CN116558929A - 一种足细胞免疫荧光染色的方法及其应用 - Google Patents
一种足细胞免疫荧光染色的方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种足细胞免疫荧光染色的方法及其应用，涉及组织荧光染色技术领域。本发明对肾活检组织石蜡切片进行脱蜡、水化、抗原修复、封闭处理后依次使用一抗、二抗进行免疫标记处理，再进行封片即可完成肾脏足细胞免疫荧光染色。本发明的方法进行足细胞染色，抗体渗透性和特异性均较好，允许抗体渗透到细胞内从而标记足细胞的整体，能够显示足细胞的三级特征性解剖结构和病理形态改变，为病理医师全面、精确评估足细胞受损情况，以及临床医生进行个体化诊断、治疗和判断预后提供更加充足的证据。
Description
技术领域
本发明属于组织荧光染色技术领域，具体为一种足细胞免疫荧光染色的方法及其应用。
背景技术
肾脏足细胞和足突（foot process，FP）是肾小球超滤系统的重要组成部分，其和内皮细胞、肾小球基底膜共同构成了滤过屏障。足细胞有其独特的解剖结构特征，包括胞体、初级和次级突起，终末分支-足突相互交叉附着在基底膜的外侧。这种独特的超滤装置主要负责把水、无机盐和小分子物质从管腔过滤进入包曼氏囊腔，白蛋白等中大分子留在肾小球的毛细血管内。因此，足细胞的结构和功能是维持肾小球滤过屏障的关键因素。蛋白尿的产生通常与由足细胞微丝系统重排驱动导致的不同程度的足细胞膜重塑，继而导致的足突融合和/或裂隙膜装置的破坏有关。越来越多的学者认为，肾小球疾病在出现重度肾综范围的蛋白尿之前，都会先出现足突形态的超微改变。
而正常的足突的宽度是大约200nm左右，超过了光学衍射极限，因此耗时的透射电镜（TEM）准备和评估是必需的。几十年来，对于肾脏足细胞的成像和观察以及形态学参数的测量依赖于电镜技术。临床上，足细胞病包括微小病变肾病（minimal change disease，MCD）、局灶节段性肾小球硬化症（focal segmental glomerulitis，FSGS）、膜性肾病（membranous nephropathy，MN），经典的常规组织病理学评估（H&E、PAS、六胺银染色、马松三色）和免疫组织学（IgG，IgM，IgA，C3）并不能确诊，因为该类疾病主要病理特征是足细胞的足突消失（foot process effacement，FPE）。然而透射电镜样本制备不同于用于光镜下观察的常规石蜡标本，需要额外的肾活检穿刺的标本以及特殊的固定、脱水、浸透、包埋聚合、切片及染色等样本处理技术。
通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷包括：1.透射电镜并不是医院乃至研究实验室中的常用成像设备，限制了普通实验室病理专家对肾活检标本组织足细胞形态的观察；2.电镜标本的制作比较复杂和耗时，需要专业的样本制备人员；3.电镜评估足细胞受限于电镜标本本身，用于光镜下观察的肾活检组织有15~25个肾小球，而电镜标本通常只有1~2个肾小球，因此对于局灶性病变的评估并不适用；4.如果电镜标本取材不当（无肾小球）会使足细胞病的诊断陷于困境。因此，目前缺少一种简单直接的观察和评估足细胞形态变化的方法。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提供一种足细胞免疫荧光染色的方法，经本发明方法染色后可直接在光镜水平实现肾活检标本的足细胞损伤程度评估，最大化利用所穿刺的肾活检标本中的所有肾小球，实现更全面的足细胞损伤评估，为足细胞病的评估和预后提供更充分的依据。
为了实现上述发明目的，本发明提供了以下技术方案：
本发明提供了一种足细胞免疫荧光染色的方法，所述免疫荧光染色方法包括如下步骤：对肾组织石蜡切片进行脱蜡、水化后，使用胃蛋白酶处理组织切片后室温封闭；依次用ANGPTL4抗体和FITC-羊抗兔抗体孵育封闭处理后的切片，封片保存。
优选地，所述胃蛋白酶处理组织切片的时间为35~45min，所述胃蛋白酶浓度为4%。
优选地，所述ANGPTL4抗体和FITC-羊抗兔抗体经PBS溶液稀释后使用。
更优选地，所述ANGPTL4抗体的稀释浓度为1:40~60；FITC-羊抗兔抗体的稀释浓度为1:400~1:600。
优选地，所述室温封闭的条件为利用3%BSA封闭处理组织切片20~40min。
优选地，所述脱蜡的方法包括如下步骤：利用二甲苯Ⅰ液体将肾组织石蜡切片初次浸泡30~50min；再用另一个二甲苯Ⅱ液体将初次浸泡后的肾组织石蜡切片再浸泡30~50min。
优选地，所述水化的方法包括如下步骤：100%酒精对组织切片处理10min，100%酒精对组织切片二次处理10min，95%酒精对组织切片处理5min，95%酒精对组织切片二次处理5min，80%酒精对组织切片处理2min。
本发明还提供了一种所述免疫荧光染色方法在辅助测量足细胞形态学参数中的应用。
优选地，所述足细胞形态学参数包括足细胞的胞体、足细胞初级突起和次级突起。
本发明还提供了一种所述免疫荧光染色方法在辅助评估足细胞损伤中的应用。
相对于现有技术，本发明具有如下有益效果：
（1）相比电镜样本需要额外的组织和制样而言，本发明的方法无需额外的标本，可直接使用常规石蜡包埋的组织切片，节省了标本和制样时间；
（2）采用本发明的方法进行足细胞染色，抗体渗透性和特异性均较好，允许抗体渗透到细胞内从而标记足细胞的整体，显示足细胞的三级特征性解剖结构和病理形态改变，包括足细胞的胞体及空泡化，初级突起和次级突起的增粗紊乱、初级突起消失；
（3）本发明的方法免疫染色过程简单，为常用的间接免疫染色技术，对技术员的要求低，可行性高；本发明的方法成像方便，对成像设备要求低，普通荧光显微镜即可获得足够的分辨率，提高了效率，节约了成本；
（4）使用本发明的方法进行光学下足细胞染色和成像，能够最大化利用肾脏标本，纳入全部肾小球来全面评估足细胞受损情况，为临床医生、研究和判断预后提供更加充足的证据。
附图说明
图1为不同组织固定方法的对比图；
图2为不同抗原修复方法的对比图；
图3为不同胃酶修复时间的对比图；
图4为不同一抗产品荧光染色结果的对比图；
图5为肾活检组织经过本发明染色后显色和成像后的足细胞初级突起和次级突起测量示意图；
图6为微小病变肾病肾病期患者的足细胞在PAS染色、本发明染色方法与电镜图片对比图；
图7为微小病变肾病缓解期患者的足细胞在PAS染色、本发明染色方法与电镜图片对比图；
图8为瘤旁肾组织健康的足细胞分别在PAS染色、本发明染色方法与电镜图片的对比图；
图9为膜性肾病患者的足细胞在PAS染色、本发明染色方法与电镜图片的对比图；
图10为不同病理类型肾活检组织经过本发明染色方法的显色和成像后的足细胞空泡化成像和电镜图片的对比图；
图11为肾活检组织在本方法进行足细胞显色的流程和临床上超薄标本制作流程图对比结果。
具体实施方式
本发明提供了一种足细胞免疫荧光染色的方法，所述免疫荧光染色方法包括如下步骤：对肾组织石蜡切片进行脱蜡、水化后，使用胃蛋白酶处理组织切片后室温封闭；依次用ANGPTL4抗体和FITC-羊抗兔抗体孵育封闭处理后的切片，封片保存。在本发明中，所述肾组织石蜡切片可通过常规石蜡切片制备方法获得，所述肾组织石蜡切片厚度优选为3μm；所述肾组织石蜡切片厚度在抗体的渗透性和免疫染色的分辨率上最佳。在本发明中，所述肾组织石蜡切片为肾活检组织石蜡切片。
在本发明中，所述胃蛋白酶处理组织切片的时间为35~45min，所述胃蛋白酶浓度为4%；更优选地处理时间为40min。在胃蛋白酶处理时间上，处理时间过短足细胞的形态无法全部显示；处理时间过长，部分细胞会被消化。本发明通过调整胃蛋白酶的处理时间，仅进行一次抗原修复既能全部暴露抗原，又不会消化掉足细胞的一些结构。
在本发明的具体实施例中，所述封片时采用的封片剂为DAPI（Cat#D5942 Sigma）。在封片前，需要用PBS缓冲液洗涤组织切片3次，每次3min，保证把非特异性吸附的二抗清洗干净，减少非特异性显色，保证背景干净，封片后避光保存。
在本发明中，所述ANGPTL4抗体和FITC-羊抗兔抗体经PBS溶液稀释后使用。在本发明中，所述ANGPTL4抗体于4℃条件下处理组织切片过夜；所述FITC-羊抗兔抗体于室温下处理组织切片0.5~1h。在本发明的具体实施例中，使用ANGPTL4抗体处理组织切片后，使用PBS缓冲液洗涤组织切片3次，每次3min，再使用FITC-羊抗兔抗体处理组织切片。在本发明中，所述ANGPTL4为血管生成素样蛋白4，本发明所述ANGPTL4购自proteintech公司，货号为51109-1-AP。本发明选择的ANGPTL4抗体作为一抗对组织切片进行标记可使得正常状态和所有疾病状态下的足细胞都染色和显像。
在本发明中，所述ANGPTL4抗体的稀释浓度优选为1:40~60；更优选为1:50；所述FITC-羊抗兔抗体的稀释浓度优选为1:400~600，更优选为1:500。
在本发明中，所述室温封闭的条件为利用3%BSA封闭处理组织切片20~40min。
在本发明中，所述脱蜡的方法包括如下步骤：利用二甲苯Ⅰ液体将肾组织石蜡切片初次浸泡30~50min；再用另一个二甲苯Ⅱ液体将初次浸泡后的肾组织石蜡切片再浸泡30~50min。本发明的方法使石蜡切片脱蜡完全，避免脱蜡不充分导致的抗原没有暴露，为之后染色提供良好基础。
在本发明中，所述水化的方法包括如下步骤：100%酒精对组织切片处理10min，100%酒精对组织切片二次处理10min，95%酒精对组织切片处理5min，95%酒精对组织切片二次处理5min，80%酒精对组织切片处理2min。本发明水化处理完全，更好地让组织还原为体内的状态，避免之后出现染色不均匀，产生非特异性背景着色等问题。
本发明还提供了一种所述免疫荧光染色方法在辅助测量足细胞形态学参数中的应用。在本发明的具体实施例中，将荧光染色后的切片置于400倍普通荧光显微镜下，肉眼观察肾小球中免疫染色阳性的足细胞的形态学特征，包括但不限于以下形态学参数：1）足细胞的胞体：有无肿胀，有无空泡化；2）足细胞的胞体分支包括初级突起和次级突起：包括排列有序或紊乱；有无增粗或肿胀；初级突起和次级突起分支的数目；初级突起消失。在本发明的具体实施例中，所述测量方法使用ImageJ图片处理软件系统，进行足细胞形态学参数的测量。
根据免疫荧光染色的成像原理，本发明基于ANGPTL4免疫荧光信号半高全宽（FWHM）参数作为突起宽度测量数值的方法。其中，初级突起宽度的半自动测量方法为：使用ImageJ软件打开图片，对足细胞的初级突起进行划线，对划线处使用Plot Profile工具得到突起宽度的灰度曲线值，将上述曲线进行高斯拟合（插件spiky-find peaks）后取半高全宽得到突起的宽度，分别计算初级突起和次级突起的宽度；次级突起宽度的半自动测量与上述步骤相同。
在本发明中，所述足细胞形态学参数包括足细胞的胞体、足细胞初级突起和次级突起。其中，足细胞的胞体的形态特征的变化和蛋白尿的严重程度有关；足细胞的初级突起和次级突起分支数目与蛋白尿的严重程度有关；初级突起消失是足细胞严重受损的表现，是足细胞脱落和丢失的前兆。
本发明还提供了一种所述免疫荧光染色方法在辅助评估足细胞损伤中的应用。在本发明的具体实施例中，通过对初级突起和次级突起定量分析后，即通过上述半自动测量方法分别计算初级突起和次级突起的宽度，若二者平均宽度越宽，代表足细胞融合越明显，足细胞受损越严重。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
一种足细胞免疫荧光染色的方法，包括以下步骤：
肾活检组织石蜡切片免疫标记前的处理：
1）肾活检组织石蜡切片：患者肾活检组织使用常规4.5%福尔马林固定，进行常规石蜡包埋后的切片至厚度为3μm；
2）脱蜡、水化：石蜡切片依次过二甲苯及酒精缸：二甲苯40min，二甲苯40min，100%酒精10min，100%酒精10min，95%酒精5min，95%酒精5min，80%酒精2min，然后PBS洗涤3次，每次3min；
3）抗原修复：使用0.4%胃蛋白酶对脱蜡水化后的组织切片于37℃孵育40min。PBS洗涤3次，每次3min；
4）封闭：3%BSA室温封闭30min。
石蜡切片足细胞进行免疫标记处理：
1）一抗处理：用PBS按稀释浓度1:50稀释兔抗人ANGPTL4抗体，使用稀释后的抗体于4℃条件下孵育组织切片过夜；
2）二抗处理：使用PBS洗涤组织切片3次，每次3min，用PBS按稀释浓度1:500稀释FITC-羊抗兔抗体，用稀释后的抗体于室温下孵育组织切片1h。
3）DAPI-封片剂封：PBS洗涤组织切片3次，每次3min，使用含有DAPI的封片剂进行封片（化学染色），封片后避光保存。
实施例2
与实施例1不同的是，抗原修复时间为35min，其余步骤不变。
实施例3
与实施例1不同的是，抗原修复时间为45min，其余步骤不变。
实施例4
与实施例1不同的是，一抗处理时的稀释浓度为1:40；二抗处理时的稀释浓度为1:400，其余步骤不变。
实施例5
与实施例1不同的是，一抗处理时的稀释浓度为1:60；二抗处理时的稀释浓度为1:600，其余步骤不变。
实施例6
与实施例1不同的是，封闭时间为20min，其余步骤不变。
实施例7
与实施例1不同的是，封闭时间为40min，其余步骤不变。
对比例1
使用肾组织冰冻切片1进行实施例1的后续实验步骤；所述冰冻切片1的制备过程如下：将肾穿刺活检组织放入挤有OCT的包埋模具中，往包埋模具继续加入预冷的OCT，完全覆盖组织，在冰冻切片机中进行切片，厚度约为5μm。冰冻切片1放入PBS中清洗3遍，每遍3分钟，然后进行胎牛血清封闭，加入一抗，二抗，同石蜡组织。
对比例2
使用肾组织冰冻切片2进行实施例1的后续实验步骤；所述冰冻切片2的制备步骤同冰冻切片1。
对比例3
与实施例1不同的是，抗原修复的方法为高温EDTA修复，其余步骤不变；其中，高温EDTA修复的方法为：微波炉，微波火力调为100W加热至沸腾，取出烧杯，将组织切片放入沸腾的EDTA修复液（pH9.0）里，再次放入微波炉内，减小火力为40W，加热10min。
对比例4
与实施例1不同的是，抗原修复的方法为EDTA高压修复，其余步骤不变；其中，EDTA高压修复的方法为：高压锅，将石蜡组织切片放入高压锅EDTA修复液（pH9.0）中，加热至沸腾；盖上压力阀至喷汽后持续5分钟。
对比例5
与实施例1不同的是，抗原修复的方法为使用0.1%胰蛋白酶替换0.4%胃蛋白酶进行修复，其余步骤不变。
对比例6
与实施例1不同的是，抗原修复的方法为柠檬酸高压修复，其余步骤不变；其中，柠檬酸高压修复的方法为：高压锅，将石蜡切片放入高压锅柠檬酸修复液（pH6.0）中，加热至沸腾；盖上压力阀至喷汽后持续5分钟。
对比例7
与实施例1不同的是，抗原修复的方法为使用蛋白酶K（1mg/ml）替换0.4%胃蛋白酶进行修复，其余步骤不变。
对比例8
与实施例1不同的是，抗原修复的时间为20min，其余步骤不变。
对比例9
与实施例1不同的是，抗原修复的时间为30min，其余步骤不变。
对比例10
与实施例1不同的是，抗原修复的时间为50min，其余步骤不变。
对比例11
与实施例1不同的是，抗原修复的时间为60min，其余步骤不变。
对比例12
与实施例1不同的是，抗原修复的时间为70min，其余步骤不变。
对比例13
与实施例1不同的是，一抗处理时使用抗体1替换ANGPTL4抗体，抗体1购自proteintech公司，货号为18374-1-AP，其余步骤不变。
对比例14
与实施例1不同的是，一抗处理时使用抗体2替换ANGPTL4抗体，抗体2购自abcam公司，货号为ab47046，其余步骤不变。
对比例15
与实施例1不同的是，一抗处理时使用抗体3替换ANGPTL4抗体，抗体3购自Invitrogen公司，货号为40-9800，其余步骤不变。
将实施例1以及对比例1~对比例15的荧光染色后的切片置于100倍普通荧光显微镜下，整体评估足细胞的免疫染色情况，保证所有足细胞均为荧光阳性；再将上述切片置于400倍普通荧光显微镜下，肉眼观察肾小球中免疫染色阳性的足细胞的形态学特征。
根据图1中不同组织固定方法对比图结果可以看出，使用冰冻组织1和冰冻组织2，肾小球为阳性，但组织形态不够完整，不能辨别足细胞（图1A和图1B）；图1C为本发明实施例1中使用石蜡组织切片，肾小球为阳性，组织形态完整，可清楚辨别足细胞。其中，图1的标尺为50μm。
根据图2中不同抗原修复方法的对比图结果可以看出，高温EDTA修复和高压修复（图2A和图2B），肾小球为阳性，肾小管为阴性，抗原暴露70%，足细胞结构不能辨别；胰酶修复、柠檬酸修复和蛋白酶K修复（图2C、图2D和图2E），肾小球为阳性，肾小管为阴性，抗原暴露20%，足细胞结构不能辨别；图2F为本发明实施例1使用胃蛋白酶修复，肾小球为阳性，肾小管为阴性，抗原暴露100%，足细胞结构可清楚辨别。其中，图2的标尺为50μm；细节图标尺为10μm。
根据图3中不同胃酶修复时间的对比图结果可以看出，37℃胃酶抗原修复20分钟，肾小球为阳性，肾小管为阴性，抗原暴露20%，不能清楚显示足细胞（图3A）；37℃胃酶修复30分钟，肾小球阳性，肾小管为阴性，抗原暴露50%，不能清楚显示足细胞（图3B）；本发明实施例1中37℃胃酶修复40分钟肾小球阳性，肾小管为阴性，抗原暴露100%，可以清楚显示足细胞（图3C）；37℃胃酶修复分别消化50分钟、60分钟、70分钟，肾小球阳性，肾小管为阴性，部分足细胞结构被消化（图3D、图3E、图3F）。其中，图3的标尺为50μm。
根据图4中不同一抗产品的对比图结果可以看出，抗体1对肾小球的足细胞有轻微染色，但荧光强度较弱，不能勾勒足细胞形态；抗体2对肾小球的足细胞不能染色；抗体3对肾小球的足细胞有轻微染色，但荧光强度较弱，不能勾勒足细胞形态；本发明使用的ANGPTL4抗体（图4中抗体4）对肾小球的足细胞有明显特异染色，且荧光强度较强，可勾勒足细胞形态。
实施例8
对实施例1获得的足细胞初级突起和次级突起进行测量，具体测量方式包括如下步骤：
使用ImageJ软件打开图片，对足细胞的初级突起进行垂直划线，对划线处使用Plot Profile工具得到突起宽度的灰度曲线值，将上述曲线进行高斯拟合（插件spiky-find peaks）后取半高全宽，即值得到突起的宽度；次级突起宽度的半自动测量与上述步骤相同。
根据图5可以看出，经本发明实施例1的染色方法显色成像后，可清晰分辨足细胞的三级结构，其中α为初级突起，β为次级突起。其中，图5A是患者石蜡切片ANGPTL4和DAPI（细胞核）共染的免疫荧光图片，厚度为3μm。图5B为在初级突起α横线处使用Plot Profile工具得到突起宽度的灰度值，图5C为图5B曲线进行高斯拟合，取半高全宽（FWHM）得到突起的宽度图；图5D为在次级突起α横线处使用Plot Profile工具得到突起宽度的灰度值，图5E为图5D曲线进行高斯拟合，取半高全宽（FWHM）得到突起的宽度图。
试验例1
来自肾病期的微小病变肾病患者肾活检组织分别进行PAS、本方法实施例1的免疫染色以及超薄切片的电镜图片。观察足细胞的形态：PAS染色不能显示足细胞的形态；所有足细胞经本方法染色后均可清晰显示；超薄切片可显示足细胞和广泛融合的足突，但视野有限。本发明的方法染色后可见肾小球足细胞及其分支，包括初级突起和次级突起，俯瞰图可见经典的相邻足细胞的突起指状交叉；横切面部分可见足细胞的分支初级突起（3.96±0.98μm）分出次级突起（1.42±0.46μm），紊乱地排列在毛细胞血管襻上。具体通过图6可以看出，图6a和图6b为该患者常规病理染色图片，分别是PAS染色和电镜图片，PAS染色（图6a）不能显示足细胞形态，电镜图片（图6b）厚度为70nm，可显示足细胞，但是视野局限，观察数目有限，只能观察到1~2个肾小球；图6c和图6e是同一患者石蜡切片ANGPTL4和DAPI（细胞核）共染的免疫荧光图片，厚度为3μm，图6c为俯视图，图6e为横断面图，图6d和图6f分别为对应方框的细节图，图6d和图6e可清晰分辨足细胞的三维结构，其中星为足细胞的胞体，α为初级突起，β为次级突起。
试验例2
来自缓解期的微小病变肾病患者肾活检组织分别进行PAS、本方法免疫染色以及超薄切片的电镜图片。观察足细胞的形态：PAS染色不能显示足细胞的形态；所有足细胞经本方法染色后均可清晰显示；超薄切片可显示足细胞和广泛融合的足突，但视野有限。本发明实施例1的方法染色后可见肾小球足细胞及其分支，包括初级突起和次级突起，横切面部分可见足细胞的分支初级突起（3.45±0.75μm）分出次级突起（1.39±0.48μm），相对整齐地排列在毛细胞血管襻上。具体通过图7可以看出，图7a和图7b该患者常规病理染色图片，分别是PAS染色和电镜图片，PAS染色（图7a）不能显示足细胞形态，电镜图片（图7b）厚度为70nm，可显示足细胞，但是视野局限，观察数目有限，只能观察到1~2个肾小球；图7c和图7d是同一患者石蜡切片ANGPTL4和DAPI（细胞核）单染的免疫荧光图片，图7e为merge后的图片，厚度为3μm，图7f为对应方框的细节图，可清晰分辨足细胞的三维结构，其中星为足细胞的胞体，α为初级突起，β为次级突起。
试验例3
来源于瘤旁肾组织的健康足细胞分别进行PAS、本方法免疫染色以及超薄切片的电镜图片，观察足细胞的形态。PAS染色不能显示足细胞的形态，所有足细胞经本方法染色后均可清晰显示，超薄切片可显示足细胞和终末突起（足突），但只能显示数个毛细血管襻。本发明实施例1的方法染色后可见肾小球足细胞及其分支，包括初级突起和次级突起，横切面可见初级突起（3.13±0.64μm）分出纤细的次级突起（1.28±0.23μm）规则地排列在毛细胞血管襻上。具体通过图8可以看出，图8a和图8d为该患者常规病理染色图片，分别是PAS染色和电镜图片，PAS染色（图8a）不能显示足细胞形态，电镜图片（图8d）厚度为70nm，可显示足细胞，但是视野局限，观察数目有限，只能观察到1~2个肾小球，图8b是该患者石蜡切片ANGPTL4和DAPI（细胞核）共染的免疫荧光图片，厚度为3μm，图8c为对应方框的细节图，可清晰分辨足细胞的三维结构，其中星为足细胞的胞体，α为初级突起，β为次级突起
试验例4
膜性肾病患者足细胞分别进行PAS、本方法免疫染色以及超薄切片的电镜图片，观察足细胞的形态；PAS不能显示足细胞的形态，所有足细胞经本方法染色后均可清晰显示，超薄切片可显示足细胞和初级突起消失，明显空泡化，但只能显示数个足细胞。本发明实施例1的方法染色后可见肾小球足细胞，横切面可见初级突起消失，肿胀的足细胞胞体趴在毛细胞血管襻外侧；足细胞的胞体空泡形成。具体通过图9可以看出，图9a和图9d为该患者常规病理染色图片，分别是PAS染色和电镜图片，PAS染色（图9a）不能显示足细胞形态，电镜图片（图9d）厚度为70nm，可显示足细胞，但是视野局限，观察数目有限，只能观察到1~2个肾小球，图9b是该患者石蜡切片ANGPTL4和DAPI（细胞核）共染的免疫荧光图片，厚度为3μm，图9c为对应方框的细节图，可清晰分辨足细胞结构，其中星为足细胞的胞体，初级突起和次级突起消失，和电镜图片一致。
试验例5
不同病理类型肾活检组织经过本发明实施例1方法显色和成像后的足细胞空泡化成像和电镜图片的对比如下：
图10为不同疾病类型和疾病的不同阶段以及瘤旁肾组织ANGPTL4染色情况以及对足细胞空泡化的显示，分别为局灶阶段性肾小球硬化症非特殊型（图10A），I期膜性肾病（图10B），II期膜性肾病（图10C），III期膜性肾病（图10D），微小病变肾病（图10E），瘤旁肾组织石蜡切片ANGPTL4和DAPI（细胞核）共染的免疫荧光图片，厚度为3μm，第二行为对应方框的细节图，可清晰分辨足细胞结构和空泡，其中箭头指示为足细胞内的空泡，和电镜图片一致。其中，图10F为瘤旁肾正常对照组。
综上对比可知，电镜样本需要额外的组织和制样，本发明无需额外的标本，可直接使用常规石蜡包埋的组织切片，节省了标本和制样时间；采用本发明的方法进行足细胞染色，能够清晰显示足细胞的三级特征性解剖结构和病理形态改变，包括足细胞的胞体及空泡化，初级突起和次级突起的增粗紊乱、初级突起消失，打破了足细胞形态只能在电镜下观察的传统观念和技术壁垒；本发明的方法免疫染色过程简单，为常用的间接免疫染色技术，对技术员的要求低，可行性高；本发明的方法成像方便，对成像设备要求低，普通荧光显微镜即可获得足够的分辨率，提高了效率，节约了成本。其中，图11为肾活检组织在本发明进行足细胞显色的流程和临床上超薄标本制作流程图对比。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种足细胞免疫荧光染色的方法，其特征在于，所述免疫荧光染色方法包括如下步骤：对肾组织石蜡切片进行脱蜡、水化后，使用胃蛋白酶处理组织切片后室温封闭；依次用ANGPTL4抗体和FITC-羊抗兔抗体孵育封闭处理后的切片，封片保存。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胃蛋白酶处理组织切片的时间为35~45min，所述胃蛋白酶浓度为4%。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述ANGPTL4抗体和FITC-羊抗兔抗体经PBS溶液稀释后使用。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述ANGPTL4抗体的稀释浓度为1:40~60；所述FITC-羊抗兔抗体的稀释浓度为1:400~1:600。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述室温封闭的条件为利用3%BSA封闭处理组织切片20~40min。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱蜡的方法包括如下步骤：利用二甲苯液体将肾组织石蜡切片初次浸泡30~50min；再用另一个二甲苯液体将初次浸泡后的肾组织石蜡切片再浸泡30~50min。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述水化的方法包括如下步骤：100%酒精对组织切片处理10min，100%酒精对组织切片二次处理10min，95%酒精对组织切片处理5min，95%酒精对组织切片二次处理5min，80%酒精对组织切片处理2min。
8.权利要求1~7任意一项所述方法在辅助测量足细胞形态学参数中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述足细胞形态学参数包括足细胞的胞体、足细胞初级突起和次级突起。
10.权利要求1~7任意一项所述方法在辅助评估足细胞损伤中的应用。
Priority Applications (1)
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