KR20110106899A

KR20110106899A - 암 환자에서의 진단 목적용 방법 및 조성물

Info

Publication number: KR20110106899A
Application number: KR1020117017228A
Authority: KR
Inventors: 이빙 얀; 폴 제이. 필더; 쿤 제니 유
Original assignee: 제넨테크, 인크.
Priority date: 2008-12-23
Filing date: 2009-12-22
Publication date: 2011-09-29
Also published as: SG10201604988YA; CN102265157B; US20130022596A1; AU2009329994B2; MX2011006875A; WO2010075420A1; IL213410A0; KR101596539B1; MX2018011832A; CA2746120A1; SG187385A1; EP2382472B1; KR20140020368A; US20130224193A1; SG172355A1; BRPI0918211A2; AU2014203615A1; US20100216115A1; EP2382472A1; JP2012513592A

Abstract

암 환자에 최적의 임상적 이로움을 부여할 가능성이 있는 요법을 확인하는데 유용한 방법 및 조성물을 본원에서 개시한다.

Description

암 환자에서의 진단 목적용 방법 및 조성물{METHODS AND COMPOSITIONS FOR DIAGNOSTIC USE IN CANCER PATIENTS}

<관련 출원>

본 출원은 2008년 12월 23일에 출원된 미국 특허 가출원 제61/140,392호를 우선권 주장하며, 그 전문이 모든 목적을 위해 본원에 참고로 도입된다.

본 발명은 임상 결과를 예측하는데 있어 유용하고, 항혈관신생 요법으로 치료받는 암 환자를 모니터링하는데 있어 유용한 방법 및 조성물에 관한 것이다.

암은 인간 건강에 가장 치명적인 위협 중의 하나이다. 미국에서만 매년 1백 3십만명 정도의 새로운 암 환자가 발생하고, 이는 심혈관계 질환 다음으로 두 번째로 높은 사망 원인이며, 사망자 4명 중의 대략 1명이 암 환자인 것으로 추정된다. 이러한 사망의 대부분은 충실성 종양으로 인한 것이다. 특정 암의 경우에는 의학적 치료에 유의한 진보가 있었지만, 모든 암에 대한 전반적인 5년 생존율은 지난 20년 동안 겨우 약 10％만 개선되었다. 암 또는 악성 종양은 제어되지 않는 방식으로 신속하게 전이 및 성장하기 때문에 제시간에 이를 검출하고 치료하는 것은 극도로 어려운 일이다.

암 유형에 따라, 환자는 전형적으로 화학요법, 방사선 및 항체-기재의 약물을 비롯하여 이들에게 이용가능한 여러가지 치료 옵션을 갖는다. 상이한 치료 방식으로 인한 임상 결과를 예측하는데 유용한 진단 방법은 이러한 환자들의 임상적 관리에 크게 이로울 것이다. 여러 연구에서 예를 들어 돌연변이-특이적 분석, 마이크로어레이 분석, qPCR 등에 의해 유전자 발현과 특정 암 유형의 확인과의 상관관계가 조사된 바 있다. 이러한 방법은 환자가 나타내는 암을 확인하고 분류하는데 유용할 수 있다. 그러나, 임상 결과에 따른 유전자 발현의 예측 또는 예후 가치에 대해 알려져 있는 것은 훨씬 더 적다.

따라서, 암 환자의 무진행 생존과 같은 치료 결과를 예측하거나, 또는 상기 치료의 진행을 모니터링함으로써 각 환자에 대한 최적의 치료 방식을 선택하기 위한, 객관적이고 재현가능한 방법이 요구되고 있다.

<발명의 개요>

본 발명의 방법은 예를 들어, 암 환자 치료 방법을 지원할 때, 약물 개발 과정 동안 환자를 선택할 때, 특정 치료 방식을 사용한 개개의 환자를 치료할 경우 그 성공 가능성을 예측할 때, 질환 진행 상태를 평가할 때, 치료 효능을 모니터링할 때, 개개의 환자에 대한 예후를 결정할 때, 및 특정 항암 요법이 이로운 개체의 소질을 평가할 때를 비롯한 다양한 환경하에서 사용될 수 있다.

본 발명은 부분적으로 암을 앓고 있는 환자에서의 특정 바이오마커의 발현 수준이 단독 항혈관신생 요법으로부터의 임상적 이로움의 감소와 관련이 있다는 발견에 기초한다. 따라서, 한 측면에서 본 발명은 환자로부터 수득한 샘플에서 태반 성장 인자 (PlGF)의 발현 수준을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 샘플에서 PlGF의 발현이 참조 샘플에 비해 증가하는 것이 상기 환자에게 항혈관신생 요법이 아닌 또는 항혈관신생 요법에 추가한 항암 요법이 이로울 수 있음을 나타내는 것인, 암의 치료에 대한 치료 효능을 최적화하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 상기 방법은 항암 요법을 환자에게 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 항암 요법은 항혈관신생 요법이 아닌 또는 항혈관신생 요법에 추가한 것이다.

또 다른 측면에서 본 발명은 항혈관신생 요법이 아닌 또는 항혈관신생 요법에 추가한 항암 요법이 이로울 수 있는 암 환자로부터 수득한 샘플에서 태반 성장 인자 (PlGF)의 발현 수준을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 샘플에서 PlGF의 발현이 참조 샘플에 비해 증가하는 것이 상기 환자에게 항혈관신생 요법이 아닌 또는 항혈관신생 요법에 추가한 항암 요법이 이로울 수 있음을 나타내는 것인, 항혈관신생 요법이 아닌 또는 항혈관신생 요법에 추가한 항암 요법이 이로울 수 있는 암 환자를 확인하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 환자로부터의 샘플은 항혈관신생 요법 시작 이전에 또는 항혈관신생 요법 시작시에 수득한다. 한 실시양태에서, 환자로부터의 샘플은 항혈관신생 요법 시작 이후에 수득한다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에게 항암 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 항암 요법은 항혈관신생 요법이 아닌 또는 항혈관신생 요법에 추가한 것이다.

또 다른 측면에서 본 발명은 암 환자로부터 수득한 샘플에서 PlGF의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 PlGF의 발현 수준이 참조 샘플에 비해 증가하는 것이 상기 환자가 단독 항혈관신생 요법에 보다 덜 반응성이 될 수 있음을 나타내는 것인, 암 환자의 항혈관신생 요법에 대한 반응성을 예측하는 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 환자로부터의 샘플은 항혈관신생 요법 시작 이전에 또는 항혈관신생 요법 시작시에 수득한다. 한 실시양태에서, 환자로부터의 샘플은 항혈관신생 요법 시작 이후에 수득한다. 일부 실시양태에서, 방법은 환자에게 항암 요법을 투여하는 것을 추가로 포함하며, 여기서 항암 요법은 항혈관신생 요법이 아닌 또는 항혈관신생 요법에 추가한 것이다.

본 발명은 또한 암 환자에게 항혈관신생 요법이 아닌 또는 항혈관신생 요법에 추가한 항암 요법을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 환자로부터 수득한 샘플이 참조 샘플에 비해 증가한 PlGF의 발현 수준을 나타내는 것인, 암 환자의 치료 방법을 제공한다. 한 실시양태에서, 환자로부터의 샘플은 항혈관신생 요법 시작 이전에 또는 항혈관신생 요법 시작시에 수득한다. 한 실시양태에서, 환자로부터의 샘플은 항혈관신생 요법 시작 이후에 수득한다. 샘플은 치료 시작 이전에 환자로부터 수득할 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플은 28 pg/ml 이상의 PlGF의 발현 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 샘플은 최근에 항혈관신생 요법으로 치료받은 환자로부터 수득할 수 있다. 한 실시양태에서, 환자로부터의 샘플은 항혈관신생 요법 시작 이후에 수득한다. 한 실시양태에서, 샘플은 50 pg/ml 이상의 PlGF의 발현 수준을 갖는다.

다른 측면에서, 본 발명은 암 환자에게 항혈관신생 요법을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 환자로부터 수득한 샘플이 참조 샘플에 비해 낮거나 감소한 PlGF의 발현 수준을 나타내는 것인, 암 환자의 치료 방법을 제공한다. 샘플은 치료 시작 이전에 환자로부터 수득할 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플은 28 pg/ml 이하의 PlGF의 발현 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 샘플은 최근에 항혈관신생 요법으로 치료받은 환자로부터 수득할 수 있다. 한 실시양태에서, 환자로부터의 샘플은 항혈관신생 요법 시작 이후에 수득한다. 한 실시양태에서, 샘플은 50 pg/ml 이하의 PlGF의 발현 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항혈관신생 요법은 항-VEGF 항체, 예를 들어 베바시주맙을 투여하는 것을 포함한다.

또한, PlGF의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 화합물을 포함하는 키트가 제공되며, 이 키트는 암을 앓고 있는 환자의 단독 항혈관신생 요법에 대한 반응성을 예측하기 위해 키트를 사용하기 위한 설명서를 추가로 포함하며, 여기서 PlGF의 발현이 참조 샘플에 비해 증가하는 것은 상기 환자에게 항혈관신생 요법이 아닌 또는 항혈관신생 요법에 추가한 항암 요법이 이로울 수 있음을 나타낸다.

본원에 기재된 임의의 방법에서, 샘플은 조직 또는 세포 샘플일 수 있거나 또는 혈액, 혈장 및/또는 혈청으로부터 수득할 수 있다. 특정 실시양태에서, 샘플은 암 치료 시작 이전에 환자로부터 수득한다. 특정 실시양태에서, 샘플은 암 치료 시작 이후에 환자로부터 수득한다. 예를 들어, 샘플은 암 치료 시작 이후 24시간 이내에 또는 암 치료 시작 이후 2일, 3일, 5일, 10일, 14일, 20일, 25일, 28일, 42일 또는 56일 이내에 수득한다.

본원에 기재된 임의의 방법에서, 하나 이상의 유전자 또는 유전자 생성물의 발현 수준은 핵산 수준, 단백질 수준 또는 단백질의 분비 또는 표면 발현 수준에서 결정할 수 있다. 특정 실시양태에서, PlGF의 발현 수준의 증가는 발현 수준에서 1.4-1.8배의 증가이다. 일부 실시양태에서, PlGF의 발현 수준의 증가는 발현 수준에서 1.5배 이상의 증가이다.

본 발명의 방법의 일부 실시양태에서, 암은 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병이다. 상기 암의 보다 특정한 예로는 편평 세포 암, 폐암(소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평세포 암종 포함), 복막암, 간세포성 암, 위암 (위장암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 유형의 두경부암 뿐만 아니라, B-세포 림프종 (저등급/여포성 비-호지킨 림프종 (NHL); 소 림프구성 (SL) NHL; 중등급/여포성 NHL; 중등급 미만성 NHL; 고등급 면역모세포성 NHL; 고등급 림프모구성 NHL; 고등급 소 비-분할 세포 NHL; 거대 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종; 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 포함); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프모구성 백혈병 (ALL); 모발상 세포 백혈병; 만성 골수모구성 백혈병; 및 이식 후 림프구증식성 장애 (PTLD) 뿐만 아니라, 모반증, 부종 (예를 들어, 뇌 종양과 연관된 부종) 및 메이그스 증후군과 연관된 비정상적 혈관 증식을 포함한다.

한 실시양태에서, 암은 예를 들어 전이성 유방암을 비롯한, 유방암이다.

본 발명의 방법은 본원에서 아래 기재하는 임의의 항암제로 수행할 수 있다. 항혈관신생제는 본원에서 아래 기재하는 임의의 항혈관신생제 단독 또는 그의 조합일 수 있다. 일부 실시양태에서, 항혈관신생 요법은 예를 들어 항-VEGF 항체를 비롯한 VEGF 길항제의 투여를 포함한다. 일부 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 베바시주맙이다.

본원에 기재된 임의의 실시양태 또는 이들의 임의의 조합은 본원에 기재된 본 발명의 임의의 모든 방법에 적용된다.

도 1은 제0일 (처치 시작 이전)에 혈장 PlGF 수준과 유방암 환자의 전체 생존기간을 비교하는 그래프이다.
도 2는 혈장 PlGF 수준이 베바시주맙으로의 처치에 반응하여 증가한다는 것을 보여주는 그래프이다.
도 3은 베바시주맙으로의 처치 제14일에 혈장 PlGF 수준과 유방암 환자의 전체 생존기간을 비교하는 그래프이다.

달리 언급하지 않는 한, 본 발명의 실시는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기술을 이용할 것이고, 이들은 당업계의 기술 범위 내에 속한다. 그러한 기술은 문헌, 예를 들어 ["Molecular Cloning: A Laboratory Manual", second edition (Sambrook et al., 1989)]; ["Oligonucleotide Synthesis" (M.J. Gait, ed., 1984)]; ["Animal Cell Culture" (R.I. Freshney, ed., 1987)]; ["Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)]; ["Current Protocols in Molecular Biology" (F.M. Ausubel et al., eds., 1987)] 및 주기적인 증보판; 및 ["PCR: The Polymerase Chain Reaction", (Mullis et al., eds., 1994)]에 충분히 설명되어 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 기술 용어 및 학술 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 통상적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 문헌 [Singleton et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology 2nd ed., J. Wiley & Sons (New York, N.Y. 1994)], 및 [March, Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms and Structure 4th ed., John Wiley & Sons (New York, N.Y. 1992)]은 당업자에게 본 출원에서 사용된 많은 용어에 관한 일반적인 지침을 제공한다.

특허 출원 및 공개공보를 포함하여 본원에서 인용된 모든 참고문헌은 그 전문이 참고로 포함된다.

I. 정의

본원에 사용된 용어 "어레이" 또는 "마이크로어레이"는 기판 상에 혼성화될 수 있는 어레이 요소, 바람직하게, 폴리뉴클레오티드 프로브 (예를 들어, 올리고뉴클레오티드)의 정렬된 배열을 나타낸다. 상기 기판은 고체 기판, 예를 들어 유리 슬라이드, 또는 반-고체 기판, 예를 들어 니트로셀룰로스 막일 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 DNA, RNA, 또는 이들의 임의의 치환일 수 있다.

본원에 사용된 "표적 서열", "표적 핵산" 또는 "표적 단백질"은 검출을 원하는, 관심의 대상이 되는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질이다. 일반적으로, 본원에 사용된 "주형"은 표적 뉴클레오티드 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드이다. 일부 경우에서, "표적 서열", "주형 DNA", "주형 폴리뉴클레오티드", "표적 핵산", "표적 폴리뉴클레오티드" 및 그의 변형은 상호교환적으로 사용된다.

본원에 사용된 "증폭"은 일반적으로 원하는 서열의 다수의 카피를 생산하는 과정을 나타낸다. "다중 카피"란 적어도 2개의 카피를 의미하는 것이다. "카피"가 반드시 주형 서열에 대한 완전한 서열 상보성 또는 동일성을 의미하는 것이 아니다. 예를 들어, 카피는 뉴클레오티드 유사체, 예를 들어 데옥시이노신, 의도적인 서열 변경 (예를 들어, 주형에 혼성화가능하지만 상보성이지는 않은 서열을 포함하는 프라이머를 통해 도입되는 서열 변경), 및/또는 증폭 동안 발생하는 서열 오류를 포함할 수 있다.

제1 샘플 중 유전자, 유전자 생성물, 예를 들어 단백질 또는 바이오마커의 발현 수준/양이 제2 샘플 중 유전자, 유전자 생성물, 예를 들어 단백질 또는 바이오마커의 발현 수준/양보다 더 크다면, 제1 샘플 중 유전자, 단백질 또는 바이오마커의 발현/양은 제2 샘플 중의 발현/양과 비교하여 높거나 증가된 것이다. 한 실시양태에서, 제1 샘플 중 유전자, 유전자 생성물, 예를 들어 단백질 또는 바이오마커의 발현 수준/양의 증가란 제2 샘플 중의 각 유전자, 유전자 생성물, 예를 들어 단백질 또는 바이오마커의 발현 수준/양의 적어도 약 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X, 또는 100X인 것이다.

제1 샘플 중 유전자, 유전자 생성물, 예를 들어 단백질 또는 바이오마커의 발현 수준/양이 제2 샘플 중 유전자, 유전자 생성물, 예를 들어 단백질 또는 바이오마커의 발현 수준/양보다 더 적다면, 제1 샘플 중 유전자, 단백질 또는 바이오마커의 발현/양은 제2 샘플 중의 발현/양과 비교하여 낮거나 감소된 것이다. 한 실시양태에서, 제1 샘플 중 유전자, 유전자 생성물, 예를 들어 단백질 또는 바이오마커의 발현 수준/양의 감소란 제2 샘플 중의 각 유전자, 유전자 생성물, 예를 들어 단백질 또는 바이오마커의 발현 수준/양보다 적어도 약 1.5X, 1.75X, 2X, 3X, 4X, 5X, 6X, 7X, 8X, 9X, 10X, 25X, 50X, 75X, 또는 100X 낮은 것이다.

발현 수준/양은 mRNA, cDNA, 단백질, 단백질 단편 및/또는 유전자 카피를 포함하나, 이에 제한되지 않는, 당업계에 공지된 임의의 적합한 기준에 기초하여 측정될 수 있다. 발현 수준/양은 정성적으로 및/또는 정량적으로 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플은 RNA 또는 단백질의 분석량의 차이 및 사용된 RNA 또는 단백질 샘플의 질적 가변성 둘 모두에 대하여 표준화된다. 주지되어 있는 하우스키핑 유전자, 예를 들어, GAPDH를 비롯한, 특정의 표준화 유전자의 발현을 측정하고 그를 도입함으로써 상기와 같은 표준화를 달성할 수 있다. 다르게는, 표준화는 분석된 유전자 또는 그의 보다 대형 서브세트 모두의 평균 또는 중간 신호를 기초로 할 수 있다 (전역 표준화 접근법). 유전자마다, 환자 종양 mRNA 또는 단백질의 측정된 표준화 양을 참조 세트에서 확인된 양과 비교한다. 각 환자마다 시험된 종양 1개 당 각 mRNA 또는 단백질에 대해 표준화된 발현 수준은 참조 세트에서 측정된 발현 수준의 비율(％)로서 표현될 수 있다. 분석할 특정 환자 샘플에서 측정된 발현 수준은 이러한 범위 내의 일부 백분위수에 포함될 것이며, 이는 당업계에 주지된 방법으로 결정될 수 있다.

"검출"은 직접 및 간접 검출을 비롯하여 임의의 검출 수단을 포함한다.

본원에 사용된 용어 "샘플" 또는 "시험 샘플"은 예를 들어 물리적, 생화학적, 화학적 및/또는 생리학적 특징을 기초로 하여 특성화 및/또는 확인되는 세포성 및/또는 다른 분자 엔티티를 함유하는 관심 있는 대상체로부터 얻거나 상기 대상체로부터 유래된 조성물을 나타낸다. 한 실시양태에서, 상기 정의는 생물학적 기원의 혈액 및 다른 액체 샘플 및 조직 샘플, 예를 들어 생검 표본 또는 조직 배양물 또는 그로부터 유래된 세포를 포함한다. 조직 샘플의 공급원은 신선하고/하거나 냉동되고/되거나 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고체 조직, 혈액 또는 임의의 혈액 성분, 체액, 및 대상체의 임신 또는 발생 중 임의의 시점으로부터의 세포 또는 혈장일 수 있다. 샘플은 치료 (예를 들어, 암 치료) 시작 이전에 또는 치료 (예를 들어, 암 치료) 시작 이후에 대상체로부터 수득할 수 있다. 샘플은 치료 (예를 들어, 암 치료) 시작 이후 24시간, 7일, 10일, 14일, 28일, 42일 또는 56일 이내에 수득할 수 있다.

용어 "샘플" 또는 "시험 샘플"은 공급받은 후에 시약을 처리하거나 가용화하거나, 특정 성분, 예를 들어 단백질 또는 폴리뉴클레오티드를 풍부하게 하거나 또는 절편화를 목적으로 반-고체 또는 고체 매트릭스 중에 매립하는 것과 같은 임의의 방법으로 조작된 생물학적 샘플을 포함한다. 본원의 목적상, 조직 샘플의 "절편"은 조직 샘플의 단일 부분 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단된 조직 또는 세포의 박편을 나타낸다.

샘플은 원발성 또는 배양된 세포 또는 세포주, 세포 상등액, 세포 용해물, 혈소판, 혈청, 혈장, 유리체액, 림프액, 활액, 여포액, 정액, 양수, 젖, 전혈, 혈액-유래 세포, 소변, 뇌척수액, 타액, 가래, 눈물, 땀, 점액, 종양 용해물, 및 조직 배양 배지, 조직 추출물, 예를 들어 균질화된 조직, 종양 조직 및 세포 추출물, 및 이들의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.

한 실시양태에서, 샘플은 임상 샘플이다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 진단 분석에 사용된다. 일부 실시양태에서, 샘플은 원발성 또는 전이성 종양으로부터 수득한다. 조직 생검은 종양 조직의 대표적인 조각을 얻기 위해 종종 사용된다. 다르게는, 종양 세포는 관심 종양 세포를 함유하는 것으로 공지되어 있거나 그렇게 여겨지는 조직 또는 유체의 형태로 간접적으로 수득될 수 있다. 예를 들어, 폐암 병변의 샘플은 절제, 기관지경 검사, 미세침 흡인, 기관지 찰과술에 의해, 또는 가래, 흉수 또는 혈액으로부터 얻을 수 있다.

한 실시양태에서, 샘플은 항혈관신생 요법 이전에 대상체 또는 환자로부터 수득한다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 VEGF 길항제 요법 이전에 대상체 또는 환자로부터 수득한다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 항-VEGF 항체 요법 이전에 대상체 또는 환자로부터 수득한다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 VEGF 길항제 요법으로의 하나 이상의 치료 이후에 대상체 또는 환자로부터 수득한다.

한 실시양태에서, 샘플은 항혈관신생 요법으로의 하나 이상의 치료 이후에 대상체 또는 환자로부터 수득한다. 또 다른 실시양태에서, 샘플은 항-VEGF 항체로의 하나 이상의 치료 이후에 대상체 또는 환자로부터 수득한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 암이 전이되기 전에 환자로부터 수득한다. 특정 실시양태에서, 샘플은 암이 전이된 후에 환자로부터 수득한다.

본원에 사용된 "참조 샘플"은 비교 목적으로 사용되는 임의의 샘플, 표준물, 또는 수준을 나타낸다. 한 실시양태에서, 참조 샘플은 동일 대상체 또는 환자 신체의 건강하고/하거나 질환에 걸리지 않은 부분 (예를 들어, 조직 또는 세포)으로부터 수득한다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플은 동일 대상체 또는 환자 신체의 미처치 조직 및/또는 세포로부터 수득한다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌 개체의 신체의 건강하고/하거나 질환에 걸리지 않은 부분 (예를 들어, 조직 또는 세포)으로부터 수득한다. 또 다른 실시양태에서, 참조 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌 개체의 신체의 미처치 조직 및/또는 세포 부분으로부터 수득한다.

특정 실시양태에서, 참조 샘플은 시험 샘플이 수득된 때와 상이한 하나 이상의 시점에서 동일 대상체 또는 환자로부터 수득된 단일 샘플 또는 조합된 다중 샘플이다. 예를 들어, 참조 샘플은 시험 샘플이 수득된 때보다 더 이른 시점에 동일 대상체 또는 환자로부터 수득한다. 이러한 참조 샘플은, 참조 샘플이 암의 초기 진단 동안 수득되고 시험 샘플은 이후에 암이 전이성이 된 시점에 수득된 경우에 유용할 수 있다.

특정 실시양태에서, 참조 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌 하나 이상의 개체로부터 수득된, 용어 "샘플"에서 상기 정의된 바와 같은 모든 유형의 생물학적 샘플을 포함한다. 특정 실시양태에서, 참조 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌, 혈관신생 장애 (예를 들어, 암)를 갖는 하나 이상의 개체로부터 수득한다.

특정 실시양태에서, 참조 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌 하나 이상의 건강한 개체로부터의 조합된 다중 샘플이다. 특정 실시양태에서, 참조 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌 질환 또는 장애 (예를 들어, 혈관신생 장애, 예를 들어 암)를 갖는 하나 이상의 개체로부터의 조합된 다중 샘플이다. 특정 실시양태에서, 참조 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌 하나 이상의 개체로부터 모은 혈장 또는 혈청 샘플 또는 종양 조직으로부터 모은 RNA 샘플이다. 특정 실시양태에서, 참조 샘플은 대상체 또는 환자가 아닌 질환 또는 장애 (예를 들어, 혈관신생 장애, 예를 들어 암)를 갖는 하나 이상의 개체로부터 모은 혈장 또는 혈청 샘플 또는 종양 조직으로부터 모은 RNA 샘플이다.

본원에서 상호교환적으로 사용된 "폴리뉴클레오티드" 또는 "핵산"은 임의의 길이의 뉴클레오티드의 중합체를 나타내고, DNA 및 RNA를 포함한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드, 변형된 뉴클레오티드 또는 염기 및/또는 이들의 유사체, 또는 DNA 또는 RNA 폴리머라제에 의해 중합체로 혼입될 수 있는 임의의 기질일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 변형된 뉴클레오티드, 예를 들어 메틸화 뉴클레오티드 및 그의 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드 구조에 대한 변형이 존재하는 경우, 이러한 변형은 중합체의 조립 이전 또는 이후에 부여될 수 있다. 뉴클레오티드의 서열에 비뉴클레오티드 성분이 개재될 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 표지 성분과의 접합에 의해서와 같이 중합 후에 추가로 변형될 수 있다. 또 다른 유형의 변형은, 예를 들어 "캡(cap)", 하나 이상의 자연 발생 뉴클레오티드의 유사체로의 치환, 뉴클레오티드간 변형, 예를 들어 하전되지 않은 연결을 갖는 것 (예를 들어, 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포아미데이트, 카바메이트 등) 및 하전된 연결을 갖는 것 (예를 들어, 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등), 펜던트 잔기, 예를 들어 단백질 (예를 들어, 뉴클레아제, 독소, 항체, 신호 펩티드, 폴리-L-리신 등)을 함유하는 것, 인터칼레이터(intercalator) (예를 들어, 아크리딘, 프소랄렌 등)가 있는 것, 킬레이터 (예를 들어, 금속, 방사성 금속, 붕소, 산화성 금속 등)를 함유하는 것, 알킬레이터를 함유하는 것, 변형된 결합이 있는 것 (예를 들어, 알파 아노머 핵산 등) 뿐만 아니라, 변형되지 않은 형태의 폴리뉴클레오티드(들)을 포함한다. 또한 당에 본래 존재하는 임의의 히드록실기는 예를 들어 포스포네이트기, 포스페이트기에 의해 치환되거나, 표준 보호기에 의해 보호되거나, 또는 추가의 뉴클레오티드에 대한 추가의 연결을 형성하기 위해 활성화되거나, 또는 고체 지지체에 접합될 수 있다. 5' 및 3' 말단 OH는 인산화되거나 또는 아민 또는 1 내지 20개의 탄소 원자를 갖는 유기 캐핑 (capping) 기 잔기로 치환될 수 있다. 다른 히드록실이 표준 보호기로 유도체화될 수도 있다. 폴리뉴클레오티드는 또한 예를 들어 2'-O-메틸-2'-O-알릴, 2'-플루오로- 또는 2'-아지도-리보스, 카르보시클릭 당 유사체, α-아노머 당, 에피머 (epimeric) 당, 예를 들어 아라비노스, 자일로스 또는 릭로스, 피라노스 당, 푸라노스 당, 세도헵툴로스, 비환식 (acyclic) 유사체 및 비염기성 (abasic) 뉴클레오시드 유사체, 예를 들어 메틸 리보시드를 포함하여, 일반적으로 당업계에 공지되어 있는 유사한 형태의 리보스 또는 데옥시리보스 당을 함유할 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 연결부가 대안적인 연결부로 대체될 수 있다. 이들 대체 연결기는 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), "(O)NR2 ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH2 ("포름아세탈")로 치환된 실시양태를 포함하고, 이로 제한되지 않으며, 여기서 각각의 R 또는 R'는 독립적으로 H 또는 임의로 에테르 (--O--) 연결을 함유하는 치환 또는 비치환된 알킬 (1-20 C), 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알킬이다. 폴리뉴클레오티드 내의 모든 연결부가 동일할 필요는 없다. 전술한 설명은 RNA 및 DNA를 비롯하여 본원에서 언급되는 모든 폴리뉴클레오티드에 적용된다.

본원에 사용된 "올리고뉴클레오티드"는 일반적으로, 길이가 약 200개 미만 뉴클레오티드이긴 하지만 반드시 그럴 필요가 없는 짧은, 일반적으로 단일 가닥, 일반적으로 합성 폴리뉴클레오티드를 나타낸다. 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"는 서로 배타적이지 않다. 폴리뉴클레오티드에 대한 상기 기재는 올리고뉴클레오티드에 동일하고 완전하게 적용가능하다.

"프라이머"는 일반적으로 표적 서열에 혼성화함으로써 관심 샘플에 잠재적으로 존재하는 표적에 결합한 후, 표적에 상보성인 폴리뉴클레오티드의 중합을 촉진하는, 일반적으로 유리 3'-OH 기를 갖는 짧은 단일 가닥의 폴리뉴클레오티드이다.

본원에 사용된 용어 "바이오마커"는 일반적으로, 포유동물 조직 또는 세포 중에서 또는 그 위에서의 발현이 표준 방법 (또는 본원에 개시된 방법)에 의해 검출될 수 있고, 혈관형성 억제에 기초한 치료 방식, 예를 들어 항혈관신생제, 예를 들어, VEGF-특이적 억제제에 대한 포유동물 세포 또는 조직의 감수성에 대해 예측, 진단 및/또는 예후하는 것인, 유전자, 단백질, 당질 구조체, 또는 당지질을 비롯한 분자를 나타낸다. 임의로, 그러한 바이오마커의 발현은 대조군/참조 조직 또는 세포 샘플에 대해서 관찰되는 것보다 더 높게 결정된다. 그러한 바이오마커의 발현은 고효율의 멀티플렉스화된 면역분석법, 예를 들어, 룰즈 베이스드 메디슨, 인크.(Rules Based Medicine, Inc.) 또는 메조 스케일 디스커버리(Meso Scale Discovery)로부터 상업적으로 이용가능한 것을 사용함으로써 결정할 수 있다. 바이오마커의 발현은 또한 예를 들어 PCR 또는 FACS 분석법, 면역조직화학적 분석법 또는 유전자 칩-기반 분석법을 사용함으로써 결정될 수 있다.

"조직 또는 세포 샘플"은 대상체 또는 환자의 조직으로부터 수득한 세포 수집물을 나타낸다. 조직 또는 세포 샘플의 공급원은 신선하고/하거나 냉동되고/되거나 보존된 장기 또는 조직 샘플 또는 생검 또는 흡인물로부터의 고체 조직, 혈액 또는 임의의 혈액 구성성분, 예를 들어 뇌 척수액, 양수, 복수액 또는 간질액과 같은 체액 및 대상체의 임신 또는 발생 중 임의의 시점으로부터의 세포 또는 혈장일 수 있다. 또한, 조직 샘플은 1차 또는 배양된 세포 또는 세포주일 수 있다. 임의로, 조직 또는 세포 샘플은 암성 조직/기관으로부터 수득한다. 조직 샘플은 자연에서 조직과 자연히 서로 혼합되지 않는 화합물, 예를 들어 보존제, 항응고제, 완충제, 고정제, 영양분, 항생제 등을 함유할 수 있다. 본원의 목적상, 조직 샘플의 "절편"은 조직 샘플의 단일 부분 또는 조각, 예를 들어 조직 샘플로부터 절단된 조직 또는 세포의 박편을 나타낸다.

"상관관계가 있다" 또는 "상관관계가 있는"은, 제1 분석 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과를 제2 분석 또는 프로토콜의 성능 및/또는 결과와 임의의 방식으로 비교하는 것을 나타낸다. 예를 들어, 제2 프로토콜의 수행시에 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용할 수 있고/있거나 제1 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용하여 제2 분석 또는 프로토콜을 수행해야 하는지의 여부를 결정할 수 있다. 유전자 발현 분석 또는 프로토콜의 실시양태와 관련하여, 유전자 발현 분석 또는 프로토콜의 결과를 이용하여 특정 치료 방식을 수행해야 하는지의 여부를 결정할 수 있다.

본원에서 사용될 때 단어 "표지"는 시약, 예를 들어 핵산 프로브 또는 항체에 직접 또는 간접적으로 접합되거나 융합되어, 접합되거나 또는 융합된 시약의 검출을 용이하게 하는 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 표지는 그 자체가 검출가능할 수도 있고 (예를 들어, 방사성 동위원소 표지 또는 형광 표지), 또는 효소 표지의 경우에는 기질 화합물 또는 조성물의 검출가능한 화학적 변경을 촉매할 수도 있다.

"천연 서열" 폴리펩티드는 자연계로부터 유래된 폴리펩티드와 동일한 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 포함한다. 따라서, 천연 서열 폴리펩티드는 임의의 포유동물로부터의 자연-발생 폴리펩티드의 아미노산 서열을 가질 수 있다. 이러한 천연 서열 폴리펩티드는 자연계로부터 단리될 수도 있고, 또는 재조합 또는 합성 수단에 의해 생성될 수도 있다. 용어 "천연 서열" 폴리펩티드에는 구체적으로, 폴리펩티드의 자연 발생 말단절단 또는 분비된 형태 (예를 들어, 세포외 도메인 서열), 폴리펩티드의 자연-발생 변이체 형태 (예를 들어, 대체 스플라이싱된 형태) 및 자연-발생 대립유전자성 변이체가 포괄된다.

폴리펩티드 "변이체"는 천연 서열 폴리펩티드와 적어도 약 80％의 아미노산 서열 동일성을 갖는 생물학적 활성 폴리펩티드를 나타낸다. 이러한 변이체는 예를 들어 하나 이상의 아미노산 잔기가 폴리펩티드의 N- 또는 C-말단에서 부가 또는 결실된 폴리펩티드를 포함한다. 통상적으로, 변이체는 천연 서열 폴리펩티드와 적어도 약 80％의 아미노산 서열 동일성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 90％의 아미노산 서열 동일성, 훨씬 더욱 바람직하게는 적어도 약 95％의 아미노산 서열 동일성을 가질 것이다.

용어 "VEGF" 또는 "VEGF-A"는 문헌 [Leung et al. Science, 246:1306 (1989)] 및 [Houck et al. Mol. Endocrin., 5:1806 (1991)]에 기재된 바와 같이, 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련된 121-, 189- 및 206-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 및 그의 자연 발생 대립유전자 및 프로세싱된 형태를 지칭하기 위해 사용된다. VEGF-A는 VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGF-E, VEGF-F 및 PlGF를 포함하는 유전자 계열의 일부이다. VEGF-A는 주로 2종의 고친화도 수용체 티로신 키나제인 VEGFR-1 (Flt-1) 및 VEGFR-2 (Flk-1/KDR)에 결합하는데, 후자의 것은 VEGF-A의 혈관 내피 세포 유사분열촉진 신호의 주요 전달자이다. 추가로, 뉴로필린-1이 헤파린 결합 VEGF-A 이소형에 대한 수용체로서 확인되었고, 이는 혈관 발생시에 소정의 역할을 할 수 있다. 용어 "VEGF" 또는 "VEGF-A"는 또한 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 래트 또는 영장류로부터의 VEGF를 나타낸다. 때때로, 특정 종으로부터의 VEGF는 인간 VEGF의 경우에는 hVEGF, 또는 뮤린(murine) VEGF의 경우에는 mVEGF와 같은 용어로 표시된다. 용어 "VEGF"는 또한 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자의 아미노산 8 내지 109 또는 아미노산 1 내지 109를 포함하는 폴리펩티드의 말단절단 형태 또는 단편을 지칭하는데 사용된다. VEGF의 임의의 상기 형태들에 대한 언급은 본 출원에서 예를 들어 "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" 또는 "VEGF₁₆₅"에 의해 확인될 수 있다. "말단절단된" 천연 VEGF에 대한 아미노산 위치는 천연 VEGF 서열에 표시된 바와 같이 번호매김된다. 예를 들어, 말단절단된 천연 VEGF에서의 아미노산 위치 17 (메티오닌)은 또한 천연 VEGF에서의 위치 17 (메티오닌)이다. 말단절단된 천연 VEGF는 KDR 및 Flt-1 수용체에 대해 천연 VEGF와 유사한 결합 친화도를 갖는다.

본원에 사용된 용어 "VEGF" 또는 "VEGF-A"는 문헌 [Leung et al. (1989) Science 246:1306] 및 [Houck et al. (1991) Mol. Endocrin, 5:1806]에 기재된 바와 같은 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 및 관련 121-, 189- 및 206-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자 및 그의 자연 발생 대립유전자 및 프로세싱된 형태를 나타낸다. 용어 "VEGF"는 또한 비-인간 종, 예를 들어 마우스, 래트 또는 영장류로부터의 VEGF를 나타낸다. 때때로, 특정 종으로부터의 VEGF는 인간 VEGF의 경우에는 hVEGF, 뮤린 VEGF의 경우에는 mVEGF 등과 같은 용어로 표시된다. 용어 "VEGF"는 또한 165-아미노산 인간 혈관 내피 세포 성장 인자의 아미노산 8 내지 109 또는 아미노산 1 내지 109를 포함하는 폴리펩티드의 말단절단 형태를 지칭하는데 사용된다. VEGF의 임의의 상기 형태들에 대한 언급은 본 출원에서 예를 들어 "VEGF (8-109)", "VEGF (1-109)" 또는 "VEGF₁₆₅"에 의해 확인될 수 있다. "말단절단된" 천연 VEGF에 대한 아미노산 위치는 천연 VEGF 서열에 표시된 바와 같이 번호매김된다. 예를 들어, 말단절단된 천연 VEGF에서의 아미노산 위치 17 (메티오닌)은 또한 천연 VEGF에서의 위치 17 (메티오닌)이다. 말단절단된 천연 VEGF는 KDR 및 Flt-1 수용체에 대해 천연 VEGF와 유사한 결합 친화도를 갖는다.

"VEGF 생물학적 활성"은 임의의 VEGF 수용체에 대한 결합 또는 임의의 VEGF 신호전달 활성, 예를 들어 정상적 및 비정상적 혈관신생 및 혈관형성 둘다의 조절 (문헌 [Ferrara and Davis-Smyth (1997) Endocrine Rev. 18:4-25]; [Ferrara (1999) J. Mol. Med. 77:527-543)]), 배아 혈관형성 및 혈관신생의 촉진 (문헌 [Carmeliet et al. (1996) Nature 380:435-439]; [Ferrara et al. (1996) Nature 380:439-442]); 및 여성 생식기에서의 순환적 혈관 증식 및 골 성장 및 연골 형성을 위한 순환적 혈관 증식의 조정 (문헌 [Ferrara et al. (1998) Nature Med. 4:336-340]; [Gerber et al. (1999) Nature Med. 5:623-628])을 포함한다. VEGF는 혈관신생 및 혈관형성에 있어서의 혈관신생 인자인 것 이외에도 다형질성 성장 인자로서 다른 생리 과정, 예를 들어 내피 세포 생존, 혈관 투과성 및 혈관확장, 단핵구 화학주성 및 칼슘 유입에 있어서 여러가지 생물학적 효과를 나타낸다 (문헌 [Ferrara and Davis-Smyth (1997), 상기 문헌] 및 [Cebe-Suarez et al. Cell. Mol. Life Sci. 63:601-615 (2006)]). 추가로, 몇가지 비-내피 세포 유형, 예를 들어 망막 색소 상피 세포, 췌장관 세포 및 쉬반 세포에 대한 VEGF의 유사분열촉진 효과가 최근 연구에서 보고되었다. (문헌 [Guerrin et al. (1995) J. Cell Physiol. 164:385-394], [Oberg-Welsh et al. (1997) Mol. Cell. Endocrinol. 126:125-132], [Sondell et al. (1999) J. Neurosci. 19:5731-5740]).

"VEGF 길항제" 또는 "VEGF-특이적 길항제"는 VEGF에 결합하거나, VEGF 발현 수준을 감소시키거나, 또는 하나 이상의 VEGF 수용체에 대한 VEGF 결합 및 VEGF 매개 혈관신생 및 내피 세포 생존 또는 증식을 포함하는 (이에 제한되지 않음) VEGF 생물학적 활성을 중화, 차단, 억제, 폐지, 감소 또는 방해할 수 있는 분자를 나타낸다. VEGF에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드, 항-VEGF 항체 및 그의 항원-결합 단편, VEGF에 특이적으로 결합하여 하나 이상의 수용체에 대한 그의 결합을 격리시키는 수용체 분자 및 유도체, 융합 단백질 (예를 들어, VEGF-트랩 (리제네론(Regeneron))) 및 VEGF₁₂₁-겔로닌 (페레그린(Peregrine))이 본 발명의 방법에 유용한 VEGF-특이적 길항제로서 포함된다. VEGF-특이적 길항제는 또한, VEGF 폴리펩티드의 길항제 변이체; VEGF 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 적어도 단편에 대해 상보적인 안티센스 뉴클레오염기 올리고머; VEGF 폴리펩티드를 코딩하는 핵산 분자의 적어도 단편에 대해 상보적인 소분자 RNA; VEGF를 표적으로 하는 리보자임; VEGF에 대한 펩티바디; 및 VEGF 아프타머를 포함한다. VEGF-특이적 길항제는 또한 VEGF에 결합하고, VEGF 생물학적 활성을 차단, 억제, 폐지, 감소 또는 방해할 수 있는 비펩티드 소분자를 포함한다. 따라서, 용어 "VEGF 활성"은 구체적으로 VEGF의 VEGF 매개 생물학적 활성을 포함한다. 특정 실시양태에서, VEGF 길항제는 VEGF의 발현 수준 또는 생물학적 활성을 적어도 10％, 20％, 30％, 40％, 50％, 60％, 70％, 80％, 90％ 또는 그 초과 만큼 감소시키거나 억제한다. 일부 실시양태에서, VEGF-특이적 길항제에 의해 억제된 VEGF는 VEGF(8-109), VEGF (1-109) 또는 VEGF₁₆₅이다.

"항-VEGF 항체"는 VEGF에 충분한 친화도 및 특이성으로 결합하는 항체이다. 특정 실시양태에서, 선택된 항체는 정상적으로, VEGF에 대한 충분히 강력한 결합 친화도를 가질 것이고, 예를 들어 이러한 항체는 100 nM 내지 1 pM의 K_d 값으로 hVEGF와 결합할 수 있다. 항체 친화도는, 예를 들어 표면 플라스몬 공명 기재의 분석 (예를 들어, PCT 출원 공개 번호 WO2005/012359에 기재된 바와 같은 BIAcore 분석), 효소-연결 면역흡착 분석 (ELISA) 및 경쟁 분석 (예를 들어, RIA)으로 결정될 수 있다.

특정 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 VEGF 활성이 관여하는 질환 또는 상태를 표적화하고 이를 간섭하는데 있어서의 치료제로서 사용될 수 있다. 또한, 상기 항체를 대상으로 하여 다른 생물학적 활성 분석을 수행하여, 예를 들어 그의 치료제로서의 효과를 평가할 수 있다. 이러한 분석은 당업계에 공지되어 있고, 표적 항원 및 항체의 의도된 용도에 따라 달라진다. 이것의 예는 HUVEC 억제 분석, 종양 세포 성장 억제 분석 (예를 들어, WO 89/06692에 기재된 바와 같음), 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC) 및 보체-매개 세포독성 (CDC) 분석 (미국 특허 제5,500,362호), 및 효능제 활성 또는 조혈 분석 (WO 95/27062 참조)을 포함한다. 항-VEGF 항체는 통상적으로 다른 VEGF 상동체, 예를 들어 VEGF-B 또는 VEGF-C에도 결합하지 않을 것이고, 다른 성장 인자, 예를 들어 PlGF, PDGF 또는 bFGF에도 결합하지 않을 것이다. 한 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 하이브리도마 ATCC HB 10709에 의해 생성되는 모노클로날 항-VEGF 항체 A4.6.1과 동일한 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체이다. 다른 실시양태에서, 항-VEGF 항체는 베바시주맙 (BV; 아바스틴(AVASTIN)(등록상표))이라고 공지된 항체를 포함하나 이에 제한되지 않는, 문헌 [Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에 따라 생성되는 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체이다.

"rhuMAb VEGF" 또는 "아바스틴(등록상표)"으로서 공지되기도 한 항-VEGF 항체 "베바시주맙 (BV)"은 문헌 [Presta et al. (1997) Cancer Res. 57:4593-4599]에 따라서 생성된 재조합 인간화 항-VEGF 모노클로날 항체이다. 이것은 돌연변이된 인간 IgG1 프레임워크 영역, 및 인간 VEGF의 그의 수용체에 대한 결합을 차단하는 뮤린 항-hVEGF 모노클로날 항체 A.4.6.1로부터의 항원-결합 상보성-결정 영역을 포함한다. 베바시주맙의 아미노산 서열의 대략 93％ (대부분의 프레임워크 영역 포함)는 인간 IgG1로부터 유래되고, 서열의 약 7％는 뮤린 항체 A4.6.1로부터 유래된다. 베바시주맙은 분자량 약 149,000 달톤이고 글리코실화된다. 베바시주맙 및 다른 인간화 항-VEGF 항체는 2005년 2월 26일자로 허여된 미국 특허 제6,884,879호 (전체 개시문이 명시적으로 본원에 참고로 도입됨)에 추가로 기재되어 있다. 추가의 바람직한 항체로는 PCT 출원 공개 번호 WO 2005/012359에 기재되어 있는 G6 또는 B20 계열 항체 (예를 들어, G6-31, B20-4.1)를 포함한다. 추가의 바람직한 항체에 대해서는 미국 특허 제7,060,269호, 동 제6,582,959호, 동 제6,703,020호, 동 제6,054,297호, WO 98/45332, WO 96/30046, WO 94/10202, EP 0666868B1, 미국 특허 출원 공개 제2006009360호, 동 제20050186208호, 동 제20030206899호, 동 제20030190317호, 동 제20030203409호 및 동 제20050112126호 및 문헌 [Popkov et al., Journal of Immunological Methods 288:149-164 (2004)]을 참조한다. 다른 바람직한 항체는 잔기 F17, M18, D19, Y21, Y25, Q89, I91, K101, E103 및 C104를 포함하거나, 다르게는 잔기 F17, Y21, Q22, Y25, D63, I83 및 Q89를 포함하는 인간 VEGF 상의 기능적 에피토프에 결합하는 것을 포함한다.

용어 "항체"는 가장 광범위한 의미로 사용되고, 구체적으로는 모노클로날 항체 (완전한 길이의 모노클로날 항체 포함), 폴리클로날 항체, 다중-특이적 항체 (예를 들어, 이중-특이적 항체), 및 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 항체 단편이 포함된다.

"차단" 항체 또는 항체 "길항제"는 이것과 결합하는 항원의 생물학적 활성을 억제 또는 저하시키는 것이다. 예를 들어, VEGF-특이적 길항제 항체는 VEGF와 결합하고, 혈관 내피 세포 증식을 유도하는 VEGF의 능력을 억제한다. 바람직한 차단 항체 또는 길항제 항체는 항원의 생물학적 활성을 완전히 억제한다.

달리 나타내지 않는다면, 표현 "다가 항체"는 본 명세서 전반에 걸쳐 3개 이상의 항원 결합 부위를 포함하는 항체를 나타내는데 사용된다. 다가 항체를 바람직하게는 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖도록 조작하고, 이것은 일반적으로 천연 서열 IgM 또는 IgA 항체가 아니다.

"Fv" 단편은 완전한 항원 인식 및 결합 부위를 함유하는 항체 단편이다. 이러한 영역은 1개의 중쇄 가변 도메인 및 1개의 경쇄 가변 도메인이 단단하게 연결된 이량체로 이루어지며, 이러한 연결은 예를 들어 scFv에서 성질상 공유 결합일 수 있다. 이러한 형태에서, 각 가변 도메인의 3개의 CDR이 상호작용하여 V_H-V_L 이량체 표면의 항원 결합 부위를 규정한다. 전체적으로, 6개의 CDR 또는 이것의 하위세트가 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 1개의 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)일지라도 일반적으로 전체 결합 부위보다 친화도가 낮긴 하지만 항원을 인식하고 결합하는 능력을 갖는다.

본원에 사용된 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체 집단으로부터 수득된 항체를 지칭하는데, 즉 이러한 집단을 구성하는 개개의 항체는 소량으로 존재할 수 있는 가능한 자연 발생 돌연변이를 제외하고는 동일하다. 모노클로날 항체는 단일 항원 부위에 대해 지시되며 고도로 특이적이다. 추가로, 전형적으로 상이한 결정자 (에피토프)에 대해 지시된 상이한 항체를 포함하는 통상의 (폴리클로날) 항체 제제와는 반대로, 각각의 모노클로날 항체는 항원상의 단결정자에 대해 지시된다. 수식어구 "모노클로날"은 항체의 특징을 실질적으로 동종인 항체 집단으로부터 수득된 것으로 나타내며, 임의의 특정한 방법을 통한 항체 생성이 필요하다는 것으로 해석되어서는 안된다. 예를 들어, 본 발명에 따라 사용될 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975)]에 최초로 기재되었던 하이브리도마 방법으로 제조될 수도 있고, 또는 재조합 DNA 방법 (예를 들어, 미국 특허 제4,816,567호 참조)으로 제조될 수도 있다. "모노클로날 항체"는 또한, 예를 들어 문헌 [Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991)] 및 [Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)]에 기재된 기술을 사용하여 파지 항체 라이브러리로부터 단리할 수 있다.

구체적으로, 본원에서의 모노클로날 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부가 특정 종으로부터 유래되거나 특정 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이고, 쇄(들)의 나머지 부분은 또 다른 종으로부터 유래되거나 또 다른 항체 클래스 또는 하위클래스에 속하는 항체의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메라" 항체 (이뮤노글로불린) 뿐만 아니라, 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한 이러한 항체의 단편을 포함한다 (미국 특허 제4,816,567호 및 문헌 [Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855 (1984)]).

"인간화" 형태의 비-인간 (예를 들어, 뮤린) 항체는 비-인간 이뮤노글로불린으로부터 유래된 최소 서열을 함유하는 키메라 항체이다. 대부분의 경우, 인간화 항체는 수용자의 초가변 영역의 잔기가 원하는 특이성, 친화도 및 능력을 보유하는 마우스, 래트, 토끼 또는 비-인간 영장류와 같은 비-인간 종 (공여 항체)의 초가변 영역의 잔기로 치환된 인간 이뮤노글로불린 (수용 항체)이다. 일부 경우에, 인간 이뮤노글로불린의 Fv 프레임워크 영역 (FR) 잔기를 상응하는 비-인간 잔기로 치환한다. 추가로, 인간화 항체는 수용 항체 또는 공여 항체에서는 발견되지 않는 잔기를 포함할 수도 있다. 이러한 변형은 항체 성능이 추가로 개선되게 한다. 일반적으로, 인간화 항체는 1개 이상, 전형적으로는 2개의 가변 도메인을 실질적으로 모두 포함할 것이고, 여기서 모든 또는 실질적으로 모든 초가변 루프는 비-인간 이뮤노글로불린의 것에 상응하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 영역은 인간 이뮤노글로불린 서열의 것이다. 또한, 인간화 항체는 임의로 이뮤노글로불린 불변 영역 (Fc)의 적어도 일부, 전형적으로 인간 이뮤노글로불린의 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 것이다. 추가의 세부사항에 대하여는 문헌 [Jones et al., Nature 321:522-525 (1986)], [Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988)] 및 [Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992)]을 참조한다.

"인간 항체"는 인간에 의해 생성된 항체의 그것에 상응하는 아미노산 서열을 갖고/갖거나 본원에 개시된 바와 같은 인간 항체 제조 기술 중 임의의 것을 이용하여 제조된 것이다. 인간 항체의 이러한 정의에서 비인간 항원-결합 잔기를 포함하는 인간화 항체는 명확하게 제외된다. 인간 항체는 당업계에 공지된 다양한 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 한 실시양태에서, 인간 항체는 파지 라이브러리로부터 선택되는데, 이러한 파지 라이브러리는 인간 항체를 발현한다 (문헌 [Vaughan et al. Nature Biotechnology 14:309-314 (1996)]: [Sheets et al. Proc. Natl. Acad. Sci. 95:6157-6162 (1998)]; [Hoogenboom and Winter, J. Mol. Biol., 227:381 (1991)]; [Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581 (1991)] 참조). 인간 항체는 인간 이뮤노글로불린 유전자좌를 내인성 이뮤노글로불린 유전자가 부분적으로 또는 완전히 불활성화된 트랜스제닉 동물, 예를 들어 마우스에 도입시켜 제조될 수도 있다. 시험접종시에, 인간 항체 생성이 관찰되고, 이것은 유전자 재배열, 조립 및 항체 레퍼토리를 비롯한 모든 면에서 인간에서 관찰되는 것과 매우 유사하다. 이러한 접근법은, 예를 들어 미국 특허 제5,545,807호; 제5,545,806호; 제5,569,825호; 제5,625,126호; 제5,633,425호; 제5,661,016호, 및 하기 학술 문헌 [Marks et al., Bio/Technology 10:779-783 (1992)]; [Lonberg et al., Nature 368:856-859 (1994)]; [Morrison, Nature 368:812-13 (1994)]; [Fishwild et al., Nature Biotechnology 14:845-51 (1996)]; [Neuberger, Nature Biotechnology 14:826 (1996)]; 및 [Lonberg and Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13:65-93 (1995)]에 기재되어 있다. 다르게는, 인간 항체는 표적 항원에 대해 지시된 항체를 생성하는 인간 B 림프구를 불멸화시킴으로써 제조될 수 있다 (이러한 B 림프구는 개체로부터 회수될 수도 있고, 또는 시험관내 면역화되었을 수도 있음). 예를 들어, 문헌 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p. 77 (1985)], [Boerner et al., J. Immunol., 147 (1):86-95 (1991)] 및 미국 특허 제5,750,373호를 참조한다.

"단리된" 폴리펩티드 또는 "단리된" 항체는 그의 천연 환경의 성분으로 확인되어 이러한 천연 환경으로부터 분리 및/또는 회수시킨 것이다. 그의 천연 환경의 오염 성분은 폴리펩티드 또는 항체에 대한 진단적 또는 치료적 용도를 방해할 수도 있는 물질인데, 이에는 효소, 호르몬, 및 다른 단백질성 또는 비-단백질성 용질이 포함될 수 있다. 바람직한 실시양태에서, 폴리펩티드 또는 항체는 (1) 로우리(Lowry) 방법에 의한 측정시, 폴리펩티드 또는 항체의 95중량％ 초과, 가장 바람직하게는, 99중량％ 초과 수준까지, (2) 스피닝 컵(spinning cup) 서열분석기를 사용하여 N-말단 또는 내부 아미노산 서열의 적어도 15개의 잔기를 얻기에 충분한 수준까지 또는 (3) 쿠마시 블루 또는 바람직하게는 은 염색을 사용하여 환원 또는 비환원 조건하에 SDS-PAGE에 의해 균질해질 때까지 정제될 것이다. 단리된 폴리펩티드 또는 항체에는 재조합 세포 내의 계내 폴리펩티드 또는 항체가 포함되는데, 이는 폴리펩티드의 천연 환경의 하나 이상의 성분이 존재하지 않을 것이기 때문이다. 그러나, 통상적으로 단리된 폴리펩티드 또는 항체는 한 가지 이상의 정제 단계에 의해 제조될 것이다.

본원에서 사용된 "치료"는 치료될 개체 또는 세포의 자연적인 과정을 변경하려는 시도에서의 임상적 개입을 나타내고, 예방을 위해 또는 임상 병리학의 과정 도중에 수행될 수 있다. 원하는 치료 효과에는 질환의 발생 또는 재발을 예방하고, 증상을 완화시키며, 질환의 임의의 직접적 또는 간접적 병적 결과를 경감시키며, 질환 진행 속도를 감소시키고, 질환 상태를 개선시키거나 일시적으로 완화시키며, 차도시키거나 예후를 개선시키는 것이 포함된다. 일부 실시양태에서, 본 발명의 방법 및 조성물은 질환 또는 장애의 발병을 지연시키기 위한 시도에서 유용하다.

"유효량"은 원하는 치료 또는 예방 결과 달성에 필요한 용량에서 그러한 기간 동안 효과적인 양을 나타낸다. 치료제의 "치료 유효량"은 개체의 질환 상태, 연령, 성별 및 체중, 개체에서 원하는 반응을 유도하기 위한 항체의 능력과 같은 요인에 따라 달라질 수 있다. 치료 유효량은 또한 치료제의 임의의 독성 또는 유해 효과보다 치료상 유익한 효과가 더 큰 양이다. "예방 유효량"은 원하는 예방 결과 달성에 필요한 용량 및 그러한 기간 동안 효과적인 양을 나타낸다. 반드시는 아니지만, 일반적으로 예방 용량은 질환 발생 전에 또는 질환의 초기 단계에 대상체에 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량 미만일 것이다. 전암성, 양성, 조기 또는 말기 종양의 경우, 혈관형성 억제제의 치료 유효량은 암 세포의 수를 감소시킬 수도 있고/거나; 원발성 종양의 크기를 축소시킬 수도 있고/거나; 말초 기관 내로의 암 세포 침윤을 억제 (즉, 어느 정도 속도를 느리게 하고, 바람직하게는 정지)시킬 수 있고/거나; 종양 전이를 억제 (즉, 어느 정도 느리게 하고, 바람직하게는 정지)시킬 수 있고/거나; 종양 성장을 어느 정도까지 억제할 수도 있고/거나; 장애와 관련된 하나 이상의 증상을 어느 정도까지 완화시킬 수도 있다. 약물이 기존 암 세포의 성장을 예방하고/하거나 기존 암 세포를 사멸시킬 수 있는 정도라면, 이것은 세포증식 억제성 및/또는 세포독성일 수 있다. 암 요법의 경우, 생체내 효능은 예를 들어 생존 기간, 질환 진행까지의 시간 (TTP), 반응률 (RR), 반응 지속기간, 및/또는 삶의 질을 평가하여 측정될 수 있다.

"단기간 무진행 생존"은 1차 종양 평가 시점에서의 진행 상태를 나타낸다. 암 또는 종양의 유형에 따라서, 1차 종양 평가 시점은 치료 시작 이후 약 4개월, 3개월, 2개월, 또는 1개월이 경과한 때이다. 1차 종양 평가 시간은 특정 질환의 진행 속도에 따라 달라진다. 한 실시양태에서, 신장암에 대한 1차 종양 평가 시간은 항암 요법 시작 이후 56일이 경과한 때이다.

용어 "암" 및 "암성"은 조절되지 않는 세포 성장을 전형적인 특징으로 하는 포유동물의 생리적 상태를 지칭하거나 기재한다. 이 정의에는 양성 및 악성 암이 포함된다. 암의 예는 암종, 림프종, 아세포종, 육종 및 백혈병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이러한 암의 보다 특정한 예에는 편평 세포 암, 폐암 (소세포 폐암, 비소세포 폐암, 폐의 선암종 및 폐의 편평 암종 포함), 복막암, 간세포성 암, 위암 (위장암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 각종 유형의 두경부암 뿐만 아니라; B-세포 림프종 [저등급/여포성 비-호지킨 림프종 (NHL); 소 림프구성 (SL) NHL; 중등급/여포성 NHL; 중등급 미만성 NHL; 고등급 면역모세포성 NHL; 고등급 림프모구성 NHL; 고등급 소 비-분할 세포 NHL; 거대 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 포함]; 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프아성 백혈병 (ALL); 모발 세포 백혈병; 만성 골수모구성 백혈병; 및 이식 후 림프구증식성 장애 (PTLD) 뿐만 아니라 모반증과 연관된 비정상적 혈관 증식, 부종 (예를 들어, 뇌 종양과 연관된 부종), 및 메이그스 증후군이 포함되지만, 그에 제한되지 않는다.

"대상체" 또는 "환자"는 인간 또는 비-인간 포유동물, 예를 들어 소, 말, 개, 양 또는 고양이를 포함하지만 이에 제한되지 않는 포유동물을 나타낸다. 바람직하게는, 대상체 또는 환자는 인간이다.

용어 "항암 요법"은 암 치료에 유용한 요법을 나타낸다. 항암 치료제의 예는 예를 들어 화학요법제, 성장 억제제, 세포독성제, 방사선 요법에 사용되는 작용제, 항혈관신생제, 세포자멸제, 항튜불린제, 및 암 치료를 위한 다른 작용제, 예를 들어 항-HER-2 항체, 항-CD20 항체, 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 길항제 (예를 들어, 티로신 키나제 억제제), HER1/EGFR 억제제 (예를 들어, 에를로티닙 (타르세바(Tarceva)(상표명))), 혈소판 유래 성장 인자 억제제 (예를 들어, 글리벡(Gleevec)(상표명) (이마티닙 메실레이트)), COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브), 인터페론, 시토카인, VEGF, ErbB2, ErbB3, ErbB4, PDGFR-베타, BlyS, APRIL, BCMA 또는 VEGF 수용체(들) 표적 중 하나 이상과 결합하는 길항제 (예를 들어, 중화 항체), TRAIL/Apo2, 및 다른 생물활성 및 유기 화학제 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들의 조합물 역시 본 발명에 포함된다.

"혈관신생 인자 또는 작용제"는 혈관의 발달을 자극하는데 관여하는, 예를 들어 혈관신생, 내피 세포 성장, 혈관의 안정성 및/또는 혈관형성 등을 촉진하는 성장 인자 또는 그의 수용체이다. 예를 들어 혈관신생 인자는, 예를 들어 VEGF 및 VEGF 계열의 구성원 및 그의 수용체 (VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D, VEGFR1, VEGFR2 및 VEGFR3), PlGF, PDGF 계열, 섬유모세포 성장 인자 계열 (FGF), TIE 리간드 (안지오포이에틴, ANGPT1, ANGPT2), TIE1, TIE2, 에프린, Bv8, 델타-유사 리간드 4 (DLL4), Del-1, 섬유모세포 성장 인자: 산성 (aFGF) 및 염기성 (bFGF), FGF4, FGF9, BMP9, BMP10, 폴리스타틴, 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), GM-CSF, 간세포 성장 인자 (HGF)/산란 인자 (SF), 인터류킨-8 (IL-8), CXCL12, 렙틴, 미드카인, 뉴로필린, NRP1, NRP2, 태반 성장 인자, 혈소판 유래 내피 세포 성장 인자 (PD-ECGF), 혈소판 유래 성장 인자, 특히 PDGF-BB, PDGFR-알파 또는 PDGFR-베타, 플레이오트로핀 (PTN), 프로그라뉴린, 프로리퍼린, 형질전환 성장 인자-알파 (TGF-알파), 형질전환 성장 인자-베타 (TGF-베타), 종양 괴사 인자-알파 (TNF-알파), Alk1, CXCR4, Notch1, Notch4, Sema3A, Sema3C, Sema3F, Robo4 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 이것은 혈관신생을 촉진하는 인자, 예컨대 ESM1 및 페를리칸을 추가로 포함할 것이다. 이것은 또한 상처 치유를 가속화하는 인자, 예컨대 성장 호르몬, 인슐린-유사 성장 인자-I (IGF-I), VIGF, 표피 성장 인자 (EGF), EGF-유사 도메인, 멀티플 7 (EGFL7), CTGF 및 그의 계열의 구성원, 및 TGF-알파 및 TGF-베타를 포함할 것이다. 예를 들어 문헌 [Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39]; [Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179]; [Ferrara & Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364]; [Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556] (예를 들어, 공지된 혈관신생 인자를 나열한 표 1); 및 [Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206]을 참조한다.

"항혈관신생제", "혈관신생 억제제", "항혈관신생발생제" 또는 "혈관신생발생 억제제"는 혈관신생, 혈관형성, 또는 바람직하지 않은 혈관 투과성을 직접적으로 또는 간접적으로 억제하는 적은 분자량의 물질, 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, 억제성 RNA (RNAi 또는 siRNA)), 폴리펩티드, 단리된 단백질, 재조합 단백질, 항체, 또는 이들의 접합체 또는 융합 단백질을 나타낸다. 항혈관신생제는 혈관신생 인자 또는 그의 수용체에 결합하고 이것의 혈관신생 활성을 차단하는 작용제를 포함한다는 것을 이해해야 한다. 예를 들어, 항혈관신생제는 상기 정의된 바와 같은 혈관신생제에 대한 항체 또는 다른 길항제, 예를 들어 VEGF-A 또는 VEGF-A 수용체 (예를 들어, KDR 수용체 또는 Flt-1 수용체)에 대한 항체, 항-PDGFR 억제제, 예를 들어 글리벡(등록상표) (이마티닙 메실레이트)), VEGF 수용체 신호전달을 차단하는 소분자 (예를 들어, PTK787/ZK2284, SU6668, 수텐트(SUTENT)(등록상표)/SU11248 (수니티닙 말레이트), AMG706, 또는 예를 들어 국제 특허 출원 WO 2004/113304에 기재된 것들)이다. 항혈관신생제는 하기 제제들: VEGF 억제제, 예를 들어, VEGF-특이적 길항제, EGF 억제제, EGFR 억제제, 에르비툭스(등록상표) (세툭시맙, 임클론 시스템즈, 인크.(ImClone Systems, Inc.), 미국 뉴저지주 브랜치버그), 벡티빅스(등록상표) (파니투무맙, 암젠(Amgen), 미국 캘리포니아주 싸우전드 오크스), TIE2 억제제, IGF1R 억제제, COX-II (시클로옥시게나제 II) 억제제, MMP-2 (매트릭스-메탈로프로테이나제 2) 억제제, 및 MMP-9 (매트릭스-메탈로프로테이나제 9) 억제제, CP-547,632 (미국 뉴욕주 화이자 인크.(Pfizer Inc.)), 액시티닙(Axitinib) (화이자 인크.; AG-013736), ZD-6474 (아스트라제네카(AstraZeneca)), AEE788 (노파르티스(Novartis)), AZD-2171), VEGF 트랩 (리제네론/아벤티스(Aventis)), 바타라닙(Vatalanib) (또한, PTK-787, ZK-222584로도 알려져 있음: 노파르티스 & 셰링 A G(Schering A G)), 마큐젠(Macugen) (페갑타닙 옥타소듐, NX-1838, EYE-001, 화이자 인크./길레드(Gilead)/아이테크(Eyetech)), IM862 (미국 워싱턴주 커클랜드 소재의 사이트란 인크.(Cytran Inc.)); 및 리보자임(Ribozyme: 콜로라도주 볼더 소재) 및 키론(Chiron: 캘리포니아주 에머리빌 소재)으로부터 입수한 합성 리보자임인 안지오자임, 및 그의 조합물을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 다른 혈관신생 억제제는 트롬보스폰딘1, 트롬보스폰딘2, 콜라겐 IV 및 콜라겐 XVIII를 포함한다. VEGF 억제제는 미국 특허 제6,534,524호 및 제6,235,764호 (둘 모두의 전문이 모든 목적을 위해 본원에서 참고로 도입된다)에 개시되어 있다. 항혈관신생제는 또한 천연 혈관신생 억제제, 예를 들어 안지오스타틴, 엔도스타틴 등을 포함한다. 예를 들어, 문헌 [Klagsbrun and D'Amore (1991) Annu. Rev. Physiol. 53:217-39]; [Streit and Detmar (2003) Oncogene 22:3172-3179] (예를 들어, 악성 흑색종에서의 항혈관신생 요법을 나열한 표 3); [Ferrara ＆ Alitalo (1999) Nature Medicine 5(12):1359-1364]; [Tonini et al. (2003) Oncogene 22:6549-6556] (예를 들어, 공지된 항혈관신생 인자를 나열한 표 2); 및 [Sato (2003) Int. J. Clin. Oncol. 8:200-206] (예를 들어, 임상 시험에서 사용된 항혈관신생제를 나열한 표 1)을 참조한다.

용어 "항혈관신생 요법"은 항혈관신생제를 투여하는 것을 포함하는, 혈관신생을 억제시키는데 유용한 요법을 나타낸다.

본원에 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 억제 또는 저해하고/하거나 세포의 파괴를 야기하는 물질을 나타낸다. 상기 용어는 방사성 동위원소 (예를 들어, I¹³¹, I¹²⁵, Y⁹⁰ 및 Re¹⁸⁶), 화학요법제, 및 독소, 예를 들어 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소 활성 독소, 또는 그의 단편을 포함한다.

"화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 암 치료에 유용한 화학적 화합물을 포함한다. 화학요법제의 예로는 알킬화제 예를 들어 티오테파 및 사이톡산(CYTOXAN)(등록상표) 시클로스포스파미드; 알킬 술포네이트 예를 들어 부설판, 임프로설판 및 피포설판; 아지리딘 예를 들어 벤조도파, 카르보쿠온, 메투레도파, 및 우레도파; 알트레타민, 트리에틸렌멜라민, 트리에틸렌포스포르아미드, 트리에틸렌티오포스포르아미드 및 트리메틸롤로멜라민이 포함되는, 에틸렌이민 및 메틸라멜라민; 아세토게닌 (특히 불라타신 및 불라타시논); 캄토테신 (합성 유사체 토포테칸 포함); 브리오스타틴; 칼리스타틴; CC-1065 (이의 아도젤레신, 카르젤레신 및 비젤레신 합성 유사체 포함); 크립토파이신 (특히 크립토파이신 1 및 크립토파이신 8); 돌라스타틴; 듀오카르마이신 (합성 유사체인 KW-2189 및 CB1-TM1 포함); 엘레우테로빈; 판크라티스타틴; 사르코딕타인; 스폰지스타틴; 질소 머스타드 예를 들어 클로람부실, 클로르나파진, 클로로포스파미드, 에스트라무스틴, 이포스파미드, 메클로레타민, 메클로레타민 옥시드 히드로클로라이드, 멜팔란, 노벰비친, 페네스테린, 프레드니무스틴, 트로포스파미드, 우라실 머스타드; 니트로스우레아 예를 들어 카르무스틴, 클로로조토신, 포테무스틴, 로무스틴, 니무스틴, 및 라니무스틴; 항생제 예를 들어 엔다이인 항생제 (예를 들어, 칼리키아마이신, 특히 칼리키아마이신 감마1I 및 칼리키아마이신 오메가I1 (예를 들어, 문헌 [Agnew, Chem Intl. Ed. Engl., 33:183-186 (1994)] 참조); 디네미신 (디네미신 A 포함); 비스포스포네이트, 예를 들어 클로드로네이트; 에스페라미신 뿐만 아니라; 네오카르지노스타틴 발색단 및 관련 색소단백질 엔다이인 항생제 발색단), 아클라시노마이신, 악티노마이신, 아우트라마이신, 아자세린, 블레오마이신, 칵티노마이신, 카라비신, 카르미노마이신, 카르지노필린, 크로모마이시니스, 닥티노마이신, 다우노루비신, 데토루비신, 6-디아조-5-옥소-L-노르류신, 아드리아마이신(ADRIAMYCIN)(등록상표) 독소루비신 (모르폴리노-독소루비신, 시아노모르폴리노-독소루비신, 2-피롤리노-독소루비신 및 데옥시독소루비신 포함), 에피루비신, 에소루비신, 이다루비신, 마르셀로마이신, 미토마이신 (예를 들어, 미토마이신 C), 미코페놀산, 노갈라마이신, 올리보마이신, 페플로마이신, 포트피로마이신, 푸로마이신, 쿠엘라마이신, 로도루비신, 스트렙토니그린, 스트렙토조신, 투베르시딘, 우베니멕스, 지노스타틴, 조루비신; 항대사물, 예를 들어 메토트렉세이트 및 5-플루오로우라실 (5-FU); 엽산 유사체, 예를 들어 데노프테린, 메토트렉세이트, 프테로프테린, 트리메트렉세이트; 퓨린 유사체, 예를 들어 플루다라빈, 6-메르캅토퓨린, 티아미프린, 티오구아닌; 피리미딘 유사체, 예를 들어 안시타빈, 아자시티딘, 6-아자우리딘, 카르모푸르, 시타라빈, 디데옥시우리딘, 독시플루리딘, 에노시타빈, 플록수리딘; 안드로겐, 예를 들어 칼루스테론, 드로모스타놀론 프로피오네이트, 에피티오스타놀, 메피티오스탄, 테스토락톤; 항부신제, 예를 들어 아미노글루테티미드, 미토탄, 트릴로스탄; 엽산 보충물, 예를 들어 프롤린산; 아세글라톤; 알도포스파미드 글리코시드; 아미노레불린산; 에닐우라실; 암사크린; 베스트라부실; 비산트렌; 에다트락세이트; 데포파민; 데메콜신; 디아지쿠온; 엘포르니틴; 엘리프티늄 아세테이트; 에포틸론; 에토글루시드; 질산갈륨; 히드록시우레아; 렌티난; 로니다이닌; 마이탄시노이드, 예를 들어 마이탄신 및 안사미토신; 미토구아존; 미톡산트론; 모피단몰; 니트라에린; 펜토스타틴; 페나메트; 피라루비신; 로속산트론; 포도필린산; 2-에틸히드라지드; 프로카르바진; PSK(등록상표) 폴리사카라이드 복합체 (JHS 내추럴 프로덕츠(JHS Natural Products), 오레곤주 유진 소재); 라족산; 리족신; 시조피란; 스피로게르마늄; 테누아존산; 트리아지쿠온; 2,2',2"-트리클로로트리에틸아민; 트리코테센 (특히, T-2 독소, 베라쿠린 A, 로리딘 A 및 안구이딘); 우레탄; 빈데신; 다카르바진; 만노무스틴; 미토브로니톨; 미토락톨; 피포브로만; 가시토신; 아라비노시드 ("Ara-C"); 시클로포스파미드; 티오테파; 탁소이드, 예를 들어 탁솔(TAXOL)(등록상표) 파클리탁셀 (브리스톨-마이어스 스퀴브 옹콜로지(Bristol-Myers Squibb Oncology), 뉴저지주 프린스턴 소재), 아브락산(ABRAXANE)(상표명) 크레모포르-무함유, 파클리탁셀의 알부민-조작된 나노입자 제제 (아메리칸 파마슈티칼 파트너스(American Pharmaceutical Partners), 일리노이주 샴버그 소재), 및 탁소테레(TAXOTERE)(등록상표) 도세탁셀 (론-프랑 롤러(Rhone-Poulenc Rorer), 프랑스 안토니 소재); 클로란부실; 겜자르(GEMZAR)(등록상표) 겜시타빈; 6-티오구아닌; 메르캅토퓨린; 메토트렉세이트; 백금 유사체, 예를 들어 시스플라틴 및 카르보플라틴; 빈블라스틴; 백금; 에토포시드 (VP-16); 이포스파미드; 미톡산트론; 빈크리스틴; 나벨빈(NAVELBINE)(등록상표) 비노렐빈; 노반트론; 테니포시드; 에다트렉세이트; 다우노마이신; 아미노프테린; 크셀로다; 이반드로네이트; 이리노테칸 (캄프토사르(Camptosar), CPT-11) (이리노테칸과 5-FU 및 류코보린과의 치료 방식 포함); 토포이소머라제 억제제 RFS 2000; 디플루오로메틸오르니틴 (DMFO); 레티노이드 (예를 들어, 레티노산); 카페시타빈; 콤브레타스타틴; 류코보린 (LV); 옥살리플라틴 (옥살리플라틴 치료 방식 (폴폭스(FOLFOX)) 포함); PKC-알파, Raf, H-Ras, EGFR (예를 들어, 에를로티닙 (타르세바)(상표명)) 및 세포 증식을 저하시키는 VEGF-A의 억제제; 및 상기 언급된 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.

또한, 상기 정의에는 종양에 대한 호르몬 작용을 조절하거나 억제하는 작용을 하는 항-호르몬제, 예를 들어 항-에스트로겐 및 선택적인 에스트로겐 수용체 조절제 (SERM), 예를 들어 타목시펜 (놀바덱스(NOLVADEX)(등록상표) 타목시펜 포함), 랄록시펜, 드롤록시펜, 4-히드록시타목시펜, 트리옥시펜, 케옥시펜, LY117018, 오나프리스톤, 및 파레스톤(FARESTON)ㆍ도레미펜, 부신에서의 에스트로겐 생성을 조절하는 효소 아로마타제를 억제하는 아로마타제 억제제, 예를 들어 4(5)-이미다졸, 아미노글루테티미드, 메가스(MEGASE)(등록상표) 메게스트롤 아세테이트, 아로마신(AROMASIN)(등록상표) 엑세메스탄, 포르메스타니, 파드로졸, 리비소르(RIVISOR)(등록상표) 보로졸, 페마라(FEMARA)(등록상표) 레트로졸, 및 아리미덱스(ARIMIDEX)(등록상표) 아나스트로졸; 및 항-안드로겐, 예를 들어 플루타미드, 닐루타미드, 비칼루타미드, 류프롤리드 및 고세렐린 뿐만 아니라; 트록사시타빈 (1,3-디옥솔란 뉴클레오시드 시토신 유사체); 안티센스 올리고뉴클레오티드, 특히 이상 세포 증식과 관련이 있는 신호전달 경로에서의 유전자 발현을 억제하는 것, 예를 들어 PKC-알파, Raf 및 H-Ras; 리보자임, 예를 들어 VEGF 발현 억제제 (예를 들어, 안지오자임(ANGIOZYME)(등록상표) 리보자임) 및 HER2 발현 억제제; 백신, 예를 들어 유전자 요법 백신, 예를 들어 알로벡틴(ALLOVECTIN)(등록상표) 백신, 류벡틴(LEUVECTIN)(등록상표) 백신, 및 박시드(VAXID)(등록상표) 백신; 프로류킨(PROLEUKIN)(등록상표) rIL-2; 루르토테칸(LURTOTECAN)(등록상표) 토포이소머라제 1 억제제; 아바렐릭스(ABARELIX)(등록상표) rmRH; 비노렐빈 및 에스페라마이신 (미국 특허 제4,675,187호 참조) 및 이들 중 임의의 것의 제약상 허용되는 염, 산 또는 유도체가 포함된다.

"방사선 요법"은, 정상적으로 기능하거나 세포를 파괴시키는 능력이 완전히 제한되도록 세포에 대한 충분한 손상을 유도시키기 위해 지정된 감마선 또는 베타선을 사용하는 것을 나타낸다. 당업계에는 투여량 및 치료 기간을 결정하는 수많은 방법이 공지되어 있음을 이해할 것이다. 전형적인 치료는 1회 투여로 제공되며, 전형적인 투여량은 1일 당 10 내지 200 단위 (그레이(Gray))의 범위이다.

"감소 또는 억제"는 참조물과 비교하여 활성, 기능 및/또는 양을 감소시키거나 줄이는 것이다. "감소 또는 억제"는 바람직하게는 20％ 이상, 더욱 바람직하게는 50％ 이상, 가장 바람직하게는 75％, 85％, 90％, 95％ 이상의 전반적인 감소를 야기하는 능력을 나타낸다. 감소 또는 억제는 치료할 장애의 증상, 전이의 존재 또는 크기, 원발성 종양의 크기, 또는 혈관신생 장애에서 혈관의 크기 또는 수를 지칭할 수 있다.

본원에서, 용어 "진단"은 분자 또는 병리 상태, 질환 또는 상태의 확인, 예를 들어 암의 확인을 지칭하거나, 또는 특정 치료 방식이 이로울 수 있는 암 환자의 확인을 지칭하는데 사용된다. 본원에서, 용어 "예후"는 항암 요법으로 인한 임상적 이로움의 가능성의 예측을 지칭하는데 사용된다. 본원에서, 용어 "예측"은 환자가 특정 항암 요법에 대하여 유리하게 또는 불리하게 반응할 가능성을 지칭하는데 사용된다. 한 실시양태에서, 예측은 이러한 반응의 정도에 관한 것이다. 한 실시양태에서, 예측은 환자가 치료, 예를 들어 특정 치료제를 사용한 치료 이후에 질환의 재발 없이 특정 기간 동안 생존하거나 개선되는지의 여부 및/또는 그러할 확률과 관련이 있다. 본 발명의 예측 방법은 임의의 특정 환자에 대한 가장 적절한 치료 방식을 선택하여 치료를 결정하는데 임상적으로 사용될 수 있다. 본 발명의 예측 방법은 환자가 치료 방식, 예를 들어 주어진 치료 방식, 예를 들어 주어진 치료제 또는 조합물의 투여, 수술적 개입, 스테로이드 처치 등에 유리하게 반응할 것인지의 여부 또는 치료 방식 수행 후에 환자의 장기간 생존이 가능한지의 여부를 예측할 때 유용한 도구이다.

"환자 반응"은 (1) 질환 진행의 어느 정도까지의 억제, 예를 들어 저속화 및 완전한 성장 정지, (2) 병변 크기의 감소, (3) 인접한 말초 장기 및/또는 조직으로의 종양 세포 침윤의 억제 (즉, 감소, 저속화 또는 완전한 정지), (4) 질환 확산의 억제 (즉, 감소, 저속화 또는 완전한 정지), (5) 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 완화, (6) 처치 후 무병 상태를 보이는 기간의 증가, 및/또는 (8) 처치 후 주어진 시점에서의 사망률 감소를 포함하지만 이에 제한되지 않는, 환자에 대한 이로움을 나타내는 임의의 종점을 이용하여 평가할 수 있다.

용어 "장기간 생존"은 요법 처치 이후 적어도 1년, 5년, 8년, 또는 10년 동안 생존해 있는 것을 나타내는 것으로 본원에서 사용된다.

용어 "이로움"은 가장 광범위한 의미로 사용되고, 임의의 바람직한 효과를 지칭하며, 구체적으로는 본원에서 정의된 바와 같은 임상적 이로움을 포함한다.

임상적 이로움은 다양한 종점, 예를 들어 질환 진행의 어느 정도까지의 억제, 예를 들어 저속화 및 완전한 성장 정지, 질환 에피소드 및/또는 증상의 수 감소, 병변 크기의 감소, 인접한 말초 장기 및/또는 조직으로의 질환 세포 침윤의 억제 (즉, 감소, 저속화 또는 완전한 정지), 질환 확산의 억제 (즉, 감소, 저속화 또는 완전한 정지), 질환 병변을 퇴행시키거나 제거할 수는 있지만 반드시 그래야 하는 것은 아닌 자가면역 반응의 감소, 장애와 관련된 하나 이상의 증상의 어느 정도까지의 완환, 처치 후 무병 상태, 예를 들어 무진행 생존을 보이는 기간의 증가, 전체 생존의 증가, 반응율의 증가, 및/또는 처치 후 주어진 시점에서의 사망률 감소를 평가하여 측정할 수 있다.

II. 본 발명의 방법

본 발명은 부분적으로, 암 치료를 위한 항혈관신생 요법이 보이는 감소된 임상적 이로움과 서로 관련성이 있는 특이적 바이오마커를 확인하는 것을 토대로 이루어진 것이다. 따라서, 본 개시된 방법 및 분석법은 암 환자를 치료하는데 있어 적절하거나 효과적인 요법을 평가하는데 유용한 데이터 및 정보를 수득하기 위한, 편리하고, 효율적이며, 잠재적으로는 비용면에서도 효과적인 수단을 제공한다. 예를 들어, 조직 또는 세포 샘플을 수득하기 위해 암 환자에서 생검을 수행할 수 있거나, 또는 혈장 샘플을 환자로부터 수득할 수 있고, 상기 샘플을 각종 시험관내 분석법으로 검사하여 PlGF의 발현이 대조군 또는 참조 샘플에 비해 증가하였는지 여부를 결정할 수 있다. 발현이 증가한 것으로 검출되었다면, 환자는 아마도 항혈관신생 요법이 아닌 또는 항혈관신생 요법에 추가한 항암 요법으로도 이로울 수 있게 될 것이다. 따라서, 본 발명은 항혈관신생 요법이 아닌 또는 항혈관신생 요법에 추가한 항암 요법이 이로울 수 있는 암 환자로부터 수득한 샘플에서 태반 성장 인자 (PlGF)의 발현 수준을 검출하는 단계를 포함하며, 여기서 상기 샘플에서 PlGF의 발현이 참조 샘플에 비해 증가하는 것이 상기 환자에게 항혈관신생 요법이 아닌 또는 항혈관신생 요법에 추가한 항암 요법이 이로울 수 있음을 나타내는 것인, 항혈관신생 요법이 아닌 또는 항혈관신생 요법에 추가한 항암 요법이 이로울 수 있는 암 환자를 확인하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 암 치료 시작 이전에 환자로부터 수득하고, 여기서 샘플은 28 pg/ml 초과의 PlGF의 발현 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 샘플은 최근 항혈관신생 요법을 처치받은 환자로부터 수득하고, 여기서 샘플은 50 pg/ml 초과의 PlGF의 발현 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈장 샘플이다.

본 발명은 또한 암 환자로부터 수득한 샘플에서 PlGF의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 PlGF의 발현 수준이 참조 샘플에 비해 증가하는 것이 상기 환자가 단독 항혈관신생 요법에 대해 덜 반응성일 수 있음을 나타내는 것인, 항혈관신생 요법에 대한 암 환자의 반응성을 예측하는 방법을 제공한다. 일부 실시양태에서, 샘플은 암 치료 시작 이전에 환자로부터 수득하고, 여기서 샘플은 28 pg/ml 초과의 PlGF의 발현 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 샘플은 최근에 항혈관신생 요법을 받고 있는 환자로부터 수득하고, 여기서 샘플은 50 pg/ml 초과의 PlGF의 발현 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 샘플은 혈장 샘플이다. 또한, 암 환자에게 항혈관신생 요법이 아닌 또는 항혈관신생 요법에 추가한 항암 요법을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 환자로부터 수득한 샘플이 참조 샘플에 비해 증가한 PlGF의 발현 수준을 나타내는 것인, 암 환자의 치료 방법이 제공된다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 환자로부터 수득한 샘플에서 PlGF의 발현 수준을 결정하는 것을 포함하며, 여기서 PlGF의 발현 수준이 참조 샘플에 비해 증가하는 것이 환자가 단독 항혈관신생 요법에 덜 반응성일 수 있음을 나타내는 것인, 암 치료에 대한 치료 효능을 최적화하는 방법을 제공한다. 샘플은 치료 시작 이전에 환자로부터 수득할 수 있다. 샘플은 치료 시작 이후에 환자로부터 수득할 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플은 28 pg/ml 이하의 PlGF의 발현 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 샘플은 최근에 항혈관신생 요법으로 치료받은 환자로부터 수득할 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플은 50 pg/ml 이하의 PlGF의 발현 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항혈관신생 요법은 VEGF 길항제, 예를 들어 항-VEGF 항체, 예를 들어 베바시주맙의 투여를 포함한다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 암 환자에게 항혈관신생 요법을 투여하는 것을 포함하며, 여기서 상기 환자로부터 수득한 샘플이 참조 샘플에 비해 낮은 PlGF의 발현 수준을 나타내는 것인, 암 환자의 치료 방법을 제공한다. 샘플은 치료 시작 이전에 환자로부터 수득할 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플은 28 pg/ml 이하의 PlGF의 발현 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 샘플은 최근에 항혈관신생 요법으로 치료받은 환자로부터 수득할 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플은 50 pg/ml 이하의 PlGF의 발현 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 항혈관신생 요법은 VEGF 길항제, 예를 들어 항-VEGF 항체, 예를 들어 베바시주맙의 투여를 포함한다.

본 발명의 방법은 암 환자를 포함한다. 암은 예를 들어, 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및/또는 백혈병일 수 있다. 상기 암의 보다 특정한 예는 편평 세포 암, 폐암(소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 폐의 선암종, 및 폐의 편평세포 암종 포함), 복막암, 간세포성 암, 위암 (위장암 포함), 췌장암, 교모세포종, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 결장직장암, 자궁내막 또는 자궁 암종, 타액선 암종, 신장암 또는 신암, 간암, 전립선암, 외음부암, 갑상선암, 간 암종 및 다양한 유형의 두경부암 뿐만 아니라, B-세포 림프종 (저등급/여포성 비-호지킨 림프종 (NHL); 소 림프구성 (SL) NHL; 중등급/여포성 NHL; 중등급 미만성 NHL; 고등급 면역모세포성 NHL; 고등급 림프모구성 NHL; 고등급 소 비-분할 세포 NHL; 거대 질환 NHL; 외투 세포 림프종; AIDS-관련 림프종 및 발덴스트롬 마크로글로불린혈증 포함); 만성 림프구성 백혈병 (CLL); 급성 림프모구성 백혈병 (ALL); 모발상 세포 백혈병; 만성 골수모구성 백혈병; 및 이식 후 림프구증식성 장애 (PTLD) 뿐만 아니라, 모반증, 부종 (예를 들어, 뇌 종양과 연관된 부종) 및 메이그스 증후군과 연관된 비정상적 혈관 증식을 포함한다. 한 실시양태에서, 암은 신세포 암종이다.

표적 바이오마커를 포함하는 샘플은 당업계에 주지되어 있고, 관심의 대상이 되는 암의 특정 유형 및 위치에 대해 적절한 방법에 의해 수득할 수 있다. 조직 생검은 대개 대표적인 암성 조직 조각을 수득하는데 사용된다. 다르게는, 세포는 관심의 대상이 암 세포를 함유하는 것으로 알려져 있거나, 함유할 것으로 판단되는 조직/체액 형태로 간접적으로 수득할 수 있다. 예를 들어, 암성 병변의 샘플은 절제술, 기관지경술, 미세 바늘 흡인술, 기관지 브러싱으로 수득될 수도 있고, 또는 가래, 흉수 또는 혈액으로부터 수득될 수도 있다. 유전자 또는 유전자 생성물은 암 또는 종양 조직으로부터, 또는 다른 신체 샘플, 예를 들어 소변, 가래, 혈청 또는 혈장으로부터 검출될 수 있다. 암성 샘플에서 표적 유전자 또는 유전자 생성물의 검출에 관해 상기 논의된 것과 동일한 기술이 다른 신체 샘플에도 적용될 수 있다. 암 세포는 암 병변으로부터 벗겨져서 이러한 신체 샘플 중에 나타날 수 있다. 이러한 신체 샘플을 스크리닝함으로써 이들 암에 관한 간단한 조기 진단을 달성할 수 있다. 또한, 요법의 진행은 이러한 신체 샘플을 표적 유전자 또는 유전자 생성물에 대해 시험함으로써 보다 쉽게 모니터링될 수 있다.

조직 제제를 암 세포에 대해 풍부하게 하는 수단은 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 조직을 파라핀 또는 동결 절편으로부터 단리할 수 있다. 또한, 암 세포는 유세포 분석법 또는 레이저 포획 미세절제법에 의해 정상 세포로부터 분리될 수도 있다. 이러한 기술, 뿐만 아니라 정상 세포로부터 암성 세포를 분리해 내는 다른 기술이 당업계에 공지되어 있다. 암 조직이 정상 세포로 고도로 오염되어 있는 경우에는, 오염 및/또는 가양성/가음성 결과를 최소화하는 기술 (이중 일부는 본원에서 하기 기재됨)이 공지되어 있기는 하지만, 표지 유전자 또는 단백질 발현 프로파일의 검출이 더욱 어려울 수 있다. 예를 들어, 샘플은 또한 관심 암 세포와는 관련이 있지만 상응하는 정상 세포와는 관련이 없는 것으로 공지된 바이오마커, 또는 그와 반대되는 경우의 바이오마커의 존재에 대해 평가될 수 있다.

본 발명의 방법에서, 포유동물 조직 또는 세포 샘플을 수득하고, 하나 이상의 바이오마커 (예를 들어, PlGF)의 발현에 대하여 조사한다. 샘플 중 다양한 바이오마커의 발현을 다수의 방법론에 의해 분석할 수 있는데, 상기 방법론들 다수는 당업계에 공지되어 있으며, 이는 당업자가 이해하고 있는 것이고, 면역조직화학법 및/또는 웨스턴 블롯 분석법, 면역침전법, 분자 결합 분석법, ELISA, ELIFA, 형광 활성 세포 분류법 (FACS) 등, (예를 들어, 단백질 발현 수준을 조사하기 위한) 정량적 혈액 기반 분석법 (예를 들어, 혈청 ELISA), 생화학적 효소 활성 분석법, 계내 혼성화, mRNA의 노던 분석법 및/또는 PCR 분석법 뿐만 아니라, 유전자 및/또는 조직 어레이 분석법에 의해 실시될 수 있는 매우 다양한 분석법들 중 어느 하나의 분석법을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 유전자 및 유전자 생성물의 상태를 평가하는 전형적인 프로토콜은 예를 들어 문헌 [Ausubel et al. eds., 1995, Current Protocols In Molecular Biology]의 유닛 2 (노던 블롯팅), 유닛 4 (서던 블롯팅), 유닛 15 (이뮤노블롯팅) 및 유닛 18 (PCR 분석)에 기재되어 있다. 멀티플렉스화된 면역분석법, 예를 들어 룰즈 베이스드 메디슨(Rules Based Medicine) 또는 메조 스케일 디스커버리 (MSD)로부터 입수가능한 것도 사용될 수 있다.

본 발명의 일부 실시양태에서, 샘플 중 표적 단백질의 발현은 면역조직화학법 및 염색 프로토콜을 사용함으로써 조사한다. 조직 절편의 면역조직화학 염색은 샘플 내 단백질의 존재를 평가 또는 검출하는 신뢰할 수 있는 방법으로 나타난 바 있다. 면역조직화학 ("IHC") 기술은 프로브에 대한 항체를 이용하고, 일반적으로 발색 또는 형광 방법에 의해 계내에서 세포 항원을 가시화시킨다.

샘플 제조를 위해, 포유동물 (전형적으로 인간 환자)로부터의 조직 또는 세포 샘플을 사용할 수 있다. 샘플의 예로는 조직 생검, 혈액, 폐 흡인물, 객담, 림프액, 혈장 등을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 샘플은 수술에 의한 절제, 흡인 또는 생검을 포함하나 이로 제한되지 않는 당업계에 공지된 다양한 절차에 의해 얻을 수 있다. 조직은 신선하거나 냉동될 수 있다. 한 실시양태에서, 샘플은 고정되고 파라핀 등에 포매된다.

조직 샘플은 통상의 방법으로 고정 (즉, 보존)될 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology," 3^rd edition (1960) Lee G. Luna, HT (ASCP) Editor, The Blakston Division McGraw-Hill Book Company, New York; The Armed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology (1994) Ulreka V. Mikel, Editor, Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology, Washington, D.C.] 참조). 당업자는 샘플이 조직학적으로 염색되거나 달리 분석되는 목적에 따라 고정제를 선택할 수 있음을 알 것이다. 당업자는 또한 고정시키는 시간의 길이는 조직 샘플의 크기 및 사용된 고정제에 따라 달라질 것임을 알 것이다. 예를 들어, 중성 완충된 포르말린, 보우인(Bouin) 또는 파라포름알데히드를 사용하여 샘플을 고정시킬 수 있다.

일반적으로, 샘플을 먼저 고정시킨 후에 농도가 상승하는 일련의 알콜을 통해 탈수시켜서 조직 샘플이 절편화될 수 있도록 파라핀 또는 다른 절편화 매질로 침윤 및 포매시킨다. 다르게는, 조직을 절편화하여 수득된 절편을 고정시킬 수 있다. 예를 들어, 조직 샘플을 통상의 방법으로 파라핀에 포매시키고 처리할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 사용될 수 있는 파라핀의 예는 파라플라스트(Paraplast), 브롤로이드(Broloid) 및 티슈메이(Tissuemay)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 조직 샘플이 포매되면, 샘플을 마이크로톰 등으로 절편화시킬 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 이러한 절차의 예를 들어, 절편의 두께는 약 3 ㎛ 내지 약 5 ㎛의 범위일 수 있다. 절편화되면, 절편을 여러가지 표준 방법을 통해 슬라이드에 부착시킬 수 있다. 슬라이드 접착제의 예는 실란, 젤라틴, 폴리-L-리신 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예를 들어, 파라핀 포매된 절편은 양으로 하전된 슬라이드 및/또는 폴리-L-리신으로 코팅된 슬라이드에 부착될 수 있다.

파라핀이 포매재로서 사용된 경우, 조직 절편을 일반적으로 탈파라핀화하고 물에 재수화시킨다. 조직 절편은 통상적인 여러가지 표준 방법을 통해 탈파라핀화될 수 있다. 예를 들어, 크실렌 및 점차적으로 농도가 감소하는 일련의 알콜을 사용할 수 있다 (예를 들어, 문헌 ["Manual of Histological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology", 상기 문헌] 참조). 다르게는, 시판되는 탈파라핀화 비-유기 작용제, 예를 들어 Hemo-De7 (CMS, 텍사스주 휴스톤 소재)을 사용할 수 있다.

임의로, 샘플 제조 이후에, IHC를 이용하여 조직 절편을 분석할 수 있다. IHC는 형태 염색 및/또는 형광 계내 혼성화와 같은 부가적인 기술과 함께 수행할 수 있다. 2가지 일반적인 IHC 방법; 즉 직접 및 간접 분석을 이용할 수 있다. 첫번째 분석에 따르면, 표적 항원에 대한 항체의 결합을 직접 결정한다. 이러한 직접 분석은 추가의 항체 상호작용 없이도 가시화될 수 있는 표지된 시약, 예를 들어 형광 태그 또는 효소-표지된 1차 항체를 사용한다. 전형적인 간접 분석에서는, 미접합 1차 항체가 항원에 결합한 후, 표지된 2차 항체가 상기 1차 항체에 결합한다. 2차 항체가 효소 표지에 접합된 경우, 항원이 가시화되도록 발색 또는 형광 기질을 첨가한다. 여러 2차 항체가 1차 항체 상의 상이한 에피토프와 반응할 수 있기 때문에 신호 증폭이 발생한다.

면역조직화학에 사용되는 1차 및/또는 2차 항체는 전형적으로 검출가능한 잔기로 표지될 것이다. 수많은 표지가 이용가능하고, 이들은 일반적으로 하기 카테고리로 분류될 수 있다:

(a) 방사성 동위원소, 예를 들어 ³⁵S, ¹⁴C, ¹²⁵I, ³H 및 ¹³¹I. 항체는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, Volumes 1 and 2, Coligen et al., Ed. Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. (1991)]에 기재된 기술을 이용하여 방사성 동위원소로 표지할 수 있고, 방사능은 섬광 계수를 이용하여 측정할 수 있다.

(b) 콜로이드성 금 입자.

(c) 형광 표지, 예를 들어 (이에 제한되지 않음) 희토류 킬레이트 (유로퓸 킬레이트), 텍사스 레드(Texas Red), 로다민, 플루오레세인, 댄실, 리사민(Lissamine), 움벨리페론, 피코크리테린, 피코시아닌 또는 시판되는 형광단, 예를 들어 스펙트럼 오렌지7(SPECTRUM ORANGE7) 및 스펙트럼 그린7(SPECTRUM GREEN7) 및/또는 상기 물질 중 임의의 하나 이상의 유도체. 형광 표지는 예를 들어 문헌 [Current Protocols in Immunology, 상기 문헌]에 개시된 기술을 이용하여 항체에 접합될 수 있다. 형광은 형광계를 사용하여 정량할 수 있다.

(d) 다양한 효소-기질 표지가 이용가능하고, 미국 특허 제4,275,149호는 이들 중 일부에 대한 개관을 제공한다. 효소는 일반적으로 발색 기질의 화학적 변경을 촉매하며, 이는 다양한 기술을 이용하여 측정할 수 있다. 예를 들어, 효소는 기질에서의 색상 변화를 촉매할 수 있고, 이는 분광학적으로 측정할 수 있다. 다르게는, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변경시킬 수 있다. 형광의 변화를 정량하는 기술은 상기 기재되어 있다. 화학발광 기질은 화학적 반응에 의해 전자적으로 여기된 후에 측정 (예를 들어, 화학발광계 사용)할 수 있는 광을 방출하거나 에너지를 형광 수용자에게 제공할 수 있다. 효소 표지의 예는 루시페라제 (예를 들어, 반딧불이 루시페라제 및 박테리아 루시페라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디히드로프탈라진디온, 말레이트 데히드로게나제, 우레아제, 퍼옥시다제, 예를 들어 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO), 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어, 글루코스 옥시다제, 갈락토스 옥시다제, 및 글루코스-6-포스페이트 데히드로게나제), 헤테로시클릭 옥시다제 (예를 들어, 우리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등을 포함한다. 효소를 항체에 접합시키는 기술이 [O'Sullivan et al., Methods for the Preparation of Enzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, in Methods in Enzym. (ed. J. Langone ＆ H. Van Vunakis), Academic press, New York, 73:147-166 (1981)]에 기재되어 있다.

효소-기질 조합의 예는 예를 들어 다음을 포함한다:

(i) 양고추냉이 퍼옥시다제 (HRPO)와 기질로서의 수소 퍼옥시다제 (여기서, 수소 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 히드로클로라이드 (TMB))를 산화시킴);

(ii) 알칼리성 포스파타제 (AP)와 발색 기질로서의 파라-니트로페닐 포스페이트; 및

(iii) β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)와 발색 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 형광발생 기질 (예를 들어, 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제)의 조합물.

수많은 다른 효소-기질 조합이 당업자에게 이용가능하다. 이들의 일반적인 검토를 위해, 미국 특허 제4,275,149호 및 동 제4,318,980호를 참조한다. 때때로, 표지는 항체에 간접적으로 접합된다. 당업자는 이를 달성하기 위한 각종 기술을 알 것이다. 예를 들어, 항체는 비오틴과 접합될 수 있고, 상기 언급된 4가지 넓은 카테고리의 표지 중 임의의 것이 아비딘과 접합될 수도 있고, 또는 그 반대의 경우도 가능하다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하기 때문에, 표지는 이러한 간접적인 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 다르게는, 표지와 항체의 간접 접합을 달성하기 위해서, 항체는 작은 합텐과 접합되고, 상기 언급된 표지의 여러 유형 중 하나가 항-합텐 항체와 접합된다. 따라서, 표지와 항체의 간접적인 접합이 달성될 수 있다.

앞서 논의된 샘플 제조 절차 외에도, IHC 이전, IHC 동안 또는 IHC 이후에 조직 절편을 추가로 처리하는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시트레이트 완충제 중에서 조직 샘플을 가열하는 것과 같은 에피토프 복구 방법을 수행할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Leong et al. Appl. Immunohistochem. 4(3):201 (1996)] 참조).

임의의 차단 단계 후에, 조직 절편을 1차 항체가 조직 샘플 중의 표적 단백질 항원에 결합하기에 적합한 조건하에 충분한 기간 동안 1차 항체에 노출시킨다. 이를 달성하기에 적절한 조건은 통상적인 실험으로 결정할 수 있다. 항체가 샘플에 결합하는 정도는 상기 논의된 검출가능한 표지 중 어느 하나를 사용하여 결정한다. 바람직하게는, 표지는 발색 기질, 예를 들어 3,3'-디아미노벤지딘 발색원의 화학적 변형을 촉매하는 효소 표지 (예를 들어, HRPO)이다. 바람직하게는, 효소 표지는 1차 항체에 특이적으로 결합하는 항체에 접합된다 (예를 들어, 1차 항체는 토끼 폴리클로날 항체이고, 2차 항체는 염소 항-토끼 항체이다). 이와 같이 제조한 시료를 장착하여 커버 글라스를 덮을 수 있다. 이어서, 예를 들어 현미경을 사용하여 슬라이드 평가를 수행하고, 당업계에서 통상 사용되는 염색 강도 기준을 사용할 수 있다.

다른 방법에서, 샘플을 항체-바이오마커 복합체 형성에 충분한 조건하에서 상기 바이오마커에 특이적인 항체와 접촉시킨 후에 상기 복합체를 검출할 수 있다. 바이오마커의 존재는 수많은 방법, 예를 들어 혈장 및 혈청을 포함하는 다양한 조직 및 샘플을 분석하기 위한 웨스턴 블롯팅 및 ELISA 절차로 검출할 수 있다. 이러한 분석 포맷을 이용한 광범위한 면역분석 기술이 이용가능하고, 예를 들어 미국 특허 제4,016,043호, 동 제4,424,279호 및 동 제4,018,653호를 참조한다. 이들은 비-경쟁 유형의 단일-부위 및 2-부위 또는 "샌드위치" 분석 뿐만 아니라, 통상적인 경쟁적 결합 분석을 둘 모두 포함한다. 또한, 상기 분석은 표지된 항체의 표적 바이오마커에 대한 직접 결합을 포함한다.

샌드위치 분석은 가장 유용하고 일반적으로 이용되는 분석 중 하나이다. 샌드위치 분석 기술의 수많은 변형이 존재하고, 모두가 본 발명에 포함된다. 간략하게, 전형적인 순방향 분석에서, 표지되지 않은 항체를 고체 기판에 고정시키고, 시험할 샘플을 결합된 분자와 접촉시킨다. 적합한 인큐베이션 기간 후, 항체-항원 복합체의 형성을 허용하기에 충분한 시간 동안, 검출가능한 신호를 생성할 수 있는 리포터 분자로 표지된 항원에 특이적인 2차 항체를 이어서 첨가하고, 항체-항원-표지된 항체의 다른 복합체의 형성에 충분한 시간 동안 인큐베이션한다. 임의의 미반응 물질을 세척해 내고, 항원의 존재를 리포터 분자에 의해 생성된 신호를 관찰하여 결정한다. 결과는 가시적인 신호의 단순 관찰에 의해 정성적일 수도 있고, 또는 공지된 양의 바이오마커를 함유하는 대조군 샘플과의 비교로 정량할 수도 있다.

순방향 분석에 대한 변형은 동시 분석을 포함하며, 여기서 샘플 및 표지된 항체 둘 모두가 결합된 항체에 동시에 첨가된다. 이들 기술은 쉽게 명백해질 임의의 근소한 변형을 포함하여 당업자에게 공지되어 있다. 전형적인 순방향 샌드위치 분석에서, 바이오마커에 특이성을 갖는 1차 항체는 고체 표면에 공유 또는 수동 결합된다. 고체 표면은 전형적으로 유리 또는 중합체이고, 가장 일반적으로 사용되는 중합체는 셀룰로스, 폴리아크릴아미드, 나일론, 폴리스티렌, 폴리비닐 클로라이드 또는 폴리프로필렌이다. 고체 지지체는 튜브, 비드, 마이크로플레이트의 디스크의 형태, 또는 면역분석 수행에 적합한 임의의 다른 표면일 수 있다. 결합 과정은 당업계에 공지되어 있고, 일반적으로 가교 공유 결합 또는 물리적 흡착으로 이루어지고, 중합체-항체 복합체는 시험 샘플 제조시에 세척하였다. 이후, 시험할 샘플의 분취액을 고체 상 복합체에 첨가하고, 항체에 존재하는 임의의 서브유닛의 결합을 허용하기에 적합한 조건 (예를 들어, 실온 내지 40℃, 예를 들어 25℃ 내지 32℃ 포함)하에 충분한 기간 동안 (예를 들어, 2분 내지 40분 또는 더 편리하다면 밤새) 인큐베이션한다. 인큐베이션 기간 후, 항체 서브유닛 고체 상을 세척하여 건조시키고, 바이오마커의 일부에 특이적인 2차 항체와 함께 인큐베이션한다. 2차 항체는 분자 마커에 대한 2차 항체의 결합을 표시하는데 사용되는 리포터 분자에 연결된다.

다른 방법은 샘플 중의 표적 바이오마커를 고정화시킨 후, 리포터 분자로 표지되어 있거나 그렇지 않을 수 있는 특이성 항체에 고정화된 표적을 노출시키는 것을 포함한다. 표적의 양 및 리포터 분자 신호의 강도에 따라, 결합된 표적은 항체로 직접 표지함으로써 검출할 수 있다. 다르게는, 1차 항체에 특이적인 2차 표지된 항체를 표적-1차 항체 복합체에 노출시켜 표적-1차 항체-2차 항체 3원 복합체를 형성시킨다. 상기 복합체는 리포터 분자에 의해 방출되는 신호에 의해 검출된다. 본 명세서에서 사용된 "리포터 분자"는 그의 화학적 성질에 의해 항원-결합된 항체의 검출을 허용하는 분석적으로 확인가능한 신호를 제공하는 분자를 나타낸다. 이러한 유형의 분석에서 가장 일반적으로 사용되는 리포터 분자는 효소, 형광단 또는 방사선핵종 함유 분자 (즉, 방사성 동위원소) 및 화학발광 분자이다.

효소 면역분석의 경우에, 효소는 일반적으로 글루타르알데히드 또는 퍼요오데이트에 의해 2차 항체에 접합된다. 그러나, 쉽게 인지될 바와 같이, 당업자가 쉽게 이용가능한 다양한 여러가지 접합 기술이 존재한다. 통상적으로 사용되는 효소는 특히 양고추냉이 퍼옥시다제, 글루코스 옥시다제, -갈락토시다제 및 알칼리성 포스파타제를 포함한다. 특이적 효소와 함께 사용될 기질은 일반적으로 상응하는 효소에 의한 가수분해시에 검출가능한 색상 변화가 생성되는 것으로서 선택된다. 적합한 효소의 예는 알칼리성 포스파타제 및 퍼옥시다제를 포함한다. 상기한 발색 기질 보다는 형광 생성물을 생성하는 형광 기질을 사용하는 것이 또한 가능하다. 모든 경우에, 효소-표지된 항체가 1차 항체-분자 마커 복합체에 첨가되어 결합한 후, 과량의 시약을 세척하여 제거하였다. 이어서, 적절한 기질을 함유하는 용액을 상기 항체-항원-항체의 복합체에 첨가한다. 기질은 2차 항체에 연결된 효소와 반응하여 정성적인 가시적 신호를 생성할 것이고, 이는 샘플 내에 존재하는 바이오마커의 양을 표시하도록 일반적으로는 분광학적으로 추가로 정량될 수 있다. 다르게는, 플루오레세인 및 로다민과 같은 형광 화합물이 이들의 결합 능력을 변경시키지 않으면서 항체에 화학적으로 커플링될 수 있다. 특정 파장의 광을 사용한 조사에 의해 활성화될 때, 형광색소-표지된 항체는 광 에너지를 흡수하여 분자를 여기가능 상태로 유도한 후, 광학현미경으로 가시적으로 검출가능한 특징적인 색상에서 광을 방출한다. EIA에서와 같이, 형광 표지된 항체는 1차 항체-분자 마커 복합체에 결합하도록 허용된다. 결합되지 않은 시약을 세척해 낸 후, 남아있는 3원 복합체를 적절한 파장의 광에 노출시키고, 관찰된 형광은 관심 분자 마커의 존재를 나타낸다. 면역형광 및 EIA 기술 둘 다 당업계에 널리 확립되어 있다. 그러나, 다른 리포터 분자, 예를 들어 방사성 동위원소, 화학발광 또는 생체발광 분자를 사용할 수도 있다.

상기 기술은 또한 PlGF의 발현 검출에 사용될 수 있음이 고려된다.

본 발명의 방법은 추가로 조직, 세포 또는 혈장 샘플에서 PlGF mRNA의 존재 및/또는 발현 수준을 조사하는 프로토콜을 포함한다. 세포 내의 mRNA의 평가 방법은 공지되어 있고, 예를 들어, 상보성 DNA 프로브를 사용하는 혼성화 분석 (예를 들어, PlGF에 특이적인 표지된 리보프로브를 사용하는 계내 혼성화, 노던 블롯 및 관련 기술) 및 다양한 핵산 증폭 분석 (예를 들어, PlGF에 특이적인 상보성 프라이머를 사용하는 RT-PCR, 및 다른 증폭 유형의 검출 방법, 예를 들어 분지형 DNA, SISBA, TMA 등)을 포함한다.

포유동물로부터의 조직, 세포 또는 혈장 샘플을 노던, 도트 블롯팅 또는 PCR 분석을 이용하여 mRNA에 대해 편리하게 분석할 수 있다. 예를 들어, RT-PCR 분석, 예를 들어 정량적 PCR 분석은 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 예시적인 실시양태에서, 생물학적 샘플에서 표적 mRNA를 검출하는 방법은 하나 이상의 프라이머를 사용한 역전사에 의해 샘플로부터 cDNA를 생성하는 단계, 표적 폴리뉴클레오티드를 센스 및 안티센스 프라이머로서 사용하여 상기와 같이 생성된 cDNA를 증폭시킴으로써 그안의 표적 cDNA를 증폭시키는 단계, 및 증폭된 표적 cDNA의 존재를 검출하는 단계를 포함한다. 또한, 상기 방법은 (예를 들어, "하우스키핑" 유전자, 예를 들어, 액틴 계열 구성원의 비교 대조군 mRNA 서열 수준을 동시에 조사함으로써) 생물학적 샘플 중 표적 mRNA의 수준을 결정하도록 하는 하나 이상의 단계를 포함할 수 있다. 임의로, 증폭된 표적 cDNA의 서열을 결정할 수 있다.

본 발명의 임의의 방법은 마이크로어레이 기술에 의해 조직, 세포 또는 혈장 샘플 중의 mRNA, 예를 들어 표적 mRNA를 검사 또는 검출하는 프로토콜을 포함한다. 핵산 마이크로어레이를 사용함으로써, 시험 및 대조군 샘플로부터의 시험 및 대조군 mRNA 샘플을 역전사시키고 표지하여 cDNA 프로브를 생성한다. 이후, 프로브를 고체 지지체에 고정된 핵산의 어레이에 혼성화시킨다. 상기 어레이를 이 어레이의 각 구성원의 서열 및 위치를 알 수 있게 배열한다. 예를 들어, 그의 발현이 항혈관신생 요법이 보이는 증가된 또는 감소된 임상적 이로움과 서로 관련성이 있는 것인 유전자의 선택물을 고체 지지체 상에 배열할 수 있다. 특정 어레이 구성원을 갖는 표지된 프로브의 혼성화는, 프로브가 유래된 샘플이 상기 유전자를 발현함을 나타낸다. 질환 조직의 차등적 유전자 발현 분석은 가치있는 정보를 제공할 수 있다. 마이크로어레이 기술에서는 단일 실험 내에서 수천 개 유전자의 mRNA 발현 프로파일을 평가하기 위해 핵산 혼성화 기술 및 전산화 기술을 이용한다. (예를 들어, 2001년 10월 11일자로 공개된 WO 01/75166 참조; 어레이 제작의 논의에 대해서는 예를 들어 미국 특허 제5,700,637호, 미국 특허 제5,445,934호, 및 미국 특허 제5,807,522호, 문헌 [Lockart, Nature Biotechnology, 14:1675-1680 (1996)]; [Cheung, V.G. et al., Nature Genetics 21(Suppl):15-19 (1999)] 참조). DNA 마이크로어레이는, 유리 또는 다른 기판에서 직접 합성되거나 이것으로 스팟팅되는 유전자 단편을 함유하는 미니어처 어레이이다. 수천개의 유전자는 통상적으로 단일 어레이로 나타낸다. 통상적인 마이크로어레이 실험은 1) 샘플로부터 단리된 RNA로부터 형광 표지된 표적의 제조 단계, 2) 표지된 표적의 마이크로어레이로의 혼성화 단계, 3) 어레이의 세척, 염색 및 스캐닝 단계, 4) 스캐닝된 영상의 분석 단계, 및 5) 유전자 발현 프로파일의 생성 단계를 포함한다. 현재, 2가지 주요 유형의 DNA 마이크로어레이가 사용된다: 올리고뉴클레오티드 (통상적으로, 25 내지 70 mer) 어레이 및 cDNA로부터 제조된 PCR 생성물을 함유하는 유전자 발현 어레이. 어레이를 형성하는 경우, 올리고뉴클레오티드는 미리 제작되어 표면에 스팟팅되거나, 또는 표면에서 직접 합성될 수 있다 (계내).

애피메트릭스 진칩(Affymetrix GeneChip)(등록상표) 시스템은 유리 표면 상에 올리고뉴클레오티드를 직접 합성함으로써 제작된 어레이를 포함하는 시판 마이크로어레이 시스템이다. 프로브/유전자 어레이: 올리고뉴클레오티드 (일반적으로 25 mer)는 반도체-기재 포토리소그래피 및 고체상 화학적 합성 기술의 조합에 의해 유리 웨이퍼 상에서 직접 합성된다. 각각의 어레이는 최대 400,000개의 상이한 올리고를 함유하고, 각각의 올리고는 수백만개의 카피로 존재한다. 올리고뉴클레오티드 프로브는 어레이상의 공지된 위치에서 합성되기 때문에, 혼성화 패턴 및 신호 강도는 애피메트릭스 마이크로어레이 스위트(Affymetrix Microarray Suite) 소프트웨어에 의해 유전자 정체성 및 상대적인 발현 수준의 면으로 해석될 수 있다. 각각의 유전자는 어레이에서 일련의 상이한 올리고뉴클레오티드 프로브에 의해 나타난다. 각각의 프로브 쌍은 완전 매치 올리고뉴클레오티드 및 미스매치 올리고뉴클레오티드로 이루어진다. 완전 매치 프로브는 특정 유전자에 대해 정확하게 상보적인 서열을 갖기 때문에 유전자 발현을 결정한다. 미스매치 프로브는 중심 염기 위치에서의 단일 염기 치환에 의해 완전 매치 프로브과 상이하여 표적 유전자 전사체의 결합을 방해한다. 이것은 완전 매치 올리고에 대해 측정된 신호에 기여하는 백그라운드 및 비-특이적 혼성화를 결정하는 것을 돕는다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어는 완전 매치 프로브의 혼성화 강도로부터 미스매치 프로브의 혼성화 강도를 감하여 각 프로브 세트에 대한 절대 강도 값 또는 특이적 강도 값을 결정한다. 프로브는 진뱅크(Genbank) 및 다른 뉴클레오티드 정보보관소의 최근 정보를 기초로 선택한다. 상기 서열은 유전자의 3' 말단의 독특한 영역을 인식한다고 여겨진다. 진칩 혼성화 오븐(GeneChip Hybridization Oven) ("회전식(rotisserie)" 오븐)을 사용하여 한번에 최대 64개 어레이의 혼성화를 수행한다. 플루이딕스 스테이션(fluidics station)은 프로브 어레이의 세척 및 염색을 수행한다. 이는 완벽하게 자동화되어 있고, 4가지 모듈을 함유하며, 각 모듈에는 하나의 프로브 어레이가 들어간다. 각 모듈은 미리 프로그래밍된 플루이딕스 프로토콜을 이용하여 마이크로어레이 스위트 소프트웨어를 통해 독립적으로 제어된다. 스캐너는 공초점 레이저 형광 스캐너이며, 이는 프로브 어레이에 결합된 표지된 cRNA에 의해 방출되는 형광 강도를 측정한다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어에 의한 컴퓨터 워크스테이션은 플루이딕스 스테이션 및 스캐너를 제어한다. 마이크로어레이 스위트 소프트웨어는 프로브 어레이에 대해 미리 프로그래밍된 혼성화, 세척 및 염색 프로토콜을 이용하여 최대 8개의 플루이딕스 스테이션을 제어할 수 있다. 또한, 상기 소프트웨어는 혼성화 강도 데이터를 수득하고 이것을 적절한 알고리즘을 이용하여 각 유전자에 대한 존재/부재 신호로 전환한다. 마지막으로, 상기 소프트웨어는 실험들 사이의 비교 분석에 의해 유전자 발현의 변화를 검출하고, 결과를 텍스트 파일 형식으로 구성하며, 이를 사용하여 다른 소프트웨어 프로그램으로 추가의 데이터 분석을 수행할 수 있다.

조직 또는 세포 샘플 중 선택된 바이오마커의 발현은 또한 기능 또는 활성-기반 분석에 의해 조사될 수 있다. 예를 들어, 바이오마커가 효소인 경우, 당업계에 공지된 분석을 수행함으로써 조직 또는 세포 샘플에서 주어진 효소 활성의 존재를 결정 또는 검출할 수 있다.

본 발명의 키트는 다수의 실시양태를 갖는다. 전형적인 실시양태는 용기, 상기 용기 상의 라벨, 및 상기 용기 내에 함유된 조성물 (여기서, 조성물은 PlGF에 결합하는 1차 항체를 포함하고, 용기 상의 라벨은 조성물이 1종 이상의 유형의 포유동물 세포에서 PlGF의 존재를 평가하는데 사용될 수 있음을 나타낸다), 및 1종 이상의 유형의 포유동물 세포에서 PlGF의 존재를 평가하는데 항체를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트이다. 키트는 또한 조직, 세포 또는 혈장 샘플을 제조하고, 항체 및 프로브를 동일한 절편의 조직, 세포 또는 혈장 샘플에 적용하기 위한 물질 및 설명서 세트를 포함할 수 있다. 키트는 1차 및 2차 항체 둘 모두를 포함할 수 있고, 여기서 2차 항체는 표지, 예를 들면 효소 표지에 접합된다

다른 실시양태는 용기, 상기 용기 상의 라벨 및 상기 용기 내에 함유된 조성물 (여기서 조성물은 엄격한 조건하에 PlGF에 혼성화하는 하나 이상의 폴리뉴클레오티드를 포함하고; 상기 용기 상의 라벨은 조성물이 1종 이상의 유형의 포유동물 세포 또는 혈장에서 PlGF의 존재를 평가하는데 사용될 수 있음을 나타낸다), 및 1종 이상의 유형의 포유동물 세포 또는 혈장에서 PlGF RNA 또는 DNA의 존재를 평가하는데 폴리뉴클레오티드를 사용하기 위한 설명서를 포함하는 키트이다.

키트 중의 다른 임의의 성분은 1종 이상의 완충제 (예를 들어, 차단 완충제, 세척 완충제, 기질 완충제 등), 다른 시약, 예를 들어 효소 표지에 의해 화학적으로 변경되는 기질 (예를 들어, 발색원), 에피토프 복구 용액, 대조군 샘플 (양성 및/또는 음성 대조군), 대조군 슬라이드(들) 등을 포함한다.

본 발명의 방법의 경우, 항암 치료제, 항혈관신생제 및/또는 화학요법제는 예를 들어, 일정 기간 동안에 걸쳐 볼루스로서 정맥 투여에 의해 또는 연속 주입에 의해, 근육내, 복강내, 뇌척수내, 피하, 동맥내, 활액막내, 경막내, 경구, 국소, 또는 흡입 경로와 같은 공지된 방법에 따라 인간 환자에게 투여된다. 항체의 정맥내 또는 피하 투여가 바람직하다.

본 발명의 치료는 항-VEGF 항체와 하나 이상의 화학요법제의 조합 투여를 포함할 수 있다. 본 발명은 상이한 화학요법제의 칵테일 투여를 주시한다. 조합 투여는 별개의 제제 또는 단일 제약 제제를 사용하는 공동 투여, 및 임의의 순서로의 연속 투여를 포함하고, 이때, 바람직하게는 2종 모두 (또는 모든) 활성 작용제가 이들의 생물학적 활성을 동시에 발휘하는 일정 기간이 존재한다. 이러한 화학요법제에 대한 제조 및 투여 스케줄은 제조업체의 지침에 따라 또는 숙련된 전문인이 경험적으로 결정하는 바에 따라 이용될 수 있다. 화학요법을 위한 제제 및 투여 스케줄은 또한 문헌 [Chemotherapy Service Ed., M.C. Perry, Williams ＆ Wilkins, Baltimore, MD (1992)]에도 기재되어 있다. 화학요법제는 항체 투여 이전 또는 이후에 이루어질 수 있거나, 그와 동시에 제공될 수 있다.

질환의 예방 또는 치료를 위해, 항암 치료제 또는 항혈관신생제의 적절한 투여량은 상기 정의된 바와 같이, 치료하고자 하는 질환의 유형, 질환의 중증도 및 경과 상태, 예방 또는 치료 목적으로 작용제를 투여받고 있는지 여부, 이전 요법, 환자의 임상적 병력 및 작용제에 대한 반응, 및 주치의의 재량에 따라 달라질 것이다다. 상기 작용제는 적합하게는 환자에게 1회 이상의 일련의 치료로서 투여된다. 병용 치료 방식에서, 본 발명의 조성물은 치료 유효량 또는 상승작용적 양으로 투여된다. 일부 실시양태에서, 항혈관신생제는 VEGF 길항제, 예를 들어 항-VEGF 항체 (예를 들어, 베바시주맙)이다. 질환의 유형과 중증도에 따라서, 예를 들어 1회 이상의 별도 투여이든지 아니면 연속적인 주입이든지 관계없이, 항체 약 1 ㎍/kg 내지 50 mg/kg (예를 들어, 0.1 mg/kg 내지 20 mg/kg)이 환자에게 투여하기 위한 초기 후보 투여량이다. 상기 언급된 인자에 따라, 전형적인 1일 투여량은 약 1 ㎍/kg 내지 약 100 mg/kg 이상의 범위일 수 있다. 수일 또는 그보다 오랜 기간에 걸친 반복 투여의 경우, 상태에 따라서 치료는 질환 증상이 원하는 수준으로 저해될 때까지 지속된다. 그러나, 다른 투여 방식이 유용할 수 있다. 바람직한 측면에서, 본 발명의 항체를 2주 내지 3주 마다 약 5 mg/kg 내지 약 15 mg/kg 범위의 용량으로 투여한다. 보다 바람직하게, 이러한 투여 방식을 전이성 결장직장암을 치료하기 위한 1차 치료로서 화학요법 방식과 병행하여 사용한다. 일부 측면에서, 화학요법 방식은 전통적인 고-용량 간헐적 투여를 포함한다. 일부 다른 측면에서, 화학요법제는 예정된 중단없이 보다 적은 용량을 보다 자주 투여한다 ("메트로놈 화학요법"). 본 발명의 요법의 진행은 통상적인 기술 및 분석에 의해 쉽게 모니터링된다.

일부 실시양태에서, 본 발명의 방법에 사용되는 항-VEGF 항체는 베바시주맙이다. 특정 실시양태에서, 예를 들어, 조합되어 사용될 경우, 베바시주맙은 약 0.05 mg/kg 내지 약 15 mg/kg의 범위로 투여된다. 한 실시양태에서, 약 0.5 mg/kg, 1.0 mg/kg, 2.0 mg/kg, 3.0 mg/kg, 4.0 mg/kg, 5.0 mg/kg, 6.0 mg/kg, 7.0 mg/kg, 7.5 mg/kg, 8.0 mg/kg, 9.0 mg/kg, 10 mg/kg 또는 15 mg/kg (또는 이들의 임의의 조합) 중 하나 이상의 용량을 대상체에게 투여할 수도 있다. 이러한 용량을 간헐적으로, 예를 들어, 매일, 매 3 일마다, 매주 또는 매 2 내지 3 주마다 투여할 수도 있다. 또 다른 실시양태에서, 예를 들어, 조합되어 사용될 경우, 베바시주맙은 매 2주마다 10 mg/kg 또는 매 3주마다 15 mg/kg씩 대상체에게 정맥내로 투여된다.

본원에서 교시될 때 하기 실시예는 단지 예시적인 목적으로 제공되는 것이며, 제한하는 것으로서 해석되어서는 안된다.

실시예

실시예 1: 암 환자에서 보다 높은 기준 PlGF 수준은 보다 짧은 생존기간과 관련된다

연구 대상체 및 처치:

전이성 질환에 대한 하나 이상의 종래 화학요법 처방 후에 재발된 전이성 유방암 환자에서의 베바시주맙 단독요법의 연구인 AVF-0776으로부터 샘플을 수집하였다. 모든 대상체에게 매 2주마다 3 mg/kg, 10 mg/kg 또는 20 mg/kg의 베바시주맙을 투여하였다 (총 6회 주입). 종양 평가 제70일에 질환 진행의 증거가 나타나지 않은 대상체에게 제154일까지 매 2주마다 베바시주맙을 계속 투여하고 (6회 초과 주입), 이어서 종양 평가를 수행하였다. 제154일에 질환 진행의 증거가 나타나지 않은 대상체에게 제168일에 베바시주맙을 마지막으로 주입하였다. 질환 진행을 경험한 대상체는 연구를 중단하였다. 연구 종료 또는 취소 후에, 대상체의 생존 상태를 제0일 이후 1년 동안 추적하였다.

샘플 및 방법:

대상체로부터의 말초 정맥 혈액을 라벤더 종래 마개가 있는 BD 배큐테이너(Vacutainer)(등록상표) 플라스틱 EDTA 튜브에 직접 넣었다. 수집 후에, 샘플을 부드럽게 혼합하고, 30분 동안 그대로 두었다. 혈장을 실온에서 20분 동안 3,000xg에서 원심분리하여 수득하였다. 베바시주맙으로 처치한 재발된 전이성 유방암 환자 총 67명으로부터 샘플을 선택하였고, 이들로부터의 혈장 샘플은 제0일부터 제56일까지 중 적어도 2개의 시점 (제0일, 제14일, 제28일, 제42일 및 제56일)에서 이용가능하였다.

혈장의 기준 PlGF 수준을 처치 시작 이전 제0일에 환자에서 제조업체의 설명에 따라 MSD(등록상표) MS6000 인간 성장 인자 키트 (K11029C-1 메조 스케일 디스커버리, 미국 메릴랜드주 게이터스버그)로 측정하였다. PlGF 수준을 임상 결과와 연관시키기 위해, 카플란-마이어(Kaplan-Meier) 방법 및 로그-랭크(log-rank) (맨틀(Mantel)-Cox) 시험을 사용하여 연구 개시 (최초 투여)로부터의 생존 지속기간을 분석하였다.

결과:

로그-랭크 시험은 기준에서 28 pg/ml에서의 혈장 PlGF 수준이 환자의 전체 생존기간과 관련된 유의한 변수임을 확인하였다 (p < 0.0026; 도 1 참조). 처치 시작 이전 제0일에 28 pg/ml 초과의 기준 혈장 PlGF 수준을 갖는 환자에서 중간 전체 생존 시간은 171일이었다. 대조적으로, 처치 시작 이전 제0일에 28 pg/ml 이하의 기준 PlGF 수준을 갖는 환자에 대한 중간 전체 생존 시간은 417일이었다. 이러한 결과는 환자에서의 기준 혈장 PlGF 수준이 항혈관신생 요법을 받고 있는 암 환자를 위한 생존 이로움의 예측인자임을 나타낸다.

실시예 2: 베바시주맙으로 처치한 환자에서 혈장 PlGF 수준이 증가한다

실시예 1에서 상기 기재된 바와 같이 환자를 처치하고, 혈장 샘플을 수집하였다. 혈장 PlGF 수준을 베바시주맙으로의 처치 과정 동안 모니터링하였다. 결과는 혈장 PlGF 수준이 베바시주맙으로의 처치 후에 증가한다는 것을 보여준다 (도 2 참조). 1.5배 초과의 중간 증가가 베바시주맙으로의 처치 이후 제14일, 제28일, 제42일 및 제56일에 환자에서 관찰되었다.

실시예 3: 베바시주맙으로 처치한 후에 환자에서 보다 높은 혈장 PLGF 수준은 보다 짧은 전체 생존기간과 관련된다

실시예 1에서 상기 기재된 바와 같이, 환자를 처치하고, 혈장 샘플 및 혈장 PlGF 수준을 측정하였다. 혈장 PlGF 수준을 임상 결과와 연관시키기 위해, 카플란-마이어 방법 및 로그-랭크 (맨틀-Cox) 시험을 사용하여 연구 개시 (최초 투여)로부터의 생존 지속기간을 분석하였다.

로그-랭크 시험 결과는 베바시주맙 처치 제14일에서 50 pg/ml에서의 혈장 PlGF 수준이 환자의 전체 생존기간과 관련된 유의한 변수임을 나타낸다 (p < 0.0003; 도 3 참조). 베바시주맙 처치 시작 이후에 50 pg/ml 초과의 기준 혈장 PlGF 수준을 갖는 환자에 대한 중간 생존 시간은 165일이었다. 대조적으로, 베바시주맙 처치 시작 이후에 50 pg/ml 이하의 혈장 PlGF 수준을 갖는 환자에 대한 중간 전체 생존 시간은 431일이었다. 이러한 결과는 항혈관신생 요법, 예를 들어 베바시주맙으로의 처치를 시작한 환자에서의 혈장 PlGF 수준이 항혈관신생 요법을 받고 있는 암 환자를 위한 생존 이로움의 예측인자임을 나타낸다.

Claims

항혈관신생 요법이 아닌 또는 항혈관신생 요법에 추가한 항암 요법이 이로울 수 있는 암을 앓고 있는 환자로부터 수득한 샘플에서 태반 성장 인자 (PlGF)의 발현 수준을 결정하는
것을 포함하며, 여기서 상기 환자로부터 수득한 샘플에서 PlGF의 발현 수준이 참조 샘플에 비해 증가하는 것이 상기 환자에게 항혈관신생 요법이 아닌 또는 항혈관신생 요법에 추가한 항암 요법이 이로울 수 있음을 나타내는 것인,
항혈관신생 요법이 아닌 또는 항혈관신생 요법에 추가한 항암 요법이 이로울 수 있는 암을 앓고 있는 환자를 확인하는 방법.
암을 앓고 있는 환자로부터 수득한 샘플에서 PlGF의 발현 수준을 결정하는
것을 포함하며, 여기서 상기 환자로부터 수득한 샘플에서 PlGF의 발현 수준이 참조 샘플에 비해 증가하는 것이 상기 환자가 단독 항혈관신생 요법에 보다 덜 반응성이 될 수 있음을 나타내는 것인,
암을 앓고 있는 환자의 항혈관신생 요법에 대한 반응성을 예측하는 방법.
환자로부터 수득한 샘플에서 PlGF의 발현 수준을 결정하는
것을 포함하며, 여기서 상기 환자로부터 수득한 샘플에서 PlGF의 발현 수준이 참조 샘플에 비해 증가하는 것이 상기 환자가 단독 항혈관신생 요법에 보다 덜 반응성이 될 수 있음을 나타내는 것인,
항혈관신생 요법의 유효성을 모니터링하는 방법.
환자로부터 수득한 샘플에서 PlGF의 발현 수준을 결정하는
것을 포함하며, 여기서 상기 환자로부터 수득한 샘플에서 PlGF의 발현 수준이 참조 샘플에 비해 증가하는 것이 상기 환자가 단독 항혈관신생 요법에 보다 덜 반응성이 될 수 있음을 나타내는 것인,
암 치료에 대한 치료 효능을 최적화하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 환자로부터 수득한 샘플에서 PlGF의 발현 수준이 참조 샘플에 비해 약 1.5배 이상 증가하는 것인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 항혈관신생 요법이 VEGF 길항제의 투여를 포함하는 것인 방법.
제6항에 있어서, VEGF 길항제가 항-VEGF 항체인 방법.
제7항에 있어서, 항-VEGF 항체가 베바시주맙인 방법.
제5항에 있어서, 암이 유방암인 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 환자로부터 수득한 샘플이 혈장인 방법.
제10항에 있어서, PlGF의 발현 수준을 혈장에서 PlGF 단백질을 검출하여 결정하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 항혈관신생 요법 이전에 환자로부터 수득하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 샘플을 항혈관신생 요법 시작 이후에 환자로부터 수득하는 방법.
제12항에 있어서, 샘플을 항혈관신생 요법 시작 이후 24시간 이내에 환자로부터 수득하는 방법.
제12항에 있어서, 샘플을 항혈관신생 요법 시작 이후 14일 이내에 환자로부터 수득하는 방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 환자에게 항암 요법을 투여하는 것을 더 포함하며, 여기서 상기 항암 요법은 항혈관신생 요법이 아닌 또는 항혈관신생 요법에 추가한 것인 방법.
제16항에 있어서, 환자로부터 수득한 샘플에서 PlGF의 발현 수준이 참조 샘플에 비해 증가하였을 때 환자에게 항암 요법을 투여하는 방법.
PlGF의 발현 수준을 특이적으로 검출할 수 있는 화합물; 및
암을 앓고 있는 환자의 단독 항혈관신생 요법에 대한 반응성을 예측하기 위해 키트를 사용하기 위한 설명서
를 포함하며, 여기서 PlGF의 발현이 참조 샘플에 비해 증가하는 것이 상기 환자에게 항혈관신생 요법이 아닌 또는 항혈관신생 요법에 추가한 항암 요법이 이로울 수 있음을 나타내는 것인,
PlGF의 발현 수준을 검출하기 위한 키트.