JP2021521821A - 粘性が低下した表現型を含む糸状菌株 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
本出願は、その全体が参照により本明細書に援用される、2018年4月24日に出願された米国仮特許出願第62/661,658号に基づく優先権を主張するものである。
「NB40808−WO−PCT_SequenceListing.txt」と名付けられた、配列表のテキストファイルの電子的提出の内容は、2019年4月5日に作製され、サイズは184KBであり、その全体は参照により本明細書に組み込まれる。
配列番号1は、配列番号2の天然SSB7タンパク質をコードする野生型T.リーゼイ(T.reesei)ssb7遺伝子の核酸配列である。
本菌株及び方法を詳細に説明する前に、明確にするために以下の用語を定義する。定義されていない用語は、当分野において使用されるそれらの通例の意味に一致するはずである。他に定義されていない限り、本明細書で使用する技術用語及び科学用語は全て、本発明の組成物及び方法が属する分野の当業者であれば一般に理解する意味と同一の意味を有する。
上記で一般に記載し、下記の実施例のセクションで詳述するように、本開示の所定の実施形態は、親菌株に由来する糸状菌の変異菌株に関する。より特別には、所定の実施形態は、糸状菌の変異菌株及びその方法に関するが、ここでそのような変異菌株は、改良された体積効率、強化された/一様な酸素分布、低下した細胞ブロス粘性、高比生産性、改良された炭素源の収率、減少したバイオリアクター(発酵槽)の運転費、変化した(細胞)表現型、変化した(細胞)形態、変化した(細胞)増殖特性等を含む。
所定の実施形態では、糸状菌の変異菌株(細胞)は、糸状菌の親菌株(細胞)に由来するが、ここで変異菌株は、SSB7タンパク質/SSB7オルソログをコードする遺伝子の(即ち、親菌株と比較した)少なくとも1つの遺伝子改変を含み、そのような変異菌株は、親菌株と比較して粘性が低下した表現型を含む。より特別には、本開示の所定の他の実施形態は、SSB7タンパク質/SSB7オルソログをコードする遺伝子の遺伝子改変を含む糸状菌のそのような変異菌株(細胞)に向けられ、ここで変異菌株は、深部培養中における好気発酵中に、(i)予め選択された溶存酸素(DO)量を維持するために低下した撹拌量を必要とする細胞ブロス、及び/又は(ii)予め選択された撹拌量で、即ち親菌株と比較して増加したDO量を維持する細胞ブロスを産生する。
上記で概して記載したように、本開示の所定の実施形態は、親トリコデルマ(Trichoderma)種菌株に由来する変異トリコデルマ(Trichoderma)種菌株に向けられる、ここで変異菌株は、粘性が低下した表現型を含む。所定の実施形態では、変異トリコデルマ(Trichoderma)種菌株は、配列番号2又は配列番号31のSSB7タンパク質と少なくとも約50%の配列同一性を含むSSB7タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで変異菌株は、粘性が低下した表現型を含む。所定の他の実施形態では、変異トリコデルマ(Trichoderma)種菌株は、配列番号1のssb7遺伝子と少なくとも約50%の配列同一性を含むssb7遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで変異菌株は、粘性が低下した表現型を含む。所定の他の実施形態では、変異トリコデルマ(Trichoderma)種菌株は、配列番号32のssb7遺伝子と少なくとも約50%の配列同一性を含むssb7遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで変異菌株は、粘性が低下した表現型を含む。所定の他の実施形態では、変異トリコデルマ(Trichoderma)種菌株は、配列番号34のssb7遺伝子と少なくとも約50%の配列同一性を含むssb7遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで変異菌株は、粘性が低下した表現型を含む。
上述したように、所定の実施形態は、糸状菌の親菌株(細胞)に由来する糸状菌の変異菌株(細胞)に向けられるが、ここで変異菌株は、SSB7タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで変異菌株は、粘性が低下した表現型を含む。より特別には、所定の実施形態は、トリコデルマ(Trichoderma)種、アスペルギルス(Aspergillus)種、フザリウム(Fusarium)種、ペニシリウム(Penicillium)種、クリソスポリウム(Chrysosporium)種、セファロスポリウム(Cephalosporium)種、タラロマイセス(Talaromyces)種、ゲオスミチア(Geosmithia)種、ニューロスポラ(Neurospora)種、ミセリオフトラ(Myceliophthora)種等を含むがそれらに限定されない糸状菌の変異菌株に関する。従って、所定の実施形態では、本開示は、配列番号8のSSB7タンパク質オルソログをコードする遺伝子の遺伝子改変を含む変異フザリウム(Fusarium)種菌株に関する。他の実施形態では、本開示は、配列番号9のSSB7タンパク質オルソログをコードする遺伝子の遺伝子改変を含む変異ニューロスポラ(Neurospora)種菌株に関する。他の実施形態では、本開示は、配列番号10のSSB7タンパク質オルソログをコードする遺伝子の遺伝子改変を含む変異ミセリオフトラ(myceliophthora)種菌株に関する。他の実施形態では、本開示は、配列番号11のSSB7タンパク質オルソログをコードする遺伝子の遺伝子改変を含む変異タラロマイセス(Talaromyces)種菌株に関する。他の実施形態では、本開示は、配列番号12のSSB7タンパク質オルソログをコードする遺伝子の遺伝子改変を含む変異アスペルギルス(Aspergillus)種菌株に関する。他の実施形態では、本開示は、配列番号13のSSB7タンパク質オルソログをコードする遺伝子の遺伝子改変を含む変異ペニシリウム(Penicillium)種菌株に関する。
所定の実施形態では、本開示は、SSB7タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変、並びにMPG1タンパク質(配列番号14)、SFB3タンパク質(配列番号15)、SEB1タンパク質(配列番号16)、CRZ1タンパク質(配列番号17)及び/又はGAS1タンパク質(配列番号18)をコードする遺伝子の1つ以上の遺伝子改変を含む糸状菌の変異菌株に関する。
概して上述したように、本開示の所定の実施形態は、糸状菌の親菌株に由来する糸状菌の変異菌株に向けられる。これらの変異菌株の細胞は、引き続いて、親菌株の細胞と比較して、深部培養中における好気発酵中に、予め選択された溶存酸素(DO)量を維持するための減少した撹拌量を必要とする細胞ブロス、及び/又は予め選択された撹拌量で、増加したDO量を維持する細胞ブロスを産生する。従って、所定の実施形態では、粘性が低下した表現型を含む本開示の変異菌株は、(即ち、親菌株の細胞と比較して)SSB7をコードする遺伝子の遺伝子改変を含む。
一般に上記に記載したように、及び下記の実施例のセクションで提示するように、本明細書に開示した糸状菌の粘性が低下した菌株の使用は、深部培養中における酸素及び栄養分の分布を改良し、深部培養を撹拌するために必要とされるエネルギー量を減少させ、培養中に存在する細胞集団濃度の増加を可能にし、タンパク質生産の増加をもたらす。更に、本明細書に開示した糸状菌の変異菌株は、それらをその後の遺伝子操作、相補的分布、交配等のために良好に適合させる、完全に確定されたゲノムを含む。同様に、本発明の菌株は、例えば、付随する粘性低下を生じさせる操作によって、タンパク質産生に有害な影響を及ぼさない。更にその上、本明細書に開示した糸状菌のこれらの変異菌株(即ち、粘性が低下した菌株)は、既に高レベル発現が意図されたタンパク質(即ち、目的の内在性若しくは異種タンパク質)を生成する、既に選択マーカーをコードする、又は既に生産宿主において所望である他の特徴を含む親菌株を含む、本質的に任意の親菌株から生成することができる。従って、本発明の菌株及び方法は、目的タンパク質をコードする遺伝子を先在する粘性が低下した生産菌株内に移動させる必要を排除する。
先行するセクションで手短に述べたように、本発明の菌株及び方法は、糸状菌の深部培養中における商業的に重要なタンパク質の産生において利用される。本開示の目的タンパク質(POI)は、任意の内在性又は異種タンパク質であってよく、そのようなPOIの変異体であってもよい。タンパク質は、1つ以上のジスルフィド架橋を含有し得る、又はその機能的形態が単量体若しくは多量体であるタンパク質である、即ち、タンパク質は、四次構造を有し、複数の同一(相同)若しくは非同一(異種)サブユニットから構成され、ここで、POI若しくはその変異POIは、好ましくは目的の特性を備えるタンパク質である。
糸状菌における形態学的変化の原因としてのssb7遺伝子の同定
A.概説
トリコデルマ・リーゼイ(Trichoderma reesei)は、商業的発酵において使用した場合に濃い粘性発酵ブロスを産生する好気性糸状菌である。例えば、そのような発酵ブロスの高粘性は、特に酸素移動を減少させ、それにより細胞集団の量を限定し、これは同時にT.リーゼイ(T.reesei)の商業的発酵において達成される体積生産性を減少させる。粘性が低下した突然変異体の単離は、より粘性が低い発酵ブロスを産生する突然変異菌株を生じさせ得る。そのような変異菌株を用いると、発酵は、より多くの細胞集団を利用することができ、体積生産性の増加をもたらす。より特別には、1つのそのような突然変異体であるMorph 77B7は、遺伝子スクリーニングから単離されたが、ここで原因となる突然変異は、以前に特性解析されていないMITドメインを含有するタンパク質をコードする遺伝子ssb7におけるフレームシフト突然変異であると同定された。本実施例(及び下記に続く実施例2及び3)では、ssb7の突然変異が発酵ブロスの粘性の低下を生じさせることを例示する、ssb7の様々な突然変異対立遺伝子を開示する。本明細書に開示したssb7遺伝子座及び突然変異ssb7対立遺伝子は、図1に示した。
トリコデルマ(Trichoderma)菌株を発現する「TrGA 29−9」と名付けられたグルコアミラーゼ(GA)(全体として参照により本明細書に組み込まれる米国特許第9,725,727号明細書を参照されたい)は、10%の殺滅が得られるまで、NTG(N−メチル−N’−ニトロ−N−ニトロソグアニジン)を用いて突然変異させた。生存細胞をPDA(ポテトデキストロース寒天)上で平板培養し、胞子形成させた。胞子は、水中に懸濁させた後に平板から擦り取った。胞子は48〜72時間に渡りYEG(酵母エキスグルコースブロス)中で増殖させ、生じた菌糸体は200マイクロメートル(μm)フィルターに通してふるい、引き続いてこのフィルターを大量の水を用いて洗浄した。濾液を遠沈させ、菌糸体を収集し、YEG内に再接種した。毎回菌糸体をより小さなフィルターに通してふるった以外は、この同じ抽出手法を数回繰り返した。最終ステップでは、YEG中での増殖後、菌糸体を40μmのフィルターに通して濾過し、菌糸体を濾液から回収し、PDA上で平板培養した。
「Morph 77B7」と名付けられたT.リーゼイ(T.reesei)突然変異体(即ち、実施例1Bで上述したように得られた)は、特にその親より短くより粘性の糸状体を有する、深部液体培養中で変化した形態(表現型)を有することが観察された。例えば、液体培地中では、Morph 77B7を含有する培養は、親を含有する培養と比較して、増殖中のより高レベルの溶存酸素(DO)を更に示した(表1を参照されたい)。
T.リーゼイ(T.reesei)TrGA 29−9親菌株及びMorph 77B7突然変異菌株のゲノムを(概して国際PCT出願の国際公開第2012/027580号パンフレットに記載されているように)シーケンシングすると、Morph 77B7ゲノムにおけるコーディング配列を変化させると予測された8つの新規な突然変異が同定され、それらの突然変異は何れも単独で、又は組み合わせて、本明細書に記載した観察された変化した形態表現型及び粘性の低下のために必要であると考えられる。そこで、これらの突然変異の何れが重要であるかを決定するために、相補性分析を実施した。
本明細書で実施したBLASTの検索は、SSB7タンパク質オルソログがフザリウム(Fusarium)種(配列番号8)、ニューロスポラ(Neurospora)種(配列番号9)、ミセリオフトラ(Myceliophthora)種(配列番号10)、タラロマイセス(Talaroymyces)種(配列番号11)、アスペルギルス(Aspergillus)種(配列番号12)及びペニシリウム(Penicillium)種(配列番号13)中には存在するが、サッカロミセス(Saccharomycetes)種には存在しないことを証明した。例えば、T.リーゼイ(T.reesei)ssb7遺伝子は、予測された微小管相互作用及び輸送(MIT)ドメイン(表2、領域A及び図5を参照されたい)及び表2の領域B、領域C及び領域Dに記載された未知のSSB7タンパク質ドメインを含む、特性解析されていないが高度に保存されたSSB7タンパク質をコードする。より特別には、353個の子嚢菌(Ascomycete)ホモログ(N末端MITドメインに渡るアミノ酸が欠如する短鎖タンパク質の予測を排除する)は、ソフトウエアパッケージGeneious内のMUSCLE法を使用してアラインメントさせた(Edgar RC(2004).”MUSCLE:multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput”.Nucleic Acids Research.32(5):1792−97.doi:10.1093/nar/gkh340)。グラフィカル出力は、図5に示したが、ここでアミノ酸保存の4つの領域(A〜D)は、アラインメントから同定された。領域Aは、MITドメインと重複した。保存は、これらの4つの領域がSSB7機能にとって重要であることを意味するが、精密な酵素的若しくは構造的機能は、現在の化学的知見に基づくアミノ酸配列によっては示唆されない。
親菌株TrGA 29−9内でのssb7の破壊によるMORPH 77B7表現型の改造
A.概説
ssb7突然変異が粘性低下の原因であったことを詳細に検証するために、ssb7遺伝子座を親菌株TrGA 29−9内で特異的に突然変異させた。そこで、相同組換えによりssb7突然変異誘発を標的とするために、2種の方法を使用した。プラスミドpRATT311由来の線状DNAカセットを使用する1つの方法は、菌株Morph 77B7において同定されたΔGの部位(対立遺伝子「ssb7(311)」)での破壊的DNAの挿入を標的とした。
環状プラスミドpTrex2g MoCas 77b7−HR1を使用する第2方法は、フレームシフト突然変異の下流での(元のフレームと比較して)1つの同義コドン変化と一緒に、菌株Morph 77B7内で同定されたΔG突然変異を導入した(対立遺伝子「ssb7(TS1)」;対立遺伝子の比較については図1を参照されたい)。従って、ssb7の対立遺伝子はどちらも粘性の低下を示したが、他方フレームシフト対立遺伝子ssb7(TS1)は、より良好な粘性の低下を有していた。
T.リーゼイ(T.reesei)ssb7破壊カセットプラスミドpRATT311は、標準的な分子生物学的手順を用いて調製した。従って、当業者であれば、このプラスミドを本明細書に開示した関連DNA部分から容易に改造することができる。このプラスミドは、Scaffold 13、164849〜167403(左フランク)に対応するDNA配列と相同な2.6Kbのホモロジーボックスを有するDNA配列を含んでいた。このプラスミド内には、Scaffold 13、167405〜169218(右フランク)に対応するDNA配列と相同な1.8Kbのホモロジーボックスを有するDNA配列も又含まれていた。これらの配列は、ssb7遺伝子を標的化し、左フランクと右フランクとの間のゲノムのヌクレオチド(Scaffold 13、167404)を介在カセット配列で置換するために設計された。これらの介在カセット配列は、トリコデルマ・アトロビリデ(Trichoderma atroviride)由来のpyr2選択マーカーを含んでいた。pyr2選択マーカーの直ぐ下流は、左フランク(リピート)の3’に最も近い領域と相同であるScaffold 13、167403〜166833に対応する0.6Kb領域を有するDNA配列であった。これらの繰り返し配列は、唯一の新規な標的化遺伝子改変としてのssb7遺伝子内に単一ヌクレオチドG欠失突然変異(Scaffold 13、167404)を残しながら、pyr2マーカーのその後の消失を促進し、将来の菌株開発におけるこのマーカーの使用を可能にする。本明細書に提示したデータは、ssb7コーディング配列を破壊するpyr2マーカー及びリピートを含有するpRATT311形質転換体由来であることに留意されたい(図1)。
本明細書に記載した菌株TrGA 29−9内のssb7のcas9媒介性編集のために使用したベクター及び菌株開発の方法は、本質的には、国際PCT出願のPCT/US2015/65693及び国際公開第2016/100272号パンフレットに記載された通りに実施したが、ここでその中の実施例3及び実施例4は、pTrex2gHyg MoCasの構築について記載しており;実施例5はこのベクター内にガイドRNA(gRNA)発現カセットを付加することを記載しており;及び実施例8は、HR指向性ゲノムの編集、形質転換及びスクリーニングのためのホモロジー領域の付加について記載している。
トリコデルマ・リーゼイ(Trichodermareesei)菌株は、深部(液体)培養中の類似の条件下で増殖させ、それらの増殖表現型を比較した。手短には、各菌株の胞子は、サイドバッフル及びボトムバッフルの両方を備える250mLのフラスコ内の50mLのクエン酸最小培地へ別個に添加した。培養は、5cmの動程を備える振とうインキュベーター内で170RPM、30℃で48時間に渡り増殖させた。48時間後、各フラスコの内容物は、接種のために2Lの発酵槽(バイオリアクター)に別個に添加した。インキュベーションの前に、4.7g/LのKH2PO4、1.0g/LのMgSO4・7H2O、9g/Lの(NH4)2SO4及び2.5mL/Lの微量元素溶液を含有する0.95kgの培地を2Lのバイオリアクターに添加し、その後に30分間に渡り121℃で一緒に加熱殺菌した。殺菌後の添加物:滅菌した4.8mLの50%のグルコース及び0.96mLの0.48%のCaCl2・2H2Oは、インキュベーションの前にタンクに添加した。培地は、14%のNH3を用いてpH3.5へ調整し、全増殖期間に渡り、温度は30℃及びpHは3.5で維持した。
全セルラーゼ菌株T4abc内のssb7の標的化突然変異
A.概説
ssb7突然変異体の有用性を詳細に試験するために、Nik1(M743T)突然変異(配列番号36)を含み、セルラーゼの天然カクテルを発現する、ssb7の3つの突然変異対立遺伝子についても、「T4abc」と名付けられた異なるT.リーゼイ(T.reesei)系統内でも評価した。これらの突然変異体も又、粘性が低下した表現型を証明した。
ssb7(311)対立遺伝子は、菌株「T4abc ssb7(311)」を生成するために、上記の実施例2に記載した菌株T4abc pyr2内で生成した。ssb7(TS2)対立遺伝子は、標的配列2を含有するプラスミド(TS2)を使用することを除いて、実施例2におけるssb7(TS1)と同様に、菌株T4abc内で生成した。従って、それは、TS1及びTS2認識配列それぞれを不活化するために、Scaffold 13、167404でのMorph 77B7フレームシフト突然変異並びにScaffold 13、167436及びScaffold 13、167466での2個の追加のGからCへの突然変異を含有していた(図1)。この菌株は、「T4abc ssb7(TS2)」と名付けられた。
粘性の評価は、実施例2で記載したように、バイオリアクター内でT4abc及びssb7突然変異菌株について実施した。表4に示したように、全グルコースが消費され尽くしたバッチ増殖期の終了時には、全菌株は類似のバイオマス濃度を達成した(乾燥細胞重量)。3つのssb7対立遺伝子は、そのすべてが、DOを設定点より上方に維持するために必要とされた撹拌量の低下(撹拌の追加)及びその間にDOが設定点の20%上方又はそれ以下(DO制限)となった時間分率の低下によって証明される、T4abc親と比較したバイオリアクター内のブロス粘性の低下を生じさせた。
PCT国際出願第PCT/US2015/65693号
PCT国際公開第WO2012/027580号
PCT国際公開第WO2012/145584号
PCT国際公開第WO2012/145592号
PCT国際公開第WO2012/145595号
PCT国際公開第WO2012/145596号
PCT国際公開第WO2016/100272号
PCT国際公開第WO2016/100568号
PCT国際公開第WO2016/100571号
PCT国際公開第WO2016/130523号
PCT国際公開第WO20161/00562号
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Claims (31)
- 親菌株に由来する糸状菌の変異菌株であって、配列番号2、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号31、配列番号33若しくは配列番号35との約50%の配列同一性を含むSSB7タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変を含み、ここで前記変異菌株の細胞は親細胞と比較して粘性が低下した表現型を含む、糸状菌の変異菌株。
- 深部培養中における好気発酵中の前記変異菌株は、(i)前記親菌株の前記細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために減少した撹拌量を必要とする細胞ブロスを産生する、及び/又は(ii)予め選択された撹拌量で、前記親菌株の前記細胞と比較して増加した溶存酸素量を維持する細胞ブロスを産生する、請求項1に記載の変異菌株。
- SSB7タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変は、前記SSB7タンパク質をコードする前記遺伝子の少なくとも3’領域で欠失するか、又は破壊することを含む、請求項1に記載の変異菌株。
- 目的タンパク質をコードする遺伝子を更に含む、請求項1に記載の変異菌株。
- 前記変異菌株は、前記親菌株と比較して、バイオマス単位量当たり実質的に同一量の目的タンパク質を産生する、請求項4に記載の変異菌株。
- 前記変異菌株は、バイオマス単位量当たりで前記親菌株より多量の前記目的タンパク質を産生する、請求項4に記載の変異菌株。
- 前記糸状菌は、子嚢菌門(phylum Ascomycota)の糸状菌である、請求項1に記載の変異菌株。
- 前記糸状菌は、トリコデルマ(Trichoderma)種真菌、フザリウム(Fusarium)種真菌、ニューロスポラ(Neurospora)種真菌、ミセリオフトラ(Myceliophthora)種真菌、タラロマイセス(Talaromyces)種真菌、アスペルギルス(Aspergillus)種真菌及びペニシリウム(Penicillium)種真菌から成る群から選択される、請求項1に記載の変異菌株。
- 請求項4に記載の変異菌株によって産生した目的タンパク質。
- MPG1タンパク質、SFB3タンパク質、SEB1タンパク質、CRZ1タンパク質及び/又はGAS1タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子の遺伝子改変を更に含む、請求項1に記載の変異菌株。
- 前記SSB7タンパク質をコードする前記遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1の前記ssb7遺伝子又はその相補的配列とハイブリダイズする、請求項1に記載の変異菌株。
- 前記SSB7タンパク質をコードする前記遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号19、配列番号20若しくは配列番号21のssb7エキソン又はそれらの相補的配列とハイブリダイズする、請求項1に記載の変異菌株。
- 前記SSB7タンパク質をコードする前記遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号22の領域A、配列番号23の領域B、配列番号24の領域C若しくは配列番号25の領域Dをコードする核酸配列又はそれらの相補的配列とハイブリダイズする、請求項1に記載の変異菌株。
- 前記SSB7タンパク質をコードする前記遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記SSB7タンパク質の保存アミノ酸配列をコードする核酸配列とハイブリダイズし、前記保存配列は、配列番号26〜30から成る群又はそれらの相補的配列から選択される、請求項1に記載の変異菌株。
- 糸状菌細胞の粘性が低下した菌株を構築するための方法であって、
(a)糸状菌の親菌株を入手するステップ、及び、配列番号2、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号31、配列番号33若しくは配列番号35との少なくとも50%の配列同一性を含むSSB7タンパク質をコードする遺伝子を遺伝子改変するステップ、及び
(b)ステップ(a)において産生された変異菌株を単離するステップであって、前記変異菌株の前記細胞は、前記親細胞と比較して、粘性が低下した表現型を含むステップ
を含む、方法。 - 深部培養中における好気発酵中の前記変異菌株は、(a)前記親菌株の前記細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するための減少した撹拌量を必要とする細胞ブロスを産生する、及び/又は(b)予め選択された撹拌量で、前記親菌株の前記細胞と比較して増加した溶存酸素量を維持する細胞ブロスを産生する、請求項15に記載の方法。
- SSB7タンパク質をコードする遺伝子の遺伝子改変は、前記SSB7タンパク質をコードする前記遺伝子の少なくとも3’領域で欠失するか、又は破壊することを含む、請求項15に記載の方法。
- 前記真菌細胞は、目的タンパク質をコードする遺伝子を更に含む、請求項15に記載の方法。
- 前記変異菌株は、前記親菌株と比較して、バイオマス単位量当たり実質的に同一量の目的タンパク質を産生する、請求項18に記載の方法。
- 前記変異菌株は、バイオマス単位量当たりで前記親菌株より多量の前記目的タンパク質を産生する、請求項18に記載の方法。
- 前記糸状菌は、子嚢菌門(phylum Ascomycota)の糸状菌である、請求項18に記載の方法。
- 前記糸状菌は、トリコデルマ(Trichoderma)種真菌、フザリウム(Fusarium)種真菌、ニューロスポラ(Neurospora)種真菌、ミセリオフトラ(Myceliophthora)種真菌、タラロマイセス(Talaromyces)種真菌、アスペルギルス(Aspergillus)種真菌及びペニシリウム(Penicillium)種真菌から成る群から選択される、請求項18に記載の方法。
- 請求項18に記載の方法によって産生した目的タンパク質。
- MPG1タンパク質、SFB3タンパク質、SEB1タンパク質、CRZ1タンパク質及び/又はGAS1タンパク質をコードする1つ以上の遺伝子の遺伝子改変を更に含む、請求項15に記載の方法。
- 前記SSB7タンパク質をコードする前記遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号1のssb7遺伝子又はその相補的配列とハイブリダイズする、請求項15に記載の方法。
- 前記SSB7タンパク質をコードする前記遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号19、配列番号20若しくは配列番号21のssb7エキソン又はそれらの相補的配列とハイブリダイズする、請求項15に記載の方法。
- 前記SSB7タンパク質をコードする前記遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、配列番号22の領域A、配列番号23の領域B、配列番号24の領域C若しくは配列番号25の領域Dをコードする核酸配列又はそれらの相補的配列とハイブリダイズする、請求項15に記載の方法。
- 前記SSB7タンパク質をコードする前記遺伝子は、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下で、前記SSB7タンパク質の保存アミノ酸配列をコードする核酸配列とハイブリダイズし、前記保存配列は、配列番号26〜30又はそれらの相補的配列から成る群から選択される、請求項15に記載の方法。
- 粘性が低下した表現型を含む糸状菌細胞の変異菌株をスクリーニング及び単離する方法であって:
(a)配列番号2、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号31、配列番号33若しくは配列番号35との少なくとも50%の配列同一性を含むSSB7タンパク質をコードする親糸状菌株内の遺伝子を遺伝子改変するステップ、
(b)前記親菌株の細胞形態と比較して、ステップ(a)の前記改変変異菌株の細胞形態を粘性が低下した表現型についてスクリーニングするステップ、及び
(c)粘性が低下した表現型を含むステップ(b)の改変変異菌株を単離するステップ
を含む方法。 - 深部培養中における好気発酵中の前記変異菌株は、(a)前記親菌株の前記細胞と比較して、予め選択された溶存酸素量を維持するために減少した撹拌量を必要とする細胞ブロスを産生する、及び/又は(b)予め選択された撹拌量で、前記親菌株の前記細胞と比較して増加した溶存酸素量を維持する細胞ブロスを産生する、請求項29に記載の方法。
- 粘性が低下した表現型を含むステップ(c)の前記変異菌株は、前記親菌株と比較して、短い菌糸体を含む、請求項29に記載の方法。
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