CN117385024A - 一种lncRNA标志物及其在制备诊断、筛查或评估急性冠状动脉综合征的产品中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种lncRNA标志物及其在制备诊断、筛查或评估急性冠状动脉综合征的产品中的应用。本发明证明了lncRNA‑ACSD在急性冠状动脉综合征患者及冠脉正常者的外周血单个核细胞中存在差异，在诊断急性冠状动脉综合征临床诊断方面具有较好的价值(AUC＝0.875，95％CI:0.807‑0.943)，当Cutoff值为0.007时，敏感性87％，特异性为80％，准确度为80％，可作为诊断、筛查或评估急性冠状动脉综合征的标志物。相较于传统的生物标志物，本发明所提供的lncRNA‑ACSD标志物具有更好的组织特异性和良好的稳定性，将大大提高急性冠状动脉综合征诊断的敏感性和特异性。

Description

一种lncRNA标志物及其在制备诊断、筛查或评估急性冠状动 脉综合征的产品中的应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，特别涉及一种长链非编码RNA(lncRNA)标志物，及其在制备诊断、筛查或评估急性冠状动脉综合征的产品中的应用。

背景技术

心血管疾病(Cardiovascular disease，CVD)是目前是全球范围内致死、致残率最高的疾病，每年因心血管病死亡人数高达总因病死亡人数的30％！急性冠状动脉综合征(acute coronary syndrome，ACS)是最严重的心血管疾病之一，发病急、进展快，且治疗后易复发冠状动脉栓塞及不良心血管事件，是心血管病的主要死因。ACS主要包括不稳定型心绞痛和急性心肌梗死，可诱发室颤等恶性心律失常、心脏破裂，危及生命。虽然，随着现代医学技术的发展，特别是经皮冠状动脉介入支架植入术的出现，极大地挽救了ACS患者的生命，减少了因病死亡人数。然而，中国ACS发病率和死亡率仍在逐年增加，给人民的健康造成巨大负担。因此，早期诊断和及早干预，对控制心血管疾病，特别是减少ACS的发生具有重要意义。

临床上，ACS患者确诊需结合临床表现(胸痛)心电图检查、心酶检查及冠状动脉造影检查。目前，缺乏ACS特异性的诊断标志物。肌钙蛋白(cTnI)是目前较为公认的诊断及鉴别ACS的血清学标志，在发生胸痛的早期(2-6小时)即可升高，但其它疾病如病毒性心肌炎、心力衰竭及慢性肾功能衰竭发生时，也能引起该蛋白升高；D-二聚体和C-反应蛋白与炎症和应激有关，但这些指标参与较多的病理生理过程，心脏特异性较差，与冠脉病变程度的相关性尚有争议。冠状动脉造影是诊断冠脉狭窄病变的“金标准”，也可作为冠脉再通的治疗方式，然而，冠脉造影属于有创检查方式，且价格昂贵，所需技术及设备要求较高，限制了在患者接纳程度及普及范围。因此，寻找一种具有较高特异性和灵敏性的血液标志物，用于ACS的早期诊断，具有重要意义。

长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是指序列长度大于200核苷酸，无编码功能蛋白质能力的非编码RNA。已有充分证据证明，lncRNA可在转录、转录后和表观遗传水平调控基因表达，参与多种细胞过程，对心血管病的进程具有重要调控作用。LncRNAANRIL在动脉粥样硬化病人中表达明显升高；抑制心脏组织中lncRNA MHRT的表达，可加速心肌肥大向心力衰竭的进程；研究者发现，线粒体来源lncRNA LIPCAR在心血管不良事件发生的早期表达较低，晚期表达增高。由于lncRNA通常形成相对稳定的二级结构，因其可以稳定存在于血液及其他各种体液中，较传统的分子标志物具有更高的稳定性和特异性，可以在血液中被检测到，有望成为心血管疾病诊断及预后的新型生物学标志物。因此，鉴定和筛选外周循环中具有ACS疾病特异性的lncRNA标志物，对于开发ACS早期诊断策略和产品具有重要价值。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种急性冠状动脉综合征的生物标志物及其应用。该生物标志物可以用于特异性诊断、筛查或评估急性冠状动脉综合征。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

第一方面，本发明通过对确诊急性冠状动脉综合征患者和冠脉正常对照患者的外周血单个核细胞转录组进行高通量测序，筛选出一种差异表达显著的lncRNA，命名为lncRNA-ACSD，提供了一种急性冠状动脉综合征标志物。lncRNA-ACSD是一个全新的、尚未报道过的lncRNA分子，序列如SEQ ID NO.1所示。

高通量测序结果显示，lncRNA-ACSD在急性冠状动脉综合征患者中表达显著升高(图1)。进一步地，通过qRT-PCR在更大样本量的急性冠状动脉综合征及冠脉正常者外周血单个核细胞进行lncRNA-ACSD表达验证，发现lncRNA-ACSD在急性冠状动脉综合征中表达显著升高，差异显著(图2)；ROC曲线显示lncRNA-ACSD在急性冠状动脉综合征的诊断中具有较好的临床价值(图3)；为明确外周血中lncRNA-ACSD水平对ACS的诊断价值，采用qRT-PCR检测在胸痛患者外周血单个核细胞中lncRNA-ACSD水平，通过受试者工作特征曲线(ROC)分析，发现lncRNA-ACSD诊断冠状动脉粥样硬化的准确度较高，可辅助诊断急性冠状动脉综合征。

第二方面，本发明提供了一种lncRNA-ACSD在制备如下任一项产品中的应用：

(1)在制备诊断急性冠状动脉综合征的产品中的应用；

(2)在制备筛查急性冠状动脉综合征的产品中的应用；

(3)在制备评估急性冠状动脉综合征风险的产品中的应用。

进一步的，所述产品包括检测lncRNA-ACSD表达水平的试剂；

更进一步的，所述产品包括检测lncRNA-ACSD表达水平的荧光定量PCR试剂；

更进一步的，所述检测lncRNA-ACSD表达水平的荧光定量PCR试剂为特异性检测lncRNA-ACSD表达水平的引物对，所述引物对包含正向引物(5’-TAGTGGTATGATTCTCGCTTTGG-3’)及反向引物(5’-CGCCGATTGCAGTATTTGTTA-3’)。

再进一步的，所述产品为芯片、制剂、试纸条或试剂盒。

进一步的，所述产品的检测样本为外周静脉血；更进一步的，所述样本为外周血单个核细胞；再进一步的，所述样本为从外周静脉血分离得到的外周血单个核细胞。

第三方面，本发明提供了一种试剂盒，所述试剂盒包括检测lncRNA-ACSD表达水平的试剂；且所述试剂盒为应用于如下任一项应用的试剂盒：

(1)用于急性冠状动脉综合征诊断的试剂盒；

(2)用于急性冠状动脉综合征筛查的试剂盒；

(3)用于急性冠状动脉综合征风险评估的试剂盒；

优选地，所述试剂盒包括特异性检测lncRNA-ACSD表达水平的引物对。

所述引物对包含正向引物(5’-TAGTGGTATGATTCTCGCTTTGG-3’)及反向引物(5’-CGCCGATTGCAGTATTTGTTA-3’)。

进一步地，所述试剂盒还包括特异性检测GAPDH表达水平的引物对、荧光染料。

优选的，所述荧光染料为SYBR Green荧光染料或TB Green荧光染料。

优选的，所述的特异性检测GAPDH表达水平的引物对包括GAPDH正向引物(5’-GAACGGGAAGCTCACTGG-3’)和GAPDH反向引物(5’-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3’)。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及有益效果：

本发明证明了lncRNA-ACSD在急性冠状动脉综合征患者及冠脉正常者的外周血单个核细胞中存在差异，在诊断急性冠状动脉综合征临床诊断方面具有较好的价值(AUC＝0.875，95％CI:0.807-0.943)，当Cutoff值为0.007时，敏感性87％，特异性为80％，准确度为80％，可作为诊断、筛查或评估急性冠状动脉综合征的标志物。同时，本发明提供了一种可以特异性检测lncRNA-ACSD表达的荧光定量PCR试剂盒用于诊断、筛查或评估急性冠状动脉综合征患者。相较于传统的生物标志物，本发明所提供的lncRNA-ACSD标志物具有更好的组织特异性和良好的稳定性，将大大提高急性冠状动脉综合征诊断的敏感性和特异性。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是急性冠状动脉综合征患者及冠脉正常者差异表达lncRNA火山图。

图2是急性冠状动脉综合征患者及冠脉正常者lncRNA-ACSD表达情况。

图3是lncRNA-ACSD在急性冠状动脉综合征中的临床诊断价值图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

为了便于理解本发明，下面结合优选实施例和附图对本发明做更全面的说明。需要明白，下面所具体描述的内容是说明性的而非限制性的，不应以此限制本发明的保护范围。

本研究主要收集梅州市人民医院急性冠状动脉综合征患者和冠脉正常者外周血。急性冠状动脉综合征患者为急诊入院胸痛12h以内的患者，急性冠状动脉综合征患者诊断符合美国心脏协会(AHA)与美国心脏学会(ACC)制定的关于ACS的诊断标准。

冠脉正常者为行冠状动脉造影检测排除冠心病的胸痛者。所有对象均签署知情同意书。冠脉正常者与急性冠状动脉综合征患者通过年龄、性别、高血压、糖尿病、高脂血症等变量进行匹配。采血方法：急性冠状动脉综合征及冠脉正常组均于患者急诊入院当时采集肘正中静脉血3mL。

实施例1：高通量测序及分析

1.研究对象

选取急诊入院的10例急性冠状动脉综合征患者及10例冠脉正常者外周血。两组患者的基线资料如表1所示，两组患者临床基线资料间的差异均无统计学意义，P>0.05。

表1急性冠状动脉综合征患者及冠脉正常者临床基线资料

2.采血方法

所有患者均于入院当时采集外周静脉血3mL。

3.外周血单个核细胞(PBMC)分离

采集的血液静置30min后，室温下3000rpm，离心15min，分离上层血浆；通过密度梯度离心，分离外周血单个核细胞。具体操作为：

(1)在分离血浆后的2mL体积的血细胞中加入等体积的PBS，充分混合，形成细胞悬液；

(2)于15mL离心管中加入4mL淋巴细胞分离液，使用移液管将细胞悬液缓慢加入淋巴细胞分离液表面(注意动作温柔，勿与淋巴细胞分离液混合)，离心1500rpm离心30min。

(3)使用胶头吸管吸取细胞交界层(白膜)于另一离心管，使用PBS洗涤两次，最后一次将细胞悬液移入1.5mL EP管中，用于RNA提取。

4.RNA提取

采用Trizol裂解PBMC，使用RNeasy试剂盒按照说明书的操作流程，从PBMC中提取总RNA。采用Nanodrop-1000分光光度计测定RNA的浓度和纯度。RNA提取具体操作为：

(1)于PBMC中加入1mL Trizol，震荡3min混匀，室温静置10min；

(2)加入200μL氯仿，颠倒混匀，室温静置3min，13000rpm，4℃离心15min；

(3)小心吸取上清水相约450μL，移入1.5mL EP管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静置10min，13000rpm，4℃离心10min；

(4)弃上清，管底可见白色物质，加入1mL 75％的预冷乙醇，洗涤沉淀，13000rpm，4℃离心5min；

(5)去除乙醇，室温晾10min，根据沉淀大小加入30-100μL 56℃预热的DEPC水，溶解RNA；

(6)取3μL RNA样本，于1.5％琼脂糖凝胶中电泳；l.5μL RNA样品于紫外分光光度计(Nanodrop-1000)检测浓度和纯度，以A260/280在1.8-2.0视为RNA样本合格。

5.RNA测序及生信分析

使用Ribo-zero rRNA去除试剂盒去除核糖体RNA。处理后的RNA用乙醇沉淀法洗涤。通过使用Illumina-Ultra II RNA库准备试剂盒，按照操作流程生成互补DNA(cDNA)文库。cDNA文库在Agilent Bioanalyzer 2100系统上纯化和评估。测序在Illumina Hiseq2500平台上进行，产生150bp的成对末端reads，使用SOAPnuke对原始测序数据进行处理，去除接头序列、poly-N reads和低质量reads。计算Q20、Q30和GC含量，用于检查清洗数据的质量。然后，使用TopHat 2将配对的末端clean reads与人类参考基因组(版本:human.GRCH38/hg38)进行比对。通过参考注释(版本:Gencode.v26)使用cufflink将转录本与映射的reads组装在一起。使用分层聚类和火山图过滤来识别差异表达的lncRNA。采用随机方差模型鉴定具有统计学意义的差异表达基因，采用配对t检验确定p值。结合测序结果与文献调研结果，筛选了差异表达的lncRNA-ACSD(相关结果如图1所示)。

lncRNA-ACSD基因序列如下：SEQ ID No.1所示，具体为：

AAAATAAATGAACACTCTTAAAGAATAGAATCTCTCCAGTTCTGGCTCGTTGGTCTAGTGGTATGATTCTCGCTTTGGGTGCGAGAGGTCCCGGGTTCAAATCCCGGACGAGCCCCTTTACTTTCCTTTCCGTTTCATCTTTCTCTCTTTAAAGTCAGTAGTTAACAAATACTGCAATCGGCGCTACGGCTAGGTCACCTAGCCCTCTTCAACCTCGACCTATGGGGGATGAGATTGTTGAGCAAATTGCGGCTACTTTCGCTGAAAGAATCAAAGACAACGAAGACGCTGCGAAGGGCCAAGGTCTTCATCACAGATCGGGGTTCCCTGACGGGCTCTGACAGGATCTTTTGTCAGGAGCAGAGTGTTCGGGCAGTTCTTACCCAG。

实施例2：急性冠状动脉综合征患者及冠脉正常者外周血PBMC中lncRNA-ACSD表达情况

1.研究对象

募集确诊为急性冠状动脉综合征的患者55例，及冠脉造影确定冠脉无狭窄的冠脉正常者55例。其中，急性冠状动脉综合征患者及冠脉正常者的基线资料如表2所示，两组患者临床基线资料间的差异无统计学意义，P>0.05。

表2急性冠状动脉综合征患者及冠脉正常者临床基线资料

2.采血方法：所有患者均于入院当时采集外周静脉血3mL。

3.PBMC分离及总RNA提取：采用与实施例1相同的方法，即密度梯度离心法从外周血中分离获得PBMC；采用与实施例1相同的方法，即Trizol法提取总RNA。

4逆转录反应

(1)使用TAKARA PrimeScript^TM RT Master Mix逆转录试剂盒，用逆转录缓冲液和1μg总RNA进行逆转录合成cDNA。采用20μL反应体系，参照表3组分配制逆转录反应液；

表3逆转录反应体系

试剂	使用量	终浓度
			5X PrimeScript RT Master Mix	4μL	1X
总RNA	1μg
			Rnase Free dH2O	up to 20μL

(2)轻柔混匀后进行逆转录反应(RT)，条件如表4，得到cDNA模板；

表4逆转录反应条件

37℃	15min(反转录反应)
		85℃	5s(反转录酶的失活反应)
4℃

4.2 qRT-PCR

(1)仪器和分析方法：采用ABI 7500型荧光定量PCR仪，采用2^-△△Ct法以GAPDH作为内参，进行lncRNA-ACSD的相对定量分析。

(2)引物设计：

采用在线引物设计软件，设计lncRNA-ACSD及GAPDH引物，引物设计后由生工生物工程公司合成，具体引物序列如表5所示。

表5 lncRNA-ACSD及GAPDH引物

基因名	正向引物：Forward primer(5’-3’)	反向引物：Reverse primer(5’-3’)
			lncRNA-ACSD	TAGTGGTATGATTCTCGCTTTGG	CGCCGATTGCAGTATTTGTTA
GAPDH	GAACGGGAAGCTCACTGG	GCCTGCTTCACCACCTTCT

(3)反应体系，参照TAKARATB Green^TM Premix Ex Taq^TM II扩增试剂盒，具体反应体系如表6。

表6荧光定量PCR反应体系

试剂	使用量	终浓度
			TB Green Premix Ex Taq II(2X)	10μL	1X
PCR Forward primer	0.8μL	0.4μM
			PCR Reverse primer	0.8μL	0.4μM
ROX Reference Dye(50X)	0.4μL	1X
			cDNA模板	2μL
灭菌水	6μL
			Total	20μL

(4)反应条件，轻柔混匀后进行Real Time PCR反应，条件如表7。

表7荧光定量PCR反应条件

实验结果

实验结果如图2所示，从图中可以看出，急性冠状动脉综合征外周血PBMC中的lncRNA-ACSD表达量(0.043±0.006)显著高于冠脉正常组(0.009±0.002)，差异具有统计学意义(P<0.001)。

急性冠状动脉综合征和冠脉正常组的ROC曲线如图3所示，从图中可以看出，ROC曲线的AUC值为0.875，95％CI为0.807-0.943，P<0.0001。当Cutoff值为0.007时，敏感性为87％，特异性为80％。

实施例3：对lncRNA-ACSD诊断急性冠状动脉综合征的准确性进行验证。

1.研究对象和方法

收集30例急诊入院的胸痛患者外周静脉血，基线资料如表8所示。急诊入院采集外周血分离PBMC，通过qRT-PCR检测lncRNA-ACSD表达，诊断、筛查胸痛患者中罹患ACS的人数，再与胸痛患者后续进行临床综合评估的诊断结果进行比对，对lncRNA-ACSD诊断ACS的准确性进行评估。

表8急诊入院的胸痛患者基线资料

2.采血方法：所有患者均于急诊收治当时采集外周静脉血3mL。

3.外周血单个核细胞分离和总RNA提取：使用与实施例1相同的密度梯度离心法从外周血中分离获得PBMC；使用与实施例1相同的Trizol法提取总RNA。

4.逆转录及qRT-PCR检测lncRNA-ACSD诊断急性冠状动脉综合征的准确性

采用与实施例1相同的方法及体系进行逆转录反应及荧光定量PCR反应。采用2^-△△Ct法以GAPDH作为内参，进行lncRNA-ACSD的相对定量分析。以lncRNA-ACSD>0.007作为诊断界值，与胸痛患者最终的临床诊断进行对比，评估lncRNA-ACSD诊断ACS的准确性。

实验结果

以lncRNA-ACSD>0.007作为诊断界值，诊断30名胸痛患者中有18名为ACS患者，12名为其他疾病患者；临床诊断结果显示30名胸痛患者中，有20名为ACS患者，10名为其他疾病患者。结果显示，lncRNA-ACSD作为诊断性试验，检出“真阳性”患者15例，“真阴性”患者9例，检测准确度为80％(真阳性与真阴性患者之和在总受检例数中的占比)，结果表明，lncRNA-ACSD诊断急性冠状动脉综合征的准确性较好(具体实验结果见表9)。

表9lncRNA-ACSD表达与临床诊断符合情况

实施例4：一种用于诊断急性冠状动脉综合征的荧光定量PCR试剂盒

1.组成成分

lncRNA-ACSD引物序列：

正向引物：5’-TAGTGGTATGATTCTCGCTTTGG-3’；

反向引物：5’-CGCCGATTGCAGTATTTGTTA-3’；

GAPDH引物序列：

正向引物：5’-GAACGGGAAGCTCACTGG-3’；

反向引物：5’-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3’；

SYBR Green荧光染料(2X)，ROX参比染料(50X)和ddH₂O。

2.反应体系，配制方式如下表

试剂	使用量
		SYBR Green Mix(2X)	10μL
PCR Forward primer	0.8μL
		PCR Reverse primer	0.8μL
ROX Reference Dye(50X)	0.4μL
		cDNA模板	2μL
灭菌水	6μL
		Total	20μL

3.反应条件

反应条件：95℃10min(1个循环)；95℃15s，60℃60s(40个循环)。

4.结果分析

采用2^-△△Ct法以GAPDH作为内参，进行lncRNA-ASD的相对定量分析。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种急性冠状动脉综合征生物标志物，其特征在于：所述生物标志物为lncRNA-ACSD，所述lncRNA-ACSD的序列如SEQ ID NO.1所示。

2.权利要求1中所述的lncRNA-ACSD在制备如下任一项产品中的应用，其特征在于：

(1)在制备诊断急性冠状动脉综合征的产品中的应用；

(2)在制备筛查急性冠状动脉综合征的产品中的应用；

(3)在制备评估急性冠状动脉综合征风险的产品中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述产品包括检测lncRNA-ACSD表达水平的试剂。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述产品包括检测lncRNA-ACSD表达水平的荧光定量PCR试剂。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述检测lncRNA-ACSD表达水平的荧光定量PCR试剂为特异性检测lncRNA-ACSD表达水平的引物对，所述引物对包含正向引物：5’-TAGTGGTATGATTCTCGCTTTGG-3’；及反向引物：5’-CGCCGATTGCAGTATTTGTTA-3’。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述产品为芯片、制剂、试纸条或试剂盒。

7.根据权利要求2-6任一项所述的应用，其特征在于：所述产品的检测样本为外周静脉血。

8.一种试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求3-5任一项中所述的试剂；且所述试剂盒为应用于如下任一项应用的试剂盒：

(1)用于急性冠状动脉综合征诊断的试剂盒；

(2)用于急性冠状动脉综合征筛查的试剂盒；

(3)用于急性冠状动脉综合征风险评估的试剂盒。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括特异性检测GAPDH表达水平的引物对、荧光染料。

10.根据权利要求9所述的试剂盒，其特征在于：

所述荧光染料为SYBR Green荧光染料或TB Green荧光染料；

所述的特异性检测GAPDH表达水平的引物对包括GAPDH正向引物：5’-GAACGGGAAGCTCACTGG-3’和GAPDH反向引物5’-GCCTGCTTCACCACCTTCT-3’。