JP5416221B2 - 癌患者における診断用途のための方法および組成物 - Google Patents

Description

（関連出願）
本出願は、２００８年１２月２３日に出願の米国仮特許出願番号６１／１４０３９２の優先権を主張するものであり、この内容はすべての目的のためにその全体が出典明記によって本明細書中に援用される。

（発明の分野）
本発明は、臨床結果を予測するため、そして、抗血管形成療法によって治療される癌患者をモニターするために有用な方法および組成物に関する。

癌はヒトの健康を脅かす最も致死率の高いものの一つである。米国だけでも、毎年１，３００，０００人近くの患者が新たに癌に罹患しており、循環器系疾患に次いで２番目の死因となっており、およそ４人に１人を占める。固形腫瘍はこれらの死の大部分の原因である。特定の癌の医学治療においてめざましい進歩があるにもかかわらず、すべての癌の全体の５年生存率は過去２０年においておよそ２０％しか改善されていない。癌又は悪性腫瘍は転移して、制御されずに急速に成長するので、タイムリーな検出と治療を極めて難しくする。
癌の種類に応じて、患者は一般的に、化学療法、放射線および抗体ベースの薬剤を含む、患者に有用な様々な治療の選択がある。異なる治療投薬計画から臨床結果を予測するために有用な診断法は、この患者の臨床管理のためになる。様々な研究により、例えば突然変異特異的アッセイ、マイクロアレイ分析、ｑＰＣＲなどによって特定の癌種の同定と遺伝子発現との相関性が研究されてきた。このような方法は、患者が示す癌の同定及び分類に有用でありうる。しかしながら、臨床結果との遺伝子発現の予測又は予後の値についてはあまり知られていない。
ゆえに、癌患者の無進行生存のような治療結果を予測するため、または、このような治療の経過をモニターして、これにより各患者のための最適治療投薬計画を選択するための客観的な、再現性のある方法が必要とされている。

本発明の方法は、例えば、癌患者の治療方法に役立つか又は薬剤開発中の患者の選別に役立つ、特定の治療投薬計画を有する個々の患者を治療するときの成功の可能性の予測、疾患進行の評価、治療有効性のモニタリング、個々の患者の予後の決定、及び特定の抗癌療法から利益を得る個体の因子の評価といった、様々な状況において利用可能である。
本発明は、癌を患っている患者における特定のバイオマーカの発現レベルが抗血管形成療法のみからの臨床利点の低減と相関するという発見にある程度基づく。したがって、ある態様では、本発明は、癌の治療のために治療上の有効性を最適化する方法であって、患者から得た試料における胎盤増殖因子(ＰｌＧＦ)の発現レベルを検出する工程を含み、このとき参照試料と比較したときの該試料におけるＰｌＧＦの発現の増加が、該患者が抗血管形成療法以外の抗癌療法又は抗血管形成療法に加えた抗癌療法から利益を得うることを示す方法を提供する。いくつかの実施態様では、方法は、患者に抗癌療法を投与することを更に含み、このとき抗癌療法は抗血管形成療法以外のもの、または、抗血管形成療法に加えたものである。

他の態様では、本発明は、抗血管形成療法以外の抗癌療法、または、抗血管形成療法に加えた抗癌療法から利益を得うる癌患者を識別する方法であって、患者から得た試料における胎盤増殖因子(ＰｌＧＦ)の発現レベルを検出する工程を含み、このとき参照試料と比較したときの該試料におけるＰｌＧＦの発現の増加が、該患者が抗血管形成療法以外の、または、抗血管形成療法に加えた抗癌療法から利益を得うることを示す方法を提供する。一実施態様では、患者からの試料は、抗血管形成療法の開始の前又は開始時に得られる。一実施態様では、患者からの試料は、抗血管形成療法の開始の後に得られる。いくつかの実施態様では、方法は患者に抗癌療法を投与することを更に含み、このとき抗癌療法は抗血管形成療法以外のもの、または、抗血管形成療法に加えたものである。
他の態様では、本発明は、癌患者の抗血管形成療法に対する応答性を予測する方法であって、患者から得た試料におけるＰｌＧＦの発現レベルを決定することを含み、このとき参照試料と比較したときのＰｌＧＦの発現レベルの増加が、該患者が抗血管形成療法単独に応答することが少ないことを示す方法を提供する。一実施態様では、患者からの試料は、抗血管形成療法の開始の前又は開始時に得られる。一実施態様では、患者からの試料は、抗血管形成療法の開始の後に得られる。いくつかの実施態様では、方法は患者に抗癌療法を投与することを更に含み、このとき抗癌療法は抗血管形成療法以外のもの、または、抗血管形成療法に加えたものである。

また、本発明は、癌患者の治療方法であって、患者に抗血管形成療法以外の抗癌療法、または、抗血管形成療法に加えて抗癌療法を投与することを含み、このとき患者から得た試料は参照試料と比較してＰｌＧＦの発現レベルの増加を示す方法を提供する。一実施態様では、患者からの試料は、抗血管形成療法の開始の前に、または、開始時に得られる。一実施態様では、患者からの試料は、抗血管形成療法の開始の後に得られる。試料は、治療の開始の前に患者から得てもよい。一実施態様では、試料は２８ｐｇ／ｍｌ以上のＰｌＧＦ発現レベルを有する。いくつかの実施態様では、試料は、抗血管形成療法によって現在治療されている患者から得てもよい。一実施態様では、患者からの試料は、抗血管形成療法の開始の後に得られる。一実施態様では、試料は、５０ｐｇ／ｍｌ以上のＰｌＧＦ発現レベルを有する。
他の態様では、本発明は、癌患者の治療方法であって、患者に抗血管形成療法を投与することを含み、このとき患者から得た試料は参照試料と比較してＰｌＧＦの発現レベルの低さ又は低減を示す方法を提供する。試料は、治療の開始の前に患者から得てもよい。一実施態様では、試料は、２８ｐｇ／ｍｌ以下のＰｌＧＦ発現レベルを有する。いくつかの実施態様では、試料は、抗血管形成療法によって現在治療されている患者から得てもよい。一実施態様では、患者からの試料は、抗血管形成療法の開始の後に得られる。一実施態様では、試料は、５０ｐｇ／ｍｌ以下のＰｌＧＦ発現レベルを有する。いくつかの実施態様では、抗血管形成療法は、抗ＶＥＧＦ抗体、例えばベバシズマブの投与を含む。

また、ＰｌＧＦの発現レベルを特異的に検出することができる化合物を具備するキットであって、このとき癌を患っている患者の抗血管形成療法単独に対する応答性を予測するためのキットの使用についての指示書をさらに具備し、参照試料と比較したときのＰｌＧＦの発現の増加が、該患者が抗血管形成療法以外の抗癌療法又は抗血管形成療法に加えた抗癌療法から利益を得うることを示すキットが提供される。

本明細書中に記載の方法の何れかでは、試料は、組織又は細胞試料であってもよく、又は血液、血漿および／または血清から得られてもよい。ある実施態様では、試料は、癌の治療の開始の前に患者から得られる。ある実施態様では、試料は、癌の治療の開始の後に患者から得られる。例えば、試料は、癌治療の開始後２４時間以内、または、癌治療の開始後の２、３、５、１０、１４、２０、２５、２８、４２又は５６日以内に得られる。
本明細書中に記載の方法の何れかでは、一又は複数の遺伝子ないし遺伝子産物の発現レベルが、核酸レベル、タンパク質レベル、又はタンパク質の分泌ないし表面発現レベルで決定されうる。ある実施態様では、ＰｌＧＦの発現レベルの増加は、発現レベルの１．４〜１．８の倍の増加である。いくつかの実施態様では、ＰｌＧＦの発現レベルの増加は、発現レベルの少なくとも１．５倍の増加である。
本発明の方法のいくつかの実施態様では、癌は癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および白血病である。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む)、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃又は胃癌(胃腸癌を含む)、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎又は腎臓癌、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌および様々なタイプの頭頸部癌、並びにＢ細胞リンパ腫(低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；小リンパ球(ＳＬ) ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度広汎性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連のリンパ腫；及び ワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む)；慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)；急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)；線毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び、移植後リンパ増殖性疾患(ＰＴＬＤ)、並びに母斑症関連の異常な血管増殖、浮腫(脳腫瘍と関係するものなど)又はメイグス症候群が含まれる。
一実施態様では、癌は、例えば転移性乳癌を含む乳癌である。
本発明の方法は、本明細書中の以降に記載の何れかの抗癌剤と共に実施されてよい。抗血管形成剤は、本明細書中の以降に記載の何れかの抗血管形成剤を単独ないしは組み合わせてよい。いくつかの実施態様では、抗血管形成療法は、例えば抗ＶＥＧＦ抗体を含むＶＥＧＦアンタゴニストの投与を含む。いくつかの実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブである。

本明細書中に記載の何かの実施態様又はその何かの組合せを、本明細書中に記載の本発明の方法の何れか又はすべてに応用する。

０日目(治療開始の前)の血漿ＰｌＧＦレベルに対する乳癌患者の全生存を比較するグラフである。 血漿ＰｌＧＦレベルがベバシズマブによる治療に応答して増加したことを示すグラフである。 ベバシズマブによる治療の１４日目の血漿ＰｌＧＦレベルに対する乳癌患者の全生存を比較するグラフである。

（詳細な説明）
本発明の実施は、特に明記しない限り、分子生物学(組換え技術を含む)、微生物学、細胞生物学、生化学および免疫学の従来の技術を使用するものであり、これらは当業者の能力の範囲内である。このような技術は、"Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989)；"Oligonucleotide Synthesis" (M. J. Gait, ed., 1984)；"Animal Cell Culture" (R. I. Freshney, ed., 1987)；"Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)；"Current Protocols in Molecular Biology" (F. M. Ausubel et al., eds., 1987, and periodic updates)；"PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994)といった文献に十分に説明されている。
定義のない限り、本明細書中で用いる技術的及び科学的用語は、本発明が属する分野の技術者によって共通して理解されるのと同じ意味を有する。Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994), and March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)は、本出願において使用する多くの用語についての一般的な指針を当業者に提供する。
特許出願及び出版物を含む本明細書中で引用されるすべての文献は、出典明記によってその全体が援用される。

Ｉ．定義
本出願を理解するために、以下の定義を適用し、必要な場合はいつでも、単数で使用した用語には複数形も含まれ、その逆もそうである。以下に示すいずれかの定義が出典明記によって本明細書中に援用されるいずれかの文献と矛盾する場合、以下の定義を調節してもよい。

本明細書で用いる「アレイ」又は「マイクロアレイ」なる用語は、基質上でのハイブリダイズ可能なアレイ成分、好ましくはポリヌクレオチドプローブ(例えばオリゴヌクレオチド)の規則正しい整列を指す。基質は、ガラススライドなどの固体基質、又はニトロセルロースメンブレンなどの半固体基質であってもよい。ヌクレオチド配列は、ＤＮＡ、ＲＮＡ又は何れかのその並べ換えであってよい。
本明細書で用いる「標的配列」、「標的核酸」又は「標的タンパク質」は、その検出が望まれる、対象とするポリヌクレオチド又はタンパク質である。通常、本明細書中で用いる「鋳型」は標的ヌクレオチド配列を含有するポリヌクレオチドである。場合によって、「標的配列」、「鋳型ＤＮＡ」、「鋳型ポリヌクレオチド」、「標的核酸」、「標的ポリヌクレオチド」及びその変異体は交換可能に用いられる。
本明細書中で用いる「増幅」は通常、所望の配列の複数のコピーを生産する方法を指す。「複数のコピー」は少なくとも２のコピーを意味する。「コピー」が、鋳型配列に対して相補的な又は同一な完全な配列を必ずしも意味するものではない。例えば、コピーは、ヌクレオチド類似体、例えばデオキシイノシン、意図的配列変化(鋳型に相補的ではないがハイブリダイズすることができる配列を含むプライマーにより導入された配列変化など)、及び／又は増幅中に起こる配列エラーを含みうる。

第一試料における遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質又はバイオマーカの発現レベル／量が、第二試料における遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質又はバイオマーカの発現レベル／量と比較して多い場合、第一試料における遺伝子、タンパク質又はバイオマーカの発現／量は、第二試料における発現／量と比較して高い又は増加している。一実施態様では、第一試料における遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質又はバイオマーカの発現レベル／量の増加は、第二試料における遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質又はバイオマーカそれぞれの発現レベル／量の少なくともおよそ１．５倍、１．７５倍、２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍、１０倍、２５倍、５０倍、７５倍又は１００倍である。
第一試料における遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質又はバイオマーカの発現レベル／量が、第二試料における遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質又はバイオマーカの発現レベル／量より少ない場合、第一試料における遺伝子、タンパク質又はバイオマーカの発現／量は、第二試料における発現／量と比較して低い又は低減している。一実施態様では、第一試料における遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質又はバイオマーカの発現レベル／量の減少は、第二試料における遺伝子、遺伝子産物、例えばタンパク質又はバイオマーカそれぞれの発現レベル／量の少なくともおよそ１．５分の１、１．７５分の１、２分の１、３分の１、４分の１、５分の１、６分の１、７分の１、８分の１、９分の１、１０分の１、２５分の１、５０分の１、７５分の１又は１００分の１未満である。

発現レベル／量は、限定するものではないがｍＲＮＡ、ｃＤＮＡ、タンパク質、タンパク質断片および／または遺伝子コピーを含む当分野で公知の何れかの適切な基準に基づいて決定されうる。発現レベル／量は、質的におよび／または量的に決定されてよい。一実施態様では、試料は、分析するＲＮＡ又はタンパク質の量の相違と使用するＲＮＡ又はタンパク質の品質の多様性の両方について規準化される。このような基準化は、ＧＡＰＤＨ等の周知のハウスキーピング遺伝子を含む特定の規準化遺伝子の発現を測定して、組み込むことによって達成されてよい。あるいは、基準化は、分析する遺伝子のすべて又はその大きなサブセットの平均ないし中位値のシグナルに基づいてもよい(包括的規準化手法)。遺伝子ごとに、患者の腫瘍ｍＲＮＡ又はタンパク質の測定した基準化量は、設定した比較対象物に見られる量と比較する。１患者当たりの試験腫瘍につき各ｍＲＮＡ又はタンパク質の規準化した発現レベルは、設定した比較対象物において測定した発現レベルの割合として表してよい。分析される特定の患者試料において測定される発現レベルは、この範囲内で数パーセンタイルで減少する。これは当分野で周知の方法で測定されてよい。

「検出」には、直接的及び間接的な検出を含み、任意の検出手段が含まれる。
本明細書中で用いる「試料」又は「試験試料」なる用語は、例えば理学的、生化学的、化学的及び／又は生理学的特徴に基づいて特性を示す又は同定される、細胞実体及び／又は他の分子実体を含有する対象とする被検体から得られる、又は対象とする被検体由来の組成物を指す。一実施態様では、この定義には、血液及び生物起源の他の液体試料、及び生検試料などの組織試料又は組織培養物又はこれら由来の細胞が包含される。細胞試料の供給源は、新鮮な、凍結されたおよび／または保存されていた臓器や組織試料または生検または吸引による固形組織；血液または血液成分；体液；及び被検体の妊娠期または発生期の任意の時期の細胞ないし血漿であってもよい。試料は、治療(例えば癌治療)の開始前又は治療(例えば癌治療)の開始後の被検体から得てよい。試料は、治療(例えば癌治療)の開始後２４時間、７日、１０日、１４日、２８日、４２日又は５６日以内に得られてよい。
「試料」又は「試験試料」なる用語には、試薬による処理、可溶化又は特定成分(例えばタンパク質又はポリヌクレオチド)の濃縮、又は切断のための半固形又は固形マトリックスへの包埋といった、調達後の何れかの方法で操作されている生物学的試料が含まれる。本明細書中で、組織試料の「切片」は、組織試料の一部又は断片、例えば、組織の薄切り又は組織からの細胞片を意味する。

試料には、限定するものではないが、原発性又は培養された細胞又は細胞株、細胞上清物、細胞溶解物、血小板、血清、血漿、硝子体体液、リンパ液、関節液、ろ胞液、精液、羊水、乳汁、全血液、血液由来の細胞、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、汗、粘液、腫瘍溶解物および組織培養液、組織抽出物、例としてホモジナイズした組織、腫瘍組織、細胞抽出物及びこれらの組合せが含まれる。
一実施態様では、試料は臨床試料である。他の実施態様では、試料は診断検査法で使われる。いくつかの実施態様では、試料は原発性又は転移性の腫瘍から得られる。組織生検は、腫瘍組織の代表的な部分を得るために用いられることが多い。あるいは、腫瘍細胞は、対象の腫瘍細胞を含むとわかっているか又はそう思われる組織又は体液の形態で間接的に得られてもよい。例えば、肺癌病変の試料は、切除術、気管支鏡検査法、細針吸引、気管支のブラッシングによって、又は痰、胸膜液ないし血液から得られてよい。
一実施態様では、試料は、抗血管形成療法の前の被検体又は患者から得られる。他の実施態様では、試料は、ＶＥＧＦアンタゴニスト療法の前の被検体又は患者から得られる。さらに他の実施態様において、試料は、抗ＶＥＧＦ抗体療法の前の被検体又は患者から得られる。さらに他の実施態様では、試料は、ＶＥＧＦアンタゴニスト療法による少なくとも一つの治療の後の被検体又は患者から得られる。
一実施態様では、試料は、抗血管形成療法による少なくとも一つの治療の後の被検体又は患者から得られる。さらに他の実施態様では、試料は、抗ＶＥＧＦ抗体による少なくとも一つの治療の後の被検体又は患者から得られる。いくつかの実施態様では、試料は、癌が転移する前の患者から得られる。ある実施態様では、試料は、癌が転移した後の患者から得られる。

本明細書の「参照試料」は、比較のために用いられる任意の試料、標準物質又はレベルを指す。一実施態様では、参照試料は、同じ被検体又は患者の身体の健康な及び／又は罹患していない部分(例えば組織又は細胞)から得られる。他の実施態様では、参照試料は、同じ被検体又は患者の身体の処置していない組織及び／又は細胞から得られる。さらに他の実施態様では、参照試料は、被検体又は患者でない個体の身体の健康なおよび／または罹患していない部分(例えば組織又は細胞)から得られる。さらに他の実施態様では、参照試料は、被検体又は患者でない個体の身体の無処置の組織および／または細胞部分から得られる。
ある実施態様では、参照試料は、試験試料を得るときとは異なる一又は複数の時点で得る同じ被検体又は患者からの単一試料又は組み合わせた複数の試料である。例えば、参照試料は、同じ被検体又は患者から、試験試料を得る時より早い時点に得られる。この参照試料は、参照試料が癌の初期診断時に得られ、試験試料が後の癌が転移性になるときに得られている場合に、有用でありうる。

ある実施態様では、参照試料は、被検体又は患者でない一又は複数の個体から得られる「試料」なる用語の下で定義される、全種類の生物学的試料を含む。ある実施態様では、参照試料は、被検体又は患者でない血管形成疾患(例えば癌)を有する一又は複数の個体から得られる。
ある実施態様では、参照試料は、被検体又は患者でない一又は複数の健康な個体からの組み合わせた複数の試料である。ある実施態様では、参照試料は、被検体又は患者でない疾患又は障害(例えば癌などの血管形成疾患)を有する一又は複数の個体からの組み合わせた複数の試料である。ある実施態様では、参照試料は、被検体又は患者でない一又は複数の個体からの正常組織又はプールした血漿又は血清試料からのプールしたＲＮＡ試料である。ある実施態様では、参照試料は、被検体又は患者でない疾患又は障害(例えば癌などの血管形成疾患)を有する一又は複数の個体からの腫瘍組織又はプールした血漿又は血清試料からのプールされたＲＮＡ試料である。

ここで交換可能に使用される「ポリヌクレオチド」又は「核酸」は、任意の長さのヌクレオチドのポリマーを意味し、ＤＮＡ及びＲＮＡが含まれる。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド又は塩基、及び／又はそれらの類似体(アナログ)、又はＤＮＡもしくはＲＮＡポリメラーゼによりポリマー中に取り込み可能な任意の基質とすることができる。ポリヌクレオチドは、修飾されたヌクレオチド、例えばメチル化ヌクレオチド及びそれらの類似体を含み得る。存在するならば、ヌクレオチド構造に対する修飾は、ポリマーの組み立ての前又は後になされ得る。ヌクレオチドの配列は非ヌクレオチド成分により中断されてもよい。ポリヌクレオチドは、例えば標識成分とのコンジュゲートによって合成後にさらに修飾されてよい。他のタイプの修飾には、例えば「キャップ(caps)」、類似体との自然に生じたヌクレオチドの一又は複数の置換、ヌクレオチド間修飾、例えば非荷電連結(例えばホスホン酸メチル、ホスホトリエステル、ホスホアミダート、カルバマート等)及び荷電連結(ホスホロチオアート、ホスホロジチオアート等)を有するもの、ペンダント部分、例えばタンパク質(例えばヌクレアーゼ、毒素、抗体、シグナルペプチド、ｐｌｙ-Ｌ-リジン等)を含むもの、インターカレータ(intercalators)を有するもの(例えばアクリジン、ソラレン等)、キレート剤(例えば金属、放射性金属、ホウ素、酸化的金属等)を含むもの、アルキル化剤を含むもの、修飾された連結を含むもの(例えばアルファアノマー核酸等)、並びにポリヌクレオチド(類)の未修飾形態が含まれる。更に、糖類中に通常存在する任意のヒドロキシル基は、例えばホスホナート基、ホスファート基で置き換えられてもよく、標準的な保護基で保護されてもよく、又は付加的なヌクレオチドへのさらなる連結を調製するように活性化されてもよく、もしくは固体又は半固体担体に結合していてもよい。５'及び３'末端のＯＨはホスホリル化可能であり、又は１〜２０の炭素原子を有する有機キャップ基部分又はアミンで置換することもできる。また他のヒドロキシルは標準的な保護基に誘導体化されてもよい。またポリヌクレオチドは当該分野で一般的に知られているリボース又はデオキシリボース糖類の類似形態のものをさらに含み得、これらには例えば２'-Ｏ-メチル-２'-Ｏ-アリル、２'-フルオロ又は２'-アジド-リボース、炭素環式糖の類似体、アルファ-アノマー糖、エピマー糖、例えばアラビノース、キシロース類又はリキソース類、ピラノース糖、フラノース糖、セドヘプツロース、非環式類似体、及び非塩基性ヌクレオシド類似体、例えばメチルリボシドが含まれる。一又は複数のホスホジエステル連結は代替の連結基で置き換えてもよい。 これらの代替の連結基には、限定されるものではないが、ホスファートがＰ(Ｏ)Ｓ(「チオアート」)、Ｐ(Ｓ)Ｓ(「ジチオアート」)、「(Ｏ)ＮＲ２(「アミダート」)、Ｐ(Ｏ)Ｒ、Ｐ(Ｏ)ＯＲ'、ＣＯ又はＣＨ２(「ホルムアセタール」)と置き換えられた実施態様のものが含まれ、ここでそれぞれのＲ及びＲ'は独立して、Ｈ又は、エーテル(--Ｏ--)結合を含んでいてもよい置換もしくは未置換のアルキル(１-２０Ｃ)、アリール、アルケニル、シクロアルキル、シクロアルケニル又はアラルジル(araldyl)である。ポリヌクレオチド中の全ての結合が同一である必要はない。先の記述は、ＲＮＡ及びＤＮＡを含むここで引用される全てのポリヌクレオチドに適用される。

本明細書中で用いられる「オリゴヌクレオチド」は一般に、必須ではないが一般におよそ２００ヌクレオチド未満である、短い、一般に一本鎖の、一般に合成のポリヌクレオチドを指す。「オリゴヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」なる用語は互いに矛盾しない。ポリヌクレオチドについての先の記載は等しく、オリゴヌクレオチドにも完全に適用できる。
「プライマー」は、一般に、標的配列とハイブリダイズすることによって、対象の試料中に存在しうる標的に結合して、その後、標的に相補的なポリヌクレオチドの重合を促進する、一般に遊離した３'-ＯＨ基を有する短い単鎖のポリヌクレオチドである。
本明細書中で用いられる「バイオマーカー」なる用語は、一般的に、遺伝子、タンパク質、糖質構造又は糖脂質を含む分子を指し、哺乳動物組織又は細胞中ないしは組織又は細胞上での該分子の発現は標準的な方法(又は本明細書中で開示される方法)によって検出されうるものであり、哺乳動物細胞又は組織の、ＶＥＧＦ特異的インヒビターといった抗血管形成薬などの血管形成の阻害に基づく治療投薬計画への感受性を予測、診断及び／又は予後の予測をするものである。場合によって、このようなバイオマーカーの発現は、コントロール／参照組織又は細胞試料について観察されるものより高いことが決定される。このようなバイオマーカーの発現は、Rules Based Medicine, Inc.又はMeso Scale Discoveryから市販されているような高性能多重化イムノアッセイを使用して決定されてよい。また、バイオマーカーの発現は、例えば、ＰＣＲ又はＦＡＣＳアッセイ、免疫組織化学アッセイ又はジーンチップベースのアッセイを用いて決定してよい。

「組織又は細胞の試料」は、被検体又は患者の組織から採取された細胞の集まりを意味する。組織又は細胞試料の供給源は、新鮮な、凍結された及び／又は保存されていた臓器や組織の試料又は生検又は吸引による固形組織；血液又はいずれかの血液成分；大脳脊髄液、羊水、腹水又は間質液などの体液；被検体又は血漿の妊娠期又は発生期の任意の時期の細胞であってもよい。また組織試料は、原発性か又は培養された細胞ないし細胞株であってよい。場合によって、組織又は細胞の試料は、癌性の組織／臓器から得られる。組織試料は、防腐剤、抗凝血物質、バッファ、固定液、栄養分、抗生物質など天然の組織にはもともと混在していない化合物を含んでもよい。本明細書中の組織試料の「切片」とは、組織試料の一部又は一片、例えば組織試料から切り出した組織又は細胞の一薄片を意味する。

「相関」又は「相関する」は、任意の方法で、第一の分析又はプロトコルの成績及び／又は結果を、第二の分析又はプロトコルの成績及び／又は結果と比較することを意味する。例えば、第二のプロトコルを行う際に第一の分析又はプロトコルの結果を用いてもよいし、及び／又は第一の分析又はプロトコルの結果を用いて、第二の分析又はプロトコルを行うかどうかを決定してもよい。遺伝子発現分析又はプロトコルの実施態様に関し、遺伝子発現分析又はプロトコルの結果を用いて、特定の治療投薬計画を実行するかどうかを決定してもよい。
本明細書中で用いられる「標識」なる用語は、核酸プローブ又は抗体などの試薬に直接的又は間接的にコンジュゲートないしは融合され、コンジュゲートないしは融合した試薬の検出を容易にする化合物又は組成物を指す。標識自体が検出可能なもの（例えば放射性標識又は蛍光性標識）であってもよく、酵素標識の場合、検出可能な基質化合物ないしは組成物の化学的変化を触媒するものであってもよい。

「天然配列」ポリペプチドは、天然由来のポリペプチドと同一のアミノ酸配列を有するポリペプチドを含んでなる。よって、天然配列ポリペプチドは、任意の哺乳動物由来の天然に生じるポリペプチドのアミノ酸配列を有し得る。このような天然配列ポリペプチドは、自然から単離することもできるし、あるいは組換え又は合成手段により生産することもできる。「天然配列」ポリペプチドという用語は特にポリペプチドの天然に生じる切断型又は分泌型(例えば細胞外ドメイン配列)、ポリペプチドの天然に生じる変異体型(例えば、選択的スプライシング型)及び天然に生じる対立遺伝子変異体を包含する。
ポリペプチド「変異体」は、天然配列ポリペプチドと少なくとも約８０％のアミノ酸配列同一性を有する生物学的に活性なポリペプチドを意味する。そのような変異体には、例えば、一又は複数のアミノ酸残基が、ポリペプチドのＮ末端又はＣ末端で付加されているか、又は欠失しているポリペプチドが含まれる。通常、変異体は、天然配列ポリペプチドと少なくともおよそ８０％のアミノ酸配列同一性、より好ましくは少なくともおよそ９０％のアミノ酸配列同一性、よりさらに好ましくは少なくともおよそ９５％のアミノ酸配列同一性を有する。

「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ-Ａ」なる用語は、Leung等 Science, 246:1306 (1989)、及びHouck等 Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)によって記載されているように、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子と、関連した１２１-、１８９-、及び２０６-アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子、並びにそれらの天然に生じる対立遺伝子型及びプロセシング型を指すのに用いられる。ＶＥＧＦ-Ａは、ＶＥＧＦ-Ｂ、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ、ＶＥＧＦ-Ｅ、ＶＥＧＦ-Ｆ及びＰｌＧＦを含む遺伝子ファミリの一部である。ＶＥＧＦ-Ａは、ＶＥＧＦＲ-１(Ｆｌｔ-１)及びＶＥＧＦＲ-２(Ｆｌｋ-１／ＫＤＲ)の２つの高親和性レセプターチロシンキナーゼに主に結合し、後者はＶＥＧＦ-Ａの血管内皮細胞分裂促進シグナルの主な伝達物質である。加えて、ニューロフィリン−１は、ヘパリン-結合ＶＥＧＦ−Ａアイソフォームのレセプターとして同定されており、血管の発達に役割を有しうる。また、「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ-Ａ」なる用語は、マウス、ラット又は霊長類などの非ヒト動物腫由来のＶＥＧＦも意味する。特定の種由来のＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦはｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦはｍＶＥＧＦなどの用語で表されることが多い。また、「ＶＥＧＦ」なる用語は、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸８〜１０９、又は１〜１０９を含むポリペプチドの切断型ないしはその断片を意味する。そのようなＶＥＧＦ型を指すときは、本出願では、例えば、「ＶＥＧＦ(８−１０９)」、「ＶＥＧＦ(１−１０９)」又は「ＶＥＧＦ_１６５」と表す。「切断した(切断型の)」天然のＶＥＧＦのアミノ酸位置は、天然のＶＥＧＦ配列に示される数で示す。例えば、切断型の天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置１７(メチオニン)は、天然のＶＥＧＦ中の位置１７(メチオニン)でもある。切断型の天然ＶＥＧＦは、天然配列のＶＥＧＦに匹敵するＫＤＲ及びＦｌｔ−１レセプターに対して結合親和性を有する。

本明細書中で用いる「ＶＥＧＦ」又は「ＶＥＧＦ-Ａ」なる用語は、Leung et al. Science, 246:1306 (1989)、及びHouck et al. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)によって記載されているように、１６５アミノ酸の血管内皮細胞増殖因子と、関連した１２１-、１８９-、及び２０６-アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子、並びにそれらの天然に生じる対立遺伝子型及びプロセシング型を意味する。また、「ＶＥＧＦ」は、マウス、ラット又は霊長類などの非ヒト動物腫由来のＶＥＧＦも意味する。特定の種由来のＶＥＧＦは、ヒトＶＥＧＦはｈＶＥＧＦ、マウスＶＥＧＦはｍＶＥＧＦなどの用語で表されることが多い。また、「ＶＥＧＦ」なる用語は、１６５アミノ酸のヒト血管内皮細胞増殖因子のアミノ酸８〜１０９、又は１〜１０９を含むポリペプチドの切断型を意味するために用いられる。そのようなＶＥＧＦ型を指すときは、本明細書では、例えば、「ＶＥＧＦ(８−１０９)」、「ＶＥＧＦ(１−１０９)」又は「ＶＥＧＦ１６５」と表す。「切断した(切断型の)」天然のＶＥＧＦのアミノ酸位置は、天然のＶＥＧＦ配列に示される数で示す。例えば、切断型の天然ＶＥＧＦのアミノ酸位置１７(メチオニン)は、天然のＶＥＧＦ中の位置１７(メチオニン)でもある。切断型の天然ＶＥＧＦは天然のＶＥＧＦに匹敵するＫＤＲ及びＦｌｔ−１レセプター結合親和性を有する。

「ＶＥＧＦ生物学的活性」には、任意のＶＥＧＦレセプターへの結合又は任意のＶＥＧＦシグナル伝達活性、例えば正常および異常な血管形成および脈管形成の調節(Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18: 4-25；Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77: 527-543)、胚性の脈管形成および血管形成の促進(Carmeliet et al. (1996) Nature 380:435-439；Ferrara et al. (1996) Nature 380:439-442)、および雌生殖管における、および骨の成長および軟骨形成のための周期的血管増殖の調節(Ferrara et al. (1998) Nature Med. 4: 336-340；Gerber et al. (1999) Nature Med. 5: 623-628)が含まれる。血管形成および脈管形成における血管新生因子であることに加えて、多面発現増殖因子としてのＶＥＧＦは、他の生理的過程、例えば内皮細胞生存、脈管透過性および血管拡張、単球走化性、およびカルシウム流入において複数の生物学的効果を示す(上掲のFerrara and Davis-Smyth (1997)、およびCebe-Suarez et al. Cell. Mol. Life Sci. 63: 601-615 (2006))。さらに、近年の研究では、わずかな内皮性以外の細胞種、例えば網膜色素上皮細胞、膵管細胞およびシュワン細胞に対するＶＥＧＦの分裂促進効果が報告されている。Guerrin et al. (1995) J. Cell Physiol. 164:385-394；Oberg-Welsh et al. (1997) Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132；Sondell et al. (1999) J. Neurosci. 19:5731-5740。

「ＶＥＧＦアンタゴニスト」又は「ＶＥＧＦ特異的アンタゴニスト」は、ＶＥＧＦへ結合、ＶＥＧＦ発現レベルの低減、又は限定するものではないが一又は複数のＶＥＧＦレセプターへのＶＥＧＦ結合及びＶＥＧＦ媒介性の血管形成及び内皮細胞生存ないし増殖を含む、ＶＥＧＦ生物活性を中和、遮断、阻害、抑止、低減又は干渉することができる分子を指す。本発明の方法に有用なＶＥＧＦ特異的アンタゴニストには、ＶＥＧＦに特異的に結合するポリペプチド、抗ＶＥＧＦ抗体及びその抗原結合性断片、ＶＥＧＦに特異的に結合することによって一又は複数のレセプターへの結合を隔離するレセプター分子及び誘導体、融合タンパク質(例として、ＶＥＧＦ-Ｔｒａｐ(Regeneron))、及びＶＥＧＦ１２１-ゲロニン(Peregine)が含まれる。また、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストには、ＶＥＧＦポリペプチドのアンタゴニスト変異体、ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも断片に相補性があるアンチセンス核酸塩基のオリゴマー、ＶＥＧＦポリペプチドをコードする核酸分子の少なくとも断片に相補性がある小ＲＮＡ、ＶＥＧＦを標的とするリボザイム、ＶＥＧＦに対するペプチボディ、及びＶＥＧＦアプタマーが含まれる。small RNAs complementary to at least a fragment of a nucleic acid molecule encoding a VEGF polypeptide;ribozymes that target VEGF;peptibodies to VEGF;and VEGF aptamers.また、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストには、ＶＥＧＦに結合し、ＶＥＧＦ生物活性を遮断、阻害、抑止、低減又は干渉することができる非ペプチド小分子が含まれる。ゆえに、「ＶＥＧＦ活性」は具体的にはＶＥＧＦのＶＥＧＦ媒介性の生物学的活性を含む。ある実施態様では、ＶＥＧＦアンタゴニストは、ＶＥＧＦの発現レベル又は生物学的活性を少なくとも１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％又はそれ以上低減するか、又は阻害する。いくつかの実施態様では、ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストによって阻害されるＶＥＧＦは、ＶＥＧＦ(８−１０９)、ＶＥＧＦ(１−１０９)又はＶＥＧＦ_１６５である。

「抗ＶＥＧＦ抗体」は、十分な親和性と特異性を有してＶＥＧＦに結合する抗体である。ある実施態様では、選択された抗体は通常、ＶＥＧＦに対して十分に強い結合親和性を有しており、例えば該抗体は１００ｎＭ〜１ｐＭのＫｄ値を有してｈＶＥＧＦを結合しうる。抗体親和性は、例えば、表面プラスモン共鳴ベースのアッセイ(例えばＰＣＴ出願公開番号ＷＯ２００５／０１２３５９に記載される、ＢＩＡｃｏｒｅアッセイ)、酵素結合免疫吸着アッセイ(ＥＬＩＳＡ)、および競合アッセイ(例えばＲＩＡのもの)で測定されてもよい。
ある実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ＶＥＧＦ活性が伴う疾患又は症状を標的および干渉する際の治療用薬剤として用いられうる。また、抗体は、例えばその治療上の有効性を評価するために、他の生物学的活性アッセイの対象とされうる。このようなアッセイは従来技術において周知であり、標的抗原と抗体の使用目的に依存する。例として、ＨＵＶＥＣ阻害アッセイ、腫瘍細胞増殖阻害アッセイ(例えば国際公開８９／０６６９２にて説明される)、抗体依存性細胞傷害活性(ＡＤＣＣ)および補体媒介性細胞障害活性(ＣＤＣ)アッセイ(米国特許第５５００３６２号)、およびアゴニスト活性又は造血アッセイ(国際公開９５／２７０６２を参照)などがある。抗ＶＥＧＦ抗体は通常、ＶＥＧＦ−Ｂ又はＶＥＧＦ−Ｃなどの他のＶＥＧＦホモログにも、ＰＩＧＦ、ＰＤＧＦ又はｂＦＧＦなどの他の増殖因子にも結合しないであろう。一実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ハイブリドーマＡＴＣＣ ＨＢ１０７０９によって産生されるモノクローナル抗ＶＥＧＦ抗体Ａ４.６.１と同じエピトープに結合するモノクローナル抗体である。他の実施態様では、抗ＶＥＧＦ抗体は、ベバシズマブ(ＢＶ；ＡＶＡＳＴＩＮ(登録商標))として知られる抗体を含むがこれに限定されない組換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体(Presta et al. (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599に従って生成されたもの)である。

「ｒｈｕＭＡｂ ＶＥＧＦ」又は「アバスチン(登録商標)」としても知られる抗ＶＥＧＦ抗体「ベバシズマブ(ＢＶ)」は、Presta et al. (1997) Cancer Res. 57: 4593-4599に従って生成された組み換えヒト化抗ＶＥＧＦモノクローナル抗体である。これは、ヒトＶＥＧＦのそのレセプターへの結合をブロックするマウス抗ｈＶＥＧＦモノクローナル抗体Ａ４.６.１由来の抗原結合相補性決定領域と変異したヒトＩｇＧ１フレームワーク領域を含有する。ほとんどのフレームワーク領域を含む、ベバシズマブのおよそ９３％のアミノ酸配列はヒトＩｇＧ１由来のものであり、配列のおよそ７％はマウス抗体Ａ４.６.１由来である。ベバシズマブは、およそ１４９０００ダルトンの分子質量であり、グリコシル化される。ベバシズマブ及び他のヒト化抗ＶＥＧＦ抗体は２００５年２月２６日発行の米国特許第６８８４８７９号にさらに記載されており、その開示内容の全体は出典明記によって明示的に本明細書中に援用される。他の好適な抗体には、ＰＣＴ出願公開ＷＯ２００５／０１２３５９に記載のような、Ｇ６又はＢ２０シリーズ抗体(例えばＧ６−３１、Ｂ２０−４．１)が含まれる。更なる好ましい抗体については、米国特許第７０６０２６９号、同第６５８２９５９号、同第６７０３０２０号；同第６０５４２９７号；国際公開９８／４５３３２；国際公開９６／３００４６；国際公開９４／１０２０２；欧州特許第０６６６８６８号Ｂ１；米国特許公開２００６００９３６０、２００５０１８６２０８、２００３０２０６８９９、２００３０１９０３１７、２００３０２０３４０９及び２００５０１１２１２６；及びPopkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)を参照のこと。他の好ましい抗体には、残基Ｆ１７、Ｍ１８、Ｄ１９、Ｙ２１、Ｙ２５、Ｑ８９、Ｉ９１、Ｋ１０１、Ｅ１０３およびＣ１０４を含むか、あるいは残基Ｆ１７、Ｙ２１、Ｑ２２、Ｙ２５、Ｄ６３、Ｉ８３およびＱ８９を含むヒトＶＥＧＦ上の機能的エピトープに結合するものを含む。

本明細書中の「抗体」は最も広義に用いられ、具体的にはモノクローナル抗体(完全長モノクローナル抗体を含む)、ポリクローナル抗体、多特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、および所望の生物学的活性を表す限りにおける抗体断片を包含する。
「ブロック(遮断)」抗体又は抗体「アンタゴニスト」は、結合する抗原の生物学的活性を阻害するか又は低減するものである。例えば、ＶＥＧＦ-特異的アンタゴニスト抗体は、ＶＥＧＦを結合し、ＶＥＧＦの血管内皮細胞増殖を誘導する能力を阻害する。好ましいブロック抗体又はアンタゴニスト抗体は、抗原の生物学的活性を完全に阻害する。
別途示さない限り、「多価抗体」なる表現は３以上の抗原結合部位を含む抗体を表すために本明細書全体を通して使用される。多価抗体は、３以上の抗原結合部位を有するように設計され、一般に天然配列のＩｇＭ又はＩｇＡ抗体ではないのが好ましい。

「Ｆｖ」は、完全な抗原-認識及び-結合部位を含む抗体断片である。この領域は、密接に関連した１本の重鎖と１本の軽鎖の可変領域の二量体からなり、これは例えばｓｃＦｖなど、天然に共有結合しうる。この構造においては、各可変ドメインの３つのＣＤＲは相互作用してＶＨ−ＶＬ二量体の表面上の抗原結合部位を特徴付けている。集合的に、６つのＣＤＲ又はそのサブセットは抗体への抗原結合特異性を与える。しかしながら、単一の可変ドメイン（又は抗原に特異的な３つのＣＤＲのみを含んでなるＦｖの半分）でさえ、通常結合部位全体よりは低い親和性であるが、抗原を認識し結合する能力を持つ。

ここで使用される「モノクローナル抗体」なる用語は、実質的に均一な抗体の集団から得られる抗体を指し、すなわち、集団に含まれる個々の抗体は、少量で存在しうる可能性がある天然に生じる突然変異を除いて同一である。モノクローナル抗体は非常に特異的であり、単一の抗原部位に対するものである。さらに、異なる決定基(エピトープ)に対する異なる抗体を典型的に含む従来の(ポリクローナル)抗体の調製物とは異なり、各モノクローナル抗体は、抗原上の単一の決定基に対するものである。「モノクローナル」との形容は、実質的に均一な抗体の集団から得られたものであるという抗体の特性を示し、抗体を何か特定の方法で生産しなければならないことを意味するものではない。例えば、本発明に従って使用されるモノクローナル抗体は、Kohler et al., Nature 256:495 (1975)に初めて記載されたハイブリドーマ法によって作製されてもよいし、組み換えＤＮＡ法(例として米国特許第４８１６５６７号)によって作製されてもよい。また、「モノクローナル抗体」は、例としてClackson et al., Nature 352:624-628 (1991)及びMarks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)に記載の技術を用いてファージ抗体ライブラリから単離されてよい。

ここでモノクローナル抗体は、特に「キメラ」抗体(イムノグロブリン)を含み、それは特定の種由来又は特定の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致する又は類似する重鎖及び／又は軽鎖の一部であり、残りの鎖は、所望の生物学的活性を表す限り、抗体断片のように他の種由来又は他の抗体クラスもしくはサブクラスに属する抗体において、対応する配列に一致するか又は類似するものである(米国特許第４８１６５６７号；及びMorrison等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。

非ヒト(例えばマウス)の抗体の「ヒト化」型は、非ヒト免疫グロブリンに由来する最小配列を含むキメラ抗体である。ほとんどのヒト化抗体は、レシピエントの高頻度可変領域の残基が、マウス、ラット、ウサギ又は所望の特異性、親和性及び／又は能力を有する非ヒト霊長類のような非ヒト種(ドナー抗体)の高頻度可変領域の残基によって置換されたヒト免疫グロブリン(レシピエント抗体)である。例として、ヒト免疫グロブリンのＦｖフレームワーク領域(ＦＲ)残基は、対応する非ヒト残基によって置換される。さらに、ヒト化抗体は、レシピエント抗体にも、もしくはドナー抗体にも見出されない残基を含んでいてもよい。これらの修飾は抗体の特性をさらに洗練するために行われる。一般に、ヒト化抗体は、全てあるいは実質的に全ての高頻度可変ループが非ヒト免疫グロブリンのものに対応し、全てあるいは実質的に全てのＦＲ領域が、ヒト免疫グロブリン配列のものである少なくとも一又は典型的には２つの可変ドメインの実質的に全てを含むであろう。また、ヒト化抗体は、場合によっては免疫グロブリン定常領域(Ｆｃ)の少なくとも一部、典型的にはヒト免疫グロブリンのものの少なくとも一部も含む。さらなる詳細については、例えばJones et al., Nature 321:522-525 (1986)；Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)；及びPresta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)を参照のこと。

「ヒト抗体」は、ヒトによって生産される抗体のアミノ酸配列に対応するアミノ酸配列を有するもの、及び／又はここで開示されたヒト抗体を製造するための何れかの技術を使用して製造されたものである。ヒト抗体のこの定義は、特に非ヒト抗原結合残基を含んでなるヒト化抗体を除く。ヒト抗体は、当該分野で知られている様々な技術を使用して生産することが可能である。一実施態様では、ヒト抗体はファージライブラリから選択される。このファージライブラリはヒト抗体を発現する(Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996)；Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95: 6157-6162 (1998)；Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)；Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991))。また、ヒト抗体は、内因性イムノグロブリン遺伝子が部分的又は完全に不活性化されているトランスジェニック動物、例えばマウスにヒトイムノグロブリン遺伝子座を導入することによって作製されうる。抗原負荷によりヒト抗体産生が観察される。これは、遺伝子再構成、アセンブリ及び抗体レパートリを含めすべての点でヒトにおいて見られるものと非常に類似している。この手法は、例えば米国特許第５５４５８０７号、同第５５４５８０６号；同第５５６９８２５号；同第５６２５１２６号；同第５６３３４２５号；同第５６６１０１６号、及び以下の科学文献：Marks et al., Bio/Technology 10: 779-783 (1992)；Lonberg et al., Nature 368: 856-859 (1994)；Morrison, Nature 368:812-13 (1994)；Fishwild et al., Nature Biotechnology 14: 845-51 (1996)；Neuberger, Nature Biotechnology 14: 826 (1996)；Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)に記載されている。あるいは、ヒト抗体は、標的抗原に対する抗体を産生するヒトＢリンパ球の不死化により調製されてよい(このＢリンパ球は個体から回収されても、インビトロで免疫化されていてもよい)。例えば、Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)；Boerner et al., J. Immunol., 147 (1): 86-95 (1991)；及び米国特許第５７５０３７３号を参照のこと。

「単離された」ポリペプチド又は「単離された」抗体は、その自然環境の成分から同定されて分離され及び／又は回収されたものを意味する。その自然環境の汚染成分は、ポリペプチド又は抗体の診断又は治療への使用を妨害しうる物質であり、酵素、ホルモン、及び他のタンパク質様又は非タンパク質様溶質を含む。好適な実施態様では、ポリペプチド又は抗体は、(1)ローリー(Lowry)法により定量したポリペプチド又は抗体の９５重量％を上回るまで、最も好ましくは９９重量％を上回るまで、(2)スピニングカップシークエネーターを使用することにより、少なくとも１５のＮ末端あるいは内部アミノ酸配列の残基を得るのに十分な程度まで、あるいは(3)クーマシーブルー又は好ましくは銀染色を用いた非還元あるいは還元条件下でのＳＤＳ-ＰＡＧＥにより均一性が得られるまで、精製される。ポリペプチドの自然環境の少なくとも一つの成分が存在しないため、単離されたポリペプチド又は抗体には、組換え細胞内にインサイツのポリペプチドが含まれる。しかしながら、通常は、単離されたポリペプチド又は抗体は、少なくとも一の精製工程により調製されるであろう。

ここで使用される「治療」とは、治療される個体又は細胞の自然の経過を変化させる試みにおける臨床的介入を意味し、予防のため、又は臨床病理経過中に実施することができる。治療の所望する効果には、疾患の発症又は再発の予防、症状の緩和、疾病の任意の直接的又は間接的な病理学的結果の減少、疾病の進行速度の低減、病状の回復又は緩和、及び寛解又は予後の改善が含まれる。ある実施態様では、本発明の方法及び組成物は、疾患又は疾病の発達を遅らせるために有用である。

「有効量」とは、所望される治療的又は予防的結果を達成するのに必要な期間、必要な用量での有効量を意味する。個体に所望する反応を引き出すための治療上の薬剤の「治療的有効量」は、病状、年齢、性別、個体の体重、及び物質／分子の能力等の要因に応じて変わり得る。また、治療的有効量は、治療上の薬剤の任意の毒性又は有害な影響を治療的に有益な効果が上回る量である。「予防的有効量」は、所望する予防的結果を達成するのに必要な期間、用量で有効な量を意味する。必ずではないが、典型的には、予防的用量は、疾病の前又は初期の段階に患者に使用されるので、予防的有効量は治療的有効量よりも少ない。前癌性、良性、初期又は後期の腫瘍の場合、血管形成インヒビターの治療上の有効量は、癌細胞の数を減少；原発性腫瘍サイズを低減；周辺臓器への癌細胞浸潤の阻害(すなわち、ある程度の遅延及び好ましくは停止)；腫瘍転移の阻害(すなわち、ある程度の遅延及び好ましくは停止)；ある程度の腫瘍増殖の阻害；及び／又は癌が関与する一又は複数の症状のある程度の軽減をしうる。薬剤が増殖を予防しうる、及び／又は既存の癌細胞を殺しうる限り、細胞分裂停止性及び／又は細胞障害性であってよい。癌治療に対しては、インビボにおける効力は、例えば生存期間、病状の進行時間(ＴＴＰ)、応答速度(ＲＲ)、応答期間、及び／又は生活の質の測定により測定される。

「短い無進行生存」とは、最初の腫瘍評価時の進行を指す。癌や腫瘍のタイプに応じて、最初の腫瘍評価は治療開始後およそ４、３、２又は１か月に行う。最初の腫瘍評価の時期は特定の疾患がどのくらい早く進行するかに依存する。一実施態様では、腎癌についての最初の腫瘍評価の時期は抗癌療法の開始後５６日目である。

「癌」及び「癌性」なる用語は、一般的に調節不可能な細胞増殖に特徴がある哺乳動物の生理学的状態を指すか又は表す。この定義には良性及び悪性の癌が含まれる。癌の例には、上皮癌、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫及び白血病が含まれるが、これらに限定されるものではない。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌、及び肺の扁平癌腫(squamous carcinoma)を含む)、腹膜の癌、肝細胞癌、胃(gastric)又は腹部(stomach)癌(消化器癌を含む)、膵臓癌、神経膠芽細胞腫、子宮頸管癌、卵巣癌、肝臓癌、膀胱癌、肝癌、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌、唾液腺癌、腎臓(kidney)又は腎(renal)癌、肝臓癌、前立腺癌、産卵口癌、甲状腺癌、肝細胞癌、及び様々なタイプの頭頸部癌、並びにＢ細胞リンパ腫(低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；小リンパ球(ＳＬ)ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度びまん性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞性ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連リンパ腫；及びワルデンストロームのマクログロブリン病を含む；慢性リンパ性白血病(ＣＬＬ)；急性リンパ芽球白血病(ＡＬＬ)；ヘアリー細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び移植後リンパ増殖性疾患(ＰＴＬＤ)、並びに、母斑症と関係する異常な血管増殖、浮腫(脳腫瘍と関係するものなど)、及びメイグス症候群が含まれる。

「被検体」又は「患者」は、ヒト又は、ウシ、ウマ、イヌ、ヒツジ又はネコといった非ヒト哺乳動物を含むがこれらに限定されない哺乳動物を意味する。好ましくは、被検体又は患者はヒトである。

「抗癌療法」なる用語は、癌を治療する際に有用な療法を指す。抗癌治療薬の例には、限定するものではないが、例えば、化学療法剤、増殖阻害剤、細胞障害剤、放射線療法に用いる薬剤、抗血管形成剤、アポトーシス剤、抗チューブリン薬剤、および癌を治療するための他の薬剤、例として、抗ＨＥＲ-２抗体、抗ＣＤ２０抗体、上皮性増殖因子レセプター(ＥＧＦＲ)アンタゴニスト(例えばチロシンキナーゼインヒビター)、ＨＥＲ１／ＥＧＦＲインヒビター(例えばエルロチニブ(Ｔａｒｃｅｖａ^ＴＭ)、血小板由来増殖因子インヒビター(例えばＧｌｅｅｖｅｃ^ＴＭ(メシル酸イマチニブ))、ＣＯＸ-２インヒビター(例えばセレコキシブ)、インターフェロン、サイトカイン、以下の標的ＶＥＧＦ、ＥｒｂＢ２、ＥｒｂＢ３、ＥｒｂＢ４、ＰＤＧＦＲ−β、ＢｌｙＳ、ＡＰＲＩＬ、ＢＣＭＡ又はＶＥＧＦレセプター(一又は複数)、ＴＲＡＩＬ／Ａｐｏ２の一又は複数に結合するアンタゴニスト(例えば中和抗体)、および他の生理活性かつ有機化学的薬剤などが含まれる。また、その組合せが本発明に包含される。

「血管形成因子又は薬剤」は、血管の発達を刺激するのに伴う、例えば脈管形成、血管内皮細胞増殖、血管の安定性および／または脈管形成などを促進する増殖因子又はそのレセプターである。例えば、血管形成因子には、例えば、ＶＥＧＦおよびＶＥＧＦファミリのメンバー及びそのレセプター(ＶＥＧＦ-Ｂ、ＶＥＧＦ-Ｃ、ＶＥＧＦ-Ｄ、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３)、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦファミリ、線維芽細胞増殖因子ファミリ(ＦＧＦ)、ＴＩＥリガンド(アンギオポイエチン、ＡＮＧＰＴ１、ＡＮＧＰＴ２)、ＴＩＥ１、ＴＩＥ２、エフリン、Ｂｖ８、デルタ様リガンド４ (ＤＬＬ４)、Ｄｅｌ-１、線維芽細胞増殖因子：酸性(ａＦＧＦ)及び塩基性(ｂＦＧＦ)、ＦＧＦ４、ＦＧＦ９、ＢＭＰ９、ＢＭＰ１０、ホリスタチン、顆粒性コロニー刺激因子(Ｇ−ＣＳＦ)、ＧＭ−ＣＳＦ、肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)／スキャッター因子(ＳＦ)、インターロイキン-８(ＩＬ-８)、ＣＸＣＬ１２、レプチン、ミドカイン、ニューロフィリン、ＮＲＰ１、ＮＲＰ２、胎盤増殖因子、血小板由来内皮細胞増殖因子(ＰＤ−ＥＣＧＦ)、血小板由来増殖因子、特にＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＤＧＦＲ−α又はＰＤＧＦＲ−β、プレイオトロフィン(ＰＴＮ)、Ｐｒｏｇｒａｎｕｌｉｎ、Ｐｒｏｌｉｆｅｒｉｎ、形質転換増殖因子-α(ＴＧＦ-α)、形質転換増殖因子-β(ＴＧＦ-β)、腫瘍壊死因子-α(ＴＮＦα)、Ａｌｋ１、ＣＸＣＲ４、Ｎｏｔｃｈ１、Ｎｏｔｃｈ４、Ｓｅｍａ３Ａ、Ｓｅｍａ３Ｃ、Ｓｅｍａ３Ｆ、Ｒｏｂｏ４などが含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、ＥＳＭ１及びパールカンといった血管形成を促す因子が含まれる。また、成長ホルモン、インスリン様増殖因子-Ｉ(ＩＧＦ−Ｉ)、ＶＩＧＦ、上皮細胞増殖因子(ＥＧＦ)、ＥＧＦ様ドメイン、マルチプル７(ＥＧＦＬ７)、ＣＴＧＦ及びそのファミリのメンバー、およびＴＧＦ−αおよびＴＧＦ−βなどの、創傷治癒を促進する因子を含むであろう。例として、Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39；Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179；Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12): 1359-1364；Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556(例えば、公知の血管形成因子の一覧を示す表１)；及びSato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206を参照。

「抗血管形成剤」、「血管形成(血管新生)インヒビター」、「抗血管新生剤」又は「血管新生インヒビター」は、直接的又は間接的に、血管新生、脈管形成又は望ましくない血管透過を阻害する、小分子量の物質、ポリヌクレオチド(例えば阻害ＲＮＡ(ＲＮＡｉ又はｓｉＲＮＡ)を含む)、ポリペプチド、単離したタンパク質、組換えタンパク質、抗体、又はそれらのコンジュゲート又は融合タンパク質を意味する。抗血管形成剤には、結合して血管形成因子又はそのレセプターの血管形成活性を遮断する薬剤が含まれることは理解されるであろう。例えば、抗血管形成剤は、上記に定義したように血管形成剤に対する抗体又は他のアンタゴニスト、例えば、ＶＥＧＦ−Ａ又はＶＥＧＦ−Ａレセプター(例えばＫＤＲレセプター又はＦｌｔ−１レセプター)に対する抗体、抗ＰＤＧＦＲインヒビター(例えばＧｌｅｅｖｅｃ(登録商標)(メシル酸イマチニブ))、ＶＥＧＦレセプターシグナル伝達を遮断する小分子(例えば、ＰＴＫ７８７／ＺＫ２２８４、ＳＵ６６６８、ＳＵＴＥＮＴ(登録商標)／ＳＵ１１２４８(sunitinib malate)、ＡＭＧ７０６、又は例えば国際公開２００４／１１３３０４に記載されるもの)である。抗血管形成剤には、限定するものではないが、以下の薬剤が含まれる。ＶＥＧＦ特異的アンタゴニストといったＶＥＧＦインヒビター、ＥＧＦインヒビター、ＥＧＦＲインヒビター、Ｅｒｂｉｔｕｘ(登録商標)(セツキシマブ、ImClone Systems, Inc., Branchburg, N.J.)、Ｖｅｃｔｉｂｉｘ(登録商標)(パニツムマブ、Amgen, Thousand Oaks, CA)、ＴＩＥ２インヒビター、ＩＧＦ１Ｒインヒビター、ＣＯＸ-ＩＩ(シクロオキシゲナーゼＩＩ)インヒビター、ＭＭＰ-２(マトリックス-メタロプロテイナーゼ２)インヒビター、及び、ＭＭＰ-９(マトリックス-メタロプロテイナーゼ９)インヒビター、ＣＰ−５４７６３２(Pfizer Inc., NY, USA)、アキシチニブ(Pfizer Inc.；ＡＧ−０１３７３６)、ＺＤ-６４７４(AstraZeneca)、ＡＥＥ７８８(Novartis)、ＡＺＤ-２１７１)、ＶＥＧＦ Ｔｒａｐ(Regeneron/Aventis)、バタラニブ(ＰＴＫ−７８７としても知られる、ＺＫ-２２２５８４：Novartis & Schering A G)、Ｍａｃｕｇｅｎ(ペガプタニブオクタソディウム、ＮＸ-１８３８、ＥＹＥ-００１、Pfizer Inc./Gilead/Eyetech)、ＩＭ８６２(Cytran Inc. of Kirkland, Wash., USA)；及び、リボザイム(Boulder, Colo.)およびカイロン(Emeryville, Calif.)からの合成リボザイムであるアンギオザイム、およびこれらの組合せ。他の血管形成インヒビターには、トロンボスポンジン１、トロンボスポンジン２、コラーゲンＩＶおよびコラーゲンXVIIIが含まれる。ＶＥＧＦインヒビターは、米国特許第６５３４５２４号および同第６２３５７６４号に開示されており、これは何れもあらゆる目的のために全体が援用される。また、抗血管形成剤には、天然の血管形成インヒビター、例えばアンジオスタチン、エンドスタチンなどが含まれる。例えば、Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39；Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179(例えば、悪性メラノーマにおける抗血管形成療法の一覧を示す表３)；Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12): 1359-1364；Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556(例えば、公知の抗血管形成因子の一覧を示す表２)；及び、Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206(例えば、臨床試験において使用される抗血管形成剤の一覧を示す表１)を参照のこと。
「抗血管形成療法」なる用語は、抗血管形成剤の投与を含む、血管新生を阻害するために有用な治療法を指す。

本明細書中で用いる「細胞障害性剤」なる用語は、細胞の機能を抑制又は阻害する、及び／又は細胞の破壊を引き起こす物質を指す。この用語は、放射性同位体(例えばＩ^１３１、Ｉ^１２５、Ｙ^９０及びＲｅ^１８６)、化学療法剤、細菌、真菌、植物又は動物起源の酵素活性毒素といった毒素、又はこれらの断片を含むことが意図される。

「化学療法剤」は、癌の治療に有用な化学的化合物である。化学療法剤の例には癌の治療に有用な化学的化合物が含まれる。化学療法剤の例には、チオテパ及びCYTOXAN(登録商標)シクロホスファミドのようなアルキル化剤；ブスルファン、インプロスルファン及びピポスルファンのようなスルホン酸アルキル類；ベンゾドーパ(benzodopa)、カルボコン、メツレドーパ(meturedopa)、及びウレドーパ(uredopa)のようなアジリジン類；アルトレートアミン(altretamine)、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホラミド、トリエチレンチオホスホラミド(triethylenethiophosphaoramide)及びトリメチローロメラミン(trimethylolomelamine)を含むエチレンイミン類及びメチラメラミン類；アセトゲニン(特にブラタシン及びブラタシノン)；カンプトセシン(合成アナログトポテカンを含む)；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ-１０６５(そのアドゼレシン、カルゼレシン及びビゼレシン合成アナログを含む)；クリプトフィシン(特にクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８)；ドラスタチン；ドゥオカルマイシン(合成アナログ、ＫＷ-２１８９及びＣＢ１-ＴＭ１を含む)；エロイテロビン；パンクラチスタチン；サルコジクチン；スポンギスタチン；クロランブシル、クロロナファジン(chlornaphazine)、チョロホスファミド(cholophosphamide)、エストラムスチン、イフォスファミド、メクロレタミン、メクロレタミンオキシドヒドロクロリド、メルファラン、ノベンビチン(novembichin)、フェネステリン(phenesterine)、プレドニムスチン(prednimustine)、トロフォスファミド(trofosfamide)、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン(chlorozotocin)、フォテムスチン(fotemustine)、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロスレアス(nitrosureas)；抗生物質、例えばエネジイン抗生物質(例えば、カリケアマイシン(calicheamicin)、特にカリケアマイシンγ１Ｉ及びカリケアマイシンωＩ１(例えばAgnew Chem Intl. Ed. Engl. 33:183-186(1994)参照)；ダイネマイシン(dynemicin)Ａを含むダイネマイシン；クロドロネートなどのビスホスホネート類；エスペラマイシン；並びにネオカルチノスタチン発色団及び関連する色素タンパクエネジイン抗生物質発色団)、アクラシノマイシン類(aclacinomysins)、アクチノマイシン、オースラマイシン(authramycin)、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン(cactinomycin)、カラビシン(carabicin)、カルミノマイシン、カルジノフィリン(carzinophilin)、クロモマイシン類、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン(detorbicin)、６-ジアゾ-５-オキソ-Ｌ-ノルロイシン、ADRIAMYCIN(登録商標)ドキソルビシン(モルホリノ-ドキソルビシン、シアノモルホリノ-ドキソルビシン、２-ピロリノ-ドキソルビシン、及びデオキシドキソルビシンを含む)、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マーセロマイシン(marcellomycin)、マイトマイシンＣのようなマイトマイシン、マイコフェノール酸(mycophenolic acid)、ノガラマイシン(nogalamycin)、オリボマイシン(olivomycins)、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン(potfiromycin)、ピューロマイシン、ケラマイシン(quelamycin)、ロドルビシン(rodorubicin)、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン(tubercidin)、ウベニメクス、ジノスタチン(zinostatin)、ゾルビシン(zorubicin)；代謝拮抗剤、例えばメトトレキセート及び５-フルオロウラシル(５-ＦＵ)；葉酸アナログ、例えばデノプテリン(denopterin)、メトトレキセート、プテロプテリン(pteropterin)、トリメトレキセート(trimetrexate)；プリンアナログ、例えばフルダラビン(fludarabine)、６-メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニン；ピリミジンアナログ、例えばアンシタビン、アザシチジン(azacitidine)、６-アザウリジン(azauridine)、カルモフール、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン(enocitabine)、フロキシウリジン(floxuridine)；アンドロゲン類、例えばカルステロン(calusterone)、プロピオン酸ドロモスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストラクトン(testolactone)；抗副腎剤、例えばアミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタン；葉酸リプレニッシャー(replenisher)、例えばフロリン酸(frolinic acid)；アセグラトン；アルドホスファミドグリコシド；アミノレブリン酸；エニルウラシル；アムサクリン(amsacrine)；ベストラブシル(bestrabucil)；ビサントレン(bisantrene)；エダトラキセート(edatraxate)；デフォファミン(defofamine)；デメコルシン(demecolcine)；ジアジコン(diaziquone)；エルフォルニチン(elfornithine)；酢酸エリプチニウム(elliptinium)；エポシロン；エトグルシド(etoglucid)；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダミン(lonidamine)；メイタンシノイド(maytansinoid)類、例えばメイタンシン(maytansine)及びアンサミトシン(ansamitocine)；ミトグアゾン(mitoguazone)；ミトキサントロン；モピダモール(mopidamol)；ニトラクリン(nitracrine)；ペントスタチン；フェナメット(phenamet)；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸(podophyllinic acid)；２-エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ(登録商標)多糖複合体(JHS Natural Products, Eugene, OR)；ラゾキサン(razoxane)；リゾキシン；シゾフィラン；スピロゲルマニウム(spirogermanium)；テニュアゾン酸(tenuazonic acid)；トリアジコン(triaziquone)；２,２',２''-トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン類(特にＴ-２毒素、ベラクリン(verracurin)Ａ、ロリジン(roridine)Ａ及びアングイジン(anguidine))；ウレタン；ビンデシン；ダカーバジン；マンノムスチン(mannomustine)；ミトブロニトール；ミトラクトール(mitolactol)；ピポブロマン(pipobroman)；ガシトシン(gacytosine)；アラビノシド(「Ａｒａ-Ｃ」)；シクロホスファミド；チオテパ；タキソイド類、例えばTAXOL(登録商標)パクリタキセル(Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, N.J.)、ABRAXANE^TM パクリタキセルのクレモフォー無添加アルブミン操作ナノ粒子製剤(American Pharmaceutical Partners, Schaumberg, Illinois)、及びTAXOTERE(登録商標)ドキセタキセル(Rhone-Poulenc Rorer, Antony, France)；クロランブシル；GEMZAR(登録商標)ゲムシタビン；６-チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；プラチナアナログ、例えばシスプラチン及びカルボプラチン；ビンブラスチン；プラチナ；エトポシド(ＶＰ-１６)；イホスファミド；マイトキサントロン；ビンクリスチン；NAVELBINE(登録商標)ビノレルビン；ノバントロン(novantrone)；テニポシド；エダトレキセート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロナート(ibandronate)；イリノテカン(Camptosar、ＣＰＴ−１１)(イリノテカンと５−ＦＵ及びロイコボリンの治療投薬計画を含む)；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチロールニチン(ＤＭＦＯ)；レチノイン酸のようなレチノイド；カペシタビン； コンブレタスタチン；ロイコボリン(ＬＶ)；オキサリプラチン治療投薬計画(ＦＯＬＦＯＸ)を含むオキサリプラチン；ＰＫＣ−α、ラルフおよびＨ−Ｒａｓ、ＥＧＦＲのインヒビター(例えば、エルロチニブ(Tarceva^TM))及び細胞増殖を低減するＶＥＧＦ−Ａ、及び上記何れかの薬学的に許容可能な塩類、酸又は誘導体が含まれる。

また、この定義には、腫瘍へのホルモン作用を調節又は抑制するように働く抗ホルモン剤、例えば、抗エストロゲン及び選択的エストロゲン受容体モジュレータ(ＳＥＲＭ)を含み、例えば、タモキシフェン(NOLVADEX(登録商標)タモキシフェンを含む)、ラロキシフェン(raloxifene)、ドロロキシフェン、４-ヒドロキシタモキシフェン、トリオキシフェン(trioxifene)、ケオキシフェン(keoxifene)、ＬＹ１１７０１８、オナプリストーン(onapristone)、及びFARESTON(登録商標)トレミフェン；副腎のエストロゲン産生を調節する酵素アロマターゼを阻害するアロマターゼ阻害剤、例えば４(５)-イミダゾール、アミノグルテチミド、MEGASE(登録商標)酢酸メゲストロール、AROMASIN(登録商標)エキセメスタン、フォルメスタニー(formestanie)、ファドロゾール、RIVISOR(登録商標)ボロゾール、FEMARA(登録商標)レトロゾール、及びARIMIDEX(登録商標)アナストロゾール；及び抗アンドロゲン、例えばフルタミド(flutamide)、ニルタミド(nilutamide)、ビカルタミド、リュープロリド及びゴセレリン；並びにトロキサシタビン(troxacitabine)(１,３-ジオキソランヌクレオシドシトシン類似体)；アンチセンスオリゴヌクレオチド、特に接着細胞の増殖に結びつくシグナル伝達経路における遺伝子の発現を阻害するもの、例えばＰＫＣ-α、Ｒａｆ、及びＨ-Ｒａｓ；リボザイム、例えばＶＥＧＦ発現インヒビター(例えばANGIOZYME(登録商標))及びＨＥＲ２発現インヒビター；遺伝子治療ワクチン、例えばALLOVECTIN(登録商標)、LEUVECTIN(登録商標)及びVAXID(登録商標)などのワクチン；PROLEUKIN(登録商標)ｒＩＬ−２；LURTOTECAN(登録商標)トポイソメラーゼ１インヒビター；ABARELIX(登録商標)ｒｍＲＨ；ビノレルビン及びエスペラミシン(米国特許第４６７５１８７号参照)、及び上記何れかの薬学的に許容可能な塩類、酸類及び誘導体類が含まれる。

「放射線療法」とは、正常に機能する能力を制限するため又は完全に細胞を破壊するために、細胞に十分な損傷を誘導する有向性のγ線又はβ線の使用を意味する。治療の用量および治継続期間を決定するためには公知の多くの方法があることは明らかであろう。典型的な治療は、１回の投与として、１日当たり１０〜２００単位(グレイ)の典型的な用量として施される。

「低減するか又は阻害する」とは、対照と比較して活性、機能および／または量を減少させる又は低減させることである。「低減するか又は阻害する」とは、好ましくは２０％以上、より好ましくは５０％以上、最も好ましくは７５％、８５％、９０％、９５％以上の全体の減少を引き起こす能力を意味する。低減又は阻害とは、治療される疾患の症状、転移の存在又はサイズ、原発性腫瘍のサイズ、又は血管形成性疾患の血管のサイズ又は数を指しうる。

「診断」なる用語は、癌の同定といった分子又は病的状態、疾患又は状態の同定を指すため、又は特定の治療投薬計画から利益を得うる癌患者の同定を指すためにここで用いられる。「予後」なる用語は、抗癌療法から臨床上の利益の可能性の予測を指すためにここで用いられる。「予測」なる用語は、患者が特定の抗癌治療に対して有利又は不利に応答する可能性を指すためにここで用いられる。一実施態様では、予測はそれらの応答の程度に関する。一実施態様では、予測は、例えば特定の治療的薬剤による治療、及び疾患の再発を伴わない一定期間の治療の後に患者が生存しているか改善しているかどうか、及び／又はその可能性に関する。本発明の予測方法は、任意の特定の患者のために最も好適な治療様式を選択することによって、治療決定を臨床的に行うことができる。本発明の予測方法は、患者が、治療投薬計画、例えば特定の治療剤や組み合わせの投与、外科的介入、ステロイド治療などを含む特定の治療投薬計画に有利に応答するかどうか、又は治療投薬計画の後に患者が長期に生存しているかどうかを予測する際の有用なツールである。

「患者の応答性」は患者への利益を示す任意のエンドポイントを使用して評価されてよく、限定するものではないが、(1)緩徐化及び完全な停止を含む、疾患進行のある程度の阻害、(2)病変サイズの減少、(3)隣接する周辺臓器及び／又は組織への疾患細胞の浸潤の阻害(すなわち、緩徐化又は完全な停止)、(4)疾患播種の阻害(すなわち、緩徐化又は完全な停止)、(5)疾患と関連する一又は複数の症状のある程度の軽減、(6)治療後の無疾患状態の期間の増加、及び／又は(7)治療後のある時点での死亡率の減少が含まれる。
「長期生存」なる用語は、治療的処置後少なくとも１年、５年、８年又は１０年間の生存を指すためにここで用いられる。

「利益」なる用語は広義の意味で用いられ、何れかの所望の効果を指し、特に本明細中で定義する臨床上の利益を包含する。
臨床上の利益は、例えば、緩徐化及び完全な停止を含む疾患進行のある程度の阻害、疾患出現及び／又は症状の数の減少、病変サイズの減少、隣接する周辺臓器及び／又は組織への疾患細胞の浸潤の阻害(すなわち、緩徐化又は完全な停止)、疾患播種の阻害(すなわち、緩徐化又は完全な停止)、必ずしもそうではないが、疾患病変の退縮又は除去となりうる自己免疫応答の減少、疾患と関連する一又は複数の症状のある程度の軽減、治療後の無疾患状態の期間、例えば無進行生存期間の増加、全生存率の増加、応答率の向上、及び／又は、治療後のある時点での死亡率の減少といった、様々なエンドポイントを評価することによって測定されうる。

II．本発明の方法
本発明は、癌を治療するための抗血管形成療法の臨床上の利点の低減と相関する特定のバイオマーカの同定にある程度基づく。ゆえに、開示された方法およびアッセイは、癌患者を治療するための適切又は有効な治療法を評価する際に有用なデータおよび情報を得るための簡便な、効率的な、及び潜在的な費用効率的な手段を提供する。例えば、癌患者は組織又は細胞試料を得るために生検が実施されるか、または、血漿試料は患者から得ることができ、試料はＰｌＧＦの発現がコントロール又は参照試料と比較して増加しているか否かを決定するために様々なインビトロアッセイによって調べられうる。発現の増加が検出される場合、患者はおそらく抗血管形成療法以外の抗癌療法、または、抗血管形成療法に加えて抗癌療法から利益を得るであろう。ゆえに、本発明は、抗血管形成療法以外の抗癌療法、または、抗血管形成療法に加えた抗癌療法から利益を得うる癌患者を識別する方法であって、患者から得た試料における胎盤増殖因子(ＰｌＧＦ)の発現レベルを検出する工程を含み、このとき参照試料と比較したときの該試料におけるＰｌＧＦの発現の増加が、該患者が抗血管形成療法以外の、または、抗血管形成療法に加えた抗癌療法から利益を得うることを示す方法を提供する。いくつかの実施態様では、試料は癌治療の開始前に患者から得られ、この試料は２８ｐｇ／ｍｌを超えるＰｌＧＦ発現レベルを有する。いくつかの実施態様では、試料は現在抗血管形成療法を受けている患者から得られ、この試料は５０ｐｇ／ｍｌを超えるＰｌＧＦ発現レベルを有する。いくつかの実施態様では、試料は血漿試料である。

本発明は、さらに、癌患者の抗血管形成療法に対する応答性を予測する方法であって、患者から得た試料におけるＰｌＧＦの発現レベルを決定することを含み、このとき参照試料と比較したときのＰｌＧＦの発現レベルの増加が、該患者が抗血管形成療法単独に応答することが少ないことを示す方法を提供する。いくつかの実施態様では、試料は癌治療の開始前に患者から得られ、この試料は２８ｐｇ／ｍｌを超えるＰｌＧＦ発現レベルを有する。いくつかの実施態様では、試料は現在抗血管形成療法を受けている患者から得られ、この試料は５０ｐｇ／ｍｌを超えるＰｌＧＦ発現レベルを有する。いくつかの実施態様では、試料は血漿試料である。また、癌患者の治療方法であって、患者に抗血管形成療法以外の抗癌療法、または、抗血管形成療法に加えて抗癌療法を投与することを含み、このとき患者から得た試料は参照試料と比較してＰｌＧＦの発現レベルの増加を示す方法も提供される。
他の態様では、本発明は、癌の治療のために治療上の有効性を最適化する方法であって、患者から得た試料におけるＰｌＧＦの発現レベルを検出することを含み、このとき参照試料と比較したときのＰｌＧＦの発現レベルの増加が、該患者が抗血管形成療法単独に応答することが少ないことを示す方法を提供する。試料は、治療の開始前に患者から得られてよい。試料は、治療の開始後の患者から得られてよい。一実施態様では、試料は、２８ｐｇ／ｍｌ以下のＰｌＧＦ発現レベルを有する。いくつかの実施態様では、試料は、抗血管形成療法によって現在治療されている患者から得られてよい。一実施態様では、試料は、５０ｐｇ／ｍｌ以下のＰｌＧＦ発現レベルを有する。いくつかの実施態様では、抗血管形成療法は、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体（例えばベバシズマブ）のようなＶＥＧＦアンタゴニストの投与をを含む。

他の態様では、本発明は、癌患者の治療方法であって、患者に抗血管形成療法を投与することを含み、このとき患者から得た試料は参照試料と比較してＰｌＧＦの低い発現レベルを示す方法を提供する。試料は、治療の開始前に患者から得られてよい。一実施態様では、試料は、２８ｐｇ／ｍｌ以下のＰｌＧＦ発現レベルを有する。いくつかの実施態様では、試料は、抗血管形成療法によって現在治療されている患者から得られてよい。一実施態様では、試料は、５０ｐｇ／ｍｌ以下のＰｌＧＦ発現レベルを有する。いくつかの実施態様では、抗血管形成療法は、例えば、抗ＶＥＧＦ抗体（例えばベバシズマブ）のようなＶＥＧＦアンタゴニストの投与をを含む。
本発明の方法は、癌患者を包含する。癌は、例えば、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫および／または白血病であってよい。このような癌のより具体的な例には、扁平細胞癌、肺癌(小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺の腺癌および肺の扁平上皮癌を含む)、腹膜の癌、肝細胞性癌、胃又は胃癌(胃腸癌を含む)、膵癌、神経膠芽腫、子宮頸癌、卵巣癌、肝癌、膀胱癌、肝腫瘍、乳癌、大腸癌、結腸直腸癌、子宮内膜又は子宮癌腫、唾液腺癌腫、腎又は腎臓癌、肝癌、前立腺癌、外陰部癌、甲状腺癌、肝癌および様々なタイプの頭頸部癌、並びにＢ細胞リンパ腫(低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫(ＮＨＬ)；小リンパ球(ＳＬ) ＮＨＬ；中悪性度／濾胞性ＮＨＬ；中悪性度広汎性ＮＨＬ；高悪性度免疫芽細胞ＮＨＬ；高悪性度リンパ芽球ＮＨＬ；高悪性度小型非切れ込み核細胞性ＮＨＬ；巨大腫瘤病変ＮＨＬ；マントル細胞リンパ腫；エイズ関連のリンパ腫；及び ワルデンシュトレームマクログロブリン血症を含む)；慢性リンパ球性白血病(ＣＬＬ)；急性リンパ芽球性白血病(ＡＬＬ)；線毛細胞白血病；慢性骨髄芽球性白血病；及び、移植後リンパ増殖性疾患(ＰＴＬＤ)、並びに母斑症関連の異常な血管増殖、浮腫(脳腫瘍と関係するものなど)又はメイグス症候群が含まれる。一実施態様では、癌は腎細胞癌腫である。

標的バイオマーカーを含む試料は、当分野で周知の、目的の癌の種類や位置に適切である方法によって得られうる。組織生検は、癌性組織の代表的な部分を得るために用いられることが多い。あるいは、細胞は、目的の癌細胞を含むことがわかっているか又はそう考えられている組織／体液の形で間接的に得られうる。例えば、癌性病変の試料は、切除術、気管支鏡検査法、細針吸引、気管支のブラッシングによって、又は痰、胸膜液又は血液から得られてよい。遺伝子又は遺伝子産物は、癌又は腫瘍組織から、または、尿、痰、血清又は血漿といった他の身体試料から検出されうる。癌性試料における標的遺伝子又は遺伝子産物の検出について先に述べたのと同じ技術は、他の身体試料に適用されてよい。癌細胞は、癌病変部からはがれ落ち、前記身体試料に出現しうる。前記の身体試料のスクリーニングによって、これら癌について単一の早期診断法が達成されうる。さらに、治療の経過は、前記の身体試料を標的遺伝子又は遺伝子産物について試験することによって、より容易にモニターされうる。
癌細胞のための組織調製物の濃縮手段は当分野で公知である。例えば、組織は、パラフィン又はクリオスタット切片から単離してよい。また、癌細胞はスローサイトメトリー又はレザーキャプチャ切除法によって正常細胞から分離してよい。これら、並びに正常細胞から癌性細胞を分離するための技術は当分野で周知である。癌組織が正常細胞とひどく混ざり合っている場合、混入及び／又は偽陽性／陰性結果を最小限にするための技術は公知であるが、特徴となる遺伝子又はタンパク質の発現プロファイルの検出はより困難であり、これらのいくつかは本明細書中の以下に記載する。例えば、試料は、目的のの癌細胞と関連しているが対応する正常細胞とは関連していない(その逆もそうである)ことがわかっているバイオマーカーの存在について評価してよい。

本発明の方法において、哺乳動物の組織又は細胞の試料は、採取され、一又は複数のバイオマーカ(例えばＰｌＧＦ)の発現について調べられる。試料中の様々なバイオマーカーの発現は、当分野で公知であり当業者に理解される多くの方法によって分析することができ、その方法には、免疫組織化学及び／又はウェスタンブロット分析、免疫沈降法、分子結合アッセイ、ＥＬＩＳＡ、ＥＬＩＦＡ、蛍光標識細胞分取(ＦＡＣＳ)など、定量的血液ベースのアッセイ(例えば、血清ＥＬＩＳＡ)(例えば、タンパク質発現のレベルを調べるためのもの)、生化学酵素活性アッセイ、インサイツハイブリダイゼーション、ｍＲＮＡのノーザン分析及び／又はＰＣＲ分析、並びに遺伝子及び／又は組織アレイ分析によって行われうる多種多様なアッセイの何れか一つが含まれるが、これらに限定するものではない。遺伝子の状態及び遺伝子産物を評価するための典型的なプロトコールは、例えばAusubel 等 編集, 1995, Current Protocols In Molecular Biology中のユニット２(ノーザンブロッティング)、４(サザンブロッティング)、１５(イムノブロッティング)及び１８(ＰＣＲ分析)にみられる。Rules Based Medicine又はMeso Scale Discovery (MSD)から入手可能なものなどの多重免疫アッセイも使用されてよい。
本発明のいくつかの実施態様では、試料中の標的タンパク質の発現は、免疫組織化学及び染色プロトコールを使用して調べられる。組織切片の免疫組織化学的染色は、試料中のタンパク質の存在を評価するか又は検出する確実な方法であることが示されている。免疫組織化学(「ＩＨＣ」)技術は、一般に色素生産性又は蛍光性の方法によってインサイツの細胞抗原をプローブし可視化するために抗体を利用する。

試料調整のために、哺乳動物(一般的にヒト患者)からの組織又は細胞試料が使われてよい。試料の例には、組織生検、血液、肺吸引物、痰、リンパ液、血漿などが含まれるが、これらに限定されるものではない試料は、外科的切除、吸引又は生検を含むがこれらに限らず当分野で公知である様々な手順によって得られうる。組織は、新鮮でもよいし凍結されていてもよい。一実施態様では、試料は、固定して、パラフィン等に包埋される。
前記組織試料は従来の方法によって固定(すなわち保存)されてもよい(例として、“Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology,” 3^rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.を参照)。当分野の技術者は、組織学的染色ないしは他の分析に供する試料の目的に応じて固定液を選択することは理解するところであろう。また、当分野の技術者は、組織試料の大きさ及び用いる固定液に応じて固定の長さを決定することも理解するであろう。実施例では、中性緩衝ホルマリン、ブアン固定液又はパラホルムアルデヒドを用いて試料を固定してもよい。

通常、まず試料を固定し、次いで段階的に増加させたアルコールによって、脱水し、パラフィン又は他の切片溶液に浸透させて包埋し、組織試料を切断できるようにする。別法として、組織を切断して、得られた切片を固定してもよい。例として、従来の方法によって、組織試料を包埋して、パラフィンで処理してもよい(例として、上掲の"Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology"を参照)。使用されうるパラフィンの例として、Paraplast、Broloid及びTissuemayがあるが、これらに限定するものではない。組織試料を包埋すると、試料をミクロトーム等によって、切断してもよい(例として、上掲の"Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology"を参照)。この手順の例として、切片はおよそ３ミクロンからおよそ５ミクロンの範囲の厚さでよい。切断すると、いくつかの標準的な方法によって、切片をスライドに付着させてもよい。スライド接着剤の例として、シラン、ゼラチン、ポリ‐Ｌ‐リジンなどがあるが、これに限定されるものではない。例として、パラフィン包埋切片は、正に荷電したスライド及び／又はポリ‐Ｌ‐リジンでコートしたスライドに付着させてもよい。

包埋材料としてパラフィンを用いた場合、組織切片は通常、脱パラフィン化して、水に再水和させる。組織切片は、いくつかの従来の標準的な方法によって、脱パラフィン化してもよい。例えば、キシレン及び段階的に減少するアルコールを用いてもよい(例として、上掲の"Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology"を参照)。別法として、Ｈｅｍｏ-Ｄｅ７(CMS, Houston, Texas)などの市販の脱パラフィン化非有機薬剤が用いられてもよい。
場合によって、試料の調整の後に、組織切片をＩＨＣを用いて分析してもよい。ＩＨＣは、形態学的染色及び／又は蛍光発光インサイツハイブリダイゼーションなどの付加的な技術と組み合わせて行ってもよい。ＩＨＣの直接アッセイ及び間接アッセイの２つの一般的な方法が有用である。第一のアッセイでは、標的抗原に対する抗体の結合は、直接的に測定される。この直接アッセイは、更なる抗体相互作用を必要とせずに可視化されうる酵素標識一次抗体又は蛍光タグ付加一次抗体などの標識された試薬を用いる。代表的な間接アッセイでは、コンジュゲートしていない一次抗体が抗原と結合し、次いで標識された二次抗体が一次抗体と結合する。二次抗体が酵素標識にコンジュゲートする場合、抗原を視覚化させるために色素生産性基質ないしは蛍光発生基質が加えられる。二次抗体の中には一次抗体上の異なるエピトープと反応するものもあるので、シグナルの増幅が起こる。

一般的に、免疫組織化学に使用する一次及び／又は二次抗体は、検出可能な成分にて標識されるであろう。通常、以下の種類に分類できる多くの標識が利用可能である：
(ａ)ラジオアイソトープ、例えば^３５Ｓ、^１４Ｃ、^１２５Ｉ、^３Ｈ及び^１３１Ｉ。抗体は例えばImmunology, Volumes 1 and 2, Coligen 等, 編集 Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)のＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに記載される技術を用いて放射性同位体にて標識することができ、放射能はシンチレーション計測器を用いて測定することができる。
(ｂ)コロイド金粒子
(ｃ)希有土類キレート(ユウロピウムキレート)、テキサスレッド、ローダミン、フルオレセイン、ダンシル、リサミン、ウンベリフェロン、フィコクリセリン(phycocrytherin)、フィコシアニン又はＳＰＥＣＴＲＵＭ ＯＲＡＮＧＥ7及びＳＰＥＣＴＲＵＭ ＧＲＥＥＮ7などの市販の蛍光体及び／又は上記の何れか一ないしは複数の誘導体を含むが、これらに限定されるものではない蛍光標識。蛍光標識は、例えば、上記のＩｍｍｕｎｏｌｏｇｙのＣｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓに開示される技術を用いて抗体にコンジュゲートすることができる。蛍光は、蛍光計を用いて定量化することができる。
(ｄ)様々な酵素基質標識が利用可能であり、米国特許第４,２７５,１４９号にはこの概説がある。一般に、酵素は、様々な技術を用いて測定することができる色素生産性基質の化学変化を触媒する。例えば、酵素は、分光測光法で測定することができる基質の変色を触媒するかもしれない。あるいは、酵素は、基質の蛍光又は化学発光を変えうる。蛍光の変化を定量化する技術は上記の通りである。化学発光基質は、化学反応によって電子的に励起され、測定することができる(例えば化学発光計測器を用いて)か、又はエネルギーを蛍光アクセプターに与える光を発しうる。酵素標識の例には、ルシフェラーゼ(例えば、ホタルルシフェラーゼ及び細菌ルシフェラーゼ；米国特許第４,７３７,４５６号)、ルシフェリン、2,3-ジヒドロフタルアジネジオン(dihydrophthalazinediones)、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ウレアーゼ、西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰＯ)などのペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシダーゼ、グルコアミラーゼ、リソチーム、サッカライドオキシダーゼ(例えばグルコースオキシダーゼ、ガラクトースオキシダーゼ及びグルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ)、複素環のオキシダーゼ(例えばウリカーゼ及びキサンチンオキシダーゼ)、ラクトペルオキシダーゼ、ミクロペルオキシダーゼなどが含まれる。抗体に酵素をコンジュゲートする技術は、O'Sullivanら., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed J. Langone & H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)に記載されている。

酵素基質の組合せの例には、例えば以下のものが含まれる：
(i)基質として水素ペルオキシダーゼを有する西洋わさびペルオキシダーゼ(ＨＲＰＯ)、ここで水素ペルオキシダーゼが染料前駆体(例えば、オルソフェニレン(orthophenylene)ジアミン(ＯＰＤ)又は3,3',5,5'テトラメチルのベンジジン塩酸塩(ＴＭＢ))を酸化する；
(ii)色素生産性基質としてリン酸パラグラフ-ニトロフェニルを有するアルカリホスファターゼ(ＡＰ)；及び
(iii)色素生産性基質(例えばｐ-ニトロフェニル-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ)又は蛍光発生基質(例えば、4-メチルウンベリフェリル(methylumbelliferyl)-β-Ｄ-ガラクトシダーゼ)を有するβ-Ｄ-ガラクトシダーゼ(β-Ｄ-Ｇａｌ)。
多数の他の酵素基質の組合せは当業者にとって利用可能である。これらの一般的な概要については、米国特許第４２７５１４９号及び４３１８９８０を参照。標識は、抗体と間接的にコンジュゲートされることがある。これを行うための様々な技術は当分野の技術者に公知である。例えば、抗体は、ビオチンとコンジュゲートさせることができ、前述した大きな４つの分類のうちの何れかはアビジンとコンジュゲートさせることができ、その逆もまた可能である。ビオチンは選択的にアビジンと結合し、したがって、標識はこの間接的な方法で抗体にコンジュゲートさせることができる。あるいは、抗体と標識を間接的にコンジュゲートさせるために、抗体は小ハプテンとコンジュゲートさせ、前述した標識の異なるタイプのうちの１つは抗ハプテン抗体とコンジュゲートさせる。したがって、抗体と標識は間接的にコンジュゲートすることができる。

上記の試料調製手順以外に、ＩＨＣ前、ＩＨＣの間又はＩＨＣ後に組織切片の更なる処置が所望されてもよい。例えば、クエン酸塩バッファ中で組織サンプルを加熱するなどのエピトープ検索方法が実施されてもよい(例として、Leong 等 Appl. Immunohistochem. 4(3): 201 (1996)を参照)。
場合によって行うブロック処置の後に、一次抗体が組織試料中の標的タンパク質抗原と結合するような好適な条件下と十分な時間、組織切片を一次抗体に曝露させる。これを達成するための好適な条件は慣例的な実験によって決定できる。試料に対する抗体の結合の範囲は、上記の検出可能な標識の何れか一つを用いて決定される。好ましくは、標識は、3,3'-ジアミノベンジジンクロモゲンなどの色素生産性基質の化学変化を触媒する酵素標識(例えばＨＲＰＯ)であることが望ましい。好ましくは、酵素標識は、一次抗体(例えば、一次抗体はウサギポリクローナル抗体であり、二次抗体はヤギ抗ウサギ抗体である)に特異的に結合する抗体にコンジュゲートさせる。したがって、調製される検査材料はマウントしてカバーグラスをかけてもよい。その後、例えば顕微鏡を使用してスライドの評価を行い、当分野で通常用いられる染色強度判定基準を用いてもよい。

別法では、試料を、抗体-バイオマーカー複合体が形成するために十分な条件下で該バイオマーカーに特異的な抗体と接触させ、次いで該複合体を検出してもよい。バイオマーカーの存在は、多くの方法、血漿又は血清を含む多種多様な組織及び試料を検定するためのウエスタンブロッティング及びＥＬＩＳＡ手順において検出されてよい。このようなアッセイ様式を用いた広範囲にわたるイムノアッセイ技術は利用可能である。米国特許第４０１６０４３号、同第４４２４２７９号及び同第４０１８６５３号参照。これらには、単一の部位及び２-部位の両方、あるいは非競合型の「サンドイッチ」アッセイ、並びに従来の競合的結合アッセイが含まれる。また、これらのアッセイには、標的バイオマーカーに対する標識抗体の直接結合が含まれる。
サンドイッチアッセイは最も有用なものの一つで、一般的に用いられるアッセイである。サンドイッチアッセイ技術には多くのバリエーションあり、そのすべては本発明により包含されることを目的とする。簡潔には、代表的な最近のアッセイでは、非標識抗体を固体基板上に固定して、試験する試料を結合した分子に接触させる。抗体-抗原複合体が形成されるくらいの適当な期間インキュベートした後、検出可能なシグナルを産生できるレポーター分子で標識した、抗原特異的な第二抗体を添加して、更なる抗体-抗原-標識抗体の複合体が形成されるために十分な時間インキュベートする。反応しなかった材料を洗い流し、レポーター分子により産生されるシグナルを観察することによって抗原の存在を決定する。結果は、可視的なシグナルを単純に観察したものであれば質的なものであり、バイオマーカーを既知量含有するコントロール試料と比較したものであれば量的なものである。

前記のアッセイへのバリエーションには、試料及び標識抗体の両方を結合した抗体に同時に添加する同時アッセイなどがある。これらの技術は当分野の技術者には公知であり、多少のバリエーションが加えられることは容易に明らかであろう。代表的な近年のサンドイッチアッセイでは、バイオマーカーに対して特異性を有する第一抗体は固形表面に共有結合するか受動的に結合する。固形表面は一般的にガラス又はポリマーであり、最も一般的に用いられるポリマーはセルロース、ポリアクリルアミド、ナイロン、ポリスチレン、ポリ塩化ビニル又はポリプロピレンである。固形支持体は、チューブ、ビーズ、マイクロプレートの皿、又はイムノアッセイを行うために適切な他の任意の表面の形態でもあってもよい。結合方法は従来技術において周知であり、一般に、架橋性共有結合又は物理的な吸着から成り、ポリマー-抗体複合体は試験試料の調整において洗浄される。次いで、試験される試料の分割量を固相複合体に添加し、抗体中に存在する任意のサブユニットが結合するために十分な時間(例えば、より便利であるならば２〜４０分又は前夜)と適切な条件(例えば室温から４０℃、例えば２５℃から３２℃の間)下でインキュベートする。インキュベーションの後、抗体サブユニット固相を洗浄して、乾燥させ、一部のバイオマーカーに特異的な二次抗体とともにインキュベートする。二次抗体は、分子マーカーへの二次抗体の結合を表すために用いられるレポーター分子に結合させる。
別法では、試料中の標的バイオマーカーを固定して、その後レポーター分子にて標識しているか又は標識していない特異的抗体に固定された標的を曝すことを伴う。標的の量及びレポーター分子シグナルの強度に応じて、結合した標的は、抗体で直接標識することによって、検出可能でありうる。あるいは、一次抗体に特異的な二次標識抗体を標的-一次抗体複合体に曝して、標的-一次抗体-二次抗体の三位複合体を形成させる。複合体は、レポーター分子により発されるシグナルにより検出される。本明細書中で用いられる「レポーター分子」は、その化学的性質によって、抗原と結合した抗体を検出するための分析して同定可能となるシグナルを提供する分子を意味する。この種のアッセイにおいて、最も一般的に用いられるレポーター分子は、酵素、蛍光体又は分子を含有する放射性核種(すなわち放射性同位体)及び化学発光分子である。

酵素イムノアッセイの場合、一般にグルタールアルデヒド又は過ヨウ素酸塩によって、酵素を二次抗体にコンジュゲートさせる。しかしながら、容易に認識されるように、技術者に容易に利用可能である多種多様な異なるコンジュゲート技術が存在する。一般的に用いられる酵素には、西洋わさびペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ−中でもガラクトシダーゼ及びアルカリホスファターゼなどがある。特定の酵素と共に用いられる基質は、一般的に、対応する酵素による加水分解の際に生じる検出可能な色の変化で選択する。適切な酵素の例として、アルカリホスファターゼやペルオキシダーゼなどがある。また、上記の色素生産性基質よりも蛍光性産物を産生する蛍光性基質を用いることができる。すべての例において、酵素標識抗体を一次抗体-分子マーカー複合体に加えて、結合させ、次いで過剰な試薬を洗い流す。次いで、適当な基質を含有する溶液を抗体-抗原-抗体の複合体に加える。基質は二次抗体と結合した酵素と反応して、通常は分光測定法による量的なものでもある定性的な可視化シグナルを生じ、試料中に存在するバイオマーカーの量を表す。あるいは、フルオレセイン及びローダミンなどの蛍光性化合物を、抗体の結合能を変化させることなく抗体に化学的に結合させてもよい。特定の波長の光を照射することにより活性化されると、蛍光色素標識抗体はその光エネルギーを吸収し、それによリその分子において励起状態が誘発され、続いて光学顕微鏡を用いて目視で検出可能な特徴的な色で光が放射される。ＥＩＡでは、蛍光標識抗体は、一次抗体-分子マーカー複合体に結合できる。結合していない試薬を洗い落とした後に、残りの三位複合体を適当な波長の光に曝すと、対象の分子マーカーの存在を示す蛍光発光が観察される。免疫蛍光法及びＥＩＡ技術は何れも、当分野で非常に確立されたものである。しかしながら、放射性同位体、化学発光性分子又は生物発光性分子などの他のレポーター分子も用いられてもよい。
また、上記の技術が、ＰｌＧＦの発現を検出するために用いられうることも包含される。

本発明の方法は、組織、細胞又は血漿試料中のＰｌＧＦ ｍＲＮＡレベルの存在及び／又は発現を調べる手順を更に含む。細胞中のｍＲＮＡの評価方法は公知であり、例えば、相補的ＤＮＡプローブを用いたハイブリダイゼーションアッセイ(例えば、ＰｌＧＦに特異的な標識リボプローブを用いたインサイツハイブリダイゼーション、ノーザンブロット及び関連した技術)及び様々な核酸増幅アッセイ(例えば、ＰｌＧＦに特異的な相補的プライマーを用いたＲＴ-ＰＣＲ及び、他の増幅型の検査法、例えば枝分れＤＮＡ、ＳＩＳＢＡ、ＴＭＡなど)が含まれる。
哺乳動物の組織、細胞又は血漿試料は、ノーザン、ドットブロット又はＰＣＲ分析を用いて、ｍＲＮＡについて都合よくアッセイすることができる。例えば、定量的ＰＣＲアッセイなどのＲＴ-ＰＣＲアッセイは公知技術である。本発明の例示的実施態様では、生体試料中の標的のｍＲＮＡの検出方法は、少なくとも一のプライマーを用いて逆転写によって、試料からｃＤＮＡを生成し、標的ｃＤＮＡを増幅するために、標的ポリヌクレオチドをセンスプライマー及びアンチセンスプライマーとして用いて産生された該ｃＤＮＡを増幅し、そして、増幅された標的ｃＤＮＡの存在を検出することを含む。加えて、このような方法は、生体試料中の標的ｍＲＮＡのレベルを決定し得る一ないし複数の工程(例えば、アクチンファミリーメンバーなどの「ハウスキーピング」遺伝子のコントロールｍＲＮＡ配列と該レベルを同時に検討すること)を含んでもよい。場合によって、増幅された標的ｃＤＮＡの配列を決定してもよい。

本発明の任意の方法には、マイクロアレイ技術によって、組織、細胞又は血漿試料中のｍＲＮＡ、例えば標的ｍＲＮＡを調べるか又は検出する手順が含まれる。核酸マイクロアレイを用いて、試験及びコントロール試料から得た試験及びコントロールのｍＲＮＡ試料を逆転写させて、ｃＤＮＡプローブを生成するために標識する。次いで、プローブを、固形支持体に固定した核酸のアレイにハイブリダイズさせる。アレイの配列及び各々のメンバーの位置がわかるように、アレイを設定する。例えば、その発現が抗血管形成治療の臨床上の利益の増加又は減少と相関している遺伝子の選択を、固形支持体上に配してよい。特定のアレイメンバーと標識プローブとのハイブリダイゼーションは、プローブが由来する試料がその遺伝子を発現することを示す。疾患組織の差次的遺伝子発現分析は、貴重な情報を提供する。マイクロアレイ技術は、単一の実験で何千もの遺伝子のｍＲＮＡ発現性質を評価するために、核酸ハイブリダイゼーション技術及び演算技術を利用する。(２００１年１０月１１日公開の国際公開公報０１／７５１６６を参照、(例えば米国特許第５７００６３７号、同第５４４５９３４号及び同第５８０７５２２号、Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996)）、アレイ製作の考察のためにはCheung, V.G.等, Nature Genetics 21(Suppl): 15-19 (1999)を参照)。ＤＮＡマイクロアレイは、ガラス又は他の基質上で染色されるか直接合成される遺伝子断片を含有する微小なアレイである。何千もの遺伝子は、通常単一のアレイ上に現れる。代表的なマイクロアレイ実験は以下の工程を伴う：１．試料から単離したＲＮＡからの蛍光性標識標的の調製、２．マイクロアレイへの標識した標的のハイブリダイゼーション、３．洗浄、染色及びアレイのスキャニング、４．走査画像の分析、そして５．遺伝子発現性質の生成。一般に、ＤＮＡマイクロアレイには２つの主要な種類、ｃＤＮＡから調製されたＰＣＲ産物を含有する遺伝子発現アレイ及びオリゴヌクレオチドアレイ(通常２５〜７０マー)が用いられる。アレイを形成する際に、オリゴヌクレオチドは、事前に作製して表面にスポットしても、(インサイツで)表面上で直接合成してもよい。

Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ ＧｅｎｅＣｈｉｐ(登録商標)システムは、ガラス表面上でオリゴヌクレオチドを直接合成することにより製造されるアレイを含んでなる市販のマイクロアレイシステムである。プローブ／遺伝子アレイ：オリゴヌクレオチド（通常２５マー）は、半導体ベースのフォトリソグラフィーと固相化学合成技術との組合せによって、ガラスウェーハ上へ直接合成される。各々のアレイは最高４００，０００の異なるオリゴを含有し、各々のオリゴは何百万ものコピーで存在する。オリゴヌクレオチドプローブがアレイ上の既知の位置で合成されるので、ハイブリダイゼーションのパターン及びシグナル強度は、Ａｆｆｙｍｅｔｒｉｘ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅソフトウェアによる遺伝子同一性と相対的な発現レベルに置き換えて解釈できる。各々の遺伝子は、一連の異なるオリゴヌクレオチドプローブによって、アレイ上に表される。各々のプローブ対は、完全一致のオリゴヌクレオチドと、不一致のオリゴヌクレオチドからなる。完全一致プローブは、特定の遺伝子に対して完全に相補的な配列を有するため、遺伝子の発現を測定する。不一致プローブは、中心塩基位置での単一塩基置換によって、完全一致プローブとは異なり、標的遺伝子転写物の結合を妨げる。これによって、完全一致オリゴを決定するシグナルの一因となるバックグラウンド及び非特異的ハイブリダイゼーションを決定できる。Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅソフトウェアは、完全一致プローブのハイブリダイゼーション強度から不完全一致プローブのハイブリダイゼーション強度を減算して、それぞれのプローブセットの絶対値又は特異的強度の値を決定する。プローブは、Ｇｅｎｂａｎｋ及び他のヌクレオチド貯蔵所の当時の情報に基づいて選択される。この配列は遺伝子の３'末端の特定の領域を認識すると思われている。ＧｅｎｅＣｈｉｐハイブリダイゼーションオーブン(「回転式(rotisserie)」オーブン)を用いて、一度に最高６４アレイのハイブリダイゼーションを行う。ｆｌｕｉｄｉｃｓ ｓｔａｔｉｏｎでは、プローブアレイの洗浄と染色が行われる。これは完全に自動化しており、４つのモジュールを含有しており、その各々のモジュールが一つのプローブアレイを保持している。各々のモジュールは、事前にプログラム化されたfluidicsプロトコルを用いたＭｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅソフトウェアにより個々に制御される。スキャナは、プローブアレイ結合した標識ｃＲＮＡにより発される蛍光強度を測定する共焦点レーザー蛍光発光スキャナである。Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅソフトウェアを有するコンピュータワークステーションがｆｌｕｉｄｉｃｓ ｓｔａｔｉｏｎとスキャナを制御する。Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ Ｓｕｉｔｅソフトウェアは、プローブアレイについて事前にプログラム化したハイブリダイゼーション、洗浄及び染色プロトコルを用いてｆｌｕｉｄｉｃｓ ｓｔａｔｉｏｎを８つまで制御できる。また、ソフトウェアは、ハイブリダイゼーション強度データを得て、適切なアルゴリズムを使用して各々の遺伝子の存在／非存在情報に変換する。最後に、ソフトウェアは、比較分析によって、遺伝子発現における実験間の変化を検出して、テキストファイルに出力する。このファイルは更なるデータ分析のために他のソフトウェアプログラムに用いることができる。

また、組織又は細胞試料中の選択したバイオマーカーの発現は、機能的なアッセイ又は活性に基づくアッセイにより検査されてもよい。例えば、バイオマーカーが酵素である場合、組織又は細胞試料中の所定の酵素の存在を決定又は検出するために公知技術のアッセイを行ってもよい。

本発明のキットは多くの実施態様を有する。典型的な実施態様は、容器と、該容器上のラベルと、該容器内に収容される組成物を具備するキットであり、この場合の組成物はＰｌＧＦに結合する一次抗体を含有するものであり、該容器上のラベルは、該組成物を用いて少なくとも一種類の哺乳動物細胞中のＰｌＧＦの存在を評価することができることと、少なくとも一種類の哺乳動物細胞中のＰｌＧＦの存在を評価するための抗体の使用についての指示書を示すものである。さらに、キットは、組織、細胞又は血漿試料を調整して組織、細胞又は血漿試料の同一片に抗体及びプローブを適用するための一組の指示書と材料を具備しうる。キットは、一次抗体と、酵素標識などの標識にコンジュゲートしている二次抗体の両方を具備してもよい。

他の実施態様は、容器と、該容器上のラベルと、該容器内に収容される組成物を具備するキットであり、この場合の組成物はストリンジェントな条件下でＰｌＧＦにハイブリダイズする一又は複数のポリヌクレオチドを含有するものであり、該容器上のラベルは、該組成物を用いて少なくとも一種類の哺乳動物細胞又は血漿におけるＰｌＧＦの存在を評価することができることと、少なくとも一種類の哺乳動物細胞又は血漿におけるＰｌＧＦのＲＮＡ又はＤＮＡの存在を評価するためのポリヌクレオチドの使用についての指示書を示すものである。
キットの他の任意の成分には、一又は複数のバッファ(例えばブロックバッファ、洗浄バッファ、基質バッファなど)、酵素標識によって化学的に変化する基質などの他の試薬(例えば色素原)、エピトープ探索溶液、コントロール試料(ポジティブコントロール及び／又はネガティブコントロール)、コントロールスライド(一ないし複数)などがある。

本発明の方法のために、抗癌療法剤、抗血管形成剤及び／又は化学療法剤は、ヒト患者に、周知の方法、例えば、ボーラスとして又は所定時間に渡る連続注入による静脈内投与、筋肉内、腹膜内、脳脊髄内、皮下、関節間、滑膜内、鞘内、経口、局所、又は吸入経路などにより投与される。抗体の静脈内ないし皮下投与が好ましい。
本発明の治療は、抗ＶＥＧＦ抗体および一又は複数の化学療法剤の併用投与を伴ってよい。本発明は、異なる化学療法剤の反応混液の投与が考慮される。併用投与には、異なる製剤又は単一の薬物製剤を用いた同時投与、および何れかの順序での連続投与が含まれ、このとき、両方(又はすべて)の活性薬剤が同時にそれらの生物活性を示す期間があることが好ましい。 化学治療剤の調製と用量スケジュールは、製造者の指示書に従って使用されるか、熟練した実務者により経験的に決定されて使用される。また、化学治療の調製と用量スケジュールは、Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992)にも記載されている。化学療法剤は、抗体の投与の前でも後でもよく、同時であってもよい。

疾患の予防又は治療のために、抗癌療法剤又は抗血管形成剤の好適な用量は、前記のような治療する疾患のタイプ、疾患の重症度及び経過、抗体を予防目的で投与するか治療目的で投与するか、以前の治療法、患者の病歴及び薬剤への応答性、及び担当医師の判断に依存するであろう。薬剤は一時的又は一連の治療にわたって好適に患者に投与される。併用療法投薬計画において、本発明の組成物は、治療的に有効であるか相乗的な量で投与される。いくつかの実施態様では、抗血管新生剤は、ＶＥＧＦアンタゴニスト、例えばベバシズマブ等の抗ＶＥＧＦ抗体である。 疾患のタイプ及び重症度に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜５０ｍｇ／ｋｇ（例えば０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ）の抗体が、例えば一又は複数の分割投与又は連続注入による患者投与の初期候補用量である。ある典型的な１日量は、上記の要因に応じて、約１μｇ／ｋｇ〜約１００ｍｇ／ｋｇ以上の範囲であろう。症状に応じて、数日間以上にわたる繰り返し投与は、所望の疾患症状の抑制が得られるまで持続する。しかしながら他の用量処方が有用であるかもしれない。好適な態様では、本発明の抗体は約５ｍｇ／ｋｇから約１５ｍｇ／ｋｇの範囲の用量で２ないし３週毎に投与される。より好ましくは、そのような用量計画は転移性結腸直腸癌の治療の第一の選択療法として化学療法計画と併用して使用される。ある態様では、化学療法計画は伝統的な高用量間欠投与を含む。ある他の態様では、化学療法剤は、予定の中断なしにより少量でより頻繁な用量を用いて投与される（「メトロノーム(metronomic)化学療法」）。本発明の治療法の進行は、常套的な技術及びアッセイで容易に監視される。
いくつかの実施態様では、本発明の方法で使用する抗ＶＥＧＦ抗体はベバシズマブである。ある種の実施態様では、例えば、併用されるとき、ベバシズマブはおよそ０．０５ｍｇ／ｋｇからおよそ１５ｍｇ／ｋｇで投与される。一実施態様では、およそ０．５ｍｇ／ｋｇ、１．０ｍｇ／ｋｇ、２．０ｍｇ／ｋｇ、３．０ｍｇ／ｋｇ、４．０ｍｇ／ｋｇ、５．０ｍｇ／ｋｇ、６．０ｍｇ／ｋｇ、７．０ｍｇ／ｋｇ、７．５ｍｇ／ｋｇ、８．０ｍｇ／ｋｇ、９．０ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は１５ｍｇ／ｋｇ(または何かの組合せ)の一又は複数の用量が、被検体に投与されてよい。このような用量は、間欠的、例えば毎日、３日ごと、週ごと又は２〜３週ごとに投与されてよい。他の実施態様では、例えば併用されるとき、ベバシズマブは、隔週で１０ｍｇ／ｋｇ又は３週ごとに１５ｍｇ／ｋｇで被検体に静脈内投与される。

以下の実施例は例示のためにのみ示され、本明細書中の教示により限定されるものではない。

実施例１：癌患者における高い基準のＰｌＧＦレベルが短い生存と相関する
試験被検体および治療：
試料は、転移性疾患についての少なくとも一つの従来の化学療法投薬計画後に再発した転移性乳癌患者におけるベバシズマブ単一療法の研究である、ＡＶＦ−０７７６から採取した。すべての被検体に、２週間ごとに３ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ又は２０ｍｇ／ｋｇのベバシズマブを合計６回注入した。７０日目の腫瘍評価において疾患進行の所見がなかった被検体には、１５４日目まで(さらに６回の注入)２週間ごとにベバシズマブを投与し、次いで腫瘍評価を行った。１５４日目に疾患進行の所見がなかった被検体には、１６８日目にベバシズマブの最終注入を行った。疾患が進行した被検体は試験を中断した。試験完了又は中断の後、被検体は０日後１年間の生存状況について追跡した。
試料および方法：
被検体の末梢静脈血を、薄紫色の従来のストッパーを有するBD Vacutainer(登録商標)プラスチックＥＤＴＡチューブに直接入れた。採取後、試料は、ゆっくりと混合し、３０分間静置した。室温で３０００×ｇで２０分間遠心して血漿を得た。試料は、ベバシズマブで治療した再発性転移性乳癌を有する合計６７人の患者から採取し、０日目から５６日目の間で少なくとも２時点(０日目、１４日目、２８日目、４２日目及び５６日目)の血漿試料を得た。
血漿における基準ＰｌＧＦレベルは、製造業者の説明書に従って、ＭＳＤ(登録商標)ＭＳ６０００ヒト増殖因子キット(K11029C-1 Meso Scale Discovery, Gaithersburg, MD)により、０日目の治療の開始前の患者において測定した。ＰｌＧＦレベルを臨床結果と相関させるために、カプラン-メイヤー方法論およびログランク(マンテル-コックス)検定を、試験開始(最初の投薬)からの生存期間の分析のために用いた。
結果：
ログランク検定により、基準の２８ｐｇ／ｍｌの血漿ＰｌＧＦレベルは有意に可変的であり、患者の全生存と相関していた(ｐ＜０．００２６；図１を参照)。全生存期間の中位数は、治療開始前の０日目の２８ｐｇ／ｍｌより大きい基準血漿ＰｌＧＦレベルを有する患者では１７１日であった。対照的に、治療開始前の０日目の２８ｐｇ／ｍｌ以下の基準ＰｌＧＦレベルを有する患者の全生存期間の中位数は、４１７日であった。これらの結果から、患者における基準血漿ＰｌＧＦレベルが抗血管形成療法を受けている癌患者のための生存上の利点の予測因子であることが示される。

実施例２：ベバシズマブにて治療される患者における血漿ＰｌＧＦレベルの増加
実施例１に記載のように、患者を治療し、血漿試料を採取した。血漿ＰｌＧＦレベルは、ベバシズマブによる治療のクールを通じてモニターした。結果は、ベバシズマブによる治療の後に血漿ＰｌＧＦレベルが増加したことを示す(図２を参照のこと)。ベバシズマブによる治療後１４日目、２８日目、４２日目及び５６日目の患者において１．５倍以上の中位値の増加が観察された。

実施例３：ベバシズマブによる治療後の患者における高い血漿ＰＬＧＦレベルは短い全生存と相関している
実施例１に記載のように、患者を治療し、血漿試料を得、血漿ＰｌＧＦレベルを測定した。血漿ＰｌＧＦレベルを臨床結果と相関させるために、カプラン-メイヤー方法論およびログランク(マンテル-コックス)検定を、試験開始(最初の投薬)からの生存期間の分析のために用いた。
ログランク検定結果により、ベバシズマブ治療の１４日目の５０ｐｇ／ｍｌの血漿ＰｌＧＦレベルは有意に可変的であり、患者の全生存と相関していた(ｐ＜０．０００３；図３を参照)。ベバシズマブ治療開始後の５０ｐｇ／ｍｌより大きい基準血漿ＰｌＧＦレベルを有する患者の生存期間の中位値は、１６５日であった。対照的に、ベバシズマブ治療開始後の５０ｐｇ／ｍｌ以下の血漿ＰｌＧＦレベルを有する患者の全生存期間の中位値は、４３１日であった。これらの結果は、抗血管形成療法（例えばベバシズマブ）による治療を開始した患者における血漿ＰｌＧＦレベルが抗脈管形成療法を受けている癌患者の生存上の利点の予測因子であることを示す。

Claims (14)

1. 抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗血管形成療法以外の抗癌療法、または、抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗血管形成療法に加えた抗癌療法から利益を得うる乳癌を患っている患者を識別するためのデータを収集する方法であって、患者から得た試料における胎盤増殖因子(ＰｌＧＦ)の発現レベルを決定することを含み、このとき参照試料と比較したときの、該患者から得た試料におけるＰｌＧＦの発現レベルの増加が、該患者が抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗血管形成療法以外の、または、抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗血管形成療法に加えた抗癌療法から利益を得うる患者であると識別する方法。
2. 乳癌を患っている患者の抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗血管形成療法に対する応答性を予測するためのデータを収集する方法であって、患者から得た試料におけるＰｌＧＦの発現レベルを決定することを含み、このとき参照試料と比較したときの、該患者から得た試料におけるＰｌＧＦの発現レベルの増加が、該患者が抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗血管形成療法単独にあまり応答しないことを示す方法。
3. 乳癌を患っている患者における抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗血管形成療法の有効性をモニタリングするためのデータを収集する方法であって、患者から得た試料におけるＰｌＧＦの発現レベルを決定することを含み、このとき参照試料と比較したときの、該患者から得た試料におけるＰｌＧＦの発現レベルの増加が、該患者が抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗血管形成療法単独にあまり応答しないことを示す方法。
4. 乳癌の治療のために治療上の有効性を最適化するためのデータを収集する方法であって、患者から得た試料におけるＰｌＧＦの発現レベルを決定することを含み、このとき参照試料と比較したときの、該患者から得た試料におけるＰｌＧＦの発現レベルの増加が、該患者が抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗血管形成療法単独にあまり応答しないことを示す方法。
5. 患者から得た試料におけるＰｌＧＦの発現レベルが、参照試料と比較して少なくともおよそ１．５倍増加している、請求項１から４の何れか一に記載の方法。
6. 抗ＶＥＧＦ抗体がベバシズマブである、請求項１から４の何れか一に記載の方法。
7. 乳癌が転移性乳癌である、請求項１から４の何れか一に記載の方法。
8. 患者から得られる試料が血漿、血液、血清及びそれらの組合せからなる群から選択される、請求項１から４の何れか一に記載の方法。
9. ＰｌＧＦの発現レベルが、ＰｌＧＦのタンパク質発現レベルである、請求項１から４の何れか一に記載の方法。
10. 試料が抗血管形成療法の前の患者から得られる、請求項１から４の何れか一に記載の方法。
11. 試料が抗血管形成療法の開始後の患者から得られる、請求項１から４の何れか一に記載の方法。
12. 試料が抗血管形成療法の開始後１４日以内の患者から得られる、請求項１１の方法。
13. 参照試料と比較した患者から得た試料におけるＰｌＧＦの発現レベルの増加が、該患者が抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗血管形成療法以外の、または、抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗血管形成療法に加えた抗癌療法を投与されるべきであることを示す、請求項１から４の何れか一に記載の方法。
14. ＰｌＧＦの発現レベルを検出することにより、抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗血管形成療法以外の抗癌療法、または、抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗血管形成療法に加えた抗癌療法から利益を得うる乳癌を患っている患者を識別するためのキットであって、
    ＰｌＧＦの発現レベルを特異的に検出することができる化合物と、乳癌を患っている患者の抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗血管形成療法単独に対する応答性を予測するための該キットの使用についての指示書とを具備し、
    このとき参照試料と比較したときのＰｌＧＦの発現の増加が、該患者が抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗血管形成療法以外の抗癌療法又は抗ＶＥＧＦ抗体を含む抗血管形成療法に加えた抗癌療法から利益を得うることを示すキット。

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