CN106198996A - 微小病变型肾病的早期诊断生物标记物、试剂盒及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种微小病变型肾病的早期诊断的生物标记物STMN1蛋白、含有抗STMN1蛋白抗体的试剂盒及其应用。STMN1在早期无光镜结构变化的肾小球损伤中高表达，STMN1蛋白和基因表达量在损伤的肾小球足细胞中也比未损伤的细胞中明显升高，STMN1蛋白可用于在显微镜下没有明显结构变化的微小病变型肾病的早期诊断。利用本发明的试剂盒，免疫组织化学染色后，STMN1蛋白阳性细胞染成褐色，可以在光学显微镜下观察得到。该方法操作简单准确，对样品的要求不高，可用于大规模筛查或追溯性研究。

Description

微小病变型肾病的早期诊断生物标记物、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术与医学领域，具体涉及一种微小病变型肾病的早期诊断的生物标记物、试剂盒及其应用。

背景技术

微小病变型肾病(minimal change nephropathy，MCD)是以大量蛋白尿、低蛋白血症、水肿，高脂血症为基本特征的肾病综合征的多种类型之一。好发于儿童，占儿童原发性肾病综合征的80％左右，占成人原发性肾病综合征的5％-10％。微小病变型肾病对糖皮质激素的治疗敏感，但极易复发，易转变为激素耐药或激素依赖，临床治疗较为棘手。并且该病强调个体化治疗，即针对不同个体及同一个体的不同病程的病理改变来调整治疗方案。因此，对微小病变型肾病的正确的早期诊断尤为重要。微小病变型肾病在光镜下肾小球无明显病变，免疫荧光阴性，只有通过电镜下特征性改变，即广泛的肾小球脏层上皮细胞足突融合来进行确诊。而电镜学技术检查费用高、诊断用时长，目前国内医疗机构尚未广泛普及。该病的特点决定了病理诊断的困难，从而容易错过患者的最佳治疗时机。同时，在出现激素耐药或激素依赖时，则应及时注意病理类型的改变。因此，一种可以在早期有效并且简易的诊断微小病变型肾病的方法的出现，对患者至关重要。

另一方面，在肾小球疾病的不同病理类型中，除膜性肾病(membranousnephropathy，MN)和微小病变型肾病这两者，多数在光镜下可见肾小球结构的异常变化。临床膜性肾病可以通过免疫荧光技术来进行诊断，但免疫荧光显微镜相对普通显微镜昂贵。如果能够通过免疫组织化学染色在普通光镜下即可观察到该病的特征性病变，不仅有助于对两种疾病的鉴别，也有助于进一步快速的确定膜性肾病的诊断，从而为临床医生制定针对性的治疗方案提供可靠的依据。

发明内容

鉴于上述现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种微小病变型肾病的早期病变有密切的关系并能够独立用于检测微小病变型肾病早期病变的生物标记物，并将其应用于制造微小病变型肾病的早期诊断试剂盒。

本发明目的是通过如下技术方案来实现的。

一种微小病变型肾病的早期诊断生物标记物，所述生物标记物为STMN1蛋白。

本发明还提供所述的生物标记物在制造用于微小病变型肾病的早期诊断的试剂盒中的应用，其包括以下步骤：

(1)准备取自受试者的待测样品和对照品；

(2)对步骤(1)的待测样品和对照品中的STMN1蛋白进行定量测定，得到样品值和对照值；

(3)将步骤(2)中得到的所述样品值和所述对照组进行比较，所述样品值高于所述对照值，则判断所述受试者伴有微小病变型肾病。

进一步地，所述的受试者的待测样品取自患有肾小球损伤患者的肾组织，所述对照品取自肾切除术患者的正常肾组织。

进一步地，在步骤(2)中使用免疫组织化学染色法对所述STMN1蛋白进行定量测定。免疫组织化学染色法的检测结果根据STMN1蛋白阳性细胞的染色强度和所述阳性细胞占所有同类细胞的百分比中和判断。本发明中根据对于STMN1蛋白的免疫组织化学染色的定性结果，也可以判断受试者是否为伴有微小病变型肾病患者。

上述所述的待测样品和对照品可以为任何类型的离体肾组织或细胞样本，包括新鲜采集的肾穿刺活检组织、福尔马林固定石蜡包埋的肾组织、OCT包埋的冷冻肾组织，液氮保存的新鲜无固定肾组织等。无论应用于哪种类型的生物样本，本领域的技术人员可以根据现有技术信息确定样品的前处理方法，使处理后的样品适用于利用免疫组织化学染色法对所述STMN1蛋白进行定性和定量测定。

本发明所述的试剂盒，包括抗STMN1抗体。抗STMN1抗体只要对STMN1蛋白具有特异的结合性，则其种类或来源等没有特别限制。另外，可以是多克隆抗体，也可以是单克隆抗体。

进一步地，所述试剂盒还包括封闭待测样品组织的封闭液、与STMN1抗体特异性结合的生物标记二抗、与生物标记二抗进行显色反应的显色剂。为了检测直接、简便、高灵敏度的目的，优先使用利用结合有标记物的二次抗体的方法、利用二次抗体与标记物质结合而成的聚合物的方法等间接的检测方法。

此处的二次抗体是指对抗STMN1抗体具有特异性结合的抗体。二次抗体可以使用来源于兔、山羊、小鼠等的市售的具有标记物的二次抗体。

进一步地，所述封闭液含有5wt％山羊血清、1wt％BSA、0.01wt％聚乙二醇辛基苯基醚和pH7.4的磷酸缓冲液，所述生物标记二抗为生物素化二抗，所述显色剂含有辣根酶标记链霉卵白素和DAB显色试剂。

进一步地，所述试剂盒还包括作为复染剂的苏木精染色液。

进一步地，所述试剂盒还包括由0.01M柠檬酸盐缓冲液和磷酸缓冲液组成的抗原修复系统，以及由3％过氧化氢和磷酸缓冲液组成的消除内源性过氧化物酶系统。

本发明中，对动物肾小球病变的研究结果显示，STMN1在早期无光镜结构变化的肾小球损伤中高表达，经western blotting和qPCR进一步证实，STMN1的蛋白和基因表达量在损伤的肾小球足细胞中也比未损伤的细胞中明显升高。结合此结果，利用我国正常和常见三种肾小球病变的病人标本，包括MN，MCD，局灶节段性肾小球硬化(FSGS)，采用简单易行的免疫组织化学方法，定性地确认了STMN1在微小病变型肾病早期诊断的生物标记作用。目前还没有Stathmin 1(STMN1)蛋白与微小病变型肾病的关联性的报道。

本发明采用利用所述试剂盒，对于取自受试者的待测样品和对照品进行免疫组织化学染色，测定待测样品和对照品中的STMN1蛋白的表达。免疫组织化学染色后，STMN1蛋白阳性细胞染成褐色，可以在光学显微镜下观察得到。根据样品染色情况判定肾组织的疾病诊断：肾小球足细胞的细胞核及细胞体呈褐色阳性反应可诊断为微小病变型肾病。该方法操作简单准确，对样品的要求不高，可用于大规模筛查或追溯性研究。这些方法可以应用于多种样本，冰冻组织、石蜡包埋组织、新鲜离体组织等，可提供多层次的检测信息，可为微小病变型肾病等肾小球性疾病的研究提供支持，也为临床诊断和指导用药提供可依赖的检测指标。从而使患者得到更加充分、有效的治疗，最终达到改善疾病预后的目的。

附图说明

图1表示STMN1在阿霉素肾病模型大鼠肾组织中的表达情况；

图2表示STMN1在微小病变肾病临床病人肾组织中的表达情况；

图3表示STMN1在不同类型的肾小球损伤疾病患者的肾组织中的表达对比情况。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的应用范围。下面实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规条件所述条件，或按照产品说明书上所提供的条件。下面实施例中所用的材料、试剂等如无特殊说明，均可从商业途径得到。

1.待测样品和对照品：

(1)来自实验动物的待测样品和对照品：

按照文献(Okuda S.等，Kidney international，1986；29(2):502-510)所述的方法，将大鼠(雄性Sprague-Dawley大鼠6～8周，购自从大连医科大学实验动物中心)，给予两次尾静脉注射阿霉素(4.0毫克/公斤和2.5毫克/公斤)，得到大鼠阿霉素肾病大鼠模型，取肾组织，作为肾小球肾病组(待测样品)。对照品来自两次尾静脉注射同样计量的生理盐水的大鼠肾组织。

(2)来自病人的待测样品和对照品：

取自常见三种肾小球病变的病人的肾组织作为待测样品，所述常见三种肾小球病变为微小病变型肾病(MCD)，膜性肾病(MN)和局灶节段性肾小球硬化(FSGS)。取自肾切除术患者的正常肾组织作为对照品。

2.采用含有抗STMN1抗体的试剂盒，对于取自受试者的待测样品和对照品进行免疫组织化学染色，测定待测样品和对照品中的STMN1蛋白的表达。免疫组织化学染色后，STMN1蛋白阳性细胞染成褐色，可以在光学显微镜下观察得到。根据样品染色情况判定肾组织的疾病诊断：肾小球足细胞的细胞核及细胞体呈褐色阳性反应可诊断为微小病变型肾病。

(1)含有抗STMN1抗体的试剂盒，包括封闭待测样品组织的封闭液、与STMN1抗体特异性结合的生物标记二抗、与生物标记二抗进行显色反应的显色剂。优先地，所述封闭液含有5wt％山羊血清、1wt％BSA、0.01wt％聚乙二醇辛基苯基醚和pH7.4的磷酸缓冲液，所述生物标记二抗为生物素化二抗，所述显色剂含有辣根酶标记链霉卵白素和DAB显色试剂。

所述试剂盒还可以包括作为复染剂的苏木精染色液。

所述试剂盒还可以包括由0.01M柠檬酸盐缓冲液和磷酸缓冲液组成的抗原修复系统，以及由3％过氧化氢和磷酸缓冲液组成的消除内源性过氧化物酶系统。所述试剂盒可针对性地适用于石蜡包埋的肾组织样本。

3.免疫组织化学染色及判断标准

采用本发明试剂盒对待测样品和对照品进行免疫组织化学染色，根据染色结果进行微小病变型肾病的早期诊断，包括如下步骤：

①封闭：在待处理样品的组织上加200μl封闭液，室温孵育60分钟；

②抗原抗体反应：

(1)一抗孵育：在组织上加150μl按照1:100比例稀释的STMN1抗体，以封口膜覆盖组织，于4℃孵育过夜，然后以PBS清洗3次，每次10分钟；

设阴性对照组，用同体积封闭液代替STMN1抗体。

(2)二抗孵育：在组织上加150μl生物素化二抗工作液，室温孵育60分钟，PBS清洗3次，每次10分钟；

③在组织上滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液(S-A/HRP)，室温孵育60分钟，PBS清洗3次，每次10分钟；

④DAB显色(采用市售的DAB染色液)：

(1)制备底物混合液：在1ml pH值＝7.0的双蒸水中，加入一滴试剂A，混合均匀后，将试剂B和试剂C各一滴加入其中，混合均匀得底物混合液；

(2)显色：将150μl底物混合液滴加在组织上，室温显色3～10分钟，充分显色后自来水冲洗终止反应；

⑤染色、脱水、透明、封片：将组织切片浸入苏木精染色液2次，每次2秒；然后用蒸馏水处理3次，每次5分钟；再依次以50％乙醇、70％乙醇、90％乙醇各处理1次，每次1分钟；再以无水乙醇处理2次，每次2分钟，二甲苯与无水乙醇1:1混合物处理1次，2分钟，100％二甲苯处理2次，每次2分钟；最后用树胶封片，保存；

⑥根据样品染色情况判定肾组织的疾病诊断：肾小球足细胞的细胞核及细胞体呈褐色阳性反应可诊断为微小病变型肾病。

上述本发明的对肾组织进行微小病变型肾病的早期诊断的方法理论上适用于任何类型的离体肿瘤组织或细胞样本，包括新鲜采集的肾穿刺活检组织、福尔马林固定石蜡包埋肾组织、OCT包埋的冷冻肾组织，液氮保存的新鲜无固定肾组织等。无论应用于哪种类型的生物样本，本领域的技术人员可以根据现有技术信息确定样品的前处理方法，已使处理后的样品适用于本发明所述及的免疫组化检测。对于几种典型的样本及其处理方法分别是：

(1)所述早期诊断微小病变型肾病的方法应用于福尔马林固定石蜡包埋肾组织时，对样品的预处理包括如下步骤：

a.脱蜡：福尔马林固定石蜡包埋肾组织常规切片，厚度4～5μm的石蜡组织切片依次经过100％二甲苯脱蜡3次，每次5分钟；无水乙醇脱蜡3次，每次2分钟；95％乙醇、90％乙醇、70％乙醇、50％乙醇各脱蜡1次，2分钟；

b.抗原修复：以0.01M柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，然后以PBS清洗3次，每次5分钟；

c.消除内源性过氧化物酶：将组织切片置于3％过氧化氢中，室温孵育30分钟，用PBS清洗3次，每次5分钟。

处理所得样品直接用于检测。

(2)所述早期诊断微小病变型肾病的方法应用于OCT包埋的冷冻保存的肾组织时，对样品的预处理包括如下步骤：

a.组织固定：将患者肾穿刺活检组织约2x2cm³立即置入4％多聚甲醛中，4℃，固定24小时；

b.PBS清洗3次，每次10分钟；

c.将组织浸入30％蔗糖，4℃过夜；

d.OCT混合物(opti-mum cutting temperature compound)包埋，放置在干冰上；

e.待OCT混合物凝固后，恒冷箱冰冻切片7～10μm；

(3)所述早期诊断微小病变型肾病的方法的应用于液氮保存的新鲜无固定肾组织时，对样品的预处理包括如下步骤：

a.将患者肾穿刺活检的新鲜肾组织迅速置入液氮中，待用；

b.用时首先将组织浸入4％多聚甲醛中，4℃，固定24小时；

根据用户所具有的实验室设备，可行上述两种方法中的任何一种：即石蜡包埋或OCT包埋过程后，处理所得样品直接用于检测。

实施例1 STMN1在早期无光镜结构变化的肾小球损伤中高表达

早期无光镜结构变化的肾小球损伤待测样品准备：

注射阿霉素获得的阿霉素肾病模型大鼠，断头处死，剖开腹腔，取出一部分肾组织，生理盐水冲洗，并将其切成小块，经福尔马林等固定液固定后，石蜡包埋，制备得到福尔马林固定石蜡包埋肾组织，作为病变组。代替阿霉素注射生理盐水的大鼠，处死，取出肾组织，与病变组同样的方法处理，得到福尔马林固定石蜡包埋肾组织，作为对照组。

将准备得到的病变组和对照组的石蜡包埋肾组织，上切片机切片，得到5μm厚度的石蜡组织切片，用于苏木精-伊红染色(HE染色)以及免疫组织化学染色，在光学显微镜下观察染色结果。

图1A为HE染色结果，图1A中可见，相对于对照组，病变组的肾小球在结构上无明显的变化。

图1B为STMN1免疫组织化学染色结果，图1B中可见，相对于对照组，STMN1在病变组的肾小球足细胞中高表达，在对照组的肾小球内的足细胞中几乎不表达STMN1，但在肾小球损伤的模型中，大部分肾小球足细胞高表达STMN1(在图中部分STMN1阳性细胞用箭头表示)。

图1C为电镜下观察得到的病变组和对照组的EPON812树脂包埋肾组织切片，图1C中可见，相对于对照组，病变组的足细胞损伤，可见突起融合基膜增厚(用箭头表示)。

在上述STMN1定性表达的研究基础上，为了进一步确认STMN1在肾小球损伤肾组织中的定量表达，将阿霉素肾病模型大鼠的肾组织和正常肾组织(对照组)中，提取总蛋白，采用Westen Blotting法测定STMN1蛋白的表达情况；同时提取总RNA，采用定量PCR方法检测STMN1基因的表达情况。Westen Blotting结果如图1D，定量PCR结果如图1E，可见STMN1的蛋白和基因表达量在损伤的肾小球足细胞中比未损伤的细胞中明显升高。

结果表明：STMN1可以作为一个生物标记物，对动物模拟的肾小球损伤进行早期诊断。即便损伤是在常规光镜尚无任何迹象，仅在80万倍放大的电镜下，方可观察到的定性变化。综合上述定性与定量结果分析，STMN1可以作为一个用于微小病变肾病早期诊断的生物标志物。

实施例2 STMN1在微小病变肾病中的表达

图2表示STMN1在微小病变肾病中的表达。

微小病变肾病病人待测样品准备：微小病变肾病病人的临床肾穿标本，经福尔马林等固定液固定后，石蜡包埋，制备得到福尔马林固定石蜡包埋肾组织，作为病变组。肾切除术患者的正常肾组织同样的方法处理，得到福尔马林固定石蜡包埋肾组织，作为对照组。

将准备得到的病变组和对照组的石蜡包埋肾组织，上切片机切片，得到5μm厚度的石蜡组织切片，用于免疫组织化学染色，在光学显微镜下观察染色结果。

结果显示：相对于对照组，病变组的肾小球在光镜观察时结构上无明显的变化。但与对照组相比，STMN1在微小病变肾病标本组的肾小球中表达明显增高，其阳性褐色表达主要分布在足细胞的细胞核与细胞体(在放大图中部分STMN1阳性细胞用箭头表示)。而对照组中的肾小球足细胞显示STMN1阴性表达。图2的结果可见，STMN1可用于即使在光学显微镜下没有任何结构变化的微小病变肾病的早期诊断的生物标志物。

图3表示STMN1在不同类型的肾小球损伤疾病患者的肾组织中的表达对比情况。

临床上诊断为微小病变型肾病(MCD)、膜性肾病(MN)和局灶节段性肾小球硬化(FSGS)的患者肾穿刺活检的新鲜肾组织，作为病变组。肾切除术患者的正常肾组织，作为对照组，置入福尔马林等固定液固定后，石蜡包埋，制备得到福尔马林固定石蜡包埋肾组织，上切片机切片，得到5μM厚度的石蜡包埋组织切片，用于STMN1的免疫组织化学染色。

在对照组、MCD、MN和FSGS中的STMN1的免疫组织化学染色结果如图3，图3结果可见，与对照组相比，STMN1在微小病变型肾病(MCD)和膜性肾病(MN)的肾小球足细胞中明显增强。STMN1在微小肾病(MCD)的肾小球组织中，仅表达在足细胞的细胞核及细胞体，但在膜性肾病的肾小球组织中，STMN1除了在足细胞的细胞核及细胞体外，还明显地表达在环绕在血管襻周围的足细胞突起中(在放大图中部分STMN1阳性细胞用箭头表示)。STMN1在FSGS中表达阴性。

本发明中，STMN1在肾小球损伤肾组织中表达明显提高，可以初步判定，STMN1阳性反应的肾组织可诊断为肾小球损伤性疾病。根据STMN1在足细胞的表达分布可以进一步确定是哪种病变的肾小球损伤。STMN1仅表达在足细胞的细胞核及细胞体，没有明显细长突起环绕血管襻周围的肾组织可诊断为微小病变型肾病。对于初级检验师，可以通过免疫荧光技术排除膜性肾病。MN，MCD和FSGS是临床上最为常见的肾小球损伤性疾病。FSGS通常可在HE染色的光镜下进行诊断，MN需在免疫荧光染色的荧光显微镜下确诊，但是MCD微小病变型肾病的诊断只能通过电镜，检查费用高、诊断用时长且普及性受限(除高级的教学医院外，一般医院没有电镜)。基于此发现，本申请提供一系列用于早期诊断微小病变型肾病的方法，以及相关的试剂组合。本发明所述方法可以在普通显微镜下通过免疫组织化学染色的方式，快速、灵敏，直观的对微小病变型肾病进行诊断以及与膜性肾病和FSGS的鉴别。本发明所述的操作方法简单准确，对样品的要求不高，可用于大规模筛查或追溯性研究。这些方法可以应用于多种样本，冰冻组织、石蜡包埋组织、新鲜离体组织等，可提供多层次的检测信息，可为微小病变型肾病等肾小球性疾病的研究提供支持，也为临床诊断和指导用药提供可依赖的检测指标。从而使患者得到更加充分、有效的治疗，最终达到改善疾病预后的目的。

Claims (6)

1.一种微小病变型肾病的早期诊断生物标记物，其特征在于，所述生物标记物为STMN1蛋白。

2.一种用于微小病变型肾病的早期诊断的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括抗STMN1抗体。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括封闭液、与抗STMN1抗体特异性结合的生物标记二抗、与生物标记二抗进行显色反应的显色剂。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述封闭液含有5wt％山羊血清、1wt％BSA、0.01wt％聚乙二醇辛基苯基醚和pH7.4的磷酸缓冲液，所述生物标记二抗为生物素化二抗，所述显色剂含有辣根酶标记链霉卵白素和DAB显色试剂。

5.根据权利要求1所述的生物标记物在制造用于微小病变型肾病的早期诊断的试剂盒中的应用，其特征在于，包括以下步骤：

(1)准备取自受试者的待测样品和对照品；

(2)对步骤(1)的待测样品和对照品中的STMN1蛋白进行定量测定，得到样品值和对照值；

(3)将步骤(2)中得到的所述样品值和所述对照组进行比较，所述样品值高于所述对照值，则判断所述受试者伴有微小病变型肾病。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，在步骤(2)中使用免疫组织化学染色法对所述STMN1蛋白进行定量测定。