CN115389768A - Reg家族蛋白在诊断、筛查或评估动脉粥样硬化中的应用 - Google Patents

Reg家族蛋白在诊断、筛查或评估动脉粥样硬化中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种REG家族蛋白在诊断、筛查或评估动脉粥样硬化中的应用，属于生物医药技术领域。本发明在动脉粥样硬化造模大鼠中发现Reg家族基因在mRNA转录水平、蛋白水平以及血清游离水平，均呈现出显著的上调表达。并进一步发现在动脉粥样硬化患者的血清中REG家族蛋白也呈现出上调表达，为动脉粥样硬化临床诊断以及病程评估提供更加便捷、准确而灵敏的检测指标，从而完善动脉粥样硬化临床检验手段与评估方案。

Description

REG家族蛋白在诊断、筛查或评估动脉粥样硬化中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域。具体地，涉及再生基因REG家族蛋白在诊断、筛查或评估动脉粥样硬化中的应用。
背景技术
心血管疾病是目前人类发病率最高、危害最大的疾病之一，动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是其最主要病因。AS的形成表现为管腔内脂质积累形成粥样斑块，造成动脉腔隙变窄甚至堵塞，从而导致动脉供应的组织器官缺血、坏死；病理进程主要包括血管内皮细胞损伤和功能障碍、平滑肌细胞异常增殖和迁移、泡沫细胞形成。目前AS的诊断主要依靠影像学来实现。与影像学相比，血清学检测具有简便、快速、易于操作和结果判读等优点，并且AS的生物学表现先于影像学表现，可以根据血清学检测结果进行早期干预减少并发症的产生。传统的AS血清学检测指标，包括炎性标志物、氧化应激指标、凝血功能指标、脂质相关标志物等，在辅助诊断AS方便发挥了一定的作用，但特异性较差，临床急需更加特异、有效的血清生物标志物用于AS的诊断、斑块稳定性评估、风险分层管理以及预后评估；同时，新型生物表标志物的研发有助于深入揭示AS的发生发展机制。
再生基因REG家族蛋白最早在研究胰腺炎和胰岛增殖过程中被发现的，在人和啮齿类动物中高度保守。每种REG家族蛋白由信号肽和一个C型凝集素结构域构成，根据蛋白质一级结构分为四组：(i)REG1：大鼠和小鼠为Reg1，人有两个同源类似物REG1A和REG1B；(ii)REG2，仅存在于小鼠中；(iii)REG3：大鼠和小鼠为Reg3α、Reg3β、Reg3γ和Reg3δ，人有两个同源类似物REG3A和REG3G；(iv)Reg4。人类表达的五个REG家族蛋白REG1A、REG1B、REG3A、REG3G和REG4具有促进细胞增值、抗凋亡、免疫调节等功能；已有研究表明REG家族蛋白在糖尿病、阿尔茨海默病和消化道肿瘤等疾病中发挥着重要作用，具有成为潜在生物标志物的价值。尚未有关于再生基因Reg或REG家族基因或其编码的REG家族蛋白与动脉粥样硬化是否有关的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于动脉粥样硬化诊断、筛查、评估的生物标志物及其应用。特别是REG家族蛋白作为生物标志物在诊断、筛查或评估动脉粥样硬化中的应用。
为达到上述目的，本发明采用下述技术方案：
第一方面，本发明提供了一种用于动脉粥样硬化诊断、筛查、评估的生物标志物，所述生物标志物为REG家族蛋白。具体的，所述REG家族蛋白为REG1A(NCBI中的蛋白序列号为P05451)，REG1B(NCBI中的蛋白序列号为P48304)，REG3A(NCBI中的蛋白序列号为Q06141)或REG3G(NCBI中的蛋白序列号为Q6UW15)。
利用APOE敲除(APOE-/-)大鼠合并高脂饮食构建了AS模型，大体O油红染色显示AS大鼠主动脉斑块形成显著，利用Image J软件分析斑块面积约30％；相比之下，对照组大鼠(APOE-/-、普通饮食)主动脉基本上无斑块形成(图1)。对AS模型大鼠主动脉进行了转录组分析，研究发现再生基因Reg家族基因在粥样硬化的大鼠主动脉中显著高表达(图2)，mRNA转录水平、蛋白水平以及血清中游离蛋白浓度均得以体现(见图3至图5)。通过对临床AS患者与健康对照志愿者血清中四种REG家族蛋白(REG1A，REG1B，REG3A和REG3G)的评估，发现REG1A和REG3G在AS患者中显著高表达；REG1B和REG3A在AS患者也呈现升高趋势，与健康对照组相比具有统计学差异；ROC曲线分析揭示这四种REG家族蛋白在AS患者的临床诊断中具有较高的可靠性(见图6)，表明再生基因REG家族蛋白可作为潜在的AS生物标志物，为动脉粥样硬化临床诊断以及病程评估提供更加便捷、准确而灵敏的检测指标，完善动脉粥样硬化临床检验手段与评估方案。
第二方面，本发明提供了REG家族蛋白的检测试剂在制备如下任一产品中的应用：
1)在制备动脉粥样硬化诊断产品中的应用；
2)在制备动脉粥样硬化筛查产品中的应用；
3)在制备评估动脉粥样硬化风险产品中的应用；
4)在制备动脉粥样硬化预后评估产品中的应用。
进一步地，所述REG家族蛋白选自REG1A，REG1B，REG3A和/或REG3G。
进一步地，所述检测试剂为检测样本中REG家族蛋白的表达水平的试剂。
在上述应用中，所述产品可以通过但不限于免疫组化或酶联免疫吸附检测样本中的REG家族蛋白的表达水平。
进一步地，所述产品中含有与REG家族蛋白特异性结合的抗体。
进一步地，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体，优选的，所述抗体为单克隆抗体，该抗体可以采用本领域公知的方法制备得到或商业购买获得。
在上述应用中，所述检测样本可以优选为血清或尿液。例如，收集临床动脉粥样硬化患者血清样本来进行检测。
进一步的，所述产品可以为芯片、制剂、试纸条或试剂盒。
第三方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括上述检测样本中REG家族蛋白的表达水平的试剂；且，
所述试剂盒为应用于如下任一应用的试剂盒：
1)用于动脉粥样硬化诊断的试剂盒；
2)用于动脉粥样硬化筛查的试剂盒；
3)用于评估动脉硬化风险的试剂盒；
4)用于动脉粥样硬化预后评估的试剂盒。
本发明的有益效果如下：
本发明在动脉粥样硬化造模大鼠中发现Reg家族基因在mRNA转录水平、蛋白水平以及血清游离水平，均呈现出显著的上调表达。为检测Reg家族蛋白的血清浓度上调是否具有在临床中用于动脉粥样硬化诊断方面的作用，本发明采用ELISA方法测定30例冠状动脉粥样硬化患者行PCI术前以及29例健康体检者新鲜血液标本中REG1A、REG1B、REG3A和REG3G的浓度，检测结果如图6所示：动脉粥样硬化组REG1A、REG1B、REG3A和REG3G血清浓度均显著高于健康对照组。受试者工作特征曲线(ROC)分析显示：血清中REG1A、REG1B、REG3A和REG3G在动脉粥样硬化临床诊断的AUC值分别为0.739、0.678、0.695和0.892，结果表明REG家族蛋白可有效地作为动脉粥样硬化临床诊断的标志物。
附图说明
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。
图1示出动脉粥样硬化造模大鼠主动脉油红O染色图。
图2示出动脉粥样硬化造模大鼠差异表达基因的火山图。
图3示出荧光定量PCR检测动脉粥样硬化造模大鼠主动脉再生基因Reg的表达情况。
图4示出免疫组织化学检测Reg家族蛋白在大鼠动脉粥样硬化斑块中的表达情况。
图5示出酶联免疫吸附测定动脉粥样硬化造模大鼠血清中Reg3b的浓度。
图6示出人血清中REG1A、REG1B、REG3A和REG3G的评估在冠状动脉粥样硬化临床诊断中具有重要临床应用价值。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做进一步的说明。附图中相似的部件以相同的附图标记进行表示。本领域技术人员应当理解，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。
实验材料：
试剂与耗材
本发明所使用的试剂包含：油红O染色试剂盒(碧云天)、Trizol(Invitrogen)、PrimeScriptTM RT试剂盒(Takara)、TB
Figure BDA0003747864990000031
Premix Ex TagTM II(Takara)、ELISA试剂盒(REG1A、REG3G和Reg3β，武汉菲恩生物；REG1B和REG3A，AVIVA SYSTEMS BIOLOGY)、Reg1antibody(Proteintech)、Reg3αantibody(Abcam)、Reg3βantibody(Thermo Fisher)、Reg3γantibody(Thermo Fisher)、DAB显色试剂盒(迈新生物)和中性树胶(碧云天)等；本发明所使用的耗材包括：吸头、无酶EP管、盖玻片、载玻片、透明96孔板等。
转基因大鼠
ApoE-/-大鼠和普通SD大鼠，采用富含1.25％胆固醇高脂饲料和普通饲料进行喂养，大鼠均饲养于无病原体、温度与湿度可控的环境中。大鼠主动脉粥样硬化造模分为普通饮食组和高脂饮食组，每组数量不低于5只。
实验仪器
分光光度计(Thermo Fisher)、酶标仪(Thermo Fisher)、荧光定量PCR仪(ABI)、倒置显微镜(Leica)和全自动数字切片扫描仪(Leica)等仪器。
实施例1：大鼠主动脉油红O染色
1)大鼠麻醉与灌流：ApoE敲除大鼠普通饮食组(KO60NC)和高脂饮食组(KO60HL)分别取2～3只进行油红O染色。大鼠每100g体重采用0.2ml的2％戊巴比妥钠进行腹腔注射，待其麻醉后，将其仰卧固定于解剖台，剪开胸腔，使用无菌器械在右心房剪开一小口，将输液器针头插入左心室，采用预冷的PBS进行全身灌流至右心房剪口出流出澄清透明液体、肝脏变白。
2)大鼠主动脉组织采集；体式显微镜下去除主动脉弓周边的心脏、气管、食管、胸腺以及多余脂肪组织，剥离完整的主动脉及其分支并采用4％多聚甲醛进行固定。
3)主动脉大体油红染色以及斑块评估：将充分固定后的全主动脉从固定液中取出，加入PBS清洗去除表面残留的固定液；由于脂肪组织可被油红染为亮红色而干扰斑块观察，染色前需要进一步在体式显微镜下使用精细镊去除血管外膜的脂肪组织，注意轻柔操作，避免损伤血管；用解剖剪沿血管壁小心地将血管纵向剖开，将其浸入油红染液中37℃染色60min后取出，用75％乙醇分化至管腔内脂肪斑块呈橘红色或鲜红色，其它部位近无色；将染好的大体组织在白色滤纸和泡沫板上展开固定，选择良好的光线条件下，调整好焦距进行拍照评估。与对照组KO60NC相比，KO60HL主动脉斑块大量形成，参见图1。
实施例2：大鼠主动脉转录组测序
1)大鼠主动脉组织采集与裂解：大鼠主动脉组织采集参照上述流程进行，ApoE敲除大鼠普通饮食组和高脂饮食组各剥离3只大鼠主动脉进行转录组测序。在2ml的EP管中加入1.5ml的Trizol裂解液，取适量组织样品于液氮中快速研磨成粉末，并转入裂解液中，静置5min，使组织细胞充分裂解。
2)样本抽提纯化：将研磨、破碎的组织样本离心，4℃，12000g离心5min，上清转入加有300μl的氯仿：异戊醇(24:1)的EP管中，颠倒剧烈震荡混匀，4℃，12000g离心8min；将上清加有600μl异丙醇的EP管中，颠倒混匀，室温静置30min以上；4℃，12000g离心10min，弃上清，75％乙醇洗涤两次，晾干3～5min，无酶水溶解，测定RNA浓度。
3)mRNA片段化与cDNA合成：取2～3μg组织总RNA，70℃变性2min，使用oligo-dT磁珠进行纯化、二价金属离子片段化、富集纯化并进行逆转录，合成cDNA。
4)文库构建：纯化的cDNA，配制接头连接反应体系，室温连接1h，Ampure XP磁珠纯化并进行PCR扩增，Agilent 2100分析仪检测文库大小，Illumina测序平台进行高通量测序。再生基因Reg家族，包括Reg1、Reg3α、Reg3β和Reg3γ显著高表达于动脉粥样硬化大鼠主动脉，参见图2。
实施例3：荧光定量PCR验证Reg家族基因的表达
1)大鼠主动脉组织RNA提取与逆转录：大鼠主动脉总RNA提取参照实施例2进行提取，1μg总RNA中加入2μl的PrimeScript RT混合液，37℃反应15min，85℃变性5s，逆转录引物采用Oligo dT和6碱基随机引物。
2)实时荧光PCR：选择Premix Ex Taq II试剂盒进行荧光定量。
3)数据分析：采用2-ΔΔCt计算方法进行Reg家族基因的相对定量。
结果参见图3，高脂饮食组ApoE敲除大鼠主动脉中Reg1、Reg3α、Reg3β和Reg3γmRNA表达水平显著高于普通饮食对照组。
实施例4：免疫组织化学检测大鼠斑块中Reg家族蛋白的表达
1)大鼠主动脉组织固定、脱水与包埋：大鼠主动脉组织采集参照上述流程进行，并放入4％多聚甲醛中固定3～4小时，固定后将主动脉组织放入包埋盒中进行脱水、浸蜡、包埋。
2)组织切片与制片：切片机中固定蜡块并调整其与刀片间的距离，切片厚度调整为10μm，调整刀片角度以保证切片方向与主动脉根部保持垂直，边切边显微镜下观察，每个样本留取10张切片。
3)免疫化学染色：组织切片可放置60℃培养箱中进行脱蜡1～2小时，依次进行水化、抗原修复、封闭、一抗孵育过夜。
4)显色：次日，室温复温30分钟，PBS清洗、二抗孵育、PBS清洗；滴加两滴DAB显色液，显微镜下观察3～10分钟，染色适度即可终止染色并进行自来水冲洗；苏木素复染1～2分钟，细胞核变蓝色即可终止，自来水冲洗，1％盐酸酒精分化3秒，自来水冲洗3分钟。
5)封片：组织切片脱水、中性树脂封片、晾干、扫片。
结果显示：高脂饮食喂养60周的ApoE敲除大鼠主动脉斑块中Reg1、Reg3α、Reg3β和Reg3γ蛋白显著高表达，主动脉斑块采用虚线标记，参见图4。
实施例5：ELISA法检测血清中REG家族蛋白
1)ELISA法(ER0296，武汉菲恩生物)测定大鼠血清Reg3β：
①分别选取普通饮食和高脂饮食喂养60周的ApoE敲除大鼠，每组分别取六份不同大鼠来源的血清；
②加样：向相应孔中加入100μl标准品及50倍稀释的大鼠血清样品，覆膜，于37℃孵育90分钟；
③洗涤：取下盖子，用洗涤缓冲液洗涤板3次，每次洗涤缓冲液在孔中停留1～2分钟；
④生物素标记抗体：将100μl生物素标记抗体工作溶液加入上述孔中，盖上板，于37℃孵育60分钟，然后洗板3次；
⑤加HRP-链霉亲和素偶联物(SABC)：在每个孔中加入100μl SABC工作溶液，盖上板，于37℃孵育30分钟，并洗板5次；
⑥TMB底物：每孔加入90μl TMB底物，盖上板，于37℃避光孵育15分钟，然后每孔加入50μl终止液；
⑦酶标仪在450nm下测定OD值，绘制标准曲线，计算浓度。
2)人血清样本：收集我院心血管病中心诊断为冠状动脉粥样硬化患者行PCI术前患者30例和健康体检者29例的新鲜血清样本，ELISA法测定人血清REG1A(EH3707，武汉菲恩生物)、REG1B(OKEH00380，AVIVA SYSTEMS BIOLOGY)、REG3A(OKBB01254，AVIVA SYSTEMSBIOLOGY)和REG3G(EH0847，武汉菲恩生物)：
①选取疾病组30例血清标本、健康体检组29例血清样本；
②加样：向相应孔中加入100μl标准品及2倍稀释的人血清样品，覆膜，于37℃孵育90分钟；
③洗涤：取下盖子，用洗涤缓冲液洗涤板3次，每次洗涤缓冲液在孔中停留1～2分钟；
④生物素标记抗体：将100μl生物素标记抗体工作溶液加入上述孔中，盖上板，于37℃孵育60分钟，然后洗板3次；
⑤加HRP-链霉亲和素偶联物(SABC)：在每个孔中加入100μl SABC工作溶液，盖上板，于37℃孵育30分钟并洗板5次；
⑥TMB底物：每孔加入90μl TMB底物，盖上板，于37℃避光孵育15分钟，然后每孔加入50μl终止液；
⑦酶标仪在450nm下测定OD值，绘制标准曲线，计算浓度。
结果参见图6：散点图代表ELISA测定AS患者与健康对照组血清中REG1A、REG1B、REG3A和REG3G浓度，AS患者血清中具有更高的REG1A、REG1B、REG3A和REG3G蛋白浓度；ROC曲线分析血清中REG1A、REG1B、REG3A和REG3G在AS患者与健康对照组评估具有较高的可信度，可作为潜在的AS生物学标志物。
显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定，对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无法对所有的实施方式予以穷举，凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

Claims (9)

1.REG家族蛋白的检测试剂在制备如下任一产品中的应用：
1)在制备动脉粥样硬化诊断产品中的应用；
2)在制备动脉粥样硬化筛查产品中的应用；
3)在制备评估动脉粥样硬化风险产品中的应用；
4)在制备动脉粥样硬化预后评估产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述REG家族蛋白选自REG1A，REG1B，REG3A和/或REG3G。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述检测试剂为检测样本中REG家族蛋白的表达水平的试剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品通过免疫组化或酶联免疫吸附检测样本中的REG家族蛋白的表达水平。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述产品中含有与REG家族蛋白特异性结合的抗体。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述抗体为多克隆抗体或单克隆抗体。
7.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于，所述样本为血清或尿液。
8.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为芯片、制剂、试纸条或试剂盒。
9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括检测样本中REG家族蛋白的表达水平的试剂；且，
所述试剂盒为应用于如下任一应用的试剂盒：
1)用于动脉粥样硬化诊断的试剂盒；
2)用于动脉粥样硬化筛查的试剂盒；
3)用于评估动脉硬化风险的试剂盒；
4)用于动脉粥样硬化预后评估的试剂盒。
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CN117385024A (zh) * 2023-11-29 2024-01-12 梅州市人民医院(梅州市医学科学院) 一种lncRNA标志物及其在制备诊断、筛查或评估急性冠状动脉综合征的产品中的应用
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