CN101347422A - 丹酚酸a在预防和\或治疗糖尿病及并发症中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了了丹酚酸A能够降低动物血糖，促进细胞葡萄糖吸收，改善糖尿病高血糖症，防治糖尿病心血管并发症，防治糖尿病肾病，防治糖尿病末梢循环障碍，防治糖尿病外周神经病变，以及降低血脂，降低哺乳动物体重，增加细胞能量物质ATP的产生从而促进伤口愈合和代谢功能。说明丹酚酸A能用于防治糖尿病高血糖症，糖尿病心血管并发症，糖尿病肾病，糖尿病末梢神经病变，末梢循环障碍(血管病、糖尿病性坏疽、足溃疡)，肥胖症，高脂血症，促进伤口愈合(各种创伤、烧伤、烫伤、皮肤糜烂、褥疮、植皮、放射所致的皮肤、粘膜损伤)。

Description

丹酚酸A在预防和\或治疗糖尿病及并发症中的应用

技术领域

本发明涉及丹酚酸A在制备防治糖尿病高血糖症，糖尿病心血管并发症，糖尿病肾病，糖尿病末梢神经病变，末梢循环障碍(血管病、糖尿病性坏疽、足溃疡)，肥胖症，高脂血症，促进伤口愈合(各种创伤、烧伤、烫伤、皮肤糜烂、褥疮、植皮、放射所致的皮肤、粘膜损伤)药物中的应用，属于医药技术领域。

背景技术

糖尿病是一种以血液中葡萄糖浓度增高为特征的代谢性疾病群。引起血糖增高的病理生理机制是胰岛素分泌缺陷及胰岛素作用缺陷。明显血糖增高时可出现多尿、多饮、体重减轻，有时尚可伴多食及视力模糊。糖尿病的急性酮症酸中毒及非酮症高渗综合征是可危及生命的并发症。糖尿病患者长期血糖增高可致各器官组织损害，引起功能不全以致功能衰竭。在糖尿病的慢性并发症中，主要表现为肾功能衰竭、周围神经病变引起活动障碍及足病变、自主神经病变(可出现胃肠道、泌尿生殖及心血管等系统的表现)，视网膜病变可导致视力丧失，糖尿病也可导致或促进脉粥样硬化性心血管、周围血管、脑血管病的发生和发展，而且与高血压、脂代谢异常密切相关。糖尿病导致患者的生活质量将降低，寿限将缩短，病死率增高。

丹参(Salvia miltiorrhiza Bge.)为唇形科鼠尾草属植物的干燥根。具有祛瘀止痛，活血通经，清心除烦之功效。丹参是一重要的传统中药，传统医学认为丹参有祛瘀止痛、活血通经、清心除烦的功效。近来对丹参的作用研究主要集中在改善心、肝、肺、脑等脏器的缺血再灌注损伤；对肝细胞的损伤；肝纤维化、肝硬变、肝癌的作用；调节免疫应答；抗感染和抗肿瘤等方面，而对丹参及其成分在防治糖尿病及其并发症方面，主要通过其活血化瘀作用，降低血粘度，改善血液循环，对糖尿病及其并发症的直接治疗作用尚没有报道。

丹参作为临床上常用的一种传统药物，其活性成分越来越引起医学研究者的重视，中国医学科学院药物研究所首先从丹参中发现了多种丹酚酸，其中丹酚酸A是重要的一种水溶性成分，其化学结构如下：

近年来研究发现，丹参中丹酚酸类成分的抗心肌缺血缺氧的活性比丹参素和原儿茶醛更强，其中丹酚酸A是目前已知的最强的抗氧化化合物之一，并且还具有改善记忆、抑制血小板聚集、降低抗癌药阿霉素毒性等作用。抗肝损伤、肝纤维化作用，防治动脉粥样硬化、保护心肌损伤作用、诱导细胞凋亡作用，抗肿瘤作用、改善记忆功能障碍、防治白内障、抑制血小板功能等作用。

发明内容

本发明要解决的技术问题是，提供一种新的药物。即丹酚酸A在制备预防和\或治疗糖尿病相关疾病药物中的应用。优选的糖尿病是2型糖尿病。所述的糖尿病相关疾病选自糖尿病高血糖症、糖尿病血管病变、糖尿病肾病、糖尿病末梢循环功能障碍、糖尿病外周神经病变、糖尿病合并高脂血症血脂。所述的末梢循环障碍包括血管病、糖尿病性坏疽、足溃疡。

丹酚酸A在制备预防和\或治疗高脂血症药物中的应用。

丹酚酸A在制备促进机体ATP生成药物中的应用。

丹酚酸A在制备促进伤口愈合的药物中的应用。所述的伤口的引起原因包括创伤、烧伤、烫伤、皮肤糜烂、褥疮、植皮、放射所致的皮肤、粘膜损伤。

丹酚酸A在制备预防和\或治疗肥胖症的药物中的应用。

丹酚酸A在制备降低正常哺乳动物体重的药物中的应用。

为了完成本发明之目的，可采用如下技术方案：

本发明的目的是通过以下方法实现的

1、丹酚酸A降糖、降低体重作用的研究

(1)检测丹酚酸A对正常小鼠血糖及体重的影响，结果显示丹酚酸A具有降低正常动物血糖及体重作用。

(2)检测丹酚酸A对糖尿病大鼠血糖的影响，结果显示丹酚酸A具有降低糖尿病大鼠血糖的作用。

(3)检测丹酚酸A对人Bel-7401细胞系葡萄糖吸收的影响，结果显示丹酚酸A能够促进细胞对葡萄糖的吸收和利用。

上述方法共同证明了丹酚酸A是具有降低正常和糖尿病大鼠血糖的作用，同时能够降低哺乳动物体重的药物。

2、丹酚酸A防治糖尿病慢性心血管并发症的研究

(1)检测丹酚酸A对糖尿病大鼠离体主动脉舒张和收缩反应性的影响。

(2)检测丹酚酸A糖尿病大鼠血管反应性(缺血组织充血程度和速度)的影响，反应糖尿病大鼠的内皮细胞功能。

3、丹酚酸A防治糖尿病性肾病的研究

(1)检测丹酚酸A对糖尿病大鼠尿液中NAG含量影响及干预作用

(2)检测丹酚酸A对糖尿病大鼠血肌酐、尿素氮含量的变化及干预作用

(3)检测丹酚酸A对糖尿病大鼠肾脏指数的变化的影响(肾脏重/体重)。

4、丹酚酸A防治糖尿病性慢性末梢循环障碍的研究

(1)采用激光多普勒检测丹酚酸A对糖尿病大鼠足底血流灌注量的变化及丹酚酸A的干预作用。

5、丹酚酸A防治糖尿病性慢性外周神经病变的研究

(1)检测丹酚酸A对糖尿病性大鼠痛域的变化及干预作用

(2)检测丹酚酸A对糖尿病大鼠神经肌肉信号传导速度的变化及干预作用

6、丹酚酸A促进细胞ATP生成的研究

(1)检测丹酚酸A促进细胞ATP生成作用。

(2)检测丹酚酸A对线粒体功能的促进作用。

7、丹酚酸A降血脂作用研究

(1)检测丹酚酸A降低高脂血症大鼠血脂水平的作用。

(2)检测丹酚酸A降低糖尿病合并高脂血症大鼠血脂水平的作用。

总而言之，本发明显示丹酚酸A可降低正常和糖尿病动物血糖，促进哺乳动物细胞对糖的吸收及利用，改善糖尿病性大血管病变、改善糖尿病性肾病、改善糖尿病性外周神经病变、改善糖尿病性末梢循环障碍，同时具有促进机体能量物质ATP的生成，并能够降低血脂、减轻哺乳动物体重的作用。

即丹酚酸A通过促进细胞对葡萄糖的摄取和利用，增加细胞ATP的生成，促进细胞糖的利用，降低动物血糖水平，适用于糖尿病性性高血糖症，慢性心血管并发症，糖尿病性肾病，糖尿病性外周神经障碍，糖尿病性末梢循环障碍，高脂血症及肥胖症的治疗。

本发明因此还涉及以本发明化合物作为活性成份的药物组合物。该药物组合物可根据本领域公知的方法制备。可通过将本发明化合物与一种或多种药学上可接受的固体或液体赋形剂和/或辅剂结合，制成适于人或动物使用的任何剂型。本发明化合物在其药物组合物中的含量通常为0.1-95重量％。

本发明化合物或含有它的药物组合物可以单位剂量形式给药，给药途径可为肠道或非肠道，如口服、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、鼻腔、口腔粘膜、眼、肺和呼吸道、皮肤、阴道、直肠等。

给药剂型可以是液体剂型、固体剂型或半固体剂型。液体剂型可以是溶液剂(包括真溶液和胶体溶液)、乳剂(包括o/w型、w/o型和复乳)、混悬剂、注射剂(包括水针剂、粉针剂和输液)、滴眼剂、滴鼻剂、洗剂和搽剂等；固体剂型可以是片剂(包括普通片、肠溶片、含片、分散片、咀嚼片、泡腾片、口腔崩解片)、胶囊剂(包括硬胶囊、软胶囊、肠溶胶囊)、颗粒剂、散剂、微丸、滴丸、栓剂、膜剂、贴片、气(粉)雾剂、喷雾剂等；半固体剂型可以是软膏剂、凝胶剂、糊剂等。

本发明化合物可以制成普通制剂、也制成是缓释制剂、控释制剂、靶向制剂及各种微粒给药系统。

为了将本发明化合物制成片剂，可以广泛使用本领域公知的各种赋形剂，包括稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、润滑剂、助流剂。稀释剂可以是淀粉、糊精、蔗糖、葡萄糖、乳糖、甘露醇、山梨醇、木糖醇、微晶纤维素、硫酸钙、磷酸氢钙、碳酸钙等；湿润剂可以是水、乙醇、异丙醇等；粘合剂可以是淀粉浆、糊精、糖浆、蜂蜜、葡萄糖溶液、微晶纤维素、阿拉伯胶浆、明胶浆、羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基纤维素、丙烯酸树脂、卡波姆、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等；崩解剂可以是干淀粉、微晶纤维素、低取代羟丙基纤维素、交联聚乙烯吡咯烷酮、交联羧甲基纤维素钠、羧甲基淀粉钠、碳酸氢钠与枸橼酸、聚氧乙烯山梨糖醇脂肪酸酯、十二烷基磺酸钠等；润滑剂和助流剂可以是滑石粉、二氧化硅、硬脂酸盐、酒石酸、液体石蜡、聚乙二醇等。

还可以将片剂进一步制成包衣片，例如糖包衣片、薄膜包衣片、肠溶包衣片，或双层片和多层片。

为了将给药单元制成胶囊剂，可以将有效成分本发明化合物与稀释剂、助流剂混合，将混合物直接置于硬胶囊或软胶囊中。也可将有效成分本发明化合物先与稀释剂、黏合剂、崩解剂制成颗粒或微丸，再置于硬胶囊或软胶囊中。用于制备本发明化合物片剂的各稀释剂、黏合剂、润湿剂、崩解剂、助流剂品种也可用于制备本发明化合物的胶囊剂。

为将本发明化合物制成注射剂，可以用水、乙醇、异丙醇、丙二醇或它们的混合物作溶剂并加入适量本领域常用的增溶剂、助溶剂、pH调剂剂、渗透压调节剂。增溶剂或助溶剂可以是泊洛沙姆、卵磷脂、羟丙基-β-环糊精等；pH调剂剂可以是磷酸盐、醋酸盐、盐酸、氢氧化钠等；渗透压调节剂可以是氯化钠、甘露醇、葡萄糖、磷酸盐、醋酸盐等。如制备冻干粉针剂，还可加入甘露醇、葡萄糖等作为支撑剂。

此外，如需要，也可以向药物制剂中添加着色剂、防腐剂、香料、矫味剂或其它添加剂。

为达到用药目的，增强治疗效果，本发明的药物或药物组合物可用任何公知的给药方法给药。

本发明化合物药物组合物的给药剂量依照所要预防或治疗疾病的性质和严重程度，患者或动物的个体情况，给药途径和剂型等可以有大范围的变化。一般来讲，本发明化合物的每天的合适剂量范围为0.001-150mg/Kg体重，优选为0.1-100mg/Kg体重，更优选为1-60mg/Kg体重，最优选为2-30mg/Kg体重。上述剂量可以一个剂量单位或分成几个剂量单位给药，这取决于医生的临床经验以及包括运用其它治疗手段的给药方案。

本发明的化合物或组合物可单独服用，或与其他治疗药物或对症药物合并使用。当本发明的化合物与其它治疗药物存在协同作用时，应根据实际情况调整它的剂量。

附图说明

定义：salA为丹酚酸A

图1.药物对正常小鼠体重的影响。Normal，正常对照组；Metformin，二甲双胍150mg/kg组；salA H，丹酚酸A 10mg/kg组；salAM，丹酚酸A 5mg/kg组，salA L，丹酚酸A1mg/kg组；weight：动物体重以(g)计。药物对正常小鼠体重的影响，其中以丹酚酸A 1mg/kg给药组作用最强，其作用稍强于二甲双胍150mg/kg给药组，而丹酚酸A高剂量组作用稍弱。

图2.：丹酚酸A对正常小鼠血糖的影响。Normal，正常对照组；Metformin，二甲双胍150mg/kg；salA H，丹酚酸A 10mg/kg；salA M，丹酚酸A 5mg/kg，salA L，丹酚酸A 1mg/kg。末次给药15h，禁食14h后血糖测定结果，丹酚酸A1mg/kg给药低剂量组对正常小鼠降糖作用持续的时间较为长久，其作用强于二甲双胍150mg/kg组，丹酚酸A其余剂量组降糖作用不明显。

图3：丹酚酸A对正常小鼠血糖的影响。禁食16h，给药2h后血糖测定结果，各给药组均有降低小鼠血糖的作用，其中以丹酚酸A(10mg/kg)高剂量组作用最强。

图4.：丹酚酸A对糖尿病大鼠正常进食，禁食8小时及OGTT血糖的影响。糖尿病大鼠模型组、正常组、丹酚酸高、低剂量组不同时间点血糖测定结果。

图5：丹酚酸A对Bel-7401细胞对培养基中葡萄糖消耗的影响。

图6：丹酚酸A对Bel-7401细胞葡萄糖吸收过程细胞数量的影响。

图7.糖尿病大鼠末梢循环舒张反应性的变化及丹酚酸A的干预作用。

图8.糖尿病大鼠尿NAG排除率与肌酐的比值变化及丹酚酸A的干预作用。

图9.糖尿病大鼠末梢循环血流灌注量的变化及丹酚酸A的干预作用。

图10.糖尿病大鼠坐骨神经肌肉传导速度的变化及丹酚酸A的改善作用。

图11.糖尿病大鼠足底痛域的变化及丹酚酸A的改善作用。

图12.SalA对hy926细胞ATP生成的影响。

图13.salA对乳鼠心肌细胞ATP生成的影响。

图14.salA对心、脑、肝中线粒体ATP生成的影响。

具体实施方式

一、丹酚酸A降低血糖作用

实施例1.丹酚酸A对正常小鼠血糖的影响

方法：将50只小鼠随机分为5组，体重17-20g，全营养饲料喂食，不限食水。正常对照组给予等体积生理盐水，阳性对照组给予二甲双胍150mg/kg，其余三组分别给予丹酚酸A水溶液10mg/kg，3mg/kg，1mg/kg。连续6天给药，第6天(禁食14h)断尾取血一次(20ul血液加入20ul生理盐水稀释后取上清)，然后给药，2h(禁食16h)后摘眼球取血，常规分离血清，按血糖测定试剂盒(己糖激酶法，中生北控生物科技股份有限公司)说明以测定小鼠血糖含量。

结果：二甲双胍和丹酚酸A给药组均能降低正常小鼠的体重，其中以丹酚酸A1mg/kg给药组作用最强，其作用稍强于二甲双胍150mg/kg给药组，而丹酚酸A高剂量组作用稍弱。【图1】

末次给药15h，禁食14h后血糖测定结果，丹酚酸A 1mg/kg低剂量给药组对正常小鼠降糖作用持续的时间较为长久，其作用强于二甲双胍150mg/kg组。【图2】禁食16h，给药2h后血糖测定结果显示，各给药组均有降低小鼠血糖的作用，其中以丹酚酸A(10mg/kg)高剂量组作用最强，其作用随剂量增加而增强。所有丹酚酸A组血糖降低水平均大于二甲双胍150mg/kg组。结果提示丹酚酸A的短时间降糖效果(2h)随剂量增加而增加，但是长时间的维持作用则以低剂量组为明显，提示丹酚酸A还存在其他作用机制。【图3】

实施例2.丹酚酸A对糖尿病大鼠血糖的影响

方法：SD大鼠腹腔注射链脲佐霉素30mg/kg，分两次注射，间隔时间为一周，然后采用罗氏血糖测定仪测血糖，血糖值高于11.5作为糖尿病大鼠进行实验。动物分组：正常组、模型组、丹酚酸A高剂量5mg/kg组、低剂量1mg/kg。每组7只。丹酚酸A腹腔注射，连续给药6天。期间喂正常全营养饮食。5天以后测定动物进食状态下血糖值，第6天禁食8h，测定基础血糖值作为零时血样，而后腹腔注射给药，于给药后60min各实验组灌胃葡萄糖2g/kg(2ml)，并于给葡萄糖后30、60、120min，180min断尾取血。4000rpm离心10min。常规分离血清，按血糖测定试剂盒(己糖激酶法，中生北控生物科技股份有限公司)说明以测定小鼠血糖含量。

结果：丹酚酸A 1mg/kg能降低正常进食和空腹糖尿病大鼠血糖值，同时也能降低OGTT90min血糖值；丹酚酸A 5mg/kg能降低OGTT90min时血糖，上述结果具有统计学差异(p＜0.05)。1mg/kg剂量其余时间点也有降低血糖作用，但统计学差异不明显。【图4】

实施例3.丹酚酸A对人肝癌细胞系Bel-7401葡萄糖吸收的影响

方法：Bel-7401细胞常规10％FBS 1640培养。胰酶消化，3×10³细胞/孔常规种在96孔细胞培养板中，16h后细胞贴壁完全后，换用不同浓度丹酚酸A(终浓度10^-5M-10^-9M)的无酚红无血清1640培养基，胰岛素(终浓度0.04U/ml)对照组处理相同。72h后测定上清液中葡萄糖浓度，同时SRB法检测细胞含量。

加入药物72h后检测上清液中葡萄糖含量，SRB法检测细胞的量，

结果：salA10^-6M-10^-8M剂量组均可促进人肝癌细胞系Bel-7401细胞对葡萄糖的吸收，其中salA10^-6M组促进葡萄糖吸收作用大于终浓度0.04U/ml胰岛素。因为salA 10^-5 M组对细胞具有损伤作用，促吸收作用不明显。【图5】【图6】

二、丹酚酸A对糖尿病大鼠血管并发症的干预作用

实施例4.(1)糖尿病大鼠主动脉收缩与舒张反应性的变化及丹酚酸A的干预作用

方法：SD大鼠适应性喂养1周后，从中随机抽取12只作为正常对照组(NC组)，其余作为糖尿病组(DM组)。正常对照组喂养标准大鼠饲料，糖尿病组喂养高糖高脂饲料。喂养4周后糖尿病组空腹18-24小时腹腔注射小剂量链霉佐菌素(STZ)30mg/kg(用前以PH4.4的0.1mol/L柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液配成0.75％的浓度)，正常对照组仅注射柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液。1周后再测血糖。根据血糖水平，可以再继续注射2-3次，每次间隔1周。选择空腹血糖大于10mmol/L糖尿病大鼠，随机分为糖尿病对照组(DC组)、糖尿病二甲双胍治疗组(150mg/kg)，糖尿病卡托普利治疗组(20mg/kg)，丹酚酸A治疗组(分高10mg/kg、中3mg/kg、低剂量组1mg/kg)。药物溶于蒸馏水中灌胃，每日一次。连续给药3个月。

末次给药后动物禁食8-12h，处死，取近端胸主动脉切成3mm宽的环，挂于含K-H缓冲液(NaCl113.8mmol/L，NaHCO3 20mmol/L，KCl 4.7mmol/L，KH2PO41.2mmol/L，CaCl2 2.5mmol/L，glucose 5.5mmol/L，pH为7.4)浴槽中的三角环内，控制基础张力1.2克，稳定约40分钟，保持37℃，缓冲液通以95％O2+5％CO2混合气体，期间每20分钟换一次K-H缓冲液。稳定1h后，给予2次60mMKCl收缩，加入去甲肾上腺素，终浓度为1×10-6mol/L，观察收缩效应。然后加入乙酰胆碱终浓度为10-5mol/L，观察舒张效应。

表1糖尿病大鼠主动脉收缩与舒张反应性的变化及丹酚酸A的干预作用

N＝10，平均值±SD采用LSD one-way ANOVA进行统计学分析。^＊P＜0.051.^＊＊P＜0.01.结果可见，糖尿病模型动物在造模3月左右对KCl，去甲肾上腺素的收缩反应性减弱，对乙酰胆碱的舒张反应性也减弱，而丹酚酸A低中剂量组对此反应具有改善作用，其中丹酚酸A中剂量组对乙酰胆碱的舒张反应性的改善具有统计学意义。

实施例5.阻断后反应性充血

方法：糖尿病大鼠造模和具体分组方法见实施例4，采用弹力带将大鼠后肢扎紧，将激光多普勒血流检测仪(PFLDPM单元，瑞典PERIMED公司)激光探头放置在大鼠脚掌部位，待血流灌注量降低到0值时，持续3-5min，然后突然剪断弹力带，观察血流灌注量到达峰值时斜率、与基线的百分比变化、上升时间、斜率和到达峰值额度时间。结果如【图7】结果显示丹酚酸A对血管内皮细胞的功能具有保护作用，可改善阻断后反应性充血。

三、丹酚酸A防治糖尿病性肾病的研究

实施例6.丹酚酸A对糖尿病大鼠尿液中NAG/肌酐的影响

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAG)广泛存在于各种组织器官、体液、红细胞、白细胞及血小板中，是溶酶体中的一种酸性水解酶。NAG是肾小管损伤的标记物，尿NAG活性升高是肾脏损害的敏感性指标。NAG活性可用于肾小管间质性肾炎、尿路感染、糖尿病肾病综合症、高血压肾病、肾移植后的排异反应和肾病综合症的早期诊断。NAG活性的升高均早于其他相应指标，有利于疾病的早期发现和及时治疗。本测定方法的原理是底物在NAG作用下水解，释放出游离的对硝基酚。加入碱性溶液停止反应，并使对硝基酚显色。在400nm处测吸光度，可计算酶活力单位。肌酐采用碱性苦味酸测定法，测定时尿液50倍稀释。糖尿病大鼠造模和分组方法见实施例4，NAG，肌酐测试试剂盒均购自南京建成生物技术研究所，结果如【图8】与模型组相比，丹酚酸A及卡托普利组均能降低尿中NAG的量，其中丹酚酸A低剂量组(1mg/kg)具有统计学意义。

实施例7.，丹酚酸A糖尿病大鼠血清中肌酐、尿素氮含量的影响

糖尿病大鼠造模，分组及给药方法参见实施例4，肌酐，尿素氮试剂盒购自南京建成生物技术研究所。

表2丹酚酸A糖尿病大鼠血清中肌酐、尿素氮含量的影响

N＝10，平均值±SD采用LSD one-wayANOVA进行统计学分析。^＊P＜0.051.^＊＊P＜0.01.

结果可见丹酚酸A可降低慢性糖尿病大鼠血肌酐水平，对糖尿病肾病可能具有保护作用。

四、丹酚酸A防治糖尿病性慢性末梢循环障碍的研究

实施例8.丹酚酸A防治糖尿病性慢性末梢循环障碍的研究

方法：糖尿病大鼠造模，分组及给药方法参见实施例4，糖尿病大鼠给药第80天，乌拉坦麻醉，采用激光多普勒血流检测仪(PFLDPM单元，瑞典PERIMED公司)检测大鼠足底部血流的变化。结果可见，丹酚酸A各组均对糖尿病大鼠末梢循环的血流具有改善作用。【图9】

五、丹酚酸A防治糖尿病性慢性外周神经病变的研究

实施例9.(1)糖尿病大鼠坐骨神经-肌肉传导速度的变化及丹酚酸A的干预作用

方法：糖尿病大鼠造模，分组及给药方法参见实施例4，糖尿病大鼠给药第80天时，各组动物乌拉坦腹腔麻醉，俯卧固定。刺激电极为双针电极，75％酒精消毒后插入坐骨神经窝处坐骨神经干附近，记录电极为双针电极，75％酒精消毒后插入腓肠肌肌腹，两电极相距约30毫米(mm)。设备采用BL-420E⁺型生物机能实验系统，刺激信号选择1毫伏(mv)，0.015毫秒(ms)，单刺激，扫描速度为0.01秒(s)，10kHz滤波，诱导信号放大50倍，计算神经肌肉动作电位潜伏期，传导速度计算公式为：MNCV＝刺激电极到记录电极的距离(m)/潜伏期(ms)如图【10】

实施例10.糖尿病大鼠足底痛域感觉的变化及丹酚酸A的干预作用

方法：糖尿病大鼠造模，分组及给药方法参见实施例4，给药第60天，将大鼠足底部一固定部位置于光电痛域检测器检测孔处，固定刺激强度，给予热刺激，观察大鼠足部移开的时间。结果如下；丹酚酸A对糖尿病性大鼠的痛觉神经功能具有改善作用，提高痛觉灵敏性。【图11】

六、丹酚酸A促进细胞ATP生成的研究

实施例11.丹酚酸A对培养细胞ATP生成的影响

1)salA对乳鼠心肌细胞ATP生成作用的测定：SD大鼠乳鼠心肌细胞P1代，(低糖DMEM/F12培养基，20％FBS培养)细胞种植24小时后，去血清，无血清低糖DMEM培养基洗一遍，再加入不同浓度的salA与细胞孵育2h，、ATP酶检测。

2)salA对人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞ATP生成作用的测定：hy926细胞，低糖DMEM培养15％FBS。接种到2块96孔板中。细胞统一弃上清，无血清低糖DMEM洗一遍，再加入无血清低糖DMEM配制的salA至终浓度，分别作用相应时间，ATP酶法检测ATP含量。

3)salA对主动脉平滑肌细胞和成纤维细胞ATP生成作用的测定：低糖DMEM培养15％FBS。接种到96孔板中。细胞统一弃上清，无血清低糖DMEM洗一遍，再加入无血清低糖DMEM配制的salA至终浓度，分别作用相应时间，ATP酶法检测ATP含量。

ATP检测方法：CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay，美国Promega公司，该方法是基于萤光细胞活性检测的方法，是根据定量测定所存在的ATP数量来确定培养物中活性细胞数目的一种均质的高灵敏方法。

实验发现，丹酚酸A可促进多种细胞ATP的生成。包括乳鼠心肌细胞、人脐静脉内皮细胞系EA.hy926细胞、大鼠主动脉成纤维细胞、大鼠主动脉平滑肌细胞、人肝癌细胞系Bel-7401细胞等。

结果可见，salA10^-5M-10^-11M 10min即可明显增加EA.hy926细胞内ATP的产生，作用至12小时减弱。5min时则作用不明显。SalA增加ATP产生的作用与浓度成正比。【图12】

SalA10^-5M-10^-9M呈浓度依赖性增加SD乳鼠心肌细胞的产生，其中10-5M-10-7M在实验中具有统计学差异。【图13】

SalA对主动脉平滑肌细胞和成纤维细胞ATP生成作用的测定，salA10^-5M-10^-6MsalA对细胞\ATP生成作用最明显。图略。

实施例12.丹酚酸A促进心、肝、脑线粒体功能的研究

方法：常规提取250g正常SD大鼠心肌、肝脏、大脑线粒体，与线粒体底物，ADP。加入等体积CellTiter-GloTM Luminescent Cell Viability Assay共同孵育10min，检测ATP生成的速度，结果可见。丹酚酸A可促进线粒体ATP的产生。【图14】

七、丹酚酸A降血脂作用研究

实施例13.检测丹酚酸A降低高脂血症大鼠血脂水平的作用。

实验方法：雄性SD大鼠60只，随机分为六组，每组12只。空白对照组、高脂血症模型组、辛伐他汀(Simvastatin，3.5mg/kg)对照组、血脂康(Xuezhikang)对照组、受试药品高、中、低剂量组。除空白对照组大鼠喂养普通饲料以外，其它各组大鼠都给予高脂饲料喂养30天。辛伐他汀对照组、血脂康对照组灌胃口服，丹酚酸A各给药组腹腔注射，连续给药15天时，麻醉大鼠，眼眶取血，静置，离心(4000转/分)10min，取出血清，放于-40℃冰箱备用。严格按照试剂盒说明书进行检测，测定血清中CHO、TG、LDL-C、HDL-C的含量，以便观察受试药品在高脂饲料致大鼠高脂血症模型的降血脂作用。总胆固醇试剂盒，甘油三酯试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇试剂盒均购自北京北化康泰临床试剂有限公司。

表3：药物对血脂的影响，给药15d后结果，单位：mg/dl

N＝12，平均值±SD采用LSD one-wayANOVA进行统计学分析。^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01.

结果可见，丹酚酸A高中低剂量组均可降低血清中胆固醇、低密度脂蛋白含量，提高高密度脂蛋白胆固醇的水平。也具有降低血清中甘油三酯水平的趋势。

实施例14.检测丹酚酸A降低糖尿病合并高脂血症大鼠血脂水平的作用。

方法：SD大鼠适应性喂养1周后，从中随机抽取12只作为正常对照组(NC组)，其余作为糖尿病组(DM组)。正常对照组喂养标准大鼠饲料，糖尿病组喂养高糖高脂饲料。喂养4周后糖尿病组空腹18-24小时腹腔注射小剂量链脉佐菌素(STZ)30mg/kg。1周后再测血糖。选择空腹血糖大于10mmol/L糖尿病大鼠模型。把糖尿病大鼠随机分为糖尿病对照组(DC组)、糖尿病二甲双胍治疗组(150mg/kg)，糖尿病卡托普利治疗组(20mg/kg)，丹酚酸A治疗组(分高10mg/kg、中3mg/kg、低剂量组1mg/kg)。药物溶于蒸馏水中灌胃，每日一次。连续给药3个月，给药期间给予高脂饮食，80天后股动脉取血离心取血清，-20℃储存备检。总胆固醇试剂盒，甘油三酯试剂盒、高密度脂蛋白胆固醇试剂盒、低密度脂蛋白胆固醇试剂盒均购自北京北化康泰临床试剂有限公司。

表4糖尿病合并高脂血症大鼠血脂水平变化及丹酚酸A的干预作用

N＝10，平均值±SD采用LSD one-wayANOVA进行统计学分析。^＊P＜0.05，^＊＊P＜0.01.

Claims (10)

1.丹酚酸A在制备预防和\或治疗糖尿病相关疾病药物中的应用。

2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的糖尿病是2型糖尿病。

3.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述的糖尿病相关疾病选自糖尿病高血糖症、糖尿病血管病变、糖尿病肾病、糖尿病末梢循环功能障碍、糖尿病外周神经病变、糖尿病合并高脂血症血脂。

4.根据权利要求3的应用，所述的末梢循环障碍包括血管病、糖尿病性坏疽、足溃疡。

5.丹酚酸A在制备预防和\或治疗高脂血症药物中的应用。

6.丹酚酸A在制备促进机体ATP生成药物中的应用。

7.丹酚酸A在制备促进伤口愈合的药物中的应用。

8.根据权利要求3的应用，所述的伤口的引起原因选自创伤、烧伤、烫伤、皮肤糜烂、褥疮、植皮、放射所致的皮肤、粘膜损伤。

9.丹酚酸A在制备预防和\或治疗肥胖症或降低正常哺乳动物体重的药物中的应用。

10.一种药物组合物，其特征在于，含有药物有效剂量的丹酚酸A，及药用载体。

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