CN112410234A - 一种多靶点编辑重组曲霉菌株的可视化筛选方法 - Google Patents

一种多靶点编辑重组曲霉菌株的可视化筛选方法 Download PDF

Info

Publication number
CN112410234A
CN112410234A CN202010847441.0A CN202010847441A CN112410234A CN 112410234 A CN112410234 A CN 112410234A CN 202010847441 A CN202010847441 A CN 202010847441A CN 112410234 A CN112410234 A CN 112410234A
Authority
CN
China
Prior art keywords
trna
gene
aspergillus
genes
sgrna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202010847441.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN112410234B (zh
Inventor
刘松
李岑
堵国成
陈坚
周景文
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Jiangnan University
Original Assignee
Jiangnan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Jiangnan University filed Critical Jiangnan University
Publication of CN112410234A publication Critical patent/CN112410234A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN112410234B publication Critical patent/CN112410234B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/37—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi
    • C07K14/38—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from fungi from Aspergillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/14—Fungi; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/111—General methods applicable to biologically active non-coding nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/65—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression using markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/67—Aspergillus flavus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/68—Aspergillus fumigatus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/645—Fungi ; Processes using fungi
    • C12R2001/66—Aspergillus
    • C12R2001/685—Aspergillus niger

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种多靶点编辑重组曲霉菌株的可视化筛选方法，属于基因工程技术领域。本发明利用CRISPR‑Cas9在曲霉中同时剪切孢子颜色变化相关基因与目的基因，使目的基因编辑可视化，可通过孢子表型快速高效筛选出黑曲霉多基因编辑菌株。通过可视化基因与无表型变化基因的不同组合，以实现多基因编辑菌株快速筛选和多个可视化基因同时筛选，减少工业菌株中抗性基因的使用。

Description

一种多靶点编辑重组曲霉菌株的可视化筛选方法
技术领域
本发明涉及一种多靶点编辑重组曲霉菌株的可视化筛选方法，属于基因工程技术领域。
背景技术
丝状真菌在传统发酵行业中有悠久的发展历史，其中曲霉在工业中应用于食品发酵，生产酶制剂及其有机酸等产品，具有商业价值的曲霉菌种包括黑曲霉和米曲霉等。但是缺乏高效的基因编辑方法和快速筛选重组菌株的方法是阻碍着工业曲霉菌种分子改造进程的重要因素。
曲霉的细胞由菌丝包裹，细胞壁结构与大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等原核细胞相比更复杂，曲霉可视化筛选单菌落难以实现。常见的菌株可视化筛选方法可将目的基因N端与绿色荧光蛋白(GFP)融合表达，通过荧光进行筛选。在大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等原核细胞中可通过菌体绿色荧光沉积挑选单菌落进行筛选重组菌，或通过流式细胞仪的荧光分选筛分单细胞。但是曲霉中表达GFP需利用荧光显微镜进行观察菌体的荧光情况，难以达到分选的目的。而通过培养基的显色反应筛选曲霉的重组菌株不仅有使用的局限性，而且操作繁琐、效果不精确。所以需要在曲霉中应用更合理的进行“可视化”操作用于筛选重组菌株。
曲霉种类的不同，其孢子颜色有区别，孢子颜色的不同不仅可作为区分曲霉种类的“可视化”特征，也可以通过编辑孢子色素沉淀相关基因，改变宿主孢子颜色，用于曲霉重组菌株“可视化”的筛选标记。野生型黑曲霉成熟孢子颜色多为黑褐色，利用CRISPR-Cas9在曲霉中同时突变孢子颜色变化相关基因与目的基因，可能会使目的基因编辑可视化。但是，目前对丝状真菌进行基因敲除或阻断存在着同源重组效率低、可使用的筛选标记有限等缺点。
因此，提供一种无抗性可视化的曲霉基因重组菌株的筛选方法，有利于工业中对曲霉基因编辑菌株的筛选和利用。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种可视化筛选曲霉中基因编辑菌株的方法，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，同时敲除曲霉中的基因(a)和(b)；其中，(a)为影响孢子颜色变化的基因；(b)为敲除前后曲霉表型不变的基因。
在本发明的一种实施方式中，所述影响孢子颜色变化的基因包括fwnA、pptA、brnA。
在本发明的一种实施方式中，所述敲除前后曲霉表型不变的基因包括但不限于amyA、ammA、pepA、kusA。
在本发明的一种实施方式中，所述fwnA的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述pptA的Gene ID:4985743，所述brnA的Gene ID:4987395。
在本发明的一种实施方式中，所述amyA的Gene ID:4980947，所述ammA的Gene ID:4984565，所述pepA的Gene ID:4987328，所述kusA的Gene ID:4987871。
在本发明的一种实施方式中，所述曲霉包括黄曲霉、黑曲霉、烟曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉。
在本发明的一种实施方式中，宿主为黑曲霉(Aspergillus niger)。
在本发明的一种实施方式中，宿主为Aspergillus niger CCTCC M 2018881，已公开于公开号为CN110438018A的专利申请文件中。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是通过构建Cas9表达质粒与sgRNA表达框，将Cas9表达质粒与sgRNA表达框转入黑曲霉中共表达。
在本发明的一种实施方式中，黑曲霉密码子优化的Cas9基因序列如SEQ ID NO.4所示。
在本发明的一种实施方式中，所述方法是利用Pu3或Pu6启动子以及相对应的终止子Tu3或Tu6构建sgRNA表达框。
在本发明的一种实施方式中，sgRNA利用曲霉内源的tRNA释放；所述内源tRNA包括tRNAAla，tRNAArg，tRNACys，tRNAIle，tRNALeu，tRNALys，tRNAMet，tRNAPhe，tRNASer，tRNAThr，tRNAVal，tRNAGlu，tRNAPro，tRNAGlu，tRNAGln，tRNAGly。
在本发明的一种实施方式中，当对单个基因编辑时，启动子后的第一个tRNA优选为tRNAAla。
在本发明的一种实施方式中，当对两个基因编辑时，启动子后的第一个tRNA优选为tRNAAla，第二个tRNA优选为tRNAArg。
在本发明的一种实施方式中，当多个基因编辑时，启动子后的第一个tRNA优选为tRNAAla，最后一个sgRNA中的tRNA优选为tRNAArg。
本发明的第二个目的是提供一种用于曲霉中基因敲除可视化的系统，所述系统包括编码Cas9蛋白的基因、sgRNA表达框以及筛选标记；所述sgRNA表达框上含有影响孢子颜色变化的基因的靶序列，和不影响曲霉表型的基因的靶序列。
在本发明的一种实施方式中，sgRNA利用曲霉内源的tRNA释放；所述内源tRNA包括tRNAAla，tRNAArg，tRNACys，tRNAIle，tRNALeu，tRNALys，tRNAMet，tRNAPhe，tRNASer，tRNAThr，tRNAVal，tRNAGlu，tRNAPro，tRNAGlu，tRNAGln，tRNAGly。
本发明的第三个目的是提供一种提高曲霉基因编辑筛选效率的方法，是利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，同时敲除曲霉中的基因(a)和(b)；其中，(a)为影响孢子颜色变化的基因；(b)为敲除前后曲霉表型不变的基因；所述影响孢子颜色变化的基因包括fwnA、pptA、brnA；所述敲除前后曲霉表型不变的基因包括但不限于amyA、ammA、pepA、kusA。
本发明还保护所述可视化筛选曲霉中基因编辑菌株的方法在曲霉基因编辑中的应用。
本发明还保护所述用于曲霉中基因敲除可视化的系统在曲霉基因编辑中的应用。
本发明还保护提高曲霉基因编辑筛选效率的方法在曲霉基因编辑中的应用。
本发明的有益效果：
本发明利用CRISPR-Cas9在曲霉中同时剪切孢子颜色变化相关基因与目的基因，使目的基因编辑可视化，可通过孢子表型快速高效筛选出黑曲霉多基因编辑菌株。通过可视化基因与无表型变化基因的不同组合，以实现多基因编辑菌株快速筛选和多个可视化基因同时筛选，减少工业菌株中抗性基因的使用。本发明的这种方法也可通用于其他的曲霉中，通过颜色变化的可视化基因与需要敲除的目的基因结合，可实现目的基因快速、准确的敲除。
附图说明
图1为黑曲霉Cas9表达质粒pUC19-Cas9图谱。
图2为黑曲霉sgRNA共表达质粒pUC19-sgRNA图谱。
图3为黑曲霉无表型基因sgRNA与可视化表型基因sgRNA共表达质粒pUC19-sgRNA-1/2/3的图谱。
图4为黑曲霉可视化基因编辑转化子孢子颜色对比图。
具体实施方式
(一)培养基
PDA培养基：土豆200g，葡萄糖20g，琼脂15-20g，加水定容至1L。
LB培养基：10g蛋白胨，5g酵母粉，10g NaCl，加水定容至1L。
(二)试剂配方
STC缓冲液：1.2M山梨糖醇，50mM CaCl2，10mM Tris，pH 7.5-8。
PEG缓冲液：25％PEG 6000，50mM CaCl2，10mM Tris，pH 7.5-8。
表1靶向位点验证PCR引物
Figure BDA0002643556200000031
Figure BDA0002643556200000041
表2tRNA序列
Figure BDA0002643556200000042
Figure BDA0002643556200000051
实施例1：利用CRISPR-Cas9构建黑曲霉可视化单基因编辑重组菌株
CRISPR-Cas9系统包括编码Cas9蛋白的基因(Cas9基因)、sgRNA以及筛选标记。
(1)Cas9表达载体的构建
利用曲霉启动子PglaA(核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示)或Ptef1(核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示)等曲霉强启动子表达Cas9蛋白(核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示)。
利用Vazyme的
Figure BDA0002643556200000053
II One Step Cloning Kit，以pUC19为载体骨架，将曲霉启动子序列、编码Cas9蛋白的基因序列、抗性基因与AMA1(GenBank:X78051.1)序列分两次进行同源重组合成，得到Cas9表达质粒pUC19-Cas9(质粒图谱见图1)。其中，编码Cas9蛋白的基因(如SEQ ID NO.1所示)的N端或C端添加核定位信号NLS序列(CCCAAGAAGAAGCGCAAGGTC)。
(2)sgRNA表达框的构建
利用Pu3启动子、目标基因protospacers序列(见表3)、gRNA backbone序列(核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示)、终止子Tu3构建sgRNA表达框。
表3目标基因protospacers序列表
目标基因 目标基因序列
fwnA AGTGGGATCTCAAGAACTAC
pptA GGCGGGTGTCGATGTACCAC
brnA ACCATGCCAATGGATTCCGG
kusA CGAGCACTGGTAGATGATGA
选择标记包括曲霉中常用的潮霉素B(hygB)、乳清酸核苷-5’-磷酸脱羟酶、乙酰胺酶等具有类似功效的丝状真菌标记。重组质粒中的潮霉素抗性基因由质粒PAN7-1中获得，表达框引物Hyg-F/R见表4，若要选择其他抗性可替换表达框中的hyg进行构建。
表4引物表
引物名称 引物序列
Hyg-F GAATTCCCTTGTATCTCTACACACAG
Hyg-R TGAAGAACGAATACCGCGACATCCAACCCATC
利用Vazyme的
Figure BDA0002643556200000052
II One Step Cloning Kit，以pUC19为载体骨架，与sgRNA表达框重组，构建sgRNA表达质粒(质粒图谱见图2)。
(3)Cas9表达质粒和sgRNA表达框的转化
采用原生质体转化方法将Cas9表达质粒和sgRNA表达框转入宿主：
在PDA培养基中过夜培养黑曲霉菌丝，收集菌丝体，用生理盐水清洗菌丝体三遍；用Lysozyme酶解3h，用四层擦镜纸过滤后制备原生质体；4℃，1000rpm离心收集原生质体，用预冷的STC洗涤原生质体2-3次；取制备好的原生质体100μL加入10μL Cas9表达质粒和10μL sgRNA表达框混匀，加入2mL PEG 6000，在培养基中加入相应抗性进行筛选。30℃培养5-7天，提取转化子的基因组，PCR验证目标基因靶向位点的编辑情况。挑取阳性单菌落转板，每个单菌落转板(即挑取单菌落至新的培养基培养)三次。
以Aspergillus niger CCTCC M 2018881出发菌株(菌株已公开于公开号为CN110438018A的专利申请文件中)的孢子颜色作为对照，观察转化后黑曲霉孢子颜色表型的变化，破坏fwnA或pptA后，孢子颜色由褐色变成白色，破坏brnA后，孢子颜色由褐色变成橄榄色，见图4。破坏无表型变化基因kusA时，菌体表型无变化。孢子颜色变化转化株的基因编辑效率显著提高，其中，颜色突变菌株占14％，颜色突变株中brnA的基因编辑效率为30％，fwnA或pptA的编辑效率达100％；而kusA的编辑效率为4.16％。
实施例2：黑曲霉可视化双靶向基因编辑重组菌株筛选
(1)Cas9表达载体的构建
具体实施方式参见实施例1步骤(1)。
(2)sgRNA表达框的构建
利用Pu3突变启动子(为方便多个sgRNA组装，将与之相关的BsaI位点进行突变，方便后续组装，具体为将核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的Pu3启动子序列的BsaI
(GAGACC)位点突变为ACCCAC)、目标基因protospacers序列pptA、fwnA、brnA(见表1)、amyA序列见表5，利用tRNAGly释放sgRNA表达框、gRNA backbone序列(核苷酸序列如SEQID NO.8所示)、终止子Tu3(核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示)构建sgRNA表达框。
表5目标基因protospacers序列表
目标基因 目标基因序列
amyA TCTCTTCGGCCCTTCATGAG
选择标记包括曲霉中常用的潮霉素B(hygB)、乳清酸核苷-5’-磷酸脱羟酶、乙酰胺酶等具有类似功效的丝状真菌标记。重组质粒中的潮霉素抗性基因由质粒PAN7-1中获得，表达框引物Hyg-F/R见表3，若要选择其他抗性可替换表达框中的hygB进行构建。
利用Vazyme的
Figure BDA0002643556200000071
II One Step Cloning Kit，以pUC19为载体骨架，将曲霉启动子序列、编码Cas9蛋白的基因序列、抗性基因与AMA1序列分两次同源重组至pUC19，得到Cas9表达质粒pUC19-Cas9(质粒图谱见图1)。其中，编码Cas9蛋白的基因(如SEQID NO.1所示)的N端或C端添加核定位信号NLS序列(CCCAAGAAGAAGCGCAAGGTC)。
利用Vazyme的
Figure BDA0002643556200000072
II One Step Cloning Kit，以pUC19为载体骨架，将sgRNA表达框重组至pUC19，构建包含两个protospacers序列的sgRNA表达框的双sgRNA表达质粒PUC19-sgRNA-1质粒，利用tRNAGly进行不同sgRNA的释放。其中sgRNA表达框中包括一个可视化基因的sgRNA和一个无表型基因的sgRNA，可视化基因sgRNA为pptA-sgRNA、fwnA-sgRNA或brnA-sgRNA，另一个无表型基因sgRNA为amyA-sgRNA(质粒图谱见图3)。
(3)Cas9表达质粒和sgRNA表达框的转化
采用原生质体转化方法将Cas9表达质粒、双sgRNA表达框(包括pptA-sgRNA和amyA-sgRNA、或fwnA-sgRNA和amyA-sgRNA、或brnA-sgRNA和amyA-sgRNA中的任意一种)转入宿主，sgRNA直接与tRNA连接，构建得到含双sgRNA表达框的菌株。
在PDA培养基中过夜培养黑曲霉菌丝，收集菌丝体，生理盐水清洗三遍；用Lysozyme酶解3h，四层擦镜纸过滤后制备原生质体；4℃，1000rpm离心收集原生质体，用预冷的STC洗涤原生质体2-3次；取制备好的原生质体100μL加入10μL Cas9表达质粒和10μLsgRNA表达框混匀，加入2mL PEG 6000，在培养基中加入相应抗性进行筛选。30℃培养5-7天，挑白色孢子单菌落转化子进行测序验证。
以Aspergillus niger CCTCC M 2018881出发菌株的孢子颜色作为对照，观察转化后黑曲霉孢子颜色表型的变化，敲除fwnA后，孢子颜色由黑色变成白色，平板上共有4％的单菌落显示出白色表型，直接挑选这些白色单菌落，结果显示，在白色单菌落中，amyA基因双拷贝破坏的纯合转化子占25％，提高了多基因编辑转化子的阳性挑选率。对amyA基因双拷贝进行编辑时不需要使用新的抗性标记，有利于工业生产。
对比例1
利用与实施例2相同的方法，构建amyA基因的单拷贝基因编辑重组菌株，利用相同的方法，培养重组菌菌株至长出单菌落，挑取单菌落并计算其基因编辑效率，结果显示，其基因编辑效率为5％。
实施例3：黑曲霉可视化多靶向基因编辑重组菌株筛选
具体实施方式参见实施例2，区别在于，将实施例2中的启动子后的tRNAGly替换为tRNAAla，第二个tRNA换为tRNAPhe；
利用tRNAAla和tRNAPhe与不同sgRNA相连。一个可视化基因sgRNA表达框为fwnA-sgRNA表达框，另一个无表型基因sgRNA表达框为amyA-sgRNA表达框(质粒图谱见图3)。
以Aspergillus niger CCTCC M 2018881出发菌株的孢子颜色作为对照，观察转化后黑曲霉孢子颜色表型的变化，敲除fwnA后，孢子颜色由黑色变成白色，36％为白色表型转化子，直接挑选这些白色单菌落提高了多基因编辑转化子的阳性挑选率并节约了菌株纯化的时间，其中amyA基因编辑效率为90％。对amyA基因进行编辑时不需要使用新的抗性标记，有利于工业生产。
对比例2
利用与实施例3相同的方法，利用tRNAGly构建fwnA和amyA双基因编辑重组菌株，利用相同的方法，培养重组菌菌株至长出单菌落，挑取单菌落并计算其基因编辑效率，结果显示，6％为白色突变体，其个amyA基因编辑效率为36％。
对比例3
利用与实施例3相同的方法，利用tRNAAla构建fwnA和amyA基因编辑重组菌株，利用相同的方法，培养重组菌菌株至长出单菌落，挑取单菌落并计算其基因编辑效率，结果显示，37％为白色突变体，其个amyA基因编辑效率为70％。
对比例4
利用与实施例3相同的方法，利用tRNAphe构建fwnA和amyA基因的单拷贝基因编辑重组菌株，利用相同的方法，培养重组菌菌株至长出单菌落，挑取单菌落并计算其基因编辑效率，结果显示，15％为白色突变体，其个amyA基因编辑效率为80％。
实施例4：黑曲霉可视化多表型筛选基因编辑重组菌株
具体实施方式参见实施例2，区别在于，将实施例2中的amyA基因替换为pepA或ammA(protospacers序列表见表6)，将实施例2中的启动子后的tRNAGly替换为tRNAAla，第二个tRNA换为tRNAArg；
表6目标基因protospacers序列表
目标基因 目标基因序列
pepA CGGTGTCAAAGTCCAGATGG
ammA CTGCCCCAGGATACTGCTGA
利用tRNAAla和tRNAArg进行不同sgRNA的释放。其中一个可视化基因sgRNA表达框为fwnA-sgRNA，另一个无表型基因sgRNA表达框为pepA-sgRNA或ammA-sgRNA表达框
(质粒图谱见图3B)。
将Cas9表达质粒和sgRNA表达框转入宿主，测序后得到。
以Aspergillus niger CCTCC M 2018881出发菌株的孢子颜色作为对照，观察转化后黑曲霉孢子颜色表型的变化，敲除fwnA后孢子颜色由黑色变成白色，挑取白色菌落，计算基因编辑效率，pepA或ammA基因的编辑效率分别为75％和80％。有利于进行目标基因活性protospacers序列的黑曲霉体内筛选，节约分子操作时间和成本。
实施例5：黑曲霉可视化多表型筛选基因编辑重组菌株
具体实施方式参见实施例2，区别在于，将实施例2中的amyA基因替换为ammA，同时增加第三个amyA-sgRNA(protospacers序列表见表7)用tRNAArg连接，将实施例2中的启动子后的tRNAGly替换为tRNAAla，第二个替换为tRNAPhe。
表7目标基因protospacers序列表
目标基因 目标基因序列
ammA CTGCCCCAGGATACTGCTGA
amyA TCTCTTCGGCCCTTCATGAG
利用tRNAAla，tRNAArg和tRNAPhe进行不同sgRNA的释放。其中一个可视化基因sgRNA为fwnA-sgRNA，另两个无表型基因sgRNA分别为pepA-sgRNA和ammA-sgRNA。
将Cas9表达质粒和sgRNA表达框转入宿主，测序后得到
以Aspergillus niger CCTCC M 2018881出发菌株的孢子颜色作为对照，观察转化后黑曲霉孢子颜色表型的变化，敲除fwnA后孢子颜色由黑色变成白色。优化后的三基因敲除白色转化子中，ammA基因的编辑效率为50％，amyA基因的编辑效率为100％，双基因共编辑的效率为50％。有利于进行多目标基因活性protospacers序列的黑曲霉体内筛选，节约分子操作时间和成本。
实施例6：黑曲霉可视化多表型筛选基因编辑重组菌株
具体实施方式参见实施例2，区别在于，将实施例2中的amyA基因替换为ammA，将实施例2中的启动子后的tRNAGly替换为tRNAAla，第二个tRNAGly替换为tRNAPhe；同时增加一个sgRNA表达框利用tRNAIle进行释放，利用Pu6启动子(核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示)和Tu6终止子(核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示)表达tRNAIle和ammA-sgRNA
利用tRNAAla，tRNAArg和tRNAPhe进行不同sgRNA的释放。其中一个可视化基因sgRNA表达框为fwnA-sgRNA，另两个无表型基因sgRNA为ammA-sgRNA和amyA-sgRNA。
将Cas9表达质粒和sgRNA表达框转入宿主，并进行测序验证。
以Aspergillus niger CCTCC M 2018881出发菌株的孢子颜色作为对照，观察转化后黑曲霉孢子颜色表型的变化，敲除fwnA后孢子颜色由黑色变成白色。优化后的三基因敲除白色转化子中，ammA基因的编辑效率为69％，amyA基因的编辑效率为100％，两个基因共同编辑的效率为69％。有利于进行多目标基因活性protospacers序列的黑曲霉体内筛选，节约分子操作时间和成本。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 江南大学
<120> 一种多靶点编辑重组曲霉菌株的可视化筛选方法
<130> BAA200321A
<150> CN 201910773193.7
<151> 2019-08-21
<160> 24
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 4104
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
atggacaaga agtatagcat cgggctggac attggaacga actcggttgg ttgggctgtg 60
attacggacg aatacaaggt gccatccaag aagtttaagg tcctgggaaa caccgaccgt 120
cactcaatca agaagaatct cattggagcc ctgctcttcg atagtgggga gaccgccgaa 180
gctactcgac tgaagcgaac ggctcgccgg cgttatacac gacgcaagaa tcgcatctgc 240
tacctccagg agattttcag caacgaaatg gctaaggttg atgactcatt ctttcatcga 300
ctcgaagaaa gtttcttggt cgaggaggat aagaagcacg agcgccatcc gatctttggt 360
aacattgtgg atgaggttgc ctatcacgaa aagtacccaa ctatctatca tcttcgtaag 420
aagctggtcg atagcacgga caaggctgat ttgcgactta tctacctggc actcgcgcac 480
atgattaagt tccgcggcca ttttcttatc gagggtgacc tgaaccccga taattctgac 540
gttgataagc tcttcatcca gttggtccaa acctacaatc agctgtttga ggaaaaccct 600
attaatgcat ctggcgtgga cgccaaggct atcctttcgg cgcgcctgtc taagtcgcgg 660
cgtttggaga accttatcgc acaactcccc ggcgaaaaga agaacggcct cttcggtaat 720
ttgattgcgt tgtcacttgg tctgactcct aacttcaaga gtaattttga cctggcagag 780
gatgcgaagc tccagttgtc taaggatacg tatgatgacg atctcgacaa cttgcttgcc 840
caaatcggtg accagtacgc tgatcttttc ctggccgcta agaatctctc agatgcaatc 900
ctgctcagtg acattttgcg ggtcaacacc gagattacta aggcccccct gtcagctagt 960
atgatcaagc ggtatgatga gcaccatcag gacctcacct tgcttaaggc cctcgtgcgt 1020
cagcaattgc ctgagaagta taaggaaatc ttctttgacc aatccaagaa cggatacgca 1080
gggtatattg atggcggtgc gagccaggag gaattctaca agtttatcaa gccgattttg 1140
gagaagatgg acggcactga ggaactgctc gtcaagctga atcgcgaaga tttgcttcgt 1200
aagcaacgaa cgttcgacaa cggctccatc ccgcaccaga ttcatctggg cgagctccac 1260
gccatccttc gacgccagga agatttctac ccatttctga aggacaaccg tgagaagatc 1320
gaaaagattc ttacattccg aatcccctac tatgtgggac ctttggcccg tgggaattcc 1380
cgatttgctt ggatgacccg aaagagcgag gaaaccatca ctccgtggaa cttcgaggaa 1440
gtcgtggaca agggtgcatc cgcgcagagc ttcattgagc ggatgaccaa ttttgataag 1500
aaccttccga atgaaaaggt cctgccaaag cattcgctgc tctacgagta tttcaccgtg 1560
tataacgaac tgactaaggt caagtacgtg acggagggaa tgcggaagcc agccttcctc 1620
tcaggggaac aaaagaaggc tatcgtcgat ttgcttttta agaccaatcg taaagtgact 1680
gttaagcagc tgaaggagga ttatttcaag aagattgaat gtttcgactc cgtcgagatc 1740
agcggcgtgg aagatcgctt taacgcttcc ctcggtacct accacgacct gctcaagatc 1800
attaaggaca aggatttcct cgataacgag gaaaatgagg acatcttgga agatattgtc 1860
ctcacgttga cactttttga ggaccgcgaa atgatcgagg aacggctcaa gacatatgcc 1920
catttgttcg acgataaggt gatgaagcag ctgaagcggc gtcgatacac cggatggggt 1980
cgccttagcc ggaagctgat caacggcatt cgagataagc aatctggtaa gactatcttg 2040
gatttcctta agtcggacgg cttcgccaac cgcaatttta tgcagcttat tcacgacgat 2100
tccctgacgt tcaaggagga catccagaag gcacaagtct caggacaagg ggattccctg 2160
cacgagcata tcgccaacct ggctggatcc ccggcgatca agaaggggat tcttcagacc 2220
gtcaaggttg tcgacgagct ggtcaaggtg atgggccgtc ataagccaga aaacatcgtg 2280
attgagatgg cccgagaaaa tcagaccact caaaagggtc agaagaacag ccgcgagcgg 2340
atgaagcgga tcgaggaagg cattaaggaa cttggttctc agatcctgaa ggagcaccct 2400
gttgaaaaca cacagctcca aaatgagaag ctgtatctct actatttgca aaatggacgc 2460
gacatgtacg tcgatcagga gctcgacatt aaccggttgt cggactacga tgttgaccat 2520
atcgtcccgc aatccttcct taaggacgat agcattgata acaaggtgct gactcgctca 2580
gataagaacc ggggcaagtc cgacaatgtt ccaagcgagg aagtggttaa gaagatgaag 2640
aactactggc gccaattgct taatgccaag ctcatcacac agcgcaagtt tgacaacttg 2700
accaaggccg agcggggagg gctgagtgaa ctcgataagg ctggcttcat caagcgtcaa 2760
ctcgtggaga cgcgacagat cacaaagcac gttgctcaga ttctggactc ccggatgaac 2820
acaaagtacg acgagaatga taagctcatc cgtgaagtta aggtcattac cctcaagtct 2880
aagttggtgt cggatttccg caaggacttc caattttata aggttcggga gatcaacaat 2940
tatcaccatg cacatgatgc gtacctcaac gcagtcgtgg gaactgcgct catcaagaag 3000
tatcccaagt tggagtccga attcgtctac ggggattata aggtttacga cgtccgcaag 3060
atgatcgcca agagtgagca ggaaattggc aaggccacgg ctaagtattt cttttactcc 3120
aacatcatga atttctttaa gacggagatc acactcgcca atggagaaat ccgtaagcga 3180
cctttgattg agaccaacgg cgagactggt gaaatcgttt gggataaggg gcgcgacttc 3240
gctaccgtgc ggaaggttct gagcatgccg caagtcaata tcgtcaagaa aaccgaggtg 3300
cagacaggcg gtttctctaa ggaatcgatt cttccaaagc gtaactctga caagctgatc 3360
gctcgaaaga aggattggga ccccaagaag tatggagggt tcgattctcc tacagtggca 3420
tactcggttc tcgttgtcgc gaaggttgag aagggaaagt ctaagaagct gaagtcggtc 3480
aaggaactgc tcgggatcac cattatggag cgctccagct tcgaaaagaa tcccatcgac 3540
tttctcgagg ccaagggcta taaggaagtc aagaaggatc ttatcattaa gctgcctaag 3600
tactctttgt tcgagcttga aaacggtcga aagcgaatgc tcgcatcggc aggagagttg 3660
cagaagggga atgaattggc acttccctca aagtacgtga acttcctgta tctcgcgtcc 3720
cactacgaga agctgaaggg tagccctgag gacaacgaac agaagcaact ttttgttgag 3780
caacacaagc attatctgga tgagatcatt gaacagattt cagagttcag taagcgcgtc 3840
atcctcgccg atgctaatct cgacaaggtg ttgtcggcct acaacaagca ccgtgacaag 3900
ccgatccgag agcaggctga aaatatcatt catctgttca ccctcactaa cttgggagca 3960
ccagcagcgt tcaagtattt tgatacgaca atcgaccgta agcgatacac gtccacaaag 4020
gaggtgcttg atgcgaccct gattcatcaa tccatcactg ggctctatga aacccgtatc 4080
gaccttagtc aactgggggg cgac 4104
<210> 2
<211> 468
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gatcacatag atgctcggtt gacaggacca cctatagcaa gtactttgta ggaggttctc 60
ctaacgcttg gcttcaaatc caatcaggat atcagtgagt tactgtttgt catcgcatcc 120
tcatgaagtc gctcaacagc cactgagaag caaatatttg ggagaccatc cctgatgttg 180
aaattttacg ctggagccca ttcaccggtg agctcgggga cagtctggcc agtggagcgg 240
aaaatcttca actaactctg attggtacca caggtagccc cacagaacaa accgagcaaa 300
catgaaaatt ttcgcttgag gttagcgcac tcgctagcgc ctgcccgcaa atataaaagg 360
ccccgaaatc ccatgcattt tggaaatcaa gcgactctac gtatgtcatc cccctcccta 420
cctttgggaa aacctctcaa ctgcaagtca gaacattttg ctaacagc 468
<210> 3
<211> 508
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
tggttcactt ctctttagaa atcaactgtg ggttttgctt tttgcttcat tctctttgtc 60
ttctccatct ttgatcaaat cctggacttt ctcaatcccc agctaattca atcatagtca 120
gttttctatt tttattattt ctttttcttt tgaaatgtga ttaacaacca gtccgttata 180
tatcttgtac ccagattacg cccaactcgt gctcctcagc cacaaagata ctcaattgat 240
agccaagata catacatacc acaaagtaag gactccatgc attgagtatt actcatcgta 300
ttctagacta ctccaaaact cagcacatag acaaacaata cgaacctcgt ctaggggtga 360
ttcagaggcg gcaaagcggg gttttcgcat ttgatgttcc tggcacttat gtaagcccac 420
gcttcccgct caactaaacc atcagccaat cagactgctc agatttatct tttgaagggt 480
aaataaatca ttgtaaagaa gaacaagt 508
<210> 4
<211> 226
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
tgtcaatttt tacacttgat gttggtgtaa tcaggcgatc agagtttgct caaattctct 60
cttgttttag attctgaaga atataatttt tacatgacta gttcatttta cttccaagta 120
gactatttgt agattgagat tgccgtcaac tttattcata gaatcacatt aaattgctca 180
ttgacctgca tgtctatgca cacattcaca tctatcttct cagggt 226
<210> 5
<211> 134
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 5
tttttgagca tttatcagct tgatatagag gtaggaatgt atggaggtgc agaatggcta 60
ttttgttatt ggagcgggtt cgaaacggag ggcaggagac tttttctaaa tacgtcacgt 120
gatatagagc tgct 134
<210> 6
<211> 886
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 6
cgagacagca gaatcaccgc ccaagttaag cctttgtgct gatcatgctc tcgaacgggc 60
caagttcggg aaaagcaaag gagcgtttag tgaggggcaa tttgactcac ctcccaggca 120
acagatgagg ggggcaaaaa gaaagaaatt ttcgtgagtc aatatggatt ccgagcatca 180
ttttcttgcg gtctatcttg ctacgtatgt tgatcttgac gctgtggatc aagcaacgcc 240
actcgctcgc tccatcgcag gctggtcgca gacaaattaa aaggcggcaa actcgtacag 300
ccgcggggtt gtccgctgca aagtacagag tgataaaagc cgccatgcga ccatcaacgc 360
gttgatgccc agctttttcg atccgagaat ccaccgtaga ggcgatagca agtaaagaaa 420
agctaaacaa aaaaaaattt ctgcccctaa gccatgaaaa cgagatgggg tggagcagaa 480
ccaaggaaag agtcgcgctg ggctgccgtt ccggaaggtg ttgtaaaggc tcgacgccca 540
aggtgggagt ctaggagaag aatttgcatc gggagtgggg cgggttaccc ctccatatcc 600
aatgacagat atctaccagc caagggtttg agcccgcccg cttagtcgtc gtcctcgctt 660
gcccctccat aaaaggattt cccctccccc tcccacaaaa ttttctttcc cttcctctcc 720
ttgtccgctt cagtacgtat atcttccctt ccctcgcttc tctcctccat ccttctttca 780
tccatctcct gctaacttct ctgctcagca cctctacgca ttactagccg tagtatctga 840
gcacttctcc cttttatatt ccacaaaaca taacacaacc ttcacc 886
<210> 7
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 7
cctctcgtat gcagaggaaa tctcccctga tcttccgaac tggtcgtacc tggcgaccta 60
tgactatggc accccagttc tggggacctt ccacggaagt gacctgctgc aggtgttcta 120
tgggatcaag ccaaactatg cagctagttc tagccacacg tactatctga gctttgtgta 180
tacgctggat ccgaactcca accgggggga gtacattgag tggccgcagt ggaaggaatc 240
gcggcagttg atgaatttcg gagcgaacga cgccagtctc cttacggatg atttccgcaa 300
cgggacatat gagttcatcc tgcagaatac cgcggcgttc cacatctgat gccattggcg 360
gaggggtccg gacggtcagg aacttagcct tatgagatga atgatggacg tgtctggcct 420
cggaaaagga tatatgggga tcatgatagt actagccata ttaatgaagg gcatatacca 480
cgcgttggac ctgcgttata gcttcccgtt agttatagta ccatcgttat accagccaat 540
caagtcacca cgcacgaccg gggacggcga atccccggga attgaaagaa attgcatccc 600
aggccagtga ggccagcgat tggccacctc tccaaggcac agggccattc tgcagcgctg 660
gtggattcat cgcaatttcc cccggcccgg cccgacaccg ctataggctg gttctcccac 720
accatcggag attcgtcgcc taatgtctcg tccgttcaca agctgaagag cttgaagtgg 780
cgagatgtct ctgcaggaat tcaagctaga tgctaagcga tattgcatgg caatatgtgt 840
tgatgcatgt gcttcttcct tcagcttccc ctcgtgcaga tgaggtttgg ctataaattg 900
aagtggttgg tcggggttcc gtgaggggct gaagtgcttc ctccctttta gacgcaactg 960
agagcctgag cttcatcccc agcatcatta cacctcagca 1000
<210> 8
<211> 76
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 8
gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt 60
ggcaccgagt cggtgc 76
<210> 9
<211> 91
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 9
gcccgggtgg tctagtggta tgattctcgc ttagggatac aaacccaagc atatctgcga 60
gaggtcccgc gttcgatccg cggctcgggc c 91
<210> 10
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 10
ggggctgtgg tttagtggta taatattccc ttagcatggg agaggtccgg ggttcgattc 60
cccgcagctc ca 72
<210> 11
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 11
acaaccatac gttaattggt aaactagtcg tcttccaaac gataattgtg agttcgaacc 60
tcactggttg ta 72
<210> 12
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 12
gcttctatgg ctcagttggt agagcgcatg actagtaatc atgaggtccg cggttcgaat 60
ccgcgtggaa gca 73
<210> 13
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 13
ggccggatgg tgtagttggt tatcacgtat cgttaacacc gataaggtcc tgggatcgag 60
ccccagtctg gtca 74
<210> 14
<211> 81
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 14
gtcagtgtgg ccgagtggtt aaggcgatag actagaaatc tattgggttc gcccgcacag 60
gttcgagtcc tgtcgctgac g 81
<210> 15
<211> 112
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ggcaagatgg ccgagttggt ccaaggcgtc aggttaaggt ccaccttaat acccagcttc 60
acagcttcct gatcatcgta agatggcgtg ggttcgaatc ccactcttgt ca 112
<210> 16
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ggggcaatgg cgcatctggg agcgcgtcag actgaagatc tggaggtggc cggttcaagc 60
ccggcttgcc cca 73
<210> 17
<211> 73
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
gcccggctag ctcaatcggt agagcgtgag actcttaatc tcaaggctgc gggttcgagc 60
cccgcgttgg gct 73
<210> 18
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 18
tccgatatgg tgtagtggct aacatcgccg tctctcacac ggcagccggg ggttcgattc 60
cccctatcgg ag 72
<210> 19
<211> 74
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 19
ggtcccatag ctcagttggt tagagcgtga cgctaataac gtcaaagtcg agggttcgag 60
cccctctggg acca 74
<210> 20
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 20
ggcctgctgg cccaatggta aggcgcttga ctacggatca agagattgca ggttcgagtc 60
ctgcgtaggt ca 72
<210> 21
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 21
agcatgttag ctcaggggaa gagcgccggg ctcataaccc ggaggtccct ggatcgaaac 60
caggacatgc ta 72
<210> 22
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 22
ggttgtgtag tgtaatggtc atcactctgg attctgattc cagcaatccc ggttcgatcc 60
cgggcacgac ct 72
<210> 23
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 23
gggccggtag ctcaggggta gagcgtggga ctgcagatct taaggtcacg cgttcaaatc 60
gcgttcggcc ct 72
<210> 24
<211> 6680
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
atggagggtc catctcgtgt gtaccttttt ggagaccaga ccagcgacat cgaagctggc 60
ctgcgccgtc tgctccaagc gaagaatagt accattgtcc agtccttttt ccagcaatgc 120
ttccatgcaa ttcgtcaaga gatcgcgaag ctcccgccgt ctcatcggaa gctcttccca 180
cgcttcacga gcatcgttga tctcctttcc aggagtcgtg aatcaggtcc tagccctgtc 240
ctggagagtg cattgacatg catctaccaa ttgggttgtt tcattcagta agtcaatgag 300
ttaccatcta tacttgacaa gtctgaccag ccttcagctt ttacggggat cttggacatg 360
actaccctac accctccaac agccatcttg ttggcctgtg cactggtgtt ctgagctgca 420
cggctgtaag ttgcgccaga aatgttggag agcttattcc agctgcagtg gaatcggttg 480
taattgcact gcgactggga atctgcgttt ttcgagttcg agaactggtg gactccgccg 540
attccgagtc aacatgctgg tcagcgttgg tttctggaat cagtgaagca gaggctagcc 600
acctgatcga cgagtacagt agtaagaagg tgtgctcttc caactttaaa cccccgcatt 660
gtgggatgct gacagatgca ggctactccg ccttcttcga aaccgtatat cagcgcggta 720
agctctaatg gcgttactgt cagcgcacca cctacggtac ttgatgaatt cgtcgagacc 780
tgcatttcca agaattacaa gccagtgaag gcccctattc atggcccgta ccatgcgcca 840
catctgtatg atgataagga tatcgaccgc atcctgcagc agtcctctgc tctagaagga 900
ctgaccggct gttcacccgt tattcccatc atctccagta acactggaaa gccgatcaag 960
gccaagtcca tcaaagatct cttcaaggtc gcactggagg agatactcct acgacgacta 1020
tgctgggaca aggtcacgga gtcctgcaca tcagtctgca agaccggcac aaaccactct 1080
tgcaaattgt ttccgatctc gagtagcgcc actcaaagtt tgttcacagt cctcaagaag 1140
gccggtgtga gcatcagctt ggagactggg gtaggagaga tcgcgacgaa cccagaaatg 1200
cggaacctta ctggcaaggc agaaaattca aagattgcta tcattggtat gtctggaaga 1260
tttcctgact cggatggtac ggagagcttc tggaacctcc tgtacaaagg actcgacgta 1320
catcgcaaag tccccgcaga ccgttgggac gttgatgccc acgtcgacat gaccgggtca 1380
aagagaaaca caagcaaagt ggcttacggt tgctggatca acgaacccgg cctgtttgac 1440
ccccgattct tcaacatgtc gcctcgggaa gcactccaag cagatcctgc acaacgtctt 1500
gcgttgctta cagcgtacga ggctctcgag atggctggct tcatcccgga tagctctcca 1560
tcgacgcaga gggaccgtgt gggtattttc tacggaatga ccagtgacga ctaccgtgag 1620
atcaacagcg gccaggacat tgatacctat ttcatccctg gcggtaaccg agcatttacg 1680
ccgggtcgga taaactacta cttcaaattt agcggcccca gtgtgagcgt tgacacagcg 1740
tgctcgtcta gtcttgctgc tatccacatg gcttgcaatt cgatctggag aaatgactgc 1800
gatgccgcca tcactggagg tgtgaacatt ctgaccagcc ctgacaacca cgccggtctg 1860
gatcggggcc atttcctgtc caccactggc aactgtaaca cctttgatga cggcgccgac 1920
ggctactgta gagcggacgg agttggaagc atcgttttga agcggcttga agatgccgag 1980
gccgacaacg acccgatcct ggccgtcatc aacggtgctt acaccaacca ctcggcggag 2040
gccgtgtcaa tcactcgtcc ccatgttggc gcgcaagcat tcatcttcaa caagctgctc 2100
aatgatgcga atatcgaccc taaggacgtg agctacgtgg aaatgcatgg cactggaact 2160
caagcaggtg atgcagtcga aatgcagtcc gttcttgacg tcttcgcacc agactaccgc 2220
cggggtcccg gtcaatcgct tcatatcggt tctgccaagg caaacattgg acacggtgaa 2280
tccgcatcag gagtgactgc tcttgtcaag gtcctcctaa tgatgagaga gaacatgatt 2340
cctcctcatt gtggtatcaa gaccaagatc aattccaatt tcccgacaga cttggcgaag 2400
cgcaatgttc atatcgcctt ccaacccact ccctggaatc ggccagcttc aggaaagcgg 2460
cgaactttcg tcaacaactt ttctgctgct ggtggtaaca ctgctcttct actggaagat 2520
gctcccatac cggaacgcca agggcaggac cccaggtcgt tccatttggt ctccgtgtca 2580
gcaagatccc agtctgcatt gaagaacaac gtcgaagctc tggtgaagta cattgactct 2640
cagggcaagt cctttggtgt gaaagagact gaattccttc caaacctggc gtacacgacc 2700
accgcacgcc gtatccacca tcccttccgt gtcattgcgg ttggagcgaa cctacaatca 2760
ctgcgtgact cgctgcatgg tgctttgcac cgtgagacat ataccccagt tccctcaacg 2820
gctcctggta ttggtttcgt cttcaccggc caaggagccc aatactccgg aatgggcaag 2880
gaactctacc gcagttgttt ccaattccga accaccattg agcattttga ctgcatcgca 2940
agaagccagg gccttccttc tatccttcct cttgtcgatg gaagcgtggc tgtcgaagaa 3000
cttagccctg tcgtggtaca agtgggaact acctgtgtac aaatggctct agtaaattac 3060
tggactgctc tgggtgtgaa gccggccttt atcatcggac acagtcttgg agactatgca 3120
gcccttaaca cggccggtgt tctatccacc agcgatacaa tctatctttg tggccggcgt 3180
gctcagttgc tgacgaagga atgcaagatt gggacacatt cgatgctggc catcaaggcg 3240
tccctggcag aggtcaaaca tttcctcaga gacgagctcc acgaagtctc ttgtgttaac 3300
gcacctgcgg agaccgtcgt cagcggcctt gtcgctgata tcgacgagtt ggctcagaaa 3360
tgctccacag agggtttgaa gtcaaccaag ctcaaggttc cttacgcgtt ccattcctct 3420
caggttgatc ctatcttgga ggccttcgaa gatattgccc aaggtgtcac cttccacaag 3480
ccgacaacac ctttcgtctc agccctgttc ggggaagtga tcaccgatgc taactgggag 3540
tgtctcggcc ccaagtacct gcgcgatcat tgcagaaaga cggtcaactt ccttggcggc 3600
gtggaggcta cgaggcatgc gaagctgacc aatgacaaga ctctgtgggt tgagatcggc 3660
tcacatacca tttgctctgg aatgatcaaa gcaactcttg gaccgcaagt tacaacggtt 3720
gcatctctac gccgcgaaga agatacctgg aaggtccttt cgaacagtct tgcgagcctt 3780
catctggcgg gtattgatat caactggaag caatatcacc aggactttag ctcctctctc 3840
caggtcctcc gcctcccagc ctacaagtgg gatctcaaga actactggat tccctatacc 3900
aacaacttct gcctgagcaa gggcgctcca gttgcgacag tagcggcagg gccacagcat 3960
gagtacctga caaccgcggc tcagaaggtc attgagactc gaagtgatgg agcaacagct 4020
acagtcgtga tagagaacga cattgctgat cccgagctca accgcgtcat tcaaggccat 4080
aaggtcaacg gtactgcttt gtgtccctca gtaagttacc gctcttgccc aacgactgcg 4140
ttaagattcg tactaatcag gatatagtca ctatatgccg acatctctca aacgcttgca 4200
gagtatctca tcaaaaagta caagcctgag tacgacggac ttggactgga tgtgtgtgag 4260
gtcacagtgc cacgaccact gattgcgaaa ggcggacagc agctctttag agtatctgcg 4320
acagcggatt gggcggagaa gaagacaacc cttcagatat attcagtcac tgcggagggg 4380
aagaagacgg ctgaccacgc aacttgcact gtccgattct ttgactgcgc tgctgcggag 4440
gcggaatgga aacgagtttc ctaccttgtc aagaggagca ttgaccgact gcatgatatc 4500
gccgaaaatg gtgacgctca ccgtcttggt agaggcatgg tttacaaact cttcgctgcc 4560
ttggttgatt atgacgacaa cttcaagtcc attcgcgagg ttattcttga cagtgaacag 4620
cacgaagcga ctgcacgcgt caagttccaa gcaccacaag gcaatttcca ccgaaacccg 4680
ttctggattg acagttttgg acacctgtct gggttcatca tgaacgcaag cgatgcaacc 4740
gactccaaga accaggtctt tgtcaatcac ggatgggact ccatgcgttg tttgaagaag 4800
ttctcgcctg atgtcaccta caggacttat gttagaatgc agccttggaa agactccatc 4860
tgggctggtg atgtctacgt tttcgatggg gatgatatcg ttgcggtgta tggtgcagtc 4920
aaggtgagtt cggcccgcgc tcagttgcat aagattcaag gtgctaatca ttggtgtcac 4980
agttccaagc cttatcacgc aagattctcg atacggtcct acctccagtt ggggcttcga 5040
agggccccgc cagaccagcc gctagcgctc agaaggcggc ccctgctgct gctgccagca 5100
agagtcgtgc tagcgccccg gccccggcga agcctgctgc taagcccagc gccccaagct 5160
tggtcaaacg ggcacttacc atcctcgcag aggaagtggg tctgtctgaa tccgagatta 5220
cggatgatct ggtcttcgca gactacggtg tggactccct tctttcgttg acggtcacgg 5280
gcaggtatcg tgaagagctg gatatcgatc tcgaatcctc catcttcatc gaccagccga 5340
ccgtgaaaga cttcaagcag ttcttggccc caatgagcca gggagaagcc agcgatgggt 5400
ccaccagtga cccagagtct agtagctcct tcaatggtgg ctcttcaaca gacgagtcca 5460
gtgctgggtc ccctgtcagc tcaccaccaa atgagaaggt tacgcaggtc gagcagcatg 5520
ctacgataaa ggagattcgc gccattttgg ccgatgagat tggtgttacg gaggaggagc 5580
tgaaggacga tgagaacttg ggagagatgg ggatggactc tctgctttcg cttacggtgc 5640
ttggtaggat ccgtgagaca ttggatctgg atctaccggg cgagttcttc atcgagaatc 5700
aaactctgaa tgacgtggag gatgcattgg gcctcaaacc caaggcagct cctgcgcctg 5760
cgcctgcgcc tgctcccgta cccgcacccg tgtccgcgcc catattgaag gagcctgtcc 5820
ccaacgcaaa ctctaccatc atggcccggg cgagcccgca ccctcgatca acctccattc 5880
tgttgcaagg aaacccgaaa accgcgacca agaccctgtt cctgttccct gatgggtctg 5940
gctccgcaac atcgtatgca accattcccg gagtgtcccc ggacgtgtgt gtctacggat 6000
tgaactgccc gtacatgaag actccagaga agctcaagta tccccttgct gagatgacat 6060
tcccctatct ggccgagatc cgccgcagac agcccaaggg cccgtacaac ttcggtggat 6120
ggtctgcagg tggtatttgc gcctatgatg ccgctcgcta cctaatcctt gaagagggcg 6180
aacaggttga ccgattgctt cttcttgact cgcccttccc cattggctta gagaagttgc 6240
ccactcggct gtacggcttc atcaactcaa tgggtctctt tggtgaaggc aacaaggctc 6300
ccccggcctg gttgctccct catttcctgg ccttcattga ttccctcgat acctacaagg 6360
ccgtccccct cccctttgac gatccgaagt gggccaagaa gatgccaaag acattcatgg 6420
tctgggccaa ggacggtatc tgcagcaagc cggatgaccc gtggcccgag ccggacccgg 6480
acggcaagcc ggacacgaga gagatggtct ggctcctcaa gaaccggacc gacatgggac 6540
ccaacaagtg ggacacactc gtcgggcccc aaaacgtcgg tggaatcact gtgatagagg 6600
gtgcgaatca tttcaccatg actttgggac ccaaggctaa agaattgggc tcgttcattg 6660
gcaacgccat ggccaattaa 6680

Claims (10)

1.一种可视化筛选曲霉中基因编辑菌株的方法，其特征在于，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，同时敲除曲霉中的基因(a)和(b)；其中，(a)为影响孢子颜色变化的基因；(b)为敲除前后曲霉表型不变的基因。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述影响孢子颜色变化的基因包括fwnA、pptA、brnA；所述fwnA的核苷酸序列如SEQ ID NO.24所示，所述pptA的Gene ID:4985743，所述brnA的Gene ID:4987395。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述敲除前后曲霉表型不变的基因包括但不限于amyA、ammA、pepA、kusA。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述amyA的Gene ID:4980947，所述ammA的Gene ID:4984565，所述pepA的Gene ID:4987328，所述kusA的Gene ID:4987871。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述曲霉包括黄曲霉、黑曲霉、烟曲霉、杂色曲霉、构巢曲霉。
6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，sgRNA利用曲霉内源的tRNA释放；所述内源tRNA包括tRNAAla，tRNAArg，tRNACys，tRNAIle，tRNALeu，tRNALys，tRNAMet，tRNAPhe，tRNASer，tRNAThr，tRNAVal，tRNAGlu，tRNAPro，tRNAGlu，tRNAGln，tRNAGly。
7.一种用于曲霉中基因敲除可视化的系统，其特征在于，所述系统包括编码Cas9蛋白的基因、sgRNA表达框以及筛选标记；所述sgRNA表达框上含有影响孢子颜色变化的基因的靶序列，和不影响曲霉表型的基因的靶序列。
8.如权利要求7所述的系统，其特征在于，sgRNA利用曲霉内源的tRNA释放；所述内源tRNA包括tRNAAla，tRNAArg，tRNACys，tRNAIle，tRNALeu，tRNALys，tRNAMet，tRNAPhe，tRNASer，tRNAThr，tRNAVal，tRNAGlu，tRNAPro，tRNAGlu，tRNAGln，tRNAGly。
9.一种提高曲霉基因编辑筛选效率的方法，其特征在于，是利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，同时敲除曲霉中的基因(a)和(b)；其中，(a)为影响孢子颜色变化的基因；(b)为敲除前后曲霉表型不变的基因；所述影响孢子颜色变化的基因包括fwnA、pptA、brnA；所述敲除前后曲霉表型不变的基因包括但不限于amyA、ammA、pepA、kusA。
10.权利要求1-6所述方法，或权利要求7或8所述系统，或权利要求9所述方法在曲霉基因编辑中的应用。
CN202010847441.0A 2019-08-21 2020-08-21 一种多靶点编辑重组曲霉菌株的可视化筛选方法 Active CN112410234B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910773193 2019-08-21
CN2019107731937 2019-08-21

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN112410234A true CN112410234A (zh) 2021-02-26
CN112410234B CN112410234B (zh) 2022-08-23

Family

ID=74659940

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010847441.0A Active CN112410234B (zh) 2019-08-21 2020-08-21 一种多靶点编辑重组曲霉菌株的可视化筛选方法

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20220177925A1 (zh)
CN (1) CN112410234B (zh)
WO (1) WO2021032180A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110438018A (zh) * 2019-08-21 2019-11-12 江南大学 一种快速构建曲霉重组菌株的方法
CN117385024A (zh) * 2023-11-29 2024-01-12 梅州市人民医院(梅州市医学科学院) 一种lncRNA标志物及其在制备诊断、筛查或评估急性冠状动脉综合征的产品中的应用

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113667688A (zh) * 2021-09-21 2021-11-19 江苏医药职业学院 一种长梗木霉质粒载体及其构建方法和应用

Citations (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106480036A (zh) * 2016-11-30 2017-03-08 华南理工大学 一种具有启动子功能的dna片段及其应用
WO2017037304A2 (en) * 2016-07-28 2017-03-09 Dsm Ip Assets B.V. An assembly system for a eukaryotic cell
CN106520824A (zh) * 2016-09-30 2017-03-22 北京大北农科技集团股份有限公司 多靶点编辑系统及其用途
WO2017189589A1 (en) * 2016-04-25 2017-11-02 Isp Investments Llc An antimicrobial composition, process for preparing the same and method of use thereof
CN107475256A (zh) * 2017-08-01 2017-12-15 西南大学 一种基于内源tRNA加工系统的多靶序列sgRNA表达载体及其在植物基因编辑中的应用
WO2018083128A2 (en) * 2016-11-02 2018-05-11 Wageningen Universiteit Microbial genome editing
WO2018127611A1 (en) * 2017-04-06 2018-07-12 Dsm Ip Assets B.V. Self-guiding integration construct (sgic)
CN108738328A (zh) * 2015-01-06 2018-11-02 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于丝状真菌宿主细胞的crispr-cas系统
KR20190104343A (ko) * 2016-12-14 2019-09-09 바게닝겐 유니버시테이트 열안정성 cas9 뉴클레아제
CN110438018A (zh) * 2019-08-21 2019-11-12 江南大学 一种快速构建曲霉重组菌株的方法
CN111971063A (zh) * 2018-04-06 2020-11-20 4阵营疗法公司 通过靶向调节基因信号传导网络治疗疾病

Patent Citations (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN108738328A (zh) * 2015-01-06 2018-11-02 帝斯曼知识产权资产管理有限公司 用于丝状真菌宿主细胞的crispr-cas系统
WO2017189589A1 (en) * 2016-04-25 2017-11-02 Isp Investments Llc An antimicrobial composition, process for preparing the same and method of use thereof
WO2017037304A2 (en) * 2016-07-28 2017-03-09 Dsm Ip Assets B.V. An assembly system for a eukaryotic cell
CN106520824A (zh) * 2016-09-30 2017-03-22 北京大北农科技集团股份有限公司 多靶点编辑系统及其用途
WO2018083128A2 (en) * 2016-11-02 2018-05-11 Wageningen Universiteit Microbial genome editing
CN106480036A (zh) * 2016-11-30 2017-03-08 华南理工大学 一种具有启动子功能的dna片段及其应用
KR20190104343A (ko) * 2016-12-14 2019-09-09 바게닝겐 유니버시테이트 열안정성 cas9 뉴클레아제
JP2020505000A (ja) * 2016-12-14 2020-02-20 ヴァーヘニンゲン ユニヴェルシテット 熱安定性ｃａｓ９ヌクレアーゼ
WO2018127611A1 (en) * 2017-04-06 2018-07-12 Dsm Ip Assets B.V. Self-guiding integration construct (sgic)
CN107475256A (zh) * 2017-08-01 2017-12-15 西南大学 一种基于内源tRNA加工系统的多靶序列sgRNA表达载体及其在植物基因编辑中的应用
CN111971063A (zh) * 2018-04-06 2020-11-20 4阵营疗法公司 通过靶向调节基因信号传导网络治疗疾病
CN110438018A (zh) * 2019-08-21 2019-11-12 江南大学 一种快速构建曲霉重组菌株的方法

Non-Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CEN LI等: "Visualized Multigene Editing System for Aspergillus niger", 《ACS SYNTH. BIOL.》 *
LETIAN SONG等: "Efficient genome editing using tRNA promoter-driven CRISPR/Cas9 gRNA in Aspergillus niger", 《PLOS ONE》 *
THOMAS R. JØRGENSEN等: "The molecular and genetic basis of conidial pigmentation in Aspergillus niger", 《FUNGAL GENETICS AND BIOLOGY》 *
张驰等: "曲霉高效基因编辑技术研究进展", 《菌物学报》 *
朱萌萌等: "复合诱变选育耐高温高产葡萄糖酸盐的黑曲霉菌株", 《中国酿造》 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110438018A (zh) * 2019-08-21 2019-11-12 江南大学 一种快速构建曲霉重组菌株的方法
CN117385024A (zh) * 2023-11-29 2024-01-12 梅州市人民医院(梅州市医学科学院) 一种lncRNA标志物及其在制备诊断、筛查或评估急性冠状动脉综合征的产品中的应用
CN117385024B (zh) * 2023-11-29 2024-04-19 梅州市人民医院(梅州市医学科学院) 一种lncRNA标志物及其在制备诊断、筛查或评估急性冠状动脉综合征的产品中的应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN112410234B (zh) 2022-08-23
US20220177925A1 (en) 2022-06-09
WO2021032180A1 (zh) 2021-02-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN112410234B (zh) 一种多靶点编辑重组曲霉菌株的可视化筛选方法
Zwiers et al. Efficient Agrobacterium tumefaciens-mediated gene disruption in the phytopathogen Mycosphaerella graminicola
JP4307563B2 (ja) 糸状菌、特にアスペルギルス属に属する糸状菌のアグロバクテリウム媒介性形質転換
Fitzgerald et al. Agrobacterium and PEG-mediated transformation of the phytopathogen Venturia inaequalis
KR20170087521A (ko) 진균 게놈 변형 시스템 및 사용 방법
EP3831948B1 (en) Recombinant expression vector applicable to rapid screening for recombinant strain and application
CN110438018B (zh) 一种快速构建曲霉重组菌株的方法
Han et al. An efficient Agrobacterium-mediated transformation method for aflatoxin generation fungus Aspergillus flavus
JP2021521821A (ja) 粘性が低下した表現型を含む糸状菌株
Diener et al. DLH1 is a functional Candida albicans homologue of the meiosis-specific gene DMC1
JP2011087596A (ja) マグナポルセにおける機能的遺伝子とインパラトランスポゾンとを含む、真菌における突然変異誘発用のポリヌクレオチド
WO1999032641A1 (en) A process for site-directed integration of multiple copies of a gene in a mould
CN110592073A (zh) 一种基于crispr技术定向遗传改造米曲霉基因的方法
AU7509194A (en) Production and application of transgenic mushroom mycelium and fruitbodies
CN113249241A (zh) 一种酿酒酵母蛋白酶缺失菌株的构建及其应用
CN108929882B (zh) 一种地衣芽孢杆菌的基因编辑方法及应用
JP4495904B2 (ja) 改変プロモーター
CN109796525B (zh) Csep27蛋白及其编码基因和应用
EP1801221A1 (en) Promoter sequences
JP2009060797A (ja) 異種タンパク質分泌高生産株を選抜する方法
EP1268824B1 (en) Promoter sequence of 3-phosphoglycerate kinase gene 1 of rhizopus oryzae and its use
CN111630165A (zh) 通过抑制条件性必需基因进行反向选择
CN112592954B (zh) 基因GliT作为筛选标记基因在抗性筛选中的应用
CN112831517B (zh) 由番茄红素基因介导的改造的克隆载体及其应用
US20030134353A1 (en) Recombinant dimorphic fungal cell

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant