejemplo, las células mieloides CDllb+Grl+. En determinadas formas de realización de la invención, un agente reductor de células mieloides incluye, entre otros, un antagonista de Grl, un antagonista de CDllb, un antagonista de CD18, un inhibidor de elastasa, un antagonista de CP-1, un antagonista de MIP-1 alfa, clodronato, etc. En una forma de realización, el antagonista es un anticuerpo.

[0014] La invención brinda, además, métodos para diagnosticar tumores resistentes y grupos de marcadores para diagnosticar tumores resistentes. En determinadas formas de realización de la invención, un método incluye el diagnóstico de un tumor resistente en un sujeto y el método comprende el suministro de una población celular de prueba proveniente de un tumor del sujeto o de la sangre del sujeto; la medición de la cantidad o el porcentaje de células CDllb+Grl+ en la población celular de prueba; la comparación de la cantidad o el porcentaje de células CDllb+Grl+ en la población celular de prueba con la cantidad o el porcentaje de células CDllb+Grl+ en una población celular de referencia (por ejemplo, una población celular de un tumor sensible a anti-VEGF) ; y la detección de un aumento de la cantidad o el porcentaje de CDllb+Grl+ en la población celular de prueba en comparación con la población celular de referencia, en el que la cantidad o el porcentaje de CDllb+Grl+ indica que el tumor es el tumor resistente.

[0015] En una forma de realización, el método comprende, además, la medición del tamaño del bazo del sujeto y la comparación del tamaño del bazo del sujeto con un tamaño de bazo de referencia (por ejemplo, el tamaño del bazo del sujeto cuando el sujeto no tenia el tumor o cunado el sujeto era sensible al tratamiento con antagonista de VEGF o tamaños de bazos de otras personas sensibles al tratamiento con antagonista de VEGF que estén almacenados en una base de datos) , en el que un mayor tamaño del bazo indica que el tumor es el tumor resistente. En otra forma de realización, el método comprende, además, la medición de la cantidad o el porcentaje de la superficie vascular (VSA) de un tumor en un sujeto después de que se le haya administrado al sujeto un antagonista de VEGF y la comparación de la cantidad o el porcentaje de la superficie vascular en el sujeto con una superficie vascular de referencia (por ejemplo, una superficie vascular de un tumor sensible a anti-VEGF) , en el que un aumento de la cantidad o el porcentaje de la superficie vascular del tumor indica que el tumor es el tumor resistente. En una forma de realización, el antagonista es un anticuerpo.

[0016] En otra forma de realización de la invención, un método incluye el diagnóstico de un tumor resistente en un sujeto y el método comprende lo siguiente: el suministro de una población celular de prueba de un tumor del sujeto; la medición de la cantidad o el porcentaje de células linfoides B CD19 o células dendriticas CDllc en la población celular de prueba; la comparación de la cantidad o el porcentaje de células linfoides B CD19 o células dendriticas CDllc en la población celular de prueba con la cantidad o el porcentaje de células linfoides B CD19 o células dendriticas CDllc en una población celular de referencia; y la detección de una disminución de la cantidad o el porcentaje de células linfoides B CD-19 o células dendriticas CDllc en la población celular de prueba en comparación con una población celular de referencia, en el que la disminución en la cantidad o el porcentaje de células linfoides B CD-19 o células dendriticas CDllc indica que el tumor es el tumor resistente.

[0017] En otra forma de realización, un método incluye el diagnóstico de un tumor resistente en un sujeto y el método comprende lo siguiente: el suministro de una población celular de la médula ósea del sujeto; la medición de la cantidad o el porcentaje de células linfoides T CD90, células linfoides B CD19 o células dendriticas CDllc en la población celular; la comparación de la cantidad o el porcentaje de células linfoides T CD90, células linfoides B CD19 o células dendriticas CDllc en la población celular con la cantidad o el porcentaje de células linfoides T CD90, células linfoides B CD19 células dendriticas CDllc en una población celular de referencia; y la detección de una disminución de la cantidad o el porcentaje de células linfoides T CD90, células linfoides B CD19 o células dendriticas CDllc en la población celular en comparación con la población celular de referencia, en el que la disminución en la cantidad o el porcentaje de células linfoides T CD90, células linfoides B CD19 o células dendriticas CDllc indica que el tumor es el tumor resistente.

[0018] En otra forma de realización de la invención, un método incluye el tratamiento de un tumor resistente de un sujeto con un tratamiento combinado y el método comprende la administración de una cantidad eficaz de antagonista de VEGF en combinación con una cantidad eficaz de un agente reductor de células mieloides y una cantidad eficaz de un tercer agente al sujeto con el tumor resistente, en el que el tercer agente es un agente quimioterapéutico . En una forma de realización, el antagonista es un anticuerpo. En determinadas formas de realización de la invención, un agente reductor de células mieloides incluye, entre otros, un antagonista de Grl, un antagonista de CDllb, un antagonista de CD18, un inhibidor de elastasa, un antagonista de CP-1, un antagonista de MIP-1 alfa, clodronato, etc. En otra forma de realización, el agente quimioterapéutico es 5FU, gemcitabina .

[0019] En una forma de realización de la invención, un método de la invención incluye el suministro de una población celular de prueba de un tumor del sujeto, la medición de la expresión, los niveles o la actividad de una molécula en la población celular de prueba; la comparación de la expresión, los niveles o la actividad de la molécula en la población celular de prueba con la expresión y/o actividad de la molécula en una población celular de referencia; y la detección de una alteración en la expresión y/o actividad de la molécula en la población celular de prueba en comparación con la población celular de referencia (por ejemplo, una población celular de un tumor sensible al tratamiento con anti-VEGF) , en el que la molécula es ácido nucleico que codifica una proteina o la proteina codificada por el ácido nucleico, lo que permite diagnosticar o determinar el tumor resistente en el sujeto. En ciertas formas de realización, la proteina con la expresión y/o actividad alterada incluye, entre otros, IL-13R, TLR-1, Endo-Lip, FGF13, IL-4R, THBS1, Crea7, MSCA, MIP2, IL-8R, G-CSF, IL10-R2, THBSP-4 y JAM-2. La alteración de la expresión y/o actividad puede ser con una o más proteínas, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, doce o más, trece o más, catorce o más o todas las proteínas.

[0020] En ciertas formas de realización de la invención, la expresión de la molécula experimenta una regulación al alza y la proteína incluye, entre otros, IL-13R, TLR-1, Endo-Lip, FGF13, IL-4R, MSCA, MIP2, IL-8R y G-CSF. En ciertas formas de realización de la invención, la expresión de la molécula experimenta una regulación a la baja y la proteína incluye, entre otros, THBS1, Crea7, IL10-R2, THBSP-4 y JAM-2.

[0021] Tal como se mencionó anteriormente, en determinadas formas de realización de la invención, un método incluye el suministro de una población celular de prueba de un tumor del sujeto o de la sangre del sujeto; la medición de la cantidad o el porcentaje de células CDllb+Grl+ en la población celular de prueba; la comparación de la cantidad o el porcentaje de células CDllb+Grl+ en la población celular de prueba con la cantidad o el porcentaje de células CDllb+Grl+ en una población celular de referencia (por ejemplo, una población celular de un tumor sensible a anti-VEGF) ; y la detección de un aumento de la cantidad o el porcentaje de CDllb+Grl+ en la población celular de prueba en comparación con la población celular de referencia, en el que la cantidad o el porcentaje de CDllb+Grl+ indica que el tumor es el tumor resistente. En una forma de realización, el método comprende, además, la detección de una alteración de la expresión o actividad de una molécula en la población celular de prueba en comparación con la población celular de referencia, en el que la molécula es ácido nucleico que codifica una proteina o la proteina, en el que la proteina incluye, entre otros, IL-13R, TLR-1, Endo-Lip, FGF13, IL-4R, THBS1 y Crea7. En ciertas formas de realización, existe una alteración de la expresión y/o actividad de una o más, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más o todas las proteínas.

[0022] La invención brinda además grupos de marcadores para identificar los tumores resistentes. Por ejemplo, un grupo de marcadores incluye dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, doce o más, trece o más, catorce o más o todo el grupo de moléculas. La molécula es un ácido nucleico que codifica una proteína o una proteína con la expresión y/o actividad alterada y se selecciona de entre los siguientes: IL-13R, TLR-1, Endo-Lip, FGF13, IL-4R, THBS1, Crea7, MSCA, MIP2, IL-8R, G-CSF, IL10-R2, THBSP-4 y JAM-2. En una forma de realización, las moléculas se derivan de células CDllb+Grl+ e incluyen, por ejemplo, IL-13R, TLR-1, Endo-Lip, FGF13, IL-4R, THBS1 y Crea7. En otra forma de realización, las moléculas se derivan de tumores resistentes e incluyen, por ejemplo, MSCA, MIP2, IL-8R, G-CSF, IL10-R2, THBSP-4 y JAM-2.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS

[0023] La Fig. la - lf, ilustran que la resistencia de las líneas celulares de tumores singénicos al tratamiento anti- VEGF se correlaciona con su potencial para atraer C MO. (a) Curvas de crecimiento de tumores LLC, EL4 y B16F1 xenotransplantados en C57BL/6, ratones quiméricos con médulas óseas con GFP tratados con el anticuerpo anti-VEGF, G6-23, o un anticuerpo de control (anti-Ragweed) (n = 5) . El tratamiento comenzó el segundo día mediante la administración intraperitoneal (IP) del anticuerpo de control, G6-23, a 10 mg/kg, dos veces por semana. Los datos que se muestran corresponden a la media ± desviaciones estándar de un experimento representativo de tres experimentos independientes. (b) Crecimiento de tumores EL4 en ratones beige sin pelaje (nude) XID (n = 10) tratados con el control (10 y 50 mg/kg, IP, dos veces por semana) o G6-23 (10 y 50 mg/kg, IP, dos veces por semana) . El tratamiento comenzó en día 1 después de la implantación de las células tumorales. El análisis estadístico se evaluó mediante el programa ANOVA, *p = 0,05, **p < 0,005. (c) Crecimiento de tumores LLC (n = 10) en ratones beige sin pelaje (nude) XID, tal como se describe para (b) , tratados con G6-23 (10 y 100 mg/kg) y control (100 mg/kg), IP, dos veces por semana, respectivamente. (d) Análisis FACS de suspensión de células tumorales B16F1, EL4 y LLC tratadas durante 14 días (n = 4) . Se identificó el aumento de la cantidad de CMMO GFP+ en tumores EL4 y LLC tratados con anti-VEGF en relación con los tumores B16F1. (e) Tinción inmunofluorescente de células CD31+ y GFP+ en cortes histológicos de tumores EL4 , LLC y B16F1 tratados durante 14 días con un anticuerpo de control o un anticuerpo anti-VEGF. Se identificó una notable disminución de la cantidad de vasos CD31+ y una menor presencia de células GFP+ en el estroma de tumores B16F1, en comparación con tumores EL4 y LLC. Los datos que se muestran corresponden a una sección representativa por grupo de tres experimentos independientes. (f) Cuantificación de la superficie vascular (VSA) en xenotransplantes de tumor tratados durante 14 días. Los tumores B16F1 tratados con anti-VEGF muestran disminuciones más pronunciadas de la superficie vascular que los tumores LLC o EL4. Los datos que se muestran corresponden la media ± error estándar de la media de 9 a 15 cortes histológicos de 3 a 5 tumores por grupo de tratamiento.

[0024] La Fig. 2a - 2d, ilustran los experimentos de tumores añadidos y mezclados y las curvas de crecimiento de los tumores B16F1 que se añadieron y mezclaron con GFP+ aisladas de la médula ósea y los tumores de los ratones quiméricos con GFP . (a) Crecimiento de las células tumorales B16F1 de 2,5 x 106 cuando se añadieron y mezclaron con CMMO 106 aisladas de ratones con tumores EL4 , LLC o B16F1 y tratados con el anticuerpo de control. Como control, se muestran las CMMO de ratones implantados con matrigel o ratones de control . (n = 5) (b) Curvas de crecimiento tumoral de los tumores B16F1 que se añadieron y mezclaron con CMMO GFP+ aisladas de ratones con tumores EL4 , LLC o B16F1 y tratados con el anticuerpo anti-VEGF. Las células de médula ósea con GFP+ derivadas de los tumores EL4 y LLC aumentaron significativamente el crecimiento de los tumores B16F1 sensibles al anti-VEGF (n = 4) . Los datos que se muestran en (a) y (b) corresponden a un experimento representativo de al menos dos experimentos independientes. (c y d) Crecimiento de los tumores B16F1 de 2xl06 cuando se añadieron y mezclaron con células GFP positivas de 5xl05 aisladas de los tumores EL4 , LLC o B16F1 de 14 días de desarrollo tratados con el anticuerpo de control (c) o con anti-VEGF, G6-23 (d) .

[0025] La Fig. 3a - 3f, ilustran el análisis de frecuencia de células CDllb y Grl en experimentos in vitro de migración celular, tumores y médula ósea in vivo y su papel funcional en la mediación de la resistencia al anti-VEGF. Las células CDllb+Grl+ aisladas de los ratones con tumores EL4 y LLC constituyen una población principal de células MO que median la resistencia al tratamiento anti-VEGF. (a) Cantidad de células CDllb+Grl+ positivas migratorias de C MO recién aisladas tras la exposición a medios condicionados de tumores EL4, LLC o B16F1 tratados con el control o anti-VEGF. Ambos tumores resistentes al anti-VEGF (EL4, LLC) inducen la migración independiente de VEGF. (b) Análisis multilinaje de aislados de tumores de ratones implantados con tumores EL4, LLC y B16F1 y tratados con el control o anti-VEGF. Los tumores EL4 y LLC muestran un aumento significativo de células CDllb+Grl+, pero no asi los tumores B16F1. Los datos que se muestran corresponden a un experimento representativo de dos experimentos independientes. (c) Análisis multilinaje de aislados de tumores y médula ósea de ratones implantados con tumores EL4, LLC y B16F1. A diferencia de los aislados de tumores (Fig. 3b), no se detectó un aumento constante de células CDllb+ o Grl+ en la médula ósea de ratones con tumores. Los datos que se muestran corresponden a un experimento representativo de dos experimentos independientes. (d) Curvas de crecimiento de tumores B16F1 que se añadieron y mezclaron con células CDllb+Grl+ derivadas de médula ósea con tumores cebados con EL4 y LLC y tratados con anti-VEGF (G6-23, n = 5 por grupo) . Las células CDllb+Grl+ son necesarias y suficientes para mediar la resistencia, ya que las CMMO con menor cantidad de células CDllb+Grl+ mostraron un potencial reducido para mediar la resistencia. Los datos que se muestran corresponden a un experimento representativo de dos experimentos independientes. (e y f) Curva de crecimiento de células B16F1 que se añadieron y mezclaron con células CDllb+Grl+ relacionadas con tumores aisladas de ratones con tumores EL4 (e) y LLC (f ) . En el análisis FACS de 3xl05 se separaron células CDllb+Grl+ aisladas de ratones con tumores EL4 o LLC, se añadieron y mezclaron con células B16F1 de 3xl06 y se implantaron en ratones C57BL/6 (n=5), aproximadamente.

[0026] La Fig. 4a - 4d, ilustran el análisis de expresión génica de las células de médula ósea y aislados de tumores, (a) Análisis de conglomerados no supervisado de los datos de expresión génica de células CDllb+Grl+ aisladas de la médula ósea de ratones implantados con tumores EL4 (ER1-3) resistentes al anti-VEGF, tumores LLC (LR1-3) o tumores B16F1 (BR1-3) sensibles al anti-VEGF tratados con anti-VEGF. Para un enfoque de conglomerado jerárquico, los datos se normalizaron para controlar los ratones implantados con matrigel. Se muestran genes regulados a la baja, sin modificaciones y regulados al alza. Se puede identificar un conjunto característico de cambios inducido por tumores resistentes al anti-VEGF que es diferente al inducido por tumores sensibles al anti-VEGF. (b) Presentación de genes que pueden verse involucrados en la regulación de la angiogénesis o diferenciación y migración de células mieloides con cambios significativos (p= 0,05, > 2 veces) en los niveles de expresión en células CDllb+Grl+ de la médula ósea entre tumores resistentes y sensibles al anti-VEGF tratados con anti-VEGF durante 17 días. (c) Análisis de conglomerados no supervisado de los datos de expresión génica generados a partir del ARN aislado de tumores EL4 , LLC y B16F1 después del tratamiento con G6-23 durante 17 días. (d) Presentación de genes que pueden verse involucrados en la regulación de la angiogénesis y/o diferenciación y migración de células mieloides con cambios significativos en los niveles de expresión (p = 0,05, cambio >2 veces) en tumores resistentes al anti-VEGF (EL4=ERl-3, LLC=LRl-3) con respecto a los tumores B16F1 (BR1-3) después del tratamiento con G6-23 durante 17 días.

[0027] La Fig. 5a-5f, ilustran los efectos de la combinación de anti-VEGF con un anticuerpo que actúa sobre las células mieloides Grl+ (anti-Grl) en el crecimiento de los tumores EL4 y LLC. (a) Curvas de crecimiento de tumores EL4 tratados con anti-VEGF, (n = 5) o anti-Grl (n = 4) , ya sea solos o en combinación (anti-VEGF + anti-Grl; conjunto) . La cantidad de animales en estos grupos es de entre 3 y 4. (b) Cuant ificación de la superficie vascular (VSA) mediante IHC, frecuencia de células Grl+ en la periferia y células tumorales y endoteliales CD31+ (EC) mediante FACS y pesos de los tumores terminales de tumores EL4 tratados durante 17 días como se describe en (a) . A diferencia de la disminución casi completa de las células Grl circulatorias, se descubrió una reducción de entre 2 y 3 veces en los tumores de ratones tratados con anti-Grl. Se identificó una diferencia estadísticamente significativa en el peso de tumores terminales entre los tumores EL4 con anti-VEGF, solos o en combinación con un anti-Grl MAb. Los datos corresponden a la media ± SEM de un experimento representativo de al menos dos experimentos independientes. (c) Curvas de crecimiento de tumores LLC tratados con anti-VEGF (n = 5) o anti-Grl (n = 4), ya sea solos o en combinación (n=4) . (d) Cuantificación de la superficie vascular (VSA) mediante IHC, frecuencia de células Grl+ en la periferia, células endoteliales Grl+ y CD31+ (EC) en tumores mediante FACS y pesos tumorales en los animales tratados. Se descubrió una diferencia estadísticamente significativa en los volúmenes tumorales y la VSA entre los tumores LLC tratados con anti-VEGF, solos o en combinación con anti-Grl (c) . Los datos corresponden a la media ± SEM de un experimento representativo de al menos dos experimentos independientes. (e y f) El inhibidor de elastasa en combinación con el tratamiento anti-VEGF retrasa la resistencia tumoral de los tumores EL4 (e) y LLC (f ) . Los volúmenes tumorales en el tratamiento combinado fueron significativamente menores en comparación con la cohorte anti-VEGF. Los datos que se muestran en la Fig. 5 corresponden a la media ± desviaciones estándar de un experimento representativo de al menos dos experimentos independientes. El análisis estadístico se evaluó mediante ANOVA* , indica p < 0,05, ** indica p<0,01.

[0028] La Fig. 6a - 6b, ilustran la estrategia experimental que se utiliza para investigar el papel de las CMMO en los tumores resistentes al tratamiento anti-VEGF y el aislamiento de las células GFP+ del tumor o la médula ósea de los animales experimentales. El Panel a ilustra esquemáticamente la estrategia experimental para investigar el papel de las CMMO en los tumores resistentes al tratamiento anti-VEGF. Para controlar la cinética de atracción de las CMMO en los estudios de xenotransplantes, las CMMO GFP+ se inyectaron por vía intravenosa a ratones C57B1/6 irradiados mortalmente (al.) . A continuación, los ratones quiméricos se cebaron mediante la implantación de tumores sensibles (B16F1) y resistentes (EL4 y LLC) en matrigel (all.) . Se aislaron las células GFP+ tanto de la médula ósea (allí.) como de los tumores (alV. ) de los ratones quiméricos, se añadieron y mezclaron con células B16F1 y se las inyectó (SC) a los ratones C57BL/6. Los animales con tumores implantados se trataron con anticuerpos anti-VEGF o de control (aV.) para determinar el papel de las CM O en la mediación de la resistencia de los tumores al tratamiento anti-VEGF. El Panel b ilustra el aislamiento de las células GFP+ de los tumores y la médula ósea de ratones implantados. Mediante la separación FACS, se aislaron las células GFP+ de los tumores y la médula ósea de ratones implantados (paso all. de la estrategia) (bl.) . Se utilizó el análisis post separación (bll.) para determinar la pureza de las células GFP+ aisladas de los tumores o la médula ósea de los animales experimentales .

[0029] La Fig. 7 ilustra la purificación de CDllbGrl de la médula ósea de ratones implantados con tumores EL4 y LLC. Las CMMO se aislaron de los ratones C57BL/6 implantados con células EL4 o LLC. Las CMMO se incubaron con partículas conjugadas anti-CDllb y se pasaron por columnas magnéticas de gran escala para aislar la fracción de CDllb+ y CDllb-. Las células de cada fracción y una alícuota de células sin separar se tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromo de CDllb y Grl para determinar la pureza de las células.

[0030] La Fig. 8 ilustra el perfil de elusión de los lisados del tumor linfoma de un ratón resistentes al tratamiento anti-VEGF que se trataron con anticuerpos anti-VEGF (G6-31) y se cargaron en una columna HiTrap HS. La columna se eluyó de manera gradual con una concentración elevada de sal.

[0031] La Fig. 9 ilustra un cambio en el tamaño del tumor EL4 en los ratones después de 72 horas de haber recibido una dosis de 1) liposoma/ragweed con PBS, 2) liposoma/G6-31 con PBS; 3) liposomas con clodronato/G6-23 , 4) liposomas con clodronato/G6-31 ó 5) liposomas con clodronato/PBS en la vena de la cola.

[0032] La Fig. 10 ilustra una disminución de la expresión del ARNm del VEGF en los ratones con tumores resistentes al tratamiento anti-VEGF cuando se les administró a los ratones liposomas con clodronato en combinación con anti-VEGF (G6-23) .

[0033] La Fig. 11 ilustra una disminución en los niveles de KC en ratones con tumores resistentes al tratamiento anti-VEGF tratados con liposomas con clodronato y anti-VEGF (G6-23) .

[0034] La Fig. 12a -12b, ilustran que tanto ???-lalfa (Panel A) como MCP-1 (Panel B) se expresan en líneas de células tumorales resistentes al tratamiento anti-VEGF, en las que Dil(+) son células endoteliales , CD3(+) representa las células linfoides y F4/80(+) son macrófagos.

[0035] La Fig. 13a - 13b, ilustran que MIP-1 alfa y MCP-1 tienen actividad angiogénica en un ensayo de proliferación angiogénica y formación del lumen capilar. El Panel A ilustra los controles de las células endoteliales, en los que las partículas se trataron con VEGF y D551 durante 10 días. El Panel B ilustra las células endoteliales tratadas con D551 (control negativo) (parte superior izquierda) , VEGF (control negativo) (parte superior derecha), 1,25 g/ml de MCP-1 y D551 (parte inferior izquierda) y 1,25 µg/ l deb ???-lalfa y D551 (parte inferior derecha) .

[0036] La Figura 14a - 14c ilustran el análisis de linaje de las CMMO de ratones con tumores (B16F1 (a), EL4 (b) y LL2 (c) ) en los días 7 (pl) y 14 (p2) del tratamiento con el control o anticuerpo anti-VEGF, G6-23. Los enganches representan células separadas por CDllb. El tratamiento anti-VEGF aumentó los niveles de células CDllb+ y Grl+, pero no así los otros tipos de células analizados. Los tipos de células que aumentaron entre los días 7 y 14 fueron las células CXCR4+, CDllb+, CD31+ y CDllb+, CD31+. En cambio, se descubrió una disminución de células CD19+ (linfocitos B) y CD90+ (linfocitos T) en los tumores LL2 y EL4 entre los días 7 y 14, pero no asi en los tumores B16F1.

[0037] La Figura 15a -15b ilustran un análisis de multilinaje de células GFP+ en el tumor y las células MO en ratones con tumores resistentes y sensibles. Se implantaron tumores TIB6, B16F1, EL4 y LLC en ratones C57B1/6 y se trataron con anticuerpos anti-VEGF o de control, tal como se describió. Se recogieron las CMMO y los aislados de tumores de cada ratón y se tiñeron con anticuerpos contra CD19 (linfocitos B) , CD90 (linfocitos T) , CDllc (dendriticas ) y también receptores de VEGF (Rl y R2) . Los gráficos representan la frecuencia de cada subconjunto en los tumores (a) y compartimentos de la médula ósea (b) .

[0038] Figura 16a -16b. El bazo es un punto alternativo de migración para las células CDllb+Grl+ en ratones con tumores resistentes. Se implantaron tumores TIB6, B16F1, EL4 y LLC en ratones quiméricos C57B1/6-GFP y se trataron con anticuerpos anti-VEGF o de control durante 17 días, tal como se describió. (a) El análisis de animales con tumores reveló un aumento significativo (p = 0,05) del tamaño de los bazos en ratones con tumores resistentes. (b) Se recogieron esplenocitos de cada ratón mediante una disrupcion mecánica y se trataron con un tampón de lisis para eliminar los glóbulos rojos. A continuación, se tiñeron las células de los bazos con anticuerpos anti-CDllb y anti-Grl y se analizaron en una máquina FACS para investigar la frecuencia de células CDllb+Grl+. Los datos que se analizaron indicaron un aumento significativo (p = 0,05) en la frecuencia de células CDllb+Grl+ en el bazo de los ratones con tumores resistentes, en comparación con los tumores sensibles. * Indica una diferencia significativa (p = 0,05) en ratones con tumores EL4 tratados con anti-VEGF, en comparación con los animales correspondients tratados con B16F1 y TIB6. + Indica una diferencia significativa (p = 0,05) en ratones con tumores LLC tratados con anti-VEGF, en comparación con los animales tratados con B16F1 y TIB6.

[0039] La Figura 17a - 17b ilustra que (a) sólo las células mieloides aisladas de ratones cebados con tumores resistentes son capaces de mediar la resistencia a anti-VEGF. Los gráficos representan curvas de crecimiento de tumores B16F1 que se añadieron y mezclaron con células CDllb+Grl+ derivadas de médula ósea cebadas con B16F1 o matrigel y se trataron con anti-VEGF (n = 5 por grupo) . El volumen tumoral se midió durante 21 días, tal como se describió anteriormente. (b) La inducción de angiogénesis es uno de los mecanismos que utilizan las células CDllb+Grl+ para desarrollar la resistencia al tratamiento anti-VEGF. La VSA se analizó en ratones que presentaban una mezcla de células B16F1 y CDllb+Grl+ o CDllb-Grl-. *Indica una diferencia significativa (p = 0,05) cuando se compara la mezcla de células B16F1 y CDllb+Grl+ de ratones cebados con EL4 o LLC para añadir y mezclar B16F1 con células CDllb-Grl- aisladas de los mismos animales cebados.

[0040] La Figura 18a -18f ilustran que distintos mecanismos rigen la resistencia al anti-VEGF y los agentes quimioterapéuticos . Se implantaron tumores EL4 (a), LLC (b) , TIB6 (c) y B16F1 (d) en ratones C57BL/6 (n=5) y se trataron con anticuerpos anti-VEGF, anticuerpos de control, gemcitabina y 5FU, tal como se describió. El volumen tumoral se midió dos veces por semana y todos los ratones se analizaron el día 17. * Indica una diferencia significativa cuando se comparan los ratones tratados con anti-VEGF y los animales tratados con 5FU o gemcitabina. (e) Las células MO de cada ratón se aislaron y tiñeron con anticuerpos conjugados con fluorocromo CDllb y Grl. El gráfico representa la cantidad de células MO CDllb+Grl+ en cada tratamiento, (f) Se recogió el aislado de tumor de cada ratón después de 17 días y se tiñó con los mismos anticuerpos para observar la frecuencia y la cantidad de células CDllb+Grl+ en cada tumor. Las barras representan la media ± SEM. * Indica una diferencia significativa (p = 0,05) en ratones con tumores EL4 tratados con anti-VEGF, en comparación con los animales correspondients tratados con B16F1 y TIB6. + Indica una diferencia significativa (p = 0,05) en ratones con tumores LLC tratados con anti-VEGF, en comparación con animales correspondientes tratados con los B16F1 y TIB6.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Definiciones

[0041] Antes de describir detalladamente la presente invención, debe entenderse que esta invención no se limita a composiciones o sistemas biológicos particulares, los cuales pueden variar, obviamente. También debe tenerse en cuenta que la terminología que se utiliza en la presente memoria descriptiva tiene como finalidad describir únicamente las formas de realización particulares y no pretende ser restrictiva. Tal como se utilizan en esta memoria detallada y en las reivindicaciones que se incluyen a continuación, las formas singulares "un", "una", "el" y "la" incluyen el plural, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por lo tanto, la referencia a "una molécula", por ejemplo, incluye opcionalmente una combinación de dos o más moléculas y asi sucesivamente.

[0042] Los términos "VEFG" y "VEGF-A" se emplean indistintamente para referirse al factor de crecimiento endotelial vascular de 165 aminoácidos y a los factores relacionados de crecimiento endotelial vascular de 121, 145, 183, 189 y 206 aminoácidos, tal como se describe en Leung y col. Science, 246:1306 (1989), Houck y col. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991) y Robinson & Stringer, Journal of Cell Science, 144 (5) : 853-865 (2001), junto con las formas alélicas y procesadas de los mismos que se producen naturalmente. El VEGF-A forma parte de una familia de genes que comprende VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F y el P1GF. El VEGF-A se une principalmente a dos receptores de tirosina quinasa de gran afinidad, el VEGFR-1 (Flt-1) y el VEGFR-2 (Flk-l/KDR), y este último es el transmisor más importante de señales mitogénicas de células endoteliales vasculares del VEGF-A. El término "VEGF" o "VEGF-A" también hace referencia al VEGF proveniente de especies no humanas, como por ejemplo, ratones, ratas o primates. Algunas veces, el VEGF proveniente de especies especificas se indica con términos tales como hVEGF, en el caso del VEGF humano, o mVEGF, en el caso del VEGF murino. El término "VEGF" también se emplea para referirse a formas o fragmentos truncados del polipéptido que comprende los aminoácidos 8 a 109 o l a 109 del factor de crecimiento endotelial vascular humano de 165 aminoácidos. La referencia a cualquiera de dichas formas del VEGF puede identificarse en la presente solicitud mediante, por ejemplo, "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" o "VEGFiss". Las posiciones de los aminoácidos del VEGF nativo "truncado" se numeran tal como se indica en la secuencia del VEGF nativo. Por ejemplo, la posición 17 del aminoácido (metionina) en el VEGF nativo truncado equivale la posición 17 (metionina) en el VEFG nativo. El VEGF nativo truncado posee afinidad de unión con los receptores KDR y Flt-1 comparable a la del VEFG nativo .

[0043] La frase "antagonista de VEGF" hace referencia a una molécula (peptidil o no peptidil) capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir en las actividades del VEGF, incluyendo su unión a uno o más receptores de VEGF. Los antagonistas del VEGF incluyen anticuerpos anti-VEGF y fragmentos de unión al antigeno de éstos, moléculas receptoras y derivadas que se unen específicamente al VEGF, que impiden así su unión a uno o más receptores (por ejemplo, las proteínas de los receptores solubles del VEGF, los fragmentos de unión al VEGF de éstas o las proteínas de los receptores quiméricos del VEGF) , anticuerpos receptores anti-VEGF y antagonistas receptores del VEGF, como por ejemplo, inhibidores de moléculas pequeñas de las tirosinas quinasas del VEGFR y proteínas de fusión, como por ejemplo, VEGF-Trap (Regeneron) , VEGFi2i-gelonina (Peregine). Los antagonistas de VEGF también incluyen variantes antagonistas de VEGF, moléculas antisentido dirigidas al VEGF, aptámeros de ARN y ribozimas contra el VEGF o los receptores del VEGF. Los antagonistas del VEGF que son de utilidad para los métodos de la invención también incluyen compuestos peptidil o no peptidil que unen específicamente el VEGF, como por ejemplo, los anticuerpos anti-VEGF y los fragmentos de unión al antígeno del mismo, polipéptidos o fragmentos de éstos que se unen específicamente al VEGF; oligómeros antisentido de nucleobase que complementan como mínimo a un fragmento de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido del VEGF; pequeños ARN que complementan como mínimo un fragmento de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido del VEGF; ribozimas que actúan sobre el VEGF; enlaces peptídicos al VEGF; y aptámeros del VEGF. En una forma de realización, el antagonista de VEGF reduce o inhibe el nivel de expresión o la actividad biológica del VEGF en al menos un 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más. En otra forma de realización, el VEGF inhibido por el antagonista de VEGF es el VEGF (8-109), VEGF (1-109) o VEGFi65.

[0044] El término "anticuerpo anti-VEGF" o "anticuerpo que se une al VEGF" hace referencia a un anticupero capaz de unirse al VEGF, con suficiente afinidad y especificidad para que dicho anticuerpo sea útil como agente diagnóstico y/o terapéutico para actuar sobre el VEGF. Por ejemplo, el anticuerpo anti-VEGF de la invención puede utilizarse como agente terapéutico para actuar sobre enfermedades o dolencias que involucran la actividad del VEGF o para interferir en ellas. Véase, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 6.582.959, 6.703.020; 098/45332; WO 96/30046; O94/10202, WO2005/044853; EP 0666868B1; Solicitudes de Patentes de Estados Unidos 20030206899, 20030190317, 20030203409, 20050112126, 20050186208 y 20050112126; Popkov y col., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004) y WO2005012359. El anticuerpo seleccionado generalmente poseerá una afinidad de unión lo suficientemente fuerte para el VEGF. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse al hVEGF con un valor Kd de entre 100 nM-1 pM. Las afinidades de los anticuerpos pueden determinarse mediante un ensayo de resonancia de plasmón de superficie (como el ensayo BIAcore descrito en la Publicación de Solicitud de PCT N° WO2005/012359 ) , un ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) y ensayos de competición (por ejemplo, RIA) . El anticuerpo puede someterse a otros ensayos de actividad biológica, como por ejemplo, para evaluar su efectividad como terapéutico. Dichos ensayos son conocidos en la materia y dependen del antigeno diana y del uso que se le pretenda dar al anticuerpo. Algunos ejemplos incluyen ensayos de inhibición de células HUVEC, ensayos de inhibición del crecimiento de células tumorales (tal como se describe en el documento WO 89/06692, por ejemplo), ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) y citotoxicidad mediada por complementos (CDC) (Patente de Estados Unidos N° 5.500.362) y ensayos de hematopoyesis o actividad agonística (véase el documento WO 95/27062) . En general, un anticuerpo anti-VEGF no se unirá a otros homólogos de VEGF, tales como VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D o VEGF-E, ni a otros factores de crecimiento tales como P1GF, PDGF o bFGF. En una forma de realización, los anticuerpos anti-VEGF comprenden un anticuerpo monoclonal que se une al mismo epítopo que el anticuerpo monoclonal anti-VEGF A4.6.1 producido por el hibridoma ATCC HB 10709, un anticuerpo monoclonal recombinante humanizado anti-VEGF generado según Presta y col. (1997) Cáncer Res. 57:4593-4599, incluyendo, entre otros, el anticuerpo conocido como "bevacizumab (BV)", también conocido como "rhuMAb VEGF" o "AVASTIN®". El bevacizumab comprende regiones estructurales de IgGl humana mutada y regiones determinantes de la complementariedad de unión al antigeno procedentes del anticuerpo monoclonal murino anti-hVEGF A.4.6.1 que bloquea la unión del VEGF humano a sus receptores. Aproximadamente el 93% de la secuencia de aminoácidos del bevacizumab, incluyendo la mayoría de las regiones estructurales, deriva de la IgGl humana y aproximadamente el 7% de la secuencia deriva del anticuerpo murino A4.6.1. El Bevacizumab tiene una masa molecular de aprox. 149.000 daltons y es glicosilado. El Bevacizumab y otros anticuerpos humanizados anti-VEGF se describen más detalladamente en la Patente de Estados Unidos N° 6.884.879 concedida el 26 de febrero de 2005. Otros anticuerpos de preferencia incluyen los anticuerpos de la serie G6 o B20 (por ejemplo, G6-23, G6-31, B20-4.1), tal como se describe en la Publicación de Solicitud PCT N° WO2005/012359. Para obtener información sobre otros anticuerpos de preferencia, véanse las Patentes de Estados Unidos N° 7.060.269, 6.582.959, 6.703.020; 6.054.297; los documentos 098/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; Publicaciones de Solicitudes de Patentes N° 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409 y 20050112126, y Popkov y col., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004).

[0045] Un "anticuerpo de la serie G6", de acuerdo con la presente invención, es un anticuerpo anti-VEGF derivado de una secuencia de un anticuerpo G6 o de un anticuerpo derivado de G6 de acuerdo con cualquiera de las Figuras 7, 24-26 y 34-35 de la Publicación de Solicitud PCT N° O2005/012359.

[0046] Una "célula progenitora/madre hematopoyética" o "célula hematopoyética primitiva" es aquella célula capaz de diferenciarse para formar un tipo de células sanguíneas más compromoetidas o maduras. Los "linajes de células sanguíneas linfoides" son aquellas células precursoras hematopoyéticas capaces de diferenciarse para formar linfocitos (células B o T) . De la misma manera, la "linfopoyesis" es la formación de linfocitos. Los "linajes de células sanguíneas eritroides" son aquellas células precursoras hematopoyéticas capaces de diferenciarse para formar eritrocitos (glóbulos rojos) y la "eritropoyesis" es la formación de eritrocitos.

[0047] A los efectos de la presente memoria descriptiva, la frase "linajes de células sanguíneas mieloides" comprende todas las células progenitoras hematopoyéticas que no sean los linajes de células sanguíneas linfoides o eritroides que se definieron anteriormente. Por su parte, la "mielopoyesis" es la formación de células sanguíneas (que no sean linfocitos ni eritrocitos) .

[0048] Una población de células mieoloides puede ser rica en inmunocitos mieloides que sean Grl+/CDllb+ (o CDllb+Grl+) o Grl+/Mac-1+. Dichas células expresan un marcador de células mieloides del linaje de los macrófagos, CDllb, y un marcador de granulocitos , Grl. Una célula Grl+/CDllb+ puede seleccionarse mediante detección de inmunoadherencia , por ejemplo, con un anticuerpo de Grl+.

[0049] Un "agente reductor de células mieloides" o "agente de reducción de células mieloides" es un agente que disminuye o elimina la población de células mieloides. Generalmente, el agente reductor de células mieloides disminuirá o eliminará las células mieloides, CDllb+Grl+, monocitos, macrófagos, etc. Algunos ejemplos de agentes reductores de células mieloides incluyen, entre otros, un antagonista de Grl+, un antagonista de CDllb, un antagonista de CD18, un inhibidor de elastasa, un antagonista de MCP-1, un antagonista de ???-lalfa, etc.

[0050] En la presente memoria descriptiva, el término "antagonista de Grl" hace referencia a una molécula que se une a Grl y que inhibe o disminuye considerablemente la actividad biológica de Grl. Algunos ejemplos, entre otros, de los antagonistas de Grl incluyen anticuerpos, proteínas, péptidos, glicoproteínas, glicopépt idos , glicolípidos , polisacáridos , oligosacáridos , ácidos nucleicos, moléculas bioorgánicas , peptidomiméticos , agentes farmacológicos y sus metabolitos, secuencias de control transcripcional y de traducción y otros similares. En una forma de realización de la invención, el antagonista de Grl es un anticuerpo, especialmente un anticuerpo anti-Grl que se une a Grl humana.

[0051] .En la presente memoria descriptiva, el término "antagonista de CDllb" hace referencia a una molécula que se une a CDllb y que inhibe o disminuye considerablemente la actividad biológica de CDllb. Generalmente, el antagonista bloqueará (parcial o completamente) la capacidad de una célula (por ejemplo, una célula mieloide inmadura) que exprese la subunidad CDllb en su superficie celular de unirse al endotelio. Algunos ejemplos, entre otros, de los antagonistas de CDllb incluyen anticuerpos, proteínas, péptidos, glicoproteínas, glicopéptidos , glicolípidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, moléculas bioorgánicas , peptidomiméticos , agentes farmacológicos y sus metabolitos, secuencias de control transcripcional y de traducción y otros similares. En una forma de realización de la invención, el antagonista de CDllb es un anticuerpo, especialmente un anticuerpo anti-CDllb que se une a CDllb humana. Los ejemplos de anticuerpos de CDllb incluyen MY904 (Patente de Estados Unidos N° 4.840.793), lB6c (véase Zhang y col., Brain Research 698:79-85 (1995)), CBRN1/5 y CBRM1/19 (WO94/08620) .

[0052] En la presente memoria descriptiva, el término "antagonista de CD18" hace referencia a una molécula que se une a CD18 (preferentemente CD18 humana) y que inhibe o disminuye considerablemente la actividad biológica de CD18. Generalmente, el antagonista bloqueará (parcial o completamente) la capacidad de una célula (por ejemplo, un neutrófilo) que exprese la subunidad CD18 en su superficie celular de unirse al endotelio. Algunos ejemplos, entre otros, de los antagonistas de CD18 incluyen anticuerpos, proteínas, péptidos, glicoproteínas , glicopéptidos , glicolípidos , polisacáridos , oligosacáridos , ácidos nucleicos, moléculas bioorgánicas, peptidomiméticos, agentes farmacológicos y sus metabolitos, secuencias de control transcripcional y de traducción y otros similares. En una forma de realización de la invención, el antagonista de CD18 es un anticuerpo.

[0053] Algunos ejemplos de anticuerpos anti-CD18 incluyen el MHM23 (Hildreth y col., Eur . J. Immunol . 13:202-208 (1983)), Ml8/2(IgG2a; Sanches-Madrid y col., J. Exp. Med.158 : 586-602 (1983)), H52 (depostitado con la American Type Culture Collection (ATCC) con el número HB 10160), Masl91c y 10T18 (Vermot Desroches y col., Scand. J. Immunol. 33:277-286 (1991)), y NA-8 (WO 94/12214). En una forma de realización, el anticuerpo es aquel que se une al epitopo de CD18, al que se une MHM23 o H52. En una forma de realización de la invención, el anticuerpo posee alta afinidad para el polipéptido de CD18. En determinadas formas de realización, el anticuerpo puede unirse a una región en el dominio extracelular de CD18 que se asocie con CDllb y también puede disociar cadenas a y P (por ejemplo, el anticuerpo puede disociar el complejo de CDllb y CD18, como es el caso del anticuerpo MHM23) .

[0054] La proteina quimiotáctica de monocitos (MCP-1) es una quimioquina que interviene en la inmunidad innata, en la respuesta del efector Th2 y en la diferenciación de células CD4+ T. Véase, por ejemplo, Paul, W. E., Fundamental Immunology, 5 Edition, Lippincott Williams & Wilkins, (Philadelphia, 2003), páginas 801-840.

[0055] En la presente memoria descriptiva, el término "antagonista de MCP-1" hace referencia a una molécula que se une a MCP-1 y que inhibe o disminuye considerablemente la actividad biológica de MCP-1. Algunos ejemplos, entre otros, de antagonistas de MCP-1 incluyen anticuerpos, proteínas, péptidos, glicoproteínas , glicopéptidos , glicolípidos , polisacáridos , oligosacáridos , ácidos nucleicos, moléculas bioorgánicas , peptidomiméticos , agentes farmacológicos y sus metabolitos, secuencias de control transcripcional y de traducción y otros similares. En una forma de realización de la invención, el antagonista de MCP-1 es un anticuerpo, especialmente un anticuerpo anti-MCP-1 que se une a MCP-1 humana.

[0056] Las proteínas inflamatorias alfa y beta de los macrófagos (MIP-1 alfa y MIP-1 beta) son quimioquinas conocidas. La MIP-1 alfa interviene en la inmunidad innata, en la respuesta del efector Thl y en la diferenciación de células CD4+ T. Véase, por ejemplo, Paul, W. E., Fundamental Immunology, 5th Edition, Lippincott Williams & Wilkins, (Philadelphia, 2003), páginas 801-840.

[0057] En la presente memoria descriptiva, el término "antagonista de MIP-1 alfa" hace referencia a una molécula que se une a MICP-1 alfa y que inhibe o disminuye considerablemente la actividad biológica de MIP-1 alfa. Algunos ejemplos, entre otros, de antagonistas de MCP-1 alfa incluyen anticuerpos, proteínas, péptidos, glicoproteínas , glicopéptidos , glicolípidos , polisacáridos , oligosacáridos , ácidos nucleicos, moléculas bioorgánicas , pept idomimét icos , agentes farmacológicos y sus metabolitos, secuencias de control transcripcional y de traducción y otros similares. En una forma de realización de la invención, el antagonista de MIP-1 es un anticuerpo, especialmente un anticuerpo anti-MIP-1 alfa que se une a MIP-1 alfa humana.

[0058] En la presente memoria descriptiva, el término "antagonista" hace referencia a una molécula capaz de neutralizar, bloquear, inhibir, anular, reducir o interferir en las actividades de una proteína de la invención, incluyendo su unión a uno o más receptores, en el caso de un ligando, o su unión a uno o más ligandos, en el caso de un receptor. Algunos ejemplos de antagonistas y de fragmentos de unión a antígeno de éstos incluyen anticuerpos, proteínas, péptidos, glicoproteínas, glicopéptidos, glicolípidos, polisacáridos, oligosacáridos, ácidos nucleicos, moléculas bioorgánicas , peptidomiméticos , agentes farmacológicos y sus metabolitos, secuencias de control transcripcional y de traducción y otros similares. Los antagonistas también incluyen inhibidores de moléculas pequeñas de una proteina de la invención y proteínas de fusión, moléculas receptoras y derivadas que se unen específicamente a la proteína, lo que impide su unión al elemento diana, las variantes de los antagonistas de la proteína, las moléculas antisentido dirigidas a la proteína de la invención, los. aptámeros de ARN y las ribozimas en contra de un proteína de la invención.

[0059] Un anticuerpo "de bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce la actividad biológica del antígeno al que se une. Algunos anticuerpos de bloqueo o anticuerpos antagonistas inhiben sustancial o completamente la actividad biológica del antígeno.

[0060] El término "URCGP" hace referencia a las proteínas que experimentan una regulación al alza en las células CDllb+Grl+ provenientes de tumores resistentes a anti-VEGF. Las URCGP comprenden, entre otras, la elastasa leucocitaria , CD14, expi, I1-13R, LDLR, TLR-1 , RLF, Endo-Lip, SOCS13, FGF13, IL-4R, IL-11R, IL-1RII, IFN TM1, TNFRSF18, WNT5A, membrana transportadora secretora 1, HSP86, EGFR, EphRB2, GPCR25, HGF, Angiopoyet ina-símil 6, Eph-RA7, Semaforina Vlb, Neurotrofina 5, Claudin-18, MDC15, ECM y ADAMTS7B. En una determinada forma de realización, URCGP hace referencia a IL-13R, TLR-1, Endo-Lip, FGF13 y/o IL-4R.

[0061] El término "DRCGP" hace referencia a las proteínas que experimentan una regulación a la baja en las células CDllb+Grl+ provenientes de tumores resistentes a anti-VEGF. Las DRCGP comprenden, entre otras, THBS1, Crea7, Acuaporina-1, proteína transportadora de solutos (SCF38), apolipoproteína E (APOE) , proteína de unión a ácidos grasos (FABP), NCAM-140, Fibronectina tipo III, WIP, CD74, ICAM-2, Jaggedl, ltga4, ITGB7, TGF-BII-R, TGFb IEP, Smad4, BMPR1A, CD83, Dectina-1, CD48, E-selectina, IL-15, Inhibidor de señales de citoquinas 4, Cytor4 y CX3CR1. En una determinada forma de realización, DRCGP hace referencia a THBS1 y/o Crea7.

[0062] El término "URRTP" hace referencia a las proteínas que experimentan una regulación al alza en los tumores resistentes a anti-VEGF. Las URRTP comprenden, entre otras, Notch2, DMD8, MCP-1, ITGB7, G-CSF, IL-8R, MIP2, MSCA, GM-CSF, IL-1R, Meg-SF, HSP1A, IL-1R, G-CSFR, IGF2, HSP9A, FGF18, ELM1, Ledgfa, receptor scavenger tipo A, lectina tipo C de macrófagos, Pigr3, SRT-1 de macrófagos, receptor emparejado de proteína G, ScyA7, IL-1R2, proteína inducible IL-1, IL- lbeta y ILIX Precuror. En una determinada forma de realización, URRTP hace referencia a: MSCA, MIP2, IL-8R y/o G-CSF.

[0063] El término "DRRTP" hace referencia a las proteínas que experimentan una regulación a la baja en los tumores resistentes a anti-VEGF. Las URRTP comprenden, entre otras, IL10-R2, Erb-2.1, Caveolina-3, Semcap3, INTG4, THBSP-4, ErbB3, JAM, Eng, JAM, Eng, JAM-2, Pecaml, Tlr3, TGF-B, FIZZ1, Wfsl, TP 14A, EMAP, SULF-2, Matriz extracelular 2, CTFG, TFPI, XCP2, Ramp 2, ROR-alfa, Efrina Bl, SPARC-símil 1 y Semaforina A. En determinadas formas de realización, DRRTP hace referencia a IL10-R2, THBSP-4 y/o JAM-2.

[0064] Un polipéptido con "secuencia nativa" es un polipéptido con la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido obtenido de la naturaleza. Por lo tanto, un polipéptido con secuencia nativa puede poseer la misma secuencia de aminoácidos que un polipéptido que cualquier mamífero produce naturalmente. Dicho polipéptido con secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o producirse por medios sintéticos o recombinantes . El término polipéptido con "secuencia nativa" comprende específicamente formas truncadas o secretadas del polipéptido (por ejemplo, una secuencia de un dominio extracelular) , formas variantes (por ejemplo, formas alternativamente enlazadas) y variantes alélicas del polipéptido, todas ellas producidas naturalmente .

[0065] Una "cadena de polipépt idos" es un polipéptido en el que cada uno de sus dominios está unido a otro/s dominio/s por unión/es péptida/s, a diferencia de interacciones no covalentes o uniones disulfuro.

[0066] Una "variante" de polipéptido es un polipéptido biológicamente activo que tiene al menos aprox. una identidad de secuencia de aminoácido del 80% con el polipéptido de secuencia nativa correspondiente. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, a los polipéptidos en los que se han añadido, o eliminado, uno o más residuos de aminoácidos (de producción natural y/o no natural) en el extremo terminal N- y/o C- del polipéptido. Normalmente, con el polipéptido de secuencia nativa, una variante tendrá al menos una identidad de secuencia de aminoácido del 80% aprox., o al menos del 90% o el 95% o más. Las variantes también incluyen los fragmentos de polipéptidos (por ejemplo, subsecuencias , truncamientos, etc.), por lo general biológicamente activos, de la secuencia nativa .

[0067] El "porcentaje (%) de identificación de la secuencia de aminoácidos" se define en la presente memoria descriptiva como el porcentaje de residuos de aminoácidos en una secuencia candidata que son idénticos a los residuos de aminoácidos en una secuencia seleccionada, después de alinear las secuencias e introducir espacios, si fuera necesario, para lograr el máximo porcentaje de identificación de la secuencia y sin considerar ninguna sustitución conservadora como parte de la identificación de la secuencia. La alineación realizada con la finalidad de determinar el porcentaje de identificación de la secuencia de aminoácidos puede lograrse mediante varias formas que son conocidas en la materia, como por ejemplo, la utilización de software disponible en el mercado, como BLAST, BLAST-2, ALIGN, ALIGN-2 o Megalign (DNASTAR) . Los expertos en la materia pueden determinar parámetros apropiados para medir la alineación, incluidos los algoritmos necesarios para lograr la alineación máxima sobre la longitud completa de las secuencias que se comparan. Sin embargo, a los fines indicados en la presente memoria descriptiva, los valores del % de identificación de la secuencia de aminoácidos se obtienen tal como se describe a continuación, utilizando el software de comparación de secuencias ALIGN-2. Dicho software fue creado por Genentech, Inc. y presentado, junto con la documentación del usuario, en la Oficina de Derechos de Autor de Estados Unidos, Washington D.C., 20559, donde está inscripto con el Registro de Derechos de Autor de Estados Unidos N° TXU510087, y está disponible en el mercado a través de Genentech, Inc., South San Francisco, California. Este programa debe ser compilado para su uso en un sistema operativo UNIX, como por ejemplo, UNIX V4.0D digital. El programa ALIGN-2 define todos los parámetros de comparación de secuencias, que no varían.

[0068] A los fines indicados en la presente memoria descriptiva, el porcentaje de identificación de la secuencia de aminoácidos de una determinada secuencia de aminoácidos A con respecto a o en comparación con una determinada secuencia de aminoácidos B (que puede expresarse alternativamente como una determinada secuencia de aminoácidos A que tiene o comprende un determinado porcentaje de identificación de la secuencia de aminoácidos con respecto a o en comparación con una determinada secuencia de aminoácidos B) se calcula de la siguiente manera: 100 veces la fracción X/Y en la que X es la cantidad de residuos de aminoácidos establecidos como coincidencia total por el programa de alineación de secuencias ALIGN-2 en la alineación de ese programa de A y B, y en la que Y es la cantidad total de residuos de aminoácidos en B. Se detectará que, cuando la longitud de la secuencia de aminoácidos A no sea igual a la longitud de la secuencia de aminoácidos B, el porcentaje de identificación de la secuencia de aminoácidos de A con respecto a B no será igual al porcentaje de identificación de la secuencia de aminoácidos de B con respecto a A.

[0069] El término "variante de proteína", tal como se lo utiliza en la presente memoria descriptiva, hace referencia a una variante descrita anteriormente y/o a una proteína que incluye una o más mutaciones de aminoácidos en la secuencia nativa de la proteína. Opcionalmente , la mutación o mutaciones de los aminoácidos incluyen una sustitución o sustituciones de aminoácidos. La proteína y las variantes de la misma para la utilización en la invención pueden prepararse mediante una variedad de métodos muy conocidos en la materia. Las variantes de la secuencia de aminoácidos de una proteína pueden prepararse mediante mutaciones en el ADN de la proteína. Dichas variantes incluyen, por ejemplo, eliminaciones de y/o inserciones dentro y/o sustituciones de residuos dentro de la secuencia del aminoácido de la proteína. Cualquier combinación de eliminación, inserción y sustitución puede llevarse a cabo para obtener el constructo final que tenga la actividad deseada. Las mutaciones que se llevarán a cabo en el ADN que codifica la variante no deberán ubicar la secuencia fuera de la estructura de lectura y, preferentemente, no deberán crear regiones complementarias que puedan producir una estructura de ARNm secundaria. Patente europea 75.444A.

[0070] Las variantes de la proteina se preparan opcionalmente mediante mutagénesis dirigida al punto de los nucleótidos en el ADN que codifica la proteina nativa o técnicas de presentación en fagos, lo que produce como resultado el ADN que codifica la variante. A continuación, el ADN se expresa en el cultivo de células recombinantes .

[0071] Si bien el punto para introducir una variación de la secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario que la mutación propiamente dicha también lo esté. Por ejemplo, para optimizar el rendimiento de una mutación en un punto dado, la mutagénesis aleatoria puede llevarse a cabo en el codón o región diana y las variantes de la proteina expresadas pueden monitori zarse para detectar la combinación óptima de la actividad deseada. Las técnicas para realizar mutaciones de sustitución en los puntos predeterminados de ADN que posean una secuencia conocida se conocen muy bien, como por ejemplo, la mutagénesis especifica de un punto. La preparación de las variantes de la proteina descritas en la presente memoria descriptiva puede llevarse a cabo mediante técnicas de presentación en fagos, tales como las descriptas en la publicación PCT WO 00/63380.

[0072] Después de seleccionar dicho clon, la región de la proteina mutada puede extraerse y colocarse en el vector apropiado para la producción proteica, que, generalmente, es un vector de expresión del tipo que puede emplearse para la transformación de un huésped adecuado.

[0073] Las eliminaciones de secuencias de aminoácidos generalmente van desde aprox. 1 a 30 residuos, opcionalmente 1 a 10 residuos, 1 a 5 residuos o menos, y suelen ser contiguas .

[0074] Las inserciones en las secuencias de aminoácidos incluyen fusiones en los extremos amino y/o carboxilo terminal de un residuo hasta polipéptidos de longitud básicamente ilimitada, asi como las inserciones intrasecuenciales de uno o múltiples residuos de aminoácidos. Las inserciones intrasecuenciales (es decir, inserciones dentro de la secuencia de la proteina nativa) pueden comprender generalmente entre 1 y 10 residuos aproximadamente o entre 1 y 5 ó 1 y 3 opcionalmente. Un ejemplo de una inserción terminal incluye una fusión de una secuencia de señal, ya sea heteróloga u homologa para la célula huésped, al extremo N-terminal para facilitar la secreción de los huéspedes recombinantes.

[0075] Las variantes adicionales de la proteina son aquellas en las que se ha extraído al menos un residuo de aminoácido de la proteína nativa y se ha colocado un residuo diferente en su lugar. Dichas sustituciones pueden realizarse según lo indicado en la Tabla 1. Las variantes de la proteína también pueden incluir aminoácidos no naturales como se ha descrito en la presente memoria.

[0076] Los aminoácidos pueden agruparse conforme a las similitudes de las propiedades de sus cadenas laterales (en A. L. Lehninger, Biochemistry, segunda edición., pp. 73-75, orth Publishers, Nueva York (1975)) : (1) no polares: Ala (A), Val (V), Leu (L) , lie (I), Pro (P), Phe (F), Trp (W) , Met (M) (2) polares no cargados: Gly (G) , Ser (S) , Thr (T) , Cys (C) , Tyr (Y), Asn (N) , Gln (Q) (3) ácidos: Asp (D), Glu (E) (4) básicos: Lys (K) , Arg (R) , His (H)

[0077] Alternativamente, los residuos que se obtienen naturalmente pueden dividirse en grupos en base a las propiedades comunes de las cadenas laterales: (1) hidrófobos: Norleucina, Met, Ala, Val, Leu, lie; (2) hidrófilos neutrales: Cis, Ser, Thr, Asn, Gln; (3) ácidos: Asp, Glu; (4) básicos: His, Lys, Arg; (5) residuos que tiene influencia en la orientación cadena: Gly, Pro; (6) aromáticos: Trp, Tyr, Phe . 78] Tabla 1 Residuo Sustituciones Sustituciones original preferentes preferentes Ala (A) Val; Leu; lie Val Arg (R) Lis; Gln; Asn Lis Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Gln Arg Asp (D) Glu; Asn Glu Cis (C) Ser; Ala Ser Gln (Q) Asn; Glu Asn Glu (E) Asp; Gln Asp Gly (G) Ala Ala His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg lie (I) Leu; Val; Met; Ala; Leu Phe; Norleucina Leu (L) Norleucina; lie; Val; lie Met; Ala; Phe Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg Met (M) Leu; Phe; lie Leu Phe (F) Trp; Leu; Val; lie; Tyr Ala; Tyr Pro (P) Ala Ala Ser (S) Thr Thr Thr (T) Val; Ser Ser Trp (W) Tyr; Phe Tyr Tyr (Y) Trp; Phe; Tyr; Ser Phe Val (V) lie; Leu; Met; Phe; Leu Ala; Norleucina

[0079] Los "residuos de aminoácidos que se obtienen naturalmente" (es decir, los residuos de aminoácidos codificados por el código genético) pueden seleccionarse de un grupo integrado por: alanina (Ala); arginina (Arg); asparragina (Asn) ; ácido aspártico (Asp) ; cisteina (Cys) ; glutamina (Gln) ; ácido glutámico (Glu) ; glicina (Gly) ; histidina (His); isoleucina (lie); leucina (Leu); lisina (Lys); metionina (Met); fenilalanina (Phe); prolina (Pro); serina (Ser); treonina (Thr); triptofano (Trp); tirosina (Tyr) ; y valina (Val) . Un "residuo de aminoácido que no se obtiene naturalmente" es un residuo que no es ninguno de los residuos de aminoácidos obtenidos naturalmente que se enumeraron anteriormente y que es capaz de unir covalentemente residuos de aminoácidos adyacentes en una cadena de polipéptidos . Los ejemplos de residuos de aminoácidos que no se obtienen naturalmente incluyen, por ejemplo, ornitina, norvalina, homoserina y otros análogos de residuos de aminoácidos, como por ejemplo, los descritos en Ellman y col., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991) y las publicaciones de solicitudes de patentes de EE.UU. 20030108885 y 20030082575. De manera resumida, dichos procedimientos implican la activación de un supresor de ARNt con un residuo de aminoácido que no se obtiene naturalmente, seguida de la transcripción y traducción in vitro o in vivo del AR . Véase, por ejemplo, las publicaciones de solicitudes de patentes de EE.UU. 20030108885 y 20030082575; Noren y col., Science 244:182 (1989) ; y Ellman y col., supra.

[0080] Un polipéptido "aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado a partir de un componente de su entorno natural. Los componentes contaminantes de su entorno natural son materiales que podrían interferir en los usos diagnósticos o terapéuticos del polipéptido, y pueden incluir enzimas, hormonas y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En ciertas formas de realización, el polipéptido se purificará (1) en más del 95% de su peso, tal como se determina por el método de Lowry, o en más del 99% de su peso, (2) en un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia del extremo N-terminal o interna de aminoácidos mediante un secuenciador de taza giratoria o (3) hasta alcanzar la homogeneidad mediante SDS-PAGE, en condiciones reductoras o no reductoras, empleando una tinción con azul de Coomassie o plata. Los polipéptidos aislados incluyen el polipéptido in situ dentro de células recombinantes , ya que al menos un componente del entorno natural del polipéptido no estará presente. De todas formas, normalmente, el polipéptido aislado se preparará mediante al menos un paso de purificación.

[0081] El término "anticuerpo" se utiliza en el más amplio sentido y cubre específicamente los anticuerpos monoclonales (incluidos los anticuerpos monoclonales de longitud completa o intactos), anticuerpos policlonales , multivalentes , multiespecí fieos (por ejemplo, anticuerpos biespecí fieos ) formados por al menos dos anticuerpos intactos y fragmentos de anticuerpos (véase más abajo), siempre que muestren la actividad biológica deseada.

[0082] A menos que se indique lo contrario, la expresión "anticuerpo multivalente" se utiliza en la presente memoria descriptiva para referirse a un anticuerpo que comprenda tres o más puntos de unión a antigenos. El anticuerpo multivalente se diseña generalmente con tres o más puntos de unión a antigenos y no es un anticuerpo IgM o IgA de secuencia nativa.

[0083] Los "fragmentos de anticuerpos" incluyen sólo una parte de un anticuerpo intacto y generalmente abarcan un punto de unión a antigenos del anticuerpo intacto, por lo que retienen la capacidad de unir a antigenos. Los ejemplos de fragmentos de anticuerpos según la definición anterior incluyen: (i) el fragmento Fab, que tiene dominios VL, CL, VH y CH1; (ii) el fragmento Fab' , que es un fragmento Fab que tiene uno o más residuos de cisteina en el extremo C-terminal del dominio CH1; (iii) el fragmento Fd, que tiene dominios VH y CHl; (iv) el fragmento Fd' , que tiene dominios VH y CH1 y uno o más residuos de cisteina en el extremo C-terminal del dominio CHl; (v) el fragmento Fv, que tiene los dominios VL y VH de un único brazo de un anticuerpo; (vi) el fragmento dAb ( ard y col., Nature 341, 544-546 (1989)), que consiste en un dominio VH; (vii) regiones CDR aisladas; (viii) fragmentos F(ab')2, que son fragmentos bivalentes que incluyen dos fragmentos Fab' unidos por un puente disulfuro en la región bisagra; (ix) moléculas de anticuerpos de cadena única (por ejemplo, Fv de cadena única o scFv) (Bird y col., Science 242:423-426 (1988); y Huston y col., PNAS (USA) 85:5879-5883 (1988)); (x) "diacuerpos" con dos puntos de unión a antigenos, incluyendo un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) en la misma cadena de polipéptidos (véanse, por ejemplo, los documentos EP 404.097; O 93/11161; y Hollinger y col., Proc . Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); (xi) "anticuerpos lineales" que incluyen un par de segmentos en tándem de Fd (VH-CH1-VH-CH1 ) , los cuales, junto con los polipéptidos complementarios de cadena ligera, forman un par de regiones de unión a antigenos (Zapata y col. Protein Eng. 8(10): 1057 1062 (1995); y patente de EE.UU. N° 5.641.870).

[0084] Por "anticuerpo monoclonal" se entiende, en la presente memoria descriptiva, un anticuerpo obtenido a partir de una población de anticuerpos sustancialmente homogéneos, es decir, los anticuerpos individuales que forman la población son idénticos, excepto en posibles mutaciones, por ejemplo, mutaciones de formación natural que podrían estar presentes en cantidades insignificantes. Por lo tanto, el modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, que consiste en que no es una mezcla de anticuerpos discretos. Los anticuerpos monoclonales son altamente específicos y están dirigidos contra un único antígeno. En determinadas formas de realización, un anticuerpo monoclonal incluye típicamente un anticuerpo que comprende una secuencia polipeptídica que se une a una diana, en la que la secuencia polipeptídica de unión a dicha diana se obtuvo mediante un procedimiento que incluye la selección de una sola secuencia polipeptídica de unión a la diana a partir de muchas secuencias polipeptídicas . Por ejemplo, el procedimiento de selección puede ser una selección de un solo clon a partir de muchos clones, como un conjunto de clones de hibridoma, clones fágicos o clones de ADN recombinante . Es conveniente saber que una secuencia seleccionada de unión a la diana puede alterarse adicionalmente , por ejemplo, para mejorar la afinidad por la diana, para humanizar la secuencia de unión a la diana, para mejorar su producción en cultivos celulares, para reducir su inmunogenia in vivo, para crear un anticuerpo multiespecifico, etc., y que un anticuerpo que comprenda la secuencia de unión a la diana alterada es, además, un anticuerpo monoclonal de esta invención. En contraste con las preparaciones de anticuerpos policlonales que típicamente incluyen distintos anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) , cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante del antigeno. Además de su especificidad, las preparaciones de anticuerpos monoclonales tienen la ventaja de que no suelen estar contaminadas por otras inmunoglobulinas .

[0085] El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo, que consiste en que se obtiene de una población de anticuerpos sustancialmente homogénea, y no debe intepretarse como que requiere que el anticuerpo debe producirse mediante algún procedimiento en particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales que se van a utilizar según la presente invención pueden producirse mediante una variedad de técnicas, incluyendo, por ejemplo, el método del hibridoma (por ejemplo, Kohler y Milstein, Nature, 256:495-97 (1975) ; Hongo y col., Hybridoma, 14 (3) : 253-260 (1995), Harlow y col., Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. 1988) ; Hammerling y col., en: Monoclonal Antibodies and T-Cell hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)), los métodos del ADN recombinante (véase, por ejemplo, Patente de EE.UU. N° 4.816.567), las tecnologías de presentación en fagos (véase, por ejemplo, Clackson y col., Nature, 352: 624-628 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol. 222: 581-597 (1991); Sidhu y col., J. Mol.

Biol. 338(2) : 299-310 (2004) ; Lee y col., J. Mol. Biol . 340(5) : 1073-1093 (2004) ; Fellouse, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 101(34) : 12467-12472 (2004) ; y Lee y col., J. Immunol. Methods 284(1-2) : 119-132(2004), y técnicas para producir anticuerpos humanos o semejantes a los humanos en animales que tienen parte o la totalidad de los loci de la inmunoglobulina humana o los genes que codifican las secuencias de la inmunoglobulina humana (véanse, por ejemplo, el documento WO 1998/24893; el documento WO 1996/34096; el documento WO 1996/33735; el documento WO 1991/10741; Jakobovits y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 90: 2551 (1993); Jakobovits y col., Nature 362: 255-258 (1993); Bruggemann y col., Year in Immunol. 7:33 (1993) ; Patentes de EE.UU. N° 5.545.807, 5.545.806, 5.569.825, 5.625.126, 5.633.425 y 5.661.016; Marks y col., Bio/'Technology, 10: 779-783 (1992); Lonberg y col., Nature 368: 856-859 (1994); Morrison, Nature 368: 812-813 (1994) ; Fish ild y col., Nature Biotechnol. 14: 845-851 (1996); Neuberger, Nature Biotechnol. 14: 826 (1996), y Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13: 65-93 (1995) .

[0086] En la presente memoria descriptiva, los anticuerpos monoclonales incluyen específicamente los anticuerpos "quiméricos", en los cuales una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homologa a las secuencias correspondientes de anticuerpos obtenidos de una especie en particular o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos en particular, mientras que el resto de las cadenas es idéntico u homólogo a las secuencias correspondientes de anticuerpos obtenidos de otra especie o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, asi como también fragmentos de dichos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (patente de EE.UU. N° 4.816.567 y Morrison y col., Proc. Nati. Acad. Scí. USA, 81:6851-6855 (1984) ) .

[0087] Las formas "humanizadas" de los anticuerpos no humanos (por ejemplo, los murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen una secuencia mínima derivada de la inmunoglobulina no humana. En su mayor parte, los anticuerpos humanizados son inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región hipervariable del receptor son sustituidos por los residuos de la región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donante), como el ratón, la rata, el conejo o los primates no humanos, que tenga la especificidad, afinidad y capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos de la región de estructura (FR) de la inmunoglobulina humana se sustituyen por sus correspondientes residuos no humanos. Además, los anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentren en el anticuerpo receptor o donante. Estas modificaciones se llevan a cabo para refinar aún más el rendimiento del anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente todos los dominios variables (o al menos uno, y típicamente dos) en los que todos, o sustancialmente todos, los bucles hipervariables correspondan a los de una inmunoglobulina no humana y todas, o sustancialmente todas, las FR sean las de una secuencia de inmunoglobulina humana. Opcionalmente, el anticuerpo humanizado también comprenderá al menos una porción de una región constante (Fe) de inmunoglobulina, típicamente humana. Para más información, véase Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986), Riechmann y col., Nature, 332:323-329 (1988) y Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992). Véase también, por ejemplo, Vaswani y Hamilton, Ann . Allergy, Asthma & Immunol. 1:105-115 (1998); Harris, Biochem. Soc. Transactions 23:1035-1038 (1995); Hurle y Gross, Curr. Op. Biotech. 5:428-433 (1994); y las patentes de Estados Unidos N° 6.982.321 y 7.087.409. Véase también van Dijk y van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol . , 5: 368-74 (2001). Los anticuerpos humanos pueden prepararse mediante la administración del antigeno a un animal transgénico que se haya modificado para producir dichos anticuerpos en respuesta al antigeno presentado, pero cuyos loci endógenos se hayan incapacitado, como por ejemplo, xenoratones inmunizados (véanse, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.075.181 y 6.150.584 con respecto a la tecnología XENOMOUSE™) . Véase también, por ejemplo, Li y col., Proc. Nati. Acaci. Sci . USA, 103:3557 3562 (2006) con respecto a los hibri doma de células B humanas.

[0088] Un "anticuerpo humano" es aquel que contiene una secuencia de aminoácidos que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o que se ha producido utilizando cualquiera de las técnicas para producción de anticuerpos humanos expuestas en la presente memoria descriptiva. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que contenga residuos de unión a antígeno no humanos. Los anticuerpos humanos pueden producirse utilizando diversas técnicas conocidas en la materia. En una forma de realización, el anticuerpo humano se selecciona de una biblioteca de fagos, en la que dicha biblioteca de fagos expresa anticuerpos humanos (Vaughan y col., Nature Biotechnology 14:309-314 (1996) ; Sheets y col., PNAS (USA) 95:6157-6162 (1998) ); Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581 (1991) ) . Los anticuerpos humanos también pueden producirse mediante la introducción de loci de inmunoglobulina humana en animales transgénicos , como por ejemplo, ratones en los que los genes de inmunoglobulina endógenos han sido inactivados total o parcialmente. Tras la prueba, se observa la producción del anticuerpo humano, que se asemeja mucho a la observada en humanos en todos los aspectos, incluyendo la reorganización y ensamblaje de genes y el repertorio de anticuerpos. Este método se describe, por ejemplo, en las patentes de EE.UU. N° 5.545.807; 5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.661.016 y en las siguientes publicaciones científicas: Marks y col., Bio/Technology 10: 779-783 (1992) ; Lonberg y col., Nature 368: 856-859 (1994) ; Morrison, Nature 368:812-13 (1994) ; Fishwild y col., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996) ; Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996); Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Immunol . 13:65-93 (1995) . Como alternativa, el anticuerpo humano puede prepararse mediante la inmortalización de los linfocitos humanos B que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno diana (dichos linfocitos B pueden obtenerse de un individuo o pueden haber sido inmunizados in vitro) . Véase, por ejemplo, Colé y col., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner y col., J. Immunol., 147 (l) :86-95 (1991); y la patente de EE.UU. N° 5.750.373.

[0089] El término "variable" se refiere al hecho de que ciertas porciones de los dominios variables difieren ampliamente en sus secuencias de un anticuerpo a otro y se utilizan para la unión y especificidad de cada anticuerpo en particular con relación a su antigeno particular. Sin embargo, la variabilidad no se distribuye uniformemente a través de los dominios variables de los anticuerpos. Se concentra en tres segmentos, denominados regiones hipervariables , de los dominios variables tanto de la cadena ligera como la pesada. Las porciones más conservadas de los dominios variables se llaman regiones de estructura (FR) . Cada dominio variable de las cadenas pesada y ligera nativas comprende cuatro FR que, en gran parte, adoptan una configuración de hoja-beta, conectadas por tres regiones hipervariables que crean bucles que conectan la estructura de la hoja-beta y en algunos casos forman parte de ella. Las FR mantienen unidas y en estrecha proximidad a las regiones hipervariables de cada cadena, las cuales, junto con las regiones hipervariables de las otras cadenas, contribuyen a la formación del punto de unión a antigeno de los anticuerpos (véase Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)) . Los dominios constantes no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antigeno, pero desarrollan diversas funciones efectoras, como la participación del anticuerpo en la citotoxicidad con mediación celular dependiente de anticuerpos .

[0090] El término "región hipervariable" "HVR" o "HV", en el contexto de la presente memoria descriptiva, se refiere a los residuos de aminoácidos de un anticuerpo responsables de la unión a antigeno. Por ejemplo, el término región hipervariable se refiere a las regiones de un domino variable de anticuerpos que son hipervariables en su secuencia y/o forman bucles estructuralmente definidos. Por lo general, los anticuerpos contienen seis regiones hipervariables: tres en la VH (Hl, H2, H3) y tres en la VL (Ll, L2, L3) . En anticuerpos nativos, H3 y L3 muestran la máxima diversidad en las seis regiones hipervariables y se cree que H3 en concreto desempeña un papel único en otorgar una buena especificidad a los anticuerpos. Véase, por ejemplo, Xu y col., Immunity 13:37-45 (2000) ; Johnson y Wu, en Methods in Molecular Biology 248:1-25 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003) . De hecho, los anticuerpos de camélidos que se producen naturalmente y están formados por una cadena pesada son sólo funcionales y estables en ausencia de la cadena ligera. Véase, por ejemplo, Hamers-Casterman y col., Nature 363:446-448 (1993); Sheriff y col., Nature Struct. Biol. 3:733-736 (1996) .

[0091] En la presente memoria descriptiva se usan y engloban diversas delineaciones de regiones hipervariables . Las regiones de determinación de complementariedad (CDR) de Kabat están basadas en la variabilidad de las secuencias y son las usadas más frecuentemente (Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunologícal Interest, 5a Ed . Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, D. (1991)) . Chothia, en cambio, se refiere a la ubicación de los bucles estructurales (Chothia y Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)) . Las regiones hipervariables de anticuerpos monoclonales representan una solución intermedia entre las regiones hipervariables de Kabat y los bucles estructurales de Chothia y son las utilizadas en el software de modelado de anticuerpos AbM de Oxford Molecular. Las regiones hipervariables "de contacto" se basan en un análisis de las estructuras de cristales complejos disponibles. Los residuos procedentes de cada una de estas regiones hipervariables se indican a continuación. Bucle Kabat AbM Chothia Contacto Ll L24-L34 L24-L34 L26-L32 L30-L36 L2 L50-L56 L50-L56 L50-L52 L46-L55 L3 L89-L97 L89-L97 L91-L96 L89-L96 Hl H31-H35B H26-H35B H26-H32 H30-H35B (Numeración de Kabat) Hl H31-H35 H26-H35 H26-H32 H30-H35 (Numeración de Chothia) H2 H50-H65 H50-H58 H53-H55 H47- H58 H3 H95-H102 H95-H102 H96-H101 H93-H101

[0092] Las regiones hipervariables pueden comprender "HVR ampliadas", tal como se indica a continuación: 24-36 ó 24-34 (Ll) , 46-56 ó 50-56 (L2) y 89-97 ó 89-96 (L3) en la VL y 26-35 (Hl), 50-65 ó 49-65 (H2) y 93-102, 94-102 ó 95-102 (H3) en la VH . Los residuos de dominio variable se numeran según Kabat y col., citado anteriormente, para cada una de estas definiciones .

[0093] Los residuos de una "región estructural" o "FR" son aquellos residuos de un dominio variable distintos de los de una región hipervariable, tal como se define en la presente memoria descriptiva.

[0094] El término "numeración de residuos de dominio variable como en Kabat"' o "numeración de la posición de los aminoácidos como en Kabat" y las variaciones de éstos se refieren al sistema de numeración utilizado para los dominios variables de cadena pesada o los dominios variables de cadena liviana de la compilación de anticuerpos en Kabat y col., citado anteriormente. Utilizando este sistema de numeración, la secuencia lineal real de aminoácidos puede contener menos aminoácidos o aminoácidos adicionales que correspondan a un acortamiento de una FR o HVR del domino variable o a una inserción en ellas, respectivamente. Por ejemplo, un dominio variable de cadena pesada puede incluir una única inserción de aminoácidos (residuo 52a según Kabat) después del residuo 52 de H2 y residuos insertados (por ejemplo, residuos 82a, 82b y 82c, etc., según Kabat) después de un residuo 82 de la FR de la cadena pesada. La numeración de Kabat de los residuos puede estar determinada para un anticuerpo dado por una alineación en regiones de homología de la secuencia del anticuerpo con una secuencia "estándar" numerada según Kabat .

[0095] A lo largo de la presente especificación y reinvindicaciones , el sistema de numeración de Kabat se utiliza generalmente al referirse a un residuo en el dominio variable (aproximadamente, residuos 1-107 de la cadena ligera y residuos 1-113 de la cadena pesada) (por ejemplo, Kabat y col., Sequences of Immunological Interest. 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)) . El "sistema de numeración EU" o el "índice EU" se utiliza generalmente al referirse a un residuo en una región constante de una cadena pesada de inmunoglobulina (por ejemplo, el índice EU referido en Kabat y col., Sequences of Proteins of Immunological Interest , 5a Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991) expresamente incorporado en la presente memoria descriptiva a modo de referencia) . A menos que se especifique lo contrario en la presente memoria descriptiva, las referencias a la numeración de los residuos en el dominio variable de los anticuerpos significa la numeración de residuos del sistema de numeración de Kabat. A menos que se indique lo contrario en la presente memoria descriptiva, las referencias a la numeración de los residuos en el dominio constante de los anticuerpos significa la numeración de residuos del sistema de numeración EU (por ejemplo, véase la Solicitud de Patente Provisional de Estados Unidos N° 60/640.323, Figuras, para consultar la numeración EU) .

[0096] Según las secuencias de aminoácidos de los dominios constantes de sus cadenas pesadas, los anticuerpos ( inmunoglobulinas ) pueden asignarse a distintas clases. Existen cinco clases principales de inmunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG, e IgM, y varias de éstas pueden seguir dividiéndose en "subclases" (isotipos) , por ejemplo, IgGi (incluyendo los alotipos A y no A), IgG2, IgG3, IqGn, IgAi e IgA2 . Los dominios constantes de cadena pesada que corresponden a las distintas clases de inmunoglobulinas se denominan a, d, e, ?, y µ respectivamente. Las estructuras de las subunidades y las configuraciones tridimensionales de las distintas clases de inmunoglobulinas son bien conocidas y se describen de forma general, por ejemplo, en Abbas y col., Cellular and Mol. Immunology, 4a ed. (W.B. Saunders, Co. , 2000) . Un anticuerpo puede formar parte de una molécula de fusión más amplia, formada por asociación covalente o no covalente del anticuerpo a una o más proteínas o péptidos.

[0097] Las "cadenas ligeras" de anticuerpos (inmunoglobulinas) de cualquier vertebrado pueden asignarse a una de dos clases claramente diferenciadas, denominadas kappa (K) y lambda (?) , en función de las secuencias de aminoácidos de sus dominios constantes.

[0098] El término "región Fe" se utiliza para definir la región del extremo C-terminal de una cadena pesada de inmunoglobulina que puede generarse mediante la digestión con papaina de un anticuerpo intacto. La región Fe puede ser una región Fe de secuencia nativa o una región Fe variante. Aunque los limites de la región Fe de una cadena pesada de inmunoglobulina pueden variar, la región Fe de una cadena pesada de IgG humana se suele definir como que se extiende a partir de un residuo de aminoácido en la posición Cys226 o desde Pro230 hasta el extremo carboxilo terminal de la región Fe. La lisina en el extermo C terminal (residuo 447 de acuerdo con el sistema de numeración EU) de la región Fe puede eliminarse, por ejemplo, durante la producción o purificación del anticuerpo, o generando mediante ingeniería recombinante el ácido nucleico que codifica la cadena pesada del anticuerpo. Por consiguiente, una composición de anticuerpos intactos puede comprender poblaciones de anticuerpos con todos los residuos K447 eliminados, poblaciones de anticuerpos sin la eliminación de los residuos K447 y poblaciones de anticuerpos con una mezcla de anticuerpos con y sin el residuo K447. La región Fe de una inmunoglobulina comprende generalmente dos dominios constantes, un dominio CH2 y un dominio CH3, y opcionalmente puede comprender un dominio CH4.

[0099] A menos que se indique lo contrario en la presente memoria descriptiva, la numeración de los residuos en una cadena pesada de inmunoglobulina es la del índice EU como en Kabat y col., citado anteriormente. El "índice EU como en Kabat" se refiere a la numeración de residuos del anticuerpo humano IgGl EU.

[0100] En la presente memoria descriptiva, el término "cadena de la región Fe" se refiere a una de las dos cadenas polipept idicas de una región Fe.

[0101] El "dominio CH2" de una región Fe de IgG humana (también llamado dominio "Cg2") se extiende generalmente desde un residuo de aminoácido en la posición 231 hasta un residuo de aminoácido en la posición 340. El dominio CH2 es único porque no está unido estrechamente a ningún otro dominio. En cambio, dos cadenas de carbohidratos ramificadas enlazadas a N se interponen entre dos dominios CH2 de una molécula de IgG nativa intacta. Se ha especulado que los carbohidratos pueden proporcionar un sustituto para el apareamiento dominio-dominio y contribuir a estabilizar el dominio CH2. Burton, Molec. Immunol .22 : 161-206 (1985) . El dominio CH2 de la presente memoria descriptiva puede ser un dominio CH2 de secuencia nativa o un dominio CH2 variante.

[0102] El "dominio CH3" comprende una región de residuos del extremo C-terminal a un dominio CH2 en una región Fe (es decir, desde un residuo de aminoácidos en posición 341 hasta un residuo de aminoácido en posición 447 de IgG) . La región CH3 de la presente memoria descriptiva puede ser un dominio CH3 de secuencia nativa o un dominio CH3 variante (por ejemplo, un dominio CH3 con una "protuberancia" insertada en una cadena del mismo y una "cavidad" correspondiente insertada en la otra cadena de dicho dominio; véase la patente de EE.UU. N° 5.821.333, expresamente incorporada a la presente memoria descriptiva para su referencia) . Dichos dominios CH3 variantes pueden utilizarse para generar anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, biespecificos ) , tal como se describe en la presente memoria descriptiva.

[0103] La "región bisagra" se define generalmente como la región desde Glu216 o Cys226 aproximadamente hasta Pro230 aproximadamente de la IgGl humana (Burton Molec. Immunol. 22:161-206 (1985)) . Las regiones bisagras de otros isotipos de IgG pueden alinearse con la secuencia de IgGl si se colocan el primer y el último residuo de cisteina formando uniones S-S entre cadenas pesadas en las mismas posiciones. La región bisagra de la presente memoria descriptiva puede ser una región bisagra de secuencia nativa o una región bisagra variante. Las dos cadenas polipeptidicas de una región bisagra variante retienen generalmente al menos un residuo de cisteina por cadena polipept idica , de modo que las dos cadenas polipeptidicas de la región bisagra variante puedan formar una unión disulfuro entre dichas dos cadenas. La región bisagra preferida en la presente memoria descriptiva es la región bisagra humana de secuencia nativa, como por ejemplo, una región bisagra IgGl humana de secuencia nativa .

[0104] Una "región Fe funcional" tiene al menos una "función efectora" de una región Fe de secuencia nativa. Algunos ejemplos de "funciones efectoras" incluyen unión Clq; citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) ; unión de receptor Fe; citotoxicidad con mediación celular dependiente de los anticuerpos (ADCC) ; fagocitosis; regulación a la baja de receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor celular B, BCR) , etc. Estas funciones efectoras generalmente requieren que la región Fe se combine con un dominio de unión (por ejemplo, un dominio variable de anticuerpos) y se puede evaluar utilizando varios ensayos conocidos de la materia para considerar dichas funciones efectoras de anticuerpos.

[0105] Una "región Fe de secuencia nativa" comprende una secuencia de aminoácidos idéntica a la secuencia de aminoácidos de una región Fe que se puede encontrar en la naturaleza. Las regiones Fe humanas con secuencia nativa incluyen una región Fe IgGl humana con secuencia nativa (alotipos A y no A) ; región Fe IgG2 humana con secuencia nativa; región Fe IgG3 humana con secuencia nativa; y región Fe IgG4 humana con secuencia nativa, asi como las variantes de las mismas que se obtienen naturalmente.

[0106] Una "región Fe variante" comprende una secuencia de aminoácidos que difiere de la de una región Fe de secuencia nativa en al menos una modificación de aminoácidos. En algunas formas de realización, la región Fe variante tiene al menos una sustitución de aminoácidos en comparación con una región Fe de secuencia nativa o la región Fe de un polipéptido parental, por ejemplo, entre aproximadamente una a diez sustituciones de aminoácidos, y preferiblemente, entre aproximadamente una y cinco sustituciones de aminoácidos en la región Fe de secuencia nativa o en la región Fe del polipéptido parental, por ejemplo, de aproximadamente una a diez sustituciones de aminoácidos y preferentemente, entre una y cinco sustituciones de aminoácidos en una región Fe de secuencia nativa o en la región Fe del polipéptido parental. La región Fe variante de la presente memoria descriptiva tendrá, por ejemplo, al menos 80% de identificación de secuencia con una región Fe de secuencia nativa y/o con una región Fe de un polipéptido parental y, preferiblemente, al menos 90% de identificación de secuencia o al menos 95% o más de identificación de secuencia con dicha región.

[0107] Las "funciones efectoras" de un anticuerpo hacen referencia a aquellas actividades biológicas atribuibles a la región Fe (una región Fe de una secuencia nativa o una región Fe variable de una secuencia aminoacidica ) de un anticuerpo y pueden variar con el isotipo del anticuerpo. Los ejemplos de funciones efectoras de un anticuerpo incluyen: La unión de Clq y la citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) , la unión de receptores de Fe, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) , la fagocitosis, la regulación a la baja de los receptores en la superficie celular (por ejemplo, el receptor de células B) y la activación de las células B.

[0108] La "citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos" o "ADCC" se refiere a una forma de citotoxicidad en la cual una Ig secretada y unida a los receptores Fe (FcR) presentes en determinadas células citotóxicas (por ejemplo, células asesinas naturales (NK) , neutrófilos y macrófagos) posibilita que estas células efectoras citotóxicas se unan específicamente a una célula diana que porte un antígeno y, posteriormente, destruyan dicha célula diana con citotoxinas. Las células primarias para mediar en la ADCC, células NK, expresan sólo FcyRIII, mientras que los monocitos expresan FcyRI, FcyRII y FcyRIII. La expresión del FcR en células hematopoyéticas se resume en la Tabla 3 de la página 464 de Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol, 9:.457-92 (1991). A fin de evaluar la actividad de ADCC de una molécula de interés, se puede realizar un ensayo de ADCC in vitro, como el que se describe en las patentes de EE.UU. N° 5.500.362 ó 5.821.337. Entre las células efectoras útiles para estos ensayos se encontrarán las células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC) y las asesinas naturales (NK) . Como alternativa, o adicionalmente, la actividad de ADCC de la molécula de interés se puede evaluar in vivo, por ejemplo, en un modelo animal como el que se desvela en Clynes y col., PNAS (USA), 95: 652-656 (1998) .

[0109] Las "células efectoras humanas" son leucocitos que expresan uno o más FcR y realizan funciones efectoras. En determinadas formas de realización, las células expresan al menos el FCYRIII y realizan la función o funciones efectoras de ADCC. Los ejemplos de leucocitos humanos que median en la ADCC serian las células sanguíneas mononucleares periféricas (PBMC), las células asesinas naturales (NK) , los monocitos, las células T citotóxicas y los neutrófilos, pero son las PBMC y las NK las que se prefieren generalmente. Las células efectoras pueden aislarse de una fuente nativa de las mismas, como por ejemplo, la sangre o las PBMC, tal como se describe en la presente memoria descriptiva.

[0110] Los términos "receptor de Fe" o "FcR" describen un receptor que se une a la región Fe de un anticuerpo. En algunas formas de realización, un FcR es un FcR nativo humano. En algunas formas de realización, un FcR es aquel que se une a un anticuerpo IgG (un receptor gamma) e incluye las subclases de receptores FcyRI, FcyRII y FcyRIII, incluidas las variantes alélicas y las formas con ayuste alternativo de estos receptores. Los receptores FcyRII incluyen el FcyRIIA (un "receptor activador") y el FcyRIIB (un "receptor inhibidor") , los cuales tienen secuencias de aminoácidos similares que difieren principalmente en sus dominios citoplasmát icos . El receptor activador FcyRIIA contiene en su dominio citoplasmático un motivo activador inmunorreceptor basado en la tirosina (ITAM) . El receptor inhibidor FcyRIIB contiene en su dominio citoplasmát ico un motivo inhibidor inmunorreceptor basado en la tirosina (ITIM) . (Véase, por ejemplo, Daéron, Annu . Rev. Immunol. 15:203-234 (1997)) . En Ravetch y Kinet, Annu. Rev. Immunol, 9:457-92 (1991), Capel y col., Immunomethods , 4:25-34 (1994) y de Haas y col., J. Lab. Clin. Meo!., 126:330-41 (1995), por ejemplo, también se analizan los FcR. Otros FcR, incluidos aquellos que se identifiquen en el futuro, se engloban en el térrmino "FcR" empleado en la presente memoria descriptiva.

[0111] El término "receptor Fe" o "FcR" también incluye el receptor neonatal, FcRn, responsable de la transferencia de las IgG maternas al feto (Guyer y col., J. Immunol., 117:587 (1976) y Kim y col., J. Immunol., 24:249 (1994)) y de la regulación de la homeostasis de las inmunoglobulinas . Se conocen los métodos de medición de la unión al FcRn (véase, por ejemplo, Ghetie y Ward, Immunol. Today 18 ( 12 ) : 592-598 (1997); Ghetie y col., A/ature Biotechnology, 15 ( 7 ) : 637-640 (1997) ; Hinton y col., J. Biol. Chem. 279 (8 ) : 6213-6216 (2004); el documento WO 2004/92219 (Hinton y col.) .

[0112] La unión al FcRn humano in vivo y la semivida sérica de los polipéptidos de unión al FcRn humano de alta afinidad pueden analizarse, por ejemplo, en ratones transgénicos o lineas celulares humanas transíectadas que expresan el FcRn humano, o en primates a los que se administran polipéptidos con una región Fe variante. El documento WO 2000/42072 (Presta) describe variantes de anticuerpos con capacidad de unión a los FcR mejorada o disminuida. Véase además, por ejemplo, Shields y col., J. Biol . Chem. , 9(2) : 6591-6604 (2001) .

[0113] La "citotoxicidad dependiente de complemento" o "CDC" se refiere a la lisis de una célula diana en presencia del complemento. La vía clásica de activación del complemento se inicia por la unión del primer componente del sistema del complemento (Clq) a los anticuerpos (de la subclase apropiada) que están unidos a su antigeno cognado. A fin de evaluar la activación del complemento, se puede efectuar un ensayo de CDC, por ejemplo, tal como se describe en Gazzano-Santoro y col., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996) . Las variantes polipept idicas con secuencias de aminoácidos de la región Fe alteradas (polipéptidos con una región Fe variante) y capacidad aumentada o disminuida de unión a Clq se describen, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos N° 6.194.551 Bl y el documento WO 1999/51642. Véase también, por ejemplo, Idusogie y col., J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000) .

[0114] Un anticuerpo con "maduración de afinidad" es aquel con una o más alteraciones en una o más CDR del mismo que dan lugar a una mejora de la afinidad del anticuerpo por el antigeno, en comparación con un anticuerpo parental que no incluye dichas alteraciones. En una forma de realización, un anticuerpo con maduración de afinidad presenta afinidades nanomolares e incluso picomolares para el antigeno diana. Los anticuerpos con maduración de afinidad se producen mediante procedimientos bien conocidos en la materia. En Marks y col., Bio/ echnology, 10:779-783 (1992), se describe la maduración de afinidad mediante la transposiciónn de los dominios VH y VL . La mutagénesis aleatoria de la CDR y/o los residuos estructurales se describen en: Barbas y col. Froc Nat. Acad. Scir USA, 91:3809-3813 (1994), Schier y col., Gene 169:147-155 (1995); Yelton y col., J. Immunol. 155:1994-2004 (1995); Jackson y col., J. Immunol. 154 ( 7 ): 3310-9 (1995); y Hawkins y col., J. Mol. Biol. 226:889-896 (1992).

[0115] En la presente memoria descriptiva, un "enlazador flexible" se refiere a un péptido que comprende dos o más residuos de aminoácidos unidos por uniones péptidas y que brinda más libertad rotacional a dos polipéptidos (como por ejemplo, dos regiones Fd) unidos por éste. Dicha libertad rotacional les permite a dos o más puntos de unión a antigeno unidos por el enlazador flexible acceder al antigeno diana de manera más eficiente. Los ejemplos de secuencias de péptidos enlazadores flexibles apropiadas incluyen gly-ser, gly-ser-gly-ser, ala-ser y gly-gly-gly-ser .

[0116] Un "dominio de dimerización" se forma a partir de la asociación de al menos dos residuos de aminoácidos (generalmente, residuos de cisteina) o de al menos dos péptidos o polipéptidos (que pueden tener secuencias de aminoácidos iguales o diferentes) . Los péptidos o polipéptidos pueden interactuar entre si a través de asociaciones covalentes o no covalentes. Los ejemplos de dominios de dimerización de la presente memoria descriptiva incluyen una región Fe; una región bisagra; un dominio CH3; un dominio CH4; un par CH1-CL; una "interfaz" con una "perilla" y/o "protuberancia" diseñada tal como se describe en la patente de EE.UU. N° 5.821.333, expresamente incorporada a la presente memoria descriptiva para su referencia; una cremallera de leucina (por ejemplo, cremallera de leucina jun/fos; véase Kostelney y col., J. Immunol., 148: 1547-1553 (1992); o una cremallera de leucina GCN4 de levadura) ; una cremallera de isoleucina; un par dimero receptor (por ejemplo, receptor de interleucina-8 (IL-8R) ; y heterodimeros de integrina, tales como LFA-1 y GPIIIb/IIIa) , o las regiones de dimerización de los mismos; polipéptidos ligandos diméricos (por ejemplo, factor de crecimiento nervioso (NGF) , neurotrofina-3 (NT-3), interleucina-8 (IL-8), factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) , miembros de VEGF-C, VEGF-D, PDGF y factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) ; véase Arakawa y col., J. Biol. Chem. 269(45) : 27833-27839 (1994) y Radziejewski y col., Biochem. 32(48) : 1350 (1993)), o las regiones de dimerización de los mismos; un par de residuos de cisteina capaces de formar una unión disulfuro; un par de péptidos o polipépt idos , cada uno con al menos un residuo de cisteina (por ejemplo, desde aproximadamente uno, dos o tres hasta aproximadamente diez residuos de cisteina) , de modo que puedan formarse uniones disulfuro entre los péptidos o polipéptidos (de aquí en adelante, una "bisagra sintética") ; y dominios variables de anticuerpos. El dominio de dimerización preferido en la presente memoria descriptiva es una región Fe o una región bisagra.

[0117] Un "punto de unión a antigeno funcional" de un anticuerpo es aquel capaz de unirse a un antigeno diana. La afinidad de unión a antigeno del punto de unión a antigeno no es necesariamente tan fuerte como la del anticuerpo parental del que se deriva el punto de unión a antigeno, pero la capacidad de unión a antigeno debe poder medirse utilizando cualquier método conocido para evaluar la unión del anticuerpo a un antigeno. Además, no es necesario que la afinidad de unión a antigeno de cada uno de los puntos de unión a antigeno de un anticuerpo multivalente de la presente memoria descriptiva sea igual cuantitativamente. Para los anticuerpos multiméricos de la presente memoria descriptiva, puede evaluarse la cantidad de puntos de unión a antigeno funcionales utilizando un análisis de ult racent rifugación . Según este método de análisis, se combinan los distintos índices de antígeno diana frente al anticuerpo multimérico y el peso molecular medio de los complejos se calcula asumiendo diferentes cantidades de puntos de unión funcionales. Estos valores teóricos se comparan con los valores experimentales reales obtenidos para evaluar la cantidad de puntos de unión funcionales .

[0118] Un anticuerpo con una "característica biológica" de un anticuerpo designado es aquel que posee una o más de las características biológicas de dicho anticuerpo que lo distinguen de otros anticuerpos que se unen al mismo antígeno .

[0119] A fin de examinar los anticuerpos que se unen a un epítopo de un antígeno unido por un anticuerpo de interés, se puede llevar a cabo un ensayo rutinario de bloqueo cruzado, como el descrito en Antibodies , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow y David Lañe (1988) .

[0120] La administración "en combinación con" uno o más agentes terapéuticos incluye la administración simultánea (concurrente) y/o consecutiva en cualquier orden.

[0121] A los efectos de tratamiento, el término "mamífero" se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluidos humanos, animales domésticos y de granja, animales de compañía, utilizados en actividades deportivas, o en zoos, como perros, caballos, gatos, vacas, ovejas, cerdos, etc. Generalmente, el mamífero es un humano.

[0122] Un "trastorno" es un proceso que se beneficiaría del tratamiento con las moléculas de la invención. Incluye trastornos o enfermedades crónicas y agudas, comprendidos los procesos patológicos que predisponen al mamífero al trastorno en cuestión. Los ejemplos no limitantes de los trastornos que se tratan en la presente memoria descriptiva incluyen cualquier forma de tumor, tumores benigos y malignos; tumores vascularizados ; hipertrofia; leucemias y malignidades linfoideas; trastornos neuronales, gliales, astrocitales , hipotalámicos y otros trastornos glandulares, macrofágicos , epiteliales, estromales y blastocélicos ; y trastornos inflamatorios, angiogénicos e inmunológicos , trastornos vasculares como consecuencia de vascularidad inadecuada, anómala, excesiva y/o patológica y/o permeabilidad vascular.

[0123] El término "cantidad eficaz" o "cantidad terapéuticamente eficaz" se refiere a una cantidad eficaz de un medicamento para tratar una enfermedad o trastorno en un mamífero. En el caso del cáncer, la cantidad eficaz del fármaco puede reducir el número de células cancerosas o el tamaño del tumor, inhibir (es decir, aminorar hasta cierto grado y en general detener) la infiltración de células cancerosas en los órganos periféricos, inhibir (es decir, aminorar hasta cierto grado y en general detener) la metástasis tumoral e inhibir, hasta cierto punto, el crecimiento tumoral, permitir el tratamiento del tumor resistente y/o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados al trastorno. Con relación a su capacidad para evitar el crecimiento y/o destruir las células cancerosas existentes, el fármaco puede ser citostático y/o citotóxico. Para la terapia contra el cáncer, la eficacia in vivo puede medirse, por ejemplo, mediante la evaluación de la duración de la supervivencia, del tiempo de progresión de la enfermedad (TTP) , de las tasas de respuesta (RR) , de la duración de la respuesta y/o de la calidad de vida.

[0124] El "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como a las medidas profilácticas o preventivas. Entre las personas que necesitan tratamiento se incluyen aquellas que ya tienen el trastorno, asi como también aquellas que deben tomar medidas para prevenirlo. En determinadas formas de realización de la invención, tratamiento puede referirse a una supresión de la angiogénesis y/o crecimiento del tumor, o al inicio retrasado de la resistencia anti-VEGF.

[0125] Los términos "actividad biológica" y "biológicamente activo", en relación con un polipéptido de la invención, se refieren a la capacidad de una molécula para unirse específicamente y regular respuestas celulares, por ejemplo, proliferación, migración, etc. Las respuestas celulares también incluyen aquellas mediadas a través de un receptor, incluyendo, entre otras, la migración y/o la proliferación. En este contexto, el término "modular" incluye tanto a la promoción como a la inhibición.

[0126] Los términos "cáncer" y "cancerígeno" describen o se refieren al estado fisiológico de los mamíferos típicamente caracterizado por un crecimiento celular no regulado. Entre los ejemplos de cáncer se incluyen, entre otros, el carcinoma, el linfoma, el blastoma, el sarcoma y la leucemia o las malignidades linfoideas. Entre los ejemplos más específicos de dichos cánceres se incluyen cáncer renal o de riñon, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer rectal, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón incluido el cáncer de pulmón de células pequeñas, cáncer de pulmón de células no pequeñas, adenocarcinoma de pulmón y carcinoma escamoso de pulmón, cáncer de células escamosas (por ejemplo, cáncer de las células escamosas epiteliales), cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de próstata, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular , cáncer de estómago o gástrico, incluido el cáncer gastrointestinal, i!>¡, cáncer pancreático, cáncer de cabeza y cuello, glioblastoma , retinoblastoma , astrocitoma, tecomas, arrenoblastomas , hepatoma, malignidades hematológicas , incluido el linfoma no de Hodgkin (LNH) , malignidades hematológicas agudas y mieloma múltiple, carcinoma endometrial o uterino, endometriosis , fibrosarcomas , coriocarcinoma , carcinoma de las glándulas salivares, cáncer vulval, cáncer de tiroides, carcinomas esofágicos, carcinoma hepático, carcinoma anal, carcinoma del pene, carcinoma nasofaríngeo, carcinomas de la laringe, sarcoma de Karposi, melanoma, carcinomas de la piel, Schwannoma, oligondendroglioma , neuroblastomas , rabdomiosarcoma , sarcoma osteogénico, leiomiosarcomas , carcinomas del tracto urinario, carcinomas de la tiroides, tumor de Wilm, así como también linforma de las células B (incluido el linfoma folicular no de Hodking (LNH) de bajo grado; LNH linfocítico de célula pequeña (SL) ; LNH folicular de grado intermedio; LHN difuso de grado intermedio; LNH inmunoblást ico de alto grado; LNH linfoblást ico de alto grado; LNH de células pequeñas no divididas de alto grado; LNH voluminoso; linfoma de las células de la corteza cerebral; linfoma relacionado con el SIDA; y macroglobulinemia de Waldenstrom) ; leucemia linfocítica crónica (LLC) ; leucemia linfoblástica aguda (LLA) ; leucemia por tricoleucitos ; leucemia mieloblástica crónica; y trastorno linfoproliferativo post ransplante (TLPT) , así como también proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edemas (como los asociados con los tumores cerebrales) y síndrome de Meig. En la presente memoria descriptiva, por "tumor" se entiende todo crecimiento y proliferación celular neoplásica, tanto benigna como maligna, así como todas las células y tejidos cancerosos y precancerosos .

[0127] El término "tumor resistente" se refiere al cáncer, las células cancerosas o a un tumor que no responde completamente o pierde respuesta o muestra una respuesta reducida durante el tratamiento para el cáncer a un tratamiento para el cáncer que contiene al menos un antagonista de VEGF. Un tumor resistente también se refiere a un tumor diagnosticado como resistente en la presente memoria descriptiva (también mencionado en la presente memoria descriptiva como "tumor resistente a anti-VEGF") . En determinadas formas de realización, existe un incremento de las células CDllb+Grl+ en un tumor resistente en comparación con un tumor sensible al tratamiento que incluye la menos un antagonista de VEGF.

[0128] El término "composición ant ineoplásica" se refiere a una composición útil en el tratamiento del cáncer que comprende al menos un agente terapéutico activo, por ejemplo, "agente ant ineoplásico" . Entre los ejemplos de agentes terapéuticos (agentes ant ineoplásicos ) se incluyen, entre otros, agentes quimioterapéuticos , agentes inhibidores del crecimiento, agentes citotóxicos, agentes usados en radioterapia, agentes antiangiogénicos , agentes apoptóticos, agentes antitubulina, toxinas y otros agentes para tratar el cáncer, como por ejemplo, anticuerpo neutralizador anti-VEGF, antagonista de VEGF, anti-HER-2, anti-CD20, un antagonista del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) (por ejemplo, un inhibidor de la tirosina quinasa) , inhibidor de HER1/EGFR, erlotinib, un inhibidor de COX-2 (por ejemplo, celecoxib) , interferones , citoquinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizadores ) que se unen a uno o más de los receptores de ErbB2, ErbB3, ErbB4 o VEGF, inhibidores para tirosina quinasas receptoras para factor de crecimiento derivado de las plaquetas (PDGF) y/o factor de células madre (SCF) (por ejemplo, imatinib mesilato (Gleevec ® Novartis)), TRAIL/Apo2 y otros agentes bioactivos y químicos orgánicos, etc. En la invención también se incluyen combinaciones de los mismos.

[0129] El término "agente citotóxico" en el contexto de la presente memoria descriptiva se refiere a una sustancia que inhibe o impide la función de las células y/o causa la destrucción de las mismas. El término pretende incluir isótopos radiactivos (por ejemplo, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P y los isótopos radiactivos de Lu) , agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como las de molécula pequeña o las enzimáticamente activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, incluyendo los fragmentos y/o las variantes de las mismas.

[0130] Un "agente inhibidor del crecimiento" se refiere, en el contexto de la presente memoria descriptiva, a un compuesto o composición que inhibe el crecimiento de una célula in vítro y/o in vivo. Asi, el agente inhibidor del crecimiento puede reducir significativamente el porcentaje de células en la fase S. Ejemplos de agentes inhibidores del crecimiento serian los agentes que bloquean la progresión del ciclo celular (en un punto distinto de la fase S), como los agentes que inducen la detención de la Gl y la fase M. Entre los bloqueadores clásicos de la fase M se incluyen las vincas (vincristina y vinblastina) , TAXOL® y los inhibidores de la topo II como la doxorrubicina , la epirrubicina , la daunorrubicina , el etopósido y la bleomicina. Dichos agentes que detienen la Gl también se desbordan en la detención de la fase S, por ejemplo, los agentes de alquilacionn del ADN como el tamoxifeno, la prednisona, la dacarbacina, la mecloretamina , el cisplatino, el metotrexato, el 5-fluorouracilo y la ara-C. Puede encontrarse más información al respecto en The Molecular Basis of Cáncer, Mendelsohn e Israel, eds . , capitulo 1, titulado "Cell cycle regulation, oncogenes, and antineoplastic drugs", por Murakami y col., (WB Saunders: Philadelphia , 1995), especialmente la página 13.

[0131] Un "agente quimoterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos serían los agentes alquilantes como la tiotepa y la ciclofosfamida (CYTOXAN®) ; los sulfonatos de alquilo como el busulfán, el improsulfán y el piposulfán; las aziridinas como la benzodopa, la carbocuona, la meturedopa y la uredopa; las etiloniminas y met ilamelaminas , incluyendo la altretamina, la triet ilenomelamina , la trietilenofosforamida, la trietilenot iofosforamida y la trimet ilolomelamina ; los acetogeninos (en especial, el bullatacin y la bullatacinona) ; el delta-9-tetrahidrocanabinol (dronabinol, MARINOL®) ; la beta-lapachona ; el lapachol; las colchicinas; el ácido betulinico, una camptotecina (incluyendo el topotecán análogo sintético (HYCAMTIN®) , el CPT-11 (irinotecán, CA PTOSAR®) , la acet ilcamptotecina , la escopolect ina y la 9-aminocamptotecina) ; la briostat ina ; la callistatina ; el CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adocelesina, carcelesina y bicelesina) ; la podofilotoxina; el ácido podofilinico; la teniposida; las criptoficinas (particularmente la criptoficina 1 y la 8); la dolastatina; la duocarmicina (incluyendo los análogos sintéticos K -2189 y CB1-TM1); la eleuterobina ; la pancratistatina ; una sarcodict ina ; la espongistatina ; la mostaza nitrogenada como el clorambucil, la clornafacina, la colofosfamida , la estramust ina , la ifosfamida, la mecloretamina , el clorhidrato de óxido de mecloretamina, el melfalán, la novembichina, la fenesterina, la prednimustina , la trofosfamida y la uramustina; las nitrosureas como la carmustina, la clorozotocina , la fotemustina, la lomustina, la nimustina y la ranimustina ; los antibióticos como los de enedina (por ejemplo, la calicheamicina, especialmente la calicheamicina gamma II y la omega II (véase, por ejemplo, Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); la dinemicina, incluyendo la dinemicina A; una esperamicina ; asi como el cromóforo de neocarcinostatina y los cromóforos de antibióticos de enedina cromoproteina relacionados, las aclacinomisinas , la actinomicina, la autramicina, la azaserina, las bleomicinas, la cactinomicina , la carabicina, la carminomicina , la carcinofilina, las cromomicinas , la dactinomicina , la daunorrubicina , la detorrubicina , la 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, la doxorrubicina (incluido ADRIAMYCIN®, la morfolino-doxorrubicina , la cianomorfolino-doxorrubicina, la 2-pirrolino-doxorrubicina, la inyección de liposomas de doxorrubicina HC1 (DOXIL®) y la desoxidoxorrubicina) , la epirrubicina, la esorrubicina , la idarrubicina , la marcelomicina , las mitomicinas como la mitomicina C, el ácido micofenólico, la nogalamicina , las olivomicinas , la peplomicina, la potfiromicina, la puromicina, la quelamicina, la rodorrubicina , la estreptonigrina , la estreptozocina , la tubercidina, el ubenimex, la cinostatina y la zorrubicina ; los antimetabolitos como el metotrexato, la gemcitabina (GEMZAR®) , el tegafur (UFTORAL®) , la capecitabina (XELODA®) , una epotilona y el 5-fluouracilo (5-FU) ; los análogos del ácido fólico como la denopterina, el metotrexato, la teropterina y el trimetrexato ; los análogos de la purina como la fludarabina, la 6-mercaptopurina , la tiamiprina y la tioguanina; los análogos de la pirimidina como la ancitabina, la azacitidina, la 6-azauridina , el carmofur, la citarabina, la didesoxiuridina , la doxifluridina, la enocitabina y la floxuridina; los antiadrenales como la aminoglutetimida, el mitotano y el trilostano; un reabastecedor del ácido fólico como el ácido folinico; la aceglatona; el glucósido aldofosfamida ; el ácido aminolevulínico; el eniluracilo; la amsacrina; el bestrabucil; el bisantreno; el edatraxato; la defofamina; la demecolcina; la diaziquona; la elfornitina; el acetato de eliptinio; el etoglúcido; el nitrato de galio; la hidroxiurea; el lentinán; la lonidainina ; los maitansinoides como la maitansina y las ansamitocinas ; la mitoguazona ; la mitoxantrona ; el mopidanmol; la nitraerina; el pentostatin; el fenamet; la pirarrubicina ; la losoxantrona ; la 2-et ilhidracida ; la procarbacina; el complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; el razoxano; la rizoxina; el sizofirán; el espirogermanio ; el ácido tenuazónico; la triaciquona ; la 2 , 2 ' , 2 "-triclorotriet ilamina ; los tricotecenos (especialmente la toxina T-2, el verracurín A, el roridin A y la anguidina) ; el uretano; la vindesina (ELDISINE®, FILDESIN®) ; la dacarbacina ; la manomustina ; el mitobronitol ; el mitolactol; el pipobromán; la gacitosina; la arabinosida ("Ara-C") ; la tiotepa; los taxoides, por ejemplo, el paclitaxel (TAXOL®) , la formulación de nanoparticulas de paclitaxel mediante ingeniería de albúmina (ABRAXANE™) y el doxetaxel (TAXOTERE®) ; el clorambucil ; la 6-t ioguanina ; la mercaptopurina ; el metatrexato ; los análogos de platino o los basados en platino como el cisplatino y el carboplatino ; la vinblastina (VELBAN®) ; el platino; el etopósido (VP-16) ; la ifosfamida; la mitoxantrona ; la vincristina (ONCOVIN®) ; el oxaliplatino; la leucovovina ; la vinorrelbina (NAVELBINE®) ; la novantrona; el edatrexato; la daunomicina ; la aminopterina; el ibandronato ; el inhibidor RFS 2000 de la topoisomerasa ; la difluomet ilornit ina (DMFO); los retinoides como el ácido retinoico y las sales, los ácidos o los derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de las sustancias anteriores, así como las combinaciones de una o más de las sustancias anteriores como la CHOP, la abreviatura de una terapia combinada de ciclofosfamida, doxorrubicina , vincristina y prednisolona, y la FOLFOX, la abreviatura de un régimen de tratamiento con oxaliplatino (ELOXATIN™) combinado con 5-FU y leucovovina.

[0132] También se incluyen en esta definición los agentes antihormonales que regulan, reducen, bloquean o inhiben los efectos de las hormonas que pueden fomentar el crecimiento del cáncer y se presentan a menudo en la forma de un tratamiento sistémico o que afecta a todo el cuerpo. Estos agentes podrán ser hormonas. Entre los ejemplos se incluyen los ant iestrógenos y los moduladores selectivos de receptores de estrógenos (SERM) , incluyendo, por ejemplo, el tamoxifeno (también el tamoxifeno NOLVADEX®) , el raloxifeno (EVISTA®) , el droloxifeno, el 4-hidroxitamoxifeno, el trioxifeno, el keoxifeno, el LY117018, la onapristona y el toremifeno ( FARESTON®) ; las ant iprogesteronas ; los reguladores a la baja de los receptores de estrógenos (ERD) ; los agentes que oprimen o cierran los ovarios, por ejemplo, los agonistas de la hormona liberadora de la hormona luteinizante (LHRH) como el acetato de leuprolida (LUPRON® y ELIGARD®) , el acetato de goserelina, el acetato de buserelina y la tripterelina ; otros ant iandrógenos como la flutamida, la nilutamida y la bicalutamida y los inhibidores de la aromatasa que inhiben el enzima aromatasa, encargado de regular la producción de estrógenos en las glándulas adrenales, como por ejemplo, las 4 ( 5 ) -imidazolas , la aminoglutetimida, el acetato de megestrol (MEGASE®) , el exemestano (AROMASIN®) , la formestania, la fadrozola, la vorozola (RIVISOR®) , la letrozola (FEMARA®) y la anastrozola (ARIMIDEX®) . Además, esta definición de agentes quimioterapéut icos incluye a los bisfosfonatos como el clodronato (por ejemplo, BONEFOS® u OSTAC®) , el etidronato (DIDROCAL®) , el NE-58095, el ácido zoledrónico/ zoledronato (ZOMETA®), el alendronato (FOSAMAX®), el pamidronato (AREDIA®) , el tiludronato (SKELID®) o el risedronato (ACTONEL®) , asi como la troxacitabina (un análogo de la citosina nucleósida 1 , 3-dioxolano) ; los oligonucleótidos antisentido, en particular los que inhiben la expresión génica en las rutas de señalización implicadas en la proliferación celular aberrante, como, por ejemplo, el PKC-alfa, el Raf, el H-Ras y el receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGF-R) ; las vacunas como THERATOPE® y las que se aplican para terapias génicas, por ejemplo, la ALLOVECTIN®, la LEUVECTIN® y la VAXID®; el inhibidor de la topoisomerasa 1 (por ejemplo, LURTOTECAN®) ; el rmRH (por ejemplo, ABARELIX®) ; el ditosilato de lapatiniba (un inhibidor de molécula pequeña doble tirosina quinasa del ErbB-2 y el EGFR conocido también como G 572016) ; inhibidores COX-2 como el celecoxib (CELEBREX®; 4 - ( 5- ( 4 -metilfenilo) -3-(trifluometilo) -lH-pirazol-l-il ) benzenesulfonamida ; y las sales, los ácidos o los derivados farmacéuticamente aceptables de cualquiera de las sustancias anteriores.

[0133] El término "citoquina" es un término genérico para aquellas proteínas, liberadas por una población de células, que actúan sobre otra célula como mediadores intercelulares. Ejemplos de tales citoquinas serían las linfoquinas, las monoquinas y las hormonas polipept ídicas tradicionales. Entre las citoquinas se incluyen las hormonas del crecimiento como la hormona humana del crecimiento, la hormona humana del crecimiento N-metionilo y la hormona bovina del crecimiento, la hormona parat iroidea , la tiroxina, la insulina, la proinsulina, la relaxina, la prorrelaxina , las hormonas glicoproteicas como la hormona estimuladora del folículo (FSH), la hormona estimuladora de la tiroides (TSH) y la hormona luteinizante (LH) , el factor de crecimiento hepático, el factor de crecimiento fibroblástico, la prolactina, el lactógeno placentario, los factores alfa y beta de necrosis tumoral, las sustancias de inhibición mulleriana, los péptidos asociados a la gonadotropina de los ratones, la inhibina, la activina, los factores de crecimiento endotelial vascular (p.ej., VEGF, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D Y VEGF-E) ; el factor de crecimiento derivado de la placenta (PIGF) ; los factores de crecimiento derivados de las plaquetas (PDGF, p.ej., PDGFA, PDGFB, PDGFC Y PDGFD) , la integrina, la trombopoietina (TPO) , los factores de crecimiento nervioso como el NGF-alfa, el factor de crecimiento plaquetario, los factores de crecimiento tumoral (TGF) como el TGF-alfa y el TGF-beta; los factores -I y -II de crecimiento similar a la insulina, la eritropoietina (EPO) , los factores osteoinduct ivos , los interferones como el interferón-alfa, -beta y -gama, los factores de estimulación colonial (CSF) como el CSF macrófago (M-CSF) , el CSF granulocito macrófago (GM-CSF) y el CSF granulocito (G-CSF) , las interleucinas (IL) como la IL-1, la IL-lalfa, la ILl-beta, la IL-2, la IL-3, la IL-4, la IL-5, la IL-6, la IL-7, la IL-8, la IL-9, la IL-10, la IL-11 y la IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18, IL-19, IL-20-IL-30 ; secretoglobina/uteroglobina ; la oncostatina M (OSM) ; un factor de necrosis tumoral como el TNF-alfa o el TNF-beta; y otros factores polipéptidos incluyendo el LIF y el ligando de kit (KL) . En el contexto de la presente memoria descriptiva, el término citoquina incluye proteínas de fuentes naturales o cultivos de células recombinantes y equivalentes biológicamente activos de las citoquinas con secuencia nativa.

[0134] El término "profármaco", tal como se usa en esta solicitud, se refiere a un precursor o forma derivada de una sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica para células tumorales que el fármaco parental y es capaz de activarse enzimáticamente o convertirse en la forma parental más activa. Véase, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cáncer Chemotherapy" Biochemical Society Transactions , 14, pp. 375-382, 615th Meeting Belfast (1986) y Stella y col., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery," Directed Drug Delivery, Borchardt y col., (ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985) . Los profármacos de esta invención incluyen, entre otros, profármacos con fosfato, profármacos con tiofosfato, profármacos con sulfato, profármacos con péptidos, profármacos modificados con D-aminoácido, profármacos glicosilados , profármacos que contienen beta-lactam, profámacos que contienen fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen fenilacetamida opcionalmente sustituida, profármacos 5-fluorocitosina y otros profármacos 5-fluorouridina que pueden transformarse en el fármaco más activo no citotóxico. Ejemplos de fármacos citotóxicos que pueden ser derivados para obtener un profármaco para su uso en esta invención son los agentes quimioterapéuticos descritos anteriormente.

[0135] Un "factor o agente angiogénico" es un factor de crecimiento que estimula el desarrollo de los vasos sanguíneos, por ejemplo, favorece la angiogénesis , el crecimiento celular endotelial, la estabilidad de los vasos sanguíneos, y/o la vasculogénesis , etc. Por ejemplo, los factores angiogénicos incluyen, entre otros, el VEGF y los miembros de la familia de VEGF, el P1GF, la familia de PDGF, la familia del factor de crecimiento de los fibroblastos (FGF), los ligandos TIE (Angiopoyetinas ) , las efrinas, la ANGPTL3, la ANGPTL4, etc. También incluirían a los factores que aceleran la curación de las heridas, como la hormona del crecimiento, el factor-I de crecimiento (IGF-I) similar a la insulina, el VIGF, el factor de crecimiento de la epidermis (EGF) , el CTGF y los miembros de su familia, y el TGF-a y el TGF-ß. Véase, por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore, Annu . Rev. Physiol., 53:217-39 (1991) ; Streit y Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003); Ferrara y Alitalo, Nature Medicine 5 (12) : 1359-1364 (1999); Tonini y col., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (por ejemplo, Tabla 1, que enumera los factores angiogénicos); y Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) .

[0136] Un "agente antiangiogénico" o "inhibidor angiogénico" es una sustancia de bajo peso molecular, un polinucleótido, un polipéptido, una proteína aislada, una proteína recombinante , un anticuerpo, o conjugados o proteínas de fusión de los mismos, que inhiben la angiogénesis , la vasculogénesis o la permeabilidad vascular no deseada, ya se directa o indirectamente. Por ejemplo, un agente antiangiogénico es un anticuerpo u otro antagonista a un agente angiogéncio tal como se define anteriormente, por ejemplo, anticuerpos anti-VEGF, anticuerpos de receptores VEGF, pequeñas moléculas que bloquean la señalización de los receptores de VEGF (por ejemplo, PTK787/ZK228 , SU6668, SUTENT/SU 11248 (sunitinib malato) , AMG706) . Los agentes ant iangiogénicos también incluyen inhibidores nativos de la angiogénesis, por ejemplo, angiostat ina , endostatina, etc. Véase, por ejemplo, Klagsbrun y D'Amore, Annu . Rev . Physiol., 53:217-39 (1991); Streit y Detmar, Oncogene, 22:3172-3179 (2003) (por ejemplo, la Tabla 3, que enumera las terapias ant iangiogénicas en el melanoma maligno) ; Ferrara y Alitalo, Nature Medicine 5 ( 12 ) : 1359-1364 (1999) ; Tonini y col., Oncogene, 22:6549-6556 (2003) (por ejemplo, la Tabla 2, que enumera factores ant iangiogénicos ) ; y Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) (por ejemplo, la Tabla 1, que enumera antiangiogénicos usados en ensayos clínicos) .

[0137] El término "agente inmunosupresor" , tal como se usa en la presente memoria descriptiva, se refiere a la sustancia que suprime o enmascara el sistema inmunológico del mamífero que se trata en la presente memoria descriptiva. Estos agentes incluirían sustancias que suprimen la producción de citoquina, regulan a la baja o suprimen la autoexpresión de antígenos o enmascaran los antígenos del MHC (complejo principal de histocompat ibilidad) . Ejemplos de estos agentes serían las pirimidinas 2-amino-6-aril-5-sust ituidas (véase la patente de EE.UU. N° 4.665.077); los medicamentos antiinflamatorios no esferoides (NSAIDs) ; el ganciclovir, el tacrolimus, los glucocorticoides como el cortisol o la aldosterona, los agentes antiinflamatorios como un inhibidor de la ciclooxigenasa, un inhibidor de la 5-lipoxigenasa o un antagonista receptor del leucotrieno ; los antagonistas de la purina como la azatioprina o el micofenolato mofetil (MMF) ; los agentes alquilantes como la ciclofosfamida ; la bromocriptina ; el danazol; la dapsona; el glutaraldehído (que enmascara los antígenos del MHC, tal como se describe en la patente de EE.UU. N° 4.120.649) ; los anticuerpos anti-idiotípicos para los antígenos y fragmentos del MHC; la ciclosporina A; los esferoides como los cort icosteroides , los glucocorticosteroides o los análogos a los glucocorticoides, por ejemplo, prednisona, metilprednisolona, y dexametasona ; los inhibidores de la dihidrofolato reductasa como el metotrexato (oral o subcutáneo) ; la hidroxicloroquina ; la sulfasalazina; la leflunoraida ; la citoquina o los anticuerpos receptores de citoquina incluyendo los anticuerpos anti-interferón-alfa, -beta o -gamma, los anticuerpos factor-alfa de necrosis anti-tumoral (infliximab o adalimumab) , la inmunoadhesina anti-TNF-alfa ( etanercept ) , los anticuerpos factor-beta de nectrosis anti-tumoral, los anticuerpos anti-interleucina-2 y anti-receptores de IL-2; los anticuerpos anti-LFA-1, incluyendo los anticuerpos anti-CDlla y anti-CD18; los anticuerpos anti-L3T4; la globulina anti-linfocitos heteróloga; los anticuerpos pan-T, preferentemente los anti-CD3 o anti-CD4/CD4a; un péptido soluble que contenga un dominio de unión a LFA-3 (documento WO 1990/08187 publicado el 26 de julio de 1990); la estreptoquinasa ; el factor de crecimiento transformador-beta (TGF-beta) ; la estreptodornasa; el ARN o ADN del anfitrión; el FK506; el RS-61443; la deoxispergualina ; la rapamicina; el receptor de células T (Cohén y col., patente de EE.UU. N° 5.114.721); los fragmentos del receptor de células T (Offner y col., Science, 251: 430-432 (1991); el documento WO 1990/11294; Ianeway, Nature, 341: 482 (1989); y el documento WO 1991/01133); y los anticuerpos de receptores de células T (Patente europea 340.109) como el T10B9.

[0138] Ejemplos de "medicamentos antiinflamatorios no esteroides" o "NSAID" son el ácido acetilsalicí lico, el ibuprofeno, el naproxeno, la indometacina , la sulindac, la tolmetina, incluyendo sales y derivados de los mismos, etc.

[0139] La palabra "marca" utilizada en la presente memoria descriptiva se refiere a un compuesto o composición detectables que se conjuga directa o indirectamente al polipéptido. La marca puede ser detectable por si misma (por ejemplo, marcas de radioisótopos o marcas fluorescentes) o, en el caso de una marca enzimática, puede catalizar la alteración química de un sustrato de compuestos o composiciones que sea detectable.

[0140] Una molécula de ácido nucleico "aislada" es una molécula de ácido nucleico que se identifica y separa de al menos una molécula contaminante de ácido nucleico con la que se asocia habitualmente en la fuente natural del ácido nucleico del polipéptido. Una molécula de ácido nucleico aislada es distinta de la forma o entorno en los que se encuentra en la naturaleza. Por lo tanto, las moléculas de ácido nucleico aisladas se distinguen de la molécula de ácido nucleico que existe en las células naturales. Sin embargo, una molécula de ácido nucleico aislada incluye una molécula de ácido nucleico contenida en células que habitualmente expresan el polipéptido en el que, por ejemplo, la molécula de ácido nucleico está en una posición cromosómica distinta de la que tiene en las células naturales. Tumores resistentes

[0141] La invención se basa, en parte, en el descubrimiento de reacciones celulares y moleculares que conducen a la resistencia por parte de tumores a un tratamiento para el cáncer que comprenda al menos un antagonista de VEGF. En la presente memoria descriptiva se muestra una correlación entre la atracción de células hematopoyéticas derivadas de la médula ósea y el desarrollo de resistencia por parte del tumor al tratamiento anti-VEGF.

[0142] El sistema inmunológico incluye células hematopoyéticas , que incluyen eritrocitos, linfocitos y células de linaje mieloide. Todos estos tipos de células surjen de las mismas células madre pluripotentes . En un adulto, la hematopoyesis tiene lugar en la médula ósea, en la que las células madre se dividen raramente para producir más células madre (autorenovacion) y diversas células progenitoras comprometidas. Las células progenitoras comprometidas son las que producirán células hematopoyéticas en respuesta a factores reguladores específicos. Estos factores reguladores son producidos principalmente por las células estromales circundantes y en otros tejidos e incluyen, por ejemplo, factores de estimulación colonial (CSF) , eritropoyetina (EPO) , interleucina 3 (IL3), CSF granulocito/macrófago (GM-CSF) , CSF granulocito (G-CSF) , CSF macrófago (M-CSF) y el factor STEEL. Se han propuesto alteraciones en los sistemas inmunológicos en pacientes con cáncer para contribuir a la incapacidad o capacidad reducida del sistema inmunológico para atacar eficazmente al cáncer, lo que permite una progresión del crecimiento del tumor. Véase, por ejemplo, Gabrilovich y col., Antibodies to Vascular Endothelial Growth Factor Enhances the Efficacy of Cáncer Immunotherapy by Improving Endogenous Dendritic Cell Function, Clinical Cáncer Research 5:2963-2970 (1999).

[0143] Los factores producidos por tumores pueden producir una mielopoyesis anormal y conducir a la supresión de la respuesta inmunológica al tumor. Véase, por ejemplo, Kusmartsev y Gabrilovich, Immature myeloid cells and cancer-associated immune suppression. Caner Immunol Immunothera . 51:293-298 (2002). La invención brinda factores específicos de células resistentes de tumores y de células CDllb+Grl+ que pueden verse implicadas en la resistencia del tumor al tratamiento con antagonista de VEGF. Por ejemplo, el fraccionamiento con sal de tumor resistente también produjo como resultado factores que brindaban resistencia directa o indirectamente. Véase, por ejemplo, la Fig. 8 y el Ejemplo 2 de la presente memoria descriptiva. La movilización y activación de células mieloides CDllb+Grl+ puede representar dos etapas en el desarrollo de la resistencia al tratamiento anti-VEGF.

[0144] La invención también ofrece métodos de tratamiento combinado y composiciones que utilizan agentes que actúan sobre las células mieloides y agentes quimioterapéuticos , tal como se describe en la presente memoria descriptiva, con anti-VEGF. Dichos tratamientos combinados pueden inhibir la angiogénesis y el crecimiento tumorales y/o retrasar el inicio de la resistencia anti-VEGF. Células CDllb+Grl+

[0145] La familia CD11/CD18 está relacionada estructural y genéticamente a la familia de integrinas mayor integrada por receptores que modular las interacciones de adhesión celular, que incluyen embriogénesis , adhesión a sustratos extracelulares y la diferenciación celular (Hynes, R. O., Cell 48: 549-554 (1987); Kishimoto y col., Adv. Immunol. 46: 149-182 (1989); Kishimoto y col., Cell 48: 681-690 (1987); y Ruoslahti y col., Science 238: 491-497 (1987)). Las integrinas son una clase de heterodimeros que abarcan membranas y que comprenden una subunidad a en asociaciones no covalentes con una subunidad ß. Las subunidades ß son generalmente capaces de asociarse con más de una subuniad a y los heterodimeros que comparten una subunidad ß en común se han clasificado como subfamilias dentro de la población de integrinas (Larson y Springer, Structure and function of leukocyte integrins, Immunol. Rev. 114: 181-217 (1990)) .

[0146] Se ha descubierto que las moléculas de integrina de la familia CD11/CD18, y sus ligandos celulares, median una variedad de interacciones entre células, especialmente en la inflamación. Se ha demostrado que estas proteínas son esenciales para las funciones de adhesión en el sistema inmunológico (Kishimoto y col., Adv. Immunol. 46: 149-182 (1989)) . Se ha demostrado que los anticuerpos monoclonales a LFA-1 bloquean la adhesión de los leucocitos a las células endoteliales (Dustin y col., J. Cell. Biol. 107: 321-331 (1988) ; Smith y col., J. Clin. Invest. 83: 2008-2017 (1989)) y que inhiben la activación de células T (Kuypers y col., Res. Immunol., 140: 461 (1989)), la formación de conjugados requerida para destruir CTL específia de antígeno (Kishimoto y col., Adv. Immunol. 46: 149-182 (1989)), la proliferación de células T (Davignon y col., J. Immunol. 127: 590-595 (1981)) y la destrucción de células NK (Krensky y col., J. Immunol. 131: 611-616 (1983)) .

[0147] La familia CD11/CD18 de moléculas receptoras de adhesión comprende cuatro glicoproteians de superficie celular altamente relacionadas: LFA-1 (CDlla/CD18 ) , Mac-1 (CDllb/CD18) , pl50,95 (CDllc/CDl8) y (CDlld/CD18) . Cada uno de estoy heterodimeros tiene una cadena a única (CSlla, b, c o d) y la cadena ß no variante (CD18) . Las integrinas CD18 que se encuentran en los leucocitos pueden unirse a una molécula de adhesión intercelular-1 (ICAM-1), que se expresa en las células del endotelio vascular y otras, lo que produce como resultado la mediación de la adhesión de leucocitos y la migración trnasendotelial. El LFA-1 está presente en la superficie de todos los leucocitos maduros, excepto en un subgrupo de macrófagos, y se considera como la integrina linfoide principal. La expression de Mac-1, pl50,95 y CDlld/CD18 se limita principalmente a células de linaje mieloide (que incluyen neutrófilos, monocitos, macrófagos y células madre) . Las CDllb+Grl+ son marcadores que también se encuentran en las células mieloides. Se ha sugerido que el equilibrio entre las células mieloides maduras e inmaduras es un indicador del cáncer y que, en el crecimiento progresivo de tumores, el equilibrio cambia a favor de las células mieloides inmaduras, con una disminución de la función de las células dendriticas. Véase, por ejemplo, Kusmartsev y Gabrilovich, Immature myeloid cells and cancer-associated immune suppression. Caner Immunol Immunothera . 51:293-298 (2002) . El cambio del equilibrio, por ejemplo, mediante la diferenciación de las células mieloides inmaduras en ratones con tumores, mejoró el efecto de las vacunas contra el cáncer. Véase, por ejemplo, All- trans-Retinoic Acid Eliminates Immature Myeloid Cells from Tumor-bearing Mice and Improves the Effect of Vaccination. Cáncer Research 63:4441-4449 (2003) . También se observó que en pacientes con cáncer, el nivel de VEGF en la circulación se correlacionaba con un aumento en la cantidad de células mieloides inmaduras. Véase Almand y col., Clinical significance of detective dendritic cells differentiation in cáncer. Clin. Cáncer Res. 6:1755 (2000) .

[0148] En la presente memoria descriptiva se demuestra que la movilización y activación de las células mieloides CDllb+Grl+ produce como resultado la resistencia al tratamiento anti-VEGF. También se demuestra que las células mieloides CDllb+Grl+ derivadas de médula ósea aisladas de ratones con tumores pueden otorgar resistencia en los tumores al tratamiento anti-VEGF y que los medios condicionados de tumores resistentes al anti-VEGF (pero no tumores sensibles al anti-VEGF) estimulan la migración de células CDllb+Grl+. Diagnóstico

[0149] La invención también proporciona métodos y composiciones para el diagnóstico de un tumor resistente al tratamiento con antagonista del VEGF. En algunas formas de realización de la invención, los métodos de la invención comparan los niveles de expresión de una o más CDllb+Gtl+ o ácidos nucleicos de tumores resistentes en una población celular de referencia y prueba. La información sobre la secuencia desarrollada en la presente memoria descriptiva, junto a los métodos de detección de ácidos nucleicos conocidos en la materia, permite la detección y comparación de los diferentes transcritos revelados. En otra forma de realización, los métodos de la invención comparan el tamaño del bazo de un sujeto con un tumor resistente con el tamaño del bazo de referencia. En una forma de realización, el tamaño del bazo de referencia corresponde al tamaño del bazo del sujeto cuando el sujeto no presentaba ningún tumor o cuando el sujeto era sensible al tratamiento con antagonista del VEGF. En otra forma de realización, el tamaño del bazo de referencia corresponde a un tamaño de bazo promedio de otros sujetos sin tumores o al tamaño de bazo promedio de otros sujetos con tumores sensibles. El tamaño del bazo puede medirse mediante métodos conocidos en la materia, incluyendo, entre otros, técnicas de diagnóstico por imágenes no invasivas tales como ultrasonido, ecografia, ecografia unidimensional (US) , tomografia computarizada (TC) e imágenes por resonancia magnética. Véase, por ejemplo, Yang y col., West J Med.; 155(1) : 47-52 (1991) . En otra forma de realización, los métodos de la invención comparan la superficie vascular de un tumor en un sujeto con un tumor resistente con una superficie vascular de referencia.

[0150] En algunas formas de realización de la invención, la invención incluye el suministro de una población celular de prueba que incluye al menos una célula capaz de expresar una o más de una molécula que es un ácido nucleico que codifica una proteina o que es la proteina, donde la proteina es GR1, una elastasa leucocitaria , MCP-1, MIP-1 alfa, una URCGP, una DRCGP, una URRTP y/o una DRRTP. El término "Capaz de expresar" se refiere a que el gen se encuentra presente en una forma intacta en la célula y puede expresarse. Después se detecta la expresión de una, alguna o todas las secuencias, en caso de existir alguna, y se mide. Mediante la información sobre la secuencia que proporcionan las entradas de bases de datos para las secuencias conocidas o el fabricante del chip, las secuencias se pueden detectar (en caso de expresarse) y medir mediante técnicas bien conocidas por cualquier experto en la materia. Por ejemplo, las secuencias dentro de las entradas de bases de datos de secuencias correspondientes a los ácidos nucleicos que codifican una Grl, una elastasa leucocitaria , MCP-1, MIP-1 alfa, una URCGP, una DRCGP, una URRTP o una DRRTP, pueden utilizarse para construir sondas para la detección de las correspondientes secuencias de ARN en, por ejemplo, análisis de hibridación por transferencia Northern o métodos que amplían específica y preferentemente de manera cuantitativa secuencias de ácidos nucleicos específicos. Como otro ejemplo, las secuencias pueden utilizarse para construir cebadores para amplificar específicamente los ácidos nucleicos que codifican secuencias de Grl, elastasa leucocitaria, MCP-1, MIP-1 alfa, URCGP, DRCGP, URRTP o DRRTP en, por ejemplo, métodos de detección basados en la amplificación tal como la reacción en cadena de la polimerasa basada en la transcripción inversa. Cuando las alteraciones en la expresión génica se asocian con la amplificación o eliminación de genes, se pueden realizar comparaciones de secuencias en poblaciones de prueba y referencia mediante la comparación de cantidades relativas de las secuencias de ADN examinadas en las poblaciones celulares de prueba y referencia .

[0151] La expresión también puede medirse a nivel de proteina, es decir, mediante la medición de los niveles de polipéptidos codificados por los productos génicos que se describen en la presente memoria descriptiva. Tales métodos son bien conocidos en la materia e incluyen, por ejemplo, inmunoensayos basados en anticuerpos a proteínas codificadas por los genes. A continuación, el nivel de expresión de una o más de las secuencias de Grl, elastasa leucocitaria , MCP-1, MIP-1 alfa, URCGP, DRCGP, URRTP o DRRTP en la población celular de prueba se compara con los niveles de expresión de las secuencias en una o más células de una población celular de referencia. La expresión de secuencias en poblaciones celulares de prueba y control puede compararse mediante cualquier método reconocido en la materia para la comparación de la expresión de secuencias de ácidos nucleicos. Por ejemplo, la expresión puede compararse mediante los métodos GENECALLING . RTM . tal como se describen en la patente de Estados Unidos N° 5.871.697 y en Shimkets y col., Nat. Biotechnol. 17:798-803. En algunas formas de realización de la invención, se mide la expresión de una, dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, once o más, doce o más, trece o más, catorce o más, quince o más, 20 o más, 25 o más o todas las secuencias que codifican la Grl, la elastasa leucocitaria, MCP-1, MIP-1 alfa, URCGP, DRCGP, URRTP y/o DRRTP.

[0152] La población celular de referencia incluye una o más células capaces de expresar las secuencias medidas de Grl, elastasa leucocitaria, MCP-1, MIP-1 alfa, URCGP, DRCGP, URRTP o DRRTP y para lo cual el parámetro comparado es conocido, por ejemplo, un tumor sensible a un antagonista del VEGF. En determinadas formas de realización de la invención, la secuencia de Grl, elastasa leucocitaria, MCP-1, MIP-1 alfa, URCGP, DRCGP, URRTP o DRRTP en una población celular de prueba se considera comparable en cuanto al nivel de expresión con el nivel de expresión de la secuencia de Grl, elastasa leucocitaria, MCP-1, MIP-1 alfa, URCGP, DRCGP, URRTP o DRRTP en la población celular de referencia si su nivel de expresión varia dentro de un factor menor o igual a 2,0 veces del nivel del transcrito de Grl, elastasa leucocitaria, MCP-1, MIP-1 alfa, URCGP, DRCGP, URRTP o DRRTP en la población celular de referencia. En diversas formas de realización, una secuencia de Grl, elastasa leucocitaria, URCGP, DRCGP, URRTP o DRRTP en una población celular de prueba puede considerarse alterada en cuanto a niveles de expresión si su nivel de expresión varia con respecto a la población celular de referencia en más de 2,0 veces del nivel de expresión de la secuencia de Grl, elastasa leucocitaria, MCP-1, MIP-1 alfa, URCGP, DRCGP, URRTP o DRRTP correspondiente en la población celular de referencia.

[0153] Alternativamente, se puede realizar una comparación de secuencias expresadas diferencialmente entre una población celular de prueba y una población celular de referencia con respecto a un ácido nucleico de control cuya expresión es independiente del parámetro o condición que se está midiendo. Se pueden utilizar los niveles de expresión del ácido nucleico de control en los ácidos nucleicos de prueba y de referencia para normalizar los niveles de señal en las poblaciones comparadas. Cualquier experto en la materia puede determinar fácilmente los ácidos nucleicos de control adecuados .

[0154] La población celular de prueba puede contener cualquier cantidad de células, es decir, uno o más células, y puede suministrarse in vi tro, in vivo o ex vivo.

[0155] En determinadas formas de realización, las células en la población celular de referencia se derivan de un tipo de tejido lo más similar posible a la célula de prueba, por ejemplo, la célula tumoral. En algunas formas de realización, la célula de control se deriva del mismo sujeto que la célula de prueba, por ejemplo, de una región proximal a la región de origen de la célula de prueba o de un momento especifico cuando el sujeto era sensible al tratamiento con antagonista del VEGF. En una forma de realización de la invención, la población celular de referencia se deriva de muchas células. Por ejemplo, la población celular de referencia puede ser una base de datos de modelos de expresión de células probadas anteriormente para las que se conoce tumores sensibles al tratamiento con antagonista del VEGF. Evaluación de la sensibilidad de los tumores

[0156] La selección de células mieloides CDllb+GRl+ y la expresión de algunas de las secuencias de URCGP, DRCGP, URRTP o DRRTP que se describen en la presente memoria descriptiva se correlacionan con los tumores resistentes al tratamiento con antagonista del VEGF. Por lo tanto, en un aspecto, la invención proporciona un método de evaluación de la sensibilidad al antagonista del VEGF en un sujeto, donde la frase "sensibilidad al antagonista del VEGF" se refiere a la capacidad de tratar un tumor con anti-VEGF. En una forma de realización de la invención, un método incluye el suministro de una o más poblaciones celulares de prueba del sujeto que incluye células capaces de expresar una o más secuencias de ácidos nucleicos homologas a los ácidos nucleicos que codifican una URCGP, DRCGP, URRTP o DRRTP. La expresión de las secuencias se compara con una población celular de referencia. Se puede utilizar cualquier población celular de referencia siempre que se conozca el estado de sensibilidad al antagonista del VEGF de las células en la población celular de referencia. Se puede realizar una comparación de muestras de prueba y de referencia medidas simultáneamente o en distintos momentos. Un ejemplo de esta última opción es el uso de la información compilada sobre la expresión, por ejemplo, una base de datos de secuencias que recoge información sobre los niveles de expresión de secuencias conocidas en células cuyo estado de sensibilidad ya se conoce. En determinadas formas de realización de la invención, la población celular de referencia está enriquecida por células mieloides CDllb+Grl+. En algunas formas de realización de la invención, la población celular de referencia se enriquece de células tumorales. Grupos de diagnósticos o marcadores

[0157] La invención brinda además grupos de marcadores para identificar los tumores resistentes. En determinadas formas de realización, estos grupos de marcadores se suministran en un kit para evaluar la sensibilidad o resistencia del tumor al tratamiento con antagonista del VEGF. Por ejemplo, un grupo de marcadores puede incluir dos o más, tres o más, cuatro o más, cinco o más, seis o más, siete o más, ocho o más, nueve o más, diez o más, doce o más, trece o más, catorce o más, quince o más, veinte o más o todo el grupo de moléculas. La molécula es un ácido nucleico que codifica una proteina o una proteina con la expresión y/o actividad alterada, y se selecciona de entre los siguientes: Notch2, DMD8, MCP-1, ITGB7, G-CSF, IL-8R, MIP2, MSCA, GM-CSF, IL-1R, Meg-SF, HSP1A, IL-1R, G-CSFR, IL10-R1, Erb-2,1, Caveolina-3, Semcap3, INTG4, THBSP-4, ErbB3, JA , Eng, JAM, Eng, JAM-2, Pecaml, Tlr3, elastasa leucocitaria , CD14, expi, I1-13R, LDLR, TLR-1, RLF, Endo-Lip, SOCS13, FGF13, IL-4R, THBS1, Crea7, Acuaporina-1 , SCF38 , APOE, FABP, IL-11R, IL-1RII, IFN T 1, TNFRSF18, WNT5A, membrana transportadora secretora 1, HSP86, EGFR, EphRB2, GPCR25, HGF, Angiopoyetina-simil 6, Eph-RA7, Semaforina Vlb, Neurotrofina 5, Claudin-18, MDC15, ECM, ADAMTS7B, NCAM-140, Fibronectina tipo III, WIP, CD74, ICAM-2, Jaggedl, ltga4, ITGB7, TGF-BII-R, TGFb IEP, Smad4 , B PRlA, CD83, Dectina-1, CD48, E-selectina, IL-15, Inhibidor de señales de citoquinas 4, Cytor4, CX3CR1, IGF2, HSP9A, FGF18, ELM1, Ledgfa, receptor scavenger tipo A, lectina tipo C de macrófagos, Pigr3, SRT-1 de macrófagos, receptor emparejado de proteina G, ScyA7, IL-1R2, proteina inducible IL-1, IL-lbeta, ILIX Precuror, TGF-B, FIZZ1, Wfsl, TP 14A, EMAP, SULF-2, Matriz extracelular 2, CTFG, TFPI, XCP2 , Ramp 2, ROR-alfa, Efrina Bl, SPARC-simil 1 y Semaforina A. En una forma de realización de la invención, se suministra un anticuerpo que detecta la proteina. En una forma de realización, las moléculas se derivan de las células CDllb+Grl+ e incluyen, por ejemplo, IL-13R, TLR-1, Endo-Lip, FGF13, IL-4R, THBS1 y Crea7. En otra forma de realización, las moléculas se derivan de tumores resistentes e incluyen, por ejemplo, MSCA, MIP2, IL-8R, G-CSF, IL10-R2, THBSP-4 y JAM-2. Moduladores y sus usos

[0158] Los moduladores del VEGF, Grl, la elastasa leucocitaria, MCP-1, MIP-1 alfa, CDllb, CD18, las URCGP, DRCGP, URRTP y DRTRP son moléculas que modulan la actividad de estas proteínas, por ejemplo, los agonistas y antagonistas. El término "agonista" se refiere a los análogos de péptidos o no péptidos de la proteína de la invención y a los anticuerpos que unen específicamente dichas proteínas de la invención, siempre que sean capaces de proporcionar una señal agonista. El término "agonista" se define en el contexto del papel biológico de la proteina. En determinadas formas de realización, los agonistas poseen las actividades biológicas de una proteina nativa de la invención, por ejemplo, para el VEGF. El término "antagonista" se refiere a las moléculas que son capaces de inhibir la actividad biológica de una proteina de la invención. Los antagonistas pueden evaluarse, por ejemplo, mediante la inhibición de la actividad de las proteínas. Usos terapéuticos

[0159] De acuerdo con la invención, se considera que pueden utilizarse las combinaciones de los moduladores incluyendo un antagonista del VEGF, los agentes reductores de células mieloides y otros agentes terapéuticos para tratar diversos neoplasmas o procesos no neoplásicos. En una forma de realización, los moduladores, como por ejemplo, los antagonistas del VEGF, los agentes reductores de células mieloides, los antagonistas de las URCGP y URRTP ("antagonistas de la invención") se utilizan en la inhibición de las células cancerígenas o el crecimiento tumoral de tumores resistentes. En determinadas formas de realización de la invención, los moduladores, como por ejemplo, los agonistas de las DRCGP y DRRTP ("agonistas de la invención") se utilizan para inhibir las células cancerígenas o el crecimiento tumoral. De acuerdo con la invención, se considera que los antagonistas de la invención también pueden utilizarse para inhibir la metástasis de un tumor. En determinadas formas de realización, pueden administrarse uno o más agentes antineoplásicos con los antagonistas y/o agonistas de la invención para inhibir las células cancerígenas o el crecimiento tumoral. Véase también el apartado de la presente memoria descriptiva titulado Terapias combinadas .

[0160] Los ejemplos de trastornos neoplásicos que pueden tratarse incluyen, entre otros, aquellos descritos en la presente memoria descriptiva bajo los términos "cáncer" y "cancerígeno". Los procesos no neoplásicos sensibles al tratamiento con los antagonistas de la invención incluyen, entre otros, por ejemplo, hipertrofia aberrante o no deseada, artritis, artritis reumatoide (AR) , psoriasis, placas psoriáticas, sarcoidosis, ateroesclerosis, placas ateroesclerót icas , edema consecuencia de un infarto de miocardio, retinopatía diabética y otras retinopatías proliferat ivas , incluida retinopatía de premadurez, fibroplasia retrolental, glaucoma neovascular, degeneración macular asociada a la edad, edema macular diabético, neovascularización corneal, neovascularización de trasplante de córnea, rechazo de trasplante de córnea, neovascularización retiniana/del coroides, neovascularización del ángulo (rubeosis), enfermedad neovascular ocular, reestenosis vascular, malformaciones arterivenosas (MAV) , meningioma, hemangioma, angiofibroma, hiperplasias de tiroides (incluida enfermedad de Grave) , trasplante de córnea y otros tejidos, inflamación crónica, inflamación pulmonar, lesión pulmonar aguda/sindrome de distrés respiratorio del adulto, sepsis, hipertensión pulmonar primaria, efusiones pulmonares malignas, edema cerebral (por ejemplo, asociado a infarto cerebral/traumatismo craneal cerrado/traumatismo), inflamación sinovial, formación de paño en AR, miositis osificante, formación osea hipertrófica, osteoartritis (OA) , ascitis refractaria, enfermedad de ovario poliquistico, endometriosis , enfermedades en el tercer espacio de fluido (pancreatitis, síndrome compartimental , quemaduras, enfermedad intestinal) , fibroides uterinos, parto prematuro, inflamación crónica como enfermedad intestinal inflamatoria (enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa) , rechazo de trasplante renal, enfermedad intestinal inflamatoria, síndrome nefrítico, crecimiento de masa tisular anómala o no deseada (no cáncer) , obesidad, crecimiento de la masa tisular adiposa, articulaciones hemofílicas, cicatrices hipertróficas, inhibición del crecimiento del cabello, síndrome de Osler-Weber, granuloma piogénico, fibroplasias retrolentales , escleroderma, tracoma, adherencias vasculares, sinovitis, dermatitis, preclampsia, ascitis, efusión pericárdica (como la asociada a pericarditis) y efusión pleural . Terapias combinada

[0161] Como se indicó anteriormente, la invención brinda terapias combinadas en las que se administra un antagonista del VEGF en combinación con otra terapia. Por ejemplo, se administra un antagonista del VEGF en combinación con un agente o antagonista diferente de la invención (y/o agonista de la invención) para tratar un tumor resistente al tratamiento anti-VEGF. En determinadas formas de realización, agentes adicionales tales como los agentes reductores de células mieloides, los agentes ant ineoplásicos o terapéuticos, los agentes ant iangiogénicos o tratamientos antineovascularizantes también pueden administrarse en combinación con el anti-VEGF y un antagonista diferente de la invención para tratar diversos procesos neoplásicos o no neoplásicos. En una forma de realización, el proceso neoplásico o no neoplásico se caracteriza por un trastorno patológico asociado a un angiogénesis anómala o no deseada que es resistente al tratamiento con antagonista del VEGF. Los antagonistas de la invención pueden administrarse en serie o en combinación con otro agente que es eficaz para estos fines, ya sea en la misma composición o en composiciones separadas. De manera alternativa o adicional, se pueden administrar múltiples antagonistas, agentes y/o agonistas de la invención.

[0162] La administración del antagonista y/o de los agentes de la invención tales como los agentes reductores de células mieloides puede efectuarse simultáneamente, por ejemplo, como una composición única o como dos o más composiciones distintas mediante la misma vía de administración o vías de administración diferentes. Otra posibilidad, que se puede combinar con lo anterior, es la administración secuencial, en cualquier orden. En determinadas formas de realización, pueden transcurrir intervalos de tiempo que oscilen de minutos a días, semanas o meses entre la administración de las dos o más composiciones. Por ejemplo, primero se puede administrar el antagonista del VEGF, seguido de un antagonista o agente diferente de la invención tal como un agente reductor de células mieloides (que no sea un antagonista del VEGF) . Sin embargo, también está prevista la administración simultánea o la administración en primer lugar del otro antagonista o agente de la invención.

[0163] El médico o veterinario fijará, según su criterio, las cantidades eficaces de agentes terapéuticos que se administrarán en combinación con un antagonista del VEGF. La administración y el ajuste de la dosis se realiza para lograr el máximo control de los procesos que se van a tratar. La dosis dependerá, además, de factores como el tipo de agente terapéutico que se vaya a utilizar y el paciente especifico que vaya a tratarse. Las dosis adecuadas para el antagonista del VEGF son aquellas que se administran actualmente y pueden reducirse debido a la acción combinada (sinergia) del antagonista del VEGF y el otro antagonista de la invención. En determinadas formas de realización, la combinación de los inhibidores potencia la eficacia de un único inhibidor. El termino "potenciar" se refiere a una mejora de la eficacia de un agente terapéutico en su dosis habitual o aprobada. Véase también la sección Composiciones farmacéuticas de la presente memoria descriptiva.

[0164] El tratamiento antiangiogénico en relación con el cáncer es una estrategia de tratamiento para el cáncer destinada a inhibir el desarrollo de vasos sanguíneos tumorales necesario para proporcionar nutrientes que promuevan el crecimiento tumoral. Debido a que la angiogénesis interviene tanto en el crecimiento del tumor primario como en la metástasis, el tratamiento angiogénico proporcionado por la invención es capaz de inhibir el crecimiento neoplásico del tumor en el sitio primario, asi como prevenir la metástasis de tumores en sitios secundarios, lo que permite atacar a los tumores con otros agentes terapéuticos. En una forma de realización de la invención, el agente antineoplásico o terapéutico constituye un agente antiangiogénico . En otra forma de realización, el agente antineoplásico es un agente quimioterapéut ico .

[0165] Se han identificado muchos otros agentes antiangiogénicos y son bien conocidos en la materia, incluidos aquellos enumerados en la presente memoria descriptiva, por ejemplo, enumerados en Definiciones y, por ejemplo, por Carmeliet y Jain, Nature 407:249-257 (2000); Ferrara y col., Nature Reviews:Drug Discovery, 3:391-400 (2004) ; y Sato Int. J. Clin. Oncol., 8:200-206 (2003) . Véase también la solicitud de patente de Estados Unidos US20030055006. En una forma de realización, se utiliza un antagonista de la invención en combinación con un anticuerpo neutralizador anti-VEGF (o fragmento del mismo) y/u otro antagonista del VEGF o un antagonista del receptor de VEGF incluyendo, entre otros, por ejemplo, fragmentos del receptor soluble de VEGF (por ejemplo, VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, neuropilinas (por ejemplo, NRP1, NRP2) ), aptámeros capaces de bloquear el VEGF o el VEGFR, anticuerpos neutralizadores anti-VEGFR, inhibidores de bajo peso molecular de tirosina quinasas (RTK) del VEGFR, estrategias antisentido para el VEGF, ribozimas contra el VEGF o receptores del VEGF, variantes antagonistas del VEGF y cualquier combinación de todos ellos. De manera alternativa o adicional, dos o más inhibidores de la angiogénesis pueden administrarse conjuntamente al paciente de manera opcional, además del antagonista del VEGF u otro agente de la invención. En determinadas formas de realización, uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, los agentes ant ineoplásicos , pueden administrarse en combinación con un agente de la invención, el antagonista del VEGF y/o un agente antiangiogénico .

[0166] En determinados aspectos de la invención, otros agentes terapéuticos útiles para el tratamiento neoplásico combinado con antagonistas de la invención incluyen otros tratamientos contra el cáncer (por ejemplo, tratamiento quirúrgico, radioterapia (por ejemplo, con irradiación o administración de sustancias radiactivas), quimioterapia, tratamiento con antineoplásicos enumerados en la presente memoria descriptiva y conocidos en la materia, o combinaciones de éstos). De manera alternativa o adicional, dos o más anticuerpos que se unen al mismo antigeno o a dos o más antigenos distintos divulgados en la presente memoria descriptiva se pueden administrar conjuntamente al paciente. En ocasiones, puede ser beneficioso administrar también una o más citoquinas al paciente. Agentes quimioterapeuticos

[0167] En determinados aspectos, la invención proporciona un método para bloquear o reducir el crecimiento del tumor resistente o el crecimiento de una célula cancerígena mediante la administración de cantidades eficaces de un antagonista del VEGF y un antagonista de la invención y uno o más agentes quimioterapéuticos a un paciente propenso al cáncer o al que se le ha diagnosticado cáncer. Se pueden usar diversos agentes quimioterapéuticos en los métodos de tratamiento combinado de la invención. Una lista de antineoplásicos no exhaustiva y que puede servir como ejemplo se incluye en la presente memoria descriptiva en "Definiciones" .

[0168] Como comprenderán los expertos en la materia, las dosis apropiadas de agentes quimioterapéuticos estarán en torno a las aquellas ya empleadas en tratamientos clínicos en los que los agentes quimioterapéuticos se administran solos o en combinación con otros quimioterapéuticos . Es probable que la dosis varíe en función del proceso que se esté tratando. El médico que administre el tratamiento será capaz de determinar la dosis apropiada para el sujeto. Crecimiento tumoral recidivante

[0169] La invención también proporciona métodos y composiciones para inhibir o prevenir el crecimiento tumoral recidivante o la proliferación recidivante de células cancerígenas. El término "crecimiento tumoral recidivante" o "proliferación recidivante de células cancerígenas" se utiliza para describir una afección en la que los pacientes sometidos o tratados con uno o más de los tratamientos actualmente disponibles (por ejemplo, tratamientos para el cáncer, como quimioterapia, radioterapia, tratamiento quirúrgico, tratamiento hormonal y/o tratamiento biológico/inmunoterapia , tratamientos con anticuerpos anti-VEGF, especialmente un tratamiento estándar para el cáncer en particular) no es clínicamente adecuado para tratar a los pacientes o los pacientes ya no están recibiendo ningún efecto beneficioso del tratamiento de modo que necesitan otro tratamiento adicional eficaz. Como se usa en la presente memoria descriptiva, la frase también se puede referir a una afección del paciente "refractario/que no responde al tratamiento", por ejemplo, que describa pacientes que responden a tratamiento pero sufran efectos secundarios, desarrollen resistencia, no respondan al tratamiento, no respondan satisfactoriamente al tratamiento, etc. En diversas formas de realización, un cáncer es un crecimiento tumoral recidivante o una proliferación recidivante de células cancerígenas en los que el número de células cancerígenas no se ha reducido significativamente, o ha aumentado, o el tamaño del tumor no se ha reducido significativamente, o ha aumentado, o no sigue reduciéndose su tamaño o el número de células cancerígenas. Se puede determinar si las células cancerosas constituyen un crecimiento tumoral recidivante o una proliferación recidivante de células cancerígenas bien in vivo o in vítro mediante cualquier método conocido en la materia para analizar la eficacia del tratamiento en células cancerígenas, utilizando los significados aceptados en la materia de "recidivante" o "refractario" o "que no responde al tratamiento" en este contexto. Un tumor resistente a un tratamiento anti-VEGF es un ejemplo de un crecimiento tumoral recidivante .

[0170] La presente invención proporciona métodos para bloquear o reducir el crecimiento tumoral recidivante o la proliferación recidivante de células cancerígenas en un sujeto mediante la administración de uno o más antagonistas de la invención para bloquear o reducir el crecimiento tumoral recidivante o la proliferación recidivante de células cancerígenas en el sujeto. En determinadas formas de realización, el antagonista se puede administrar después del tratamiento para el cáncer. En determinadas formas de realización, los antagonistas de la invención se administran simultáneamente con el tratamiento para el cáncer, como por ejemplo, la quimioterapia. De manera alternativa o adicional, el tratamiento con antagonistas se alterna con otro tratamiento para el cáncer, en cualquier orden. La invención también engloba métodos de administración de uno o más anticuerpos inhibidores para prevenir el inicio o la recurrencia del cáncer en pacientes predispuestos a sufrir cáncer. Por lo general, el sujeto estaba o está recibiendo simultáneamente tratamiento para el cáncer. En una forma de realización, el tratamiento para el cáncer es un tratamiento con un antiangiogénico, por ejemplo, un antagonista del VEGF. El agente antiangiogénico incluye aquellos conocidos en la materia y aquellos encontrados en Definiciones en la presente memoria descriptiva. En una forma de realización, el agente antiangiogénico es un anticuerpo neutralizador anti-VEGF o fragmento del mismo (por ejemplo, A4.6.1 humanizado, AVASTIN ® (Genentech, South San Francisco, CA) , Y0317, M4 , G6, B20, 2C3, etc.) . Veánse, por ejemplo, las patentes de Estados Unidos N° 6.582.959, 6.884.879, 6.703.020; el documento W098/45332; el documento WO 96/30046; el documento WO94/10202; la patente europea EP 0666868B1; las solicitudes de patentes de Estaods Unidos 20030206899, 20030190317, 20030203409 y 20050112126; Popkov y col., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004) ; y el documento WO2005012359. Otros agentes pueden administrarse en combinación con antagonistas del VEGF y un antagonista de la invención para bloquear o reducir el crecimiento tumoral recidivante o la proliferación recidivante de células cancerígenas, por ejemplo, véase la sección Terapias combinadas en la presente memoria descriptiva.

[0171] En una forma de realización, los antagonistas de la invención u otros procedimientos terapéuticos que reducen la expresión de la Grl, elastasa leucocitaria , MCP-1, MIP-1 alfa, las URCGP o URRTP se administran para invertir la resistencia o sensibilidad reducida de las células cancerígenas a ciertos agentes biológicos (por ejemplo, un antagonista que es un anticuerpo anti-VEGF) , hormonales, radiológicos y quimioterapéuticos , resensibili zando asi las células cancerígenas a uno o más de estos agentes que de esta manera pueden administrarse (o continuar administrándose) para tratar o controlar un cáncer, incluyendo la prevención de metástasis. Anticuerpos

[0098] Los anticuerpos de la invención incluyen anticuerpos de una proteína de la invención y fragmento de anticuerpos de un anticuerpo de una proteína de la invención. Un polipéptido o proteína de la invención incluye, entre otros, VEGF, Grl, MCP-1, MIP-1 alfa, CDllb, CD18, una elastasa leucocitaria , una URCGP, una DRCGP, una URRTP y una DRRTP. En ciertos aspectos, un polipéptido o proteina de la invención es un anticuerpo contra VEGF, Grl, MCP-1, MIP-1 alfa, CDllb, CD18, una URCGP, una DRCGP, una URRTP y una DRRTP, por ejemplo, para información general sobre polipéptidos o proteínas que se ofrece en la presente memoria descriptiva .

[0172] Los anticuerpos de la invención también incluyen anticuerpos que son agentes ant iangiogénesis o inhibidores de la angiogénesis , anticuerpos que son agentes reductores de células mieloides, anticuerpos del VEGF, Grl, elastasa leucocitaria, MCP-1, MIP-1 alfa, CDllb, CD18, las URCGP, DRCGP, URRTP y DRRTP, anticuerpos que son agentes anticancerígenos u otros anticuerpos que se describen en la presente memoria descriptiva. Los anticuerpos ejemplares incluyen, por ejemplo, anticuerpos policlonales , monoclonales , humanizados, fragmentados, multiespecíficos, heteroconj ugados , multivalentes , de función efectora, etc. Anticuerpos policlonales

[0173] Los anticuerpos de la invención pueden comprender anticuerpos policlonales. El experto en la materia conoce los métodos para preparar anticuerpos policlonales. Por ejemplo, los anticuerpos policlonales contra un anticuerpo de la invención se producen en animales a partir de una o múltiples inyecciones subcutáneas (se) o intraperitoneales (ip) del antígeno pertinente y un adyuvante. Puede ser útil conjugar el antígeno relevante con una proteína que sea inmunogénica en la especie que se pretende inmunizar, por ejemplo, la hemocianina de la lapa californiana (keyhole limpet), la albúmina sérica, la tiroglobulina bovina o un inhibidor de la tripsina de la soja con un agente bifuncional o derivatizante , por ejemplo, el éster de maleimidobenzoil sulfosuccinimida (conjugación a través de residuos de cisteína) , la N-hidroxisuccinimida (a través de residuos de lisina) , el glutaraldehído, el anhídrido succínico, el SOCI2 o el R1N=C=NR, donde R y R1 son diferentes grupos alquílicos.

[0174] Los animales se inmunizan contra una molécula de la invención, conjugados inmunogénicos o derivados al combinar, por ejemplo, 100 pg o 5 µ9 de la proteína o conjugado (para conejos o ratones, respectivamente) con 3 volúmenes de adyuvante completo de Freund e inyectar la solución intradérmicamente en múltiples puntos. Un mes más tarde, los animales se refuerzan con entre 1/5 y 1/10 de la cantidad original de péptido o conjugado en el adyuvante completo de Freund mediante inyección subcutánea en múltiples lugares. Entre siete y catorce días más tarde, los animales se desangran y el suero se analiza para titular los anticuerpos. Los animales se refuerzan hasta obtener los niveles adecuados de titulación. Generalmente, el animal se refuerza con el conjugado del mismo antígeno, pero conjugado con una proteína diferente y/o a través de un reactivo reticulante diferente. Los conjugados también se pueden realizar en cultivos celulares recombinantes como fusiones proteicas. También, los agentes agregantes como el alumbre son adecuados para incrementar la respuesta inmunológica . Anticuerpos monoclonales

[0175] Los anticuerpos monoclonales contra un antigeno que se describen en la presente memoria descriptiva pueden obtenerse utilizando el método del hibridoma, descrito por primera vez en Kohler y col., Nature, 256:495 (1975), o con los métodos del ADN recombinante (patente de Estados Unidos N° 4.816.567) .

[0176] En el método del hibridoma, un ratón u otro animal huésped apropiado, como un hámster o un mono macaco, se inmuniza tal como se describió anteriormente en la presente memoria descriptiva para obtener linfocitos que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unirán específicamente a la proteína utilizada para la inmunización. De manera alternativa, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Después, los linfocitos se fusionan con las células de mieloma utilizando un agente fusionante adecuado, como por ejemplo poliet ilenglicol , para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)) .

[0177] Por lo tanto, las células de hibridoma preparadas se siembran y cultivan en un medio de cultivo adecuado que normalmente contenga una o más sustancias que inhiban el crecimiento o la supervivencia de las células de mieloma parental no fusionadas. Por ejemplo, si las células de mieloma párenteles no poseen la enzima hipoxant ina-guanina-fosforribosil-transferasa (HGPRT o HPRT) , el medio de cultivo para los hibridomas generalmente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina (medio HAT) , cuyas sustancias evitan el crecimiento de células con déficit de HGPRT.

[0178] Las células de mieloma típicas son aquellas que se fusionan eficazmente, soportan altos niveles estables de producción de anticuerpos por las células productoras de anticuerpos seleccionadas y son sensibles a un medio como el medio HAT. Entre éstas, las lineas celulares de mieloma preferidas son las líneas de mieloma murino, como aquellas derivadas de los tumores de ratones MOPC-21 y MPC-11, disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, EE.UU., y las células SP-2 o X63-Ag8-653, disponibles en el American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EE.UU. Las líneas celulares de mieloma humano y heteromieloma de humano-murino también se han descrito para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J. Immunol., 133:3001 (1984) ; Brodeur y col., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp . 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987) ) .

[0179] El medio de cultivo en el que las células de hibridoma están creciendo se analiza para la producción de anticuerpos monoclonales dirigidos contra, por ejemplo, el VEGF, Grl, la elastasa leucocitaria , MCP-1, MIP-1 alfa, CDllb, CD18, una URCGP, una DRCGP, una URRTP o una DRRTP, o una molécula que intervenga en la angiogénesis . La especificidad de unión de los anticuerpos monoclonales producidos por las células de hibridoma puede determinarse mediante inmunoprecipitación o ensayo de unión in vitro, como el radioinmunoensayo (RIA) o ensayo de inmunoabsorción enzimática (ELISA) . Dichos ensayos y técnicas son conocidos en la materia. La afinidad de unión del anticuerpo monoclonal puede, por ejemplo, determinarse mediante el análisis Scatchard de Munson y Pollard, Anal. Biochem. , 107:220 (1980) .

[0180] Después de identificar que las células de hibridoma producen anticuerpos con la especificidad, afinidad y/o actividad deseada, los clones se pueden subclonar limitando los procedimientos de dilución y pueden crecer mediante métodos estándar (Goding, Monoclonal Antíbodies: Principies and Practice, pp.59-103 (Academic Press, 1986)) . Los medios de cultivo adecuados para este fin incluyen, por ejemplo, medio D-MEM o RPMI-1640. Además, las células de hibridoma pueden crecer in vivo en un animal como tumores con ascitis.

[0181] Los anticuerpos monoclonales secretados por los subclones se separan adecuadamente del medio de cultivo, los fluidos asciticos o el suero mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas , como por ejemplo, la proteina A-sefarosa, cromatografía de hidroxilapatita , electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. Los anticuerpos monoclonales también pueden obtenerse mediante métodos de ADN recombinante, como los que se describen la patente de Estados Unidos N° 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales se aisla y secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales (por ejemplo, utilizando sondas oligonucleot ídicas capaces de unirse específicamente a genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de los anticuerpos monoclonales) . Las células de hibridoma sirven como fuente de dicho ADN. Una vez aislado, el ADN se puede colocar en vectores de expresión, que después se transfectan en células huésped, como por ejemplo, las células E. coli, las células COS de monos, las células de ovario de hámster chino (CHO) o las células de mieloma que no produzcan de ningún otro modo la proteína de la inmunoglobulina para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales en las células huésped recombinantes . La producción recombinante de anticuerpos se describirá más detalladamente a continuación.

[0182] En otra forma de realización, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de bibiliotecas de fagos de anticuerpos generados mediante las técnicas descritas en McCafferty y col., Nature, 348:552-554 (1990) . Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991) y Marks y col., J. Mol. Biol.r 222:581-597 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Las publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) mediante combinación de cadenas (Marks y col., , Bio/Technology, 10:779-783 (1992) ), así como también la infección combinatoria y la recombinación in vivo como estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse y col., Nuc . Acids. Res., 21:2265-2266 (1993)) . De este modo, estas técnicas son alternativas viables a las técnicas tradicionales de hibridoma de anticuerpo monoclonal para el aislamiento de anticuerpos monoclonales .

[0183] El ADN también puede modificarse, por ejemplo, sustituyendo la secuencia de codificación de los dominios constantes de la cadena pesada y cadena ligera humanas en lugar de las secuencias murinas homologas' (patente de EE.UU. N° 4.816.567 y Morrison y col., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 81:6851 (1984)) o uniendo covalentemente toda o parte de la secuencia de codificación para un polipéptido, que no sea inmunoglobulina, a la secuencia de codificación de la inmunoglobulina .

[0184] Generalmente, los polipéptidos que no son inmunoglobulinas se sustituyen por los dominios constantes de un anticuerpo o se sustituyen por los dominios variables de un sitio de combinación a antigeno de un anticuerpo para crear un anticuerpo bivalente quimérico que comprenda un sitio de combinación a antigeno con especificidad para un antigeno y otro sitio de combinación a antigeno que tenga especificidad para otro antigeno diferente. Anticuerpos humanos y humanizados

[0185] Los anticuerpos de la invención pueden comprender anticuerpos humanos o humanizados. Un anticuerpo humanizado posee uno o más residuos de aminoácidos introducidos desde una fuente que no es humana. Estos residuos de aminoácidos no humanos se conocen, por lo general, como residuos "importados" que con frecuencia se toman de un dominio variable de "importación". La humanización se puede realizar esencialmente a través del método de Winter y colegas (Jones y col., Nature, 321:522-525 (1986); Riechmann y col., Nature, 332:323-327 (1988); Verhoeyen y col., Science, 239:1534-1536 (1988)), mediante la sustitución de los CDR o las secuencias CDR de roedores por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por consiguiente, dichos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (patente de EE.UU N° 4.816.567), en los que se ha sustituido básicamente menos de un dominio variable humano intacto por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados son generalmente anticuerpos humanos en los que algunos residuos de CDR, y posiblemente algunos residuos de FR, se sustituyen por residuos de sitios análogos en los anticuerpos de roedores.

[0186] La elección de dominios variables humanos, tanto ligeros como pesados, que se utilizarán para realizar los anticuerpos humanizados es muy importante para disminuir la antigenicidad . De acuerdo con el denominado método "del más apto", la secuencia del dominio variable del anticuerpo de un roedor se compara con toda la biblioteca de secuencias conocidas de los dominios variables humanos. Entonces, se acepta la secuencia humana más parecida a la de los roedores como estructura humana (FR) para el anticuerpo humanizado (Sims y col., J. Immunol . , 151:2296 (1993); Chothia y col., J. Mol. Biol., 196:901 (1987)) . Otro método utiliza una estructura especifica derivada de la secuencia consenso de todos los anticuerpos humanos de un subgrupo en particular de las cadenas ligeras o pesadas. La misma estructura se puede utilizar para diferentes anticuerpos humanizados (Cárter y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); Presta y col., J. Immunol., 151:2623 (1993)) .

[0187] Además, es importante que los anticuerpos se humanicen con retención de la afinidad alta para el antigeno y otras propiedades biológicas favorables. Para lograr este objetivo, de acuerdo con un método general, los anticuerpos humanizados se preparan mediante un proceso de análisis de secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales que utilizan modelos tridimensionales de las secuencias parentales y humanizadas. Generalmente se dispone de modelos de inmunoglobina tridimensional conocidos por los expertos en la materia. Existen programas informáticos que ilustran y muestran estructuras conformacionales tridimensionales probables de secuencias de inmunoglobulina candidata. La inspección de estas visualizaciones permite analizar el papel que los residuos probablemente desempeñan en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de los residuos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata para unirse a su antigeno. De esta manera, los residuos FR se pueden seleccionar y combinar a partir de las secuencias receptoras y de importación para lograr la característica deseada del anticuerpo, como por ejemplo una mayor afinidad para el/los antígeno(s) . En general, los residuos de CDR influyen directa y sustancialmente en la unión al antígeno.

[0188] De manera alternativa, actualmente es posible producir animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que sean capaces, una vez inmunizados, de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos cuando no exista producción de inmunoglobulina endógena alguna. Por ejemplo, se ha descrito que la eliminación homocigótica del gen de la región de unión (JH) de la cadena pesada del anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes de línea germinal ocasiona la inhibición total de la producción de anticuerpos endógenos. La transferencia de la matriz de genes humanos de la inmunoglobulina de línea germinal en uno de estos ratones mutantes de línea germinal ocasionará la producción de anticuerpos humanos al actuar sobre el antígeno. Véase, por ejemplo, Jakobovits y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:2551 (1993) ; Jakobovits y col., Nature, 362:255-258 (1993); Bruggermann y col., Year in Immuno., 7:33 (1993) ; y Duchosal y col., Nature 355:258 (1992) . Los anticuerpos humanos también pueden derivar de bibliotecas de representación de imágenes de fagos (Hoogenboom y col., J. Mol. Biol., 227:381 (1991); Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991); Vaughan y col., Nature Biotech 14:309 (1996) ) .

[0189] Los anticuerpos humanos también pueden producirse utilizando diversas técnicas conocidas en la materia, incluyendo bibliotecas de representación de imágenes de fagos (Hoogenboom y Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991) ; Marks y col., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)) . De acuerdo con esta técnica, los genes de dominios V de los anticuerpos se clonan en pauta de lectura con un gen proteico con revestimiento mayor o menor de un bacteriófago filamentoso, como el M13 o fd, y se presentan como fragmentos de anticuerpos funcionales en la superficie de la partícula del fago. Debido a que la partícula filamentosa contiene una copia del ADN monocatenario del genoma del fago, las selecciones que se basan en las propiedades funcionales del anticuerpo también conducen a la selección del gen que codifica el anticuerpo que exhibe esas propiedades. Por lo tanto, el fago imita alguna de las propiedades de la célula B. La presentación de fagos puede realizarse en diversos formatos, revisados, por ejemplo, en Johnson, K S. y Chiswell, D J. , Cur Opin in Struct Biol 3:564-571 (1993) . Es posible utilizar diversas fuentes de segmentos del gen V para la presentación de fagos. Por ejemplo, Clackson y col., Nature, 352:624-628 (1991) aislaron un conjunto de anticuerpos anti-oxazolona de una pequeña biblioteca combinatorial de genes V aleatoria derivada de los bazos de ratones inmunizados. Es posible construir un repertorio de genes V de donantes humanos no inmunizados y aislar anticuerpos contra un gran conjunto de antigenos (incluyendo los autoantigenos ) , por ejemplo, siguiendo fundamentalmente las técnicas descritas por Marks y col., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991) o Griffith y col., EMBO J. 12:725-734 (1993) . Véanse también las patentes de Estados Unidos N° 5.565.332 y 5.573.905. Las técnicas de Colé y col., y de Boerner y col., también se encuentran disponibles para la preparación de los anticuerpos monoclonales humanos (Colé y col., Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985) y Boerner y col., J. Immunol . , 147(1) : 86-95 (1991)) . Los anticuerpos humanos también pueden generarse mediante células B activadas in vitro (véanse las patentes de Estados Unidos N° 5.567.610 y 5.229.275) .

Fragmentos de anticuerpos

[0190] Los fragmentos de anticuerpos también se incluyen en la invención. Se han desarrollado varias técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos. Tradicionalmente , estos fragmentos se derivaban a través de la digestión proteolitica de anticuerpos intactos (véase, por ejemplo, Morimoto y col., Journal of Biochemical and Biophysical Methods 24:107-117 (1992) y Brennan y col., Science, 229:81 (1985)) . Sin embargo, estos fragmentos ahora se pueden producir directamente mediante células huésped recombinantes . Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos pueden aislarse de las bibliotecas de fagos descritas anteriormente. Como alternativa, los fragmentos Fab' -SH pueden recuperarse directamente de E. coli y unirse químicamente para formar fragmentos F(ab')2 (Cárter y col., Bio/Technology 10:163-167 (1992)). De acuerdo con otro enfoque, los fragmentos F(ab' )2 se pueden aislar directamente desde cultivos de células huésped recombinantes. Otras técnicas para la producción de fragmentos de anticuerpos serán evidentes para aquellos profesionales expertos. En otras formas de realización, el anticuerpo de elección es un fragmento Fv de cadena simple (scFv) . Véase el documento O 93/16185, la patente de Estados Unidos N° 5.571.894 y la patente de Estados Unidos N° 5.587.458. Fv y sFv son las únicas especies con puntos de combinación intactos que están privadas de regiones constantes. Por lo tanto, son aptas para una unión no especifica reducida durante el uso in vivo. Pueden construirse las proteínas de fusión sFv para obtener la fusión de una proteína efectora en el extremo carboxi-terminal o amino-terminal de un sFv. Véase Antibody Engíneering, ed. Borrebaeck, supra . El fragmento de anticuerpo también puede ser un "anticuerpo lineal", tal y como se describe en la patente de Estados Unidos N° 5.641.870. Estos fragmentos de anticuerpos lineales pueden ser monoespecí fieos o biespecí fieos . Anticuerpos multiespecificos (por ejemplo, biespecificos)

[0191] Los anticuerpos de la invención también incluyen, por ejemplo, anticuerpos multiespecificos , que poseen especificidades de unión para al menos dos antígenos diferentes. Mientras que dichas moléculas por lo general sólo unirán dos antígenos (es decir, anticuerpos biespecí fieos , BsAbs), los anticuerpos con especificidades adicionales, tales como los anticuerpos triespecíficos, se engloban en esta expresión cuando se utilizan en la presente memoria descriptiva. Los ejemplos de BsAbs incluyen a aquellos con un ramal dirigido contra un antígeno de la célula tumoral y el otro ramal dirigido contra una molécula activadora citotóxica como la anti-FcYRI/anti-CD15, anti-pl85HER2/FcYRIII (CD16) , ant i-CD3/célula B antimaligna (1D10), anti-CD3/anti-pl85HER2, ant i-CD3/anti-p97 , anti-CD3/carcinoma celular antirrenal, anti-CD3/anti-OVCAR-3 , ant Í-CD3/L-D1 (carcinoma anticolon), anti-CD3/análogo de la hormona estimuladora antimelanocito, receptor ant i-EGF/anti-CD3 , anti-CD3/anti-CAMAl, ant i-CD3 /anti-CDl 9 , anti-CD3/MoV18 , molécula de adhesión celular antineural (NCAM) /anti-CD3, proteina de unión antifolato ( FBP) /ant i-CD3 , antigeno asociado al carcinoma anti-pan (AMOC-31 ) /anti-CD3 ; BsAbs con un ramal que se une específicamente a un antígeno tumoral y un ramal que se une a una toxina como anti-saporin/anti-Id-1 , anti-CD22/anti-saporin, anti-CD7/anti-saporin, anti-CD38 /anti-saporin, ant i-CEA/cadena A antirricino, antiinterferón-a ( IFN-a) /idiotipo antihibridoma , anti- CEA/alcaloide antivinca; BsAbs para convertir los profármacos de enzimas activadas como la fosfatasa anti-CD30/antialcalina (que cataliza la conversión del profármaco fosfato de mitomicina en alcohol de mitomicina) ; BsAbs que pueden usarse como agentes fibrinolíticos como el activador plasminógeno antifibrina/antitisular (tPA) , el activador plasminógeno de tipo antifibrina/antiuroquinasa (uPA) ; BsAbs dirigidos a objetivos complejos inmunes a los receptores de la superficie celular como la antilipoproteina de baja densidad (LDL) /receptor anti-Fc (p.ej. FCYRI, FCYRII O FCYRIII) ; BsAbs para uso en el tratamiento de enfermedades infecciosas como virus simplex anti-CD3/anti-herpes (HSV) , receptor anticélula T:CD3 complex/antigripal , ant i-FcyR/anti-HIV; BsAbs para la detección de tumores in vitro o in vivo como anti-CEA/anti-EOTUBE, anti-CEA/anti-DPTA, anti-pl85HER2/anti-hapteno; BsAbs como adyuvantes de vacuna; y BsAbs como herramientas de diagnóstico como anticonejo IgG/antiferritina , peroxidasa de rábano picante (HRP) /antihormona, antisomatostatina/antisustancia P, anti-HRP/anti-FITC, anti-CEA/anti- -galactosidasa . Los ejemplos de anticuerpos triespecificos incluyen anti-CD3/anti-CD4/anti-CD37, anti-CD3/anti-CD5/anti-CD37 y anti-CD3/anti-CD8/anti-CD37. Los anticuerpos biespecificos se pueden preparar como anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpos (por ejemplo, anticuerpos biespecificos F-(ab' )2) .

[0192] Los procedimientos para realizar anticuerpos biespecificos son conocidos en la materia. La producción tradicional de anticuerpos biespecificos de longitud completa se basa en la coexpresión de dos pares de cadena pesada- cadena ligera de inmunoglobulina, en donde las dos cadenas tienen especificidades diferentes (Millstein y col., Nature, 305:537-539 (1983)) . Debido a la variedad aleatoria de cadenas pesadas y ligeras de inmunoglobulina, estos hibridomas (cuadromas) producen una posible mezcla de 10 moléculas diferentes de anticuerpos, de las cuales sólo una tiene la estructura biespecifica correcta. La purificación de la molécula correcta, que generalmente se realiza mediante etapas de cromatografía de afinidad, es bastante compleja y la cantidad de producto que se obtiene es baja. Se desvelan procedimientos similares en el documento WO 93/08829, y en Traunecker y col., EMBO J. , 10:3655-3659 (1991) .

[0193] Según una técnica distinta, los dominios variables de anticuerpos con las especificidades de unión deseadas (puntos de combinación anticuerpo-antígeno) se fusionan con las secuencias de domino constante de inmunoglobulina. La fusión es preferentemente con un dominio constante de cadena pesada de la inmunoglobulina, que comprende al menos parte de las regiones bisagra, CH2 y CH3. Es preferible tener presente la primera región constante de cadena pesada (CH1) , que contiene el lugar necesario para la unión de la cadena ligera, en al menos una de las fusiones. Los ADN que codifican las fusiones de cadena pesada de la inmunoglobulina y, si se desea, de cadena ligera de inmunoglobulina , se insertan en vectores de expresión separados, y se co-transfectan a un organismo huésped adecuado. Esto mantiene la gran flexibilidad al ajustar las proporciones mutuas de tres fragmentos polipéptidos en realizaciones en donde las proporciones desiguales de las tres cadenas de polipéptidos utilizados en la construcción proporcionan los rendimientos óptimos. Sin embargo, es posible insertar las secuencias de codificación de dos o de las tres cadenas de polipéptidos en un vector de expresión cuando la expresión es de al menos de dos cadenas de polipéptidos en resultados con proporciones iguales en rendimientos altos o cuando las proporciones no tienen particular importancia.

[0194] En una realización de este método, los anticuerpos biespecificos se componen de una cadena pesada de inmunoglobulina híbrida con una primera especificidad de unión en un brazo y un par de cadena pesada-cadena ligera de inmunoglobulina híbrida (que proporciona una segunda especificidad de unión) en el otro brazo. Se descubrió que esta estructura asimétrica facilita la separación del compuesto biespecífico deseado de las combinaciones de cadenas de inmunoglobulina no deseadas, ya que la presencia de una cadena ligera de inmunoglobulina en sólo una de las mitades de la molécula biespecifica proporciona una forma sencilla de separación. Este método se desveló en el documento WO 94/04690. Para obtener mayores detalles sobre la generación de anticuerpos biespecificos , véase, por ejemplo, Suresh y col., Methods in Enzymology, 121:210 (1986) .

[0195] Según otro de los métodos descritos en el documento W096/27011, la interfaz entre un par de moléculas de anticuerpos puede modificarse para maximizar el porcentaje de heterodimeros que se recuperan de un cultivo celular recombinante . La interfaz preferida comprende al menos una parte del dominio CH3 de un dominio constante de anticuerpos. En este procedimiento, una o más cadenas laterales cortas de aminoácidos de la interfaz de la primera molécula del anticuerpo se reemplazan por cadenas laterales más largas (por ejemplo, tirosina o triptófano) . Las "cavidades" compensatorias de tamaño idéntico o similar al de la cadena o cadenas laterales largas se crean en la interfaz de la segunda molécula del anticuerpo al reemplazar las cadenas laterales largas de aminoácidos por cadenas más cortas (por ejemplo, alanina o treonina) . Esto proporciona un mecanismo para incrementar la producción del heterodimero con relación a otros productos finales no deseados como los homodimeros.

[0196] Las técnicas para generar anticuerpos biespecificos a partir de fragmentos de anticuerpos también se han descrito en la bibliografía. Por ejemplo, los anticuerpos biespecificos se pueden preparar mediante un enlace químico. Brennan y col., Science, 229: 81 (1985) describe un procedimiento en el que los anticuerpos intactos se separan proteolíticamente para generar fragmentos F(ab')2- Estos fragmentos se reducen en presencia de arsenito de sodio del agente que forma complejos con el ditiol para estabilizar los ditioles vecinales y evitar la formación de disulfuros intermoleculares. Los fragmentos Fab' generados se convierten entonces en derivados del t ionitrobenzoato (TNB) . Uno de los derivados del Fab' -TNB se reconvierte entonces en Fab'-tiol por reducción con mercaptoetilamina y se mezcla con una cantidad equimolar de otro derivado del Fab ' -TNB para formar el anticuerpo biespecifico . Los anticuerpos biespecificos producidos se pueden utilizar como agentes para la inmovilización selectiva de enzimas.

[0197] Descubrimientos recientes han facilitado la recuperación directa de fragmentos Fab' -SH de E. coli, que se pueden unir químicamente para formar anticuerpos biespecificos . Shalaby y col., J. Exp. Med. , 175: 217-225 (1992) describen la producción de una molécula de anticuerpo biespecí fica F(ab')2 completamente humanizada. Cada uno de los fragmentos Fab' se secretó por separado a partir de E. coli y se sometió a la unión química dirigida in vitro para formar el anticuerpo biespecí fico . Por lo tanto, el anticuerpo biespecífico formado fue capaz de unirse a células con sobreexpresión del receptor VEGF y las células T humanas normales, como así también de desencadenar la actividad lítica de los linfocitos citotóxicos humanos contra dianas de tumor de mama humano.

[0198] También se han descrito varias técnicas para realizar y aislar fragmentos de anticuerpos biespecí fieos directamente de cultivos celulares recombinantes . Por ejemplo, se han producido anticuerpos biespecí fieos utilizando cremalleras de leucina. Kostelny y col., J. Immunol., 148 ( 5 ) : 1547 -1553 (1992) . Los péptidos con cremallera de leucina de las proteínas Fos y Jun se unieron a las porciones Fab' de dos anticuerpos diferentes mediante fusión génica. Los homodímeros del anticuerpo se redujeron en la región bisagra para formar monómeros y después se reoxidaron para formar los heterodímeros del anticuerpo. Este procedimiento también se puede utilizar para producir los homodímeros del anticuerpo. La tecnología "diacuerpo" descrita por Hollinger y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993) ha proporcionado un mecanismo alternativo para realizar fragmentos de anticuerpos biespecificos . Los fragmentos comprenden un dominio variable de cadena pesada (VH) conectado a un dominio variable de cadena ligera (VL) mediante un enlazador que es demasiado corto para permitir el apareamiento entre los dos dominios de la misma cadena. Por consiguiente, los dominios VH y VL de un fragmento deben emparejarse con los dominios VH y VL complementarios de otro fragmento, lo cual permite formar dos sitios de unión al antigeno. También se ha informado de otra estrategia para realizar fragmentos de anticuerpos biespecificos mediante el uso de dimeros Fv de cadena única (sFv) . Véase Gruber y col., J. Immunol., 152:5368 (1994).

[0199] También se contemplan los anticuerpos con más de dos valencias. Por ejemplo, se pueden preparar anticuerpos triespecificos . Tutt y col. J. Immunol. 147:60 (1991). Anticuerpos heteroconjugados

[0200] Los anticuerpos biespecificos incluyen anticuerpos reticulantes o "heteroconjugados", que son los anticuerpos de la invención. Por ejemplo, uno de los anticuerpos en el heteroconj ugado se puede unir a la avidina y el otro a la biotina. Estos anticuerpos se han propuesto, por ejemplo, para conseguir que las células del sistema inmunológico actúen sobre células no deseadas (patente de Estados Unidos N° 4.676.980) y para el tratamiento de la infección del VIH (documentos WO 91/00360 y WO 92/200373 y patente europea EP 03089) . Los anticuerpos heteroconjugados se pueden obtener utilizando cualquier procedimiento de reticulación adecuado. Los agentes reticulantes adecuados se conocen bien en la materia y se desvelan en la patente de Estados Unidos N° 4.676.980, junto con una serie de técnicas de reticulación. Anticuerpos multxvalentes

[0201] Los anticuerpos de la invención incluyen un anticuerpo multivalente . Un anticuerpo multivalente puede internalizarse (y/o catabolizarse) más rápido que un anticuerpo bivalente por una célula que exprese un antigeno al que se unen los anticuerpos. Los anticuerpos de la invención pueden ser anticuerpos multivalentes (que son los que no pertenecen a la clase IgM) con tres o más puntos de unión al antigeno (por ejemplo, anticuerpos tetravalentes) , que pueden producirse fácilmente mediante expresión recombinante del ácido nucleico que codifica las cadenas de polipéptidos del anticuerpo. El anticuerpo multivalente puede comprender un dominio de dimerización y tres o más sitios de unión al antigeno. El dominio preferente de dimerización comprende una región Fe o una región bisagra o está formado por ellas. En esta situación, el anticuerpo comprenderá una región Fe y tres o más puntos de unión al antigeno amino-terminal a la región Fe. El anticuerpo multivalente preferente en la presente memoria descriptiva comprende entre tres y ocho sitios de unión al antigeno aproximadamente, aunque preferentemente cuatro, o está formado por esos sitios. El anticuerpo multivalente comprende al menos una cadena de polipéptidos (y preferentemente dos cadenas de polipéptidos), en el cual la cadena o cadenas de polipéptidos comprenden dos o más dominios variables. Por ejemplo, la cadena o cadenas de polipéptidos pueden comprender VD1- (XI) n-VD2- (X2 ) n-Fc, donde VDl es un primer dominio variable, VD2 es un segundo dominio variable, Fe es una cadena de polipéptidos de una región Fe, XI y X2 representan una aminoácido o polipéptido y n es 0 ó 1. Por ejemplo, la cadena o cadenas de polipéptidos pueden comprender: VH-GHl-enlazador flexible-VH-CHl-cadena de la región Fe o VH-CHl-VH-CHl-cadena de la región Fe. El anticuerpo multivalente de la presente memoria descriptiva comprende, además, preferentemente, al menos dos (y preferiblemente cuatro) polipéptidos de dominio variable de la cadena ligera. El anticuerpo multivalente de la presente memoria descriptiva, por ejemplo, puede comprender entre dos y cuatro polipéptidos de dominio variable de cadena ligera. Los polipéptidos de dominio variable de cadena ligera considerados en esta memoria descriptiva comprenden un dominio variable de cadena ligera y, opcionalmente , un dominio CL . Ingeniería de la función efectora

[0202] Puede ser conveniente modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función efectora para aumentar la eficacia del anticuerpo en el tratamiento del cáncer, por ejemplo. Por ejemplo, uno o más residuos de cisteina pueden introducirse en la región Fe, lo que posibilita la formación de un puente disulfuro entre las cadenas en esta región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede tener mayor capacidad de internalización y/o mayor destrucción celular con mediación del complemento y citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) . Consultar Carón y col., J. Exp Med. 176:1191-1195 (1992) y Shopes, B. J. Immunol. 148:2918-2922 (1992). Los anticuerpos homodiméricos con mayor actividad antitumoral también se pueden preparar utilizando reticuladores heterobifuncionales tal como se describe en Wolff y col. Cáncer Research 53:2560-2565 (1993). De manera alternativa, puede diseñarse un anticuerpo con dobles regiones Fe, potenciando asi la lisis por complemento y las capacidades ADCC . Consultar Stevenson y col. Anti-Cancer Drug Design 3:219-230 (1989). Para incrementar la semivida sérica del anticuerpo, puede incorporarse un epitopo de unión a receptor de rescate en el anticuerpo (especialmente un fragmento de anticuerpo) , tal como se describe en la patente de Estados Unidos N° 5.739.277, por ejemplo. Tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva, el término "epitopo de unión a receptor de rescate" hace referencia a un epitopo de la región Fe de una molécula IgG (por ejemplo, IgGi, IgG2, IgG3, o IgG4) que es responsable de incrementar la semivida sérica in vivo de la molécula IgG. Inmunoconjugados

[0203] La invención también se relaciona^ con los inmunoconj ugados que comprenden el anticuerpo descrito en la presente memoria descriptiva conjugado a un agente citotóxico, como por ejemplo, un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal, animal o fragmentos de la misma) o un isótopo radiactivo (es decir, un radioconj ugado) . Hay disponibles una variedad de radionucleidos para la producción de anticuerpos radiocon ugados . Los ejemplos incluyen, entre otros, Bi, 131I, 131ln, 90Y y 186Re.

[0204] Los agentes quimioterapéuticos útiles en la generación de dichos inmunocon ugados se han descrito anteriormente. Por ejemplo, BCNU, estreptozoicina , vincristina, 5-fluorouracilo, la familia de agentes conocidos en conjunto como complejo LL-E33288, descrita en las patentes de Estados Unidos N° 5.053.394, 5.770.710, esperamicinas (patente de Estados Unidos N° 5.877.296), etc. (véase también la definición de agentes quimioterapéuticos en la presente memoria descriptiva) pueden conjugarse a los anticuerpos de la invención o a fragmentos de los mismos.

[0205] Para la destrucción selectiva del tumor, el anticuerpo puede comprender un átomo altamente radioactivo. Hay disponibles una variedad de isótopos radiactivos para la producción de anticuerpos radioconj ugados o fragmentos de los mismos. Los ejemplos incluyen, entre otros, 211At, 131I, 125I, 90Y, 186Re, 188Re, 153Sm, 212Bi, 32P, 212Pb, inIn, isótopos radiactivos de Lu, etc. Cuando el conjugado se utiliza para fines de diagnóstico, puede comprender un átomo radiactivo para gammagrafia, por ejemplo, 99mtc o 123I o una etiqueta rotatoria para resonancia magnética nuclear (NMR) (también conocida como diagnóstico por imágenes obtenidas mediante resonancia magnética, MRI), como por ejemplo, yodo-123, yodo-131, indio-111, fluorina-19, carbono-13, nitrógeno-15 , oxígeno-17, gadolinio, manganeso o hierro.

[0206] Pueden incorporarse etiquetas radiactivas o de otro tipo al conjugado utilizando las formas conocidas. Por ejemplo, el péptido se puede biosintetizar o sintetizar mediante síntesis química de aminoácidos utilizando precursores adecuados de aminoácidos que contengan, por ejemplo, fluorina-19 en vez de hidrógeno. Las marcas como 99mTc o 123I, 186Re, 188Re y U1ln se pueden unir a través de un residuo de cisteína en el péptido. El itrio-90 puede unirse a través de un residuo de lisina. El método IODOGEN (Fraker y col. (1978) Biochem. Biophys . Res. Commun . 80: 49-57) se puede utilizar para incorporar yodo-123. Véase, por ejemplo Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy (Chatal, CRC Press 1989) que describe otros métodos detalladamente.

[0207] Las toxinas enzimát icamente activas y los fragmentos de las mismas que se pueden utilizar incluyen cadena de difteria A, fragmentos activos sin unión de la toxina de la difteria, cadena de exotoxina A (de Pseudomonas aeruginosa) , cadena de ricina A, cadena de abrina A, cadena de modecina A, alfa-sarcina, proteínas de Aleurites fordii, . proteínas de diantina, proteínas de Phytolaca americana (PAPI, PAPII y PAP-S) , inhibidor de la Momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor de la Saponaria officinalis, gelonina, mitogelina, restrictocina , fenomicina, neomicina y el tricotecenos . Véase, por ejemplo, el documento WO 93/21232, publicado el 28 de octubre de 1993.

[0208] Los conjugados del anticuerpo y el agente citotóxico pueden realizarse utilizando una variedad de agentes de unión a proteina bifuncionales, tales como N-succinimidil-3- ( 2-piridilditiol ) propionato (SPDP), succinimidil-4 - (N-maleimidometil ) ciclohexano-1-carboxilato, iminotiolano (IT) , derivados bifuncionales de imidoésteres (como el dimetil adipimidato HCL) , ésteres activos (como disuccinimidil suberato) , aldehidos (como glutaraldehidos ) , compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil ) hexanodiamina) , derivados de bis-diazonio (como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina ) , diisocianatos (como 2 , 6-diisocianato de tolueno) y compuestos bis-activos de fluoruro (como 1 , 5-difluoruro-2 , 4-dinitrobenceno) . Por ejemplo, una inmunotoxina de ricina puede prepararse tal y como se describe en Vitetta y col., Science 238: 1098 (1987) . El ácido triaminopentaacético 1-isotiocianatobencil-3-metildietileno marcado con carbono 14 (MX-DTPA) es un ejemplo de agente quelante para la conjugación de un radionucleótido a un anticuerpo. Véase el documento O94/11026. El enlazador puede ser un "enlazador escindióle" que facilita la liberación del fármaco citotóxico en la célula. Por ejemplo, puede utilizarse un enlazador lábil al ácido, un enlazador sensible a la peptidasa, un enlazador fotolabil, un enlazador de dimetilo o un enlazador que contenga disulfuro (Chari y col., Cáncer Research 52:127-131 (1992); patente de Estados Unidos N° 5.208.020) .

[0209] De manera alternativa, es posible realizar una fusión de proteínas que contengan el agente anti-VEGF y/o la anti-proteína del anticuerpo y el citotóxico de la invención mediante, por ejemplo, técnicas recombinantes o síntesis de péptidos. La longitud del ADN puede incluir regiones respectivas que codifiquen las dos porciones del conjugado, ya sea adyacentes entre sí o separados por una región que codifica un péptido de enlace, el cual no destruye las propiedades deseadas del conjugado.

[0210] En algunas realizaciones, el anticuerpo se conjuga con un "receptor" (como estreptavidina ) para su utilización en la prelocalización de objetivos tumorales, donde el receptor del anticuerpo conjugado se administra al paciente, seguido de la eliminación del conjugado no unido de la circulación utilizando un agente aclarador y, luego, la administración de un "ligando" (por ejemplo, avidina) que se conjuga con un agente citotóxico (por ejemplo, un radionucleótido ) . En ciertas formas de realización, se forma un inmunoconj ugado entre un anticuerpo y un compuesto con actividad nucleolitica (por ejemplo, una ribonucleasa o una endonucleasa de ADN, tal como la desoxirribonucleasa; ADNasa) . Maitansina y maitansinoides

[0211] La invención ofrece un anticuerpo de la invención, que se conjuga con una o más moléculas de maitansinoides. Los maitansinoides son inhibidores mitóticos que actúan inhibiendo la polimerización de la tubulina. La maitansina se aisló por primera vez a partir del arbusto de África oriental Maytenus serrata (patente de Estados Unidos N° 3.896.111) . Posteriormente, se descubrió que determinados microbios también producían maitansinoides, como el maitansinol y los ésteres de C-3 maitansinol (patente de Estados Unidos N° 4.151.042) . El maitansinol sintético y sus derivados y análogos se describen, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos N° 4.137.230; 4.248.870; 4.256.746; 4.260.608; 4.265.814; 4.294.757; 4.307.016; 4.308.268; 4.308.269; 4.309.428; 4.313.946; 4.315.929; 4.317.821; 4.322.348; 4.331.598; 4.361.650; 4.364.866; 4.424.219; 4.450.254; 4.362.663 y 4.371.533.

[0212] Un anticuerpo de la invención puede conjugarse a una molécula de maitansinoide sin disminuir significativamente la actividad biológica del anticuerpo ni de la molécula de maitansinoide. Una media de 3-4 moléculas maitansinoides conjugadas por anticuerpo ha mostrado eficacia en la mejora de la citotoxicidad de las células diana sin afectar negativamente a la función o solubilidad del anticuerpo, a pesar de que podría esperarse que incluso una molécula toxina/anticuerpo mejore la citotoxicidad en relación con el uso del anticuerpo desnudo. Los maitansinoides son muy conocidos en la materia y pueden sintetizarse mediante técnicas conocidas o aislarse de fuentes naturales. En la patente de Estados Unidos N° 5.208.020 y en otras patentes y publicaciones no patentadas a las que anteriormente se ha hecho referencia, por ejemplo, se describen maitansinoides adecuados. En una forma de realización, los maitansinoides son el maitansinol y sus análogos modificados en el anillo aromático o en otras posiciones de la molécula de maitansinol, como por ejemplo, distintos ésteres del maitansinol.

[0213] Se conocen muchos grupos de enlace en la materia para producir conjugados maitansinoides de anticuerpos, incluyendo, por ejemplo, los revelados en la patente de Estados Unidos N° 5.208.020 o en la patente europea EP 0 425 235 Bl y en Chari y col., Cáncer Research 52:127-131 (1992) . Los grupos de enlace incluyen grupos disulfuros, grupos de tioéteres, grupos de lábil al ácido, grupos fotolábiles, grupos de lábil peptidasa o grupos de lábil esterasa, tal como se revelan en las patentes mencionadas anteriormente. Los grupos disulfuros y los de tioéteres son los preferidos.

[0214] Los conjugados del anticuerpo y el maitansinoide se pueden realizar utilizando una variedad de agentes de unión a proteina bifuncionales , como por ejemplo, N-succinimidil-3-(2-piridilditio) propionato (SPDP) , succinimidil-4- (N-maleimidometil ) ciclohexano-1-carboxilato (S CC) , iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como el dimetil adipimidato HCL) , ésteres activos (como disuccinimidil suberato) , aldehidos (como glutaraldehidos ) , compuestos bis-azido (como bis (p-azidobenzoil ) hexanodiamina ) , derivados de bis-diazonio (como bis- (p-diazoniobenzoil) -etilenodiamina ) , diisocianatos (como 2 , 6-diisocianato de tolueno) y compuestos bis-activos de fluoruro (como 1 , 5-difluoruro-2 , 4-dinitrobenceno) . Los agentes de unión habituales incluyen N-succinimidil-3- ( 2-piridilditio ) propionato (SPDP) (Carlsson y col., Biochem. J. 173:723-737

[1978]) y N-succinimidil-4 - (2-piridilditio) pentanoato (SPP) para proporcionar un enlace disulfuro.

[0215] El enlazador se puede unir a la molécula de maitansinoide en varias posiciones, dependiendo del tipo de enlace. Por ejemplo, un enlace con éster se puede formar mediante reacción con un grupo hidroxilo que utilice técnicas de unión convencionales. La reacción puede ocurrir en la posición C-3 con un grupo hidroxilo, la posición C-14 modificada con hidroximetilo , la posición C-15 modificada con un grupo hidroxilo y la posición C-20 con un grupo hidroxilo. La unión se forma en la posición C-3 del maitansinol o el análogo de maitansinol. Caliqueamicina

[0216] Otro inmunoconj ugado de interés comprende un anticuerpo de la invención conjugado con una o más moléculas de caliqueamicina. La familia de antibióticos de la caliqueamicina es capaz de producir la ruptura del ADN de hebra doble en concentraciones por debajo de picomolar. Para la preparación de conjugados de la familia de la caliqueamicina, véanse las patentes de Estados Unidos N° 5.712.374, 5.714.586, 5.739.116, 5.767.285, 5.770.701, 5.770.710, 5.773.001 y 5.877.296 (todas para American Cyanamid Company) . Los análogos estructurales de la caliqueamicina que pueden utilizarse incluyen, entre otros, Yl1, a2?, N-acetil-Y 1 , PSAG y ?^ (Hinman y col., Cáncer Research 53:3336-3342 (1993), Lode y col., Cáncer Research 58:2925-2928 (1998) y las patentes de Estados Unidos para American Cyanamid mencionadas anteriormente) . Otro fármaco antitumoral al que es posible conjugar el anticuerpo es QFA, que es un antifolato. Tanto la caliqueamicina como el QFA tienen puntos intracelulares de acción y no atraviesan fácilmente la membrana plasmática. Por ello, la absorción celular de estos agentes a través de la internalización mediada por el anticuerpo potencia enormemente sus efectos citotóxicos . Otras modificaciones de anticuerpos

[0217] En la presente memoria descriptiva se consideran otras modificaciones de anticuerpos. Por ejemplo, el anticuerpo puede unirse a uno o varios polímeros no proteináceos, como por ejemplo, polietilenglicol , polipropilenglicol , polioxialquilenos o copolímeros de polietilenglicol y polipropilenglicol. El anticuerpo también se puede atrapar en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial (por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente) , en sistemas de presentación de fármaco coloidal (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanoparticulas y nanocápsulas) o en macroemulsiones . Dichas técnicas se revelan en Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A. , Ed. , (1980) . Liposomas y nanoparticulas

[0218] Los polipéptidos de la invención pueden formularse en liposomas. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden formularse como inmunoliposomas . Los liposomas que contienen el anticuerpo se preparan mediante procedimientos conocidos en la materia, como por ejemplo, el descrito en Epstein y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 82:3688 (1985); Hwang y col., Proc. Nati Acad. Sci. USA, 77:4030 (1980) y las patentes de Estados Unidos N° 4.485.045 y 4.544.545. Los liposomas con mayor tiempo de circulación se revelan en la patente de Estados Unidos N° 5.013.556. Generalmente, la formulación y el uso de los liposomas son conocidos para aquellos expertos en la materia.

[0219] Pueden generarse liposomas particularmente útiles mediante el procedimiento de evaporación de fase inversa con una composición lipidica que comprenda fosfatidilcolina , colesterol y fosfatidiletanolamina derivada de PEG (PEG-PE) .

Los liposomas se extruyen a través de filtros de tamaño de poro definido para obtener liposomas con el diámetro deseado. Los fragmentos Fab' del anticuerpo de la invención pueden conjugarse a los liposomas tal y como se describe en Martin y col. J. Biol. Chem. 257: 286-288 (1982), a través de una reacción de intercambio disulfuro. Opcionalmente , el liposoma puede contener un agente quimioterapéutico (como Doxorrubicina) . Consultar Gabizon y col. J. National Cáncer Inst. 81(19) 1484 (1989) . Otros usos

[0220] Los anticuerpos de la invención tienen varias utilidades. Por ejemplo, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse en ensayos de diagnóstico para, por ejemplo, la detección de la expresión de la proteina en células especificas, tejidos o suero para la detección del cáncer (por ejemplo, en la detección de tumores resistentes), etc. En una forma de realización, los anticuerpos se utilizan para seleccionar la población de pacientes que recibirán tratamiento con los métodos proporcionados en la presente memoria descriptiva, por ejemplo, para la detección de pacientes con expresión de la Grl alterada, una elastasa leucositaria, MCP-1, MIP-1 alfa, una URCGP, una DRCGP, una URRTP o una DRRTP. . Se utilizan diversas técnicas de ensayos de diagnóstico conocidas en la materia, tales como los ensayos de unión competitiva, los ensayos "tipo sándwich" directos o indirectos y los ensayos de inmunoprecipitación realizados en fases heterogéneas u homogéneas (Zola, Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques , CRC Press, Inc. (1987) pp. 147-158) . Los anticuerpos utilizados en los ensayos de diagnóstico pueden marcarse con una porción detectable. La porción detectable debe ser capaz de producir una señal detectable, ya sea directa o indirectamente. Por ejemplo, la porción detectable puede ser un radioisótopo como 3H, 14C, 32P, 35S o 125I, un compuesto fluorescente o quimioluminescente como el isot iocianato de fluoresceina, rodamina o luciferina o una enzima como la fosfatasa alcalina, beta-galactosidasa o peroxidasa de rábano picante. Puede emplearse cualquier método conocido en la materia para conjugar el anticuerpo a la porción detectable, incluyendo los métodos descritos por Hunter y col., Nature, 144:945 (1962) ; David y col., Biochemistry, 13:1014 (1974) ; Pain y col., J. Immunol. Meth., 40:219 (1981) ; y Nygren, J. Histochem. And Cytochem. , 30:407 (1982) .

[0221] Los anticuerpos de la invención también son útiles para la purificación de afinidad de proteínas o fragmentos de una proteína de la invención de cultivos celulares recombinantes o fuentes naturales. En este proceso, los anticuerpos contra la proteína se inmovilizan en un soporte sólido, como por ejemplo, resina Sephadex o papel de filtro, utilizando métodos conocidos en la materia. El anticuerpo inmovilizado entra en contacto con una muestra que contiene la proteína que deberá purificarse y, a continuación, el soporte se lava con un solvente adecuado que eliminará sustancialmente todo el material de la muestra, excepto la proteína, que está unida al anticuerpo inmovilizado. Por último, el soporte se lava con otro solvente adecuado que liberará la proteína del anticuerpo. Modificaciones covalentes para polipeptidos de la invención

[0222] Dentro del ámbito de esta invención se incluyen las modificaciones covalentes de un polipéptido de la invención, por ejemplo una proteína de la invención, un anticuerpo de una proteína de la invención, un fragmento polipeptídico de antagonista, una molécula de fusión (por ejemplo, una molécula de inmunofusión) , etc. Dichas modificaciones pueden ser síntesis químicas o una escisión enzimática o química del polipéptido, de ser aplicable. Otros tipos de modificaciones covalentes del polipéptido se insertan en la molécula mediante residuos de aminoácidos reactivos dirigidos del polipéptido con un agente derivatizante orgánico capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o los residuos de los terminales N o C, o mediante la incorporación de un aminoácido modificado o no natural en la cadena en crecimiento del polipéptido. Véase, por ejemplo, Ellman y col., Meth. Enzym. 202:301-336 (1991); Noren y col., Science 244:182 (1989); y publicacioes de solicitud de patentes de Estados Unidos 20030108885 y 20030082575.

[0223] Los residuos cisteinilos reaccionan generalmente con haloacetatos-a (y las aminas correspondientes), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida , para producir derivados de carboximetil o carboxiamidometil . Los residuos cisteinilos también se derivan mediante reacciones con bromotrifluoroacetona, a-bromo-ß- ( 5-imidozoil ) ácido propiónico, fosfato cloroacetilo, N-alquilmaleimidas , 3-nitro-2-piridil disulfuro, metil 2-piridil disulfuro, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercuri-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l , 3-diazol .

[0224] Los residuos histidilos se derivan mediante reacción con dietilpirocarbonato con pH 5,5-7,0 porque este agente es relativamente especifico para la cadena lateral de histidilos. El bromuro para-bromofenacil también es útil y la reacción se lleva a cabo generalmente en cacodilato de sodio 0,1 M con pH 6,0.

[0225] Los residuos lisinilos y de amino terminales reaccionan con anhídridos succínicos u otros anhídridos de ácido carboxílico. La derivatización con estos agentes tiene el efecto de invertir la carga de los residuos lisinilos. Otros reactivos adecuados para la derivatización de residuos que contengan a-amino incluyen imidoésteres tales como metil picolinimidato, fosfato de piroxidal, piroxidal, cloroborohídrido, ácido trinitrobenzenosulfónico, 0-metilisourea , 2 , -pentanodiona y reacción catalizada por transaminasa con glioxilato.

[0226] Los residuos arginilos se modifican mediante reacción con uno o más reactivos convencionales, entre los que se encuentran fenilglioxal , 2 , 3-butanediona , 1 , 2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de residuos de arginina requiere que la reacción se lleve a cabo en condiciones alcalinas debido al alto pKa del grupo funcional de guanidina. Además, estos reactivos pueden reaccionar con los grupos de lisina, así como también con los grupos amino epsilon de arginina.

[0227] La modificación específica de los residuos tirosilos puede realizarse con un interés especial en la inserción de etiquetas espectrales en dichos residuos mediante la reacción con compuestos aromáticos de diazonio o tetranitrometano .

Generalmente, se utilizan N-acetilimidizol y tet ranit rometano para formar especies de tirosilos O-acetilos y derivados de 3-nitro, respectivamente. Los residuos tirosilos se yodan utilizando 125I o 131I para preparar proteínas marcadas para utilizarlas en radioinmunoensayos .

[0228] Los grupos laterales carboxilos (aspartil o glutamil) se modifican selectivamente mediante reacción con carbodiimidas (R-N=C=N-R' ) , en las que R y R' son diferentes grupos alquilos, tales como l-ciclohexil-3- (2-morfolinil-4-etil) carbodiimida o 1-et il-3- ( -azonia-4 , 4 -dimet ilpent il ) carbodiimida . Además, los residuos aspartilos y glutamilos se convierten en residuos asparaginilos y glutaminilos mediante reacción con iones de amonio.

[0229] Los residuos glutaminilos y asparaginilos se desamidan frecuentemente a los residuos glutamilos y aspartilos correspondientes, respectivamente. Estos residuos se desamidan en condiciones neutrales o básicas. La forma desamidada de estos residuos se encuentra dentro del campo de la presente invención.

[0230] Otras modificaciones incluyen hidroxilación de prolina y lisina, fosforilación de grupos hidroxilos de residuos serilos y treonilos, metilación de grupos -amino de lisina, arginina y cadenas laterales de histidina (T.E.

Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties , W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp . 79-86 (1983)), acetilación de amino N-terminal y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.

[0231] Otro tipo de modificación covalente implica el apareamiento químico o enzimático de glicosidas a un polipéptido de la invención. Estos procedimientos tienen la ventaja de que no requieren la producción del polipéptido en una célula huésped que tenga capacidades de glicosilación para glicosilación unida por enlace O o N. Dependiendo del modo de apareamiento utilizado, el azúcar o los azúcares pueden unirse a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilos libres, (c) grupos sulfidrilos libres, tales como los de la cisteína, (d) grupos hidroxilos libres, tales como los de la serina, treonina o hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos, tales como los de la fenilalanina, tirosina o triptófano o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos métodos se describen en el documento WO 87/05330, publicado el 11 de septiembre de 1987, y en Aplin y Wriston, CRC Crit. Rev. Bioche ., pp. 259-306 (1981) .

[0232] La eliminación de cualquier porción de carbohidratos presente en un polipéptido de la invención deberá realizarse química o enzimát icamente . La deglicosilación química requiere la exposición del polipéptido al compuesto de ácido triflurometanosulfónico u otro compuesto equivalente. Este tratamiento resulta en la escisión de casi todos o todos los azúcares, excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acet ilgalactosamina ) , mientras que el polipéptido permanece intacto. La deglicosilación química se describe en Hakimuddin y col., Arch . Biochem. Biophys. 259:52 (1987) y en Edge y col., Anal. Biochem., 118:131 (1981) . La escisión enzimática de porciones de carbohidratos, como por ejemplo, en anticuerpos, puede llevarse a cabo mediante el uso de diversas endo- y exo-glicosidasas , tal como se describe en Thotakura y col., Meth. Enzymol . 138:350 (1987) .

[0233] Otro tipo de modificación covalente de un polipéptido de la invención comprende la unión del polipéptido a uno de diversos polímeros no proteináceos , como por ejemplo, polietilenglicol , polipropilenglicol o polioxialquilenos , tal como se establece en la patentes de Estados Unidos N° 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337. Vectores , células huésped y métodos recombinantes

[0234] Los polipéptidos de la invención pueden producirse de forma recombinante , utilizando técnicas y materiales de fácil obtención .

[0235] Para la producción recombinante de un polipéptido de la invención, por ejemplo, una proteina de la invención, un anticuerpo de una proteina de la invención, por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF, el ácido nucleico que lo codifica se aisla e inserta en un vector replicable para otra clonación (amplificación del ADN) o para expresión. El ADN que codifica el polipéptido de la invención se aisla y secuencia fácilmente utilizando procedimientos convencionales. Por ejemplo, el ADN que codifica un anticuerpo monoclonal se aisla y secuencia, por ejemplo, mediante sondas oligonucleotidicas capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras del anticuerpo. Hay muchos vectores disponibles. Los componentes del vector suelen incluir, entre otros, uno o más de los siguientes elementos: una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un potenciador, un promotor y una secuencia de finalización de la transcripción. Componente de secuencia de señal

[0236] Los polipéptidos de la invención pueden producirse de forma recombinante, no sólo directamente, sino también como un polipéptido de fusión con un polipéptido heterólogo, que es generalmente una secuencia de señal u otro polipéptido con una escisión especifica en el terminal N de la proteina madura o polipéptido. La secuencia de señal heteróloga seleccionada generalmente es aquella que la célula huésped reconoce y procesa (es decir, la escindida por una peptidasa de señal). Para las células huésped procarióticas que no reconocen ni procesan la secuencia de señal del polipéptido nativo, la secuencia de señal se sustituye mediante una secuencia de señal procariótica seleccionada, por ejemplo, de entre un grupo de fosfatasa alcalina, penicilasa, lpp o líderes de enterotoxina II termoestable . Para la secreción de levadura, la secuencia de señal nativa puede sustituirse, por ejemplo, por el líder de la invertasa de levadura, el líder del factor (incluidos los líderes del factor a Saccharomyces y Kluyveromyces) , el líder de la fosfatasa ácida, el líder de la glucoamilasa C. albicans o la señal descrita en el documento O 90/13646. Las secuencias de señal de los mamíferos y los líderes secretores víricos, como por ejemplo, la señal del herpes simplex gD, se encuentran disponibles en la expresión celular de los mamíferos.

[0237] El ADN para la región de dicho precursor está ligado en la estructura de lectura al ADN que codifica el polipéptido de la invención. Componente origen de la replicacion

[0238] Tanto los vectores de expresión como los vectores de clonación contienen una secuencia de ácido nucleico que permite que el vector se replique en una o más de las células huésped seleccionadas. Por lo general, en los vectores de clonación, esta secuencia permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del huésped e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican autónomamente. Dichas secuencias son bien conocidas para diversas bacterias, levaduras y virus. El origen de la replicación a partir del plásmido pBR322 es apto para la mayoría de las bacterias gramnegativas , el origen plasmídico 2µ es adecuado para la levadura y varios orígenes virales (SV40, polioma, adenovirus, VSV o BPV) son útiles para los vectores de clonación en células de mamíferos. Por lo general, el componente origen de la replicación no se precisa en los vectores de expresión en mamíferos (el origen SV40 puede utilizarse habitualmente sólo porque contiene el promotor temprano) . Componente gen de selección

[0239] Los vectores de expresión y clonación pueden contener un gen de selección, también denominado marcador seleccionable . Los genes de selección típicos codifican proteínas que (a) otorgan resistencia a antibióticos u otras toxinas, como por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina , (b) complementan las deficiencias auxotróficas o (c) proporcionan nutrientes importantes que no se encuentran disponibles en otros medios complejos, como por ejemplo, el gen que codifica la D-alanina racemasa para Bacilli.

[0240] Un ejemplo de un esquema de selección utiliza un fármaco para detener el crecimiento de una célula huésped. Estas células que se transforman con éxito con un gen heterólogo producen una proteina que otorga resistencia al fármaco y, asi, sobrevive a la estrategia de selección. Ejemplos de esta selección dominante utilizan los fármacos neomicina, ácido micofenólico e higromicina.

[0241] Otro ejemplo de marcadores seleccionables adecuados para células de mamíferos son los que permiten la identificación de las células encargadas de absorber el ácido nucleico del anticuerpo, tales como DHFB, timidina quinasa, metalotioneína I y II, genes de metalotioneína en primates, adenosina deaminasa, ornitina decarboxilasa, etc.

[0242] Por ejemplo, las células transformadas con el gen de selección DHFR se identifican primero a través del cultivo de todos los transformantes en un medio de cultivo que contiene metotrexato (Mtx) , un antagonista competitivo del DHFR.

Cuando se utiliza el DHFR de tipo natural, una célula huésped adecuada es la linea de células de ovario de hámster chino (CHO) con deficiencia de actividad del DHFR.

[0243] Como alternativa, las células huésped (en especial los huéspedes naturales que contienen DHFR endógeno) transformadas o co-transformadas con secuencias de ADN que codifican un polipéptido de la invención, la proteina DHFR natural y otro marcador seleccionable , como por ejemplo, la aminoglicosida 3' -fosfotransferasa (APH) pueden seleccionarse mediante crecimiento celular en un medio que contenga un agente de selección para el marcador seleccionable, como un antibiótico aminoglicosidico, por ejemplo, canamicina, neomicina o G418. Véase la patente de Estados Unidos N° 4.965.199. [0244 ] Un gen de selección apto para el uso en levadura es el gen trpl, presente en el plásmido de levadura Yrp7 (Stinchcomb y col., Nature, 282:39 (1979)). El gen trpl proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de levadura que carece de la capacidad de crecer en triptófano, como por ejemplo, ATCC N° 44076 o PEP4-1. Jones, Genetics, 85:12 (1977). La presencia de la lesión trpl en el genoma de la célula huésped de levadura proporciona entonces un entorno eficaz para detectar la transformación mediante crecimiento en ausencia de triptófano. De forma similar, las cepas de levadura con deficiencia de Leu-2 (ATCC 20.622 ó 38.626) se complementan mediante plásmidos conocidos portadores del gen Leu-2.

[0245] Además, los vectores que derivan del plásmido circular pKDl de 1,6 µ?? pueden utilizarse para la transformación de las levaduras Kluyveromyces . De manera alternativa, se detectó un sistema de expresión para la producción a gran escala de quimosina de ternera recombinante para K. lactis. Van den Berg, Bio/Technology, 8:135 (1990). También se han divulgado vectores de expresión multicopia estables para la secreción de albúmina sérica humana recombinante madura por cepas industriales de Kluyveromyces . Fleer y col., Bio/Technology, 9:968-975 (1991). Componente promotor

[0246] Los vectores de expresión y clonación suelen contener un promotor que es reconocido por el organismo huésped y que está operativamente enlazado al ácido nucleico que codifica el polipéptido de la invención. Los promotores aptos para el uso con huéspedes procarióticos incluyen el promotor phoA, los sistemas promotores de lactosa y beta lactamasa, fosfatasa alcalina, un sistema promotor en base a triptófano (trp) y promotores híbridos, tales como el promotor tac. No obstante, otros promotores bacterianos conocidos también son adecuados. Los promotores para el uso en sistemas bacterianos también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno (S.D.) operativamente enlazada al ADN que codifica el polipéptido de la invención.

[0247] Se conocen las secuencias de promotores para eucariotas. Prácticamente todos los genes eucarióticos tienen una región rica en AT situada aproximadamente entre las bases 25 y 30 antes del extremo 5' del promotor desde el sitio donde se inicia la transcripción. Otra secuencia encontrada entre las bases 70 y 80 antes del extremo 5' del promotor desde el inicio de la transcripción de muchos genes es la región CNCAAT en la que N puede ser cualquier nucleótido. En el extremo 3' de la mayoría de los genes eucarióticos hay una secuencia AATAAA que puede ser la señal para la adición de la cola de poli (A) al extremo 3' de la secuencia de codificación. Todas estas secuencias se insertan bien en los vectores de expresión eucariótica.

[0248] Entre los ejemplos de secuencias de promotores adecuados para el uso con huéspedes de levadura están los promotores para 3-fosfoglicerato quinasa u otras enzimas glicolíticas , tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa , fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosefosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa .

[0249] Otros promotores de levadura, que son promotores inducibles con la ventaja adicional de transcripción controlada por condiciones de crecimiento, son las regiones de promotores para alcohol deshidrogenasa 2, isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas al metabolismo del nitrógeno, metalot ioneina , gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa y enzimas responsables de la utilización de la maltosa y galactosa. Los vectores y promotores adecuados para el uso en la expresión de levadura se describen con más detalle en la patente europea 73.657. Los potenciadores de levadura también se usan favorablemente con los promotores de levadura.

[0250] La transcripción de los polipéptidos de la invención proveniente de los vectores en células huésped de mamíferos está controlada, por ejemplo, por promotores obtenidos de genomas de virus tales como el poliomavirus , el virus de la viruela de las aves de corral, el adenovirus (como el Adenovirus 2), el virus del papiloma bovino, el virus del sarcoma aviario, el citomegalovirus , un retrovirus, el virus de la hepatitis B y el Simian Virus 40 (SV40) , de promotores heterólogos de mamíferos, como por ejemplo, el promotor de actina o un promotor de inmunoglobulina , o de promotores de choque térmico, siempre que dichos promotores sean compatibles con los sistemas de las células huésped.

[0251] Los promotores tempranos y tardíos del virus SV40 se obtienen fácilmente como un fragmento de restricción del SV40, que también contiene el origen viral de replicación del SV40. El promotor temprano inmediato del citomegalovirus humano se obtiene fácilmente como un fragmento de restricción HindIII E. Un sistema para la expresión del ADN en huéspedes de mamíferos que utilizan el virus del papiloma bovino como vector se da a conocer en la patente de Estados Unidos N° 4.419.446. Una modificación de este sistema se describe en la patente de Estados Unidos N° 4.601.978. Véase también Reyes y col., Nature 297:598-601 (1982) para la expresión del ADNc del interferón beta humano en células de ratón bajo el control de un promotor timidina quinasa del virus del herpes simplex. Alternativamente, la repetición del terminal largo del virus del sarcoma de Rous puede utilizarse como promotor. Componente elemento potenciador

[0252] La trascripción del ADN que codifica un polipéptido de esta invención mediante eucariotas más altas aumenta con frecuencia al insertar la secuencia de un potenciador en el vector. Actualmente, se conocen diversas secuencias de potenciadores de genes de mamíferos (globina, elastasa, albúmina, fetoproteína alfa e insulina) . Por lo general, se utiliza un potenciador procedente de un virus de células eucarióticas . Entre los ejemplos destacan el potenciador SV40 en el lado tardío del origen de la replicación (bp 100-270), el potenciador del promotor temprano de citomegalovirus , el potenciador de polioma en el lado tardío del origen de la replicación y los potenciadores de adenovirus. Véase también Yaniv, Nature 297:17-18 (1982) para elementos de potenciación para la activación de los promotores eucariót icos . El potenciador puede empalmarse en el vector en una posición 5' ó 3' a la secuencia de codificación del polipéptido, pero por lo general está situado en un sitio 5' desde el promotor. Componente de finalización de la transcripción

[0253] Los vectores de expresión utilizados en las células huésped eucarióticas (células de levadura, fúngicas, insectiles, vegetales, animales, humanas o nucleadas de otros organismos multicelulares) también contarán con secuencias necesarias para la finalización de la transcripción y la estabilización del ARNm. Estas secuencias están habitualmente disponibles desde las regiones no traducidas del extremo 5' , y ocasionalmente el 3' , de los ADN o ADNc virales o eucarióticos . Estas regiones contienen segmentos de nucleótidos transcritos como fragmentos poliadenilados en la porción no traducida del ARNm que codifica el polipéptido de la invención. Un componente de finalización de la transcripción útil es la región de poliadenilación de la hormona de crecimiento bovina. Véase el documento WO94/11026 y el vector de expresión que se da a conocer en el mismo. Selección y transformación de células huésped

[0254] Las células huésped adecuadas para la clonación o expresión del ADN que codifica los polipéptidos de la invención en los vectores de la presente memoria descriptiva son las células procariotas, de levadura o eucariotas más altas descritas anteriormente. Las procariotas adecuadas para este fin incluyen eubacterias, como organismos grampositivos o gramnegativos , por ejemplo, enterobacteriáceas tales como Escherichia , por ejemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella , Proteus, Salmonella, por ejemplo, Salmonella typhimurium, Serratia , por ejemplo, Serratia marcescans y Shigella , asi como Bacilli como B. subtilis y B. licheniformis (por ejemplo, B. licheniformis 41P revelada en el documento DD 266.710 publicado el 12 de abril de 1989) , Pseudomonas como P. aeruginosa y Streptomyces . Generalmente, el huésped de clonación E. coli habitual es el E . coli 294 (ATCC 31.446), aunque otras cepas, como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC 31.537) y E. coli W3110 (ATCC 27.325), también son adecuadas. Estos ejemplos tienen un carácter ilustrativo y no limitador.

[0255] Además de las procariotas, los microbios eucarióticos , como los hongos filamentosos o la levadura, también son aptos como huéspedes para la expresión o clonación de los vectores de codificación del polipéptido de la invención. Saccharomyces cerevisiae, o la levadura habitual del pan, es la que más se utiliza de entre los microorganismos huésped eucarióticos inferiores. No obstante, diversos géneros, especies y cepas de utilidad en la presente memoria descriptiva están disponibles, como por ejemplo, Schizosaccharomyces pombe; huéspedes Kl uyveromyces como, por ejemplo, K. lactis, K. fragilis (ATCC 12.424) , K. bulgaricus (ATCC 16.045) , K. wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K. thermotolerans y K. marxianus ; yarrowia (patente europea 402.226) ; Pichia pastoris (patente europea 183.070); Candida; Trichoderma reesia (patente europea 244.234); Neurospora crassa; Schwanniomyces como Schwannio yces occidentalis ; y hongos filamentosos como Neurospora, Penicillium, Tolypocladium, y huéspedes Aspergillus como A. nidulans y A. niger.

[0256] Las células huésped adecuadas para la expresión de los polipéptidos glicosilados de la invención se derivan de organismos multicelulares. Algunos ejemplos de células de invertebrados incluyen las células de insectos y plantas. Se han identificado numerosas cepas y variantes baculovirales y las correspondientes células huésped de insectos permisivas procedentes de huéspedes como Spodoptera frugiperda (oruga) , Aedes aegypti (mosquito) , Aedes albopictus (mosquito) , Drosophila melanogaster (mosca de la fruta) y Bombyx mori. Diversas cepas de virus para transfección se encuentran disponibles, por ejemplo, la variante L-l del NPV Autographa cali fornica y la cepa Bm-5 del NPV Bombyx mori y estos virus pueden utilizarse como el virus de la presente memoria descriptiva, de acuerdo con la presente invención, especialmente para la transfección de las células de Spodoptera frugiperda. Los cultivos de células vegetales de algodón, maiz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco también pueden utilizarse como huéspedes.

[0257] No obstante, el mayor interés se ha centrado en las células de vertebrados y la propagación de éstas en cultivos (cultivo tisular) se ha convertido en un procedimiento habitual. Ejemplos de lineas celulares útiles de mamíferos son la línea CV1 de riñon del mono transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651) ; la línea de riñon embrionario humano (células 293 o 293 subclonadas para crecimiento en cultivo en suspensión, Graham y col., J. Gen Virol. 36:59 (1977)) ; células de riñon de crías de hámster (BHK, ATCC CCL 10) ; células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub y col., Proc. Nati. Acad. Scí. USA 77:4216 (1980)) ; células sertoli de ratón (TM4, Mather, Biol . Reprod. 23:243-251 (1980) ) ; células de riñon de mono (CV1 ATCC CCL 70); células de riñon de mono verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1587) ; células de carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2); células caninas de riñon (MDCK, ATCC CCL 34); células de riñon de ratas búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442) ; células humanas de pulmón (W138, ATCC CCL 75) ; células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor de mama de ratón (MMT 060562, ATCC CCL51 ) ; células TRI (Mather y col., Annals N.Y. Acad. Sci. 383:44-68 (1982)); células MRC 5; células FS4 y una línea de hepatoma humano (Hep G2 ) .

[0258] Las células huésped se transforman con los vectores de expresión o clonación descritos anteriormente para la producción de polipéptidos de la invención y se cultivan en medios nutrientes convencionales modificados adecuadamente para inducir promotores, seleccionar transformantes o amplificar los genes que codifican las secuencias deseadas. Cultivo de células huésped

[0259] Las células huésped utilizadas para producir los polipéptidos de la invención pueden cultivarse en diversos medios. Medios comercialmente disponibles como Ham's FIO (Sigma) , Minimal Essential Médium ( (MEM) , (Sigma) , RPMI-1640 (Sigma) y Dulbecco's Modified Eagle's Médium (DMEM) , Sigma) son aptos para el cultivo de células huésped. Además, cualquiera de los medios descritos en Ham y col., Meth. Enz. 58:44 (1979) , Barnes y col., Anal. Biochem. 102:255 (1980), patentes de Estados Unidos N° 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655 ó 5.122.469; el documento WO 90/03430; el documento WO 87/00195; o la patente de Estados Unidos Re. 30.985 se pueden utilizar como medios de cultivo para células huésped. Cualquiera de estos medios puede complementarse según sea necesario con hormonas . y/u otros factores de crecimiento (como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (como cloruro sódico, calcio, magnesio y fosfato) , soluciones (como HEPES) , nucleótidos (como adenosina y timidina) , antibióticos (como el fármaco GENTAMYCIN™) , oligoelementos (definidos como los compuestos inorgánicos generalmente presentes en las concentraciones finales del intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Se pueden incluir también otros suplementos necesarios a concentraciones adecuadas que serán conocidas por aquellos con conocimientos en la materia. Las condiciones del cultivo, como temperatura o pH entre otras, son las utilizadas anteriormente con la célula huésped seleccionada para expresión y serán conocidas por los expertos en la materia. Purificación de polipeptidos

[0260] Un polipéptido o proteína de la invención puede recuperarse de un sujeto. Al utilizar técnicas recombinantes , el polipéptido de la invención se puede producir intracelularmente , en el espacio periplásmico, o directamente se puede secretar en el medio. Los polipéptidos de la invención pueden recuperarse de un medio de cultivo o de lisados celulares huésped. Si se encuentra unido a la membrana, puede liberarse de la membrana utilizando una solución detergente apropiada (por ejemplo, Triton-X 100) o mediante escisión enzimática. Las células utilizadas en la expresión de un polipéptido de la invención pueden sufrir una disrupción por diversos medios físicos o químicos, tales como ciclo de congelación/descongelación, sonicación, disrupción mecánica o agentes de lisado celular.

[0261] Los siguientes procedimientos tienen carácter ejemplar en lo que se refiere a procedimientos de purificación de proteina adecuados: fraccionamiento en una columna de intercambio iónico; precipitación en etanol, HPLC de fase inversa, cromatografía en anhídrido silicílico, cromatografía en heparina SEPHAROSE™, cromatografía en una resina de intercambio iónico o catiónico (como una columna de ácido poliaspártico, DEAE, etc.), cromatoenfoque , SDS-PAGE, precipitación en sulfato de amonio, filtrado en gel mediante, por ejemplo, Sephadex G-75, columnas de proteína A sefarosa para eliminar contaminantes tales como IgG y columnas quelantes de metal para unir formas de polipéptidos de la invención marcados con epítopos. Pueden utilizarse diversos métodos de purificación de proteínas y dichos métodos son conocidos en la materia y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990) ; Scopes, Protein Purification: Principies and Practice, Springer-Verlag, Nueva York (1982) . Las etapas de purificación seleccionadas dependerán, por ejemplo, de la naturaleza del proceso de producción utilizado y del polipéptido particular de la invención producido.

[0262] Por ejemplo, la composición de un anticuerpo preparado a partir de las células puede purificarse utilizando, por ejemplo, cromatografía de hidroxilapatita, electroforesis en gel, diálisis y cromatografía de afinidad. Esta última técnica es la técnica de purificación preferida. La idoneidad de la proteína A como ligando de afinidad depende de las especies y del isotipo de cualquier domino Fe de la inmunoglobulina que está presente en el anticuerpo. La proteína A puede utilizarse para purificar anticuerpos que se basan en cadenas pesadas humanas ??, ?2 o ?4 (Lindmark y col., J. Immunol. Meth. 62:1-13 (1983)) . La proteína G se recomienda para todos los isotipos de ratón y para la ?3 humana (Guss y col., EMBO J. 5:1567-1575 (1986)) . La matriz a la que el ligando de afinidad se une es con frecuencia la más agarosa, pero también están disponibles otras matrices. Las matrices mecánicamente estables, como vidrio poroso controlado o poli ( est irenodivinil ) benceno, permiten tasas de flujo más rápidas y tiempos de procesamiento más cortos que los que se pueden lograr con agarosa. Cuando el anticuerpo comprende un dominio CH3, la resina Bakerbond ABX™ (J. T. Baker, Phillipsburg, New Jersey) es útil para la purificación. Otras técnicas de purificación de proteínas, como las mencionadas anteriormente, por ejemplo, también están disponibles, dependiendo del anticuerpo que deba recuperarse. Véase también Cárter y col., Bio/'Technology 10:163-167 (1992), que describe un procedimiento para aislar anticuerpos que se secretan al espacio periplásmico de E. coli. Composiciones farmacéuticas

[0263] Las formulaciones farmacéuticas de los agentes de la invención (antagonista del VEGF, agente reductor de células mieloides, antagonista de la URCGP, antagonista de la URRTP, agonista de la DRCGP, un agonista de la DRRTP o un agente antineoplásico ) , y las combinaciones de los mismos y descritos en la presente memoria descriptiva utilizados de acuerdo con la invención se preparan para su almacenamiento mezclando una molécula, por ejemplo, polipéptido/s , que tenga el grado de pureza deseado con vehículos, excipientes o estabilizadores opcionales farmacéuticamente aceptables (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol, A. Ed. (1980)), en forma de formulaciones liofilizadas o soluciones acuosas. Los vehículos, excipientes o estabilizadores aceptables no son tóxicos para los receptores en las dosis y concentraciones empleadas e incluyen soluciones como el fosfato, el citrato y otros ácidos orgánicos; antioxidantes que incluyen el ácido ascórbico y la metionina; conservantes (como el cloruro de octadecildimetilbencilamonio; el cloruro de hexametonio; el cloruro de benzalconio; el cloruro de bencetonio; el fenol; el alcohol butílico o bencílico; los alquil parabenos, como el metil o el propil parabeno; el catecol; el resorcinol; el ciclohexanol ; el 3-pentanol y el m-cresol) ; los polipéptidos de bajo peso molecular (menos de 10 residuos aproximadamente); las proteínas, como la albúmina sérica, la gelatina o las inmunoglobulinas ; los polímeros hidrófilos, como por ejemplo, la polivinilpirrolidona ; los aminoácidos tales como la glicina, la glutamina, la asparragina, la histidina, la arginina o la lisina; los monosacáridos , disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo la glucosa, la mañosa o las dextrinas; agentes quelantes, como el EDTA; los azúcares, como por ejemplo, la sacarosa, el manitol, la trehalosa o el sorbitol; los contraiones que forman sales, como por ejemplo, el sodio; los complejos metálicos (por ejemplo, los complejos de la proteína Zn) y/o los tensoactivos no iónicos, como por ejemplo, TWEEN™, PLURONICS™ o el polietilenglicol (PEG) .

[0264] Los ingredientes activos también pueden atraparse en microcápsulas preparadas, por ejemplo, mediante técnicas de coacervación o mediante polimerización interfacial, por ejemplo, hidroximetilcelulosa o microcápsulas de gelatina y microcápsulas de poli- (metilmetacrilato) , respectivamente, en sistemas de administración de fármacos coloidales (por ejemplo, liposomas, microesferas de albúmina, microemulsiones , nanoparticulas y nanocápsulas ) o en macroemulsiones . Dichas técnicas se divulgan en Remington ' s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Oslo, A., Ed. , (1980).

[0265] Las formulaciones para administrar in vivo deben ser estériles. Esto se logra mediante la filtración a través de membranas de filtración estériles.

[0266] Se pueden elaborar preparaciones de liberación controlada. Algunos ejemplos adecuados de preparaciones de liberación controlada incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos con un polipéptido de la invención, cuyas matrices se encuentran en forma de elementos moldeados, como por ejemplo, películas o microcápsulas . Ejemplos de matrices de liberación controlada incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli- (2-hidroxietil-metacrilato) o poli- (vinilalcohol ) ) , poliláctidos (patente de Estados Unidos N° 3.773.919), copolímeros del ácido L-glutámico y ?-etil-L-glutamato, acetato de etilenvinilo no degradable, copolímeros del ácido glicólico-ácido láctico degradables como por ejemplo LUPRON DEPOT™ (microesferas inyectables compuestas por copolímeros del ácido glicólico-ácido láctico y acetato de leuprolida) y ácido poli-D- ( - ) -3- hidroxibutírico . Mientras que los polímeros como el acetato de etilenvinilo y el ácido glicólico-ácido láctico permiten la liberación de moléculas por un período de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante períodos de tiempo menores. Cuando los anticuerpos encapsulados permanecen en el organismo durante un largo periodo de tiempo, pueden desnaturalizarse o agregarse como resultado de la exposición a la humedad a 37°C, lo que conduce a una pérdida de la actividad biológica y a posibles cambios en la inmunogenicidad . Es posible concebir estrategias racionales para su estabilización dependiendo del mecanismo que intervenga. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es de formación de uniones intermoleculares S-S mediante el intercambio tio-disulfuro, se puede lograr la estabilización mediante la modificación de los residuos sulfhidrilos , liofilizando soluciones ácidas, controlando la humedad, utilizando aditivos adecuados y desarrollando composiciones de matrices de polímeros especificas. Véase también, por ejemplo, la patente de Estados Unidos N° 6.699.501, que describe las cápsulas cubiertas de polielectrolitos .

[0267] Además, se considera que un agente de la invención (por ejemplo, un antagonista del VEGF, un agente reductor de células mieloides, un agente quimioterapéutico o un agente antineoplásico) puede introducirse a un sujeto mediante terapia génica. La terapia génica hace referencia a la terapia que se lleva a cabo mediante la administración de un ácido nucleico a un sujeto. En las aplicaciones de terapia génica, los genes se introducen en las células con el fin de obtener la síntesis in vivo de un producto genético terapéuticamente eficaz para el reemplazo de un gen defectuoso, por ejemplo. La "terapia génica" comprende tanto la terapia génica convencional, en la que se obtiene un efecto duradero mediante un único tratamiento, y la administración de agentes génicos terapéuticos, que involucran la administración única o reiterada de ADN o ARNm terapéuticamente eficaces. Los ADN y ARN antisentido pueden utilizarse como agentes terapéuticos para bloquear la expresión de ciertos genes in vivo. Ya se ha demostrado que los oligonucléotidos antisentido cortos pueden importarse hacia las células en las que actúan como inhibidores, a pesar de contar con concentraciones intracelulares bajas a causa de la absorción restringida de la membrana celular (Zamecnik y col., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 83:4143-4146 (1986)) . Es posible modificar los oligonucléotidos para aumentar su absorción, por ejemplo, sustituyendo los grupos de fosfodiéster cargados negativamente por grupos no cargados. Para obtener revisiones generales de los métodos de terapia génica, véase, por ejemplo, Goldspiel y col., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993); Wu y Wu Biotherapy 3:87-95 (1991); Tolstoshev Ann . Rev. Pharmacol. Toxicol . 32:573-596 (1993); Mulligan Science 260:926-932 (1993) ; Morgan y Anderson Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993) ; y May TIBTECH 11:155-215 (1993) . Los métodos habitualmente conocidos en la tecnología del ADN recombinante que son de utilidad se describen en Ausubel y col., eds. (1993) Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY; y Kriegler (1990) Gene Transfer and Expression , A Laboratory Manual, Stockton Press, NY.

[0268] Existen diversas técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían, dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere hacia las células en cultivo in vitro o in vivo hacia las células del huésped deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico hacia las células de mamíferos in vitro incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, método de precipitación con fosfato de calcio, etc. Las técnicas actualmente preferidas para la transferencia de genes in vivo incluyen la transfección con vectores virales (generalmente retrovirales ) y la transfección mediada por envoltura viral liposoma-proteina (Dzau y col., Trends in Biotechnology 11, 205-210 (1993) ) . Por ejemplo, las técnicas para la transferencia de ácido nucleico in vivo incluyen la transfección con vectores virales (como por ejemplo, un adenovirus, el virus del herpes simple I, un lentivirus, un retrovirus o un virus adeno-asociado) y los sistemas basados en lipidos (los lipidos de utilidad para la transferencia mediada por lipidos del gen son DOTMA, DOPE y DC-Col, por ejemplo) . Algunos ejemplos de la utilización de vectores virales en la terapia génica pueden encontrarse en Clowes y col., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994) ; Kiem y col., Blood 83:1467-1473 (1994); Salmons y Gunzberg Human Gene Therapy 4:129-141 (1993) ; Grossman y Wilson Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993); Bout y col., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994) ; Rosenfeld y col., Science 252:431-434 (1991) ; Rosenfeld y col., Cell 68:143-155 (1992); Mastrangeli y col., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993) ; y Walsh y col., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993) .

[0269] En algunas situaciones es conveniente proporcionar la fuente del ácido nucleico con un agente que actúe sobre las células dianas, como por ejemplo, un anticuerpo especifico para una proteina de membrana de la superficie celular o la célula diana, un ligando para un receptor de la célula diana, etc. Cuando se empleen liposomas, pueden utilizarse las proteínas que se unen a una proteína de membrana de la superficie celular asociada con endocitosis para actuar y/o facilitar la unión, como por ejemplo, proteínas de la cápside o fragmentos de las mismas con tropismo para un tipo de célula en particular, anticuerpos para proteínas que sufren internalización en ciclos y proteínas que actúan en la localización intracelular y mejoran la semivida intracelular . La técnica de endocitosis mediada por un receptor se describe, por ejemplo, en Wu y col., J. Biol . Chem. 262:4429-4432 (1987); y Wagner y col., Proc. Nati. Acad. Scí . USA 87:3410-3414 (1990). Para obtener una revisión de los protocolos para la marcación de genes y la terapia génica, véase Anderson y col., Science 256:808-813 (1992). Dosificación y administración

[0270] Los agentes de la invención (antagonista del VEGF, agente reductor de células mieloides, agente quimioterapéutico o agente antienoplásico ) se administran a un paciente humano de acuerdo con los procedimientos conocidos, como por ejemplo la administración intravenosa como un bolo o una infusión continua durante un período de tiempo, mediante vías intramusculares, intraperitoneales , cefalorraquídeas, subcutáneas, intraarticulares , intrasinoviales , int ratecales , orales, tópicas o por inhalación y/o administración subcutánea.

[0271] En ciertas formas de realización, el tratamiento de la invención implica la administración combinada de un antagonista del VEGF y uno o más agentes reductores de células mieloides o agentes quimioterapéut icos . En una forma de realización, están presentes agentes ant ineoplásicos adicionales, por ejemplo, uno o más agentes antiangiogénesis diferentes, uno o más agentes quimioterapéuticos , etc. La invención también contempla la administración de inhibidores múltiples, por ejemplo, anticuerpos múltiples para el mismo antígeno o anticuerpos múltiples para diferentes proteínas de la invención. En una forma de realización, se administró un cóctel de diferentes agentes quimioterapéuticos con el antagonista del VEGF y/o uno o más agentes reductores de células mieloides. La administración combinada incluye la coadministración, usando formulaciones separadas o una formulación farmacéutica única y/o la administración consecutiva en cualquier orden. Por ejemplo, un antagonista del VEGF puede preceder, seguir o alternarse con la administración del agente reductor de células mieloides o el agente quimioterapéutico, o puede administrarse simultáneamente con ellos. En una forma de realización, existe un periodo en el cual ambos (o todos) los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas.

[0272] Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis adecuada del agente de la invención dependerá del tipo de enfermedad que deba tratarse, tal y como se define anteriormente, la gravedad y el curso de la enfermedad, si el inhibidor se administra para fines preventivos o terapéuticos, la terapia anterior, la historia clínica del paciente y la respuesta al inhibidor, y el criterio del médico tratante. El inhibidor se administra adecuadamente al paciente una vez o en una serie de tratamientos. En un tratamiento combinado, las composiciones de la invención se administran en una cantidad terapéuticamente eficaz o sinérgica. Como se usa en la presente memoria descriptiva, una cantidad terapéuticamente eficaz es la que consigue que la administración de una composición de la invención y/o la coadministración de un antagonista del VEGF y de uno o más agentes terapéuticos dé como resultado la reducción o inhibición de la enfermedad o estado que se combate. El efecto de la administración de una combinación de agentes puede ser aditivo. En una forma de realización, el resultado de la administración es un efecto sinérgico. Una cantidad terapéuticamente sinérgica es la cantidad de antagonista del VEGF y de uno o más agentes terapéuticos., por ejemplo, agente reductor de células mieloides, un agente quimioterapéutico o un agente antineoplásico, necesaria para reducir sinérgica o significativamente o eliminar los estados o síntomas asociados a una enfermedad determinada.

[0273] Dependiendo del tipo y la gravedad de la enfermedad, una dosis inicial candidata para la administración en un paciente es de aproximadamente 1 pg/kg a 50 mg/kg (por ejemplo, 0, l-20mg/kg) de un antagonista del VEGF o un agente reductor de células mieloides, un agente quimioterapéutico o un agente antineoplásico, ya sea, por ejemplo, mediante una o más administraciones separadas o mediante una infusión continua. Una dosis diaria típica podría oscilar entre aproximadamente 1 µg/kg y 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente. Para administraciones repetidas durante varios días o más, dependiendo de la enfermedad, el tratamiento se mantiene hasta que se produzca la supresión deseada de los síntomas de la misma. No obstante, también pueden ser útiles otras pautas posológicas. Generalmente, el médico administrará una o más moléculas de la invención hasta obtener una dosis que brinde el efecto biológico requerido. El progreso del tratamiento de la invención se controla fácilmente mediante técnicas y ensayos convencionales .

[0274] Por ejemplo, la preparación y programación de las dosis para los inhibidores de la angiogénesis , por ejemplo, anticuerpos anti-VEGF, como AVASTIN® (Genentech) , pueden utilizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o según lo determinado empíricamente por el médico cualificado. En otro ejemplo, la preparación y programación de las dosis para dichos agentes quimioterapéuticos puede realizarse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o tal y como lo determine empíricamente el médico cualificado. La preparación y la programación de las dosis para la quimioterapia se describen también en Chemotherapy Service Ed. , M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). Eficacia del tratamiento

[0275] La eficacia del tratamiento de la invención puede medirse mediante diversos puntos de valoración comúnmente usados en la evaluación de los trastornos neoplásicos o no neoplásicos. Por ejemplo, los tratamientos contra el cáncer pueden evaluarse mediante, por ejemplo, entre otros, la regresión del tumor, la reducción del peso o el tamaño del tumor, el tiempo de progresión, la duración de supervivencia, la supervivencia sin progresión, el índice de respuesta global, la duración de la respuesta, la calidad de vida, la expresión y/o actividad de la proteína. Puesto que los agentes antiangiogénicos aquí descritos tienen como objetivo la vasculatura del tumor y no necesariamente las células neoplásicas mismas, representan una clase única de fármacos contra el cáncer y por lo tanto pueden requerir mediciones y definiciones únicas de las respuestas clínicas a los fármacos. Por ejemplo, una reducción del tumor superior al 50% en un análisis bidimensional es el límite estándar para proclamar una respuesta. Sin embargo, los inhibidores de la invención pueden provocar inhibición de la extensión metastásica sin reducción del tumor original, o simplemente pueden tener un efecto tumorestático . Por lo tanto, pueden emplearse distintos procedimientos para determinar la eficacia de la terapia, entre los que se incluyen a modo de ejemplo, la medición del plasma o de los marcadores urinarios de la angiogénesis y la medición de la respuesta a través de imágenes radiológicas. Artículos de fabricación

[0276] En otra forma de realización de la invención, se proporcionan artículos de fabricación que contienen materiales útiles para el tratamiento de los trastornos o el diagnóstico de los trastornos descritos anteriormente. El articulo de fabricación comprende un envase, una etiqueta y un prospecto. Entre los envases adecuados se encuentran, por ejemplo, botes, viales, jeringas, etc. Los envases pueden estar hechos de diversos materiales, como vidrio o plástico. En una forma de realización, el envase contiene una composición que es eficaz en el tratamiento de la enfermedad y puede tener un puerto de acceso estéril (por ejemplo, el envase puede ser una bolsa para solución intravenosa o un vial con un tapón perforable con una aguja hipodérmica) . Al menos un agente activo en la composición es un modulador del VEGF y al menos un segundo agente activo es un agente reductor de células mieloides y/o un agente quimioterapéutico . La etiqueta del envase o asociada a él indica que la composición se utiliza para el tratamiento del trastorno elegido. El articulo de fabricación puede comprender además un segundo envase que contiene una solución farmacéuticamente aceptable, como por ejemplo, una solución salina fosfatada, una solución de Ringer y una solución de dextrosa. En otra fprma de realización, los envases contienen un grupo de marcadores para el diagnóstico de tumores resistentes. Al menos un agente en la composición es un marcador para detectar un Grl, una elastasa leucocitaria , CD19, CD90, CDllc, una URCGP, una URRTP, una DRCGP y/o una DRRTP. La etiqueta del envase o asociada al mismo indica que la composición se utiliza para diagnosticar un tumor resistente a un tratamiento con antagonista del VEGF. Los artículos de fabricación de la invención también puede incluir otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, incluidos agentes activos, otras soluciones, diluyentes, filtros, agujas y jeringas.

EJEMPLOS

[0277] Se entiende que los ejemplos y las formas de realización descritos en la presente memoria descriptiva se proporcionan únicamente a título ilustrativo y que los expertos en la materia sugerirán diversos cambios o modificaciones a la luz de los mismos, que se incluirán en el espíritu y el articulado de esta solicitud y en el alcance de las reivindicaciones anexas. Ejemplo 1 : Resistencia tumoral al tratamiento anti-VEGF por la acción de las células mieloides CDllb+Grl+

[0278] Se investigaron las reacciones celulares y moleculares, que originan la resistencia de los tumores experimentales al tratamiento anti-factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) . Se descubrió una correlación entre la atracción de células derivadas de la médula ósea y el desarrollo de resistencia por parte del tumor al tratamiento anti-VEGF. Los experimentos de tumores añadidos y mezclados demostraron que las células CDllb+Grl+ aisladas de la médula ósea o de tumores murinos que contengan tumores resistentes al tratamiento anti-VEGF (pero no sensibles anti-VEGF) son suficientes para generar resistencia al tratamiento anti-VEGF. Los medios condicionados in vitro de los tumores resistentes al anti-VEGF (pero no sensibles al anti-VEGF) estimularon la migración de células CDllb+Grl+. La atracción de células CDllb+Grl+ hacia tumores primarios representa un mecanismo celular que media la resistencia al ' tratamiento anti-VEGF. En el análisis de la expresión génica de las células CDllb+Grl+ tumorales cebadas, se identificó un conjunto de genes regulados por los tumores resistentes. La movilización y activación de células mieloides CDllb+Grl+ puede representar dos etapas en el desarrollo de la resistencia al tratamiento anti-VEGF. Un tratamiento combinado con compuestos que actúan sobre las células mieloides con anti-VEGF suprimió aún más la angiogénesis y el crecimiento tumoral, y retrasó el inicio de la resistencia al anti-VEGF demostrando los beneficios terapéuticos de la combinación de compuestos que actúan sobre las células mieloides y el VEGF. MÉTODOS

[0279] Líneas celulares. Las lineas celulares tumorales EL4, LLC, B16F1 y TIB6 (J558) se obtuvieron de la American Type Culture Collection (ATCC) , se mantuvieron en el cultivo tisular en un medio Dulbecco' s Modified Médium (DMEM) con altos contenido de glucosa y se complementaron con el 10% de suero bovino (FBS) y 2mM de glutamina. Los términos "B16F1" y "B16" se utilizan indistintamente en la presente memoria descriptiva para referirse a la misma linea celular de melanoma .

[0280] Anticuerpos . El anti-VEGF, como G6-23, es un anticuerpo que se une a y neutraliza las formas humanas y murinas del VEGF. La porción de la IgG deriva de la tecnología de presentación en fagos y comprende el isotipo murino IgG2a (véase, por ejemplo, Malik, A.K. y col. Redundant roles of VEGF-B and P1GF during selective VEGF-A blockade in mice. Blood 107:550-7 (2006)); se dosificó a 10 mg/kg, IP, dos veces por semana, a menos que se haya especificado lo contrario. El anticuerpo de control apareado a isotipo era el anticuerpo ragweed-IgG2a anti-humano (Genentech, Inc.). Los anticuerpos anti-CDllb+ (eBioSciences) , anti-L-select ina (BD BioSciences) y anti-CXCR4 (Torrey Pines Lab) se utilizaron en experimentos de FACS. Se administraron 10 mg/kg de anti-Grl Mab (eBioSciences, CA o BD BioSciences, CA) , IP, dos veces por semana. Un inhibidor de elastasa (1 mg/ratón; eBiosciences , San Diego, CA) se administró IP, diariamente, a ratones C57B1/6 (n=5) comenzando el días posterior a la implantación de 5xl06 células EL4 o LLC . La medición de los tumores se realizó dos veces por semana y los pesos de los tumores terminales se determinaron tal como se describió anteriormente .

[0281] Modelo de ratones quiméricos C57BL/6 GFP. Los ratones C57BL/6 y los ratones transgénicos (C57BL/6-TgN; ACTbEGFP; lOsb; JAX stock# 003291) que poseen la proteina fluorescente verde mejorada (EGFP) de entre 6 y 8 semanas de edad se obtuvieron de Charles River Laboratories y Jackson Laboratories, respectivamente. La EGFP se controla a partir del promotor de ß-actina, la cual existe abundantemente en todas las células de los ratones transgénicos con EGFP (véase, por ejemplo, Okabe, M., Ikawa, M., Kominami, K. , Nakanishi, T. & Nishimune, Y. ' Green mice ' as a source of ubiguitous green cells. FEBS Lett 407:313-9 (1997)) . Los ratones quiméricos C57BL/6 con GFP se generaron mediante irradiación letal (11 Gy, irradiador de Cs-) de ratones C57BL/6 para eliminar la médula ósea endógena, seguida del rescate con 5 x 106 CMMO aisladas de ratones transgénicos con EGFP. Las CMMO se prepararon tal como se describió anteriormente (véase, Gerber, H.P: y col. VEGF regulates haematopoiet ic stem cell survival by an internal autocrine loop mechanism. Nature 417:954-8. (2002)) . Todos los experimentos de xenotransplantes de tumores en ratones quiméricos se realizaron por lo menos 4 semanas después de la reconstitución hematopoyét ica . Para los experimentos de crecimiento tumoral, 5 x 106 células tumorales LLC o EL4 murinas se inyectaron subcutáneamente en el área dorsal. Para los experimentos en ratones XID, se implantaron 1 x 107 células tumorales LLC o EL4.

[0282] Experimentos de B16F1 añadidos . Se realizaron estudios sobre el crecimiento tumoral en ratones XID beige sin pelaje (Harían Sprague Dawley) , en ratones C57BL/6 (Jackson Lab, Bar harbor) o en ratones quiméricos con GFP en la médula ósea. 5 x 106 o 107 células tumorales (como se indica) se resuspendieron en 200 µ? de MatriGel (Factor de crecimiento reducido, BD BioSciences, CA) y se inyectaron subcutáneamente en la región del flanco dorsal de los ratones. Para los experimentos de tumores añadidos y mezclados en la médula ósea, se mezclaron 106 células CMMO o CDllb+Grl+ aisladas de la médula ósea con 2,5 x 106 células B16F1 en 200 µ? de matrigel (BD BioSciences) y se implantaron en el flanco de ratones C57BL/6 inmediatamente. Para los experimentos de tumores añadidos y mezclados en células GFP+/CDllb+Grl+, 2 x 106 células B16F1 se añadieron y mezclaron con 3 x 105 células GFP+, y se implantaron tal como se describió. El tratamiento de anticuerpos de control (ant i-Reagweed) o anti-VEGF (G6-23) se inició 4 días después de la inoculación de las células tumorales. El tamaño del tumor se evaluó entre 2 y 3 veces por semana utilizando pies de rey después de que los tumores alcanzaran un tamaño palpable. El volumen de los tumores se determinó utilizando la fórmula Pi/6 x L x W x W en la que L representa la mayor distancia y W el diámetro en la posición perpendicular a L.

[0283] Quimioterapia. A los ratones C57B1/6 se les implantaron lineas celulares TIB6, B16F1, EL4 y LLC . Los ratones no recibieron ningún tratamiento durante los primeros 4 dias después de la implantación para permitir el establecimiento de las células tumorales. Los agentes quimioterapéuticos , incluyendo 5-Flourouracil (5FU, American Pharmaceut ical Partner, IL; 50 mg/kg una vez por semana) y Gemcitabina (Eli Lilly Co, IN, 120 mg/kg dos veces por semana), se administraron IP. El volumen del tumor se midió dos veces por semana y se calculó tal como se describió.

[0284] Inmunohistoquímica (IHC) . Para los análisis de inmunofluorescencia , los tumores se recogieron y se congelaron en un medio con temperatura óptima de corte (OCT) para realizar criosecciones . En total, criosecciones tumorales de 6 m se secaron a temperatura ambiente durante 1 hora y se fijaron en acetona durante 10 minutos a -20 °C. Después de secar al aire durante 4 minutos a temperatura ambiente, los sitios de unión no específicos se bloquearon al incubarlos durante 1 hora a temperatura ambiente en un 20% de suero de cabra normal (NGS, GIBCO #16210-064; elaborado en una solución salina amortiguadora de fosfatos ("PBS") ) . Las partes se tiñeron secuencialmente con los siguientes anticuerpos diluidos en solución bloqueadora DAKO ( DakoCytomation, CA) : anitucerpo de conejo anti-GFP conjugado con AlexaFluor 488 (sondas moleculares) mantenido en una dilución de 20 yg/ml durante 1 hora a temperatura ambiente, anticuerpo de cabra anti-conejo conjugado con AlexaFluor 488 (sondas moleculares) mantenido en una dilución 1:500 durante 1 hora a temperatura ambiente, anticuerpo PECAM-1 de rata anti-ratón (Clone MEC13.3; BD Pharmingen) en una dilución 1:100 durante toda la noche a 4°C y anticuerpo de cabra anti- rata conjugado con AlexaFluor 594 (sondas moleculares) mantenido en una dilución 1:500 durante 1 hora a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron y se montaron en el medio de montaje fluorescente DAKO y se recogieron imágenes de inmunofluorescencia en un microscopio Nikon equipado con un objetivo Plan-Neofluar 20x y se combinaron digitalmente.

[0285] Medición de la superficie vascular (VSA) . La superficie vascular del tumor se cuantificó a partir de imágenes digitales de partes teñidas con CD31 utilizando un objetivo 20x. Generalmente, los pixeles correspondientes a los vasos teñidos se seleccionaron utilizando el software ImageJ y un umbral predeterminado establecido entre 50 y 70 como limite. Se eliminaron los pixeles perdidos contaminantes (no vasos) . A menos que se haya indicado lo contrario, se analizó un total de entre 3 y 5 tumores por grupo. Se tomó un total de 15 imágenes de cada una de las secciones del tumor. Cada imagen cubre un área de 1502 µ??2. A menos que se haya indicado lo contrario, la tinción de fondo de cada grupo se determinó mediante el uso de un anticuerpo de control marcado y se sustrajo de la cantidad total de vasos. El área de pixeles de los vasos agregados con respecto al área de la imagen total y al área total analizada se registra como % de vaso/superficie. En una forma de realización, la superficie vascular puede cuantif icarse utilizando un método cuantitativo no invasivo, incluyendo, entre otros, imágenes por resonancia magnética, imágenes dinámicas por resonancia magnética con contraste mejorado, tomografia computada (TC) y tomografia con emisión de positrones (PET) . Véase, por ejemplo, O'Connor y col., Britísh Journal of Cáncer 96:189-195 (2007) . En determinadas formas de realización, el agente de contraste del gadolinio y sus derivados y complejos pueden utilizarse en las imágenes por resonancia magnética.

[0286] Citometría de flujo. Se aislaron los tumores murinos de control y tratados con anti-VEGF, y se generó una suspensión de células únicas mediante el corte de tejidos tumorales seguido del tratamiento con un homogenizador celular (VWR) . Se extrajeron CMMO del fémur y la tibia de animales implantados y se las sometió a una lisis de glóbulos rojos utilizando el tampón de lisis de cloruro amónico (Cambrex, MA) . La sangre periférica se recogió mediante sangrado retroorbital y se pretrató 40 µ? de sangre periférica con el tampón de cloruro amónico para realizar la lisis de glóbulos rojos.

[0287] Las células de la MO, tumorales o de sangre periférica se tiñeron con una serie de anticuerpos monoclonales incluyendo CDllb, Grl, CD19, CD90, VEGFR2, CXCR4, L-Selectina 2 (todos de BD BioSciences, CA) , VEGFR1 (R&D, CA) , Tie2 (eBioSciences , CA) junto con el control de isotipos apropiados para investigar las fracciones de linfoides y mieloides en cada compartimiento. Los datos de FACS se obtuvieron a partir del FACS calibur y se analizaron con el software Cell Queso Pro (BD Biosciences ) .

[0288] Para aislar las células GFP+ y/o CDllb+Grl+, se proporcionó una suspensión unicelular de la médula ósea o de los tumores de ratones implantados. A las células se las tiñó con anti-CDllb conjugado con APC y anti-Grl conjugado con PE. Las poblaciones de células GFP, GFP- , CDllb+Grl+ y CDllb-Grl-se aislaron en una máquina FACSVantage y el análisis postseparación garantizó la pureza de la población en cuestión en cada compartimiento.

[0289] Micromatrices . El ARN de las células CDllb+Grl+ derivadas de la médula ósea se aisló utilizando el kit Qiagen Rneasy (Qiagen) . Affymetrix (Affymetrix, Inc.) proporcionó los métodos de preparación del ARN complementario (ARNc) y de la hibridación/barrido de las matrices. Cinco g del ARN total se convirtieron en ADNc de doble cadena utilizando un equipo de síntesis de ADNc (SuperScript Choice, GIBCO/BRL) y un cebador de oligómeros T7-(dT)24 (Biosearch Technologies, Inc., Custom Synthesis) . El ADNc de doble cadena se purificó en una resina de afinidad (Kit del módulo de limpieza de muestras, Affymetrix, Inc.) y mediante precipitación de etanol . Después de la síntesis de la segunda cadena, el ARNc marcado se generó a partir de la muestra de ADNc utilizando una ARN polimerasa T7 y un nucleótido marcado con biotina en un reacción de transcripción in vitro (Enzo Biochem, Inc.) . El ARNc marcado se purificó en una resina de afinidad (kit del módulo de limpieza de muestras, Affymetrix) . La cantidad de ARNc marcado se determinó mediante la medición de la absorción a 260 nm y mediante el uso de la convención de que 1 OD a 260 nm corresponde a 40 g/ml de ARN. Veinte g de ARNc se fragmentaron mediante incubación a 94 °C durante 30 minutos en 40 mM de tris-acetato (pH 8,1), 100 mM de acetato de potasio y 30 mM de acetato de magnesio. Posteriormente, las muestras se hibridaron a las matrices 2,0 de genomas mu'rinos 430 a 45°C durante 19 horas en un horno asador a 60 rpm. Dichas matrices se lavaron, tiñeron y barrieron en el escáner y en la estación Affymetrix Fluidics. El análisis de datos se realizó utilizando el software de análisis Affymetrix GeneChip o el software Spotfire (Spotfire, MA) . Se seleccionaron para continuar con los análisis los genes con una intensidad de señal que supera al ARN de referencia en 1,5 veces, por lo menos. Posteriormente, se seleccionaron los genes que eran significativamente diferenciales (p = 0,05) (más de 1,5 veces en los análisis de CDllb y más de 2 veces en los análisis de tumores) expresados en muestras EL4 y LLC y comparados con el grupo de B16F1 correspondiente para realizar los análisis definitivos. El análisis de agrupación jerárquica de genes se realizó en todos los tumores y en los datos de CDllb utilizando los algoritmos del software Spotfire (Spotfire) .

[0290] Ensayo de migración celular. Las células tumorales se aislaron tal como se describe en el análisis FACS y se colocaron a razón de 1 x 106 células/ml en un medio DMEM, FCS al 10% y en un medio con 4mM de glutamina durante 4 días en un incubador de cultivo tisular de C02. El medio se concentró de manera proporcional al volumen original utilizando columnas Amicon (Millipore) . Se utilizaron 600 µ? de muestras triplicadas en placas de migración celular Transwell (Corning) . 2,5 x 104 CMMO recién aisladas de ratones C57BL/6 se resuspendieron en medio DMEM y se colocaron en la cámara superior de las placas Transwell; posteriormente, se las incubó a 37°C durante 9 horas y se midió la capacidad de migración de las CMMO mediante el recuento de células en las cámaras inferiores.

[0291] Se utilizaron las técnicas estadísticas de ANOVA para determinar las diferencias relevantes. El valor de p 0,05 se consideró significativo.

RESULTADOS

[0292] La resistencia al tratamiento anti-VEGF no surge como consecuencia de la dosificación subóptima y no depende de los linfocitos.

[0293] Para establecer un modelo experimental que permita evaluar la identidad y abundancia relativa de las células derivadas de la méduJ ósea (CMO) en tumores tratados con anti-VEGF, las células mononucleares de la médula ósea (C MO) marcadas con la proteína fluorescente verde (GFP+) se transfirieron adoptivamente a los ratones C57BL/6 irradiados mortalmente (véase, por ejemplo, M. y col., ' Green mice ' as a source of ubiquitous green cells. FEBS Lett 407:313-9 (1997)) . Las líneas celulares de tumores singénicos C57BL/6 se implantaron en ratones quiméricos con médulas óseas con GFP+ y se evaluaron los efectos de un anticuerpo neutralizador del VEGF (G6-23 (véase, por ejemplo, Malik, A.K y col., Redundant roles of VEGF-B and P1GF during selective VEGF-A blockade in mice. Blood (2005) ) en la angiogénesis y el crecimiento tumoral. Estas líneas celulares incluyeron una línea celular de melanomas (B16F1), dos lineas celulares de linfomas de células T (EL4 y TIB6) y una línea celular de carcinoma de pulmón de Lewis (LLC) . Los términos "B16F1" y "B16" se utilizan indistintamente en la presente memoria descriptiva para referirse a la misma línea celular de melanoma. El crecimiento de tumores B16F1 se bloqueó con el anti-VEGF (G6-23) (Fig. la) . En un experimento diferente, el crecimiento de tumores TIB6 también se bloqueó significativamente por la acción del anti-VEGF. Sin embargo, los tumores EL4 y LLC sólo se suprimieron transitoriamente y después de un retraso inicial del crecimiento, los tumores comenzaron a expandirse rápidamente (Fig. la) . De manera similar, el tratamiento con G6-23 de lo tumores EL4 (Fig. Ib) y LLC (Fig. le) implantados en ratones beige sin pelo (nude) inmunodeprimidos con inmunodeficiencia ligada a X (XID) generó retrasos de crecimiento tumoral solamente transitorios en todas las dosis evaluadas. Estos descubrimientos indican que la resistencia al tratamiento anti-VEGF se produce de manera independiente a los linfocitos T y B. La resistencia de los tumores EL4 y LLC no se generó por acción de las dosis subóptimas del anticuerpo anti-VEGF en este modelo (Fig. Ib y le) .

[0294] Carencia de células progenítoras endoteliales derivadas de la médula ósea (CPE) en la vasculatura de los tumores resistentes y sensibles al anti-VEGF.

[0295] El análisis de separación de las células activadas por fluorescencia (FACS) de los aislados de tumores EL4 y LLC revelaron un incremento de frecuencia (p = 0,05) de las células GFP+ de la médula ósea en tumores resistentes tanto en ratones tratados con anti-VEGF y con el control en comparación con los tumores sensibles al anti-VEGF, lo cual sugiere que la resistencia al tratamiento anti-VEGF se relaciona con la atracción de CMMO (Fig. Id) . Para dilucidar si la infiltración directa de CMMO contribuye a la vasculatura tumoral, se utilizó la tinción doble de la molécula de adhesión celular plaquetaria-endotelial (CD31, PECAM) /GFP para cuantificar las superficies de los microvasos y la cantidad de células GFP+/CD31+ (PECAM) CPE en las secciones del tumor. El decimocuarto día de tratamiento, y sin considerar el tipo de tumor, la gran mayoría de las estructuras vasculares de CD31+ en tumores tratados con anti-VEGF o con el control carecían de expresión de GFP+ (Fig. le) . Estos descubrimientos sugieren que la atracción de CPE derivadas de la médula ósea hacia la vasculatura tumoral no contribuye directamente a la formación de la vasculatura tumoral en tumores sensibles o resistentes al anti-VEGF. Los tumores EL4 y LLC tratados con anti-VEGF exhibieron una reducción de entre 2 y 3 veces en la superficie vascular en comparación con los tumores tratados con el control (Fig. lf) y una reducción similar en los pesos de los mismos. La reducción en los vasos CD31+ después del tratamiento anti-VEGF fue más alta en los tumores B16F1 sensibles al anti-VEGF que en los tumores EL4 y LLC resistentes al anti-VEGF. Además, el análisis de la superficie vascular (VSA) demostró una reducción significativa (p = 0,05) en los vasos CD31+ después del tratamiento anti-VEGF en tumores sensibles en comparación con los tumores resistentes (Fig. lf ) .

[0296] La atracción y el cebado de CMMO son importantes para la resistencia al anti-VEGF.

[0297] Los experimentos de tumores añadidos y mezclados se realizaron con tumores B16F1 sensibles al anti-VEGF para evaluar la relevancia funcional de las CMMO GFP+ en el desarrollo de la resistencia al tratamiento anti-VEGF. Véanse las Fig. 6a y b, y la Fig. 7 para conocer el diseño experimental y la pureza celular. Para realizar experimentos quiméricos en tumores y médula ósea, se aislaron células GFP+ de los tumores o de la médula ósea de los ratones implantados con tumores sensibles y resistentes. El análisis postseparación garantizó la pureza de las células GFP+ en cada compartimiento. Añadir y mezclar tumores B16F1 con CMMO cebadas mediante tumores resistentes revelaron un efecto significativo de estimulación del crecimiento (p = 0,05) (Fig. 2a, b) . Sin embargo, las tasas de crecimiento de los tumores B16F1, cuando se los añadió y mezcló con CMMO cebadas mediante tumores B16F1 o implantes de matrigel de control, no sufrieron modificaciones importantes (Fig. 2a, b) . Las CMMO aisladas de la tibia de los ratones con tumores EL4 y LLC, añadidos y mezclado con tumores B16F1, incrementaron significativamente las tasas de crecimiento tumoral en comparación con las CMMO de los ratones implantados con matrigel o el control (Fig. 2a) . Las diferencias en las tasas de crecimiento tumoral fueron más pronunciadas en los grupos tratados con anti-VEGF (Fig. 2b) que en los grupos tratados con anticuerpos de control (Fig. 2a) . Por el contrario, las tasas de crecimiento en los tumores B16F1 no se incrementaron significativamente cuando se los añadió y mezcló con las CMMO cebadas con tumores B16F1 o el matrigel de control, sin importar el tratamiento (Fig. 2a, b) . De la misma forma, las células GFP+ aisladas de tumores EL4 y LLC después de 14 días de crecimiento fueron suficientes para mediar la resistencia al tratamiento anti-VEGF cuando se los añadió y mezcló con los tumores B16F1 sensibles al anti-VEGF (Fig. 2c, d) . Las CMMO GFP+ o las células CDllb+Grl+ no generaron tumores cuando se las implantó individualmente, lo cual demuestra la ausencia de células tumorales contaminantes. La proximidad física de las CMMO y de los tumores sensibles al anti-VEGF no es suficiente para inducir la resistencia y el cebado de las células de la médula ósea por parte de los tumores resistentes al anti-VEGF es necesario en la mediación de la resistencia tumoral. Estos datos combinados indican que tanto la atracción de las CMMO a los tumores como el cebado por parte de los tumores resistentes son dos de los pasos en la serie de reacciones que conducen al desarrollo de la resistencia al tratamiento anti-VEGF.

[0298] Las células CDl lb+Grl+cebadas por los tumores resistentes constituyen la principal población de la médula ósea que media la resistencia al anti-VEGF.

[0299] Las CMMO comprenden una población heterogénea que incluye células de linajes linfoides, mieloides o primitivos. Morrison, S.J. y col., Annu Rev Cell Dev Biol , 11:35-71 (1995) .

[0300] Los datos que aparecen en las figuras 3a-d sugieren que las células CDllb+Grl+, que representan la población de células mieloides, constituyen el subconjunto principal de las CMMO en el desarrollo de la resistencia al anti-VEGF. Véase, por ejemplo, Onai, N. y col., Blood, 96:2074-2080 (2000) . Se desarrolló un ensayo de migración celular in vitro para evaluar las CMMO expuestas a un extracto soluble recogido de tumores resistentes y sensibles. Los tumores crecieron durante 14 días en ratones tratados con anticuerpos anti-VEGF o de control. El ensayo de migración in vitro indicó una capacidad de migración mayor (p = 0,05) de células de la MO CDllb+Grl+ hacia los extractos solubles de los tumores resistentes pero no sensibles (Fig. 3a) . Por lo tanto, los factores quimioatrayentes de células mieloides se encuentran en los extractos solubles de los tumores tratados con anti-VEGF o con el control y permanecieron sin verse afectados cuando se agregó el anti-VEGF (10 µ?/p??) a los medios. Estos descubrimientos sugieren que la atracción de células mieloides es intrínseca a los tumores, independiente del VEGF y no es inducida por el tratamiento. Estos descubrimientos concuerdan con los datos de los experimentos de crecimiento tumoral (Fig. Id) en los que el tratamiento anti-VEGF no bloqueó eficazmente la migración de CMMO a los tumores resistentes y respaldan aún más la noción de que la atracción de las células mieloides es intrínseca a los tumores y no inducida por el tratamiento.

[0301] Debido al incremento en la migración de células CDllb+Grl+ en respuesta al medio condicionado por los tumores resistentes al anti-VEGF (Fig. 3a), se utilizó el análisis FACS para estudiar los linajes mieloides, linfoides y hematopoyéticos obtenidos de tumores EL4 y LLC que crecieron en ratones. Cuando se los agrupó en el subconjunto de CDllb+, los tumores EL4 y LLC mostraron un enriquecimiento de células CDllb+Grl+ en comparación con los tumores B16F1 (Fig. 3b) . Las diferencias fueron más pronunciadas en los tumores tratados con anti-VEGF. En los tumores B16F1, la población de células CDllb+Grl+ se redujo considerablemente en aquellos tratados con anti-VEGF, mientras que se no se vió afectada en los tumores EL4 o LLC (Fig. 3b) . En otro experimento, el compartimiento de células mieloides en ratones con tumores TIB6, B16F1, EL4 y LLC se analizó utilizando una máquina FACS y anticuerpos monoclonales contra CDllb y Grl. El análisis fluj ocitométrico de infiltración de CMMO en los aislados de los tumores EL4 y LLC demostraron un enriquecimiento significativo (p = 0,05) de las células CDllb+Grl+ en comparación con los tumores TIB6 y B16F1. Estos resultados concuerdan con los niveles reducidos de CMMO en los tumores sensibles al anti-VEGF (Fig. Id) y respaldan aún más la correlación entre la atracción de células CDllb+Grl+ hacia los tumores y el desarrollo de la resistencia a los fármacos. En oposición a los datos de las CDllb+Grl+ aisladas en tumores, se detectaron cambios menos pronunciados en los subconjuntos de CDllb+ de la médula ósea de ratones con tumores (Fig. 3c) . Estos datos sugieren la existencia de una intercomunicación entre la médula ósea y los tumores murinos resistentes ya que atraen más CDllb+Grl+ y también le ordenan a la médula ósea que genere más células mieloides.

[0302] Análisis posteriores de las células CDllb+Grl+ en tumores resistentes y sensibles revelaron una mayor expresión de moléculas con participación conocida en la migración y migración transendotelial de las células mieloides, como CXCR4 y L-Selectina, respectivamente. Las cantidades relativas de células CDllb+CD31+ (CPE) y CDllb+CXCR4+ (neutrófilos) , CD19 (células B) , CD90 (células T) , CDllc (células dendriticas) y VEGFR-2 en las CMMO de ratones con tumores fueron similares entre los grupos en tratamiento y los tipos de tumores, a excepción de las células CD19 en algunos tumores (Fig. 14) .

[0303] Además de CDllb y Grl, se investigaron las expresiones de otros linajes hematopoyét icos , como los linfoides B y T, CDllc, y también VEGFRl y VEGFR2 en ratones con tumores (Fig. 15) . Una reducción significativa (p = 0,05) en la frecuencia de las células linfoides B y las células dendriticas resultó notable en los tumores resistentes (Fig. 15a) . Además, los datos indican una diferencia significativa en la frecuencia de los linfoides B y T asi como también de las células dendriticas en las O de ratones con tumores resistentes en comparación con los correspondientes tumores sensibles (Fig. 15b) . Estas observaciones sugieren que el incremento en la frecuencia de células mieloides en los tumores resistentes se asocia con una reducción en los linajes hematopoyéticos . Además de la MO y los tumores, se analizaron los bazos en ratones con tumores, ya que estudios previos sugieren que las células CDllb+Grl+ esplénicas contribuyen a la expansión tumoral. Véase, por ejemplo, Kusmartsev, S. & Gabrilovich, D.I., Cáncer Immunol Immunother, 51:293-298 (2002); Bronte, V. y col., B.lood, 96:3838-3846 (2000) . Para respaldar los datos sobre la MO y los tumores, se detectó un incremento (p = 0,05) en la frecuencia de células CDllb+Grl+ en los bazos y un incremento en el tamaño de los bazos (p = 0,05) en ratones a los que se les implantaron tumores resistentes en comparación con los tumores sensibles (Fig. 16a y b) . En conjunto, estas observaciones sugieren que las células CDllb+Grl+ cumplen el papel funcional de ser una de las poblaciones de células más importantes en la mediación de la resistencia al tratamiento anti-VEGF.

[0304] Para investigar la relevancia funcional de las células mieloides en la resistencia anti-VEGF, se aislaron subpoblaciones de CDllb+Grl+ y CDllb~Grl- de la médula ósea de ratones cebados con tumores EL4 y LLC (Fig. 17), y se añadieron y mezclaron con células tumorales B16F1.

[0305] Tal como se muestra en la Fig. 3d, las células CDllb+Grl+ fueron suficientes para mediar la resistencia al tratamiento anti-VEGF. Sin embargo, las CMMO y las células GFP+ derivadas de tumores sin células CDllb+Grl+ no pudieron mediar la resistencia. Las células CDllb+Grl+ de la médula ósea de ratones cebados con tumores resistentes al anti-VEGF pueden mediar la resistencia al tratamiento anti-VEGF. Por lo tanto, la figura 3d indica que las células CDllb+Grl+ cebadas por los tumores resistentes, pero no por los sensibles, median la resistencia al tratamiento anti-VEGF. Sin embargo, el añadido y la mezcla de B16F1 con células CDllb+Grl+ aisladas de B16F1 o de ratones cebados con matrigel no estimuló la resistencia al tratamiento anti-VEGF en comparación con la población de CDllb-Grl- (Fig 17a) .

Esto prueba aún más la hipótesis de que los tumores resistentes tienen una intercomunicación diferente con los compartimientos de células mieloides, en comparación con los tumores sensibles. Para investigar el impacto de las células CDllb+Grl+ en la vasculatura tumoral, se analizó la superficie vascular (VSA) en los tumores B16F1 añadidos y mezclados con células CDllb+Grl+ y CDllb-Grl- (Fig. 17b) . Estos descubrimientos indican que la VSA en el añadido y la mezcla de CDllb+Grl+ es significativamente (p = 0,05) superior a los B16F1 solos o que el añadido y la mezcla de células CDllb-Grl-, lo cual sugiere que el desarrollo de la vasculatura es una de las causas principales de la resistencia al anti-VEGF cuando se añaden y mezclan lineas celulares con células CDllb+Grl+. Se obtuvieron resultados similares cuando se analizaron células CDllb+Grl+ asociadas a un tumor aisladas de tumores resistentes, para evaluar su capacidad de conferir resistencia a los tumores sensibles (Fig. 3e, f ) . En consecuencia, tanto las células CDllb+Grl + como las células de la médula ósea asociadas a un tumor son suficientes para conferir resistencia al anti-VEGF cuando se las analiza en un enfoque de ganancia de función celular.

[0306] Los tumores resistentes al anti-VEGF inducen un conj unto específico de genes en las células CD1 lb+Grl+ de la médula ósea.

[0307] Para detectar las posibles diferencias en el estado de activación de las células CDllb+Grl+ en la médula ósea de ratones con tumores, se realizó un análisis de la expresión de genes utilizando matrices de ADN . El análisis de conglomerados no supervisados de células CDllb+Grl+ cebadas con tumores EL4 o LLC resistentes al anti-VEGF, identificó un conjunto característico de genes regulados diferencialmente , que era diferente de las células cebadas con tumores B16F1 sensibles al anti-VEGF (Fig. 4a) . El análisis de la ontología genética reveló un enriquecimiento de las citoquinas inflamatorias y los marcadores de diferenciación de células mieloides/macrófagas, y alteraciones en los niveles de factores pro- y antiangiogénicos por parte de los tumores resistentes al anti-VEGF (Fig. 4b) . Se identificó un grupo de genes comúnmente regulados al alza por ambos tumores resistentes al anti-VEGF, de los cuales se conoce su participación en la regulación de la angiogénesis , factor similar a la relaxina (RFL) (véase, por ejemplo, Silvertown, J.D., Summerlee, A.J. & Klonisch, T. Relaxin-like peptides in cáncer. Int J Cáncer 107:513-9 (2003)) y fosfolípido escramblasa (Endo-Lip) (véase, por ejemplo, Favre, C.J. y col . Expression of genes involved in vascular development and angiogenesis in endothelial cells of adult lung. Am J Physiol Heart Circ Physiol 285:H1917-38 (2003)) .

[0308] Otra categoría de genes asociada a la diferenciación y/o activación de células mieloides experimientó una importante regulación del alza en las células CDllb+Grl+ mediante tumores resistentes al anti-VEGF, incluyendo los receptores de IL-4 (véase, por ejemplo, Palmer-Crocker , R.L., Hughes, C.C. & Pober, J.S. IL-4 and IL-13 actívate the JAK2 tyrosine kinase and Stat6 in cultured human vascular endothelial cells through a common pathway that does not involve the gamma c chain) . J Clin Invest 98:604-9 (1996)) e IL-13 (véase, por ejemplo, Roy, B. y col. IL-13 signal transduction in human monocytes: phosphorylat ion of receptor component s , associat ion with Jaks , and phosphorylation/activation of Stats. J Leukoc Biol 72:580-9 (2002) ), CD14 (véase, por ejemplo, Scott, C.S. y col., Flow cytometric analysis of membrane CDllb, CDllc and CD14 expression in acute myeloid leukaemia : relat ionships with monocytic subtypes and the concept of relative antigen expression. Eur J Haematol 44:24-9 (1990)), TLR-1 (véase, por ejemplo, Edfeldt, K. , Swedenborg, J., Hansson, G.K. & Yan, Z . Q . Expression of toll-like receptors in human atherosclerotic lesions: a possible pathway for plaque activation. Circulation 105:1158-61 (2002)) (Fig. 4). En cambio, la trombospondina-1, un potente inhibidor de la angiogénesis (véase, por ejemplo, Good, D. y col., A tumor suppressor-dependent inhibitor of angiogénesis is immunologically and functionally indistinguishable from a fragment of thrombospondin . Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87:6624-6628 (1990); e Iruela-Arispe , M.L., Bornstein, P. & Sage, H. Thrombospondin exerts an antiangiogenic effect on cord formation by endothelial cells in vitro. Proc Nati Acad Sci U S A 88:5026-30 (1991)), se encontró entre los genes que experimentaron una regulación a la baja significativa en ambos tumores resistentes al anti-VEGF.

[0309] En otro experimento de micromatrices se descubrió que los tumores resistentes representan un perfil diferente de expresión génica. Se realizó el análisis del árbol génico de las células CDllb+Grl+ aisladas de la médula ósea de los ratones implantados con tumores EL4 (El-3), LLC (Ll-3) , B16F1 (Bl-3) y TIB6 (Tl-3) y tratados con anti-VEGF. Se identifican genes regulados a la baja, sin modificaciones y regulados al alza. Se identificó un conjunto característico de cambios inducido por tumores resistentes al anti-VEGF que es diferente al inducido por tumores sensibles al anti-VEGF. Se realizó un análisis de las matrices de genes expresados diferencialmente en células CDllb+Grl+ de la médula ósea aisladas de ratones con tumores TIB6, B16F1, EL4 y LLC y tratados con anti-VEGF durante 17 días. Se identificaron genes posiblemente involucrados en la regulación de la angiogénesis o diferenciación y migración de células mieloides con cambios significativos (p = 0,05, > 1,5 veces) en los niveles de expresión en tumores resistentes versus tumores sensibles. Los genes regulados al alza que se conocen que intervienen en la regulación de la angiogénesis incluyen el receptor interleucina-11 (IL-11R), receptor interleucina-1 II (IL-1RII), transmembrana interferona 1 (IFN TM1), miembro de la superfamilia de receptores del factor de necrosis tumoral 18 (TNFRSF18), integración Wingless 5A (WNT5A) , membrana transportadora secretora 1, proteina de choque calórico (HSP86), receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) , receptor Eph B2 (EphRB2), receptor emparejado de proteina G 25 (GPCR25), factor de crecimiento derivado del hepatoma (HGF) , angiopoyet ina-simil 6, receptor de efrina RA7 (Eph-RA7), semaforina Vlb, neurotrofina 5, claudin-18, metaloproteasa desintegrina MDC15 (MDC15 ) , matriz extracelular (ECM) y una desintegrina y metaloproteasa con motivo trombospondina 7B (ADAMTS7B) . Los genes regulados a la baja incluyeron moléculas de adhesión celular neural (NCAM-140), fibronectina tipo III, proteina de interacción de la proteina del síndrome de Wiskott-Aldrich (WIP) , CD74, molécula de adhesión intercelular 2 (ICAM-2), Jaggedl, integrina alfa 4 (Itga4), integrina BETA-7 (ITGB7), receptor del factor beta de crecimiento tumoral tipo II (TGF-BII-R) , proteína temprana inducible TGFb (TGFb IEP) , proteína mothers against decapentaplegic (MAD) y C. elegans SMA-4 (Smad4), receptor de la proteína morfogenét ica ósea 1A (BMPR1A) , CD83, Dectina-1, CD48, E-selectina, interleucina-15 (IL-15), inhibidor de señales de citoquinas 4, proteína relacionada con el receptor de citoquina 4 (Cytor4) y receptor 1 (CX3CR1) de quimioquina (C-X3-C) .

[0310] Se identificó un conjunto de genes regulados normalmente al alza por ambos tumores resistentes de los que se sabe que muchos intervienen en la regulación de la angiogénesis, incluyendo el factor similar a la relaxina (RLF) (Ho, R.L. y col., Immunological responses critical to the therapeutic effects of adriamycin plus interleukin 2 in C57BL/6 mice bearing syngeneic EL4 lymphoma, Oncol Res, 5:363-372 (1993) ), Neurotrophin 5 (Lazarovici, P.y col., Nerve growth factor (NGF) promotes angiogénesis in the quail chorioallantoic membrane, Endothelium , 13:51-59 (2006) ), fosfolipido escramblasa (Endo-Lip) (Favre, C.J. y col., Expression of genes involved in vascular development and angiogenesis in endothelial cells of adult lung, Am J Physiol Heart Circ Physiol, 285 : H1917-1938 (2003)), Angiopoyet ina-simil 6, Semaforina VIb, Eph RA7 , Eph RB2 y FGF13. Además, GM-CSF (Rapoport, A.P. y col., Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) : receptor biology, signal transduction, and neutrophil activation, Blood Rev, 6:43-57 (1992) ) que se relaciona con la diferenciación y/o activación de células mieloides también se reguló al alza en las células de la médula ósea CDllb+Grl+MO aisladas de ratones con tumores resistentes. Muchos de los genes que se conocen que intervienen en la activación/generación de células dendriticas se regulan a la baja por completo en células de la médula ósea CDllb+Grl+MO aisladas de tumores resistentes. Esto incluye, CD83, CD48, Crea7 y Dectina-1 (véase, por ejemplo, Lechmann, M y col., CD83 on dendritic cells: more than just a marker for maturation, Trends Immunol 23:273-275 (2002)), IL-15 (véase, por ejemplo, Feau, S. y col., Dendritic cell-derived IL-2 production is regulated by IL-15 in humans and in mice, Blood 105:697-702 (2005)) y CX3CR1 (véase, por ejemplo, Niess, J.H. y col., CX3CRl-mediated dendritic cell access to the intestinal lumen and bacterial clearance, Science 307:254-258 (2005)) . Los datos moleculares coinciden con el análisis de multilinaje de las CMMO (Fig. 15) , en donde existe una reducción significativa (p < 0,05) en la frecuencia de las células CDllc+ tanto en la MO como en los tumores en ratones con tumores resistentes. Además, diversos miembros de la superfamilia TGF-beta (véase, por ejemplo, Derynck, R y col., TGF-beta signaling in tumor suppression and cáncer progression, Nat Genet 29:117-129 (2001)) incluyendo Smad4 y BMPR1A se encuentran entre los genes regulados a la baja lo que sugiere un papel para la via TGF-beta en la regulación de la activación/diferenciación de las células CDllb+Grl+ en ratones con tumores resistentes.

[0311] Además, el análisis de expresión génica de los tumores LL2, EL4 y B16F1 se llevó a cabo y analizó en genes específicamente regulados al alza o a la baja en tumores resistentes (EL4+LL2) tratados con anti-VEGF, pero no así en tumores sensibles (B16F1) . En general, los patrones de expresión génica fueron diferentes entre los tipos de tumores. Como se muestra en la Fig. 4d, muchos de los genes cuya expresión génica se cambió entre tumores resistentes y sensibles al anti-VEGF pertenecen a la clase de quimioquinas y citoquinas, lo que sugiere la presencia de células inflamatorias en los tumores resistentes al anti-VEGF. Además, se identificaron diversos factores pro y ant iangiogénicos .

[0312] Asimismo, el análisis de expresión génica adicional en los tumores TIB6, B16F1, EL4 y LLC tratados con anti-VEGF indicó un perfil diferente de expresión génica entre todos los tipos de tumores. Los genes regulados al alza incluyeron el factor de crecimiento similar a la insulina 2, proteina de unión 3 (IGF2BP3), proteina de choque calórico 9A (HSP9A) , factor de crecimiento fibroblástico 18 (FGF18), proteina relacionada con el factor de crecimiento del tejido conectivo WISP-1 (ELM1), factor de crecimiento derivado del epitelio del cristalino a (Ledgfa) , receptor scavenger tipo A, lectina tipo C de macrofagos, precursor polimérico del receptor de la inmunoglobulina 3 (Pigr3), receptor scavenger tipo I de macrófago (SRT-1 de macrofagos), receptor emparejado de proteina G, citoquina inducible pequeña A7 (ScyA7), receptor 2 de interleucina-1 (IL-1R2), proteina inducible de interleucina-1 (proteina inducible IL-1), interleucina-1 beta (IL-lbeta), LIX (gen de la quimioquina CXC inducida por LPS (Scyb5) I ligando 5 de la quimioquina (motivo C-X-C) ) . Los genes regulados a la baja incluyeron factor beta de crecimiento tumoral (TGF-B) , Frizzled (FIZZ1), homólogo del síndrome de olfram 1 (Wfsl), proteína transmembrana 14A (TP 14A) , proteína asociada con la matriz extracelular (EMAP) , sulfatasa 2 (SULF-2), matriz extracelular 2, factor de crecimiento del tejido conectivo (CTFG) , inhibidor de la vía del factor tisular (TFPI), gen (XCP2) de la proteína XCP2 (Xcp2) de la cepa C57BL/6|ARNm de resistina-símil moléculas-alfa, proteína modificadora de la actividad del receptor 2 (Ramp2) , receptor huérfano relacionado con RAR alfa (ROR-alfa), efrina Bl, proteína secretada ácida y rica en cisteína-símil 1 (SPARC-símil 1), Semaforina A. En el análisis de genes expresados diferencialmente (más de 2 veces, p < 0,05) en tumores resistentes versus tumores sensibles (TIB6+B16F1) se identificaron muchas citoquinas que se sabe que intervienen en la movilización de las CMMO hacia la sangre periférica incluyendo factores de estimulación de colonias de granulocito (G-CSF) (véase, por ejemplo, Rapoport, A.P. y col., Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (GM-CSF) and granulocyte colony-stimulating factor (G-CSF) : receptor biology, signal transduction, and neutrophil activation, Blood Rev 6:43-57 (1992)) y proteína quimioatrayente de monocitos (MCP-1) (véase, por ejemplo, Leonard, E.J. y col., Secretion of monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) by human mononuclear phagocytes, Adv Exp Med Biol 351:55-64 (1993)) . Además, los factores que intervienen en la inflamación, como por ejemplo, la proteina inflamatoria de macrófagos (MIP-2) (véase, por ejemplo, Cook, D.N., The role of MIP-1 alpha in inflammation and hematopoiesis , J Leukoc Biol, 59:61-66 (1996)) y IL-1R (véase, por ejemplo, Dinarello, C.A., Blocking IL-1 in systemic inflammation, J Exp Med, 201:1355-1359 (2005) se encontraron entre los genes expresados diferencialmente . También se sabe que la mayoría de las citoquinas expresadas anteriormente, como la G-CSF, intervienen en la> diferenciación (véase, por ejemplo, McNiece, I.K. y col., Recombinant human stem cell factor synergises with GM-CSF, G-CSF, IL-3 and epo to stimulate human progenitor cells of the myeloid and erythroid lineages, Exp Hematol, 19:226-231 (1991) ) y proliferación (véase, por ejemplo, Lemoli, R.M. y col., Proliferat ive response of human acute myeloid leukemia cells and normal marrow enriched progenitor cells to human recombinant growth factors IL-3, GM-CSF and G-CSF alone and in combination, Leukemia, 5:386-391 (1991)) de progenitores hematopoyéticos a células mieloides. Por lo tanto, además de cebar y promover la movilización de células hematopoyét icas a la periferia, los ratones con tumores resistentes pueden compartir la capacidad de estimular la diferenciación de células mieloides.

[0313] Estos descubrimientos respaldan la conclusión de los estudios de expresión génica en las células CDllb+ y Grl+ y sugieren que la regulación diferencial de las actividades pro o antiangiogénicas y de las quimioquinas y citoquinas inflamatorias en tumores resistentes al anti-VEGF pueden contribuir potencialmente a la resistencia de los tumores resistentes al anti-VEGF.

[0314] La combinación de anti-VEGF con agentes que interfieren en las funciones de las células mieloides suprime la angiogénesis y el crecimiento del tumor

[0315] Se probó un anticuerpo anti-Gr que disminuye la cantidad de células mieloides Grl+ en la circulación periférica solo o en combinación con el anti-VEGF en el contexto de los tumores EL4 (Fig. 5a-b) y LL2 (Fig. 5c-d) . Cuando se administró solo, el tratamiento anti-Grl demostró ser eficaz en la disminución de la cantidad de células Grl + periféricas y tumorales, sin embargo, no afectó significativamente el crecimiento tumoral ni la vascularización de los tumores EL4 (Fig. 5a-b) . Sin embargo, cuando el anticuerpo anti-Grl se combinó con el G6-23, se observó en los grupos de tratamiento combinado una tendencia hacia un retraso prolongado en el crecimiento tumoral y en el inicio de la resistencia tumoral de los tumores EL4 (Fig. 5b) o LL2 (Fig. 5d) , en comparación con los efectos inducidos por el tratamiento anti-VEGF-A solo. El análisis histológico de los tumores LL2 reveló una tendencia hacia una disminución de células mieloides Grl+ mediante FACS y las superficies vasculares (VSA) que se correlaciona con una disminución en las tasas de crecimiento tumoral (Fig. 5c y d) en los grupos de tratamiento combinado.

[0316] El análisis de expresión génica reveló un aumento significativo en la expresión de la elastasa leucocitaria en el tumor y las células CDllb, Grl+ de la médula ósea mediante lineas de células tumorales resistentes al anti-VEGF (Fig.4b) . Se describió que la elastasa producida por los neutrófilos promueve la proliferación y motilidad de las células tumorales y estimula el crecimiento de diversos tipos de tumores. Véase, por ejemplo, Sun, Z. & Yang, P. Role of imbalance between neutrophil elastase and alpha 1-antitrypsm in cáncer development and progression. Lancet Oncol 5:182-90 (2004) . Además, se propuso un papel para la elastasa leucocitaria en la regulación de la movilización leucocitaria y angiogénesis . Véase, por ejemplo, Shamamian, P. y col., Activation of progelat inase A (MMP-2) by neutrophil elastase, cathepsin G, and proteinase-3 : a role for inflammatory cells in tumor invasión and angiogenesis . J Cell Physiol 189:197-206 (2001) . Se combinó un tratamiento anti-VEGF con un inhibidor de elastasa. El tratamiento combinado dio como resultado una disminución significativa en los volúmenes tumorales y los pesos de los tumores terminales en los tumores LLC y EL4 (Fig. 5e y f ) . De manera similar al tratamiento con el anticuerpo anti-Grl (Fig 5a-d) , el inhibidor de elastasa indujo células mieloides circulatorias casi completamente eliminadas, sin embargo, se descubrió una disminución de entre 2 y 3 veces en los tumores, en comparación con el tratamiento de control. En base a esto, suponemos que el tratamiento no debería afectar a ciertas células progenitoras mieloides que no presenten la expresión de la CDllb o Grl. O bien, las células progenitoras pueden infiltrarse potencialmente en tumores y diferenciarse de las células mieloides en el lugar. Las estrategias que induzcan la eliminación más profunda de células mieloides en los tumores tratados con anti-VEGF también pueden incrementar los efectos terapéuticos del tratamiento combinado. Combinados, estos descubrimientos sugieren una eficacia terapéutica mejorada al combinar el anti-VEGF con componentes que actúen sobre las funciones de las células mieloides y brindan la primera evidencia de que las funciones proangiogénicas de las células mieloides pueden contribuir al desarrollo de la resistencia al tratamiento anti-VEGF. Además, estos descubrimientos respaldan la noción de que pueden intervenir diversas vías en la atracción y activación de células mieloides en tumores resistentes al anti-VEGF.

Características fenotípicas de CD1 lb+Grl+ en tumores resistentes

[0317] Se investigaron las propiedades de las células CDllb+Grl+ en base a sus diversas características funcionales en tumores resistentes. Se examinó la expresión de las moléculas que se conoce que intervienen en la movilización (CXCR4 (véase, por ejemplo, Orimo, A. y col., Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion, Cell , 121:335-348 (2005) )) y migración transendotelial (L-Selectina (véase, por ejemplo, Simón, S.I. y col . , L-selectin (CD62L) cross-linking signáis neutrophil adhesive functions via the Mac-1 (CDllb/CD18) beta 2-integrin, J Immunol , 155:1502-1514 (1995)) ) de las células hematopoyéticas . Además, los TAM, conocidos con la expresión de F480, se describieron como un subconjunto de células mieloides con la capacidad de incrementar el crecimiento tumoral (véase, por ejemplo, Luo, Y. y col., Targeting tumor-associated macrophages as a novel strategy against breast cáncer, J Clin Invest, 116:2132-2141 (2006)) . La disminución de los TAM, mediante clodronato, mejoró la eficacia del tratamiento anti-VEGF en ratones con tumores resistentes. Además, se descubrió que los TAM positivos en Tie2 se encuentran en los vasos tumorales y median la angiogénesis (véase, por ejemplo, De Palma, M. y col., Tie2 identifies a hematopoietic lineage of proangiogenic monocytes required for tumor vessel formation and a mesenchymal population of pericyte progenitors, Cáncer Cell, 8:211-226 (2005)) . Por lo tanto, se investigó la expresión de CXCR4, L-Selectina, F4/80 y Tie-2 en la fracción mieloide en tumores resistentes y sensibles tratados con anti-VEGF.

[0318] Se implantaron tumores TIB6, B16F1, EL4 y LLC en ratones C57BL/6 (n=5) y se trataron con anticuerpos anti-VEGF o de control, tal como se describió anteriormente. Después de 17 días, se recogieron los tumores aislados de cada ratón y se tiñeron con anticuerpos contra CDllb, Grl, CXCR4 , F480, L-Selectina y Tie2. Se observó una diferencia significativa (p = 0,05) en la expresión de los subconjuntos CXCR , F480, L-Selectina y Tie2, en comparación con las CDllb+Grl+ asociadas a los tumores en ratones con tumores resistentes versus aquellos con tumores sensibles. Las CM O se aislaron de los ratones con tumores y se tiñeron con los mismos marcadores, tal como se describió anteriormente. Al igual que en el análisis de los tumores, se descubrió una diferencia significativa (p = 0,05) en la frecuencia de los subconjuntos CXCR4, F480, L-Selectina y Tie2 en las células GFP+CD1 lb+Grl+ en tumores resistentes versus las correspondientes poblaciones en tumores sensibles.

[0319] El análisis fluj ocitométrico reveló que las células CDllb+Grl+ asociadas a los tumores en tumores resistentes son altamente ricas (p = 0,05) para la expresión de CXCR4 , F480, L-Selectina y Tie2. Se obtuvo una imagen similar cuando se analizaron las células CDllb+Grl+ de la MO aisladas de ratones con tumores. Estas observaciones sugieren que las células CDllb+Grl+ en tumores resistentes son más potentes en la movilización, migración transendotelial y migración hacia los tumores.

Diferentes mecanismos gobiernan la resistencia al anti-VEGF y los agentes quimioterapéuticos

[0320] Comprender los mecanismos celulares de la resistencia al anti-VEGF plantea la pregunta de si las células mieloides también median la resistencia a otros componentes ant ineoplásicos . Por lo tanto, se investigó la resistencia tumoral a dos agentes quimioterapéuticos utilizados comúnmente que incluyen 5-fluorouracilo (5FU) y gemcitabina (véase, por ejemplo, Pasetto, L.M. y col., Oíd and new drugs in systemic therapy of pancreatic cáncer, Cri Rev Oncol Hematol, 49:135-151 (2004)) . Los tumores resistentes y sensibles al anti-VEGF mostraron diferentes respuestas a la quimioterapia. Como se muestra en la Figura 18a y b, ambos tumores resistentes al anti-VEGF, es decir, EL4 y LLC, mostraron una respuesta completa al 5FU y una resistencia parcial a la gemcitabina en un momento posterior que es mucho más leve que la resistencia al tratamiento anti-VEGF. En lineas celulares sensibles al anti-VEGF, se descubrió que los tumores TIB6 son completamente sensibles a ambos compuestos, sin ninguna diferencia significativa en comparación con la respuesta al tratamiento anti-VEGF (Fig. 18c) . Sin embargo, los tumores B16F1 mostraron resistencia tanto al 5FU como a la gemcitabina en comparación con el tratamiento anti-VEGF (Fig. 18d) . Por lo tanto, los datos indican claramente que el perfil de resistencia al anti-VEGF no corresponde a la quimioterapia en tumores resistentes y sensibles, y sugiere que diferentes mecanismos intervienen en el desarrollo de la resistencia en un enfoque antiangiogénico versus agentes quimioterapéut icos . El análisis de células de la médula ósea mostró una falta total de células CDllb+Grl+ en todos los ratones tratados con 5FU y en menor grado en los animales tratados con gemcitabina (Fig. 6e) . Sin embargo, la falta de células CDllb+Grl+ en los tumores B16F1 tratados con gemcitabina o 5FU (Fig. 6f) minimiza la participación de células mieloides en el desarrollo de la resistencia a la quimioterapia .

[0321] La atracción de células CDllb+Grl+ hacia tumores primarios representa un mecanismo celular que media la resistencia al tratamiento anti-VEGF dentro de un subconjunto de tumores experimentales en ratones. La creación de perfiles de expresión génica permitió la identificación de un conjunto de genes que se regulan diferencialmente en las células CDllb+Grl+ en la médula ósea de ratones con tumores resistentes al anti-VEGF, en comparación con los tumores sensibles al anti-VEGF. Entre éstos, se descubrieron muchos factores pro y antiangiogénicos y marcadores de la activación de células mieloides que se regularon al alza durante el cebado con tumores. En el desarrollo de la resistencia a la droga interviene la atracción de células mieloides hacia los tumores y representa uno de los primeros pasos en la serie de reacciones. Los compuestos que actúan sobre los factores derivados de tumores que regulan la atracción y/o activación de las células mieloides pueden combinarse con compuestos antiangiogénicos . El bloqueo selectivo de quimioatrayentes derivados de los tumores para las células mieloides puede ser ventajoso en comparación con una estrategia sistemática de eliminación de células mieloides, por ejemplo, para evitar posibles complicaciones en la supresión sistemática prolongada de partes del sistema inmunológico innato (véase, por ejemplo, Lewis, CE. & Pollard, J.W. Distinct role of macrophages in different tumor microenvironments . Cáncer Research 66:605-612 (2006)). Se pueden utilizar los antagonistas de los factores proangiogénicos que secretan las células mieloides infiltrantes de tumores en el tratamiento combinado con compuestos anti-VEGF. Los factores actuantes que regulan funciones especificas de las células mieloides pueden afectar indirectamente la angiogénesis tumoral y reducir la resistencia tumoral al tratamiento anti-VEGF. Véase la Fig. 5.

[0322] La evaluación clínica del anticuerpo monoclonal anti-VEGF, bevacizumab, ha mostrado una actividad con agente único significativa en muchos cáncer humanos, incluyendo carcinomas renales y de ovario (véase, por ejemplo, Ferrara, N., Hillan, K.J., Gerber, H.P. & Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cáncer. Nat Rev Drug Discov 3:391-400 (2004); y Jain, R.K., Duda, D.G., Clark, J.W. & Loeffler, J.S. Lessons from phase III clinical triáis on anti-VEGF therapy for cáncer. Nat Clin Pract Oncol 3:24-40 (2006) ) . Durante el amplio desarrollo clínico del bevacizumab en la mayoría de los tipos de tumores humanos, resultó evidente que en muchos tumores se obtuvieron efectos terapéuticos sólidos en combinación con agentes quimioterapéuticos . Actualmente se está analizando la naturaleza de las reacciones moleculares y celulares subyacentes que conducen a mayores beneficios terapéuticos en tratamientos combinados con compuestos citotóxicos. Se propuso que el incremento en la absorción del fármaco neoplásico como consecuencia de la normalización de la vasculatura (revisado en Jain y col., en Jain, R.K. Normalizing tumor vasculature with anti-angiogenic therapy: a new paradigm for combination therapy. Na t Med 7:987-9 (2001)) y/o la interferencia con la recuperación de células endoteliales tras el daño citotóxico de la vasculatura del tumor (revisado en Ferrara y col., en Ferrara, N . , Hillan, K.J., Gerber, H.P. & Novotny, W. Discovery and development of bevacizumab, an anti-VEGF antibody for treating cáncer. Na t Rev Drug Díscov 3:391-400 (2004)) podría ser el motivo de los mayores beneficios terapéuticos (revisado en Ferrara & Kerbel in Ferrara, N. & Kerbel, R.S., Angiogenesis as a therapeutic target . Nature 438:967-74 (2005) ) . Sin limitarse a una sola teoría, la identificación de un papel para las células mieloides en el mecanismo que conduce a la resistencia al tratamiento anti-VEGF respalda aún más la idea de que los efectos mielosupresores asociados a la mayoría de los componentes citotóxicos pueden contribuir al aumento de la inhibición del crecimiento tumoral. Se observó que la disminución de la cantidad de células mieloides en tumores primarios de pulmón en pacientes tratados con quimioterapia se correlacionaba con la supervivencia (véase, por ejemplo, Di aio, M. y col., Chemotherapy-induced neutropenia and treatment efficacy in advanced non-small-cell lung cáncer: a pooled analysis of three randomised triáis. Lancet Oncol 6:669-77 (2005) ) .

[0323] El análisis de la matriz de ADN de las células CDllb+Grl+ identificó cambios en la expresión génica, que es distinta entre los tumores resistentes y los sensibles al anti-VEGF, lo que demuestra una intercomunicación notable entre los tumores que crecen en el flanco de los ratones y un subconjunto de células en la médula ósea (Fig. 4a) .

Ejemplo 2 : Factores adicionales de los modelos de tumores resistentes al tratamiento anti-VEGF

[0324] Se identificaron factores adicionales de tumores que pueden contribuir o proporcionar directa o indirectamente una resistencia a los tumores. Los Usados del tumor linfoma de un ratón resistentes al tratamiento anti-VEGF (por ejemplo, EL4 y L1210) se trataron con el anticuerpo anti-VEGF (G6-31) a 5 mg/ kg/semana , dos veces por semana durante 2 semanas. Después del tratamiento, los tumores se agruparon y homogeneizaron en una solución RIPA de 6 mi a 2X con inhibidores de la proteasa (Roche) . La homogeneización se centrifugó a 2x durante 15 minutos a 14.000 rpm en centrifugación con Eppendorf. El sobrenadante se diluyó 1:1 en 20mM Tris, pH 7,5, 50mM NaCl y se aplicó a 1 mi HiTrap HS . La columna se lavó con el tampón de equilibrio (20 mM Tris, pH 7,5, 50 mM NaCl) y después se eluyó con aproximadamente 5 volúmenes de columna con un aumento gradual en la concentración de NaCl (0,25M NaCl, 0,5 M NaCl, 1 M NaCl y 3 M NaCl) . Se recogieron las fracciones máximas en cada paso. Véase la Fig. 8.

[0325] Se descubrió una variedad de factores en las fracciones de sal elevadas de EL4 y L1210 que contribuyen a la actividad quimiotáct ica (por ejemplo, mediante un ensayo de migración de monocitos) o un ensayo de proliferación (por ejemplo, un ensayo de proliferación HUVEC) . Por ejemplo, se descubrió bFGF en la fracción elevada de sal y se demostró que contribuye a la proliferación de células HUVEC en un ensayo de proliferación HUVEC, pero no actividad quimiotáctica en el ensayo de migración de monocitos. Se demostró que otros factores encontrados en la fracción elevada de sal poseen una actividad quimiotáctica hacia los monocitos .

[0326] Mediante una combinación de un agente que reduce los macrófagos y un tratamiento anti-VEGF (G6-23) en tumores (EL4) resistentes al tratamiento anti-VEGF, se descubrió que la combinación retrasa el crecimiento tumoral. Los tumores EL4 en ratones se trataron con 1) liposoma/ragweed con PBS; 2) liposoma/G6-31 con PBS; 3) liposomas con clodronato/G6-23 ; 4) liposomas con clodronato/G6-31 ó 5) liposomas con clodronato/PBS en la vena de la cola. La Fig. 9 muestra el cambio en el volumen del tumor EL4 (medido con el calibrador) 72 horas después de la última dosis. Existe una disminución del volumen tumoral en ratones tratados con liposomas de clodronatos, un agente reductor de macrófagos y un anti-VEGF (G6-23) . También se encontró una disminución de macrófagos detectados en la sangre de animales tratados con liposomas de clodronato/anti-VEGF. Véase la parte inferior de la Fig. 9. Los liposomas de clodronato también disminuyeron la expresión del VEGF, según la medición realizada mediante la PCR cuantitativa en tiempo real (Taqman) , cuando se administraron a los ratones en combinación con el anti-VEGF (G6-23) . Véase la Fig. 10. La expresión de la proteina KC (CXCL1) también disminuyó, según la medición realizada mediante ELISA (RD Systems), en ratones tratados con liposomas de clodronato y anti-VEGF (G6-23), tal como se describió anteriormente. Véase la Fig. 11. La KC (CXCL1) es una proteina identificada por su expresión excesiva en monocitos y macrófagos murinos. Su síntesis se induce mediante TNF-alfa. La KC interviene en la quimiotaxis /activación leucocitaria y detención de monocitos circulantes en la superficie endotelial. La síntesis de la KC en células endoteliales vasculares se induce mediante la trombina. El receptor de la KC y el receptor IL-8 tipo B son homólogos. El receptor es capaz de unir la KC y MIP-2 (proteína macrófaga inflamatoria 2). La KC se secreta mediante las líneas de células tumorales sensibles al tratamiento anti-VEGF y líneas de células tumorales resistentes al tratamiento anti-VEGF.

[0327] Se descubrieron otras citoquinas proinflamatorias en la fracción elevada de sal de líneas de células tumorales resistentes, por ejemplo, ???-lalfa, MCP-1, IL-lalfa, IL-lbeta, IL-7, IL-9, IL-10 y IL-13. La MCP-1 es la proteina quimioatrayente de monocitos-1 (CCL2 o JE) y se secreta mediante células macrófagas, fibroblást icas y endoteliales . Es M-CSF, IL-1, IFNgamma y TGFbeta inducida. La ???-lalfa es una proteina macrófaga inflamatoria la (CCL3) que los macrófagos secretan en respuesta a la inflamación local y activa los neutrófilos para producir superóxido. También los linfocitos y monocitos la secretan. En un modelo murino de carcinogénesis hepatocelular , los neovasos secretan las MIP-lalfa y MCP-1 y estimulan la proliferación a través de sus receptores cognados de manera autócrina. Véase, por ejemplo, Cáncer Res. 66 ( 1 ) : 198-211 (2006) . Tanto la MCP-1 como la ???-lalfa se expresan en lineas de células tumorales resistentes al tratamiento anti-VEGF. Véase la Fig. 12, Panel A y B, en las que Dil( + ) son células endoteliales, CD3(+) representa las células linfoides y F4/80(+) representan macrófagos. Dil se refiere a Dil-Ac-LDL ( lipoproteinas de baja densidad acetiladas marcadas con perclorato de 1 , 1 ' -dioctadecilo-3 , 3 , 3 ' , 3 ' -tetramet ileno-carbocianino (Dil) (Biomedical Technologies Inc.) . Cualquier célula endotelial tiene la capacidad de aceptar este tinte.

[0328] En un ensayo de proliferación angiogénica y formación del lumen capilar también se descubrió que las ???-lalfa y MCP-1 tienen actividad angiogénica. Véase la Fig. 13, Panel A y Panel B en el día 10. En los ensayos, las células HUVEC se descongelaron en pocos pasajes por día antes de recubrirse en perlas. Las células se desprendieron al llegar aproximadamente al 80% de la confluencia y se recubrieron en microperlas cytodex (una matriz de dextrano reticulado) con HUVEC (400 células/perlas) durante 4 horas a 37°C. Las perlas y las células HUVEC libres se transfirieron a un matraz y se cultivaron durante toda la noche. Las partículas se desprendieron y se mezclaron con fibrinógeno (plasma bovino) (250 g/ml) . Después, el fibrinógeno se convirtió en gel de fibrina insoluble al agregar la trombina. Existen alrededor de 100 perlas en placas de 12 pocilios. Las partículas se cultivaron con 40.000 fibroblastos D551 y VEGF como controles positivos, D551 o VEGF como controles negativos, MCP-1 y D551 o ???-lalfa y D551. El medio se cambió todos los días. Los cultivos se tiñeron con estreptavidina CD31 y Cy3 antihumanas biotiniladas durante toda la noche con lavados exhaustivos. Se tomaron fotografías a las 60 horas, el día 6 y el día 10.

[0329] Ensayo de migración de monocitos: Paso 1: aislamiento de los monocitos de las PBMC humanas. La sangre se diluyó con PBS 1:1 (v/v) . La sangre diluida se agregó lentamente sobre el Ficoll y se centrifugó a 3000 rpm durante 15 minutos a temperatura ambiente (RT) sin intervalos. El plasma se retiró y se recogieron los glóbulos blancos (interfase de 9-5 mi) . Las células se lavaron en un tampón de migración que contenia PBS con BSA al 0,5% (bajo en endotoxinas) , se centrifugaron a 1850 rpm (9-800 g) durante 10 minutos a temperatura ambiente y se contaron. Paso 2: Marcación magnética de células. El pellet de células se resuspendió en el tampón MACS que contenia PBS con BSA al 0,5% (bajo en endotoxinas) y EDTA 2mM, 30 µ? por cada 107 células. Se agregaron y mezclaron bien los cócteles del reactivo de bloqueo FcR y el anticuerpo Biotina. A continuación, las células se incubaron durante 10 minutos a 4°C, después de lo cual, se agregó 30µ1 más al tampón MACS por cada 107 células y se añadieron microperlas de anti-biotina. Esto se mezcló bien y se incubó durante 10 minutos a 4°C. Las células se lavaron con el tampón MACS al agregar entre 10 y 20 veces más del volumen de marcación y se centrifugaron a 300 g (1250 rpm) durante 10 minutos. Las células se resuspendieron en hasta 108 células en 2 mi de tampón. Paso 3: Separación magnética con columnas LS . La columna LS (Miltenyi Biotec) se ubicó en el soporte del campo magnético. La columna se enjuagó con tampón MACS. La suspensión de células se aplicó a la columna. Se recolectó el flujo no marcado que representa la fracción enriquecida en monocitos. La columna se enjuagó con el tampón 3 veces y el flujo se recolectó y combinó. Esto después se centrifugó a 300 g (1250 rpm) durante 5 minutos. Paso 4: Las células se lavaron con medios de migración que contienen RPMI con BSA al 0,5% (bajo en endotoxina) más L- glutamina y antibióticos 2 mM. Se agregaron 106 células en placas Transwell de 24 pocilios con poros de 5 micrómetros (Corning) . En la cámara exterior, se agregaron diversos factores de crecimiento, citoquinas/ quimioquinas u otras muestras de prueba. Después de 2,5 horas a 37°C, el filtro se retiró cuidadosamente y las células se mezclaron extremadamente bien y se transfirieron a una solución ZPAK de 10 mi para su recuento.

[0330] Ensayo de proliferación de HUVEC: En este estudio se utilizaron HUVEC en pasajes menor a 8. Día 1: 3000 células/pocilio (placa de 96 pocilios) se colocaron sobre una placa recubierta con gelatina al 1% en un medio de ensayo ( DMEM : F12 50:50) con 1,5% FBS. Día 2: El medio se cambia y las células se tratan con varios factores de crecimiento o medios condicionados. Día 3: Se agrega 3H-timidina a 0, 5uCi/pocillo . Día 4: Se agregó 250mM EDTA/pocillo para detener la reacción por la mañana. Las células se recogieron en una placa de filtro de 96 pocilios y se lavaron con agua 3 veces. Las muestras de 3H se contaron con un contador de centelleo liquido TOPCOUNT.

[0331] Tratamiento in vivo para examinar la reducción de macrófagos y la expresión tumoral: Se utilizó EL4 , la linea celular murina de leucemia linfocitica. El tratamiento comenzó 48 horas después de implantar las células tumorales EL4 (5 x 106, 0,1 mi vol . en matrigel) en ratones sin pelaje. El tratamiento se realizó de la siguiente manera: Grupo 1: 8 ratones, dos veces por semana: 200 µ? IV de liposoma en PBS y 2x5mg/kg/semana 100 µ? ip. de IgG Ragweed; Grupo 2: 8 ratones, dos veces por semana: 200µ1 IV de liposoma en PBS y 2x5mg/kg/semana ???µ? ip. de G6-31; Grupo 3: 8 ratones, dos veces por semana: 200µ1 IV de liposomas de clodronato. 2x5mg/kg/semana ???µ? ip. de IgG Ragweed; Grupo 4: 8 ratones, dos veces por semana: 200µ1 IV de liposomas de clodronato. 2x5mg/kg/semana ???µ? ip. de G6-31. Grupo 5: 8 ratones, dos veces por semana: 200µ1 IV de liposomas de clodronato. ???µ? ip. de PBS dos veces por semana. De 3 ratones de cada grupo se obtuvo 50µ1 de sangre total para la evaluación de población de células macrofagas FACS. Se sangraron (óptica) 3 ratones de cada grupo para obtener ???µ? de sangre total 1 hora después de cada inyección de liposoma en PBS o liposomas de clodronatos para el análisis FACS. El estudio continuó hasta lograr el suficiente crecimiento tumoral (no más allá de 5 semanas) . El crecimiento tumoral se definió como suficiente si el tumor era mayor a 20 mm de largo. El tamaño del tumor se midió semanalmente (largo x ancho x alto) . Los animales se observaron al menos dos veces por semana. En el punto de valoración del experimento, los animales se sacrificaron, los tumores se midieron una vez más y después se extrajeron, pesaron y fijaron. Además se extrajo la sangre, el bazo y el hígado de todos los animales para realizar más análisis, por ejemplo, análisis FACS, análisis de ARN, etc.

[0332] Detección de población de macrófagos en la sangre, bazo e hígado como indicio de reducción de macrófagos : Después de 92 horas de la primera inyección IV de liposomas de clodronato, se administró C02 para matar al ratón (ratones trangénicos FV6 versus ratones beige sin pelaje XID) (2 ratones FV6 tratados con clodronato y 2 ratones beige sin pelaje XID tratados con clodronato, un ratón beige sin pelaje XID sin tratar) y se recogió 150µ1 de sangre de la cavidad del corazón y se colocó en tubos con heparina y se almacenaron a temperatura ambiente. La sangre se procesó al: 1) tomar una muestra de sangre de 150µ1 y agregar 1 mi de tampón de cloruro amónico para lisis de glóbulos rojos (Biosource P304-100); 2) realizar una lisis durante 5 minutos a temperatura ambiente; 3) girar a 5000 rpm a temperatura ambiente durante 2 minutos; 4) lavar con tampón para FACS (PBS + FCS al 2%) y girar nuevamente; y, 5) resuspender en 60µ1 de tampón para FACS y filtrar a través de una malla de 70 µ?t?. El bazo se procesó al: 1) preparar una suspensión unicelular utilizando la superficie esmerilada del portaobjetos de cristal (micro-portaobjetos VWR 48312-002, 25 X 75 mm) en tampón para FACS; 2) centrifugar a 1200 rpm durante 5 minutos; 3) suspender el pellet con 5 mi de cloruro amónico (tampón de cloruro amónico: 0,15 M NH4C1, 10,0 mM KHCO3 , 0,1 mM Na2 EDTA, pH a 7,2-7,4, filtrar esterilizado a través de 0,22µp? y almacenar a temperatura ambiente) e incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos o más, se puede agitar ocasionalmente; 4) después de la incubación, agregar medio de FACS a 15 mi; 5) centrifugar nuevamente y resuspender las células en 0,5-1 mi de tampón de FACS (1 mi para los ratones FV6, 0,5 mi para los ratones beige sin pelaje XID) ; y 6) filtrar. El hígado se procesó al: 1) cortar el hígado (1/8 de la pieza completa) en pequeños pedacitos en tampón para FACS (en tubo cónico de 50 mi) y lavar los pedacitos con 45 mi de PBS; 2) centrifugar los pedacitos a 1200 rpm durante 5 minutos y cuidadosamente mover los pequeños pedacitos hacia la superficie esmerilada para realizar células únicas; 3) lavar con 3ml de tampón para FACS y centrifugar; y 4) resuspender en 0 , 5ml de tampón para FACS y filtrar. ??µ? de glóbulos rojos se diluyen en 90µ1 de tampón para FACS para el recuento celular total. Para el recuento celular total, se toma una muestra del bazo y se diluye en 1:10. Las muestras de 50µ1 de sangre, bazo e hígado se colocan en placas para cultivo celular de 96 pocilios, con fondo en V con tapa (Costar 3894) y se agrega anticuerpo de bloqueo (CD16/32) a ?µ?/muestra durante 15 minutos. Las células se incuban con el anticuerpo F4/80-PE, ??µ?/muestra; (Serotec, F4/80 de rata anti-ratón, MCA497PE, 1101B) para detectar macrófagos. Las células se incuban con el anticuerpo en hielo durante 20 minutos cubiertas de papel aluminio, después de lo cual se agrega 200µ1 de tampón para FACS y las células se centrifugan durante 5 minutos a 4°C, 1500 rpm. El tampón se retira y las células se resuspenden utilizando 200µ1 de tampón FACS y se centrifugan nuevamente. Las células se resuspenden finalmente en 130µ1 de tampón FACS, se transfieren a pequeños tubos (202032202-12) y se leen en la máquina FACS de BD.

[0333] Preparación de una suspensión unicelular para una muestra tumoral: El tumor se disecciona para remover el tejido graso y la piel y se coloca en medio de EL4 con PSGF (factor de crecimiento plaquetario) y se coloca en hielo; los tumores se lavan con el mismo medio y se agrega 15 ml/tumor y se centrifugan a 180 rpm durante 10 minutos; los sobrenadantes se retiran y el tejido se lava nuevamente; los tumores se muelen en pequeños pedacitos (<lmm) y se colocan en 2 mi de medio de EL4 frió utilizando una placa de cultivo tisular de 10 cm. Las células únicas del tumor EL4 se recogen en un tubo Falcon de 50 mi y se les agrega 8 mi de medios y se filtra mediante una malla de nylon de 40 pm, se agrega 50 mi de tampón de disociación celula /tumor con colagenasa IV, ADNasa y elastasa a las células durante 1,5 horas a 37°C utilizando dos placas de Petri de 10 cm. El tejido se rompió y se pipetó arriba y abajo cada 15 minutos. De manera opcional, se pueden agregar 12,5 mi de Liberase Blendzyme I que contenga tampón de disociación celular, por ejemplo, 200µ1 en 12,5 mi después de media hora con colagenasa IV adicional después de 1 hora. Las soluciones de digestión del tejido se filtran secuencialmente a través de la malla de nylon de diferentes tamaños (100, 70 y 40 pm) , y las muestras se lavan dos veces con medio de EL4 y se centrifugan a 4°C a 2000 rpm/min. durante 5 minutos. Las células se recuentan y recogen. En un experimento, las células se lisan y el ARN total se aisla (por ejemplo, que puede analizarse con Taiman) . De manera opcional, las células se suspenden en hasta 1.000.000 células/???µ? utilizando medio de EL4 (1,4 mi) ; para 1.000.000 de células, las células se bloquean con 2\iq FcI/II durante 30 minutos y se marcan durante 1 hora a temperatura ambiente con F4/80, anticuerpo CD3 o anticuerpos marcados con CD31 para aislar los macrófagos, los linfocitos EL4 y otras células hematopoyéticas y endoteliales de la muestra; las células se lavan dos veces con medio de EL4, y se suspenden en 1.000.000 células/0,5 mi para la separación celular. Las células se agrupan en base a la FSC/SSC y la intensidad de fluorescencia. Las células agrupadas también pueden centrifugarse, llevarse a un medio de cultivo adecuado, contabilizarse y medirse para obtener su viabilidad celular. La célula se puede preparar para estudios de morfología/inmunofluorescencia al colocar las células en placas utilizando medio de EL4 en cámaras de cultivo celular de 4 pocilios recubiertas con gelatina o recubiertas de matrigel al 1% (30 minutos) y cultivar durante toda la noche. Las células se pueden desprender y lisar (< 500.000 células) para aislar el ARN. De manera opcional, los otros tipos de células, por ejemplo, fibroblastos, miocitos, etc. pueden aislarse de la máquina de separación, contarse y medirse para obtener la viabilidad celular y realizar más análisis. De manera opcional, estas células pueden Usarse y aislar su ARN.

[0334] Preparación y administración de liposomas de clodronato : Se agrega 75-95 mg de L-alfa-fosfatidilcolina a un matraz de 500 mi (que se enjuaga previamente con metanol y cloroformo) con 10 mi de metanol y 10 mi de cloroformo. Se agrega 10-15 mg de colesterol. El matraz se coloca en el Rotovapor con rotación (130-150 rpm) y se lleva a bajo vacio (reducción gradual de 200 mbar a 150 mbar) en baño María a 37°C hasta que el líquido se disuelva y se forme una película, ~ 10 minutos. La película se disuelve en 10 mi de cloroformo y se coloca debajo del rotovapor nuevamente para eliminar el cloroformo y se forma una película blanca de fosfolípidos alrededor de la pared interna del matraz. ~15min. En algunos casos, la película no se forma inclusive si se ha evaporado el líquido. La película fosfolípida se dispersa en 10 mi de PBS o 2,0 g de clodronato/10 mi de PBS y se rota a mano y/o gira hasta que la película se disuelva, por lo que se formará una suspensión lechosa blanca. La suspensión lechosa blanca se mantiene a temperatura ambiente durante 1,5 a 2 horas bajo gas N2. La suspensión se agita suavemente y se somete a ultrasonido en un baño de ultrasonido durante 3 min. La suspensión se mantiene bajo gas N2 durante 2 horas a temperatura ambiente o toda la noche a 4°C para que se hinchen los liposomas. El clodronato no encapsulado se retira mediante centrifugación de liposomas 10.000 X g, durante 15 minutos, a 16°C (11.600 rpm 70 Ti rotor) . Los liposomas forman una banda blanca arriba de la suspensión. La solución de clodronato debajo de los liposomas se retira utilizando una pipeta. Los liposomas se lavan 2 o 3 veces con PBS estéril y se giran a mano para alterar el pellet. Los liposomas se centrifugan a 25.000 X g, durante 30 minutos, a 16°C (18.400 rpm utilizando un 70 Ti rotor) . El pellet se resuspende en 4 mi de PBS estéril y se almacena hasta 4 semanas bajo N2( en PBS. Antes de administrar a los animales, los liposomas deberán agitarse suavemente y se administra 200 µ? del reactivo de liposomas a cada animal mediante la vena de la cola, dos veces por semana .

[0335] Se considera que la presente memoria descriptiva es suficiente para permitir que un experto en la materia practique la invención. Varias modificaciones de la invención, además de las mostradas y descritas en la presente memoria descriptiva, serán evidentes para los expertos en la materia a partir de la descripción anterior y se encuentran dentro del ámbito de aplicación de las reivindicaciones incluidas más adelante. Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes citadas en la presente memoria descriptiva se incorporan a la misma a modo de referencia en su plenitud y para cualquier fin.

Claims (13)

1. REIVINDICACIONES 1. Un método para tratar un tumor resistente en un sujeto con un tratamiento combinado, y el método comprende: la administración a un sujeto con un tumor resistente de una cantidad eficaz de antagonista del VEGF en combinación con una cantidad eficaz de un segundo agente, que comprende un agente reductor de célula mieloide.
2. 2. El método de la reivindicación 1, en el que el agente reductor de célula mieloide comprende un antagonista de Grl, un inhibidor de elastasa, un antagonista de MCP-1 o un antagonista de MIP-1 alfa.
3. 3. El método de la reivindicación 2, en el que el antagonista es un anticuerpo.
4. 4. Un método para diagnosticar un tumor resistente en un sujeto, y el método comprende: el suministro de una población celular de prueba de un tumor del sujete-la medición la cantidad o porcentaje de células CDllb+Grl+ en la población celular de prueba; la comparación de la cantidad o porcentaje de las células CDllb+Grl+ en la población celular de prueba con la cantidad o porcentaje de células CDllb+Grl+ en una población celular de referencia; y, la detección de un incremento en la cantidad o porcentaje de células CDllb+Grl+ en la población celular de prueba, en la que el aumento en la cantidad o porcentaje de células CDllb+Grl+ indica que el tumor es un tumor resistente.
5. 5. El método de la reivindicación 4, que comprende además la medición del tamaño del bazo del sujeto y la comparación d el tamaño del bazo del sujeto con un tamaño de bazo de referencia, en el que un mayor tamaño del bazo indica que el tumor es un tumor resistente.
6. 6. El método de la reivindicación 4, que comprende, además, la medición de la cantidad o el porcentaje de la superficie vascular (VSA) de un tumor en el sujeto después de que se le haya administrado al sujeto un antagonista del VEGF y la comparación de la cantidad o el porcentaje de la superficie vascular del tumor en el sujeto con una superficie vascular de referencia, en el que un aumento de la cantidad o el porcentaje de la superficie vascular del tumor indica que el tumor es el tumor resistente.
7. 7. El método de la reivindicación 6, en el que el antagonista es un anticuerpo.
8. 8. El método de la reivindicación 4, que comprende además: el suministro de una población celular de prueba de un tumor del sujétela medición de la cantidad o porcentaje de células linfoides B CD19 o células dendriticas CDllc en la población celular de prueba ; la comparación de la cantidad de células linfoides B CD19 o células dendriticas CDllc en la población celular de prueba con la cantidad o porcentaje de células linfoides B CD19 o células dendriticas CDllc en una población celular de referencia; y, la detección de una disminución de la cantidad o el porcentaje de células linfoides CD19 o células dendriticas CDllc en la población celular de prueba en comparación con una población celular de referencia en el que una disminución de la cantidad o el porcentaje de células linfoides B CD19 o células dendríticas CDllc indica que el tumor es un tumor resistente .
9. 9. El método de la reivindicación 4, que comprende además: el suministro de una población celular de la médula ósea del sujeto; la medición de la cantidad o el porcentaje de células linfoides T CD90, células linfoides B CD19 o células dendríticas CDllc en la población celular; la comparación de la cantidad o el porcentaje de células linfoides T CD90, células linfoides B CD19 o células dendríticas CDllc en la población celular con la cantidad o el porcentaje de células linfoides T CD90, células linfoides B CD19 células dendríticas CDllc en una población celular de referencia; y la detección de una disminución de la cantidad o el porcentaje de células linfoides T CD90, células linfoides B CD19 o células dendríticas CDllc en la población celular en comparación con la población celular de referencia, en el que la disminución en la cantidad o el porcentaje de células linfoides T CD90, células linfoides B CD19 o células dendríticas CDllc indica que el tumor es el tumor resistente.
10. 10. Un método para tratar un tumor resistente en un sujeto con un tratamiento combinado, y el método comprende: la administración de una cantidad eficaz de antagonista del VEGF en combinación con una cantidad eficaz de un agente reductor de células mieloides y una cantidad eficaz de un tercer agente al sujeto con el tumor resistente, en el que el tercer agente es un agente quimioterapéutico .
11. 11. El método de la reivindicación 10, en el que el antagonista es un anticuerpo.
12. 12. El método de la reivindicación 10, en el que el agente reductor de célula mieloide comprende un antagonista de Grl, un inhibidor de elastasa, un antagonista de MCP-1 o un antagonista de MIP-1 alfa.
13. 13. El procedimiento de la reivindicación 10 en el que el agente quimioterapéutico es 5FU o gemcitabina.