MX2011006875A - Metodos y composiciones para uso en diagnostico de pacientes con cancer. - Google Patents

Abstract

Aquí se describen métodos y composiciones útiles para identificar terapias que probablemente confieran beneficios clínicos óptimos para pacientes con cáncer.

Description

MÉTODOS Y COMPOSICIONES PARA , USO EN DIAGNÓSTICO DE PACIENTES CON CÁNCER SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la Solicitud de Patente Provisional de los E.U.A. No. de Serie 61/140,392, presentada en diciembre 23, 2008, los contenidos de la cual se incorporan aquí por referencia en su totalidad para todos los propósitos.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a métodos y composiciones útiles para pronosticar el resultado clínico y para supervisar a pacientes con cáncer tratados con terapia anti angiogénica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El cáncer es una de las amenazas más mortales a la salud humana. Solo en los E.U.A. , el cáncer afecta casi a 1.3 millones de nuevos pacientes cada año, y es la segunda causa principal de muerte después de las enfermedades cardiovasculares, lo que representa aproximadamente 1 en 4 muertes. Los tumores sólidos son responsables por la mayoría de esas muertes. Aunque han habido avances significantes en tratamiento médico de ciertos cánceres, la proporción de supervivencia total a 5-años para todos los cánceres ha mejorado solo en aproximadamente 10% en los últimos 20 años. Cánceres, o tumores malignos, originan metástasis y crecen rápidamente en una forma descontrolada, haciendo extremadamente difícil la detección y el tratamiento oportunos .

Dependiendo del tipo de cáncer, pacientes típicamente tienen varias opciones de tratamiento disponibles incluyendo quimioterapia, radiación y drogas basadas en anticuerpos. Métodos de diagnóstico útiles para pronosticar el resultado clínico para los regímenes diferentes de tratamiento beneficiarán enormemente el manejo clínico de estos pacientes. Varios estudios han explorado la correlación de expresión de genes con la identificación de tipos de cáncer específicos, por ejemplo por ensayos específicos de mutación, análisis de microhileras o micromatrices , qPCR, etc. Estos métodos pueden ser útiles para la identificación y clasificación del cáncer presentado en un paciente. Sin embargo, se conocen mucho menos respecto al valor predictivo o de pronóstico de expresión de genes con el resultado clínico.

De esta manera, hay necesidad por métodos objetivos, reproducibles para pronosticar el resultado de tratamiento tales como supervivencia libre de avance de pacientes de cáncer o para supervisar el avance de este tratamiento y de esta manera seleccionar el régimen óptimo de tratamiento para cada paciente.

COMPENDIO DE LA INVENCIÓN Los métodos de la presente invención pueden utilizarse en una variedad de ambientes, incluyendo por ejemplo, para ayudar en métodos de tratamiento de cáncer de pacientes o en selección de pacientes durante el curso del desarrollo de droga, pronóstico de probabilidad de éxito cuando se trata a un paciente individual con un régimen de tratamiento particular, para estimar avance de enfermedad, para supervisar eficacia de tratamiento, para determinar pronóstico para pacientes individuales y en estimar predisposición de un individuo para beneficiarse de una terapia anti-cáncer particular.

La presente invención se basa, en parte en el descubrimiento de que los niveles de expresión de ciertos biomarcadores en pacientes que sufren de cáncer, se correlacionan con beneficio clínico reducido de terapia anti angiogénica sola. De acuerdo con esto, en un aspecto, la invención proporciona un método para optimizar eficacia terapéutica para el tratamiento de cáncer, que comprende la etapa de- detectar el nivel de expresión de factor de crecimiento de placenta (P1GF = placental growth factor) , en una muestra que se obtiene del paciente en donde la expresión incrementada de P1GF en la muestra en comparación con una muestra de referencia, indica que el paciente puede beneficiarse de terapia anti-cáncer diferente a o además de la terapia anti angiogénica. En algunas modalidades, el método además comprende administrar una terapia anti-cáncer al paciente, en donde la terapia anti-cáncer es diferente a o además de la terapia anti angiogénica.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para identificar un paciente de cáncer que puede beneficiarse de terapia anti-cáncer diferente a o además de terapia anti angiogénica, que comprende la etapa de detectar el nivel de expresión de factor de crecimiento de placenta (PlGF) en una muestra que se obtiene del paciente, en donde la expresión incrementada de PlGF en la muestra en comparación con una muestra de referencia, indica que el paciente puede beneficiarse de terapia anti-cáncer diferente a o además de terapia anti angiogénica. En una modalidad, la muestra del paciente se obtiene antes o al inicio de la terapia anti angiogénica. En una modalidad, la muestra del paciente se obtiene después de inicio de la terapia anti. angiogénica . En algunas modalidades, el método además comprende administrar una terapia anti-cáncer al paciente, en donde la terapia anti-cáncer es diferente a o además de la terapia anti angiogénica.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para pronosticar respuesta de un paciente de cáncer a terapia anti angiogénica, que comprende determinar el nivel de expresión de PlGF en una muestra que se obtiene del paciente, en donde niveles de expresión incrementados de PlGF en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es menor probable que responda a la terapia anti angiogénica sola. En una modalidad, la muestra del paciente que se obtiene antes de o al inicio de la terapia anti angiogénica. En una modalidad, la muestra del paciente se obtiene después de inicio de la terapia anti angiogénica. En algunas modalidades, el método además comprende administrar una terapia anti-cáncer al paciente, en donde la terapia anti-cáncer es diferente a o además de la terapia anti angiogénica.

La invención también proporciona un método para tratar un paciente con cáncer, que comprende administrar al paciente una terapia anti-cáncer diferente a o además de terapia anti angiogénica, en donde una muestra obtenida del pacienten muestra niveles de expresión incrementados de PlGF en comparación con una muestra de referencia. En una modalidad, la muestra del paciente se obtiene antes o al inicio de la terapia anti angiogénica. En una modalidad, la muestra del paciente se obtiene después de inicio de la terapia anti angiogénica. La muestra puede obtenerse del paciente antes de iniciar el tratamiento. En una modalidad, la muestra tiene un nivel de expresión PlGF mayor que o igual a 28 pg/ml. En algunas modalidades, la muestra puede obtenerse de un paciente que actualmente se trata con terapia anti angiogénica. En una modalidad, la muestra del paciente se obtiene después de inicio de la terapia anti angiogénica. En una modalidad, la muestra tiene un nivel de expresión de PlGF mayor que o igual a 50 pg/ml.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar un paciente de cáncer que comprende administrar al paciente una terapia anti angiogénica, en donde una muestra obtenida del paciente muestra niveles de expresión bajos o disminuidos de PlGF en comparación con una muestra de referencia. La muestre puede obtenerse del paciente antes de inicio de tratamiento. En una modalidad, la muestra tiene un nivel de expresión de PlGF menor que o igual a 28 pg/ml. En algunas modalidades, la muestra puede obtenerse de un paciente que actualmente se trata con terapia anti angiogénica. En una modalidad, la muestra del paciente se obtiene después de iniciar la terapia anti angiogénica. En una modalidad, la muestra tiene un nivel de expresión de PlGF menor que o igual a 50 pg/ml. En algunas modalidades, la terapia anti angiogénica comprende administración de un anticuerpo anti-VEGF, por ejemplo, bevacizumab.

También se proporcionan equipos que comprenden un compuesto capaz de detectar específicamente niveles de expresión de PlGF, en donde el equipo además comprende instrucciones para utilizar el equipo para pronosticar la respuesta de un paciente que sufre de cáncer a terapia anti angiogénica solo, en donde la expresión incrementada de PlGF en comparación con una muestra de referencia indica que el paciente puede beneficiarse de terapia anti-cáncer diferente a o a.demás de la terapia anti angiogénica.

En cualquiera de los métodos aquí descritos, la muestra puede ser una muestra de tejido o celular que se obtiene de sangre, plasma y/o suero. En ciertas modalidades, la muestra se obtiene de un paciente antes de inicio del tratamiento del cáncer. En ciertas modalidades, la muestra se obtiene del paciente después de inicio de tratamiento del cáncer. Por ejemplo, la muestra se obtiene dentro de 24 horas después de inicio de tratamiento de cáncer o dentro de 2, 3, 5, 10, 14, 20, 25, 28, 42 ó 56 días después del inicio de tratamiento de cáncer.

En cualquiera de los métodos aquí descritos, niveles de expresión del uno o más genes o productos de genes pueden determinarse a nivel de ácido nucleico, nivel de proteínas o secreción o nivel de expresión de superficie de la proteína. En ciertas modalidades, el aumento en niveles de expresión de P1GF es un aumento en 1.4-1.8 veces en nivel de expresión. En algunas modalidades, el aumento en el nivel de expresión de P1GF es un aumento de al menos 1.5 veces en el nivel de expresión.

En algunas modalidades de los métodos de la invención, el cáncer es carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, y leucemia. Ejemplos más particulares de estos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer pulmonar (incluyendo cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas, adenocarcinoma pulmonar, ' y carcinoma escamoso de pulmón) , cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular , cáncer gástrico o del estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal) , cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñon o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepáticos y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linforna de célula B (incluyendo linforna no-Hodgkin folicular/bajo grado (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL = small lymphocytic) ; NHL folicular/grado intermedio; NHL difuso grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de células no escindidas pequeñas de alto grado; NHL de enfermedad voluminosa o afectación masiva; linforna de células de manto; linforna relacionada a SIDA; y Macroglobulinemia de Waldenstrom) ; leucemia linfocítica crónica (CLL = chronic lymphocytic leukemia) ; leucemia linfoblástica aguda (ALL = acute lymphoblastic leukemia); Leucemia de células filosas; leucemia mieloblástica crónica; y desorden linfoproliferativo post-transplante (PTLD = post-transplant lymphoproliferative disorder) , así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores de cerebro) o síndrome de Meigs.

En una modalidad, el cáncer es- cáncer de mama, incluyendo, por ej . , cáncer de mama metastásico.

Los métodos de la invención pueden realizarse con cualquier agente anti-cáncer descrito a continuación. El agente anti angiogénico puede ser cualquiera de los agentes anti angiogenesis aquí descritos a continuación, solos o en combinación. En algunas modalidades la terapia anti angiogénica comprende administración de antagonista VEGF, incluyendo, por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF. En algunas modalidades, el anticuerpo anti-VEGF es bevazicumab.

Cualquier modalidad aquí descrita o cualquier combinación de las mismas aplica a cualquiera y todos los métodos de la invención aquí descritos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La Figura 1 es una gráfica que compara supervivencia total de pacientes con cáncer de mama a niveles PlGF de plasma el Día 0 (antes de inicio de tratamiento) .

La Figura 2 es una gráfica que muestra los niveles PlGF de plasma incrementados en respuesta a tratamiento con bevacizumab.

La Figura 3 es una gráfica que compara supervivencia total de pacientes con cáncer de mama a niveles PIGF de plasma el Día 14 de tratamiento con bevacizumab.

DESCRIPCIÓN DETALLADA La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique de otra forma', técnicas convencionales de biología molecular (incluyendo técnicas recombinantes ) , microbiología, biología celular, bioquímica e inmunología, que están dentro de la destreza en la especialidad. Estas técnicas se explican completamente en la literatura, tales como, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", segunda edición (Sambrook et al., 1989); "Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed. , 1984); "Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987); "Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.); "Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds . , 1987, y actualizaciones periódicas); "PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullís et al., eds., 1994) .

A menos que se defina de otra forma, términos técnicos y científicos aquí empleados tienen el mismo significado que se entiende comúnmente por una persona con destreza ordinaria en la técnica a la cual pertenece esta invención. Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed. , J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), and March, Advanced ' Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed. , John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992), proporcionan a una persona con destreza en la técnica con una guía general a muchos de los términos empleados en la presente solicitud.

Todas las referencias aquí citadas, incluyendo solicitudes y publicaciones de patentes, se incorporan por referencia en su totalidad.

Definiciones El término "matriz" o "micromatriz " , como se emplea aquí, se refiere a un arreglo ordenado de elementos de matriz hibridizable, de preferencia sondas polinucleótido (por ejemplo, oligonucleótidos) , en un substrato. El substrato puede ser un substrato sólido, tal como un porta-objeto de vidrio, o un substrato semi-sólido, tal como una membrana de nitrocelulosa . Las secuencias de nucleótido pueden ser ADN, ARN, o cualesquiera permutaciones de las mismas .

Una "secuencia objetivo", "ácido nucleico objetivo" o "proteína objetivo", como se emplea aquí, es un polinucleótido o proteína de interés, la detección del cual se desea. En general, una "plantilla" como se emplea aquí, es un polinucleótido que contiene la secuencia nucleótido objetivo. En algunos casos, los términos "secuencia objetivo", " ADN plantilla ", "polinucleótido de plantilla", "ácido nucleico objetivo", "polinucleótido objetivo" y sus variaciones, se emplean en forma intercambiable.

"Amplificación", como se emplea aquí, en general se refiere al proceso de producir múltiples copias de una secuencia deseada. "Múltiples copias" significa al menos 2 copias. Una "copia" no necesariamente significa identidad o complementariedad de secuencia perfecta con la secuencia de plantilla. Por ejemplo, copias pueden incluir análogos nucleótidos tales . como deoxiinosina, alteraciones de secuencia intencionales (tales como alteraciones de secuencia introducidas a través de un cebador que comprende una secuencia que es hibridizable, pero no complementaria, a la plantilla) , y/o errores de secuencia que ocurren durante amplificación.

Exprésion/cantidad de un gen, prote na o biomarcador en una primera muestra es alta o incrementada en comparación con la expresión/cantidad en una segunda muestra si el nivel/cantidad de expresión del gene, producto de gen, por ejemplo, proteina o biomarcador en la primera muestra es mayor que el nivel/cantidad de expresión del gene, producto de gen, por ejemplo, proteína o biomarcador en la segunda muestra. En una modalidad, el aumento en nivel/cantidad de expresión del gen, producto de gen, por ejemplo, proteína o biomarcador en la primer muestra es al menos aproximadamente 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X, o 100X el nivel/cantidad de expresión del gen respectivo, producto de gen, por ejemplo proteína o biomarcador en la segunda muestra.

Expresión/cantidad de un gen, proteína o biomarcador en una primera muestra es baja o disminuida en comparación con expresión/cantidad en una segunda muestra si el nivel/cantidad de expresión del gene, producto de gen, por ejemplo, proteína o biomarcador en la primera muestra es menor que el nivel/cantidad de expresión del gene, producto de gen, por ejemplo, proteína o biomarcador en la segunda muestra. En una modalidad, la disminución en nivel/cantidad de expresión del gen, producto de gen, por ejemplo, proteína o biomarcador en la primera muestra es al menos aproximadamente 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X, o 100X menor que el nivel/cantidad de expresión del gen respectivo, producto de gen, por ejemplo proteína o biomarcador en la segunda muestra.

Niveles/cantidad de expresión pueden determinarse con base en cualquier criterio conveniente conocido en la técnica, incluyendo pero no limitado a ARNm, ADNc, proteínas, fragmentos de proteínas y/o copia de genes. Niveles/cantidades de expresión pueden determinarse en forma cualitativa y/o cuantitativa. En una modalidad, las muestras se normalizan para ambas diferencias en la cantidad de ARN o proteína ensayada y variabilidad en la calidad del ARN o muestras de proteína empleadas. Esta normalización puede lograrse al medir e incorporar la expresión de ciertos genes de normalización, incluyendo genes constitutivos bien conocidos, tales como GAPDH. En forma alterna, la normalización puede basarse en la señal promedio o media de todos los genes ensayados o un gran sub-conjunto de los mismos (enfoque de normalización global) . En una base gen-por-gen, cantidad normalizada medida de un ARNm de tumor de paciente o proteína se compara con la cantidad que se encuentra en un conjunto de referencia. Niveles de expresión normalizados para cada ARNm o proteína por tumor probado por paciente pueden expresarse como un porcentaje de nivel de expresión medido en el conjunto de referencia. El nivel de expresión medido en una muestra de paciente particular a analizarse caerá en cierto percentil dentro de este intervalo, que puede ser determinado por métodos bien conocidos en la técnica.

"Detección" incluye cualquier medio de detección, incluyendo detección directa e indirecta.

El término "muestra", o "muestra de prueba" como se emplea aquí, se refiere a una composición que se obtiene o deriva de un sujeto de interés que contiene una entidad celular y/u otra molecular que se va a caracterizar y/o identificar, por ejemplo con base en características físicas, bioquímicas, químicas y/o fisiológicas. En una modalidad, la definición abarca sangre y otras muestras de líquido de origen biológico y muestras de tejido tales como espécimen de biopsia o cultivos de tejido o células de ahí derivadas. La fuente de la muestra de tejido puede ser tejido sólido tal como de una muestra de tejido u órgano fresco, congelado y/o conservado o biopsia o aspirado; sangre o cualesquier constituyentes de sangre; fluidos corporales; y células de cualquier tiempo de gestación o desarrollo del sujeto o plasma. Muestras pueden obtenerse de un sujeto antes del inicio de tratamiento (por ejemplo, tratamiento de cáncer) o después de inicio de tratamiento (por ejemplo, tratamiento de cáncer). Muestras pueden obtenerse dentro de 24 horas, 7, 10, 14, 28, 42 ó 56 días después de inicio de tratamiento (por ejemplo, tratamiento de cáncer) .

El término "muestra" o "muestra de prueba" incluye muestras biológicas que se han manipulado en cualquier forma después de su procuración, tal como por tratamiento con reactivos, solubilización o enriquecimiento para ciertos componentes, tales como proteínas o polinucleótidos , o incrustación en una matriz sólida o semi-sólida para propósitos de seccionado. Para los propósitos aquí, una "sección" de una muestra de tejido se entiende una sola parte o pieza de una muestra de tejido, por ejemplo una rebanada delgada de tejido o células que se cortan de una muestra de tej ido .

Muestras incluyen, pero no están limitadas a, células primarias o cultivadas o líneas celulares, sobrenadantes celulares, lisados celulares, plaquetas, suero, plasma, fluido vitreo, fluido linfático, fluido sinovial, fluido folicular, fluido seminal, fluido amniótico, leche, sangre entera, células derivadas de la sangre, orina, fluidos cerebro-espinal, saliva, esputo, lágrimas, transpiración, moco, lisados de tumor, y medio de cultivo de tejido, extractos de tejido tales como tejido homogeneizado, tejido de tumor, extractos celulares, y sus combinaciones.

En una modalidad, la muestra es una muestra clínica. En otra la modalidad, la muestra se emplea en un ensayo de diagnóstico. En algunas modalidades, la muestra se obtiene de un tumor primario o metastásico. Biopsia de tejido a menudo se emplea para obtener una pieza representativa del tejido de tumor. En forma alterna, puede obtenerse células de tumor indirectamente en la forma de tejidos o fluidos que se conoce o se considera que contienen las células de tumor de interés. Por ejemplo, muestras de lesiones de cáncer pulmonar pueden obtenerse por resección, broncoscopía, aspiración de aguja fina, raspados bronquiales, o de esputo, fluido de pleura o sangre.

En una modalidad, se obtiene una muestra de un sujeto o paciente antes de terapia anti angiogénica. En otra modalidad, se obtiene una muestra de un sujeto o paciente antes de terapia de antagonista VEGF. Todavía en otra modalidad, se obtiene una muestra de un sujeto o paciente antes de terapia de anticuerpo anti-VEGF. Incluso en otra modalidad, se obtiene una muestra de un sujeto o paciente después de al menos un tratamiento con terapia de antagonista VEGF.

En una modalidad, se obtiene una muestra de - un sujeto o paciente después de al menos un tratamiento con una terapia anti angiogénica. Todavía en otra modalidad, se obtiene una muestra de un sujeto o paciente después de al menos un tratamiento con un anticuerpo anti-VEGF. En algunas modalidades, se obtiene una muestra de un paciente antes que el cáncer origine metástasis. En ciertas modalidades, se obtiene una muestra de un paciente después de que el cáncer ha originado metástasis.

Una "muestra de referencia", como se emplea aquí, se refiere a cualquier muestra, norma o nivel que se utiliza para propósitos de comparación. En una modalidad, una muestra de referencia se obtiene de una parte sana y/o no-enferma del cuerpo (por ejemplo, tejido o células) del mismo sujeto o paciente. En otra modalidad, se obtiene una muestra de referencia de un tejido y/o célula sin tratar del cuerpo del mismo sujeto o paciente. En todavía otra modalidad, se obtiene una muestra de referencia de una parte sana y/o no-enferma del cuerpo (por ejemplo, tejidos o células) de un individuo que no es el sujeto o paciente. Aún en todavía otra modalidad, una muestra de referencias se obtiene de un tejido y/o parte de célula sin tratar del cuerpo de un individuo que no es el sujeto o paciente.

En ciertas modalidades, una muestra de referencia es una sola muestra o múltiples muestras combinadas del mismo sujeto o paciente, que se obtienen en uno o más puntos en tiempo diferentes que cuando se obtiene la muestra de prueba. Por ejemplo, una muestra de referencia se obtiene en un punto en tiempo previo del mismo sujeto o paciente que cuando se obtiene la muestra de prueba. Esta muestra de referencia puede ser útil si la muestra de referencia se obtiene durante diagnóstico inicial de cáncer y la muestra de prueba posteriormente se obtiene cuando el cáncer se vuelve metastásico.

En ciertas modalidades, una muestra de referencia incluye todos los tipos de muestras biológicas como se definió anteriormente bajo el término "muestra" que se obtiene de uno o más individuos que no son el sujeto o paciente. En ciertas modalidades, una muestra de referencia se obtiene de uno o más individuos con un desorden angiogénico (por ejemplo, cáncer) que no es el sujeto o paciente.

En ciertas modalidades, una muestra de referencia consiste de múltiples muestras combinada de uno o más individuos sanos que no son el sujeto o paciente. En ciertas modalidades, una muestra de referencia son múltiples muestras combinadas de uno o más individuos con una enfermedad o desorden (por ejemplo, un desorden angiogénico tal como, por ejemplo cáncer) que no son el sujeto o paciente. En ciertas modalidades, una muestra de referencia comprende muestras de ARN combinadas de tejidos normales o muestras de plasma o suero combinadas de uno o más individuos que no son el sujeto o paciente. En ciertas modalidades, una muestra de referencia comprende muestras de ARN combinadas de tejidos de tumor o muestras de suero o plasma combinadas de uno o más individuos con una enfermedad o desorden (por ejemplo, un desorden angiogénico tal como por ejemplo, cáncer) que no son el sujeto o paciente.

"Polinucleótido" o "ácido nucleico", como se emplea en forma intercambiable aquí, se refieren a polímeros de nucleótidos de cualquier longitud, e incluyen ADN y ARN. Los nucleótidos pueden ser deoxiribonucleótidos , ribonucleótidos , nucleótidos o bases modificadas, y/o sus análogos, o cualquier substrato que puede incorporarse en un polímero por ADN o ARN polimerasa. Un polinucleótido puede comprender nucleótidos modificados, tales como nucleótidos metilados y sus análogos. La presente, la modificación a la estructura de nucleótido puede impartirse antes o después de armado del polímero. La secuencia de nucleótidos puede interrumpirse por componentes no nucleótido. Un polinucleótido además puede modificarse después de polimerización, tal como por conjugación con un componente etiquetado. Otros tipos de modificaciones incluyen, por ejemplo "tapas", substitución de uno o más de los nucleótidos de origen natural con un análogo, modificaciones internucleótido tales como por ejemplo, aquellas con enlaces sin carga (por ejemplo, metil fosfonatos, fosfotriésteres, fosfpamidatos , cabamatos, etc.) y con enlaces con carga (por ejemplo, fósforotioatos , fósforoditioatos , etc.), aquellos que contienen porciones secundarias, tales como por ejemplo, proteínas (por ejemplo, nucleasas, toxinas, anticuerpos, péptidos de señal, poli-Llisina, etc.), aquellos con intercaladores (por ejemplo, acridina, psoraleno, etc.), aquellos que contienen queladores (por ejemplo, metales, metales radioactivos, boro, metales oxidativos, etc.), aquellos que contienen alquiladores, aquellos con enlaces modificados (por ejemplo, ácidos nucleicos alfa anoméricos, etc.), así como formas no modificadas de el o los polinucleotidos. Además, cualquiera de los grupos hidroxilo ordinariamente presentes en los azúcares puede ser reemplazado por ejemplo por grupos fosfonato, grupos fosfato, grupos protegidos por grupos protectores estándar, o activados para preparar enlaces adicionales a nucleótidos adicionales, o pueden formularse a soporte sólidos. El OH 5' y 3' terminal puede ser fosforilado o substituido con aminas o porciones de grupos de tapa orgánicos de 1 a 20 átomos de carbono. Otros hidroxilos también pueden derivarse a grupos protectores estándar.

Polinucleotidos también pueden contener formas análogas de ribosa o deoxiribosa azúcares tales . como se conoce generalmente en la técnica, incluyendo por ejemplo, 2 ' -0-metil-2 ' -0-alilo, 2'-fluoro- o 2 ' -azido-ribosa, análogos de azúcar carbocíclicos , azúcares a- anoméricas, azúcares . epiméricas tales como arabinosa, xilosas o lixosas, piranosa azúcares, furanosa azúcares, sedoheptulosas, análogos acíclicos y análogos de nucleósido abásico tales como metil ribósido. Uno o más enlaces fosfodiéster pueden ser reemplazados por grupos de enlace alternos. Estos grupos de enlace alternos incluyen, pero no están limitados a, modalidades en donde el fosfato se reemplaza por P(0)S("tioato") , P(S)S ( "ditioato" ) , " (0)NR 2 ( "amidato" ) , P(0)R, P(0)0R', CO o CH 2 ( " formacetal " ) , en donde cada R o R' independientemente es H o alquilo sustituido o sin sustituir (1-20 C) que opcionalmente contiene un enlace éter (--0--) , arilo, alquenilo, cicloalquilo, cicloalquenilo o araldilo. No todos los enlaces en un polinucleótido requieren ser idénticos. La descripción precedente aplica a todos los polinucleotidos aquí referidos, incluyendo ARN y ADN.

"Oligonucleótido" , como se emplea aquí, en general se refiere a polinucleotidos cortos, generalmente de una sola hebra, generalmente sintéticos, que en general, pero no necesariamente, tienen menos de aproximadamente 200 nucleótidos de longitud. Los términos "oligonucleótido" y "polinucleótido" no son mutuamente excluyentes. La anterior descripción para polinucleótidos aplica e forma igual y completa a oligonucleótidos .

Un "cebador" en general es un polinucleótido de una sola hebra corto, generalmente con un grupo 3 ' -OH libre, que liga a un objetivo potencialmente presente en una muestra de interés al hibridizar con una secuencia objetivo, y posteriormente promueve la polimerización de un polinucleótido complementario al objetivo.

El término "biomarcador" como se emplea aquí, se refiere en general a una molécula, incluyendo un gen, proteína, estructura carbohidrato, o glicolípido, la expresión del cual en o sobre un tejido o células de mamífero puede ser detectada por métodos estándar (o métodos descritos aquí) y es predictivo, de diagnóstico y/o pronóstico para la sensibilidad de un tejido o célula de mamífero a regímenes de tratamiento con base en inhibición de angiogénesis , por ejemplo ' un agente anti angiogénesis tal como un inhibidor específico de VEGF. Opcionalmente, la expresión de este biomarcador se determina superior que la observada para una muestra de célula o tejido de referencia/control. La expresión de estos biomarcadores puede determinarse utilizando un inmuno-ensayo múltiple ado de alto rendimiento tal como aquellos comercialmente disponible de Rules Based Medicine, Inc. o Meso Scale Discovery. La expresión de los biornareadores también pueden determinarse utilizando, por ejemplo, ensayo PCR o FACS, un ensayo inmunohistoquímico o un ensayo basado en matriz génica.

Por "muestra de tejido o célula" se entiende una colección de células que se obtienen de un tejido de un sujeto o paciente. La fuente de la muestra de tejido o células puede ser tejido sólido tal como de una muestra o biopsia o aspirado de tejido u órgano fresco, congelado y/o conservado; sangre o cualesquiera constituyentes de sangre; fluidos corporales tales como fluido cerebro espinal, fluido amniótico, fluido peritoneal, o fluido intersticial; células de cualquier tiempo de gestación o desarrollo del sujeto o plasma. La muestra de tejido también puede ser células o líneas celulares primarias o cultivadas. Opcionalmente, la muestra de tejido o celular se obtiene de un órgano/tej ido canceroso. La muestra de tejido puede contener compuestos que no se entre-mezclan naturalmente con el tejido en la naturaleza tal como conservadores, anticoagulantes, amortiguadores, fijadores, nutrientes, antibióticos, o semejantes. Para los presentes propósitos, una "sección" de una muestra de tejido se pretende una sola parte o pieza de una muestra de tejido, por ejemplo una rebanada delgada de tejido o células que se corta de una muestra de tejido.

Por "correlaciona" o "correlacionar" se entiende comparar, en cualquier forma, el desempeño y/o resultados de un primer análisis o protocolo con el desempeño y/o resultado de un segundo análisis o protocolo. Por ejemplo, se puede utilizar los resultados de un primer análisis o protocolo para llevar a cabo segundos protocolos y/o se puede utilizar los resultados de un primer análisis o protocolo para determinar si habrá de realizarse un segundo análisis o protocolo. Con respecto a la modalidad de análisis o protocolo de expresión de genes, se puede utilizar los resultados del análisis de expresión de genes o protocolo para determinar si deberá realizarse un régimen terapéutico específico .

La palabra "etiqueta" cuando se emplea aquí, se refiere a un compuesto o composición que es conjugado o fusionado directa o indirectamente con un reactivo tal como una sonda de ácido nucleico o un anticuerpo y facilita la detección del reactivo al cual se conjuga o fusiona. La etiqueta misma puede ser detectable {por ejemplo, etiquetas de radioisótopo o etiquetas fluorescentes) o, en el caso de una etiqueta enzimática, pueden catalizar alteración química de un compuesto o composición de un substrato que es detectable .

Un polipéptido de "secuencia nativa" comprende un polipéptido que tiene la misma secuencia de amino ácidos que un polipéptido derivado de la naturaleza. De esta manera, un polipéptido de secuencia nativa puede tener la secuencia de amino ácidos de polipéptido de origen natural de cualquier mamífero. Este polipéptido de secuencia nativa puede aislarse de la naturaleza o puede producirse por medios recombinantes o sintéticos. El término polipéptido de "secuencia nativa" específicamente abarca formas secretadas o truncadas de origen natural del polipéptido (por ejemplo, una secuencia de dominio extracelular) , formas variantes de origen natural (por ejemplo, formas alternativamente combinadas) y variantes alélicas de origen natural del polipéptido .

Un polipéptido "variante" significa un polipéptido biológicamente activo que tiene al menos aproximadamente 80% de identidad de secuencia de amino ácido con el polipéptido de secuencia nativa. Estas variantes incluyen, por ejemplo polipéptidos en donde uno o más residuos amino ácidos se agregan o eliminan en el extremo N- o C del polipéptido. De manera ordinaria, una variante tendrá al menos aproximadamente 80% identidad de secuencia de amino ácido, más preferiblemente al menos aproximadamente 90% identidad de secuencia de amino ácidos, y aún más preferible al menos aproximadamente 95% identidad de secuencia de amino ácidos con el polipéptido de secuencia nativa.

El término "VEGF" o "VEGF-A" se emplea para referirse al factor de crecimiento celular endotelial vascular humano de 165 amino ácidos y relacionados factores de crecimiento celular endotelial vascular humanos de 121-, 189-, y 206- amino ácidos, como se describe por Leung et al. Science, 246:1306 (1989), and Houck et al. Mol. Endocrin. , 5:1806 (1991), junto con sus formas alélicas y procesadas de origen natural. VEGF-A es parte de una familia de genes incluyendo VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F, y PlGF . VEGF-A primordialmente liga a dos receptores de tirosina quinasas de alta afinidad, VEGFR-1 (Flt-1) y VEGFR-2 (Flk-1/KDR) , esta última es el mayor transmisor de señales mitogénicas celulares vasculares endoteliales de VEGF-A. En forma adicional, neuropilina-1 se ha identificado como un receptor para isoformas VEFG-A de enlace heparina, y puede jugar un papel en desarrollo vascular. El término "VEGF" o "VEGF-A" también se refiere a VEGFs de especies no-humanas tales como ratón, rata o primate. En ocasiones, VEGF de una especie específica se indica en términos tales como hVEGF para VEGF humano o mVEGF para VEGF murino. El término "VEGF" también se emplea para referirse a formas truncadas o fragmentos del polipéptido que comprende amino ácidos 8 a 109 o l a 109 del factor de crecimiento celular endotelial vascular humano de 165-amino ácidos. Referencia a cualesquiera de estas formas de VEGF puede ser identificada en la presente solicitud, por ejemplo por "VEGF (8-109) ", "VEGF (1-109)" o "VEGFi65". Las posiciones de amino ácido para un VEGF nativo "truncado" se numeran como se indica en la secuencia VEGF nativa. Por ejemplo, la posición de amino ácido 17 (metionina) en VEGF nativa truncado también es la posición 17 (metionina) en VEGF nativa. El VEGF nativo truncado tiene afinidad de enlace para los receptores KDR y Flt-1 comparables con el VEGF nativo.

El término "VEGF" o "VEGF-A" como se emplea aquí, se refiere al factor de crecimiento celular endotelial vascular humano de 165-amino ácidos y factores de crecimiento celular endotelial vascular humanos de 121-, 189- y 206-amino ácidos relacionados, como se describe por Leung et al. (1989) Science 246:1306, and Houck et al. (1991) Mol. Endocrin, 5:1806, junto con sus formas alélicas de origen natural y procesadas. El término "VEGF" también se refiere a VEGFs de especies no-humanas tales como ratón, rata o primate. En ocasiones, VEGF de una especie específica se indican por términos tales como hVEGF para VEGF humano, mVEGF para VEGF murino, y etc. El término "VEGF" también se emplea para referirse a formas truncadas del polipéptido que comprenden los amino ácidos 8 a 109 o 1 a 109 del factor de crecimiento celular endotelial vascular humano de 165-amino ácidos. Referencia a cualesquiera de estas formas de VEGF puede ser identificada en la presente solicitud, por ejemplo "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" o "VEGFi65" . Las posiciones de amino ácidos para un VEGF nativo "truncado" se numeran como se indica en la secuencia VEGF nativa. Por ejemplo, la posición amino ácido 17 (metionina) en VEGF nativo truncado también es la posición 17 (metionina) en VEGF nativo. El VEGF nativo truncado KDR tiene afinidad de enlace para los receptores Flt-1 comparables con VEGF nativo.

"Actividad biológica de VEGF" incluye ligar a cualquier receptor VEGF o cualquiera actividad de señalización VEGF tal como regulación tanto de angiogénesis normal como anormal y vasculogénesis (Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18:4-25; Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77:527-543); promover vasculogénesis embriónica y angiogénesis (Carmeliet et al. (1996) Nature 380:435-439; Ferrara et al. (1996) Nature 380:439-442); y modular la proliferación de bazos de sangre cíclicos en el tracto reproductor femenino para formación de cartílago y crecimiento de huesos (Ferrara et al. (1998) Nature Med. 4:336-340; Gerber et al. (1999) Nature Med. 5:623-628). Además de ser un factor angiogénico en angiogénesis y vasculogénesis, VEGF, es un factor de crecimiento pleyotrópico, exhibiendo múltiples efectos biológicos en otros procesos fisiológicos, tales como supervivencia de células endoteliales , permeabilidad de vasos y vasodilatación, quimiotaxia de monocitos e influjo de calcio (Ferrara and Davis-Smyth (1997), supra y Cebe-Suarez et al. Cell. Mol. Life Sci. 63:601-615 (2006)) . Aún más, recientes estudios han reportado efectos mitogénicos de VEGF en unos cuantos tipos de células no endoteliales , tales como células epiteliales de pigmento retinal, células de ductos pancreáticos, y células de Schwann. Guerrin et al. (1995) J. Cell Physiol. 164:385-394; Oberg-Welsh et al. (1997) Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132; Sondell et al. (1999) J. Neurosci. 19:5731-5740.

Un "antagonista VEGF" o "antagonista específico de VEGF" se refiere a una molécula capaz de ligar a VEGF, reduciendo niveles de expresión VEGF, o neutralizar, bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con actividades biológicas VEGF, incluyendo, pero no limitadas a enlace VEGF a uno o más receptores VEGF y angiogénesis mediada por VEGF, y proliferación o supervivencia de células endoteliales. Se incluye como antagonistas específicos de VEGF útiles en los métodos de la invención polipéptidos que ligan específicamente a VEGF, anticuerpos anti-VEGF y sus fragmentos de enlace de antígeno, moléculas receptoras y derivados que ligan específicamente a VEGF, de esta manera secuestrando su enlace a uno o más receptores, proteínas de fusión (e.g., VEGF-Trap (Regeneron) ) , y (Peregrine) . Antagonistas específicos VEGF también incluyen variantes antagonistas de polipéptidos VEGF, oligómeros de nucleobase antisentido complementarios a cuando menos un fragmento de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido VEGF; ARNs pequeños complementarios a cuando menos un fragmento de una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido VEGF; ribozimas que hacen blanco en VEGF; enlaces/cuerpos peptídicos a VEGF; y aptámeros VEGF. Antagonistas específicos de VEGF también incluyen moléculas pequeñas no péptido que ligan a VEGF y son capaces de bloquear, inhibir, abrogar, reducir o interferir con actividades biológicas VEGF. De esta manera, el término "actividades VEGF" incluye específicamente actividades biológicas mediadas por VEGF de VEGF. En ciertas modalidades, el antagonista VEGF reduce o inhibe, en al menos 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más, el nivel de expresión o actividad biológica de VEGF. En algunas modalidades, el VEGF inhibido por el antagonista específico de VEGF, es VEGF (8-109), VEGF (1-109) O VEGFi65.

Un "anticuerpo anti-VEGF" es un anticuerpo que liga a VEGF con afinidad y especificidad suficientes. En ciertas modalidades, el anticuerpo selecto normalmente tendrá una afinidad de enlace suficiente para VEGF, por ejemplo, el anticuerpo puede ligar hVEGF con un valor ¾ de entre 100 nM-1 pM. Afinidades de anticuerpo pueden determinarse por un ensayo basado en resonancia plasmón de superficie (tal como el ensayo BIAcore como se describe en la Publicación de la Solicitud PCT No. WO2005/012359) ; ensayo de inmunoabsorción ligado a una enzima (ELISA) ; y ensayos competitivos (por ej .

RIA's), por ejemplo.

En cierta modalidad, el anticuerpo anti-VEGF puede emplearse como un agente terapéutico para hacer blanco e interferir con enfermedades o condiciones en donde está involucrada la actividad VEGF. También, el anticuerpo puede estar sometido a otros ensayos de actividad biológica, por ejemplo para evaluar su efectividad como un agente terapéutico. Estos ensayos se conocen en la técnica y dependen del antígeno objetivo y el uso pretendido para el anticuerpo. Ejemplos incluyen el ensayo de inhibición HUVEC; ensayos de inhibición de crecimiento de células de tumor (como se describe en WO 89/06692, por ejemplo); ensayos de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC = antibody-dependent cellular cytotoxicity) y citotoxicidad mediada por complemento (CDC = complement-mediated cytotoxicity) (patente de los E.U.A. No. 5,500,362); y actividad agonista o ensayos de hematopoyesis (ver WO 95/27062) . Un anticuerpo anti-VEGF usualmente no ligará a otros homólogos VEGF tales como VEGF-B o VEGF-C, ni otros factores de crecimiento tales como PlGF, PDGF o bFGF. En una modalidad, anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo monoclonal que liga al mismo epítopo que el anticuerpo anti-VEGF monoclonal A4.6.1 producido por ATCC de hibridoma HB 10709. En otra modalidad, el anticuerpo anti-VEGF es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta et al. (1997) cáncer Res. 57:4593-4599, incluyendo pero no limitado al anticuerpo conocido como bevacizumab (BV; AVASTIN®) .

El anticuerpo anti-VEGF "Bevacizumab (BV) " , también conocido como "rhuMAb VEGF" o "AVASTIN®", es un anticuerpo monoclonal anti-VEGF humanizado recombinante generado de acuerdo con Presta et al. (.1997) cáncer Res. 57:4593-4599. Comprende regiones marco IgGl humanas mutadas y regiones de determinación de complementariedad de enlace de antígeno del anticuerpo monoclonal anti-hVEGF murino A.4.6.1 que bloquea el enlace VEGF humano a sus receptores . Aproximadamente 93% de la secuencia de amino ácidos de Bevacizumab, incluyendo la mayoría de las regiones marco, se deriva de IgGl humano, y aproximadamente 7% de la secuencia se deriva del anticuerpo murino A4.6.1. Bevacizumab tiene una masa molecular de aproximadamente 149,000 daltons y está glicosilado. Bevacizumab y otros anticuerpos anti-VEGF humanizados además se describen en la patente de los E.U.A. No. 6,884,879 otorgada en febrero 26, 2005, toda la descripción de la cual se incorpora expresamente aquí por referencia. Anticuerpos preferidos adicionales incluyen los anticuerpos series G6 o B20 (e.g., G6-31, B20-4.1), como se describe en la Publicación de la Solicitud PCT No. O2005/012359. Para anticuerpos preferidos adicionales ver las patentes de los E.U.A. Nos. 7,060,269, 6,582,959, 6,703,020; 6,054,297; W098/45332; WO 96/30046; WO94/10202; EP 0666868B1; las Publicaciones de Solicitud de Patentes de los E.U.A. Nos. 2006009360, 20050186208, 20030206899, 20030190317, 20030203409, y 20050112126; y Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004). Otros anticuerpos preferidos incluyen aquellos que ligan a un epítopo funcional en VEGF humano que comprende residuos F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, 191, 101, E103 y C104 o en forma alterna, comprende los residuos F17, Y21, Q22, Y25, D63, 183 Y Q89..

El término "anticuerpo" se emplea en el sentido más amplio y cubre específicamente anticuerpos monoclonales (incluyendo anticuerpos monoclonal de longitud íntegra) , anticuerpos policlonales, anticuerpos multiespecífieos (por ejemplo, anticuerpos biespecíficos ) , y fragmentos de anticuerpo siempre que exhiban la actividad biológica deseada.

Un anticuerpo de "bloqueo" o un anticuerpo "antagonista" es aquel que inhibe o reduce actividad biológica del antígeno al que liga. Por ejemplo, un anticuerpo antagonista específico de VEGF liga VEGF e inhibe la habilidad de VEGF para inducir proliferación de células endoteliales vasculares. Anticuerpos bloqueadores o anticuerpos antagonistas preferidos inhiben completamente la actividad biológica del antígeno.

A menos que se indique de otra forma, la expresión "anticuerpo multivalente" se emplea a través de esta especificación para denotar un anticuerpo que comprende tres o más sitios de enlace de antígeno. El anticuerpo multivalente de preferencia se somete a ingeniería para tener los tres o más sitios de enlace de antígeno y en general no es un anticuerpo IgM o IgA de secuencia nativa.

Un fragmento "Fv" es un fragmento de anticuerpo que contiene un sitio de enlace de reconocimiento de antígeno completo. Esta región consiste de un dímero de un dominio variable de cadena pesada y . una ligera en asociación estrecha, que puede ser de naturaleza covalente, por ejemplo en scFv. Es en esta configuración que las tres CDRs de cada dominio variable interactúan para definir un sitio de enlace de antígeno en la superficie del dímero VH-VL. Colectivamente, las seis CDRs o un sub-con unto de las mismas confiere especificidad de enlace de antígeno al anticuerpo. Sin embargo, incluso un solo dominio variable (o la mitad de un Fv que comprende solo tres CDRs específicas para un antígeno) tiene la capacidad para reconocer y ligar antígeno, aunque usualmente a una menor afinidad que todo el sitio de enlace.

El término "anticuerpo monoclonal" como se emplea aquí, se refiere a un anticuerpo que se obtiene de una población de anticuerpos substancialmente homogéneos , es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones de origen natural posible que pueden estar presentes en cantidades menores. Anticuerpos monoclonales son altamente específicos, dirigidos contra un solo sitio antigénico. Además, en contraste con preparaciones de anticuerpo (policlonal) convencionales que típicamente incluyen diferentes anticuerpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos), cada anticuerpo monoclonal se dirige contra un solo determinante en el antígeno. El modificador "monoclonal" indica el carácter del anticuerpo como obtenido de una población subs ancialmente homogéneo de anticuerpos, y no habrá de considerarse como que requiera producción del anticuerpo por ningún método particular. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales a utilizarse de acuerdo con la presente invención pueden elaborarse por el método de hibridoma primero descrito por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), o pueden elaborarse por métodos de ADN recombinante (ver, por ejemplo, la patente de los E.U.A. No. 4,816,567). Los "anticuerpos monoclonales" también pueden ser aislados de bibliotecas de anticuerpo fago utilizando las técnicas descritas en Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) y Marks et al., J". Mol. Biol. 222:581-597 (1991), por ejemplo.

Los anticuerpos monoclonales aquí específicamente incluyen anticuerpos "quiméricos" ( inmunoglobulinas ) en donde una porción de la cadena pesada y/o ligera es idéntica con u homologa a secuencias correspondientes en anticuerpos derivadas de una especie particular o que pertenecen a una clase o sub-clase de anticuerpo particular, mientras que el resto de la o las cadenas es idéntico con u homólogo a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o que pertenecen a otra clase o sub-clase de anticuerpo, así como fragmentos de estos anticuerpos, siempre que exhiban la actividad biológica deseada (patente de los E.U.A. No. 4,816,567; y Morrison et al., Proc. Nati. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)).

Formas "humanizadas" de anticuerpos no-humanos (por ejemplo, murinos) son anticuerpos quiméricos que contienen secuencia mínima derivada de inmunoglobulina no humana. En su mayoría, los anticuerpos humanizados son inmunoglob linas humanas (anticuerpo recipiente) en donde residuos de una región hipervariable del recipiente se reemplazan por residuos de una región hipervariable de una especie no humana (anticuerpo donador) tal como ratón, rata, conejo o primate no humano que tienen las deseadas especificidad, afinidad y capacidad. En algunos casos, residuos de región marco Fv (FR) de la inmunoglobulina humana se reemplazan por residuos no humanos correspondientes. Además, anticuerpos humanizados pueden comprender residuos que no se encuentran en el anticuerpo recipiente o en el anticuerpo donador. Estas modificaciones se hacen para refinar adicionalmente el desempeño de anticuerpo. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá substancialmente todo de al menos uno, y típicamente dos dominios variables, en donde todo o substancialmente todos los bucles hipervariables corresponden a aquellos de una inmunoglobulina no humana y todo o substancialmente todas las regiones FR son aquellas de una secuencia de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado opcionalmente también comprenderá al menos una porción de la región constante de inmunoglobulina (Fe) , típicamente la de una inmunoglobulina humana. Para mayores detalles, ver Jones et al., Nature 321 : 522 - 525 ( 1986 ) ; Riechmann et al., Nature 332 : 323 -329 ( 1988 ) ; y Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2 : 593 - 596 ( 1992 ) .

Un "anticuerpo humano" es aquel que posee una secuencia de amino ácido que corresponde a la de un anticuerpo producido por un humano y/o se ha elaborado utilizando cualquiera de las técnicas para producir anticuerpos humanos como se describe aquí. Esta definición de un anticuerpo humano excluye específicamente un anticuerpo humanizado que comprende residuos de enlace de antígeno no-humano. Anticuerpos humanos pueden producirse utilizando diversas técnicas conocidas en la especialidad. En una modalidad, el anticuerpo humano se elige de una biblioteca fago, en donde la biblioteca fago expresa anticuerpos humanos (Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996) : Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998)) ; Hoogenboom and inter, J". Mol. Biol., 227:381 (1991) ; Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)) . Anticuerpos humanos también pueden elaborarse al introducir sitios de inmunoglobulina humana en animales transgénicos, por ejemplo, ratones en donde los genes de inmunoglobulina endógenos se han inactivado en forma parcial o completa. Ante prueba, se observa producción de anticuerpo humano, que semeja cercanamente la vista en humanos en todos los aspectos, incluyendo rearreglo de genes , ensamblado y repertorio de anticuerpos. Este enfoque se describe, por ejemplo en las patentes de los E.U.A. Nos. 5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,661,016, y en las siguientes publicaciones científicas: Marks et al., Bio/ echnology 10: 779-783 (1992); Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994) ; Morrison, Nature 368:812-13 (1994) ; Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996); Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996) ; Lonberg y Huszar, Intern. Rev. Ii nunol. 13:65-93 (1995) . En forma alterna, el anticuerpo humano puede ser preparado por inmortalización de linfocitos B humanos que producen un anticuerpo dirigido contra un antígeno objetivo (tal como linfocitos B pueden ser recuperados de un individuo o pueden haber sido inmunizados in vitro) . Ver, por ej . , Colé et al., Monoclonal Antibodies and cáncer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985); Boerner et al., J. Imunol . , 147 (l):86-95 (1991); y la patente de los E.U.A. *No. 5, 750, 373.

Un polipéptido "aislado" o "anticuerpo aislado" es aquel que se ha identificado y separado y/o recuperado de un componente de su ambiente natural . Componentes de contaminación de su ambiente natural son materiales que interferirán con usos de diagnóstico o terapéutico para el polipéptido o anticuerpo, y pueden incluir enzimas, hormonas, y otros solutos proteináceos o no proteináceos . En modalidades preferidas, el polipéptido o anticuerpo será purificado (1) a más de 95% en peso de polipéptido o anticuerpo como se determina por el método de Lowry, y más preferiblemente más que 99% en peso, (2) a un grado suficiente para obtener al menos 15 residuos de secuencia de amino ácidos interna o N-terminal por el uso de un secuenciador de tasa giratoria, o (3) a homogeneidad por SDS-PAGE bajo condiciones reductoras o no reductoras utilizando azul Coomassie, o de preferencia tinción de plata. Polipéptido aislado o anticuerpo incluye el polipéptido o anticuerpo in situ dentro de células recombinantes ya que al menos un componente del ambiente natural del polipéptido no estará presente. De manera ordinaria, sin embargo el polipéptido o anticuerpo aislado será preparado por al menos una etapa de purificación.

Como se emplea aquí, "tratamiento" se refiere a intervención clínica en un intento por alterar el curso natural del individuo o célula que se trata, y puede realizarse ya sea para profilaxis o durante el curso de patología clínica. Efectos convenientes del tratamiento incluyen evitar la ocurrencia o recurrencia de enfermedad, alivio de síntomas, disminución de cualesquiera consecuencias patológicas directas o indirectas de la enfermedad, disminuir la velocidad de avance de la enfermedad, mejorar o paliar el estado de la enfermedad, y remisión o pronóstico mejorado. En algunas modalidades, métodos y composiciones de la invención son útiles en intentos para retardar el desarrollo de una enfermedad o desorden.

Una "cantidad efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y por periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado terapéutico o profiláctico deseado. Una cantidad "cantidad terapéutica efectiva" de un agente terapéutico puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo y peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para producir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéutica efectiva es también una en la que cualesquiera efectos tóxicos o nocivos del agente terapéutico son superados por los efectos benéficos terapéuticos. Una "cantidad profiláctica efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a dosis y por periodos de tiempo necesarios, para lograr el resultado profiláctico deseado. Típicamente pero no en forma necesaria, ya que se emplea una dosis profiláctica en sujetos antes de o en una etapa previa de la enfermedad, la cantidad profiláctica efectiva será menos que la cantidad terapéutica efectiva. En el caso de tumores pre-canceroso, benignos, de etapa temprana o tardía, la cantidad terapéutica efectiva del inhibidor angiogénico puede reducir el número de células de cáncer ; reducir el tamaño de tumor primario; inhibir (es decir, frenar en cierta medida y de preferencia detener) la infiltración de células de cáncer en órganos periféricos; inhibir (es decir, frenar en cierta medida y de preferencia detener) metástasis de tumor; inhibir, en cierta medida, crecimiento de tumor; y/o aliviar en cierta medida uno o más de los síntomas asociados con el desorden. En la extensión que la droga pueda evitar el crecimiento y/o exterminar células de cáncer existentes, pueden ser citostática y/o citotóxica. Para terapia de cáncer, la eficacia in vivo, por ejemplo puede medirse al estimar la duración de supervivencia, tiempo para avance de la enfermedad (TTP = time to disease progression) , las velocidades de respuesta (RR = response rates) , duración de respuesta, y/o calidad de vida .

"Corta supervivencia libre de progresión" se refiere a progresión al tiempo de primera evaluación de tumor. Dependiendo del tipo de cáncer o tumor la primera vez de evaluación de tumor ocurre aproximadamente 4, 3, 2 ó 1 mes después de inicio del tratamiento. La sincronización de primera evaluación de tumor depende de que tan rápido avanza la enfermedad particular. En una modalidad, el tiempo de primera evaluación de tumor para cáncer renal es 56 días después de inicio de terapia anti-cáncer.

Los términos "cáncer" y "canceroso" se refieren a o describen la condición fisiológica en mamíferos que se caracteriza típicamente por crecimiento celular no regulado. En esta definición se incluyen cánceres benignos y malignos. Ejemplos de cáncer incluyen pero no están limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia. Ejemplos más particulares de estos cánceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer pulmonar (incluyendo cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células no pequeñas, adenocarcinoma del pulmón, y carcinoma escamoso de pulmón) , cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o del estómago (incluyendo cáncer gastrointestinal) , cáncer pancreático, glioblastoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivales, cáncer de riñon o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer tiroideo, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer de cabeza y cuello, así como linfoma de células B (incluyendo linfoma no Hodgkin folicular/bajo grado (NHL); NHL linfocítico pequeño (SL = small lymphocytic) ; NHL folicular/grado intermedio; NHL difuso de grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de células no escindidas pequeñas de alto grado; NHL de enfermedad voluminosa o afectación masiva; linfoma de células de manto linfoma relacionado a SIDA; y Macroglobulinemia de Waldenstrom) ; leucemia linfocítica crónica (CLL = chronic lymphocytic leukemia) ; leucemia linfocítica aguda (ALL = acute lymphoblastic leukemia); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblástica crónica; y desorden linfoproliferativo post-transplante (PTLD = post-transplant lymphoproliferative disorder) , así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como 'el asociado con tumores de cerebro), y síndrome de Meig.

Por "sujeto" o "paciente" se entiende un mamífero, incluyendo pero no limitado a, un humano o mamífero no-humano, tal como bovino, equino, canino, ovino o felino. De preferencia, el sujeto o paciente es un humano.

El término "terapia de anti-cáncer" se refiere a una terapia útil para tratar cáncer. Ejemplos de agentes terapéuticos anti-cáncer incluyen, pero no están limitados a, por ejemplo agentes quimioterapéuticos , agentes inhibidores de crecimiento, agentes citotóxicos, agentes empleados en terapia de radiación, agentes de anti angiogénesis , agentes apoptósicos, agentes anti-tubulina, y otros .agentes para tratar cáncer, tales como anticuerpos anti-HER-2, anticuerpos anti-CD20, un antagonista de receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR = epidermal growth factor receptor) (por ejemplo, un inhibidor de tirosina quinasa) , un inhibidor HERI/EGFR (e.g., erlotinib (Tarceva™) , inhibidores de factor de crecimiento de inhibidor de plaquetas (por ejemplo, Gleevec" (Imatinib Mesylate) ) , un inhibidor COX-2 (e.g., celecoxib) , interferonas , citoquinas, antagonistas (por ejemplo, anticuerpos neutralizantes) que ligan a uno o más de los siguientes objetivos VEGF, ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-beta, BlyS, APRIL, BCMA o uno o varios receptores VEGF, TRAIL/Apo2, y otros agentes bioactivos y químicos orgánicos, etc. Sus combinaciones también se incluyen en la invención.

Un "factor o agente angiogénico" es un factor de crecimiento o su receptor que está involucrado en estimular el desarrollo de bazos sanguíneos, por ejemplo, promover angiogénesis, crecimiento de célula endotelial, estabilidad de bazos sanguíneos y/o vasculogénesis , etc. Por ejemplo, factores angiogénicos , incluyen pero no están limitados a, por ejemplo, VEGF y miembro de la familia VEGF y sus receptores (VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGFRl , VEGFR2 y VEGFR3 ) , P1GF, familia PDGF, familia factor de crecimiento fibroblastos (FGFs = fibroblast growth factor family) , ligados TIE (Angiopoyetinas , ANGPT1, A GPT2), TIE1, TIE2, efriñas, Bv8, ligando tipo Delta 4 (DLL4) , Del-1, factores de crecimiento de fibroblastos: acídico (aFGF) y básico (bFGF) , FGF4, FGF9, BMP9 , BMP10, Folistatina, factor de estímulo de colonia de granulocitos (G-CSF = Granulocyte colony-stimulating factor) , GM-CSF, Factor de crecimiento de hepatocitos (HFG = Hepatocyte growth factor) /Factor de dispersión (SF = scatter factor), Interleucina-8 (IL-8), CXCL12, Leptina, Midkina, neuropilinas , NRPl, NRP2 , Factor de crecimiento de placenta, Factor de crecimiento celular endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF = Platelet-derived endothelial cell growth factor) , Factor de crecimiento derivado de plaquetas, en especial PDGF-BB, PDGFR-alfa o PDGFR-beta, Pleyotrofina (PTN) , Progranulina, Proliferina, Factor de crecimiento transformante-alfa, Factor de crecimiento transformante-beta (TGF-beta) , Fctor de necrosis de tumor-alfa (TNF-alfa) , Alkl, CXCR4, Notchl, Notch4, Sema3A, Sema3C, Sema3F, Robo4, etc. Además incluirá factores que promueven angiogénesis , tales como ESMl y Perlecan. También incluirá factores que aceleran el sanado de heridas, tales como hormona de crecimiento, factor de crecimiento tipo insulina I (IGF-I = insulin-like growth factor-I), VIGF, factor de crecimiento epidérmico (EGF = epidermal growth factor), dominio tipo EGF, múltiple 7 (EGFL7), CTGF y miembros de su familia, y TGF-alfa y TGF-beta. Ver, por ej . , Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol . 53:217-39; Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179; Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5 ( 12 ) : 1359-1364 ; Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556 (por ejemplo, la Tabla 1 cita factores angiogénicos conocidos); y Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206.

Un "agente anti angiogénico" , "inhibidor angiogénico" , "agente anti angiogénesis " , o "inhibidor de angiogénesis" se refiere a una sustancia de pequeño peso molecular, un polinucleótido (incluyendo, por ejemplo, un ARN inhibitorio (ARNi o AR si) ) , un polipéptido, una prote na aislada, una proteína recombinante, un anticuerpo, o conjugados o proteínas de fusión de los mismos, que inhiben angiogénesis, vasculogénesis o permeabilidad vascular indeseable, ya sea en forma directa o indirecta. Habrá de entenderse que el agente anti angiogénico incluye aquellos agentes que ligan y bloquean la actividad angiogénica de factor angiogénico o su receptor. Por ejemplo, un agente anti angiogénico es un anticuerpo u otro antagonista a un agente angiogénico como se definió anteriormente, por ejemplo, anticuerpos a VEGF-A o al receptor VEGF-A (por ejemplo, receptor KDR o receptor Flt-1) , inhibidores anti-PDGFR (e.g., Gleevec® (imatinib mesylate) ) , moléculas pequeñas que bloquean la señalización de receptor VEGF (e.g., PTK787/ZK2284, SU6668, SUTENT®/SU11248 (sunitinib malate) , AMG706, o aquellos descritos por ejemplo, en la solicitud de patente internacional WO 2004/113304) . Agentes anti angiogénicos incluyen, pero no están limitados a los siguientes agentes : inhibidores VEGF tales como un antagonista especifico de VEGF, inhibidor EGF, inhibidores EGFR, Erbitux® (cetuximab, ImClone Systems, Inc., Branchburg, N.J.), Vectibix® (panitumumab, Amgen, Thousand Oaks , CA) , inhibidores TIE2 , inhibidores IGF1R, inhibidores COX-II (ciclooxigenasa II) , inhibidores MMP-2 (matriz-metaloproteinasa 2), e inhibidores MMP-9 (matriz-metaloproteinasa 9), CP-547,632 (Pfizer Inc., NY, USA), Axitinib (Pfizer Inc.; AG-013736), ZD-6474 (AstraZeneca) , AEE788 (Novartis) , AZD-2171), VEGF Trap (Regeneron/Aventis ) , Vatalanib (también conocido como PTK-787, ZK-222584: Novartis & Schering A G) , Macugen (pegaptanib octasodio, NX-1838, EYE-001, Pfizer inc . /Gilead/Eyetech) , IM862 (Cytran Inc. of Kirkland, Wash. , USA) ; y angiozyme, una ribozima sintética de Ribozyme (Boulder, Coló.) y Chiron (Emeryville, Calif.) y sus combinaciones. Otros inhibidores de angiogénesis incluyen trombospondinal , trombospondina2 , colágeno IV y colágeno XVIII. Inhibidores VEGF se describen en las patentes de los E.U.A. Nos. 6,534,524 y 6,235,764, ambas de la cuales se incorporan en su totalidad para todos los propósitos. Agentes anti angiogénicos también incluyen inhibidores de angiogénesis nativos, por ejemplo, angiostatina, endostatina, etc. Ver, por ej . , Klagsbrun and D'Amore ( 1991 ) Annu. Rev. Physiol. 53 : 217 -39 ; Streit and Detmar ( 2003 ) Oncogene 22 : 3172 -3179 (por ejemplo, Tabla 3 cita terapia anti angiogénica en melanoma maligno); Ferrara & Alitalo ( 1999 ) Nature Medicine 5 ( 12 ) : 1359 - 1364 ; Tonini et al. ( 2003 ) Oncogene 22 : 6549 - 6556 (por ejemplo, la Tabla 2 cita factores antiangiogénicos conocidos); y, Sato ( 2003 ) Int. J. Clin. Oncol. 8 : 200 -206 (por ejemplo, Tabla 1 cita agentes anti angiogénicos empleados en pruebas clínicas) .

El término "terapia anti angiogénica" se refiere a una terapia útil para inhibir angiogénesis, que comprende la administración de un agente anti angiogénico.

El término "agente citotóxico" como se emplea aquí, se refiere a una sustancia que inhibe o evita la función de células y/o provoca destrucción de las células. El término se pretende que incluya isótopos radioactivos (e.g., I131, I125, Y90 y Re186) , agentes quimioterapéuticos y toxinas tales como toxinas enzimáticamente activas de origen bacteriano, fangal de plantas o animales, o sus fragmentos.

Un "agente quimioterapéutico" es un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen un compuesto químico útil en el tratamiento de cáncer. Ejemplos de agentes quimioterapéuticos incluyen agentes alquilantes tales como tiotepa y CYTOXAN® ciclosfosfamida; alquil sulfonatos tales como busulfan, improsulfan y piposulfan; aziridinas tales como benzodopa, carboquona, meturedopa y uredopa; etileniminas y metilamelaminas incluyendo altretamina, trietilenmelamina, trietilenfosforamida, trietilentiofosforamida y trimetilolomelamina; acetogeninas (en especial bullatacin y bullatacinona) ; una camptotecina (incluyendo el análogo sintético topotecan) ; briostatina; calistatina; CC-1065 (incluyendo sus análogos sintéticos adozelesina, carzelesina y bizelesina) ; criptoficinas (en particular cryptophycin 1 and cryptophycin 8) ; dolastatina; duocarmina (incluyendo los análogos sintéticos, KW-2189 y CBl-TMl) ; eleuterobina; pancratistatina; una sarcodictiina; espongistatina; mostazas de nitrógeno tales como clorambucil, clornafazina, colofosfamida, estramustina, ifosfamida, mecloretamina, óxido hidrocloruro de mecloretamina, melfalan, novembichin, fenesterina, prednimustina, trofosfamida, mostaza de uracilo; nitrosureas tales como carmustina, clorozotocin, fotemustina, lomustina, nimustina y ranimnustina; antibióticos tales como los antibióticos de enediina (por ejemplo, calicheamicina, en especial calicheamicina gammall y calicheamicina omegall (ver, por ej . , Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33: 183-186 (1994)); dinemicina, incluyendo dinemicina A; bisfosfonatos , tales como clodronato; una esperamicina; así como neocarzinostatina cromóforo y cromoforos antibióticos de enediina cromoproteína relacionados), aclacinomisinas , actinomicina, autramicina, azaserina, bleomicinas, cactinomicina, carabicina, carminomicina, carzinofilina, cromomicinis , dactinomicina, daunorubicina, detorubicina, . 6-diazo-5-oxo-L-norleucina, ADRIAMYCIN® doxorubicin (incluyendo morfolino-doxorubicina, cianomorfolino-doxorubicina, 2-pirrolino-doxorubicina y deoxidoxorubicina) , epirubicina, esorubicina, idarubicina, marcelomicina, mitomicinas tales como mitomicina C, ácido micofenólico , nogalamicina, olivomicinas , peplomicina, potfiromicina, puromicina, quelamicina, rodorubicina, estreptonigrina, estreptozocina, tubercidina, ubenimex, zinostatina, zorubicina; anti-metabolitos tales como metotrexato y 5-fluorouracilo (5-FU) ; análogos de ácido fólico tales como denopterina, metotrexato, pteropterina, trimetrexato; análogos purina tales como fludarabina, 6-mercaptopurina, tiamiprina, tioguanina; análogos pirimidina tales como ancitabina, azacitidina, 6-azauridina, carmofur, citarabina, dideoxiuridina, doxifluridina, enocitabina, floxuridina; andrógenos tales como calusterona, dromostanolona propionato, epitiostanol, mepitiostano, testolactona; anti-adrenales tales como aminoglutetimida, mitotano, trilostano; reabastecedor de ácido fólico tal como ácido frolínico; aceglatona; aldofosfamida glicósido; ácido aminolevulínico; eniluracil; amsacrina; bestrabucil ; bisantreno; edatraxato; defofamina; demecolcina; diaziquona; elfornitina; acetato de eliptinio; una epotilona;' etoglúcido; nitrato de galio; hidroxiurea; lentinano; lonidainina; maytansinoides tales como maytansina y ansamitocinas ; mitoguazona; mitoxantrona; mopidanmol; nitraerina; pentostatina; phenamet; pirarubicin; losoxantrona; ácido podofilínico ; 2-etilhidrazida; procarbazina; complejo polisacárido PSK® (JHS Natural Products, Eugene, OR) ; razoxana; rizoxina; sizofirano; espirogermanio ; ácido tenuazónico; triaziquona; 2 , 2 ' , 2 " -triclorotrietilamina; tricotecenos (en especial toxina T-2, verracurina A, roridina A y anguidina) ; uretano; vindesina; dacarbazina; mannomustina; mitobronitol ; mitolactol; pipobroman; gacitosina; arabinosido ("Ara-C"); ciclofosfamida; tiotepa; taxoides, por ejemplo, TAXOL® paclitaxel (Bristol- yers Squibb Oncology, Princeton, N.J.), , formulación de nanopartículas de ingeniería de albúmina libre de Cremofor de paclitaxel ABRAXANE™ (American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois), y TAXOTERE® doxetaxel (Rhóne- Poulenc Rorer, Antony, Francia); cloranbucil; GEMZAR® gemcitabina; 6-tioguanina; mercaptopurina; metotrexato; análogos de platino tales como cisplatina y carboplatina; vinblastina; platino; etopósido (VP-16); ifosfamida; mitoxantrona; vincristina; NAVELBINE® vinorelbina; novantrona; teniposido; edatrexato; daunomicina; aminopterina ; xeloda; ibandronato; irinotecan (Camptosar, CPT-11) (incluyendo el régimen de tratamiento de irinotecan con 5-FU y leucovorina) ; inhibidor de topoisomerasa RFS 2000; difluorometilornitina (DMFO) ; retinoides tales como ácido retinoico; capecitabina; combretastatina; leucovorina (LV) ; oxaliplatina, incluyendo el régimen de tratamiento oxaliplatina (FOLFOX) ; inhibidores de PKC-alfa, Raf, H-Ras, EGFR (e.g., erlotinib (Tarceva™) ) y VEGF-A que reduce proliferación celular y las sales ácidos o derivados farmacéuticos aceptables , de cualquiera de los anteriores.

También se incluye en esta definición agentes antihormonales que actúan para regular o inhibir acción hormonal en tumores tales como anti-estrógenos y moduladores de receptor de estrógenos selectivos (SERMs = selective estrogen receptor modulators) , incluyendo por ejemplo, tamoxifen (incluyendo NOLVADEX® tamoxifen) , raloxifene, droloxifene, 4-hidroxitamoxifen, trioxifene, keoxifene, LY117018, onapristone, y FARESTON· toremifene; inhibidores de aromatasa que inhiben la enzima aromatasa, que regula la producción de estrógeno en las glándulas adrenales, tales como, por ejemplo, 4 (5) -imidazoles, aminoglutetimida, MEGASE® megestrol acetato, AROMASIN® exemestano, formestanie, fadrozol, RIVISOR® vorozol, FEMARA® letrozol, y ARIMIDEX® anastrozol; y anti-andrógenos tales como flutamida, nilutamida, bicalutamida, leuprolida y goserelina; asi como troxacitabina (un análogo de 1 , 3-dioxolano nucleósido citosina) ; oligonucleótidos antisentido, particularmente aquellos que inhiben la expresión de genes en rutas de señalización implicadas en proliferación de células aberrantes, tales como por ejemplo, PKC-alfa, Raf y H-Ras; ribozimas tales como inhibidor de expresión VEGF (por ejemplo, ribozima A GIOZYME®) y un inhibidor de expresión HER2 ; vacunas tales como vacunas de terapia de genes, por ejemplo, vacuna ALLOVECTIN®, vacuna LEUVECTIN® y vacuna VAXID®; PROLEU IN® rIL-2; inhibidor de topoisomerasa 1 LURTOTECAN®; ABARELIX® rmRH; Vinorelbine y Esperamicinas (ver patente de los E.U.A. Número 4,675,187), y sus sales, ácidos o derivados farmacéuticos aceptables, de cualquiera de los anteriores.

Por "terapia de radiación" se entiende el uso de rayos gamma o rayos beta directos para inducir suficiente daño a una células para limitar su capacidad para funcionar normalmente o para destruir por completo la célula. Se apreciara que habrá muchas formas conocidas en la técnica para determinar la dosis y duración de tratamiento. Tratamientos típicos se dan como administración de una vez e intervalos de dosis típicos de 10 a 200 unidades (Grays) por día.

"Reducir o inhibir" es disminuir o reducir una actividad, función, y/o cantidad en comparación con una referencia. Por "reducir o inhibir" se entiende la capacidad por provocar una disminución total de preferencia de 20% o mayor, más preferiblemente de 50% o mayor, y más preferiblemente de 75%, 85%, 90%, 95% o mayor. Reducir o inhibir puede referirse a los síntomas del desorden tratado, la presencia o tamaño de metástasis, el tamaño del tumor primario o el tamaño o número de vasos sanguíneos en desordenes angiogénicos .

El término "diagnosis o diagnóstico" se emplea aguí para referirse a la identificación de un estado patológico o molecular, de enfermedad o condición, tal como la identificación del cáncer o referirse a identificación de un paciente de cáncer quien puede beneficiarse de un régimen de tratamiento particular. El término "pronóstico" se emplea aquí para referirse a la predicción de la probabilidad de beneficio clínico de terapia anti-cáncer. El término "predicción" se emplea aquí para referirse a la probabilidad de que un paciente responderá ya en forma favorable o desfavorable a una terapia anti-cáncer particular. En una modalidad, la predicción se refiere a la extensión de estas respuestas. En una modalidad, la predicción se refiere a si y/o la probabilidad de que un paciente sobreviva o mejore después de tratamiento, por ejemplo tratamiento con un agente terapéutico particular, y por un periodo de tiempo determinado sin recurrencia a la enfermedad. Los métodos predictivos de la invención pueden emplearse clínicamente para tomar decisiones de tratamiento al seleccionar las modalidades de tratamiento más apropiadas para cualquier paciente particular. Los métodos predictivos de la presente invención son herramientas valiosas para pronosticar si un paciente probablemente responderá en forma favorable a un régimen de tratamiento, tal como un régimen de tratamiento dado, incluyendo por ejemplo, administración de un agente terapéutico determinado o combinación, intervención quirúrgica, tratamiento de esteroides, etc., o si es probable una supervivencia a largo plazo del paciente, después de un régimen de tratamiento.

"Respuesta de paciente" puede estimarse utilizando cualquier punto extremo indicado un beneficia al paciente, incluyendo, sin limitación, (1) inhibición, en cierta medida, de avance de la enfermedad, incluyendo frenado y paro completo; (2) reducción en tamaño de lesión; (3) inhibición (es decir, reducción, frenado o paro completo) de la infiltración de las células enfermas en órganos y/o tejidos periféricos adyacentes; (4) inhibición (es decir reducción, frenado o paro completo) de diseminación de la enfermedad; (5) alivio, en cierta medida, de uno o más síntomas asociados con el desorden,- (6) incrementar en duración la presentación libre de enfermedad después de tratamiento; y/o (8) disminuir la mortalidad en un punto determinado de tiempo después de tratamiento.

El término "supervivencia a largo plazo" se emplea aquí para referirse a supervivencia por al menos 1 año, 5 años, 8 años, o 10 años después de tratamiento terapéutico.

El término "beneficio" se emplea en el sentido más amplio y se refiere a cualquier efecto deseable e incluye específicamente el beneficio clínico como se define aquí.

Beneficio clínico puede medirse al estimar diversos punto extremos, por ejemplo, inhibición, en cierta medida, del avance de la enfermedad, incluyendo frenado y paro completo; reducción en el número de episodios y/o síntomas de enfermedad; reducción en tamaño de lesión; inhibición (es decir, reducción, frenado o paro completo) de infiltración de células enfermas en órganos y/o tejidos periféricos adyacentes; inhibición (es decir reducción, frenado o paro completo) de diseminación de la enfermedad; disminución de respuesta auto-inmune, que puede pero no tiene que, resultar en la regresión o ablación de la lesión de la enfermedad; alivio, en cierta medida, de uno o más síntomas asociados con el desorden; incremento en la duración de la presentación libre de enfermedades por el tratamiento, por ejemplo supervivencia libre de progresión; supervivencia total incrementada; superior velocidad de respuesta; y/o mortalidad disminuida en un punto dado en tiempo después del tratamiento .

II. Métodos de la Invención La presente invención se basa parcialmente en la identificación de biomarcadores específicos que se correlacionan con reducido beneficio clínico de terapia anti angiogénica para el tratamiento de cáncer. De esta manera, los métodos y ensayos descritos proporcionan medios convenientes, eficientes y potencialmente efectivos en costo para obtener datos e información útiles para estimar terapias apropiadas o efectivas para el tratamiento de pacientes de cáncer. Por ejemplo, un paciente de cáncer puede tener una biopsia realizada para obtener una muestra de tejido o celular, o una muestra de plasma puede · obtenerse del paciente, y la muestra puede examinarse por diversos ensayos in vitro para determinar si la expresión de PIGF se aumenta en comparación con una muestra de referencia o control. Si una meta en expresión se detecta el paciente probablemente se beneficiará de la terapia anti-cáncer diferente a o además de de la terapia anti angiogénica. De esta manera, la invención proporciona un método para identificar un paciente de cáncer que puede beneficiarse de terapia anti-cáncer diferente de o además de terapia anti angiogénica, que comprende la etapa de detectar el nivel de expresión de factor de crecimiento placentario (PIGF) en una muestra que se obtiene del paciente en donde expresión incrementada de PIGF en la muestra en comparación con una muestra de referencia indica que el paciente puede beneficiarse de terapia anti-cáncer diferente a o además de terapia anti angiogénica. En algunas modalidades, la muestra se obtiene del paciente antes de inicio de tratamiento de cáncer, en donde la muestra tiene un nivel de expresión de PIGF mayor a 28 pg/ml. En algunas modalidades, la muestra se obtiene de un paciente que actualmente se somete a terapia anti angiogénica, en donde la muestra tiene un nivel de expresión PIGF mayor a 50 pg/ml. En algunas modalidades, las muestras son muestras de plasma.

La invención además proporciona un método para pronosticar respuesta de paciente de cáncer a terapia anti angiogénica que comprende determinar el nivel de expresión de PIGF en una muestra que se obtiene del paciente en donde los niveles de expresión incrementados de PIGF en comparación con una muestra de referencia, indican que el paciente es menos probable responda a terapia anti angiogénica sola. En algunas modalidades, la muestra se obtiene del paciente antes de inicio de tratamiento de cáncer, en donde la muestra tiene un nivel de expresión PIGF mayor a 28 pg/ml. En algunas modalidades, la muestra se obtiene de un paciente que actualmente se somete a terapia anti angiogénica, en donde la muestra tiene un nivel de expresión PIGF mayor a 50 pg/ml. En algunas modalidades, las muestras son muestras de plasma. También se proporciona un método para tratar a un paciente con cáncer que comprende administrar al paciente terapia anti-cáncer diferente a o además de terapia anti angiogénica, en donde una muestra obtenida del paciente muestra niveles de expresión incrementados de PIGF en comparación con una muestra de referencia.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para optimizar la eficacia terapéutica para el tratamiento de cáncer, que comprende determinar el nivel de expresión de PIGF en una muestra que se obtiene del paciente, en donde incrementados niveles de expresión de PIGF en comparación con una muestra de referencia indican que el paciente es menos probable que responda solo a la terapia anti angiogénica. La muestra puede obtenerse del paciente antes del inicio del tratamiento. La muestra puede obtenerse del paciente después del inicio del tratamiento. En una modalidad, la muestra tiene un nivel de expresión PIGF menor que o igual a 28 pg/ml. En algunas modalidades, la muestra puede obtenerse de un paciente que actualmente se trata con terapia anti angiogénica. En una modalidad, la muestra tiene un nivel de expresión PIGF menor que o igual a 50 pg/ml. En algunas modalidades, la terapia anti angiogénica comprende administración de un antagonista VEGF tal como, por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF, por ejemplo, bevacizumab.

En otro aspecto, la invención proporciona un método para tratar un paciente de cáncer que comprende administrar al paciente una terapia anti angiogénica, en donde una muestra obtenida del paciente muestra .bajos niveles de expresión de PIGF en comparación con una muestra de referencia. La muestra puede obtenerse del paciente antes de inicio del tratamiento. En una modalidad, la muestra tiene un nivel de expresión PIGF menor que o igual a 28 pg/ml. En algunas modalidades, la muestra puede obtenerse de un paciente que actualmente se trata con terapia anti angiogénica. En una modalidad, la muestra tiene un nivel de expresión PIGF menor a o igual a 50 pg/ml. En algunas modalidades, la terapia anti angiogénica comprende administración de un antagonista VEGF tal como, por ejemplo un anticuerpo anti-VEGF, por ejemplo, bevacizumab.

Los métodos de la invención involucran pacientes con cáncer. El cáncer puede ser, por ejemplo carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y/o leucemia. Más particularmente ejemplos de estos canceres incluyen cáncer de células escamosas, cáncer pulmonar (incluyendo cáncer pulmonar de células pequeñas, cáncer pulmonar de células mas pequeñas, adenocarcinoma de pulmón, y carcinoma escamoso del pulmón) , cáncer del peritoneo, cáncer hepatocelular, cáncer gástrico o estomacal (incluyendo cáncer gastrointestinal) , cáncer pancreático, glioblástoma, cáncer cervical, cáncer de ovarios, cáncer de hígado, cáncer de vejiga, hepatoma, cáncer de mama, cáncer de colon, cáncer colorectal, carcinoma endometrial o uterino, carcinoma de glándulas salivares, cáncer de riñon o renal, cáncer de hígado, cáncer de próstata, cáncer vulvar, cáncer de tiroides, carcinoma hepático y diversos tipos de cáncer cara y cuello, así como linforna de células B (incluyendo linforna no Hodgkin folicular/bajo grado (NHL); NHL linfocitico pequeño (SL = small lymphocytic) ; NHL folicular/grado intermedio; NHL difuso grado intermedio; NHL inmunoblástico de alto grado; NHL linfoblástico de alto grado; NHL de células no escindidas pequeñas de alto grado; NHL de enfermedad voluminosa o de afectación masiva; linfoma de células de manto; linforna relacionado a SIDA; y Macroglobulinemia Waldenstrom) ; leucemia linfocitica crónica (CLL = chronic lymphocytic leukemia) ; leucemia linfoblastica aguda (ALL = acute lymphoblastic leukemia); leucemia de células pilosas; leucemia mieloblastica crónica; y desorden linfoproliferativo post-transplante (PTLD = post-transplant lymphoproliferative disorder) , así como proliferación vascular anormal asociada con facomatosis, edema (tal como el asociado con tumores del cerebro) o síndrome de Meigs . En una modalidad, el cáncer es carcinoma de células renales.

Una muestra que comprende un biomarcador objetivo puede obtenerse por métodos bien conocidos en la técnica, y que son apropiados para el tipo y ubicación particular del cáncer de interés. Biopsia de tejido a menudo se emplea para obtener una parte representativa de tejido canceroso. En forma alterna, pueden obtenerse células indirectamente en la forma de tejidos /fluidos que se conocen o se consideran que contienen las células de cáncer de interés. Por ejemplo, muestras de lesiones cancerosas pueden obtenerse por resección, broncoscopía, aspiración de aguja fina, cepillados bronquiales o de esputo, fluido pleural o sangre. Genes o productos de genes pueden detectarse de cáncer o tejido de tumor o de otras muestras del cuerpo tales como orina, esputo, suero o plasma. Las mismas técnicas anteriormente discutidas para detección de genes objetivo o productos de genes en muestras cancerosas pueden aplicarse a otras muestras de cuerpo. Células de cáncer pueden ser desprendidas de lesiones de cáncer y aparecer en estas muestras del cuerpo. Al cribar estas muestras corporales, un diagnóstico temprano simple puede lograrse para estos cánceres. Además, el avance de terapia puede supervisarse más fácilmente al probar estas muestras del cuerpo para genes objetivo o productos de genes.

Medios para enriquecer una preparación de tejido para células de cáncer se conocen en la técnica. Por ejemplo, el tejido puede aislarse de parafina o secciones de criostato. Células de cáncer también pueden separarse de células normales por citometría de flujo o microdisección de captura de láser . Estas así como otras técnicas para separar células cancerosas de normales, son bien conocidas en la especialidad. Si el tejido de cáncer esta altamente contaminado con células normales, la detección de gen de firma o perfil de expresión de prote na puede ser más difícil, aunque se conocen técnicas para reducir al mínimo contaminación y/o resultados falsos positivos/negativos, algunos de los cuales se describen a continuación. Por ejemplo, una muestra también puede estimarse por la presencia de un biomarcador que se conoce esta asociado con una célula de cáncer de interés, pero no una célula normal correspondiente o vise versa.

En los métodos de la invención, se obtiene y examina una muestra de células o de tejido de mamífero para expresión de uno o más biomarcadores (por ejemplo, PIGF) . Expresión de diversos biomarcadores en una muestra puede analizarse por una cantidad de metodologías, muchas de las cuales se conocen en la especialidad y se comprenden por la persona con destreza, incluyendo pero no limitadas ¦ a, análisis inmunohistoquímico y/o de transferencia Western, inmunoprecipitación, ensayos de enlace molecular, ELISA, ELIFA, clasificación de células fluorescentes activadas (FACS = fluorescence activated cell sorting) y semejantes, ensayos basados en sangre cuantitativos (por ejemplo ELISA de Suero) (para examinar por ejemplo, niveles de expresión de proteína) , ensayos de actividad enzimática bioquímica, hibridización in situ, análisis Northern y/o análisis PCR de AR ms, así como cualquiera de la amplia variedad de ensayos que pueden realizarse por análisis de matriz de tejido y/o de genes . Protocolos típicos para evaluar el estado de genes y productos de genes se encuentra por ejemplo en Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology, Units 2 (Northern Blotting) , 4 (Southern Blotting) , 15 (Immunoblotting) y 18 (PCR Análisis) . Inmuno ensayos multiplejados tales como aquellos disponibles de Rules Based Medicine o Meso Scale Discovery (MSD) también pueden emplearse .

En algunas modalidades de la invención, la expresión de proteínas objetivo en una muestra se examina utilizando protocolos de tensión e inmunohistoquímica . La tensión inmunohistoquímica de secciones de tejido se ha mostrado que es un método confiable para estimar o detectar la presencia de proteínas en una muestra. Técnicas de inmunohistoquímica ("IHC") utilizan un anticuerpo para sondear y visualizar antígenos celulares in situ, generalmente por métodos cromogénicos o fluorescentes .

Para preparación de muestra, una muestra de tejido o celular de un mamífero (típicamente un paciente humano) puede emplearse. Ejemplos de muestras incluyen pero no están limitados a, biopsia de tejido, sangre, aspirado pulmonar, esputo, fluido linfático, plasma, etc. La muestra puede obtenerse por una variedad de procedimientos conocidos en la técnica incluyendo, pero no limitados a escisión o corte quirúrgico, aspiración o biopsia. El tejido puede ser fresco o congelado. En una modalidad, la muestra se tiza e incrusta en parafina o semejantes.

La muestra de te ido puede fijarse (es decir conservarse) por metodología convencional (Ver por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology" , 3era edición (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston División McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology y Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.). Una persona con destreza en la técnica apreciará que la selección de un fijador se determina por el propósito para el cual la muestra se va a teñir histológicamente o de otra forma analizar. Una persona con destreza en la especialidad también apreciará que la duración del fijado depende del tamaño de la muestra de tejido y el fijador empleado. A manera de ejemplo, formalina amortiguada neutral, Bouin o paraformaldehído, pueden emplearse para fijar una muestra.

En General, la muestra primero se fija y después deshidrata a través de una serie ascendente de alcoholes, infiltra e incrusta con parafina u otro medio de seccionamiento, de manera tal que la muestra de tejido puede ser seccionada. En forma alterna, se puede seccionar el tejido y fijar las secciones obtenidas. A manera de ejemplo, la muestra de tejido puede incrustarse y procesarse en parafina por metodología convencional (Ver por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology" , supra) . Ejemplos de parafina que pueden emplearse incluyen, pero no están limitados a, Paraplast, Broloid, y Tissuemay. Una vez que la muestra de tejido se incrusta, la muestra puede seccionarse por un microtomo o semejante (Ver por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", supra). A manera de ejemplo para este procedimiento las secciones pueden estar en el intervalo desde aproximadamente tres mieras a aproximadamente cinco miera en espesor. Una vez seccionadas, las secciones pueden conectarse a porta objetos por varios métodos estándar. Ejemplos de adhesivos de porta objetos incluyen pero no están limitado a, silano, gelatina poli-L-lisina y semejantes. A manera de ejemplo, las secciones incrustas con parafina pueden conectarse a porta objetos cargados positivamente y/o porta objetos revestidos con poli-L-lisina.

Si la parafina se ha empleado como el material de incrustación, las secciones de tejido en general son desparafinadas y rehidratadas en agua. Las secciones de tejido pueden ser desparafinadas por varias metodologías estándar convencionales. Por ejemplo, xilenos y una serie gradualmente descendente de alcoholes pueden emplearse (Ver por ejemplo, "Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology" , supra) . En forma alterna, agentes no orgánicos desparafinantes comercialmente disponibles tales como Hemo-De7 (CMS, Houston, Texas) pueden emplearse.

Opcionalmente, subsecuente a la preparación de muestra puede analizarse, una sección de tejido utilizando IHC. IHC puede realizarse en combinación con técnicas adicionales tales como tensión morfológica y/o hibridización in-situ de fluorescencia. Dos métodos generales de IHC están disponibles; ensayos directos e indirectos. De acuerdo con el primer ensayo, el enlace de anticuerpo al antigeno objetivo se determina directamente. Este ensayo directo utiliza un reactivo de etiquetado, tal como una etiqueta fluorescente o un anticuerpo primario etiquetado con enzima, que puede ser visualizado sin mayor interacción de anticuerpo. En un ensayo indirecto típico, anticuerpo primario no conjugado liga al antígeno y después un anticuerpo secundario etiquetado liga al anticuerpo primario. Cuando el anticuerpo secundario se conjuga con una etiqueta enzimática, un substrato cromogénico o fluorogénico se agrega para proporcionar visualización del antígeno. Ocurre amplificación de señal debido a que varios anticuerpos secundarios pueden reaccionar con diferentes epítopos en el anticuerpo primario.

El anticuerpo primario y/o secundario empleado para inmunohistoquímica típicamente, se etiquetará con una porción detectable. Numerosas etiquetas están disponibles que pueden en general agruparse en las siguientes categorías: (a) Radioisótopos, tales como 35S, 14C, 125I, 3H, y 131I . El anticuerpo puede etiquetarse con el radioisótopo utilizando las técnicas descritas en Current Protocolos in Inmunology, Volumes 1 y 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs . (1991) por ejemplo y La radioactividad puede medirse utilizando conteo de centelleo . (b) Partículas de oro coloidal. (c) Etiquetas fluorescentes, incluyendo paro no limitadas a, quelatos de tierras raras (quelatos de europio) , Rojo Texas, rodamina, fluoresceína, dansil, Lisamina, umbeliferona ficoeriterina, ficocianina o fluoróforos comercialmente disponibles tales como SPECTRUM ORANGE7 y SPECTRUM GREEN7 y/o derivados de cualquier uno o más de los anteriores. Las etiquetas fluorescentes pueden conjugarse al anticuerpo utilizando las técnicas descritas en Current Protocolos in Inmunology, supra, por ejemplo. Fluorescencia puede cuantificarse utilizando un fluorímetro. (d) Diversas etiquetas de enzima-substrato están disponibles y la Patente de los E.U.A. Número 4,275,149 proporciona una revisión de algunas de ellas. La enzima en general cataliza una alteración química del substrato cromogénico que puede medirse utilizando varias técnicas. Por ejemplo, la enzima puede catalizar un cambio de color en un substrato, que puede ser medido espectrofotométricamente . En forma alterna, la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del substrato. Técnicas para cuantificar un cambio en fluorescencia se describieron anteriormente. El substrato quimioluminiscente se vuelve electrónicamente excitado por una reacción química y puede entonces emitir luz que puede medirse (utilizando un quimioluminómetro, por ejemplo) o dona energía a un aceptor fluorescente. Ejemplos de etiquetas enzimáticas incluyen luciferasas por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; La patente de los E.U.A. Número 4,737,456), luciferina, 2,3-dihidroftalazindionas , malato dehidrógenasa, ureasa, peroxidasa tal como peroxidasa de rábano picante (HRPO) , fosfatasa alcalina, ß-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa, y glucosa-6-fosfato dehidrógenasa) , oxidasas heterocíclicas (tal como uricasa y xantina oxidasa) , lactoperoxidasa, microperoxidasa, y semejantes. Técnicas para conjugar enzimas a anticuerpos se describe en O'Sullivan et al. , Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods ín Enzym. (ed. J. Langone & H. Van Vunakis) , Academic press, New York, 73:147-166 (1981) .

Ejemplos de combinaciones de enzima-substrato incluyen, por ejemplo: (i) Peroxidasa de rábano picante (HRPO) con peroxidasa de hidrógeno como un substrato, en donde la peroxidasa de hidrógeno oxida a un precursor colorante (por ejemplo, ortofenileno diamina (OPD) o hidrocloruro de 3, 3 ' , 5, 5 ' -tetrametil benzidina (TMB) ) ; (ii) fosfatasa alcalina (AP) con para-Nitrofenil fosfato como substrato cromogénico ; y (iii) ß-D-galactosidasa (ß-D-Gal) con un substrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil-ß-?-galactosidasa) o substrato fluorogénico (por ejemplo, 4-metilumbelliferil-p-D-galactosidasa) .

Numerosas otras combinaciones de enzima-substrato están disponibles para aquellos con destreza en la técnica. Para una revisión general de las mismas, ver las Patentes de los E.U.A. Números 4,275,149 y 4,318,980. En ocasiones, la etiqueta se conjuga indirectamente con el anticuerpo. La persona con destreza estará al tanto de diversas técnicas para lograr esto. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de las cuatro amplias categorías de etiquetas mencionadas anteriormente pueden conjugarse con avidina, o vice versa. La biotina liga selectivamente con avidina y de esta manera, la etiqueta puede conjugarse con el anticuerpo en esta forma indirecta. De manera alterna, para lograr conjugación indirecta de la etiqueta con el anticuerpo, el anticuerpo se conjuga con un pequeño hapteno y uno de los diferentes tipos de etiquetas anteriormente mencionados se conjuga con anticuerpo anti-hapteno . De esta manera, conjugación indirecta de la etiqueta con el anticuerpo puede lograrse.

Además de los procedimientos de preparación de muestra discutido anteriormente, adicional tratamiento de la sección de tejido antes de, durante o después de IHC puede ser deseado. Por ejemplo, métodos de recuperación de epítopo, tales como calentar la muestra de tejido en amortiguador citrato pueden llevarse a cabo (ver, por ejemplo, Leong et al. Appl. Inmunohistochem. 4(3):201 (1996)).

Después de una etapa de bloqueo opcional, la sección de tejido se expone anticuerpo primario por un periodo de tiempo suficiente y bajo condiciones convenientes de manera tal que el anticuerpo primario liga al antígeno de la proteína objetivo en la muestra de tejido. Condiciones apropiadas para lograr esto pueden determinarse por experimentación rutinaria. La extensión de enlace de anticuerpo a la muestra se determina utilizando cualquiera de las etiquetas detectables anteriormente discutidas. De preferencia, la etiqueta es una etiqueta enzimática (por ejemplo HRPO) que cataliza una alteración química del substrato cromogénico tal como cromógeno 3 , 3 ' -diaminobenzidina. De preferencia la etiqueta enzimática se conjuga con anticuerpo que liga específicamente al anticuerpo primario (por ejemplo el anticuerpo primario es anticuerpo policlonal de conejo y el anticuerpo secundario es anticuerpo cabra anti-conejo) . Especímenes de esta manera preparados pueden montarse y cubrirse con cubre objetos. La evaluación de porta objetos después de determinar, por ejemplo utilizando un microscopio, y criterio de intensidad de tinción, empleados rutinariamente en la especialidad, pueden ser empleados .

En métodos alternos, la muestra puede ponerse en contacto con un anticuerpo específico para el biomarcador bajo condiciones suficientes para que se forme un complejo anticuerpo-biomarcador, y después detectar el complejo. La presencia del biomarcador puede detectarse en una cantidad de formas tales como por transferencia Western y procedimientos ELISA para ensayar una amplia variedad de tejidos y muestras, incluyendo plasma o suero. Un amplio intervalo de técnicas de inmunoensayo que utilizan dicho formato ensayo están disponibles, ver por ejemplo, las patentes de los E.U.A. Números 4 , 016 , 043 , 4 , 424 , 279 y 4 , 018 , 653 . Estas incluyen tanto ensayos de una solo sitio y dos-sitios o "emparedados" de los tipos no competitivos, así como los ensayos de enlace competitivo tradicional. Estos ensayos también incluyen enlace directo de un anticuerpo etiquetado con un biomarcador objetivo.

Ensayos empardados son los ensayos más útiles y comúnmente empleados . Una cantidad de variaciones de la técnica de ensayo emparedado existen, y todos se pretenden abarcadas por la presente invención. Brevemente, en un ensayo directo atipico, un anticuerpo no etiquetado se inmoviliza en un substrato sólido, y la muestra a probarse se pone en contacto con la molécula ligada. Después de un periodo de incubación conveniente, por un periodo de tiempo suficiente para permitir formación de un complejo anticuerpo-antígeno, un segundo anticuerpo específico al antígeno, etiquetado con una molécula reportera capaz de producir una señal detectable después se agrega e incuba, permitiendo tiempo suficiente para la formación de otro complejo de anticuerpo-etiquetado anticuerpo-antígeno . Cualquier material sin reaccionar es lavado por arrastre, y la presencia del antígeno se determina por observación de una señal que se produce por la molécula reportera. Los resultados ya pueden ser cualitativos, por simple observación de la señal visible, o pueden cuantificarse al comparar con una muestra de control que contiene cantidades conocidas de biomarcador .

Variaciones en el ensayo directo incluyen un ensayo simultáneo, en donde tanto la muestra como el anticuerpo etiquetado se agregan simultáneamente al anticuerpo ligado. Estas técnicas son bien conocidas por aquellos con destreza en la especialidad, incluyendo cualesquiera variaciones menores como será fácilmente aparente. En un ensayo emparedado directo típico, un primer anticuerpo que tiene especificidad para el biomarcador ya se liga en forma covalente o pasiva a una superficie sólida. La superficie sólida típicamente es vidrio o un polímero, los polímeros más comúnmente empleados son celulosa, poliacrilamida, nylon, poliestireno , cloruro de polivinilo o polipropileno. Los soportes sólidos pueden estar en la forma de tubos, perlas, discos de microplacas o cualquier otra superficie adecuada para conducir un inmunoensayo . Los procesos de enlace son bien conocidos en la técnica y en general consisten de entrelazamiento, enlace covalente o adsorción física, el complejo polímero-anticuerpo se lava en preparación para la muestra de prueba. Una alícuota de la muestra a probar después se agrega al complejo de fase sólida e incuba por un periodo de tiempo suficiente (por ejemplo 2-40 minutos o durante la noche si es más conveniente) y bajo condiciones convenientes (por ejemplo desde temperatura ambiente a 40 grados C tal como entre 25 grados C y 32 grados C inclusive) para permitir enlace de cualquier subunidad presente en el anticuerpo. Después del periodo de incubación, la fase sólida de la subunidad de anticuerpo se lava y seca e incuba con un segundo anticuerpo específico para una porción del biomarcador . El segundo anticuerpo se liga a una molécula reportera que se utiliza para indicar el enlace del segundo anticuerpo al marcado molecular.

Un método alterno involucra inmovilizar los biomarcadores objetivo en la muestra y después exponer el objetivo inmovilizado a anticuerpo específico que puede o no ser etiquetado con una molécula reportera. Dependiendo de la cantidad del objetivo y la fuerza de la señal de la molécula reportera, un objetivo ligado puede ser detectable por etiquetado directo con el anticuerpo. En forma alterna, un segundo anticuerpo etiquetado, específico para el primer anticuerpo se expone al complejo ob etivo-primer anticuerpo para formar un complejo terciario objetivo-primer anticuerpo-segundo anticuerpo. El complejo se detecta por la señal emitida por la molécula reportera. Por "molécula reportera", como se emplea en la presente especificación, se entiende una molécula que por su naturaleza química, proporciona una señal analíticamente identificable que permite la detección de anticuerpo ligado con antígeno. Las moléculas reporteras más comúnmente empleadas en este tipo de ensayo ya son enzimas, fluoróforos o moléculas que contienen radionúclido (es decir radioisótopos) y moléculas quimioluminiscentes .

En el caso de un inmunoensayo enzimático, una enzima se conjuga con el segundo anticuerpo, generalmente mediante glutaraldehído o peryodato. Como se reconocerá fácilmente, sin embargo existe una amplia variedad de diferentes técnicas de conjugación, que están fácilmente disponibles a la persona con destreza. Enzimas comúnmente empleadas incluyen peroxidasa de rábano picante, glucosa oxidasa, galactosidasa y fosfatasa alcalina, entre otras. Los substratos a utilizarse con las enzimas específicas en general se seleccionan para la producción, ante hidrólisis, por la enzima correspondiente, de un cambio de color detectable. Ejemplos de enzimas convenientes incluyen fosfatasa alcalina y peroxidasa. También es posible emplear substratos fluorogénicos, que dan por resultado un producto fluorescente en vez de los substratos cromogénicos anotados anteriormente. En todos los casos, el anticuerpo etiquetado con enzima se agrega al primer complejo marcador molecular-anticuerpo, permitido para ligar, y después el exceso de reactivo se lava por arrastre. Una solución que contiene el substrato apropiado después se agrega al complejo de anticuerpo-antígeno-anticuerpo . El substrato reaccionará con la enzima enlazada al segundo anticuerpo, dando una señal visual cualitativa, que puede ser además cuantificada, usualmente en forma espectrofotométrica, para dar una indicación de la cantidad de biomarcador que estaba presente en la muestra. En forma alterna, compuestos fluorescentes, tales como fluoresceína y rodamina, pueden acoplarse químicamente a anticuerpos sin alterar su capacidad de enlace. Cuando se activan por iluminación con luz de una longitud de onda particular, el anticuerpo etiquetado con fluorócromo adsorbe la energía de luz, induciendo un estado a excitabilidad, en la molécula, seguido por emisión de la luz a un color característico visualmente detectable con un microscopio de luz. Como en EIA, el anticuerpo etiquetado fluorescente se deja que ligue al primer complejo marcador molecular-anticuerpo . Después de lavar por arrastre, el reactivo sin ligar, el complejo terciario restante después se expone a la luz de la longitud de onda apropiada, la fluorescencia observada indica la presencia del marcador molecular de interés. Técnicas de EIA e inmunofluorescencia ambas están muy bien establecidas en la especialidad. Sin embargo, también pueden emplearse otras moléculas reporteras, tales como radioisótopo, moléculas quimioluminiscentes o bioluminiscentes .

Se contempla que las técnicas anteriormente descritas también pueden emplearse para detectar expresión de P1GF .

Métodos de la invención además incluyen protocolos que examinan la presencia y/o expresión de niveles de P1GF mR A en una muestra de tejido, celular o de plasma. Métodos para la evaluación de mRNAs en células son bien conocidos e incluyen, por ejemplo ensayos de hibridización que utilizan sondas de ADN complementarias (tales como hibridización in situ utilizando ribosondas etiquetadas específicas para PlGF, transferencia Northern y técnicas relacionadas) y diversos ensayos de amplificación de ácido nucleico (tales como RT-PCR utilizando cebadores complementarios específicos para PlGF, y otros métodos de' detección tipo amplificación, tales como por ejemplo, ADN ramificado, SISBA, TMA y semejantes) .

Muestras de tejido celulares o de plasma de mamíferos pueden ensayarse convenientemente para mRNAs utilizando análisis Northern, transferencia de puntos o PCR. Por ejemplo, ensayos RT-PCR tales como ensayos PCR cuantitativos son bien conocidos en la especialidad. En una modalidad ilustrativa de la invención, un método para detectar un mRNA objetivo en una muestra biológica, comprende producir ADNc de la muestra por transcripción inversa utilizando cuando menos un cebador; amplificar el ADNc así producido utilizando un polinucleótido objetivo como cebadores sentido y antisentido para amplificar ahí los ADNc objetivo; y detectar la presencia del ADNc objetivo amplificado. Además, estos métodos pueden incluir una o más etapas que nos permiten determinar los niveles de mRNA objetivo en una muestra biológica (por ej . por examen simultáneo en los niveles a una secuencia ARNm de control comparativa de un gen "constitutivo" tal como un miembro de la familia actina) . Opcionalmente, la secuencia del ADNc objetivo amplificado puede determinarse.

Métodos opcionales de la invención incluyen protocolos que examinan o detectan mRNAs, tales como mRNAs objetivo, en una muestra de tejido, celular o de plasma por tecnologías de micromatriz. Utilizando micromatrices de ácido nucleico, muestras de mR A de prueba y control de las muestras de prueba y control se someten a transcripción inversa y etiquetan para generar sondas cDNA. Las sondas después se hibridizan a una matriz de ácidos nucleicos inmovilizados en un soporte sólido. La matriz se configura de manera tal que la secuencia y posición de cada miembro de la matriz se conoce. Por ejemplo, una selección de genes cuya expresión se correlaciona con beneficio clínico incrementado o reducido de terapia anti angiogénica, puede disponerse en un soporte sólido. Hibridización de una sonda etiquetada con un miembro de matriz particular, indica que la muestra de la cual la sonda se derivó expresa ese gen. Análisis de expresión de gen diferencial de tejido enfermo puede proporcionar información valiosa. Tecnología de micromatriz utiliza técnicas de hibridización de ácido nucleico y tecnología de cómputo para evaluar el perfil de expresión de mRNA de miles de genes dentro de un solo experimento. (Ver, e.g., wo 01/75166 publicada en octubre 11, 2001; (Ver, por ejemplo las patentes de los E.U.A. Nos. 5,700,637, 5,445,934, y 5,807,522, Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996); Cheung, V.G. et al., Nature Genetics 21 (Suppl) : 15-19 (1999) para una discusión de fabricación de matriz) . Micromatrices de ADN son matrices miniatura que contienen fragmentos de genes que ya son sintetizado directamente sobre o aplicados por puntos sobre vidrio u otros substratos. Miles de genes usualmente se representan en una sola matriz. Un experimento de micromatriz típico involucra las siguientes etapas: 1) preparación de un blanco etiquetado en forma fluorescente a partir de ARN aislado de la muestra, 2) hibridización del blanco etiquetado con la micromatriz, 3) lavado, tinción y barrido de la matriz, 4) análisis de la imagen barrida o explorada y 5) generación de perfiles de expresión de genes. Actualmente, dos tipos principales de micromatrices de ADN se utilizan: matrices de oligonucleótido (usualmente 25 a 70 meros) y matrices de expresión de genes que contienen productos PCR preparados a partir de cDNAs . Para formar una matriz, los oligonucleótidos ya pueden ser prefabricados o aplicados por puntos a la superficie o sintetizados directamente en la superficie (in situ) .

El sistema Affymetrix GeneChip® es un sistema de micromatriz comercialmente disponible, que comprende matrices fabricadas por síntesis directa de oligonucleótidos en una superficie de vidrio. Matrices de Genes/Sonda: Oligonucleótidos , usualmente 25 mers, se sintetizan directamente sobre una oblea de vidrio o una combinación de fotolitografía basada en semiconductor y tecnologías de síntesis química de fase sólida. Cada matriz contiene hasta 400,000 diferentes oligos y cada oligo está presente en millones de copias. Ya que sondas oligonucleótido se sintetizan en sitios conocidos en la matriz, los patrones de hibridización y las intensidades de señal pueden ser interpretados en términos de identidad génica y niveles de expresión relativos por el programa Affymetrix Microarray Suite. Cada gen se representa en la matriz por una serie de diferentes sondas oligonucleótido. Cada par de sondas consiste de un oligonucleótido de perfecto apareamiento y un oligonucleótido de apareamiento incorrecto. La sonda de perfecto apareamiento tiene una secuencia exactamente complementaria con el gen particular y de esta manera mide la expresión del gen. La sonda de apareamiento incorrecto difiere de la sonda de apareamiento perfecto por una sustitución de una sola base en la posición base central, perturbando el enlace de la transcripción de gen objetivo. Esto ayuda a determinar el fondo e hibridización específica que contribuye a la señal medida para el oligo de perfecto apareamiento. El programa Microarray Suite, substrae las intensidades de hibridización de las sondas de apareamiento incorrecto de aquellas de las sondas de apareamiento imperfecto para determinar el valor de intensidad absoluto o específico por cada juego de sonda. Se eligen sondas con base en información actual de Genbank y otros depósitos de nucleótidos. Las secuencias se considera que reconocen regiones únicas del extremo 3' del gen. Un Horno GeneChip Hybridization Oven (horno de "rosticería" ) empleado para llevar a cabo la hibridización de hasta 64 matrices a la vez. La estación fluídica realiza lavado y tinción de las matrices de sonda. Es completamente automatizada y contiene cuatro módulos, con cada módulo que contiene una matriz de sonda. Cada módulo se controla independientemente a través del programa Microarray Suite utilizando protocolos fluídicos previamente programados . El explorador es un explorador de fluorescencia láser confocal que mide intensidad de fluorescencia emitida por el cRNA etiquetado ligado a las matrices de sonda. La estación de trabajo de computadora con el programa Microarray Suite controla la estación fluídica y el explorador. El programa Microarray Suite puede controlar hasta ocho estaciones fluídicas utilizando hibridización preprogramada, protocolos de lavado y tinción para la matriz de sonda. El programa también adquiere y convierte datos de intensidad de hibridización en una presencia/ausencia por cada gen utilizando , algoritmos apropiados. Finalmente, el programa detecta cambios en la expresión de genes entre experimentos por análisis de comparación y formatear la salida en archivos .txt, que pueden emplearse con otros programas o soporte lógico para mayor análisis de datos.

La expresión de un biomarcador selecto en una muestra de tejido o célula también puede examinarse mediante ensayos de base funcional o de actividad. Por ejemplo, si el biomarcador es una enzima, se pueden realizar ensayos conocidos en la técnica, para determinar o detectar la presencia de la actividad enzimática dada en la muestra de tejido o celular.

Los equipos de la invención tienen una cantidad de modalidades. Una modalidad típica es un equipo que comprende un recipiente, una etiqueta en el recipiente, y una composición contenida dentro del recipiente; en donde la composición incluye un anticuerpo primario que liga a P1GF, la etiqueta en el recipiente indica que la composición pudo utilizarse para evaluar la presencia de PlGF en al menos un tipo de células de mamífero, e instrucciones para utilizar el anticuerpo para evaluar la presencia de PlGF en al menos un tipo de célula de mamífero. El equipo además puede comprender un conjunto de instrucciones y materiales para preparar una muestra de tejido, celular o de plasma y aplicar anticuerpo y sonda a la misma sección de una muestra de tejido, celular o de plasma. El equipo puede incluir tanto anticuerpo primario como secundario, en donde el anticuerpo secundario se conjuga a una etiqueta, por ejemplo. , una etiqueta enzimática.

Otra modalidad es un equipo que comprende un recipiente, una etiqueta en el recipiente, y una composición contenida dentro del recipiente; en donde la composición incluye uno o más polinucleótidos que hibridizan a PlGF bajo severas condiciones, la etiqueta en el recipiente indica que la composición puede utilizarse para evaluar la presencia de PlGF en al menos un tipo de célula o plasma de mamífero, e instrucciones para utilizar el polinucleotido para evaluar la presencia de PlGF RNA o DNA en al menos un tipo de plasma o células de mamífero.

Otros componentes opcionales en el equipo incluyen uno o más amortiguadores (por ejemplo, amortiguador de bloque, amortiguador de lavado, amortiguador de substrato, etc) , otros reactivos tales como substrato (por ejemplo, cromógeno) que se alteran químicamente por una etiqueta enzimática, solución de recuperación de epítopo, muestras de control (controles positivos y/o negativos) , porta-objeto u ob etos de control, etc.

Para los métodos de la invención, los agentes terapéuticos anti-cáncer, agentes anti angiogénesis y/o agentes quimioterapéuticos , se administran a un paciente humano, de acuerdo con métodos conocidos, tales como administración intravenosa, como un bolo o por infusión continua sobre un periodo de tiempo, por rutas intramuscular, intraperitoneal , intracerobroespinal, subcutánea, intra-articular, intrasinovial , intratecal, oral, tópica o de inhalación. Se prefieren administración intravenosa o subcutánea del anticuerpo.

El tratamiento de la presente invención puede involucrar la administración combinada de un anticuerpo anti-VEGF y uno o más agentes quimioterapéuticos . La presente invención contempla administración de cócteles de diferentes agentes quimioterapéuticos. La administración combinada incluye co-administración, utilizando formulaciones separadas o una sola formulación farmacéutica, y administración en consecutiva en cualquier orden, en donde de preferencia hay un periodo de tiempo mientras que ambos (o todos) de los agentes activos ejercen simultáneamente sus actividades biológicas. Programas de preparación y dosificación para estos agentes quimioterapéuticos pueden emplearse de acuerdo con las instrucciones del fabricante o como se determina empíricamente por el practicante con destreza. Programas de preparación y dosis para quimioterapia también se describe en Chemotherapy Service Ed. , M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992) . El agente quimioterapéutico puede preceder o seguir administración del anticuerpo o puede suministrarse en forma simultáneamente.

Para la prevención o tratamiento de la enfermedad, la dosis apropiada del agente terapéutico anti-cáncer o agente anti angiogénesis , dependerá en tipo de enfermedad a tratar, como se definió anteriormente, la severidad y curso de la enfermedad, si el agente se administra para propósitos preventivos o terapéuticos, terapia previa, la historia clínica del paciente y respuesta al agente, y la discreción del médico a cargo. El agente se administra en forma conveniente al paciente en una ocasión o sobre una serie de tratamientos. En un régimen de terapia de combinación, las composiciones de la presente invención se administran en una cantidad sinergística o terapéutica efectiva. En algunas modalidades, el agente anti angiogénesis es antagonista VEGF, por ejemplo, un anticuerpo anti-VEGF tal como bevacizumab. Dependiendo del tipo y severidad de la enfermedad, aproximadamente 1 ug/kg a 50 mg/kg (por ejemplo 0.1-20 mg/kg) de un anticuerpo es una dosis candidato inicial para administración al paciente, ya sea por ejemplo por una o más 'administraciones separadas o por infusión continua. Una dosis típica diaria puede estar en el intervalo desde aproximadamente 1 ug/kg a aproximadamente 100 mg/kg o más, dependiendo de los factores anteriormente mencionados. Para administraciones repetidas sobre varios días o más, dependiendo de la condición, se sostiene el tratamiento hasta que ocurre una suspensión deseada de los síntomas de la enfermedad. Sin embargo, pueden ser útiles otros regímenes de dosis. En un aspecto preferido, el anticuerpo de la invención se administra cada dos o tres semanas, a una dosis en el intervalo desde aproximadamente 5 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg. En forma más preferible, este régimen de dosis se emplea en combinación con un régimen quimioterapéutico como la terapia de primer línea para tratar cáncer colorectal metastásico. En algunos aspectos, el régimen de quimioterapia involucra la administración intermitente con altas dosis tradicionales. En algunos otros aspectos, los agentes quimioterapéuticos se administran utilizando dosis más pequeñas y más frecuentes sin interrupciones programadas ("quimioterapia metronómica" ) . El avance de la terapia de la invención se supervisa fácilmente por técnicas y ensayos convencionales .

En algunas modalidades, el anticuerpo anti-VEGF empleado en los métodos de la invención es bevacizumab. En ciertas modalidades, por ejemplo, cuando se utiliza en combinación, bevacizumab se administra en el intervalo desde aproximadamente 0.05 mg/kg a aproximadamente 15 mg/kg. En una modalidad, una o más dosis de aproximadamente 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 3.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 5.0 mg/kg, 6.0 mg/kg, 7.0 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8.0 mg/kg, 9.0 mg/kg, 10 mg/kg o 15 mg/kg (o cualquier combinación de las mismas) pueden administrarse al sujeto. Estas dosis pueden administrarse en forma intermitente, por ejemplo cada día, cada tres días, cada semana o cada dos a tres semanas. En otra modalidad, por ejemplo, cuando se utiliza en combinación, bevacizumab se administra en forma intravenosa al sujeto a 10 mg/kg cada semana salteada o 15 mg/kg cada tres semanas.

Los siguientes ejemplos se proporcionan para propósitos ilustrativos solamente y no se habrán de considerar como limitantes ante las presentes enseñanzas.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Niveles P1GF de superior línea base en pacientes de cáncer se correlacionan con más corta supervivencia Sujeto de Estudio y Tratamiento: • Se recolectaron muestras de AVF-0776, un estudio de monoterapia de bevacizumab en pacientes con cáncer de mama metastático quien ha tenido relapso despyés de al menos un régimen de quimioterapia convencional para enfermedad metastásica. Todos los sujetos recibieron 3 mg/kg, 10 mg/kg o 20 mg/kg de bevacizumab cada 2 semanas por un total de seis . infusiones. Los sujetos sin evidencia de avance de enfermedad en la evaluación de tumor del Día 70 continuaron recibieron bevacizumab cada 2 semanas hasta el Día 154 (seis infusiones más) y después se someten a evaluación de tumor. Sujetos sin evidencia de avance de la enfermedad en el Día 154 recibieron una infusión final de bevacizumab el Día 168. Sujetos que experimentan avance de enfermedad fueron separados del estudio. Después de terminar el estudio o abandono, a los sujetos se les dio seguimiento por estado de supervivencia a 1 año después del Día 0.

Muestras y métodos: Sangre de vena periférica de sujetos se tomó directamente en un tubo EDTA de plástico BD Vacutainer® con un tapón convencional de la banda. Después de recolectar, las muestras se mezclaron solamente y se dejó que reposaran por 30 minutos. Se obtuvo plasma al centrifugar a 3,000 x g por 20 minutos a temperatura ambiente. Se seleccionaron muestras de un total de 67 pacientes con cáncer de mama metastásico con relapso tratado con bevacizumab y del cual estuvieron disponibles muestras de plasma al menos dos puntos en tiempo desde el Día 0 al Día 56 (Día 0, Día 14, Día 28, Día 42 y Día 56) .

Niveles PlGF de línea base en plasma se midieron en pacientes antes de empezar el tratamiento el Día 0 con el equipo de factor de crecimiento humano MS6000 MSD® por (K11029C-1 Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD) de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Para correlacionar niveles de PlGF con resultado clínico, la metodología Kaplan-Meier y la prueba de rango-log (Mantel-Cox) se utilizaron para los análisis de duración de supervivencia desde el inicio de estudio (primer dosis) .

Resultados : La prueba de rango-log identifica que niveles PlGF de plasma a 28 pg/ml en línea base fue una variable significante que se correlaciona con la supervivencia total de un paciente (p < 0.0026; ver Figura 1) . El tiempo de supervivencia total medio fue 171 días en pacientes con niveles PlGF de plasma línea base que 28 pg/ml al Día 0 antes de iniciar el tratamiento. En contraste, el tiempo de supervivencia total medio para pacientes con niveles PlGF de línea base menor que o igual a 28 pg/ml en el Día 0 antes de iniciar el tratamiento, fue 417 días. Estos resultados indican que el nivel PlGF de plasma en línea base en un paciente es un pronosticador del beneficio de supervivencia para pacientes de cáncer que se someten a terapia anti angiogénesis .

Ejemplo 2: Niveles PlGF de plasma aumentan en pacientes tratados con Bevacizuxnab Pacientes se trataron y muestras de plasma se recolectaron como se describe anteriormente en el Ejemplo 1. Niveles PlGF de plasma se supervisaron sobre el curso de tratamiento con bevacizumab. Los resultados muestran que niveles de PlGF en plasma aumentaron después de tratamiento con bevacizumab (ver Figura 2) . Aumentos medios dé más de 1.5 veces se observaron en pacientes los Días 14, 28, 42 y 56 después de tratamiento con bevacizumab.

Ejemplo 3: Superiores niveles de PLGF en plasma en pacientes después de tratamiento con bevacizumab se correlacionan con más corta supervivencia total Pacientes fueron tratados, muestras de plasma, y niveles de PlGF en plasma medidos como se describió anteriormente en el Ejemplo 1. Para correlacionar los niveles de PlGF en plasma con resultado clínico, se empleó la metodología Kaplan-Meier y la prueba de rango-log (Mantel-Cox) para análisis de duración de supervivencia del inicio de estudio (primer dosis) .

Los resultados de prueba rango-log indican que los niveles PlGF en plasma a 50 pg/ml el Día 14 de tratamiento con bevacizumab fueron una variable significante que se correlaciona con supervivencia total de un paciente ( p < 0.0003; ver Figura 3). El tiempo de supervivencia medio para pacientes con niveles de PlGF en plasma en línea base mayores a 50 pg/ml después de inicio de tratamiento con bevacizumab fue de 165 días. En contraste, el tiempo de supervivencia total medio para pacientes con niveles de PlGF en plasma menor que o igual a 50 pg/ml después de inicio de tratamiento con bevacizumab fue de 431 días. Estos resultados indican que el nivel de PlGF en plasma en pacientes que han empezado el tratamiento con terapia anti angiogénica, por ejemplo, bevacizumab, es un pronóstico de beneficio de supervivencia para pacientes de cáncer que se someten a terapia de anti angiogénesis .

Claims (18)

REIVINDICACIONES

1. Un método para identificar a un paciente que sufre de cáncer, quien puede beneficiarse por terapia anti cáncer diferente a o además de terapia anti angiogénica, caracterizado porque comprende determinar el nivel de expresión del factor de crecimiento placentario (PlGF) en una muestra que se obtiene del paciente, en donde el nivel de expresión incrementado de PlGF en la muestra obtenida del paciente en comparación con una muestra de referencia, indica que el paciente puede beneficiarse de terapia anti-cáncer diferente a o además de terapia anti angiogénica.

2. Un método para pronosticar la respuesta de un paciente que sufre de cáncer a terapia anti angiogénica, caracterizado porque comprende: determinar el nivel de expresión de PlGF en una muestra que se obtiene del paciente, en donde el nivel de expresión incrementada de PlGF en la muestra obtenida del paciente, en comparación con una muestra de referencia, indica que es menor probable que el paciente responda solo a terapia anti angiogénica.

3. Un método para monitorear la efectividad de terapia anti angiogénica, caracterizado porque comprenden determinar el nivel de expresión de PlGF en una muestra que se obtiene del paciente, en donde el nivel de expresión incrementada de PlGF en la muestra obtenida del paciente en comparación con una muestra de referencia, indica que el paciente es menos probable que responda solo a la terapia anti angiogénica.

4. Un método para optimizar eficacia terapéutica para el tratamiento de cáncer, el método se caracteriza porque comprende: determinar el nivel de expresión de PlGF en una muestra que se obtiene del paciente, en donde el nivel de expresión incrementado de PlGF en la muestra obtenida del paciente, en comparación con una muestra de referencia, indica que es menos probable que el paciente responda solo a la terapia anti angiogénica.

5. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque el nivel de expresión de PlGF en la muestra obtenida del paciente se incrementa al menos 1.5 veces en comparación con una muestra de referencia.

6. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la terapia anti angiogénica comprende administrar un antagonista VEGF.

7. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el antagonista VEGF es un anticuerpo anti-VEGF.

8. El método de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado porque el anticuerpo anti-VEGF es bevacizumab.

9. El método de conformidad con la reivindicación 5, caracterizado porque el cáncer es cáncer de mama.

10. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la muestra, obtenida del paciente es plasma. °

11. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque el nivel de expresión de PlGF, se determina al detectar proteína PlGF en el plasma.

12. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la muestra se obtiene del paciente antes de terapia anti angiogénica.

13. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque la muestra se obtiene del paciente después de inicio de terapia anti angiogénic .

14. El método de conformidad con la reivindicación 12 , caracterizado porque la muestra se obtiene del paciente dentro 'de 24 horas después de inicio de terapia anti angiogénica.

15. El método de conformidad con la reivindicación 12, caracterizado porque la muestra se obtiene del paciente dentro de 14 días después de inicio de terapia anti angiogénica .

16. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque además comprende administrar una terapia anti-cáncer al paciente, en donde la terapia anti-cáncer es diferente a o además de terapia anti angiogénica.

17. El método de conformidad con la reivindicación 16, caracterizado porque la terapia anti-cáncer se administra al paciente cuando el nivel de expresión de PlGF en una muestra obtenida del paciente se incrementa en comparación con una muestra de referencia.

18. Un equipo para detectar niveles de expresión de PlGF, el equipo se caracteriza porque comprende: un compuesto capaz de detectar específicamente niveles de expresión de PlGF; e instrucciones para utilizar el equipo para pronosticar la respuesta de un paciente que sufre de cáncer solo a terapia anti angiogénica, en donde la expresión incrementada de PlGF en comparación con una muestra de referencia, indica que el paciente puede beneficiarse de terapia anti-cáncer diferente a o además de terapia anti angiogénica .