CN105687178A - 丹酚酸a在单独或多药联合治疗肾病综合症中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及中药有效成分的用途，主要涉及丹酚酸A在单独或多药联合治疗肾病综合症的应用。本发明公开了丹酚酸A或其可药用盐在单独或多药联合治疗肾病综合症的应用，本发明的目的在于将丹酚酸A引入到肾病综合症的治疗中，采用单独或多药联合对激素抵抗型肾病综合症进行治疗，通过引入丹酚酸A，增强糖皮质激素的疗效，有助于糖皮质激素在临床的合理应用，提高其治疗的有效性，以及减少激素毒性和激素抵抗；同时，本发明还明确了丹酚酸A的作用特点及其分子机制，为丹酚酸A治疗肾病综合症提供可靠依据，为研发新的治疗药物开辟新的途径，也为同类中药的开发奠定一定的基础。

Description

丹酚酸A在单独或多药联合治疗肾病综合症中的应用
技术领域
本发明涉及中药有效成分的用途，主要涉及丹酚酸A在单独或多药联合治疗肾病综合症的中应用。
背景技术
慢性肾病(CKD)已逐渐成为我国社会公共健康的重大问题，近年来死亡率大幅增加。目前，我国慢性肾病患者约为1-1.2亿人，迫切需要采取有效的防治措施。
肾病综合症(nephroticsyndrome,NS)为肾内科常见病、多发病，是一组以大量蛋白尿、水肿、高脂血症和低蛋白血症为基本特征的临床症候群，是导致终末期肾衰竭的重要原因之一。NS病程长，病情复杂，如何对其进行有效的治疗是当前肾病治疗的一大难点。目前，NS尚无理想的、有针对性的疗法。而且，同其它疾病(如心血管、肿瘤和糖尿病)治疗药物相比，肾脏疾病的新药研发明显落后，这使得肾病专家不得不采用治疗其它疾病的药物来治疗肾小球疾病。糖皮质激素是治疗NS的“抱脚石”，对疾病频繁复发、激素依赖或激素抵抗患者，临床可供选择的治疗方案有：大剂量激素冲击疗法、细胞毒或新型免疫抑制剂或生物制剂(如环磷酰胺、环孢素A、他克莫司、霉酚酸酯、利妥昔单抗)单独或联合激素疗法。上述方法治疗NS虽有一定的疗效，但是NS病程长，长期使用其不良反应不容忽视。长期应用激素会导致感染、高血压、骨质疏松、白内障等副作用，新的免疫抑制剂也会带来更多、更严重的毒副反应，如严重肝肾功能损害、严重感染、糖尿病、血液学和胃肠道毒性等【韦喆.难治性原发性肾病综合症的治疗现状】。而且，在治疗过程中，部分患者也对新的免疫抑制药物产生抵抗。故临床仍急需疗效显著且安全性高的NS治疗药物，寻找有效减少蛋白尿的方法仍是当前重要的研究课题。
根据对初始标准激素疗法的反应性，可将NS分为激素敏感型NS(SSNS)、激素依赖型NS(SDNS)和激素抵抗型NS(SRNS)。其中SRNS的诊断、预后和治疗对肾病专家具有显著的挑战性。在原发性NS中，SRNS患病率为10％～40％，如不采取有效的治疗，5～10年内，约有半数的SRNS患者会发展成为终末期肾衰竭，严重威胁患者生命健康。
肾病综合症病理机制复杂，与遗传、氧化应激、免疫损伤、炎症等有关。瞬时受体电位阳离子通道6(TRPC6)和血管生成素样蛋白4(Angptl4)相关信号通路在NS甚至是激素抵抗型NS的发生中具有重要作用，TRPC6突变或表达升高可导致遗传性或获得性NS，而Angptl4是受糖皮质激素敏感调节的微小病变肾病(MCD)致病基因。因此，调节TRPC6和Angptl4相关信号通路可能会成为治疗NS以及激素抵抗NS的重要手段。
激素依赖以及激素抵抗NS一直以来都是临床治疗的难点。在临床上，可通过联合用药来提高疗效，减少不良反应和药物抵抗的发生。有关多药联合治疗难治性NS已有多项研究报道，多药联合的原理是联合使用作用于不同信号级联水平的药物，药物之间相互补充，同时抑制引起不同组织损伤的多个反应途径，从多个方面保护肾脏，多药联合治疗可有效缓解NS，尤其是激素抵抗型NS。然而，鉴于目前所联用的药物毒性较大，多药联合治疗SRNS的长期安全性和有效性仍有待大型的临床试验加以验证。
现代研究中，有关中草药或中草药提取物治疗NS的研究并不少见，从中药中寻找毒副作用小、疗效好的NS治疗候选药物联合治疗SRNS具有很好的开发前景。丹酚酸A(Salvianolicacid,SAA)是我国传统活血化瘀中药丹参的主要水溶性活性成分，多项药理学研究证明，丹酚酸A是一个多靶点的化合物，具有多方面的药理活性，尤其是具有较强的抗氧化活性。它是丹参多种水溶性提取物中抗氧化活性最强的物质，可有效清除超氧阴离子，抑制氧自由基引起的细胞膜过氧化损伤，作用比抗氧剂维生素E强百倍甚至千倍【黄诒森，张均田.丹参中三种水溶性成分的体外抗氧化作用[J].药学学报，1992，27(2)：96-100.LiuGT,etal.Protectiveactionofsevennaturalphenoliccompoundsagainstperoxidativedamagetobiomembranes[J].BiochemPharmacol,1992,43(2):147-152.】。前期的一些研究证明，丹酚酸A体内外可有效抑制血小板粘附、活化、聚集功能。体外实验显示，丹酚酸A能够对抗多种诱导剂引起的大鼠或人血小板聚集，降低血小板中cAMP含量，减少ADP诱导的血小板P选择性表达和纤维蛋白原与受体的结合。同时，丹酚酸A还能抑制PI3K表达，降低Akt磷酸化水平【FanHY,etal.AntiplateletandantithromboticactivitiesofsalvianolicacidA[J].ThrombRes,2010,126(1):17-22.HuangZS,etal.Salvianolicacidinhibitsplateletactivationandarterialthrombosisviainhibitionofphosphoinositide3-kinase[J].JThrombHaemost,2010,8(6):1383-1393.】。体内试验证实，丹酚酸A可有效减轻大鼠动-静脉旁路血栓质量，抑制ADP诱导的血小板聚集，表现出良好的抗血栓作用，同时还能改善血液瘀滞模型大鼠血液流变性【FanHY,etal.AntiplateletandantithromboticactivitiesofsalvianolicacidA[J].ThrombRes,2010,126(1):17-22.】。这些结果提示丹酚酸A是一个很有前景的防治血栓栓塞事件的药物。此外，丹酚酸A还具有抗炎【OhKS,etal.SalvianolicacidAsuppresslipopolysaccharide-inducedNF-κBsignalingpathwaybytargetingIKKβ[J].IntImmunopharmacol,2011,11(11):1901-1906.】、心脑血管保护以及神经保护等方面的作用【张莉，等.丹酚酸A的研究与进展[J].中国中药杂志，2011，36(19)：2603-2609.】，作用机制与抑制炎症因子生成、调节线粒体功能、减少细胞凋亡有关。近年来的一些研究也报道，丹酚酸A还能预防大鼠糖尿病及糖尿病肾病的发生，降低血糖，改善糖代谢和脂质代谢紊乱【方莲花，等.丹酚酸A对实验性糖尿病大鼠的降糖作用及其机制初探[J].中国新药杂志，2011，20(21)：2063-2068】。丹酚酸A肾脏保护方面的作用主要表现在降低糖尿病肾病大鼠血中肌酐、尿素氮水平，减少尿中蛋白含量，改善肾脏病理损伤【张莉，等.丹酚酸A对高脂饮食致2型糖尿病大鼠肾病的影响[J].中国药理学通报，2009，25：241.】。
目前国内外尚无丹酚酸A治疗肾病综合症及抑制肾小球足细胞病变方面的报道，因此，将丹酚酸A引入到肾病综合症中(单独或多药联合治疗)，进行相关方面的研究具有重大现实意义。
发明内容
基于上述背景，本发明的目的在于将丹酚酸A引入到肾病综合症的治疗中，公开了丹酚酸A或其可药用盐在单独治疗或多药联合治疗肾病综合症的应用，以及丹酚酸A单独或联合激素治疗激素抵抗型肾病综合症中的应用。通过引入丹酚酸A，发挥对糖皮质激素协同增效的作用，提高激素治疗的有效性，减少激素毒性和激素抵抗；同时，本发明还明确了丹酚酸A的作用特点及其分子机制，为丹酚酸A治疗肾病综合症提供可靠依据，为研发新的治疗药物开辟新的途径，也为同类中药的开发奠定一定的基础。
为实现上述目的，本发明公开了丹酚酸A或其可药用盐在制备抑制肾组织中NF-κB激活、增加足细胞蛋白podocin、nephrin表达药物中的应用，进一步，公开了丹酚酸A或其可药用盐在制备治疗肾病综合症药物中的应用。
作为本发明的另一种方案，本发明还公开了丹酚酸A或其可药用盐在多药联合治疗肾病综合症的应用。
进一步，本发明还提供了丹酚酸A或其可药用盐与糖皮质激素协同作用在治疗激素抵抗型肾病综合症的应用。
进一步，本发明还提供了丹酚酸A或其可药用盐与地塞米松等糖皮质激素联合使用，对糖皮质激素治疗嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导的肾病的应用。
进一步，本发明还提供了丹酚酸A或其可药用盐与糖皮质激素协同作用在治疗激素抵抗型肾病综合症时，抑制足细胞瞬时受体电位阳离子通道6(TRPC6)的信号通路，降低足细胞血管生成素样蛋白4(Angptl4)的表达水平，减少蛋白尿的应用。
进一步，本发明还限定了在治疗激素抵抗型肾病综合症时采用丹酚酸A或其可药用盐与糖皮质激素的用(重)量范围比为1：1—1：10。
进一步，本发明还限定了肾病综合症为微小病变肾病、局灶性节段肾小球硬化症、膜性肾病、肾小球肾炎以及肾病综合症的高凝状态、血栓和高脂血症致命性合并症。
本发明所述的丹酚酸A通过以下制备方法得到：以浓度为1.0％的丹参多酚酸盐溶液为原料，添加柠檬酸三钠调pH至6.0，于125℃、0.15MPa条件下转化4小时，冷却至室温后盐酸调pH至2.0-3.0，得到丹酚酸A溶液；将丹酚酸A溶液依次过HPD100树脂富集与纯化、CG161树脂分离与纯化、硅胶柱色谱精细纯化得到所需的丹酚酸A。
本发明的有益效果：
1、本发明的目的在于将丹酚酸A引入到肾病综合症的治疗中，公开了丹酚酸A或其可药用盐在制备治疗肾病综合症药物中的新用途，公开了丹酚酸A对阿霉素诱导的大鼠肾病综合症的作用，包括对大鼠生化指标及血液流变性的影响，对大鼠尿蛋白、肾组织中SOD活性、MDA含量的影响，以及对肾组织中NF-κB信号通路、足细胞蛋白podocin、nephrin表达的影响。
2、本发明公开了丹酚酸A或其可药用盐在多药联合治疗肾病综合症的应用，采用多药联合方式对激素抵抗型肾病综合症进行治疗，引入的丹酚酸A对糖皮质激素具有协调增效的作用，有效抑制足细胞上的TRPC6和Angptl4表达。另外，由于糖皮质激素能够增加血液中Angptl4水平，在降蛋白尿的同时也会有加重高甘油三酯血症的风险，而丹酚酸A具有良好的降甘油三酯作用。因此，丹酚酸A与激素联合应用时，在起到增效作用的同时，还能够克服激素降蛋白尿带来的副作用，有助于提高激素临床治疗的有效性，以及减少激素毒性和激素抵抗。
3、本发明还明确了丹酚酸A的作用特点及其分子机制，明确丹酚酸A可有效减轻肾病模型大鼠肾脏损伤严重程度，减少足细胞足突融合，并且能够稳定足细胞结构蛋白podocin、nephrin的表达，抑制致病关键分子TRPC6和Angptl4的表达，这些研究成果为丹酚酸A治疗肾病综合症提供可靠依据，为研发新的治疗药物开辟新的途径，也为同类中药的开发奠定一定的基础。
附图说明
图1丹酚酸A对阿霉素肾病大鼠24h尿蛋白的影响.与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；
图2丹酚酸A对大鼠肾组织中SOD活性的影响.与正常对照组比较，##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01；
图3丹酚酸A对大鼠肾组织中MDA含量的影响.与正常对照组比较，##P<0.01；与模型对照组比较，**P<0.01；
图4丹酚酸A对大鼠肾脏病变的影响；
图5丹酚酸A对大鼠病理损伤评分的影响.与正常对照组比较，##P<0.01；与模型对照组比较，**P<0.01；
图6丹酚酸A对大鼠肾脏足细胞病变的影响；
图7丹酚酸A对大鼠肾小球足细胞足突宽度的影响.与正常对照组比较，##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01；
图8丹酚酸A对大鼠肾组织p-IκBα,IκBα蛋白表达的影响；
图9丹酚酸A对大鼠肾组织NF-κBp65蛋白表达的影响；
图10丹酚酸A对大鼠足细胞蛋白podocin和nephrin表达的影响；
图11为正常对照组光镜下肾组织病理改变；
图12为模型对照组光镜下肾组织病理改变；
图13为泼尼松组光镜下肾组织病理改变；
图14为丹酚酸A5mg/kg组光镜下肾组织病理改变；
图15为丹酚酸A10mg/kg组光镜下肾组织病理改变；
图16为丹酚酸A+泼尼松组光镜下肾组织病理改变；
图17为正常对照组肾组织超微结构变化；
图18为模型对照组肾组织超微结构变化；
图19为泼尼松组肾组织超微结构变化；
图20为丹酚酸A5mg/kg组肾组织超微结构变化；
图21为丹酚酸A10mg/kg组肾组织超微结构变化；
图22为丹酚酸A+泼尼松组肾组织超微结构变化；
图23为肾组织nephrin、desmin、Angptl4和TRPC6蛋白表达；
图24为足细胞TRPC6、nephrin和desmin表达情况；
图25为足细胞内钙离子浓度变化情况.*P<0.05，**P<0.01，与PAN处理组比较。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例和附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1丹酚酸A的制备
丹参多酚酸盐300克加水稀释至浓度为1.0％(以丹参乙酸镁计)，用柠檬酸三钠调pH至6.0，于125℃、0.15MPa条件下转化4小时，冷却至室温后盐酸调pH至2.0～3.0，依法测定丹酚酸A含量；样液过HPD100树脂柱，依次用水、25％乙醇溶液洗脱(弃去)，再用40％乙醇溶液洗脱收集丹酚酸A，依法测定丹酚酸A含量，减压浓缩至丹酚酸A浓度约15.0～30.0mg/ml；浓缩液过CG161树脂柱，依次用20％乙醇溶液洗脱(弃去)，再用35％乙醇溶液洗脱收集丹酚酸A，减压浓缩至丹酚酸A浓度约50.0mg/ml；盐酸调pH至2～3，以等体积乙酸乙酯萃取三次，合并萃取液，减压浓缩，加2.5倍量硅胶(80～120目)拌匀，干燥，湿法上硅胶柱(200～300目，2.5倍量)，以正己烷-乙酸乙酯(6:4和5:5)洗脱，收集正己烷-乙酸乙酯(5:5)洗脱液，减压浓缩至干，加水适量分散，再减压浓缩，干燥，即得丹酚酸A180.2克，含量96.6％(外标法)。
实施例2丹酚酸A对阿霉素诱导的大鼠肾病综合症的保护作用
(一)方法
1.样品批号及来源
丹酚酸A，批号20130618山东靶点药物研究有限公司提供，制法如实施1。
醋酸泼尼松片，批号130506，浙江仙琚制药股份有限公司。
氯化钠注射液(0.9％)，批号A130529E1，辽宁民康制药有限公司。
5％葡萄糖，批号B14012305，山东华鲁制药有限公司。
2.建立模型及给药
取30只大鼠，随机分为6个组，分别为：正常对照组，模型对照组，阳性药组(醋酸泼尼松10mg/kg，0.5％CMC-Na混悬)、丹酚酸A(2.5、5、10mg/kg，iv.，溶于5％的葡萄糖)。除正常对照组外，其余各组大鼠一次性尾静脉注入阿霉素7.5mg/kg，正常对照组大鼠给予相同体积的生理盐水，造模当天记为第1天。注射阿霉素7天后，即第8天，各组动物开始给药，每天一次，连续给药21天，正常对照组和模型对照组给予等体积的5％葡萄糖。
3.标本收集
分别于注射阿霉素后第3、7、14、21、28天收集24小时尿液，3000rpm离心15min，去除沉渣，收集上清液，-20度冰箱保存。第29天后，将动物麻醉，解剖，取大鼠双侧肾脏，将左侧肾脏分为两部分，一半用10％中性甲醛固定制作石蜡切片，切取另一半肾脏皮质区数块(大小为1×1×2mm)，采用3％戊二醛固定，然后放入冰箱4度保存，用作电镜观察；切取剩余的肾组织皮质区数块，存储于-80度冰箱，用于Westernblot及组织匀浆检测。随后腹主动脉取血，3000rpm，离心15min，取上清液，测定生化指标。
4.观察指标及测定方法
1)一般情况观察：观察各组大鼠精神状态、食量、活动情况，试验期间每日称大鼠体重。
2)24小时尿蛋白定量测定：于阿霉素注射后第3、7、14、21、28天收集24小时尿液，测量尿液体积并做记录，离心去除残渣，取上清液，-20℃冰箱保存，BCA蛋白定量试剂盒检测尿蛋白含量。
3)血生化指标检测：大鼠经腹主动脉取血后，部分血液以3000rmp离心15min制备上清液。取上清液，采用全自动血生化仪和BCA蛋白测定试剂盒检测血清白蛋白(albumin,ALB)、总蛋白(Totalprotein,TP)、总胆固醇(totalcholesterol,TC)、甘油三酯(triglyceride,TG)、血肌酐(serumcreatinine,SCr)，血清尿素氮(bloodureanitrogen,BUN)含量。
4)血液流变学检查：大鼠经腹主动脉取血后，部分血液分别用肝素锂和EDTA-K2抗凝，轻轻混匀后，送烟台毓璜顶医院检验科检验，采用MVIS-2035全自动血液流变分析仪测血液流变学各项指标，包括：低切变率(lowshearrate，1s-1)、中切变率(mediumshearrate，30s-1)和高切变率(highshearrate，200s-1)条件下的全血粘度(wholebloodviscosity,WBV)值，血浆粘度(plasmaviscosity,PV)值；EDTA-K2抗凝血采用XT-1800i全自动血细胞分析仪测红细胞压积(hematocritvalues,Hct)。
5)肾脏组织石蜡切片：肾脏切片，HE染色，于光镜下观察肾小球上皮细胞、小管间质和基底膜变化情况。最后，根据肾小球上皮细胞增殖、肾小管细胞肿胀、蛋白管型和肾间质炎性细胞浸润情况进行分级评分：0分为正常；1分为轻微病变；2分为中度病变；3分严重病变。所有项评分的总和为每个组织样本总的得分。
6)肾脏电镜观察：取3％戊二醛固定的肾脏组织，在PBS等渗缓冲液中进行漂洗，使样品彻底漂洗干净，并浸泡过夜。漂洗后的样品用1％锇酸(0.24MPBSpH7.4)在4度下固定2小时，PBS等渗缓冲液中漂洗15min。随后采用乙醇和丙酮梯度脱水，Epon812包埋聚合，先进行1um半薄切片，甲苯胺兰染色后，于光镜下定位，再进行超薄切片，用双氧铀和柠檬酸铅双重电染，透射电镜(JEM1400,JAPAN)下观察肾脏超微结构变化并测量足突宽度。
7)氧化指标：肾皮质组织匀浆，用试剂盒测组织中MDA含量和SOD活性，根据试剂盒说明书进行操作，MDA结果表示为μmol/mg蛋白，SOD计算公式：
SOD活力(U/mg蛋白)＝SOD抑制率÷50％×反应体系稀释倍数(0.24/0.02)÷待测样品蛋白浓度。
8)Westernblot试验：提取肾组织总蛋白和核蛋白，检测组织中NF-κBp65、IκBα、p-IκBα、裂孔膜蛋白podocin和nephrin表达情况。
(二)结果
1丹酚酸A对阿霉素肾病大鼠24h尿蛋白的影响
结果如附图1所示，静脉注射阿霉素后，大鼠尿蛋白排泄量逐渐增加。第7天时，模型对照组大鼠尿蛋白含量显著高于正常对照组；第14天开始，模型对照组大鼠尿蛋白含量快速升高。醋酸泼尼松治疗显著降低大鼠第2、3和4周尿蛋白含量；丹酚酸A也能够降低大鼠尿蛋白含量。丹酚酸A5mg/kg和10mg/kg给药剂量组大鼠于第3周和第4周时尿蛋白含量显著低于模型对照组。丹酚酸A2.5mg/kg组仅于第三周时显著降低尿蛋白排泄量，其它时间段无明显作用。
2丹酚酸A对大鼠生化指标的影响
结果如表1和表2所示，静脉注射阿霉素降低大鼠血清白蛋白和总蛋白含量，同时升高胆固醇、甘油三酯、尿素氮和血肌酐水平。丹酚酸A治疗后减轻白蛋白和总蛋白含量降低程度，降低胆固醇，甘油三酯，尿素氮和血肌酐水平，其中10mg/kg给药剂量效果相对较好。泼尼松也显示较好的作用，但是它对脂质代谢的影响没有丹酚酸A好。
表1丹酚酸A对大鼠血生化指标的影响
与正常对照组比较，#P<0.05,##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01
表2丹酚酸A对大鼠BUN和SCr含量的影响
与正常对照组比较，#P<0.05,##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01
3丹酚酸A对大鼠肾组织中SOD活性和MDA含量的影响
结果如附图2和3所示，与正常对照组比较，模型对照组肾组织SOD活性显著降低，MDA含量明显升高。与模型对照组比较，丹酚酸A10mg/kg显著升高SOD活性，降低MDA含量；丹酚酸A5mg/kg也能显著升高SOD活性，但是对MDA含量没有显著影响。丹酚酸A2.5mg/kg也有一定作用，但是没有统计学差异。
4丹酚酸A对大鼠血液流变性的影响
结果如表3所示，与正常对照组比较，模型组大鼠全血粘度、血浆粘度和红细胞压积显著升高。丹酚酸A不同剂量显著降低大鼠全血粘度、血浆粘度和红细胞压积。
表3丹酚酸A对大鼠血液流变性的影响
与正常对照组比较，#P<0.05,##P<0.01；与模型对照组比较，*P<0.05,**P<0.01
5丹酚酸A对大鼠肾脏病变的影响
正常对照组大鼠肾脏没有明显的组织病理学变化。模型组大鼠肾组织病变明显，可见肾小球上皮细胞增殖、肾小管细胞肿胀、肾小管管腔大量蛋白渗出、肾间质灶性炎性细胞浸润。组织病理损伤评分相应升高。经泼尼松和不同剂量的丹酚酸A治疗后，大鼠肾脏病变有所减轻，但程度不一，其中以泼尼松和丹酚酸A高剂量组(10mg/kg)效果最为明显，炎性细胞浸润和蛋白管型减少，少见或几乎没有上皮增殖或肾小管细胞肿胀的情况。丹酚酸A5mg/kg组大鼠肾组织炎性细胞浸润和蛋白渗出较模型组减少，可见肾小球上皮细胞增殖、肾小管细胞轻微肿胀。丹酚酸A2.5mg/kg组可见肾间质炎性细胞浸润减少，但肾小管管腔蛋白渗出较多，肾小球上皮细胞增殖、肾小管细胞轻微肿胀，但与模型组比较病变仍有所减轻。各药物治疗组大鼠肾组织病理损伤评分相应降低，与模型组比较，丹酚酸A(5、10mg/kg)和泼尼松治疗组有统计学显著性差异(附图4和5)。
6丹酚酸A对大鼠足细胞病变的影响
采用透射电子显微镜分析肾脏超微结构的变化，并采用随机垂直截距长度法测算足突宽度。如附图6和7所示，正常组大鼠的肾小球和肾小管结构完整，未见明显损伤。足突清晰可见，无肿胀和萎缩。模型组大鼠的肾小球严重损伤，可见肾小球基础结构被破坏，足细胞足突大面积融合成板片状、裂孔间隙消失，足突宽度明显增加，肾小球基底膜轻微增厚。药物治疗后足突融合范围减小，仅局部融合，足突宽度明显减小，其中以泼尼松和丹酚酸A10mg/kg的作用较为明显，各治疗组未见肾小球基底膜增厚的情况。表明丹酚酸A能够阻止阿霉素诱导的足细胞损伤。
7丹酚酸A对肾组织p-IκBα,IκBαandNF-κBp65蛋白表达的影响
结果如附图8和9所示，与正常对照组比较，模型组大鼠肾组织p-IκBα和NF-κBp65蛋白表达水平升高，IκBα蛋白表达降低，提示大鼠肾组织中NF-κB信号通路激活。丹酚酸A治疗后下调p-IκBα和NF-κBp65蛋白表达，上调IκBα蛋白表达。
8丹酚酸A对足细胞蛋白podocin,nephrin表达的影响
如附图10所示，模型组大鼠肾组织podocin、nephrin蛋白表达明显降低。Podocin和nephrin是足细胞重要的分子蛋白，它们的表达水平降低与肾脏病变有关。而丹酚酸A治疗后显著增加podocin和nephrin的表达水平。
实施例3丹酚酸A对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)诱导的肾病的影响
(一)方法
取SD大鼠，单次尾静脉注射嘌呤霉素氨基核苷(PAN)15mg/100g诱导大鼠肾病模型。注射PAN7天后，动物分组给药，分别为：正常对照组、模型对照组、泼尼松10mg/kg(用0.5％CMC-Na混悬，ig.)、丹酚酸A(5、10mg/kg，溶于5％葡萄糖注射液，iv.)、丹酚酸A5mg/kg+泼尼松10mg/kg，每天给药1次，连续7天，正常对照组和模型对照组给予等体积的葡萄糖溶液。试验期间，观察动物一般临床体征、称体重，收集大鼠第3、7、14天24h尿液，3000rpm离心15min，去除沉渣，收集上清液，-20度冰箱保存。试验结束，收集样本，测定如下指标：
(1)测定尿蛋白含量：采用BCA蛋白定量试剂盒检测尿蛋白含量。
(2)采用全自动生化仪和BCA蛋白定量试剂盒测定动物血生化指标：血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)、血清白蛋白(ABL)、总蛋白(TP)、甘油三酯(TG)、胆固醇(TC)含量。
(3)部分血液分别用肝素锂和EDTA-K2抗凝，轻轻混匀后，采用MVIS-2035全自动血液流变分析仪测全血粘度(WBV)和血浆粘度(PV)值；EDTA-K2抗凝血采用XT-1800i全自动血细胞分析仪测红细胞压积(Hct)。
(4)取肾脏，分别用10％中性甲醛和戊二醛固定，10％中性甲醛固定的组织做常规石蜡切片，HE染色，光镜下观察肾脏病理变化；戊二醛固定组织用于电镜检查，观察肾小球超微结构变化。
(5)westernblot法测定肾组织desmin、nephrin、Angptl4和TRPC6表达情况。
(二)结果
124h尿蛋白排泄量
静脉注射PAN7天后，模型对照组大鼠尿蛋白含量显著升高，第14天时急剧升高。醋酸泼尼松显著降低大鼠尿蛋白含量，丹酚酸A(5、10mg/kg)也能够降低大鼠尿蛋白含量，其中10mg/kg与模型组比较有显著性区别；丹酚酸A联合泼尼松进一步降低大鼠尿蛋白含量，并且与泼尼松单独用药组比较，有统计学差异(表4)。
表4大鼠24h尿蛋白含量
与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01；与泼尼松组比较，&P<0.05
2血生化指标
静脉注射PAN后大鼠血清白蛋白和总蛋白含量显著降低，胆固醇、甘油三酯水平明显升高。丹酚酸A各剂量不同程度减轻白蛋白和总蛋白含量降低程度，降低胆固醇、甘油三酯水平，其中10mg/kg给药剂量效果相对较好。泼尼松也能够减轻血清蛋白降低程度，降低胆固醇水平，但是不能降低甘油三酯含量。丹酚酸A联合泼尼松进一步减轻血清蛋白降低程度，甘油三酯和胆固醇含量也明显降低，从整体上来看，联合用药作用比二者单独用药稍好(表5)。
表5血生化指标
与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
3肾脏功能
结果如表6所示，模型组大鼠血中尿素氮和肌酐含量显著升高，提示肾脏功能损伤。给药后，各组动物尿素氮和血肌酐不同程度降低，表明药物有一定程度的改善肾功能的作用。丹酚酸A联合泼尼松显著降低尿素氮和血肌酐水平，对尿素氮的影响比二者单独用药时明显。
表6尿素氮和血肌酐含量
与正常组比较，#P<0.05，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05
4血液流变学指标
与正常对照组比较，模型组大鼠全血粘度、血浆粘度和红细胞压积显著升高。不同剂量的丹酚酸A有效改善大鼠血液流变学参数，表现为显著降低大鼠全血粘度、血浆粘度，高剂量还能降低红细胞压积。泼尼松能明显降低大鼠低切变率全血粘度和血浆粘度，对其它参数没有明显影响，整体上来说，泼尼松对血液流变性的改善作用不如丹酚酸A，这可能与泼尼松本身对血液流变性没有直接作用有关，而是通过减轻肾损伤而减少血液中蛋白流失、改善脂质代谢，从而对血液粘度产生了一定的影响。丹酚酸A联合泼尼松也能显著降低大鼠全血粘度和血浆粘度(表7)。
表7血液流变学指标
与正常组比较，##P<0.01；与模型组比较，*P<0.05，**P<0.01
5光镜下肾组织病理变化
正常对照组大鼠肾脏没有明显的组织病理学变化。模型组大鼠肾组织病变明显，可见肾小管细胞肿胀、肾小管管腔大量蛋白渗出、肾间质灶性炎性细胞浸润，光镜下肾小球未见明显改变。经泼尼松和不同剂量的丹酚酸A治疗后，大鼠肾脏病变有所减轻，炎性细胞浸润和蛋白管型减少，少见或几乎没有肾小管细胞肿胀的情况，其中以泼尼松联合丹酚酸A效果最为明显(图11-16)。
6肾组织超微结构变化
采用透射电子显微镜观察肾脏超微结构的变化。如图17-22所示，正常组大鼠的肾小球和肾小管结构完整，未见明显损伤，足突清晰可见，无肿胀和萎缩。模型组大鼠的肾小球严重损伤，可见肾小球基础结构被破坏，足突大面积融合、裂孔间隙消失，肾小球基底膜轻微增厚。药物治疗后足突融合范围减小，仅局部融合，未见肾小球基底膜增厚的情况，丹酚酸A联合泼尼松进一步减轻足突融合程度。
7肾组织nephrin、desmin、Angptl4和TRPC6蛋白表达情况
Nephrin为裂孔膜的组成蛋白，在维持肾小球滤过功能中具有重要作用，足细胞损伤后，nephrin的表达和分布会发生变化。Desmin为足细胞损伤的标志性蛋白。如前文所述，TRPC6蛋白表达量升高可引起足细胞结构蛋白降解或重排，导致足细胞的损伤进而产生蛋白尿。足细胞Angptl4表达升高是微小病变肾病(MCD)的致病原因。结果如图23所示，与正常对照组比较，模型对照组大鼠肾组织nephrin表达水平下降，desmin、Angptl4和TRPC6表达升高，丹酚酸A和泼尼松能够上调nephrin蛋白表达，抑制desmin、Angptl4和TRPC6蛋白表达，丹酚酸A联合泼尼松进一步加强这种作用。提示丹酚酸A的肾脏保护作用机制可能与抑制Angptl4和TRPC6蛋白表达有关。
(三)结论
丹酚酸A能够减轻肾足细胞损伤，改善脂质代谢和血液流变性，表明丹酚酸A能够抑制嘌呤霉素氨基核苷诱导的肾病，其作用机制可能与维持nephrin的表达量，抑制Angptl4和TRPC6表达有关。同时，丹酚酸A联合泼尼松对肾脏的保护作用进一步加强，表明丹酚酸A对泼尼松的肾脏保护具有增效作用。
实施例4丹酚酸A对嘌呤霉素氨基核苷(PAN)损伤足细胞TRPC6表达的影响
细胞培养：未分化足细胞用含10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液，在33℃，5％CO2孵育箱内培养。自液氨罐取出足细胞后，立即投入37℃温水中摇动1～2min，使其融化，用吸管吸出细胞悬液，注入已加入新鲜培养液5m1的离心管，转速为1000r/min，离心4min，弃上清液，加入新鲜培养液吹散细胞，继而接种至涂有I型胶原的75cm2培养瓶，于33℃、含10-100U/ml重组小鼠γ-IFN许可条件下诱导增殖。增殖期间，每2天更换一次培养液，待其长至约85％，进行传代或分化培养。将传代细胞按1：10稀释接种到涂布I型胶原的培养瓶中，置于37℃无γ-IFN的非许可条件下培养10-14d诱导分化，细胞密度约5000-10000个/cm2，每2-4d更换一次培养液。通过间接免疫荧光确定细胞表达足细胞分化成熟特异性分子nephrin、podocin、Synatopodin。细胞分化10-14d成熟后使用。
足细胞存活率：实验前1天采用无血清RPMI-1640培养基使细胞同步，将细胞分为5组：对照组、PAN处理组、地塞米松干预组(1μM)、丹酚酸A干预组(16nM)、地塞米松+丹酚酸A干预组，同时加入PAN(50μg/ml)和干预药物。于37℃培养24h后每孔添加5mg/ml的MTT溶液(终浓度0.5mg/ml)，置于5％二氧化碳培养箱中继续培养4h后，弃去上清，甩干残留液体，加入DMSO100μl，振荡器上震荡，使充分溶解后立即在570nm和630nm下测定吸光值。最后计算细胞存活率。
PAN损伤足细胞TRPC6、desmin和nephrin蛋白表达情况：实验前1天采用无血清RPMI-1640培养基使细胞同步，将细胞分为5组：对照组、PAN处理组、地塞米松干预组(1μM)、丹酚酸A干预组(16nM)、地塞米松+丹酚酸A干预组，同时加入PAN(50μg/ml)和干预药物，处理24h后收集细胞，提取各组细胞总蛋白后采用westernblot法测细胞中TRPC6、nephrin和desmin表达。
(二)结果
1足细胞存活率
采用MTT法对细胞活力进行检测。PAN处理足细胞后，足细胞存活率下降为41％，丹酚酸A和地塞米松处理组细胞存活率分别为60％和68％，丹酚酸A联合地塞米松处理组为80％。可见丹酚酸A能够抑制PAN诱导的足细胞损伤，同时丹酚酸A能够增强地塞米松的保护作用。
2足细胞TRPC6、nephrin和desmin表达情况
结果如图24所示，在PAN作用于足细胞致其损伤后，足细胞损伤标志性蛋白desmin、TRPC6表达明显升高，nephrin表达降低，加入丹酚酸A和地塞米松干预后，能够抑制desmin和TRPC6表达，上调nephrin表达，地塞米松联合丹酚酸A进一步加强这种作用。
(三)结论
丹酚酸A能够抑制PAN诱导的小鼠足细胞损伤，并能够增强地塞米松的作用，其作用机制可能与抑制TRPC6表达，稳定nephrin表达有关。
实施例5丹酚酸A对TRPC6高表达的足细胞钙离子内流的影响
(一)方法
细胞培养：未分化足细胞用含10％FBS、100U/ml青霉素、100μg/ml链霉素的RPMI1640培养液，在33℃，5％CO2孵育箱内培养。自液氨罐取出足细胞后，立即投入37℃温水中摇动1～2min，使其融化，用吸管吸出细胞悬液，注入已加入新鲜培养液5m1的离心管，转速为1000r/min，离心4min，弃上清液，加入新鲜培养液吹散细胞，继而接种至涂有I型胶原的75cm2培养瓶，于33℃、含10-100U/ml重组小鼠γ-IFN许可条件下诱导增殖。增殖期间，每2天更换一次培养液，待其长至约85％，进行传代或分化培养。将传代细胞按1：10稀释接种到涂布I型胶原的培养瓶中，置于37℃无γ-IFN的非许可条件下培养10-14d诱导分化，细胞密度约5000-10000个/cm2，每2-4d更换一次培养液。通过间接免疫荧光确定细胞表达足细胞分化成熟特异性分子nephrin、podocin、synatopodin。细胞分化10-14d成熟后使用。
细胞转染：实验前一天将细胞接种于6孔板，接种浓度5×105个细胞，添加2mlRPMI-1640培养基，培养细胞至70％融合。按照说明书分别将pEGFP-N1-mTRPC质粒、pEGFP-N1空载体与脂质体Lipofectamine2000混合，静止20分钟后加入6孔板，以无血清的Opti-MEM培养液孵育6小时后改用含10％FBS的RPMI-1640培养基继续培养。48小时后通过荧光倒置显微镜观察足细胞中增强荧光蛋白的表达，随机取5个高倍视野，计算每个视野下GFP阳性细胞数占总细胞数的百分比，取其平均值作为转染效率，用Westernblot法检测TRPC6蛋白的表达，以验证转染效果。结果证明转染细胞TRPC6蛋白表达升高。
TRPC6高表达足细胞内钙离子浓度：分组：空白对照组、PAN处理组、地塞米松1μM、丹酚酸A16nM、地塞米松+丹酚酸A。按上述方法转染细胞48小时后，用D-Hanks溶液冲洗细胞3次，加入含Fluo3-AM(3μM)Hanks溶液1ml，37℃避光孵育25min。D-Hanks溶液冲洗3次后，按分组加入含药的培养液孵育10min后开始检测。以488nm为激发波长，于共聚焦显微镜下观察胞内Ca2+荧光强度变化10min，第3min末加入AngⅡ刺激，采集图像，间隔时间1.2s，胞内钙离子浓度以相对荧光强度(实际荧光强度/基础荧光强度)表示。
(二)结果
足细胞内钙离子浓度变化情况
结果如图25所示，PAN刺激足细胞后，可引起足细胞内Ca2+浓度短时间内一过性升高，与空白对照组比较，有显著性差异(P<0.01)。加入丹酚酸A和地塞米松处理后Ca2+上升幅度降低，有显著性差异(P<0.05)，丹酚酸A联合地塞米松组Ca2+上升幅度降低更为明显(P<0.01或P<0.05)。提示丹酚酸A可能通过抑制TRPC6功能从而抑制PAN刺激诱发的Ca2+内流。
(三)结论
丹酚酸A能够抑制PAN刺激诱发的TRPC6高表达足细胞内钙离子内流，与地塞米松联合使用作用进一步增强。
本发明的目的在于将丹酚酸A引入到肾病综合症的治疗中，公开了丹酚酸A或其可药用盐在多药联合治疗肾病综合症的应用，采用多药联合方式对激素抵抗型肾病综合症进行治疗，通过引入丹酚酸A，增强糖皮质激素协疗效，减少不良反应和药物抵抗的发生，有助于糖皮质激素在临床的合理应用，提高其治疗的有效性，减少激素毒性和激素抵抗；同时，本发明还明确了丹酚酸A的作用特点及其分子机制，为丹酚酸A治疗肾病综合症提供可靠依据，为研发新的治疗药物开辟新的途径，也为同类中药的开发奠定一定的基础。
最终，以上实施例和附图仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (9)

1.丹酚酸A或其可药用盐在制备抑制肾组织中NF-κB激活、增加足细胞蛋白podocin、nephrin表达药物中的应用。
2.丹酚酸A或其可药用盐在制备治疗肾病综合症药物中的应用。
3.丹酚酸A或其可药用盐在多药联合治疗肾病综合症的应用。
4.根据权利要求3所述的丹酚酸A或其可药用盐在多药联合治疗肾病综合症的应用，其特征在于：丹酚酸A或其可药用盐与糖皮质激素协同作用在治疗激素抵抗型肾病综合症的应用。
5.根据权利要求4所述的丹酚酸A或其可药用盐与糖皮质激素协同作用在治疗激素抵抗型肾病综合症的应用，其特征在于：丹酚酸A或其可药用盐与地塞米松联合使用，对糖皮质激素治疗嘌呤霉素氨基核苷诱导的肾病的应用。
6.根据权利要求4所述的丹酚酸A或其可药用盐与糖皮质激素协同作用在治疗激素抵抗型肾病综合症的应用，其特征在于：丹酚酸A或其可药用盐与糖皮质激素联合使用，抑制足细胞瞬时受体电位阳离子通道6的信号通路，降低足细胞血管生成素样蛋白4的表达水平，减少蛋白尿。
7.根据权利要求4所述的丹酚酸A或其可药用盐与糖皮质激素协同作用在治疗激素抵抗型肾病综合症的应用，其特征在于，采用丹酚酸A与糖皮质激素的用量范围比为：1:1-1:10。
8.根据上述权利要求任一所述的用途，其特征在于，所述的丹酚酸A由以下制备方法得到：以浓度为1.0％的丹参多酚酸盐溶液为原料，添加柠檬酸三钠调pH至6.0，于125℃、0.15MPa条件下转化4小时，冷却至室温后盐酸调pH至2.0-3.0，得到丹酚酸A溶液；将丹酚酸A溶液依次过HPD100树脂富集与纯化、CG161树脂分离与纯化、硅胶柱色谱精细纯化得到所需的丹酚酸A。
9.根据权利要求1-3中任一所述的用途，其特征在于：所述的肾病综合症是微小病变肾病、局灶性节段肾小球硬化症、膜性肾病、肾小球肾炎。
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