ES2328011T3 - Selecion de alto rendimiento de bibliotecas de adn expresadas en hongos filamentosos. - Google Patents
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Abstract
Método para expresar una pluralidad de proteínas codificadas por una biblioteca de vectores de ADN, donde la biblioteca de vectores comprende una pluralidad de vectores diferentes, cada vector diferente comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos que codifica proteínas diferentes, dicha secuencia de ácidos nucleicos siendo operativamente enlazada a una región reguladora de la expresión y opcionalmente una secuencia que codifica una señal de secreción, el método incluyendo las etapas de: (a) suministar una pluralidad de hongos filamentosos individuales, dichos hongos teniendo un fenotipo caracterizado por el crecimiento en suspensión y caracterizado por la producción de elementos transferibles reproductivos que son monoclonales y fácilmente separados los unos de los otros en suspensión; (b) transfomar de forma estable dichos hongos filamentosos con dicha biblioteca de vectores de ADN para introducir en cada uno de una pluralidad de los hongos individuales al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica proteínas heterólogas u homólogas; (c) cultivar los hongos filamentosos transformados en suspensión bajo condiciones propicias para la formación de elementos reproductivos transferibles; (d) separar entre sí una pluralidad de elementos reproductivos transferibles; y (e) cultivar en cultivos monoclonales o colonias monoclonales los elementos reproductivos transferibles individuales, bajo las condiciones propicias para la expresión de las proteínas codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas heterólogas u homólogas.
Description
Selección de alto rendimiento de bibliotecas de
ADN expresadas en hongos filamentosos.
La invención proporciona un método para la
expresión y selección posterior de bibliotecas de ADN,
particularmente bibliotecas sintéticas genómicas, y de ADNc, en
huéspedes filamentosos fúngicos. El sistema emplea cepas fúngicas
filamentosas transformadas o modificadas que generan elementos
reproductivos transferibles, por ejemplo por esporulación eficaz, en
cultivo sumergido. Los hongos preferiblemente muestran una
morfología que minimiza o elimina la formación de micelios
enredados. Cepas fúngicas particularmente preferidas son también
capaces de expresar cantidades aislables de proteínas exógenas para
su evaluación. Las cepas mutantes fúngicas de la invención son
particularmente bien adecuadas para técnicas de selección de alto
rendimiento, debido a su producción de elementos reproductivos
transferibles, niveles altos de expresión, y viscosidad de cultivo
muy baja.
Las poblaciones naturales de microorganismos
muestran un conjunto amplio de diversidad bioquímica y metabólica.
En parte debido a dificultades en aislar y cultivar muchos
microorganismos, un gran número de proteínas valiosas de forma
potencial y polipéptidos presentes en estas poblaciones han
escapado de la identificación. De hecho, ha sido estimado que menos
del uno por ciento de los microorganismos del mundo han sido
cultivados hasta la fecha. Continua habiendo una necesidad de
presión para nuevos enfoques para la caracterización de proteínas,
polipéptidos y metabolitos de microorganismos todavía no
cultivados, no identificados, y también de microorganismos
conocidos. (El término "proteína" como se usa de ahora en
adelante debería ser entendido como incluyendo péptidos así como
polipéptidos). Continua habiendo también una necesidad de enfoques
nuevos para la identificación y aislamiento de los genes que
codifican estas proteínas, para permitir la modificación y/o
producción de las proteínas.
Un enfoque para este problema ha sido descrito
por Short en las patentes estadounidenses 5,958,672, 6,001,574,
6,030,779, y 6,057,103. En este enfoque, una biblioteca de ADN
genómico es preparada directamente de una muestra medioambiental (p.
ej. una muestra de tierra), haciendo o no un intento para aislar o
cultivar cualquier organismo que pueda estar presente. La
biblioteca de ADN es expresada en E. coli, y las proteínas
expresadas son seleccionadas para una propiedad o actividad de
interés. Short alude a, pero no describe o permite, el uso de
células huéspedes fúngicas en este método.
El enfoque según está descrito padece de
diferentes desventajas serias, una de ellas es que E. Coli
no expresa eficazmente genes que tienen intrones. Aproximadamente
el 90% de las especies de microorganismos en la tierra son
eucariotas (principalmente hongos), que generalmente tienen intrones
en su ADN genómico. Suponiendo que hay ya aproximadamente 100.000
especies de hongos eumicotas conocidos, estimándose que 1.000.000
todavía deben ser descubiertos (B.Kendrick, The Fifth Kingdom,
Mycologue Publications 1999), el potencial para diversidad de
proteínas y de metabolitos es mucho más alto entre los genomas
fúngicos, pero la presencia de intrones pone la mayor parte de las
proteínas fúngicas y repertorio de metabolitos fuera del alcance de
los sistemas de expresión bacteriana. No sólo son muchas clases de
enzimas (p. ej., lignina peroxidasas fúngicas secretoras y
peroxidasas dependientes de manganeso) únicas para hongos, sino que
hay muchas proteínas fúngicas, incluso enzimas (p. ej. lignina
peroxidasas, invertasa de A. niger), que son glicosiladas, y
estas proteínas no serían glicosiladas si fueran expresadas por
E. coli. El número mucho mayor y el tamaño y complejidad
superiores de genomas fúngicos, la singularidad de muchas proteínas
fúngicas, y la glicosilación de muchas proteínas fúngicas, todo
ello indica que la fracción de proteína microbiana y la diversidad
de metabolitos en una muestra medioambiental que podría ser
detectada en realidad por la expresión bacteriana del ADN genómico
es considerablemente inferior al 10%.
En parte debido a la extensión del SIDA y al
aumento de población de receptores de transplante de órganos, hay
una población en crecimiento de individuos
inmuno-comprometidos o
inmuno-suprimidos, y el número y variedad de
infecciones fúngicas ha crecido rápidamente (Infect. Med.
16:380-382, 385-386 (1999)).
Hay una necesidad de identificar y caracterizar proteínas de hongos
patógenos en la actual búsqueda de nuevas metas para fármacos
anti-fúngicos, lo que requiere la capacidad de
seleccionar bibliotecas de ADN derivadas de genomas fúngicos.
Nuevamente, la presencia de intrones en genomas fúngicos hace la
expresión de bibliotecas de ADN genómico difícil en la mayoría de
huéspedes bacterianos habitualmente disponibles. Ha habido también
un aumento en la prevalencia de infecciones bacterianas resistentes
a los antibióticos, creando una necesidad de selección de alto
rendimiento para metabolitos fúngicos nuevos con actividad
antibiótica.
Los genomas eucarióticos de organismos
superiores son también demasiado complejos para la expresión
comprensiva de bibliotecas de ADN en bacterias. Cuando todas las
especies eucarióticas son consideradas, las bacterias representan
sólo aproximadamente un 0,3% de todas las especies conocidas (E.O.
Wilson, "The Current State of Biological Diversity", en
Biodiversity, National Academy Press, Washington DC, 1988, capítulo
1); así la fracción de la diversidad del mundo genético accesible
para los sistemas de expresión bacteriana es extremadamente
limitada.
Para evitar problemas con intrones, es posible
preparar una biblioteca de ADNc y expresarla en bacterias. No
obstante, este enfoque se refiere a la presencia de transcripciones
de ARN, y cualquier gen no estando transcrito activamente no será
representado en la biblioteca. Muchas proteínas deseables son
expresadas sólo bajo condiciones específicas (p. ej., factores de
virulencia en hongos patógenos) y estas condiciones no pueden
existir al mismo tiempo que el ARNm es recolectado. Además, para
obtener suficiente ARN para preparar una biblioteca de ADNc, es
preciso cultivar una cantidad razonable del organismo. Para
organismos en muestras medioambientales que no crecen bien en
cultivo, o microorganismos nuevos para los cuales las condiciones
de cultivo apropiadas son desconocidas, no se obtendrá suficiente
ARN de una forma fácil o fiable. Por el contrario, se puede obtener
suficiente ADN genómico de un número muy pequeño de células
individuales por amplificación por PCR, usando bien cebadores
aleatorios o bien cebadores diseñados para favorecer clases
determinadas de genes. Finalmente, los genes que son altamente
expresados en un organismo tenderán a ser
sobre-representados en el ARNm, y por lo tanto
sobre-representados a costa de genes mínimamente
expresados en una biblioteca de ADNc. Para tener un nivel alto de
cobertura de las especies ARNm presentes, un número mucho mayor de
clones debe ser seleccionado si se emplea una biblioteca de ADNc en
vez de una biblioteca genómica, puesto que ésta tendrá una
representación más prácticamente igual de la variedad de genes
presentes. Claramente es más deseable seleccionar una biblioteca de
ADN genómica en la medida de lo posible.
También, E. coli es incapaz de segregar
muchas proteínas, y por tanto es indeseable como una célula huésped
para fines de selección cuando la selección se refiere a la
secreción del producto genético. Una desventaja adicional para
E. coli, y para los huéspedes bacterianos en general, es que
los procariotas no pueden proporcionar muchas de las modificaciones
postraduccionales requeridas para la actividad de numerosas
proteínas eucarióticas. Además de la glicosilación, la ruptura de
subunidades, la formación de enlaces de disulfuro, y el pliegue
apropiado de proteínas son ejemplos del procesamiento
postraduccional frecuentemente requeridos para producir una
proteína activa.
Para asegurar tal procesamiento se puede a veces
usar células mamíferas, pero las células mamíferas son difíciles de
mantener, requieren medios caros, y no son generalmente
transformadas con alta eficiencia. Estos sistemas de transformación
no son en consecuencia convenientes para selección de proteínas de
alto rendimiento, a pesar de que se han hecho esfuerzos para
emplear células mamíferas como huéspedes para la selección de
bibliotecas de ADNc (Schouten et al., WO 99/64582). Un
enfoque que implica fusión de protoplastos transformados con
células mamíferas antes de la selección de bibliotecas ha sido
descrita (patente U.S. 5,989,814), pero la expresión de la
biblioteca de proteínas ocurre en bacterias o levadura antes de la
fusión celular. Se han hecho esfuerzos para modificar modelos de
glicosilación enzimáticamente después de la expresión en células
huéspedes (Meynial-Salles y Combes, J. Biotechnol.,
46:1-14 (1996), pero este tipo de métodos deben ser
confeccionados para productos específicos y no son adecuados para
la expresión de proteínas a partir de una biblioteca de ADN. Más
recientemente, Maras et al., Eur. J. Biochem.,
249:701-707 (1997) (véase también patente
estadounidense 5,834,251) han descrito una cepa de Tichoderma
reesei creada genéticamente para expresar GIcNAc transferasa 1
humana. La enzima transfiere N-acetilglucosamina a
los residuos de manosa en otras proteínas exógenas expresadas, un
primer paso dirigido a una aproximación más cercana a productos de
mamíferos naturales.
El uso de levadura como células huéspedes
resuelve algunos de los problemas de arriba, pero introduce otros.
La levadura tiende a hiperglicosilar proteínas exógenas (Bretthauer
y Castellino, 1999, Biotechnol. Appl.. Biochem.
30:193-200), y los modelos de glicosilación
alterados frecuentemente convierten las proteínas mamíferas
expresadas en altamente antigénicas (C. Ballou, en Molecular
Biology of the Yeast Sacccharomyces, J. Strathern et al.,
eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1982,
335-360). Aunque las levaduras son capaces de
afrontar un número limitado de intrones, éstas no son generalmente
capaces de manipular genes complejos de especies superiores tales
como los vertebrados. Incluso los genes de hongos filamentosos son
normalmente demasiado complejos para que la levadura transcriba
eficazmente, y este problema está compuesto por diferencias en
expresión y secuencias de empalme entre levadura y hongos
filamentosos (véase p. ej., M. Innis et al., Science 1985
228:21-26). A pesar de estos inconvenientes, los
sistemas de transformación y de expresión para levadura han sido
desarrollados extensamente, generalmente para el uso con
bibliotecas de ADNc. Los sistemas de expresión de levadura han sido
desarrollados que son usados para seleccionar proteínas segregadas
naturalmente y de membrana de origen mamífero (Klein, et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996 93:7108-7113;
Treco, patente U.S. 5,783,385), y para proteínas heterólogas
fúngicas (Dalboge y Heldt-Hansen, Mol. Gen. Genet.
243:253-260. 243:253-260 (1994)) y
proteínas mamíferas (Tekamp-Olson y Meryweather,
patente U.S. 6,017,731).
El término "levadura" como se usa en el
contexto de sistemas de expresión en levadura generalmente se
refiere a organismos del orden de Saccharomycetales, tales
como S. cerevisiae y Pichia pastoris. Para los
objetivos de esta descripción, los términos "hongos" y
"fúngico" deberían ser entendidos como refiriéndose a
Basidiomycetes, Zygomycetes, Oomycetes, y
Chythridiomycetes, y Ascomycetes de la clase
Euascomycetes, que no son del orden de
Saccharomycetales. Los hongos filamentosos pueden ser
distinguidos de levadura por su alargamiento hifal durante el
crecimiento vegetativo, y el catabolismo de carbono estrictamente
aeróbico (el crecimiento vegetativo en levadura es realizado por
injerto de un talo unicelular, y la levadura puede emplear
catabolismo fermentativo).
La eliminación de intrones apropiada, y
glicosilación, pliegue, y otras modificaciones postraduccionales de
productos genéticos fúngicos serían manipuladas más eficazmente por
unas especies de huéspedes fúngicos, haciendo hongos filamentosos
huéspedes superiores para seleccionar ADN genómico de muestras de
tierra. También los convierte en huéspedes excelentes para la
producción de enzimas fúngicas de interés comercial, tales como
proteasas, celulasas, y amilasas. Se ha encontrado también que los
hongos filamentosos son capaces de transcribir, traducir, tratar, y
segregar los productos de otros genes eucarióticos, incluso de
genes mamíferos. Ésta propiedad convierte a los hongos filamentosos
en huéspedes atractivos para la producción de proteínas de interés
biomédico. Los modelos de glicosilación introducidos por los hongos
filamentosos se asemejan más a estos de proteínas mamíferas de lo
que lo hacen los modelos introducidos por la levadura. Por estas
razones, se han gastado muchos esfuerzos en el desarrollo de
sistemas de huéspedes fúngicos para la expresión de proteínas
heterólogas, y varios sistemas de expresión fúngica han sido
desarrollados. Para revisiones de trabajos en este área, véase
Maras et al., Glycoconjugate J.,16:99-107
(1999); Peberdy, Acta Microbiol. Immunol. Hung.
46:165-174 (1999); Kruszewsa, Acta Biochim. Pol.
46:181-195 (1999); Archer et al., Crit. Rev.
Biotechnol.17:273-306 (1997); y Jeenes et
al., Biotech. Genet. Eng. Rev. 9:327-367
(1991).
La expresión de alto rendimiento y evaluación de
bibliotecas de ADN derivadas de genomas fúngicos también serán
útiles para asignar funciones a los muchos genes mamíferos que son
habitualmente de función desconocida. Por ejemplo, una vez
identificada una proteína fúngica con una propiedad de actividad de
interés, la secuencia del gen codificante puede ser comparada con
la secuencia del genoma humano para buscar genes homólogos.
Yelton et al., Pat. U.S. Nº. 4,816,405,
expone la modificación de Ascomycetes filamentosos para
producir y segregar proteínas heterólogas. Buxton et al., en
Pat. U.S. Nº. 4,885,249, y en Buxton y Radford, Mol. Gen.
Genet.196: 339-344 (1984), expone la transformación
de Aspergillus niger por un vector de ADN que contiene un
marcador seleccionable capaz de ser incorporado en las células
huéspedes. McKnight et al., patente U.S. 4,935,349, y Boel,
en patente U.S. 5,536,661, revelan métodos para la expresión de
genes eucarióticos en Aspergillus que implican promotores
capaces de dirigir la expresión de genes heterólogos en
Aspergillus y otros hongos filamentosos. Royer et
al., en patente estadounidense 5,837,847, y Berka et al.,
en WO 00/56900, revelan sistemas de expresión para el uso en
Fusarium venenatum utilizando promotores naturales y
mutantes de Fusarium spp.. Conneely et al., en
patente U.S. 5,955,316, revelan constructos plásmidos adecuados para
la expresión y producción de lactoferrina en Aspergillus.
Glucosa-oxidasa de Cladosporium ha sido
expresada en Aspergillus (patente U.S. 5,879,921).
Técnicas similares han sido usadas en
Neurospora. Lambowitz, en la patente U.S. 4,486,533, expone
un vector de ADN que se replica de manera autónoma para hongos
filamentosos y su uso para la introducción y expresión de genes
heterólogos en Neurospora. Stuart et al. describen la
cotransformación de esferoplastos de Neurospora crassa con
genes mamíferos y elementos endógenos transcripcionales reguladores
en la patente U.S. 5,695,965, y una cepa mejorada de
Neurospora que tiene niveles reducidos de proteasa
extracelular en la patente U.S. 5,776,730. Vectores para
transformación de Neurospora están descritos en la patente
U.S. 5,834,191. Takagi et al. describen un sistema de
transformación para Rhizopus en la patente U.S. 5,436,158.
Sisniega-Barroso et al. describen un sistema
de transformación para hongos filamentosos en WO 99/51756, que
emplea promotores de los genes de
glutamato-deshidrogenasa de Aspergillus
awamori. Dantas-Barbosa et al., FEMS
Microbiol. Left. 1998 169:185-190, describen la
transformación de Humicola grisea var. thermoidea para
resistencia a la higromicina B, usando bien el método de acetato de
litio o bien electroporación.
Entre los sistemas de expresión fúngica más
exitosos están estos de Aspergillus y Trichoderma,
por ejemplo como se describe por Berka et al. en la patente
U.S. 5,578,463; véase también Devchand y Gwynne, J. Biotechnol.
17:3-9 (1991) y Gouka et al., Appl.
Microbiol. Biotechnol. 47:1-11 (1997). Ejemplos de
cepas transformadas de Myceliophthora thermophila,
Acremonium alabamense, Thielavia terrestris y
Sporotrichum cellulophilum están presentados en WO 96/02563
y las patentes U.S. 5,602,004, 5,604,129 y 5,695,985, que describen
inconvenientes determinados de los sistemas de Aspergillus y
de Trichoderma y sugieren que otros hongos pueden ser más
adecuados en la producción de proteínas a gran escala.
Los métodos para la transformación de filos
distintos de los Ascomycetes son conocidos en la técnica;
véase por ejemplo Munoz-Rivas et al., Mol.
Gen. Genet. 1986 205:103-106 (Schizophyllum
commune); van de Rhee et al., Moll. Gen. Genet. 1996
250:252-258 (Agaricus bisporus); Aenau et
al., Mol. Gen. Genet. 1991 225:193-198 (Mucor
circinelloides); Liou et Al., BioSci. Biotechnol.
Biochem. 1992 56:1503-1504 (Rhizopus niveus);
Judelson et al., Mol. Plant Microbe Interact. 1991
4:602-607 (Phytophthora infestans); y de
Groot et al., Nature Biotechnol. 1998
16:839-842 (Agaricus bisporus).
Además de los métodos usuales de transformación
de hongos filamentosos, tal como por ejemplo la fusión de
protoplastos, Chakraborty y Kapoor, Nucleic Acids Res. 18:6737
(1990) describen la transformación de hongos filamentosos por
electroporación. De Groot et al., en Nature Biotechnol. 16:
839-842 (1998), describen la transformación mediada
por Agrobacterium tumefaciens de diferentes hongos
filamentosos. La introducción biolística de ADN en hongos ha sido
realizada; véase por ejemplo Christiansen et al., Curr.
Genet. 29:100-102 (1995); Durand et al.,
Curr. Genet. 31:158-161 (1997); y Barcellos et
al., Can. J. Microbiol. 44:1137-1141 (1998). El
uso de partículas magnéticas para la transfección
"magneto-biolistica" de células está descrito
en las patentes U.S. 5,516,670 y 5,753,477, y está previsto que sea
aplicable para hongos filamentosos.
Es evidente que se ha hecho mucho trabajo para
desarrollar sistemas de expresión usando hongos como huéspedes. No
obstante, los huéspedes fúngicos comunes son todos hongos
filamentosos, que tienden a formar esteras enredadas de micelios en
cultivos no agitados, y cultivos en suspensión altamente viscosos
(sumergidos) en biorreactores de tanque agitado. Estas propiedades
de hongos filamentosos también causan algunos problemas en la
producción industrial de enzimas en células huéspedes fúngicas. Por
ejemplo, la alta viscosidad y/o la formación local de agregados
densos de micelios, conduce a dificultades en agitación,
ventilación, y difusión de nutrientes. En general, los hongos
filamentosos no son capaces de microinyectar cultivos de suspensión
en placas de microtitulación, debido a la viscosidad de los
cultivos. Además, debido a los micelios enredados, un cultivo de un
hongo filamentoso típico que expresa un banco de ADN no es
fácilmente separado en clones separados a gran escala, lo que
previene la evaluación de los genotipos individuales como sería
requerido en un sistema de ensayos de alto rendimiento.
Los hongos filamentosos típicos, en ausencia de
agitación constante, tienden a crecer en forma de esteras en la
superficie de un medio de cultivo líquido, dónde éstos producen
esporas aéreas. Ellos generalmente no esporulan cuando están en
cultivo sumergido. Ambas propiedades presentan obstáculos
sustanciales al cultivo de clones filamentosos fúngicos en placas de
mircotitulación, y a la manipulación eficaz y uso de tales cultivos
para la selección de alto rendimiento. Las esporas suspendidas u
otros elementos competentes serán reproductivamente adecuados para
la separación y distribución en pocillos de microtitulación
individuales, mientras que la producción de esporas aéreas llevarán
a la contaminación cruzada de pocillos de microtritulación si se
permite que se formen las esteras de superficie. La agitación del
medio en los pocillos de microtritulación, hasta la extensión
necesaria para prevenir la formación de esteras, no es realizable.
Además del problema de las esporas aéreas difíciles de controlar,
las esteras de superficie interfieren con ligera transmisión,
haciendo muchos ensayos (en particular ensayos de absorbencia
espectrofotométrica) difíciles o imposibles. Las esteras de
superficie también interferen con procesos tales como oxigenación,
adición de reactivos y nutrientes, e inyección por pipeta.
La influencia de morfología fúngica en las
propiedades físicas del cultivo ha sido reconocida, y las cepas
naturales que tienen morfología más favorable han sido
identificadas, como se describe por ejemplo por Jensen y
Boominathan en la patente U.S. 5,695,985. La distribución homogénea
de micelios sueltos, con ramificación pronunciada, fue descrita
como una morfología particularmente deseable. Schuster y Royer, en
la solicitud de patente internacional WO 97/26330 y la patente
estadounidense 6,184,026, sugieren un método similar de células
micóticas de identificación que tienen una morfología más adecuada
para la producción industrial de proteínas heterólogas. El método
comprende la selección de mutantes de una línea celular fúngica
parental, mejor que cepas de tipo salvaje, para encontrar una
morfología específica alterada, transformando el mutante, y
evaluando si un cultivo del mutante transformado produce más
proteína heteróloga que la línea celular parental. Mutantes con al
menos un 10% de ramificación hifal superior son particularmente
reivindicados. El método está ilustrado para cepas de
Trichoderma, Fusarium y Aspergillus, y está
sugerido para ser aplicable para otros numerosos géneros.
El efecto de frecuencia de ramificación en
viscosidad de cultivo de mutantes de Aspergillus oryzae fue
examinado por Bocking et al., Biotechnol. Bioeng.
65:638-648 (1999); cepas más altamente ramificadas
presentaron viscosidad inferior en este estudio. Van Wezel et
al., en la solicitud de PCT WO 00/00613, describen métodos para
reducir la ramificación y/o aumentar la fragmentación de
microorganismos filamentosos, por los cuales la viscosidad del
cultivo es reducida. El método implica transfomar los
microorganismos con el gen de SsgA de Streptomyces
griseus. El método está demostrado en bacterias filamentosas
del orden de los Actinomycetales, pero está establecido que sean
aplicables para hongos filamentosos. Dunn-Coleman
et al., en WO 00/56893, describen un mutante HbrA2 de A.
nidulans, que muestra un fenotipo hiperramificado cuando crece
por encima de 42ºC, y observaron una relación lineal entre el grado
de ramificación hifal y la viscosidad del cultivo.
Muchos esfuerzos previos en el campo de sistemas
de expresión fúngica filamentosa han sido dirigidos a la
identificación de cepas adecuadas para la producción industrial de
enzimas, y en consecuencia la atención ha estado focalizada en la
viscosidad del cultivo, estabilidad de la transformación,
rendimiento de la proteína heteróloga por unidad de volumen, y
rendimiento como un porcentaje de biomasa. Las bibliotecas de ADN
han sido expresadas en hongos; veéase por ejemplo Gems y
Clutterbuck, Curr. Genet. 1993 24:520-524, donde
una biblioteca de Aspergillus nidulans fue expresada en A.
nidulans y Gems et al., Mol. Gen. Genet. 1994
242:467-471 donde una biblioteca genómica de
Penicillium fue expresada en Aspergillus. Ninguno de
estos informes describió o sugirió la selección de las proteínas
expresadas; fue a través de complementación de alelos mutantes en
el huésped que la expresión de genes de la biblioteca de ADN fue
demostrada. El método de complementación requiere un huésped
mutante específico para cada actividad de proteína exógena que se
desea detectar, y no proporciona una herramienta para la selección
general de bibliotecas.
La clonación de un gen de invertasa de
Aspergillus niger por expresión en Trichoderma reesei
fue descrita por Berges et al., Curr. Genet. 1993
24:53-59. Usando una biblioteca genómica de A.
niger construida en un vector de cósmido conteniendo un
marcador seleccionable, y usando como huésped T. reesei (que
es incapaz de utilizar sacarosa), un gen de invertasa de A.
niger fue clonado por un procedimiento de selección familiar.
Aquí, nuevamente, una característica muy específica del huésped fue
requerida para detectar la presencia de una única proteína exógena
expresada, y la selección de la biblioteca genómica no fue descrita
o permitida.
WO93/11249 describe un método para clonar
proteínas en huéspedes de levadura de modo que las proteínas son
segregadas desde la célula huésped.
WO99/32617 se refiere a la expresión de ADN en
huéspedes filamentosos fúngicos para identificar proteínas de
interés. El método implica propagación en medios sólidos y no es
corregible para selección de alto rendimiento.
Las características de una célula huésped
fúngica adecuada para la expresión de una biblioteca de ADN son
diferentes en muchos aspectos a partir de las características de
huéspedes adecuados para la producción de proteínas industriales.
En términos generales, un huésped adecuado fúngico para selección
de alto rendimiento debería reunir numerosos criterios; entre éstos
se encuentran los siguientes:
- -
- el huésped debe ser transformado con alta eficiencia.
- -
- el huésped debe procesar genes conteniendo intrones y efectuar cualquier empalme necesario.
- -
- el huésped debe procesar postraduccionalmente la proteína expresada de modo que sea producido en una forma activa.
- -
- cuando la biblioteca debe ser evaluada para una proteína, el huésped debe producir la proteína en rendimiento alto suficiente para la detección por el ensayo.
- -
- el huésped debería aceptar una variedad de elementos reguladores de la expresión, para facilidad de uso y versatilidad.
- -
- el huésped debería permitir el uso de marcadores seleccionables fácilmente.
- -
- los cultivos de célula huésped deberían ser de viscosidad baja.
- -
- el huésped debería ser deficitario de proteasas y/o ser asequible para la supresión de expresión de proteasa.
- -
- el huésped debe permitir selecciones para una amplia variedad de actividades o propiedades de proteínas exógenas.
- -
- las hifas en un cultivo del hongo huésped no deberían estar tan enredadas para prevenir el aislamiento de clones individuales, y no deberían estar tan enredadas para aumentar la viscosidad hasta el punto de prevenir una transferencia y replicación eficaces en un formato de selección miniaturizado de alto rendimiento (p. ej. por micropipetado).
- -
- el huésped no debería formar esteras de superficie, sino que debería preferentemente crecer como un cultivo sumergido.
- -
- el huésped debería permitir la producción eficaz de esporas sumergidas u otros propágulos bajo las condiciones de crecimiento proporcionadas en la selección de alto rendimiento.
En los casos donde los metabolitos están siendo
seleccionados, sería ventajoso si las células huéspedes segregan
los metabolitos en el medio, donde estos podrían ser fácilmente
detectados y/o evaluados. Idealmente, el huésped debería segregar
sólo la proteína exógena.
En los casos donde una proteína está siendo
evaluada, sería particularmente ventajoso si el huésped también
expresa suficiente proteína heteróloga para permitir el aislamiento
y purificación de la proteína. Una célula huésped con esta
característica permitirá además caracterizar todas las proteínas
heterólogas de interés simplemente cultivando las células
huéspedes, sin las manipulaciones biológicas moleculares tediosas
necesarias para transferir el gen a otro organismo.
Preferiblemente, el huésped debería ser capaz de segregar la
proteína, puesto que esto permitiría ensayos más fiables y más
variados.
También sería ventajoso que la célula huésped
fuera asequible para preparar el aislamiento del ADN heterólogo, de
modo que estudios posteriores y modificaciones del gen mismo puedan
ser realizados.
Además de estas cualidades del huésped, el
sistema de transformación debería también presentar ciertas
características. La frecuencia de transformación debería ser
suficientemente alta para generar los números de transformantes
requeridos para selecciones significativas. Idealmente, la expresión
de la proteína exógena estará inducida por un único inductor, por
una única vía, que actúa en un único promotor.
Hasta el momento, ninguna combinación de células
huéspedes y sistema de transformación ha sido desarrollado que
reúna todos, o incluso más, de estos criterios. En consecuencia,
permanece una necesidad de célula huésped fúngica y sistemas de
transformación que sean capaces de expresar eficazmente los
productos genéticos de una biblioteca de ADN, especialmente
bibliotecas de ADN genómico y/o genómico eucariótico.
La presente invención emplea hongos filamentosos
que producen "elementos reproductivos transferibles" cuando
crecen en cultivo sumergido. Por "elemento reproductivo
transferibile" se entiende una espora, propágulo, fragmento
hifal, protoplasto, microgránulo, u otro elemento fúngico es decir
(1) fácilmente separado de otros elementos de este tipo en el medio
de cultivo, y (2) capaz de reproducirse él mismo en un cultivo
monoclonal. Los hongos preferiblemente también muestran un fenotipo
filamentoso menos pronunciado y/o una morfología de crecimiento
compacto, y producen cultivos de viscosidad baja que son adecuados
para las manipulaciones físicas implicadas en la selección de
bibliotecas de ADN de alto rendimiento. Particularmente preferidos
son los hongos filamentosos que, incluso en la ausencia de
agitación, tienden a crecer como cultivos sumergidos mejor que como
esteras de superficie.
La presente invención toma ventaja de las
propiedades del sistema de transformación descrito en solicitudes
de patente internacionales PCT/NL99/00618 y PCT/EP99/202516. Estas
aplicaciones describen un sistema de transformación eficaz para
huéspedes filamentosos fúngicos tales como Cluysosporium
lucknowense y Aspergillus sojae. Estas aplicaciones
también revelan que cepas mutantes son fácilmente preparadas que
retienen todas las ventajas de las células huéspedes tipo salvaje,
pero que han perdido parcialmente su fenotipo filamentoso y por lo
tanto proporcionan cultivos de baja viscosidad.
Los hongos preferidos para el uso en la
invención expresan y segregan cantidades grandes de proteína
exógena, que producen una alta proporción de proteína/biomasa
respecto a los huéspedes fúngicos filamentosos previamente
conocidos. La invención proporciona un sistema de transformación que
muestra rendimientos altos de transformantes. La invención también
proporciona bibliotecas de hongos transformantes que expresan
eficazmente los productos de proteínas de insertos de ADNc
heterólogo, y especialmente insertos de ADN genómico. En otro
aspecto de la invención, las bibliotecas de hongos transformados
pueden ser usados para la selección de actividades o propiedades de
las proteínas heterólogas, o para la selección de metabolitos
producidos por los hongos transformados como una consecuencia de
actividades de la proteína exógena, o para la selección del ADN
heterólogo o para transcripciones de ARN derivadas del mismo. Será
apreciado que la presente invención también permite la selección de
alto rendimiento de metabolitos de cepas no transformadas que
tienen las características fenotípicas anteriormente descritas.
El término "hongo filamentoso mutante" como
se utiliza en este caso se refiere simplemente a hongos no
encontrados en la naturaleza. Las "mutaciones" que llevan a
características fenotípicas deseables, tales como una forma de
crecimiento compacta, viscosidad baja, niveles de proteasa
reducidos, crecimiento sumergido, etc., pueden ser introducidas de
forma aleatoria por medios bien tradicionales, tales como
irradiación UV y mutagénesis química, o por métodos moleculares
biológicos tales como mutagénesis de "cassette", o pueden ser
deliberadamente introducidas por métodos de ingeniería genética. Si
se encontrara que un hongo natural posee las propiedades
necesarias, por supuesto será utilizable en los métodos de la
invención.
En otro aspecto adicional de la invención, las
bibliotecas de hongos transformados pueden ser seleccionadas para
propiedades útiles de los hongos ellos mismos, tales como por
ejemplo niveles altos de producción de una proteína o metabolito
expresado particular. Este aspecto de la invención está ilustrado
por un ensayo cuantitativo para la proteína expresada de interés,
donde el transformante particular que tiene la combinación más
favorable de producción de proteína, procesamiento de proteína, y
secreción de proteína sería detectado.
En otro aspecto de la invención, las bibliotecas
de hongos transformados pueden ser seleccionadas por la presencia
de secuencias de ADN capaces de hibridarse con una sonda de ácidos
nucleicos de interés.
Figura 1 es una prueba de Western blot como se
describe en los ejemplos.
Figura 2 es un mapa pUT720.
Figura 3 es un mapa pUT970G.
Figura 4 es un mapa pUT1064.
Figura 5 es un mapa pUT1 065.
Figura 6 es un mapa pF6g.
Figura 7 es un mapa pUT1150.
Figura 8 es un mapa pUT1152.
Figura 9 es un mapa pUT1155.
Figura 10 es un mapa pUT1160.
Figura 11 es un mapa pUT1162.
Figura 12 es la estructura esquemática de la
proteína pclA.
Figura 13A es una microfotografía de
Aspergillus niger de tipo salvaje.
Figura 13B es una microfotografía de un mutante
pclA de Aspergillus niger.
Figura 14A es una microfotografía de
Aspergillus sojae tipo salvaje.
Figura 14B es un microfotografía de un mutante
pclA de Aspergillus sojae.
Figuras 15A-E presentan los
resultados de secuenciación del gen pyrE. El subrayado indica que
la secuencia de aminoácidos no es continua debido a algunas
incertidumbres de secuencia. Los aminoácidos indicados son los más
probables. La letra negrita indica intrones putativos/probables.
En su aspecto más amplio, la invención se
refiere a hongos filamentosos transformados que generan elementos
reproductivos transferibles en suspensión, a bibliotecas de hongos
de este tipo, y a métodos de selección de bibliotecas de este tipo
por las propiedades biológicas de interés, tal como actividad
bioquímica o biológica asociada a proteínas expresadas exógenas o
asociadas a metabolitos, es decir, productos de molécula pequeña
producidos por enzimas endógenas y/o exógenas. La biblioteca de
hongos filamentosos de baja viscosidad comprende hongos que
contienen secuencias de ácidos nucleicos, cada secuencia de ácidos
nucleicos codificando una proteína heteróloga, cada una de dichas
secuencias de ácidos nucleicos estando operativamente enlazadas a
una región reguladora de la expresión y opcionalmente una secuencia
de codificación de señal de secreción y/o una secuencia
codificadora de proteína transportadora. Preferiblemente una cepa
transformada según la invención segregará la proteína
heteróloga.
heteróloga.
Los métodos de expresión y de selección de la
invención, y los hongos empleados en los mismos, son útiles para
producir hongos, proteínas, metabolitos, y moléculas de ADN que
tienen utilidad en una variedad de aplicaciones. Los métodos de la
invención son también útiles para producir información sobre la
secuencia de ácidos nucleicos y de proteínas, y esta información
misma está considerada como un producto valioso de los métodos
reivindicados.
Hongos preferidos filamentosos de la invención
están caracterizados por la viscosidad baja del medio de cultivo.
Mientras que un hongo filamentoso típico de grado industrial
producirá cultivos con viscosidades bien sobre 200 centipoise (cP)
y normalmente sobre 1.000 cP, y pueden alcanzar 10.000 cP, los
hongos de esta invención muestran una viscosidad de cultivo inferior
a 200 cP, preferiblemente inferior a 100 cP, más preferiblemente
inferior a 60 cP, y de la forma más preferible inferior a 10 cP
después de 48 o más horas de cultivo en presencia de nutrientes
adecuados bajo condiciones de crecimiento óptimas o casi óptimas.
Los hongos filamentosos de la invención normalmente muestran una
morfología caracterizada por hifas, o microgránulos, cortas,
específicas, no enredadas. Los microgránulos son colecciones
ligeramente o no enredadas de hifas que surgen de un único clon,
tan diferentes de los granulados que son mucho más grandes y son
derivados de clones múltiples enredados. Por ejemplo, la cepa
mutante UV 18-25 Chrysosporium lucknowense
(viscosidad < 10 cP) y la cepa mutante X-252 de
Trichoderma longibrachiatum morfológicamente similar
(viscosidad < 60 cP) están caracterizadas por la presencia de
hifas cortas, diferentes, no enredadas entre 100 y 200 micras en
longitud, y la pclA mutante de Aspergillus sojae de
viscosidad baja creada genéticamente está caracterizada por una
forma compacta con ramificaciones considerables e hifas cortas
(véase Fig. 14). Mientras que los hongos de viscosidad baja
descritos en WO97/26330 están descritos como que tienen
"ramificaciones hifales más extensas", algunos hongos de la
presente invención tienen ramificaciones hifales equivalentes o
incluso ligeramente reducidas cuando se compara con las cepas no
mutantes. Se obtiene como resultado que la longitud hifal juega el
papel dominante en el control de la viscosidad del cultivo.
Las cepas particularmente preferidas fúngicas
están caracterizadas por el hecho de que tienen una alta proporción
exógena de proteína segregada/biomasa. Esta proporción es
preferiblemente mayor que 1:1, más preferiblemente mayor que 2:1, e
incluso más preferiblemente 6:1 o superior. De la forma más
preferible, la proporción es 8:1 o mayor. Estas proporciones altas
son ventajosas en un medio ambiente de selección de alto
rendimiento, porque éstas suponen una concentración más alta de
proteína exógena, permitiendo ensayos de selección más sensibles
y/o más rápidos. Esto es de beneficio particular puesto que el
volumen de la solución de ensayo se reduce, por ejemplo de placas
de 96 pocillos a placas de 384 pocillos, y por consiguiente a
placas de 1536 pocillos. Los métodos de la presente invención son
adecuados para cualquiera de estos formatos de placa de
microtitulación, y para otros muchos formatos HTS que utilizan
muestras líquidas.
Está contemplado que cualquier hongo filamentoso
puede ser convertido, por los procesos de mutación descritos aquí,
en cepas mutantes adecuadas para el uso en la presente invención.
Entre los géneros preferidos de hongos filamentosos están el
Chrysosporium, Thielavia, Neurospora, Aureobasidium,
Filibasidium, Piromyces, Cryplococcus, Acremonium, Tolypocladium,
Scytalidium, Schizophyllum, Sporotrichum, Penicillium, Gibberella,
Myceliophthora, Mucor, Aspergillus, Fusarium, Humicola, y
Trichoderma, y anamorfos y teleomorfos de los mismos. Más
preferidos son Chrysosporium, Trichoderma, Aspergillus, y
Fusarium. Muy preferido es Chrysosporium. El género y
especies de hongos pueden ser definidos por morfología consistente
con aquella descrita en Barnett y Hunter, Illustrated Genera of
Imperfect Fungi, 3rd Edition, 1972, Burgess Publishing Company. Una
fuente que proporciona detalles en lo que se refiere a la
clasificación de hongos del género Chrysosporium es Van
Oorschot, C.A.N. (1980) "A revision of Chrysosporium and
allied genera" en Studies in Mycology No. 20, Centraal Bureau
voor Schimmelcultures (CBS), Baam, The Netherlands, págs.
1-36. Según estas instrucciones el género de
Chrysosporium cae dentro de la familia Moniliaceae
que pertenece al orden Hyphomycetales.
Otra fuente preparada de suministro de
información en la nomenclatura fúngica son los depositarios del
Tratado de Budapest, especialmente aquellos que suministran bases
de datos online (las siguientes direcciones de internet emplean el
protocolo http). La ATCC (US) proporciona información a
www.atcc.org, el CBS (NE) a www.cbs.knaw.nl, y el VKM (RU) a
www.bdt.org.br.bdt.msdn.vkm/general. Otra fuente es
NT.ars-grin.gov/fungaldatabases. Todas estas
instituciones pueden proporcionar teorias sobre las características
distintivas de especies fúngicas. Una taxonomía alterna del
Ascomycota puede ser encontrada en
www.ncbi.nlm.nih.gov/htbin-post/Taxonomy/wgetorg?mode=Undef&id=
4890. Según esta taxonomía alterna, el género Chrysosporium pertenece a la familia Onygenaceae, orden Onygenales, filo Ascomycota.
4890. Según esta taxonomía alterna, el género Chrysosporium pertenece a la familia Onygenaceae, orden Onygenales, filo Ascomycota.
La definición de Chrysosporium incluye
pero no está limitada a estas cepas: C. botryoides, C.
carmichaelii, C. crassitunicatum, C. europae, C. evolceannui, C.
farinicola, C. fastidium, C. filiforme, C. georgiae, C. globiferum,
C. globiferum var. articulatum, C. globiferum var. niveum, C.
hirundo, C. hispanicum, C. holmii, C. indicum, C. inops, C.
keratinophilum, C. kreiselii, C. kuzurovianum, C. lignorum, C.
lobatum, C. lucknowense, C. lucknowense Garg 27K, C. medium, C.
medium var. spissescens, C. mephiticum, C. merdarium, C. merdarium
var. roseum, C. minor, C. pannicola, C. parvum, C. parvum var.
crescens, C. pilosum, C. pseudomerdarium, C. pyriformis, C.
queenslandicum, C. sigleri, C. sulfureum, C. synchronum, C.
tropicum, C. undulatum, C. vallenarense, C. vespertilium, C.
zonatum.
C. lucknowense es una especie de
Chrysosporium es decir de interés particular puesto que ha
proporcionado un productor natural elevado de proteínas de celulasa
(solicitudes internacionales WO 98/15633, PCT/NL99/00618, y
patentes U.S. 5,811,381 y 6,015,707). Las cepas con números de
registro de depositario internacional ATCC 44006, CBS 251.72, CBS
143.77, CBS 272.77, y VKM F-3500D son ejemplos de
cepas de Chrysosporium lucknowense. También incluidas dentro
de la definición de Chrysoporium se encuentran las cepas
derivadas de predecesores de Chrysoporium incluso de
aquellas que han mutado bien naturalmente o por mutagénesis
inducida. Los métodos de la invención, en una forma de realización,
emplean mutantes de Chrysosporium, obtenidos por una
combinación de mutagénesis inducida por irradiación y químicamente,
que tienden a producir elementos reproductivos transferibles en
suspensión, y que muestran una morfología caracterizada por hifas
cortas, específicas, no enredadas ("crecimiento compacto"), y
un fenotipo caracterizado por un crecimiento sumergido y viscosidad
reducida del medio de fermentación cultivado en suspensión. En otra
forma de realización, la invención emplea mutantes fenotípicamente
similares de Trichoderma. En otras formas de realización la
invención emplea mutantes fenotípicamente similares de
Aspergillus sojae o Aspergillus niger.
Por ejemplo, VKM F-3500D (cepa
"C1") fue mutagenizada sometiéndola a luz ultravioleta para
generar la cepa UV13-6. Esta cepa fue posteriormente
mutada adicionalmente con
N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina
para generar la cepa NG7C-19. Esta última cepa
sucesivamente fue sometida a mutación por luz ultravioleta dando
como resultado la cepa UV18-25 (VKM
F-3631 D). Durante este proceso de mutación las
características morfológicas variaron un tanto en cultivo en
líquido o en placas al igual que bajo el microscopio. Con cada
mutagénesis sucesiva los cultivos mostraron menos apariencia
esponjosa y afieltrada en placas que están descritas como siendo
características de Chrysosporium, hasta que las colonias
lograron una apariencia plana y esterada. Un pigmento marrón
observado con la cepa de tipo salvaje en algunos medios fue menos
predominante en cepas mutantes. En cultivo líquido el mutante
UV18-25 fue evidentemente menos viscoso que la cepa
de tipo salvaje C1 y los mutantes UV13-6 y
NG7C-19. Mientras que todas las cepas mantuvieron
las características microscópicas gruesas de Chrysosporium,
los micelios se volvieron más estrechos con cada mutación sucesiva
y con UV 18-25 se pudo observar una fragmentación
diferente de los micelios. Esta fragmentación micelial es posible
que sea una causa de la viscosidad inferior asociada a los cultivos
de UV18-25. La capacidad de las cepas para
esporulación aérea disminuyó con cada fase mutagénica. Estos
resultados demuestran que una cepa puede pertenecer genéticamente
al género Chrysosporium mientras que presenta desviaciones de
las definiciones taxonómicas tradicionales (morfológicas).
En particular la forma anamorfa de
Chrysosporium ha sido encontrada como adecuada para la
aplicación de la selección según la invención. El metabolismo del
anamorfo lo vuelve particularmente adecuado para un alto grado de
expresión. Un teleomorfo debería también servir como el carácter
genético de los anamorfos y el de los teleomorfos es idéntico. La
diferencia entre anamorfo y teleomorfo es que uno es el estado
asexual y el otro es el estado sexual; los dos estados exhiben
morfología diferente bajo ciertas condiciones.
Otro ejemplo plasma las cepas mutantes creadas
genéticamente a partir de Aspergillus sojae. En uno de estos
mutantes un gen codificante de endoproteasa específico fue
interrumpido. Esto resultó en un fenotipo de crecimiento compacto
que exhibe una ramificación mejorada e hifas cortas, y la formación
de microgránulos en cultivo sumergido. Además, la Aspergillus
sojae a la que se hace referencia en esta aplicación puede ser
inducida a exhibir esporulación eficaz bajo condiciones de cultivo
sumergido específicas, que la vuelven especialmente adecuada para
el uso en un sistema de selección de alto rendimiento. En este
caso, las condiciones propicias para la formación de los elementos
reproductivos transferibles simplemente consistieron en un medio
sintético que contiene 0,6 g/ml de EDTA. Las condiciones propicias
variarán de un huésped a otro, pero es evidente que las condiciones
ya serán conocidas si se encuentra que un huésped es adecuado.
Es preferible usar cepas fúngicas no toxigénicas
y no patógenas, de las cuales un número es conocido en la técnica,
puesto que esto reducirá riesgos al profesional y simplificará el
proceso de selección global. En una forma de realización preferida
los hongos también serán deficitarios de proteasa, para minimizar
la degradación de las proteínas exógenas, y/o susceptible de
supresión de producción de proteasa. El uso de cepas deficitarias de
proteasa como huéspedes de expresión es bien conocido; véase por
ejemplo solicitud PCT WO 96/29391. Las cepas deficitarias de
proteasa pueden ser producidas mediante selección de mutantes, o
el(los) gen(es) de proteasa puede(n) ser
"bloqueados" o por lo contrario inactivado por métodos
conocidos en la técnica, como se describe por ejemplo por
Christensen y Hynes en la patente US 6,025,185 (Aspergillus
oryzae con gen areA no funcional).
Se ha descubierto que los mutantes de
Chrysosporium pueden ser hechos de manera que tengan una
expresión reducida de proteasa, así haciéndolos incluso más
adecuados para la producción de productos proteínicos,
especialmente si el producto proteínico es sensible a la actividad
proteasa. Por lo tanto, la invención puede también emplear una cepa
mutante de Chrysosporium que produce menos proteasa que la
cepa de Chrysosporium no mutante, por ejemplo menos que la
cepa C1 de C. lucknowense (VKM F-3500 D). En
particular la actividad proteasa (más que cualquier proteasa
selectiva destinada a disociar una proteína de fusión segregada) de
tales cepas es inferior a la mitad de la cantidad, más
preferiblemente menos del 30% de la cantidad, y de la forma más
preferible menos de aproximadamente el 10% de la cantidad producida
por la cepa C1. La actividad proteasa disminuida puede ser medida
por métodos conocidos, tal como midiendo el halo formado en placas
de leche desnatada o por degradación de la albúmina de suero bovino
(BSA).
Puede ser deseable inactivar otros genes en el
hongo filamentoso huésped, tales como por ejemplo aquellos que
codifican celulasas y otras proteínas segregadas en gran medida,
para minimizar la interferencia en el ensayo por proteínas huésped.
Los genes que codifican proteínas segregadas pueden ser
delecionados o mutados, o de forma alternativa los genes que
controlan el sistema de inducción u otras rutas implicadas en la
expesión de proteínas indeseadas pueden ser modificados de tal
manera que se reduzca tal expresión. Cuando un promotor endógeno es
empleado en los vectores de la invención (véase abajo), puede ser
especialmente deseable inactivar genes para otras proteínas bajo el
control del mismo inductor. Los hongos susceptibles de supresión de
secreción de proteasa son aquellos donde la expresión de proteasa
está bajo el control de un elemento regulador que responde a las
condiciones medioambientales, de manera que estas condiciones (p.
ej., concentración de aminoácidos) puede ser manipulada para
minimizar la producción de proteasa.
Preferiblemente una región reguladora de la
expresión homóloga que permite la expresión elevada en el huésped
seleccionado es empleada en el vector de transformación. Las
regiones que regulan la expresión elevada derivadas de un huésped
heterólogo, tal como de Trichoderma o Aspergillus,
son bien conocidas en la técnica y pueden también ser usadas. A modo
de ejemplo, y no de limitación, ejemplos de proteínas conocidas
para ser expresadas en cantidades grandes y por lo tanto que
proporcionan secuencias reguladoras de la expresión adecuadas para
el uso en la presente invención son hidrofobina, proteasa, amilasa,
xilanasa, pectinasa, esterasa, beta-galactosidasa,
celulasa (p. ej. endoglucanasa, celobiohidrolasa) y
poligalacturonasa.
Una región reguladora de la expresión comprende
una secuencia del promotor operativamente enlazada a una secuencia
de ácidos nucleicos que codifican la proteína que debe ser
expresada. El promotor es enlazado de manera que la posición
enfrente del codón iniciador de la secuencia que debe ser expresada
permite la expresión. La secuencia del promotor puede ser
constitutiva pero preferiblemente es inducible. El uso de un
promotor inducible y los medios de inducción apropiados favorecen
la expresión de genes operativamente enlazados al promotor.
Cualquier secuencia reguladora de la expresión procedente de una
especie homóloga, o de una cepa heteróloga capaz de permitir la
expresión de una proteína, está prevista. La secuencia reguladora
de la expresión es de manera adecuada una región reguladora de la
expresión fúngica, p. ej. una región reguladora de
ascomycete. De manera adecuada la región reguladora de la
expresión de ascomycete es una región reguladora de
cualquiera de los géneros siguientes: Aspergillus, Trichoderma,
Chrysosporium, Humicola, Neurospora, Tolypocladium, Fusarium,
Penicillium, Talaromyces, o formas sexuales alternativas de las
mismas tales como Emericela e Hypocrea. El promotor
de celobiohidrolasa de Trichoderma; promotores de
alcohol-deshidrogenasa A,
alcohol-deshidrogenasa R,
glutamato-deshidrogenasa, TAKA amilasa,
glucoamilasa, y gliceraldehído fosfato deshidrogenasa de
Aspergillus; promotores de fosfoglicerato y de control de
ruta cruzada de Neurospora; promotor de lipasa y proteinasa
aspártica de Rhizomucor miehei; promotor de
beta-galactosidasa de Penicillium canescens;
y promotores de celobiohidrolasa, endoglucanasa, xilanasa,
gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa
A, y proteasa de Chrysosporium son ejemplos representativos.
Una secuencia reguladora de la expresión del mismo género que la
cepa huésped es preferible, puesto que es más posible que sea
adaptada específicamente al huésped.
Secuencias reguladoras de la expresión naturales
de cepas de Chrysosporium que expresan proteínas en
cantidades extremadamente grandes, son particularmente preferidas.
Ejemplos de tales cepas han sido depositados conforme al tratado de
Budapest con el instituto depositario All Russian Collection (VKM)
en Moscú. La cepa C1 tipo salvaje tiene el número VKM
F-3500 D, fecha de depósito
29-08-1996, el mutante de C1
UV13-6 fue depositado con el número VKM
F-3632 D, y la fecha de depósito
02-09-1998, el mutante de C1
NG7C-19 fue depositado con el número VKM
F-3633 D y fecha de depósito
02-09-1998 y el mutante de C1
UV18-25 fue depositado con el número VKM
F-3631 D y fecha de depósito
02-09-1998. Estas cepas son también
preferidas como fuentes para la generación de mutantes de viscosidad
baja; de hecho la cepa VKM F-3631 D ya muestra el
fenotipo de viscosidad baja necesario. Una cepa mutante de
Trichoderma de viscosidad baja, designada
X-252, se obtuvo después de dos ciclos de
irradiación de Trichoderma longibrachiatum 18.2KK, que a su
vez fue derivado por mutación de la cepa QM 9414 de T.
longibrachiatum (ATCC 26921). En otras formas de realización la
invención emplea mutantes fenotípicamente similares de
Aspergillus sojae y Aspergillus niger.
Preferiblemente, allí donde el huésped es una
Chrysosporium, una secuencia del promotor de
Chrysosporium es empleada para asegurar un buen
reconocimiento de la misma por el huésped. Ciertas secuencias
heterólogas reguladoras de la expresión también funcionan tan
eficazmente en Chrysosporium como en secuencias de
Chrysosporium nativas. Esto permite el uso de constructos y
vectores bien conocidos para la transformación de
Chrysosporium, y ofrece muchas otras posibilidades para
construir vectores que permiten buenos índices de transformación y
de expresión en este huésped. Por ejemplo, las técnicas de
transformación de Aspergillus estándar pueden ser usadas
como se describe por ejemplo por Christiansen et al. en
BiolTechnology 1988 6:1419-1422. Otros documentos
que proporcionan detalles de vectores de transformación de
Aspergillus, p. ej. patentes US 4,816,405, 5,198,345,
5,503,991, 5,364,770, 5,705,358, 5,728,547, y 5,578,463,
EP-B-215,594 (también para
Trichoderma).
Como se han observado índices de expresión
extremadamente altos para celulasa en cepas de
Chrysosporium, las regiones que regulan la expresión de
genes de celulasa son particularmente preferidos.
Los vectores de la invención pueden comprender
una secuencia del promotor derivada de un gen que codifica una
enzima, preferiblemente una enzima segregada. Ejemplos de enzimas
adecuadas de las cuales pueden tomarse las secuencias del promotor
son las enzimas degradadoras de carbohidratos (p. ej., celulasas,
xilanasas, mananasas, manosidasas, pectinasas, amilasas, p. ej.
glucoamilasas, \alpha-amilasas, \alpha- y
\beta-galactosidasas, \alpha- y
\beta-glucosidasas,
\beta-glucanasas, quitinasas, quitanasas),
proteasas (endoproteasas, amino-proteasas, amino- y
carboxipeptidasas), otras hidrolasas (lipasas, esterasas, fitasas),
oxidorreductasas (catalasas, glucosa-oxidasas) y
transferasas (transglicosilasas, transglutaminasas, isomerasas e
invertasas). Diferentes ejemplos de Chrysosporium lucknowense
están presentados en la tabla A.
Un constructo de ácidos nucleicos
preferiblemente comprenderá una región reguladora de la expresión
de ácidos nucleicos de Chrysosporium, más preferiblemente de
Chrysosporium lucknowense o un derivado, operativamente
enlazada a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una
proteína que debe ser expresada. Constructos de ácidos nucleicos
particularmente preferidos comprenderán una región reguladora de la
expresión de Chrysosporium asociada a la expresión de
celulasa o xilanasa, preferiblemente a la expresión de
celobiohidrolasa, de la forma más preferible a la expresión de la
celobiohidrolasa de 55 kDa (CBH1) descrita en la tabla A. Como
ejemplos adicionales, las secuencias del promotor de
Chrysosporium de hidrofobina, proteasa, amilasa, xilanasa,
esterasa, pectinasa, beta-galactosidasa, celulasa
(p. ej. endoglucanasa, celobiohidrolasa) y poligalacturonasa están
también consideradas dentro del campo de la invención.
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(Tabla pasa a página
siguiente)
Cualquiera de los promotores o regiones
reguladoras de la expresión de enzimas descritas en la tabla A, por
ejemplo, pueden ser empleados de manera adecuada. Las secuencias de
ácidos nucleicos de estos promotores y regiones reguladoras pueden
rápidamente ser obtenidas de una cepa de Chrysosporium. Los
métodos por los que las secuencias del promotor pueden ser
determinadas son numerosos y bien conocidos en la técnica. Las
secuencias del promotor son generalmente encontradas inmediatamente
delante del codón de iniciación ATG al principio del gen pertinente.
Por ejemplo, las secuencias del promotor pueden ser identificadas
delecionando secuencias corriente arriba del gen pertinente, usando
técnicas de ADN recombinante, y examinando los efectos de estas
deleciones en la expresión del gen. También, por ejemplo, las
secuencias del promotor pueden frecuentemente ser inferidas
comparando la secuencia de regiones corriente arriba del gen
pertinente con secuencias del promotor de consenso.
Por ejemplo, las secuencias del promotor de
endoglucanasas de C1 fueron identificadas de esta manera (véase
PCT/NL99/00618) por clonación de los genes correspondientes. Los
promotores preferidos según la invención son los promotores de
celobiohidrolasa (CBH1) de 55 kDa, de
gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa
A, y de xilanasa (XyIF) de 30 kDa de Chrysosporium, puesto
que estas enzimas son expresadas en un nivel alto por sus propios
promotores. Los promotores de las enzimas degradadoras de
carbohidratos de Chrysosporium lucknowense en particular,
especialmente C. lucknowense GARG 27K, pueden ser usadas
ventajosamente para expresar bibliotecas de proteínas en otros
organismos huéspedes fúngicos.
Formas de realización particulares de las
secuencias de ácidos nucleicos según la invención son conocidas
para Chrysosporium, Aspergillus y Trichoderma.
Los promotores para Chrysosporium están descritos en
PCT/NL99/00618. La técnica anterior proporciona varias regiones de
regulación de la expresión para el uso en Aspergillus, p. ej.
patentes U.S. 4,935,349, 5,198,345, 5,252,726, 5,705,358; y
5,965,384; y solicitud PCT WO 93107277. La expresión en
Trichoderma se describe en la patente U.S. 6, 022,725.
El gen de hidrofobina es un gen fúngico que es
altamente expresado. Se sugiere por lo tanto que la secuencia del
promotor de un gen de hidrofobina, preferiblemente de
Chrysosporium, puede ser de manera adecuada aplicada como
secuencia reguladora de la expresión en una forma de realización
adecuada de la invención. Las secuencias de genes de Trichoderma
reesei y de Trichoderma harzianum para hidrofobina han
sido descritas por ejemplo en la técnica anterior al igual que una
secuencia de genes para Aspergillus fumigatus y
Aspergillus nidulans y la información de la secuencia
pertinente está incorporada por la presente como referencia
(Nakari-Setala et al., Eur. J. Biochem.
1996, 235:248-255; Parta et al., Infect.
Immun. 1994 62:4389-4395; Munoz et al.,
Curr. Genet. 1997, 32:225-230; y Stringer et
al., Mol. Microbiol. 1995 16:33-44). Usando
esta información de secuencia un experto en la técnica puede
obtener las secuencias reguladoras de la expresión de genes de
hidrofobina de Chrysosporium sin la experimentación indebida
después de técnicas estándar tales como aquellas sugeridas arriba.
Una cepa de Chrysosporium recombinante según la invención
puede comprender una región reguladora de hidrofobina operativamente
enlazada a la secuencia que codifica la proteína heteróloga.
Una secuencia reguladora de la expresión puede
también adicionalmente comprender un intensificador o silenciador.
Estos son también bien conocidos en la técnica anterior y están
normalmente localizados a cierta distancia del promotor. Las
secuencias reguladoras de la expresión pueden también comprender
promotores con sitios de enlace activadores y sitios de enlace
represores. En algunos casos tales sitios pueden también ser
modificados para eliminar este tipo de regulación. Por ejemplo,
promotores filamentosos fúngicos donde los sitios de creA están
presentes han sido descritos. Los sitios de creA pueden ser mutados
para asegurar que la represión de glucosa que normalmente resulta
de la presencia de creA es eliminada. El uso de tal promotor
habilita la producción de la biblioteca de proteínas codificada por
las secuencias de ácidos nucleicos reguladas por el promotor en
presencia de glucosa. El método es ejemplificado en WO 94/13820 y
WO 97/09438. Estos promotores pueden ser usados bien con o sin sus
sitios de creA. Los mutantes donde los sitios de creA han sido
mutados pueden ser usados como secuencias reguladoras de la
expresión en una cepa recombinante según la invención y la
biblioteca de secuencias de ácidos nucleicos regulada por ésta
puede después ser expresada en presencia de glucosa. Tales
promotores de Chrysosporium aseguran la desrepresión en una
manera análoga a aquella ilustrada en WO 97/09438. La identidad de
sitios de creA es conocida a partir de la técnica anterior. De
forma alternativa, es posible aplicar un promotor con sitios de
enlace de creA que no han sido mutados en una cepa huésped con una
mutación en otro lugar en el sistema de represión p. ej. en el gen
creA mismo, de modo que la cepa puede, sin importar la presencia de
sitios de enlace de creA, producir la biblioteca de proteínas en
presencia de glucosa.
Las secuencias del terminador son también
secuencias reguladoras de la expresión y éstas están operativamente
enlazadas a los terminales 3' de las secuencias que deben ser
expresadas. Una variedad de terminadores fúngicos conocidos son
posibles para ser funcionales en las cepas huéspedes de la
invención. Ejemplos son el terminador trpC de A. nidulans, el
terminador de alfa-glucosidasa de A. niger,
el terminador de glucoamilasa de A. niger, el terminador de
carboxil proteasa de Mucor miehei (véase US 5,578,463), y el
terminador de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei. Las
secuencias del terminador de Chrysosporium, p. ej. el
terminador EG6, funcionará por supuesto bien en
Chrysosporium.
Un vector de transformación adecuado para el uso
según la invención puede opcionalmente tener las secuencias de
ácidos nucleicos exógenas para ser expresadas operativamente
enlazadas a una secuencia que codifica una secuencia señal. Una
secuencia señal es una secuencia de aminoácidos que, cuando está
operativamente enlazada a la secuencia de aminoácidos de una
proteína expresada, habilita la secreción de la proteína del
organismo huésped. Tal secuencia señal puede ser una asociada a una
proteína heteróloga o puede ser una nativa al huésped. La secuencia
de ácidos nucleicos que codifica la secuencia señal debe ser
situada en marco para permitir la traducción de la secuencia señal
y las proteínas heterólogas. Las secuencias señal serán
particularmente preferidas cuando la invención está siendo usada en
conjunción con la evolución molecular dirigida, y una única proteína
exógena segregada está siendo desarrollada.
Será entendido que es menos ventajoso incorporar
una secuencia señal en un vector que debe ser usado para expresar
una biblioteca, puesto que esto reducirá la probabilidad de
expresión de la proteína de interés. En una biblioteca genómica
preparada por corte aleatorio del ADN y clonación en un vector, la
probabilidad de que se obtenga una fusión en marco de un gen en la
biblioteca con la secuencia señal es baja. También, incluso cuando
una fusión dentro del marco de lectura ha sido obtenida, la
secuencia señal elegida puede no funcionar con todos los genes. Por
estas razones puede ser preferible no emplear una secuencia señal
cuando se selecciona una biblioteca de ADN genómico, sino que mejor
seleccionar la actividad o la presencia de una proteína exógena
intracelular. El análisis de la actividad o presencia de proteínas
intracelulares puede ser realizado pretratando la biblioteca
transformante con enzimas que convierten las células micóticas en
protoplastos, seguido de lisis. El procedimiento ha sido descrito
por van Zeyl et al., J. Biotechnol.
59:221-224 (1997). Este procedimiento ha sido
aplicado a Chrysosporium para permitir que la PCR de la
colonia de transformantes de Chrysosporium crezca en placas
de microtitulación.
Cualquier secuencia señal capaz de permitir la
secreción de una proteína de una cepa de Chrysosporium está
prevista. Tal secuencia señal es preferiblemente una secuencia
señal fúngica, más preferiblemente una secuencia señal de
Ascomycete. Las secuencias señal adecuadas pueden ser
derivadas de eucariotas generalmente, preferiblemente de levaduras o
de cualquiera de los géneros de hongos siguientes: Aspergillus,
Trichoderma, Chrysosporium, Pichia, Neurospora, Rhizomucor,
Hansenula, Humicola, Mucor, Tolypocladium, Fusarium, Penicillium,
Saccharomyces, Talaromyces o formas sexuales alternativas de
las mismas tales como Emericella e Hypocrea.
Secuencias señal que son particularmente útiles son aquellas
originalmente asociadas a celobiohidrolasa, endoglucanasa,
beta-galactosidasa, xilanasa, pectinasa, esterasa,
hidrofobina, proteasa o amilasa. Ejemplos incluyen amilasa o
glucoamilasa de Aspergillus o Humicola, TAKA amilasa
de Aspergillus oryzae, \alpha-amilasa de
Aspergillus niger, carboxil peptidasa de Mucor (US
5,578,463), una lipasa o proteinasa de Rhizomucor miehei,
celobiohidrolasa de Trichoderma,
beta-galactosidasa de CBH1 de Penicillium
canescens de Chrysosporium, y el factor alfa de
acoplamiento de
Saccharomyces.
Saccharomyces.
De forma alternativa la secuencia señal puede
ser de un gen de amilasa o de subtilisina de una cepa de
Bacillus. Una secuencia señal del mismo género que la cepa
huésped es extremadamente adecuada puesto que es muy probable que
se una específicamente al huésped específico; así cuando
Chrysosporium lucknowense es el huésped, la secuencia señal
es preferiblemente una secuencia señal de Chrysosporium. Las
cepas C1 de Chrysosporium, UV13-6;
NG7C-19 y UV18-25 segregan proteínas
en cantidades extremadamente grandes, y las secuencias señal de
estas cepas son de interés particular. Las secuencias señal de
hongos filamentosos y levadura pueden ser útiles, al igual que las
secuencias señal de origen no fúngico.
Un hongo huésped recombinante transformado según
cualquiera de las formas de realización de la invención puede
adicionalmente comprender un marcador seleccionable. Tal marcador
seleccionable permite la selección de células transformadas o
modificadas. Un marcador seleccionable frecuentemente codifica un
producto genético que proporciona un tipo específico de resistencia
ajena a la cepa no transformada. Ésta puede ser resistencia a
metales pesados, antibióticos o biocidas en general. La prototrofía
es también un marcador seleccionable útil de la variedad no
antibiótica. Los marcadores auxotróficos generan deficiencias
nutritivas en las células huéspedes, y los genes que corrigen estas
deficiencias pueden ser usados para la selección. Ejemplos de
resistencia y marcadores de selección auxotróficos usados
comúnmente son amdS (acetamidasa), hph (higromicina
fosfotransferasa), pyrG
(orotidina-5'-fosfato-descarboxilasa),
y pyrE (orotato P-ribosil transferasa, trpC
(antranilato sintasa), argB
(ornitina-carbamoiltransferasa), sC (sulfato
adeniltransferasa), bar (fosfonitricina acetiltransferasa), niaD
(nitrato-reductasa), Sh-ble
(resistencia a la bleomicina-fleomicina),
acetolactato sintasa mutante (resistencia a la sulfonilurea), y
neomicina fosfotransferasa (resistencia a aminoglicósidos). Un
marcador de la selección preferido en Chrysosporium es
orotato P-ribosil transferasa. La selección puede
llevarse a cabo por cotransformación donde el marcador de la
selección está sobre un vector separado o donde el marcador de la
selección está sobre el mismo fragmento de ácido nucleico que la
secuencia codificadora de proteínas para la proteína
heteróloga.
Otra mejora de la frecuencia de transformación
puede ser obtenida por el uso de la secuencia del replicador AMA1,
que es útil por ejemplo en Aspergillus niger (Verdoes et
al., Gene 146:159-165 (1994)). Esta secuencia
resulta en un aumento de 10 a 100 veces en la frecuencia de
transformación en varios hongos filamentosos diferentes. Además, el
ADN introducido es retenido de manera autónoma en las células
micóticas, en una forma multicopia, sin integración en el genoma
fúngico. Se prevé que esto sea provechoso para el método de
selección de alto rendimiento de la presente invención, puesto que
el estado no integrativo reduce variaciones en el nivel de
expresión genética entre transformantes diferentes. Además, como el
ADN introducido no es recombinado en el ADN huésped, no ocurrirán
mutaciones no deseadas en genoma huésped. Niveles uniformes de
expresión genética exógena pueden ser obtenidos usando vectores de
replicación autónoma tales como AMA1, o de forma alternativa, la
replicación autónoma en hongos puede ser promovida por secuencias
teloméricas (véase p. ej. A. Aleksenko y L. Ivanova, Mol. Gen.
Genet. 1998
260:159-164).
260:159-164).
Como se utiliza en este caso el término
"proteína heteróloga" es una proteína o polipéptido
normalmente no expresado o segregado por la cepa huésped usada para
la expresión según la invención. Una proteína heteróloga puede ser
de origen procariótico, o puede ser derivada de un hongo, planta,
insecto, o animal superior tal como un mamífero. Para fines de
selección farmacéutica existirá con bastante frecuencia una
preferencia para proteínas humanas, por lo tanto una forma de
realización preferida será un huésped donde la biblioteca de ADN
sea de origen humano. Tales formas de realización también son
consideradas en consecuencia ejemplos adecuados de la
invención.
La expresión de una biblioteca de genes humanos,
derivada de una biblioteca de ADN humano genómico, en los hongos
filamentosos de la invención está previsto que sea eficaz por
diferentes razones. Es ahora conocido que el tamaño promedio de
genes humanos es 3,000-5,000 pares de bases, y que
el promedio de intrones humanos aproximadamente 75 a
aproximadamente 150 pares de bases (rango total 40 - >50,000).
Los hongos filamentosos tienen intrones de 40-75
pares de bases, pero ellos pueden tratar intrones hasta 500 pares
de bases de longitud. De media, los genes humanos llevan
3-5 intrones por gen (M. Deutsch, M. Long, Nucl.
Acids Res. 1999 27:3219-3228; Tabla B). Las
secuencias señal humanas son también conocidas por funcionar en
hongos filamentosos. Por estas razones, es posible que un gran
número de genes humanos puedan ser expresados y segregados a
niveles altos por los métodos de esta invención.
Los métodos de la invención están por lo tanto
previstos que sean útiles para la expresión de bibliotecas de ADN
derivadas de ambos genomas procariótico y eucariótico. Como se ha
descrito anteriormente, los métodos son capaces de expresión y
descubrimiento de ambas proteínas segregadas e intracelulares,
dando acceso inmediato a un número extremadamente grande de genes y
proteínas.
Otro aspecto de la invención incluye la
construcción y selección de bibliotecas fúngicas mutantes, y
bibliotecas fúngicas mutantes preparadas por los métodos descritos
aquí. Las bibliotecas pueden ser obtenidas por transformación de
los huéspedes fúngicos según esta invención con cualquier medio de
transformación integrativa o no integrativa, usando métodos
conocidos por los expertos en la técnica. Esta biblioteca de hongos
basada en las cepas huéspedes preferidas puede ser manejada y
seleccionada por sus propiedades deseadas o actividades de
proteínas exógenas en métodos de selección de formato miniturizado
y/o de alto rendimiento. Por propiedad o actividad de interés se
entiende, cualquier propiedad física, fisicoquímica, química,
biológica, o catalítica, o cualquier mejora, aumento, o reducción en
tal propiedad, asociada a una proteína exógena de un miembro de la
biblioteca. La biblioteca puede también ser seleccionada por sus
metabolitos, o por una propiedad o actividad asociada a un
metabolito, producida como resultado de la presencia de proteínas
exógenas y/o endógenas. La biblioteca puede también ser
seleccionada por los hongos que producen cantidades aumentadas o
disminuidas de tal proteína o metabolitos.
En otro aspecto de esta invención, la biblioteca
de hongos transformados puede ser seleccionada por la presencia de
metabolitos fúngicos con propiedades deseables. Ejemplos de tales
metabolitos incluyen productos naturales poliquétidos, alcaloides,
y terpenoides. Se anticipa que genes múltiples o agrupaciones de
genes (operones) pueden ser transferidos a las células huéspedes de
la invención, y que productos no proteínicos generados por la
acción de las enzimas codificadas luego serán generados en las
células huéspedes. Por ejemplo, ha sido mostrado que el ADN que
codifica las proteínas necesarias para la producción de lovastatina
pueden ser transferidas a Aspergillus oryzae (Patente U.S.
5,362,638; véase también la patente U.S. 5,849,541).
En otra forma de realización de la invención, la
biblioteca de hongos transformados puede ser seleccionada por la
presencia de ADN que se hibrida con una sonda de ácidos nucleicos
de interés. En esta forma de realización, la expresión y/o
secreción de proteínas exógenas no es esencial, aunque
frecuentemente además será deseable. Cuando la expresión de la
proteína no es necesitada, será apreciado que las secuencias
reguladoras no son necesitadas en el vector.
En otra forma de realización adicional de la
invención, la biblioteca de hongos transformados puede ser
seleccionada por alguna propiedad deseable de los hongos ellos
mismos, tal como por ejemplo tolerancia a un medio ambiente
físicamente o químicamente extremo, o la capacidad para producir,
modificar, degradar o metabolizar una sustancia de interés. Tales
propiedades deseables pueden o no pueden ser atribuibles a la
presencia de una única proteína exógena. Esta forma de realización
será de utilidad particular cuando se emplea como parte de un
proceso de evolución dirigida.
El ADN heterólogo puede ser ADN genómico o ADNc,
obtenido a partir de muestras biológicas por métodos bien conocidos
en la técnica. La muestra biológica puede ser una muestra
medioambiental (por ejemplo, tierra, compost, lecho forestal, agua
de mar, o agua dulce), o una muestra de ello extraída, filtrada, o
centrifugada o por el contrario concentrada. Los cultivos mezclados
de microorganismos derivados de muestras medioambientales pueden ser
también empleados. La muestra biológica puede también derivar de
cualquier especie única de organismo, tal como un microorganismo
cultivado, o planta, insecto, u otro animal tal como un mamífero.
Además, el ADN heterólogo puede ser sintético o
semi-sintético, por ejemplo secuencias de ADN
aleatorias o de ADN comprendiendo segmentos naturales que han sido
redistribuidos, mutados, o por el contrario alterados. Un ejemplo
de una biblioteca nucleica semi-sintética se
encuentra en Wagner et al., WO 00/0632. El ADN de muestras
medioambientales (o cultivos mezclados derivados de las mismas)
será ventajoso para el descubrimiento de proteínas nuevas, mientras
que el uso de ADN de una especie individual será ventajoso (1) un
vector apropiado puede ser elegido más juiciosamente, y (2) el
profesional se dirigirá a especies relacionadas o similares para una
selección posterior si una proteína de interés es
identificada.
identificada.
En comparación con los huéspedes fúngicos
tradicionales, los índices de transformación, de expresión y de
secreción son exageradamente altos cuando se usa una cepa de
Chrysosporium que presenta la morfología micelial compacta
de la cepa UV 18-25. Por lo tanto, una cepa
recombinante según la invención presenta preferiblemente tal
morfología. La invención no obstante también cubre cepas no
recombinantes o por el contrario cepas creadas genéticamente de
hongos que presentan esta característica. Una forma de realización
atractiva de la invención emplearía una cepa de Chrysosporium
recombinante que expone una viscosidad por debajo de aquella de la
cepa NG7C-19, preferiblemente por debajo de aquella
de UV18-25 bajo condiciones de cultivos
correspondientes o idénticas. Hemos determinado que la viscosidad
de un cultivo de UV18-25 está por debajo de 10 cP a
diferencia de aquella de Trichoderma reesei previamente
conocida siendo del orden 200-600 cP, y con aquella
de Aspergillus niger tradicional siendo del orden de
1500-2000 cP bajo condiciones de cultivo óptimas
durante los estadios de fermentación de medio a tardío. Por
consiguiente, la invención puede emplear cualquier hongo
filamentoso creado genéticamente o mutante que presenta esta
viscosidad baja característica, tal como la cepa UV
18-25 de Chrysosporium (VKM F 3631 D), la
cepa X-252 de Trichoderma, o pclA de A.
sojae (derivada de ATCC 11906) o de A. niger pclA.
La fluidez de los cultivos fúngicos filamentosos
puede variar en un rango amplio, desde casi sólido hasta un líquido
que fluye libremente. La viscosidad puede ser cuantificada
rápidamente por viscometría rotacional de Brookfield, uso de tubos
de viscosidad cinemática, viscosímetro de caída de bola o
viscosimetro tipo taza. Caldos de fermentación son fluidos no
newtonianos, y la viscosidad aparente será dependiente hasta cierto
punto de la velocidad de cizalla (Goudar et al., Appl.
Microbiol. Biotechnol. 1999 51:310-315). Este
efecto es sin embargo mucho menos pronunciado para los cultivos de
viscosidad baja empleados en la presente invención.
El uso de tales cultivos de viscosidad baja en
la selección de una biblioteca de expresión según el método de la
invención es altamente ventajoso. La selección de bibliotecas de
ADN expresadas en hongos filamentosos ha estado hasta el momento
limitada a métodos relativamente lentos y laboriosos. En general,
una vez que los hongos han sido transformados (y los transformantes
opcionalmente seleccionados), ha sido necesario preparar esporas o
conidias, o disgregar mecánicamente los micelios, para dispersar la
biblioteca de hongos transformados en organismos individuales o
elementos reproductivos. Esta dispersión es necesaria de modo que
los organismos separados pueden ser cultivados en colonias o
cultivos clonales. Las esporas, conidias, o fragmentos miceliales
son luego diluidos y dispuestos en platos de cultivo estándar, y
las colonias individuales son inspeccionadas en cuanto a color,
alteraciones del sustrato, u otra indicación detectable de la
presencia de la actividad o propiedad de la proteína. En otro
enfoque, las proteínas segregadas son transferidas de las colonias
sobre una membrana, y la membrana es evaluada o examinada para una
indicación de la presencia de la actividad o propiedad de la
proteína de interés. El uso de membranas ha demostrado ser útil
cuando la degradación proteolítica de la proteína exógena es un
problema (Asgeirsdottir et al., Appl. Environ. Microbiol.
1999, 65:2250-2252). Tales procedimientos son
laboriosos y no han demostrado ser susceptibles de automatización,
y como resultado la selección de alto rendimiento de las proteínas
expresadas fúngicamente no ha sido conseguido hasta el momento con
hongos filamentosos convencionales. Para los fines de esta
descripción, la selección de alto rendimiento se refiere a
cualquier método de selección parcialmente o completamente
automatizado que sea capaz de evaluar las proteínas expresadas de
aproximadamente 1.000 o más transformantes al día, y
particularmente a aquellos métodos capaces de evaluar 5.000 o más
transformantes al día, y más particularmente a métodos capaces de
evaluar 10,000 o más transformantes al día.
La selección automatizada de alto rendimiento de
una biblioteca de hongos transformados según la presente invención,
por consiguiente, puede ser realizada según varios modos conocidos.
Los métodos que son conocidos para ser aplicables a bacterias o
levadura pueden en general ser aplicados a los hongos de viscosidad
baja de la presente invención. Esto es permitido por la presencia
de elementos reproductivos transferibles en combinación con el
fenotipo de viscosidad baja, una consecuencia de la morfología
relativamente no enredada de las hifas de los hongos mutantes
empleados. En esencia, los hongos mutantes, y/o sus elementos
reproductivos transferibles, se comportan de forma muy parecida a
las bacterias individuales o levadura durante las manipulaciones
mecánicas implicadas en la selección automatizada de alto
rendimiento. Esto contrasta con hongos de tipo salvaje, y otros
hongos también adaptados industrialmente, que producen micelios
altamente enredados que no permiten la separación inmediata de los
organismos individuales entre sí.
Por ejemplo, una suspensión diluida de hongos
transformados según la presente invención puede ser alicuotada a
través de una micropipeta mecánica en los pocillos de una
microplaca de 96 pocillos. Se anticipa que el aparato de
manipulación de líquidos capaz de inyectar microplacas de 384 o 1536
pocillos puede también ser adaptado a la tarea de dispersión
automatizada de los organismos en microplacas. La concentración de
los organismos suspendidos puede ser ajustada según se desee para
controlar el número medio de organismos (u otros elementos
reproductivos transferibles) por pocillo. Se apreciará que cuando
los múltiples organismos individuales son alicuotados en pocillos,
la identificación de la actividad o propiedad de la proteína deseada
en este pocillo vendrá seguida de la dilución del contenido del
pocillo y cultivo de los organismos presentes en colonias o
cultivos clonales individuales. De este modo, el rendimiento del
sistema puede ser aumentado, según el coste de la necesidad para la
resolución posterior del contenido de cada pocillo que presenta un
"éxito".
En una forma de realización alternativa, una
clasificadora de células puede ser interpuesta en el recorrido del
fluido, siendo capaz de dirigir el flujo del cultivo a los pocillos
de la microplaca tras la detección de un organismo u otro elemento
reproductivo transferible en la célula detectora. Esta forma de
realización permite la dispensación precisa razonable de un
organismo por pocillo. El uso de un marcador detectable
ópticamente, tal como la proteína verde fluorescente, para
identificar transformantes es particularmente útil en esta forma de
realización, puesto que permite la selección automatizada de
transformantes por una clasificadora de células activada por
fluorescencia.
fluorescencia.
En otra forma de realización adicional, las
colonias que crecen en medios sólidos pueden ser escogidos por un
recolector robótico de colonias, y los organismos transferidos por
el robot a los pocillos por una placa de microtitulación. Las
colonias bien separadas darán lugar a clones individuales en cada
pocillo.
Los organismos dispersados son luego dejados
crecer en cultivos clonales en los pocillos de microplacas. Los
inductores, nutrientes, etc. pueden ser añadidos según se desee por
el sistema de distribución de fluido automatizado. El sistema puede
también ser usado para añadir cualquier reactivo requerido para
permitir la detección de la actividad de proteína o propiedad de
interés. Por ejemplo, los sustratos colorogénicos o fluorogénicos
pueden ser añadidos para permitir la detección espectroscópica o
fluorométrica de una actividad enzimática. La viscosidad baja y
hábito de crecimiento sumergido de los cultivos en los pocillos de
una placa de microtitulación permiten la difusión rápida de estos
reactivos en el cultivo, aumentando inmensamente la sensibilidad y
fiabilidad del ensayo. La difusión de oxígeno y nutrientes es
también inmensamente mejorada, facilitando el crecimiento rápido y
la expresión y secreción máximas de péptidos exógenos. Ciertos
ensayos, tales como el ensayo de centelleo por proximidad, dependen
de la difusión de componentes solubles para llegar a un estado de
equilibrio; nuevamente la viscosidad baja de los cultivos fúngicos
de la presente invención hace posible este ensayo de alto
rendimiento. Finalmente, en un sistema altamente automatizado será
deseable recolectar, aspirar, o pipetar automáticamente cultivos
clonales de interés desde sus pocillos en la placa de
microtitulación, y la viscosidad baja y el hábito de crecimiento
sumergido de los cultivos lo harán posible. Todas las operaciones
anteriores serían difíciles o imposibles dada la viscosidad de los
cultivos fúngicos filamentosos tradicionales, especialmente los
cultivos que crecen como esteras de superficie en las condiciones
sin agitación, sin cizalla de un pocillo de placa de
microtitulación.
En otra forma de realización, las únicas células
son pasadas a través de un aparato microfluídico, y la propiedad o
actividad de interés es detectada ópticamente (Wada et al.,
WO 99/67639). La viscosidad baja es esencial para la operación de
un dispositivo microfluídico, y se prevé que los cultivos de
viscosidad baja de hongos mutantes de la presente invención sean
susceptibles de manipulación microfluídica. Short et al., en
la patente estadounidense 6,174,673, han descrito cómo los
sustratos fluorogénicos pueden ser empleados para detectar una
actividad enzimática de interés, y cómo las células huéspedes que
expresan tal actividad pueden ser aisladas con una clasificadora de
células activada por fluorescencia. Los métodos de la presente
invención son compatibles con este método de identificación de
proteínas expresadas.
En una forma de realización, si los
transformantes llevan una proteína fluorescente como un marcador,
la fluorescencia puede ser cuantificada y empleada como una medida
de la cantidad de expresión genética y/o de proteína expresada
presente en un cultivo dado. En esta forma de realización, es
posible no sólo detectar una proteína exógena de interés, sino
estimar la actividad específica de la proteína, como se describe
por Blyna et al. en WO 00/78997. Esta forma de realización
será particularmente preferida cuando el método de selección de la
invención es empleado como parte de un proceso de evolución
dirigida.
En estos casos donde una viscosidad superior es
aceptable, una matriz formadora de gel puede proporcionar ventajas
determinadas cuando se cultivan los hongos, y se conducen ensayos
bioquímicos, en un formato de microplaca, como se describe por
Bochner en la patente estadounidense 6,046,021.
Otra clase de selecciones de alto rendimiento es
por análisis fotométrico, por espectroscopia de formación de
imágenes digitales, de grandes números de colonias individuales que
crecen en un sustrato sólido. Véase por ejemplo Youvan et
al., 1994, Meth. Enzymol. 246:732-748. En este
método, cambios en la absorción global o espectros de emisión de
reactivos especializados son indicativos de la presencia de una
actividad o propiedad de la proteína heteróloga de interés. La
dispersión inmediata de organismos individuales que sirven para el
uso de mutantes de viscosidad baja también habilita el uso de
hongos filamentosos en este método. La tendencia para las colonias
de hongos mutantes de la invención a mostrar menor crecimiento
lateral, y a producir colonias homogéneas, compactas, y bien
definidas en medios sólidos, es también ventajosa en tal sistema de
selección. Además, las características de expresión y secreción
superiores de hongos en comparación con bacterias proporcionan
cantidades superiores de proteína para el análisis espectral.
Una herramienta de manipulación automatizada de
microorganismos está descrita en la publicación de solicitud de
patente japonesa número 11-304666. Este dispositivo
es capaz de transferir microgotas que contienen células
individuales, y se anticipa que las cepas fúngicas de la presente
invención, en virtud de su morfología, serán susceptibles de
micromanipulación de clones individuales con este dispositivo.
Un sistema de selección microbiológica
automatizado de alto rendimiento está descrito en Beydon et
al., J. Biomol. Screening 5:13-21 (2000). El
sistema robótico es capaz de transferir gotitas con un volumen de
400 nl a placas de agar, y tratar 10.000 puntos de selección por
hora, y ha sido usado para conducir selecciones de levadura de dos
híbridos. Es anticipado que los huéspedes fúngicos de la presente
invención serán tan susceptibles como la levadura para la selección
de alto rendimiento con tales sistemas.
Como una alternativa para placas de
microtitulación, los transformantes pueden ser dejados crecer en
placas y, en forma de microcolonias, evaluados ópticamente como se
describe en WO 00/78997.
El desarrollo de selecciones de alto rendimiento
en general es discutido por Jayawickreme y Kost, Curr. Opin.
Biotechnol. 8:629-634 (19977). Una selección de
alto rendimiento para genes raramente transcritos diferencialmente
expresados está descrita en von Stein et al., Nucleic Acids
Res. 35: 2598-2602 (1997).
La cepa LTV1 8-25 de
Chrysosporium y la cepa X-252 de
Trichoderma ilustran varios aspectos de la invención
extremadamente bien. La invención no obstante puede emplear otro
mutante o por el contrario cepas creadas genéticamente de hongos
filamentosos que producen elementos reproductivos transferibles en
suspensión y presentan baja viscosidad en cultivo. La morfología
específica de los hongos no puede ser crítica; los inventores
presentes han observado micelios cortos no enredados en estas dos
cepas pero otras morfologías, tal como la ramificación hifal
cercana y extensiva, pueden también llevar a una viscosidad
reducida. Las cepas fúngicas según la invención son preferidas si
éstas muestran condiciones de crecimiento óptimo a pH neutro y
temperaturas de 25-43ºC. Tales condiciones de
selección son ventajosas para mantener la actividad de proteínas
exógenas, en particular aquellas susceptibles de degradación o
inactivación a pH ácido. Muchas proteínas mamíferas, y proteínas
humanas en particular, han evolucionado para funcionar a pH y
temperatura fisiológicos, y la selección de la actividad normal de
una enzima humana es mejor realizada bajo estas condiciones. Las
proteínas destinadas para el uso terapéutico tendrán que funcionar
bajo estas condiciones, lo que también hace que éstas sean las
condiciones de selección preferidas. Las cepas de
Chrysosporium presentan precisamente esta característica,
creciendo bien a pH neutro y 35-40ºC, mientras que
otras especies huéspedes fúngicas empleadas de forma común (p. ej.
Aspergillus y Trichoderma) crecen mejor a pH ácido y
pueden ser menos adecuadas por esta razón.
Otra aplicación del método de la presente
invención es en el proceso de "evolución dirigida", en la que
nuevas secuencias de ADN que codifican proteínas son generadas, las
proteínas codificadas son expresadas en una célula huésped, y estas
secuencias que codifican proteínas que presentan una característica
deseada, son seleccionadas, mutadas, y expresadas nuevamente. El
proceso es repetido en varios ciclos hasta que una proteína con las
características deseadas es obtenida. La transposición de genes,
ingeniería de proteínas, PCR con tendencia al error, mutagénesis
dirigida, y mutagénesis combinatoria y aleatoria son ejemplos de
procesos a través de los cuales nuevas secuencias de ADN que
codifican proteínas exógenas pueden ser generadas. Las patentes
U.S. 5,223,409, 5,780,279 y 5,770,356 proporcionan teorías de
evolución dirigida. Véase también Kuchner y Arnold, Trends in
Biotechnology, 15:523-530 (1997);
Schmidt-Dannert y Arnold, Trends in Biotech.,
17:135-136 (1999); Arnold y Volkov, Curr. Opin.
Chem. Biol., 3:54-59 (1999); Zhao et al.,
Manual of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2nd Ed.,
(Demain and Davies, eds.) págs. 597-604, ASM Press,
Washington DC, 1999; Arnold y Wintrode, Encyclopedia of Bioprocess
Technology: Fermentation, Biocatalysis, and Bioseparation,
(Flickinger and Drew, eds.) pp. 971-987, John Wiley
& Sons, New York, 1999; y Minshull and Stemmer, Curr. Open.
Chem. Biol. 3:284-290.
Una aplicación de mutagénesis combinatoria se
describe en Hu et al., Biochemistry. 1998
37:10006-10015. US 5,763,192 describe un proceso
para obtener nuevas secuencias de ADN codificadoras de proteínas
generando estocásticamente secuencias sintéticas, introduciéndolas
en un huésped, y seleccionando las células huéspedes con la
característica deseada. Los métodos para efectuar la recombinación
de genes artificial (redistribución de ADN) incluyen la
recombinación aleatoria (Z. Shao, et al., Nucleic Acids Res.,
26:681-683 (1998), el proceso de extensión
empalmada (H. Zhao et al., Nature Biotech.,
16:258-262 (1998), y recombinación de heterodúplex
(A. Volkov et al., Nucleic Acids Res., 27:e18 (1999)). PCR
con tendencia al error es otro enfoque adicional (Song y Rhee,
Appl. Environ. Microbiol. 66:890-894 (2000)).
Hay dos métodos muy practicados de realización
de la fase de selección en un proceso de evolución dirigida. En un
método, la actividad de proteína de interés de alguna manera se
vuelve esencial para la supervivencia de las células huéspedes. Por
ejemplo, si la actividad deseada es una celulasa activa a pH 8, un
gen de celulasa podría ser mutado e introducido en las células
huéspedes. Los transformantes son dejados crecer con celulosa como
la única fuente de carbono, y el pH aumentado gradualmente hasta
que sólo queden unos pocos residuos. El gen de celulasa mutado de
los supervivientes, que supuestamente codifican una celulasa activa
a pH relativamente alto, es sometido a otra ronda de mutación, y el
proceso es repetido hasta que los transformantes que pueden crecer
bien son obtenidos en celulosa a pH 8. Variantes termoestables de
enzimas pueden asimismo ser desarrolladas, por ciclos de mutación
de genes y cultivo a alta temperatura de células huéspedes (Liao
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986
83:576-580; Giver et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. U S A. 1998 95:12809-12813. Para los fines de
esta aplicación, la mutación de secuencias de ADN que codifican
proteínas exógenas pueden ser realizadas por cualquiera de los
diferentes métodos empleados para la evolución dirigida, por
ejemplo por transposición de genes, recombinación in vivo, o
mutagénesis de "cassette".
La ventaja mayor de este método es la naturaleza
masivamente paralela de "supervivencia de la fase de selección
más adecuada". Millones, o billiones, de mutaciones fallidas son
simultáneamente eliminadas de consideración sin la necesidad de
evaluarlas individualmente. No obstante, no es siempre posible
enlazar una actividad enzimática de interés a la supervivencia del
huésped. Por ejemplo cuando la propiedad de proteína deseada es la
unión selectiva a un objetivo de interés, haciendo que la propiedad
de unión sea esencial para la supervivencia, es posible que sea
difícil. También, la supervivencia bajo condiciones forzadas tales
como alta temperatura o pH extremo es posible que sea dependiente
de factores múltiples, y una mutación deseable no será seleccionada
y se perderá si la célula huésped es incapaz de sobrevivir por
cuestiones no relacionadas con las propiedades de la proteína
mutante.
Una alternativa al enfoque masivamente paralelo
de "supervivencia del más adecuado" es la selección en serie.
En este enfoque, los transformantes individuales son seleccionados
por métodos tradicionales, tales como observación de zonas
esclarecidas o coloreadas alrededor de colonias que crecen en
medios indicadores, ensayos enzimáticos colorimétricos o
fluorométricos, inmunoensayos, ensayos de unión, etc. Véase por
ejemplo Joo et al., Nature 399:670-673
(1999), donde una citocromo P450 monooxigenasa que no requiere NADH
como un cofactor fue desarrollada por ciclos de mutación y
selección; May et al., Nature Biotech.
18:317-320 (2000), donde una hidantoinasa de
estereoselectividad inversa fue desarrollada de una forma similar;
y Miyazaki et al., J. Mol. Biol.
297:1015-1026 (2000), donde fue desarrollada una
subtilisina termoestable.
El enfoque de selección tiene ventajas claras
sobre una simple "selección de supervivencia" especialmente si
puede ser realizada en una manera de alto rendimiento que se acerca
al rendimiento de la técnica de "selección de supervivencia"
masivamente paralela. Por ejemplo, algo de paralelismo ha sido
introducido utilzando medidas tales como formación de imágenes
digitales de los organismos transformados (Joo et al.,
Chemistry & Biology, 6:699-706 (1999)) o
evaluación digital espectroscópica de colonias (Youvan et
al., 1994, Meth. Enzymol. 246:732-748). Ensayos
en serie pueden ser automatizados por el uso de clasificación de
células (Fu et al., Nature Biotech.,
17:1109-1111 (1999)). Un enfoque bien establecido
para la selección de alto rendimiento implica la evaluación
automatizada de proteínas expresadas en placas de microtitulación,
usando lectores de placa comercialmente disponibles, y el método de
la presente invención es adecuado para la aplicación de este modo
de selección de alto rendimiento para una evolución dirigida.
En esta forma de realización de la invención, un
gen que codifica una proteína de interés es mutado por cualquier
método conocido de generación de una pluralidad de mutantes, el ADN
mutante que codifica la proteína es introducido mediante un vector
de expresión adecuado en un huésped fúngico filamentoso de
viscosidad baja según la presente invención, y los transformantes
son opcionalmente seleccionados y cultivados. Las células huéspedes
son luego dispersadas como se describe previamente en los pocillos
de una placa de microtitulación, o por el contrario espacialmente
separados en lugares resolubles, para proporcionar cultivos
monoclonales individuales (o cultivos policlonales que tienen menos
de aproximadamente 100 clones diferentes). Las células son
preferiblemente dispersadas en los pocillos de una placa de
microtitulación. La proteína codificada por el ADN mutante es
preferiblemente segregada en el medio en los pocillos de las placas
de microtitulación. Cada uno de los cultivos dispersos es
seleccionado para la actividad de la proteína de interés, y
aquellos que presentan más fuertemente la propiedad deseada son
seleccionadas. El gen que codifica la proteína de interés en los
cultivos seleccionados es mutado otra vez, el ADN mutante es otra
vez introducido en el huésped fúngico de baja viscosidad, y los
transformantes son reseleccionados. El mutante y proceso de
reselección es repetido hasta que el valor de la propiedad de
interés alcanza un nivel deseado.
En una forma de realización alternativa, la
evolución dirigida se realiza por mutación y reproducción del gen
de interés en otro organismo, tal como E. coli, seguido de
transferencia de los genes mutantes a un hongo filamentoso según la
presente invención para selección.
Será inmediatamente apreciado por los expertos
en la técnica que una proteína que resulta ser de interés basándose
en el ensayo de selección no tendrá necesariamente todas las demás
propiedades requeridas para utilidad comercial. Por ejemplo, la
posesión de actividad enzimática, aunque sea alta la actividad
específica, no indicará que la enzima mutante tiene el requisito de
estabilidad térmica o del pH, o resistencia al detergente o a la
proteasa, o no inmunogenicidad, u otra propiedad que puede ser
deseable o necesaria en un producto comercialmente viable. Hay una
necesidad de métodos que determinen fácilmente si una proteína
identificada tiene propiedades comercialmente útiles.
Los enfoques de la técnica anterior para la
selección no han proporcionado una solución para esta necesidad,
porque los organismos huéspedes (bacterias y levadura) no fueron
adaptados a la producción de cantidades aislables de proteína.
Hasta el momento ha sido necesario transferir genes útiles de forma
potencial de un organismo a otro, como uno que procede de la
preparación de la biblioteca de ADN, expresión génica, selección,
expresión de cantidades de investigación de productos genéticos, y
sobre-expresión en cepas de producción
industrialmente adecuadas. Los hongos mutantes filamentosos de la
presente invención, en cambio, son excelentes superproductores y
secretores de proteínas exógenas, especialmente cuando se emplean
con los vectores descritos aquí. Proteína suficiente puede ser
aislada no sólo para los fines de caracterización, sino para la
evaluación en ensayos de aplicación. De hecho, las cepas usadas en
el método de selección de la invención son adecuadas para la
producción industrial también, puesto que éstas poseen propiedades
de producción deseables tales como viscosidad baja, índices de
expresión altos, y proporciones de proteína/biomasa muy altas.
Por consiguiente, en una forma de realización
preferida de la presente invención, el método además comprende el
cultivo de una colonia clonal o cultivo identificado según el
método de la invención, bajo condiciones que permiten la expresión
y secreción de la proteína de la biblioteca exógena (o un precursor
de la misma), y recuperación de la proteína posteriormente producida
para obtener la proteína de interés. La expresión y secreción de
una proteína de la biblioteca puede ser facilitada creando una
fusión dentro del marco de lectura del gen clonado con el gen para
una proteína heteróloga (o un fragmento de la misma) con su
secuencia señal correspondiente, o con la secuencia señal de una
tercera proteína, todas operativamente enlazadas a una secuencia
reguladora de la expresión. Por este enfoque una proteína de fusión
es creada que contiene secuencias de aminoácidos heterólogas
corriente arriba de la proteína de la biblioteca. Posteriormente,
esta proteína precursora de fusión puede ser aislada y recuperada
usando técnicas de purificación conocidas en la técnica. El método
puede opcionalmente comprender el sometimiento del precursor de la
proteína de fusión segregada a una fase de ruptura para generar la
proteína de la biblioteca de interés. La fase de seccionamiento
puede llevarse a cabo con Kex-2, una proteasa tipo
Kex-2, u otra proteasa selectiva, cuando el vector
es creado genéticamente de modo que un sitio de seccionamiento de
proteasa enlaza un portador de proteína bien segregada y la
proteína de interés.
La disponibilidad inmedianta de la proteína
mutante, directamente del organismo huésped de selección, no ha
sido previamente posible con huéspedes de selección de la técnica
anterior. La presente invención así proporciona una ventaja, en la
que las proteínas mutantes creídas de interés basándose en la
selección de alto rendimiento pueden ser aisladas en de cantidades
suficientes (miligramos) para una caracterización adicional y
cantidades incluso más grandes (gramos a kilogramos) para ensayos de
aplicación. Esta forma de realización particular de la invención
permite por lo tanto que el profesional seleccione proteínas
mutantes para la siguiente ronda de evolución dirigida basándose en
un número cualquiera de propiedades deseables, y no solamente en la
única propiedad detectada en la selección de alto rendimiento. Los
criterios más rigurosos de selección posibilitados por la presente
invención deberían conducir a un proceso de evolución dirigida más
eficaz y rentable.
El método de producción de una cepa fúngica
recombinante mutante filamentosa según la invención comprende
introducir una biblioteca de secuencias de ADN comprendiendo
secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas heterólogas
en un hongo filamentoso mutante de baja viscosidad según la
invención, las secuencias de ácidos nucleicos estando
operativamente enlazadas a una región reguladora de la expresión. La
introducción de las secuencias de ADN puede ser realizada en
cualquier manera conocida per se para transformar hongos
filamentosos. Los expertos en la técnica apreciarán que hay
diferentes métodos bien establecidos, tal como la absorción del ADN
estimulada por CaCl_{2}-polietilenglicol por
protoplastos fúngicos (Johnstone et al., EMBO J., 1985,
4:1307-1311). Un método de transformación de
protoplastos está descrito en los ejemplos. Los métodos de
transformación de protoplastos o de esferoplastos alternativos son
conocidos y pueden ser usados puesto que han sido descritos en la
técnica anterior para otros hongos filamentosos. Los vectores
adecuados para la integración multicopia del ADN heterólogo en el
genoma fúngico son bien conocidos; véase por ejemplo Giuseppin
et al., WO 91/00920. El uso de plásmidos que se replican de
manera autónoma ha sido muy conocido como una herramienta de
transformación eficaz para hongos (Gems et al., Gene 1991
98:61-67; Verdoes et al., Gene 1994
146:159-165; Aleksenko and Clutterbuck, Fungal
Genetics Biol. 1997 21:373-387; Aleksenko et
al., Mol. Gen. Genet. 1996 253:242- 246). Detalles de tales
métodos pueden ser encontrados en muchas de las referencias
citadas, y están por tanto incorporados por referencia.
Métodos ejemplares según la invención,
comprendiendo el uso de una cepa mutante de baja viscosidad de
Chrysosporium o A. sojae como materia prima para la
introducción de vectores que llevan ADN heterólogo, están
presentados abajo.
Varias solicitudes de patente enseñan que los
mutantes morfológicos pueden ser aislados mediante varias maneras
de selección. WO 96/02653 y WO 97/26330 describen mutantes no
definidos que presentan morfología compacta. Se descubrió que una
proproteina que procesó el mutante de A. sojae tuvo un
fenotipo de crecimiento aberrante inesperado (hiperramificación)
mientras que no se observó ningún efecto perjudicial en la
producción de proteínas. Los experimentos de cultivo con esta cepa
revelaron un fenotipo de crecimiento muy compacto con
microgránulos. Las características observadas no sólo estuvieron
presentes en A. sojae sino que también en otros hongos
mutados, p. ej. A. niger.
Para clonar el gen que codifica la proproteína
convertasa de A. niger, se usó la PCR. Basándose en la
comparación de varios genes de la proproteína convertasa de varias
especies de levadura y eucariotas superiores, cebadores de la PCR
diferentes fueron diseñados que son degenerados, respectivamente,
4, 2, 2, 512, 1152, 4608, 2048 y 49152 veces. A partir de la
amplificación usando cebadores PE4 y PE6, dos clones individuales
fueron obtenidos de los cuales la secuencia de la proteína
codificada mostró homología significante a la secuencia KEX2
de S. cerevisiae. Estos clones fueron usados para
experimentos sucesivos.
Con base en la homología observada para otros
genes de la proproteína convertasa del fragmento de PCR clonado, el
correspondiente gen de A. niger fue designado pclA (de tipo
proproteína convertasa). Análisis de Southern de digeridos
genómicos de A. niger revelaron que el gen pclA fue un gen de
copia individual sin genes cercanamente relacionados en el genoma
de A. niger, puesto que incluso a condiciones de hibridación
heterólogas (50ºC; lavados a 6xSSC) no se constataron señales de
hibridación adicionales. Una primera selección de una biblioteca
genómica EMBL3 de N401 de A. niger (van Hartingsveldt et
al., Mol. Gen. Genet. 1987 206:71-75) no resultó
en placas de hibridación positiva aunque aproximadamente
10-20 equivalentes de genoma fueron seleccionados.
En una segunda selección una copia genómica de longitud total del
gen pclA fue aislada de una biblioteca genómica N400 de A.
niger en EMBL4 (Goosen et al., Curr. Genet.
11:499-503 (1987)).
De las 8 placas de hibridación que fueron
obtenidas después de seleccionar 5-10 equivalentes
del genoma, 6 siguieron siendo positivas después de una primera
reselección. Todos estos 6 clones muy probablemente llevaron una
copia completa del gen pclA, como en todos los clones (como
fue observado para el ADN genómico) con el fragmento de PCR dos
fragmentos EcoRV hibridantes de 3 y 4 kb estuvieron presentes (el
fragmento de PCR contenía un sitio de restricción de EcoRV). Con
base en la comparación del tamaño de otras proproteínas
convertasas, junto con estos fragmentos contendrán el gen completo
pclA con 5' y 3' secuencias flanqueantes. Los dos fragmentos
EcoRV y un fragmento EcoRI de 5 kb superpuestos fueron subclonados
para caraterización adicional.
Con base en el mapa de restricción la secuencia
de ADN completa del gen pclA fue determinada de los
subclones EcoRI y EcoRV. El análisis de la secuencia obtenida
reveló un marco de lectura abierto con similitud considerable a
aquella del gen KEX2 de S. cerevisiae y otras proproteínas
convertasas. Con base en una comparación adicional dos secuencias de
intrones putativos fueron identificadas en la región codificante.
Un análisis de PCR posterior con cebadores que flanquean a los
intrones putativos, en una biblioteca de ADNc de A. niger
basada en pEMBLyex reveló que sólo la mayoría 5' de estas dos
secuencias representaron un intrón real. La estructura general de
la proteína de pclA codificada fue claramente similar a aquella de
otras proproteínas convertasas. La similitud global de la proteína
de pclA con las otras proproteínas convertasas fue aproximadamente
del 50%.
Para demostrar que el gen pclA clonado es un gen
funcional que codifica una proteína funcional, la construcción de
cepas desprovistas del gen pclA fue intentada. En consecuencia,
pPCL1A, un vector de deleción de pclA, donde una gran parte de la
región codificante de pclA fue sustituida por el marcador de
selección pyG de A. oryzae, fue generado. Posteriormente, a
partir de este vector el fragmento del inserto EcoRI de 5 kb fue
usado para transformación de varias cepas de A. niger.
A partir de estas transformaciones (basadas en
selección de pyrG) numerosos transformantes fueron
obtenidos. De manera interesante, una fracción de los
transformantes (variando del 1-50%) mostraron un
fenotipo aberrante muy diferente (figura 13). El análisis de
Southern de diferentes transformantes de tipo salvaje y aberrantes
revelaron que estos transformantes aberrantes que mostraron un
fenotipo de crecimiento seriamente restringido (compacto), habían
perdido el gen pclA. Todas las cepas que muestran
crecimiento tipo salvaje demostraron llevar una copia del fragmento
de sustitución integrado contiguo al gen pclA de tipo
salvaje o en una posición no homóloga.
Para construir el correspondiente mutante en
A. sojae, la complementación funcional del mutante de
viscosidad baja de A. niger se efectuó por transformación de
un mutante de pclA de A. niger con la biblioteca de cósmidos
ATCC 11906 de A. sojae. A partir de los transformantes de
A. niger complementados resultantes, los clones de cósmidos
genómicos fueron aislados, que comprendieron la proteína de A.
sojae de procesamiento de la proteasa de pclA. El análisis de
secuencias parcial de las secuencias aisladas confirmó la clonación
del gen pclA de A. sojae. Con base en las secuencias de pclA
de A. sojae clonadas un vector de sustitución de genes fue
generado siguiendo un enfoque similar al que se describe en otro
lugar en nuestros ejemplos, usando el marcador de selección pyrG
reutilizable descrito en WO 01/09352.
Además, un vector de interrupción génica fue
construido llevando el marcador de selección pyrG y el fragmento
truncado en 5' y 3' del gen pclA de A. sojae. El
vector de sustitución génica y de interrupción génica fueron usados
para generar mutantes de pclA en derivados de ATCC 11906 y ATCC
11906. Experimentos de cultivos con algunos transformantes
resultantes revelaron características morfológicas mejoradas, en
particular morfología de crecimiento compacto y microgránulos..
(figs. 14A y 14B).
La transformación de A. sojae ATCC 11906
y derivados puede ser realizada con fragmentos de ADN lineales que
llevan un marcador de selección fúngica. Si no se proveen
secuencias de replicación no específicas los transformantes
obtenidos usando este procedimiento llevan el ADN introducido
integrado en el genoma de la cepa huésped. Como el marcador de
selección introducido es de origen heterólogo (A. niger)
sólo ocurrirá la recombinación heteróloga, conduciendo a una
recogida de transformantes que llevan el ADN marcador a varias
posiciones en el genoma. Esta integración es propensa a resultar en
la ruptura de secuencias endógenas de A. sojae, así dando
como resultado una recogida de cepas mutantes de A. sojae.
Esto está ejemplificado por el análisis de una recogida grande de
transformantes obtenidos de A. sojae ATCC 11906alpApyrG
usando un fragmento de ADN con el marcador de selección pyrG de
A. niger. En total mil transformantes diferentes fueron
analizados y de estos 5-10 mostraron un fenotipo
morfológicamente aberrante. Entre estos varios tuvieron un fenotipo
comparable a los mutantes de pclA. Similar a como se describe para
la clonación del gen pclA de A. sojae, el gen
correspondiente a la mutación podría ser aislado de la genoteca de
A. sojae por complementación del fenotipo morfológico. Con
base en el gen clonado los mutantes de ruptura/deleción del gen
correspondiente pueden ser generados.
Usando un enfoque de clonación basado en PCR
similar al que se describe para el gen pclA de A. niger, un
fragmento del gen de procesamiento de la proproteína de
Chrysosporium, denominado pcl1, fue clonado de una genoteca
de Chrysosporium BLUESTAR (TM). Un fragmento de gen que lleva
la copia del gen genómico completo fue subclonado del clon
pBLUESTAR. Con base en el subclón obtenido un vector de
interrupción génica fue generado como se describe para A.
sojae. En vez del marcador pyrG, para Chrysosporium la
versión flanqueada de repetición del gen pyrE de A. niger fue
usada. La transformación/interrupción génica de
Chrysosporium resultó en cepas con un fenotipo de
crecimiento compacto.
\vskip1.000000\baselineskip
Los rangos de datos paramétricos de operación
siguientes han sido determinados para fermentaciones fúngicas
usando cinco organismos fúngicos diferentes. Los cinco organismos
fúngicos comparados fueron cepas de Aspergillus niger,
Trichoderma longibrachiatum de 18.2KK (precedentemente T.
reesei), X-252 de Trichoderma de
longibrachiatum, cepa UV18-25 de
Chrysosporium lucknowense, y pclA de Aspergillus
sojae. La viscosidad de un cultivo fúngico varía durante el
curso de una fermentación y varía con la concentración de
nutrientes. Para las mediciones proporcionadas, el medio que
contiene entre 20 y 100 g/l de una fuente de carbono de
carbohidrato (p. ej., celulosa, lactosa, sacarosa, xilosa, glucosa,
y similares) es inoculada con el hongo, y el cultivo permitió
proceder a través de una "fase de crecimiento" durante la cual
la fuente de carbono es consumida. Los cultivos del frasco de
agitación son agitados a 200 r.p.m., mientras que los vasos de
fermentación de un litro son agitados con un propulsor a
500-1000 r.p.m. La viscosidad máxima normalmente
ocurre a o cerca del fin de la fase de crecimiento. En ese momento
el cultivo es accionado a un modo de flujo continuo, donde una
fuente de carbono es alimentada al cultivo a una velocidad tal que
la concentración de la fuente de carbono no asciende por encima de
aproximadamente 0,5 g/l. Es típica una velocidad de alimentación de
entre 1 y 3 g/l/hr.
La viscosidad fue determinada en un viscosímetro
LVF de Brookfield usando el pequeño adaptador de muestra y el
husillo número 31, accionado a 30ºC. Una muestra fresca de caldo de
fermentación (10 ml) fue colocada en el pequeño husillo de muestra.
La velocidad del husillo fue ajustada para dar una lectura en la
gama 10-80. Después de cuatro minutos una lectura
fue tomada de la escala del viscosímetro. La lectura fue
multiplicada por el factor dado abajo para obtener la viscosidad en
centipoise (cP).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La viscosidad final fue medida al final de la
fermentación:
\newpage
\vskip1.000000\baselineskip
Los medios de transformación usados fueron los
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Medios para selección y cultivo:
\vskip1.000000\baselineskip
Los medios de regeneración (MnR) suplementados
con 50 \mug/ml de fleomicina o 100-150 \mug/ml
de higromicina se utilizan para seleccionar transformantes. El
medio GS, suplementado con 5 \mug/ml de fleomicina se utiliza
para confirmar resistencia antibiótica.
PDA es un medio completo para crecimiento rápido
y buena esporulación. Medios líquidos son inoculados con 1/20º de
suspensión de esporas (todas las esporas de una placa PDA de 90 mm
en 0,1% Tween de 5 ml). Tales cultivos son cultivados a 27ºC en
frascos de agitación (200 r.p.m.).
Dos cepas no transformadas de
Chrysosporium C1 y una cepa de referencia de Trichoderma
reesei fueron evaluadas en dos medios (GS pH 6.8, y Pridham
agar, PA, pH 6.8). Para evaluar el nivel de resistencia antibiótica,
las esporas fueron recogidas de placas de PDA de 7 días. Placas
selectivas fueron incubadas a 32ºC y marcadas después de 2, 4 y 5
días. Las cepas C-1 NG7C-19 y
UV18-25 claramente tienen un nivel de resistencia
basal baja tanto a la fleomicina como a la higromicina, comparable
a aquella para una cepa de laboratorio de T. reesei de
referencia. Ésta es una indicación clara de que estos marcadores
fúngicos estándar seleccionables pueden ser usados en cepas de
Chrysosporium. Problemas con otros marcadores fúngicos
estándar seleccionables no están previstos.
Selección de cepas de Chrysosporium
transformadas con Sh-ble (resistencia a la
fleomicina) fue exitosamente realizada a 50 \mug/ml. Éste fue
también el nivel de selección usado para T. reesei así
mostrando que la selección diferencial puede ser fácilmente
conseguida en Chrysosporium. Las mismas observaciones son
válidas para cepas transformadas para resistencia a la higromicina
a un nivel de 150 \mug/ml.
La técnica de transformación de protoplastos fue
usada en Chrysosporium con base en la tecnología de
transformación fúngica generalmente aplicada. Todas las esporas de
una placa PDA de 90 mm fueron recuperadas en IC1 de 8 ml y
transferidas a un matraz vibrante de medio IC1 de 50 ml para
incubación durante 15 horas a 35ºC y 200 r.p.m. Después de esto el
cultivo fue centrifugado, el granulado fue lavado en MnP, devuelto
en solución en 10 ml de MnP y 10 mg/ml de Caylase C_{3} e
incubado durante 30 minutos a 35ºC con agitación (150 r.p.m.).
La solución fue filtrada y el filtrado fue
sometido a centrifugado durante 10 minutos a 3500 r.p.m. El
granulado fue lavado con 10 ml de MnP Ca^{2+}. Este fue
centrifugado durante 10 minutos a 25ºC. Luego 50 microlitros de MPC
frío fueron añadidos. La mezcla fue mantenida en hielo durante 30
minutos a partir de lo cual 2,5 ml de PMC fueron añadidos. Después
de 15 minutos a la temperatura ambiente 500 microlitros de los
protoplastos tratados fueron mezclados con 3 ml de MnR Soft e
inmediatamente dispuesto en una placa de MnR conteniendo fleomicina
o higromicina como agente de selección. Tras la incubación durante
cinco días a 30ºC los transformantes fueron analizados (los clones
se hacen visibles después de 48 horas). La eficiencia de la
transformación fue determinada usando 10 \mug de plásmido de
referencia pAN8-1. Los resultados están presentados
en la siguiente tabla C.
Los resultados muestran que la viabilidad de
transformante de Chrysosporium es superior a aquella de
Trichoderma. La transformabilidad de las cepas es comparable
y por lo tanto, el número de transformantes obtenidos en un
experimento se extiende 4 veces más para Chrysosporium que
para T. reesei. Así el sistema de transformación de
Chrysosporium no sólo iguala el comúnmente usado sistema de
T. reesei, sino que incluso lo supera. Esta mejora puede
demostrarse especialmente útil para vectores que tienen una
transformación menos eficaz que pAN8-1.
Varios otros plásmidos de transformación y de
expresión fueron construidos con secuencias codificantes de
proteínas homólogas de Chrysosporium y también con
secuencias codificantes de proteínas heterólogas para el uso en
experimentos de transformación con Chrysosporium. Los mapas
de vector se proveen en las Figuras 6-11.
La proteína homóloga para ser expresada fue
seleccionada del grupo de celulasas producido por
Chrysosporium y consistió en endoglucanasa 6 que pertenece a
la familia 6 (PM 43 kDa) y la proteína heteróloga fue endoglucanasa
3 que pertenece a la familia 12 (PM 25 kDa) de
Penicillium.
pF6g comprende el fragmento promotor de
endoglucanasa 6 de Chrysosporium enlazado a la secuencia
señal de endoglucanasa 6 en marco con el marco de lectura abierto
de endoglucanasa 6 seguido de la secuencia del terminador de
endoglucanasa 6. La selección de transformantes se realiza usando
cotransformación con un vector seleccionable.
pUT1150 comprende el promotor de
celobiohidrolasa de Trichoderma reesei enlazado a la
secuencia señal de endoglucanasa 6 en marco con el marco de lectura
abierto de endoglucanasa 6 seguido de la secuencia del terminador
de celobiohidrolasa de T. reesei. Además este vector lleva un
segundo cassette de expresión con un marcador de selección, es
decir el gen de resistencia a la fleomicina (gen
Sh-ble).
pUT1152 comprende el promotor de
Gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa
A de Aspergillus nidulans enlazado a la secuencia señal de
endoglucanasa 6 en marco con el marco de lectura abierto de
endoglucanasa 6 seguido de la secuencia del terminador de
antranilato sintasa (trpC) de A. nidulans. Además este
vector lleva un segundo cassette de expresión con un marcador de
selección, es decir el gen de resistencia a la fleomicina (gen
Sh-ble).
pUT1155 comprende un promotor de
gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa
A de A. nidulans enlazado a la secuencia señal de
celobiohidrolasa de Trichoderma reesei en marco con la
proteína transportadora Sh-ble que a su vez es
enlazada en marco con el marco de lectura abierto de endoglucanasa
6 seguido de la secuencia del terminador trpC de A.
nidulans. Este vector usa la tecnología de la proteína
transportadora fusionada a la proteína de interés que es conocida
por mejorar mucho la secreción de la proteína de interés.
pUT1160 comprende el promotor de
Gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa
A de Aspergillus nidulans enlazado a la secuencia señal de
celobiohidrolasa de Trichoderma reesei en marco con la
proteína transportadora Sh-ble que a su vez es
enlazada en marco con el marco de lectura abierto de endoglucanasa
3 de Penicillium seguido de la secuencia del terminador trpC
de A. nidulans.
pUT1162 comprende el promotor de
celobiohidrolasa de Trichoderma reesei enlazado a la
secuencia señal de endoglucanasa 3 en marco con el marco de lectura
abierto de la endoglucanasa 3 de Penicillium seguido de la
secuencia del terminador de celobiohidrolasa de T. reesei.
Además este vector lleva un segundo cassette de expresión con el
gen de resistencia a la fleomicina (Sh-ble gen)
como marcador de la selección.
Será aparente para los expertos en la técnica
que una muestra de ADN genómico o ADNc puede ser fácilmente cortada
o digerida en fragmentos codificantes de proteínas, y los
fragmentos ligados en vectores tales como los ilustrados aquí para
producir una biblioteca de vectores de expresión. Será
adicionalmente aparente que los métodos que emplean la
cotransfección sean aplicables, y que los vectores que se replican
de manera autónoma o vectores de integración puedan ser empleados
para transfectar hongos filamentosos con tal biblioteca de
vectores.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla D muestra los resultados de
transformación de ambos Chrysosporium
UV18-25 y Tolypocladium geodes. El protocolo
de transformación usado está descrito abajo en la sección para
transformación heteróloga.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas C1 (NG7C-19 y/o
UV18-25) fueron evaluadas por su capacidad para
segregar varias proteínas heterólogas: una proteína bacteriana
(proteína de resistencia a la fleomicina de Streptoalloteichus
hindustanus, Sh-ble), una proteína fúngica
(xilanasa II de Trichoderma reesei, XYN2) y una proteína
humana (la lisozima humana, HLZ). Los detalles del proceso son los
siguientes:
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas C1 NG7C-19 y
UV18-25 fueron transformadas por el plásmido pUT720
(Ref. 1). Este vector presenta el cassette de expresión fúngica
siguiente:
- -
- promotor de gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa de Aspergillus nidulans (gpdA) (Ref 2)
- -
- una secuencia señal de celobiohidrolasa I sintética de Trichoderma reesei (cbhl) (refs 1, 3)
- -
- gen Sh-ble de resistencia a la fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus (Ref. 4)
- -
- terminador de triptófano-sintasa de Aspergillus nidulans (trpC) (Ref. 5)
El vector también lleva el gen de
beta-lactamasa (bla) y el origen de
replicación de E. Coli del plásmido pUC18 (Ref 6). El mapa
del plásmido detallado está provisto en la figura 2.
Los protoplastos de C1 fueron transformados
según Durand et al. (Ref. 7) adaptados a C1: todas las
esporas de una placa PDA de 90 mm de la cepa C1 no transformada
fueron recuperadas en 8 ml de IC1 y transferidas en un matraz
vibrante con 50 ml de medio IC1 para incubación 15 horas a 35ºC y
150 r.p.m. Por lo tanto, el cultivo fue centrifugado, el granulado
lavado en MnP, redisuelto en 10 ml de MnP + 10 mg/ml Caylase
C_{3}, e incubado 30 min a 35ºC con agitación (150 r.p.m.). La
solución fue filtrada y el filtrado fue centrifugado 10 min a 3500
r.p.m. El granulado fue lavado con 10 ml de MnPCa^{2+}. Este fue
centrifugado 10 min a 3500 r.p.m. y el granulado fue retomado en 1
ml de MnPCa^{2+}. 10 \mug de ADN de pUT720 fueron añadidos a
200 \mul de solución de protoplastos e incubados 10 min a la
temperatura ambiente (aprox. 20ºC). Luego, 50 \mul de MPC frío
fue añadido. La mezcla fue mantenida en hielo durante 30 min a
partir de lo cual 2,5 ml de PMC fueron añadidos. Después de 15 min
a la temperatura ambiente 500 \mul de los protoplastos tratados
fueron mezclados a 3 ml de MnR Soft e inmediatamente dispuestos en
una placa de MnR que contenía fleomicina (50 \mu/ml a f6.5) como
agente de selección. Después de 5 días de incubación a 30ºC, los
transformantes fueron analizados (los clones empiezan a ser
visibles después de 48 horas). La producción de
Sh-ble de transformantes de C1 (clones resistentes a
la fleomicina) fue analizada como sigue: transformantes primarios
fueron pinchados con palillos en placas de GS+fleomicina (5
\mug/ml) y dejados crecer durante 5 días a 32ºC para verificación
de resistencia. Cada clon resistente validado fue subclonado sobre
placas GS. Dos subclones por transformante fueron usados para
inocular placas de PDA para obtener esporas para la iniciación del
cultivo líquido. Los cultivos líquidos en IC1 fueron dejados crecer
5 días a 27ºC (agitación 200 r.p.m.). Luego, los cultivos fueron
centrifugados (5000 g, 10 min.) y 500 \mul de sobrenadante fueron
recogidos. De estas muestras, las proteínas fueron precipitadas con
ATC y resuspendidas en un tampón de muestra de Western hasta 4
mg/ml de proteínas totales (método Lowry, Ref. 8). 10 \mul
(aproximadamente 40 \mug de proteínas totales) fueron cargadas en
un 12% de gel de acrilamida/SDS y hechas fluir (Sistema de Mini
Trans-Blot^{TM}, BioRad Laboratories). La
transferencia de Western fue conducida según las instrucciones de
BioRad (Schleicher & Schull 0.2 \mum de membrana) usando
antisuero anti-Sh-ble de conejo
(Societe Cayla, Tolouse FR, Catalog #ANTI-0010)
como anticuerpo primario. Los resultados están mostrados en la
figura 1 y tabla E.
Estos datos muestran que:
- 1)
- las señales de transcripción/traducción heterólogas de pUT720 son funcionales en Chrysosporium.
- 2)
- la secuencia señal heteróloga de pUT720 es funcional en Chrysosporium.
- 3)
- Chrysosporium puede ser usada como huésped para la secreción de proteínas heterólogas bacterianas.
Cepas C1 NG7C-19 y
UV18-25 fueron transformadas por el plásmido
pUT97OG (Ref. 9). Este vector presenta el cassette de expresión
fúngica siguiente:
- -
- promotor de gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (gpdA) de Aspergillus nidulans (Ref. 2)
- -
- una secuencia señal sintética de celobiohidrolasa I (cbh1) de Trichoderma reesei (refs. 1, 3)
- -
- gen Sh-ble 4 de resistencia a la fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus usado como proteína transportadora (Ref 10)
- -
- dominio articulado (glaA2) de glucoamilasa de Aspergillus niger clonado del plásmido pAN56-2 (refs. 11, 12)
- -
- un péptido de enlace (LGERK) representando un sitio de seccionamiento de proteasa tipo KEX2 (Ref. 1)
- -
- un gen de lisozima humana sintético (h/z) (Ref. 10)
- -
- un terminador de triptófano-sintasa (trpC) de Aspergillus nidulans (Ref. 5)
\vskip1.000000\baselineskip
El vector también lleva el gen de
beta-lactamasa (bla) y el origen de replicación de
E. coli del plásmido pUC18 6. El mapa del plásmido detallado
está provisto en la Figura 3.
Los protoplastos de C1 fueron transformados con
el plásmido pUT970G siguiendo el mismo procedimiento ya descrito en
el ejemplo 1. La proteína de fusión (Sh-ble::
articulación GAM:: HLZ) es funcional con respecto a la resistencia
a la fleomicina permitiendo así la selección fácil de los
transformantes de C1. Además, el nivel de resistencia a la
fleomicina se correlaciona ligeramente con el nivel de expresión de
hlz.
La producción de HLZ de los transformantes de C1
(clones resistentes a la fleomicina) fue analizada por ensayo de
actividad de lisozima como sigue: transformantes primarios fueron
pinchados con palillos en placas de GS+fleomicina (5 \mug/ml)
(verificación de resistencia) y también en placas LYSO (detección
de actividad de HLZ aclarando la zona de visualización (refs. 1,
10). Las placas fueron crecidas durante 5 días a 32ºC. Cada clon
validado fue subclonado en placas LYSO. Dos subclones por
transformante fueron usados para inocular placas de PDA para
obtener esporas para la iniciación del cultivo líquido. Los
cultivos líquidos en IC1 fueron cultivados 5 días a 27ºC (agitación
180 r.p.m.). Luego, los cultivos fueron centrifugados (5000 g, 10
min.). de estas muestras, la actividad de lisozima fue medida según
Mörsky et al. (Ref 13)
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Estos datos muestran que:
- 1)
- los puntos 1 & 2 del Ejemplo 1 están confirmados.
- 2)
- Sh-ble es funcional en Chrysosporim como marcador de resistencia.
- 3)
- Sh-ble es funcional en Chrysosporim como proteína transportadora.
- 4)
- el sitio de seccionamiento de proteasa tipo KEX2 es funcional en Chrysosporium (de lo contrario HLZno sería activa).
- 5)
- Chrysosporium puede ser usada como huésped para la secreción de proteínas heterólogas mamíferas.
\vskip1.000000\baselineskip
La cepa C1 UV18-25 fue
transformada por los plásmidos pUT1064 y pUT1065. pUT1064 presenta
los dos cassettes de expresión fúngica siguientes:
El primer cassette permite la selección de
transformantes resistentes a la fleomicina:
- -
- promotor del gen 1 de control de ruta cruzada de Neurospora crassa 1 (cpc-1) (Ref. 14)
- -
- gen Sh-ble de resistencia a la fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus (Ref. 4)
- -
- terminador de triptófano-sintasa de Aspergillus nidulans (trpC) (Ref. 5)
El segundo cassette es el cassette de producción
de xilanasa:
- -
- promotor cbh1 de la cepa TR2 de T. reesei (Ref. 15)
- -
- gen xyn2 de la cepa TR2 de T. reesei (incluida su secuencia señal) (Ref. 16)
- -
- terminador cbh1 de la cepa TR2 de T. reesei (Ref. 15)
El vector también lleva un origen de replicación
de E. coli del plásmido pUC19 (Ref. 6). El mapa detallado
del plásmido está provisto en la figura 4. pUT1065 presenta el
cassette de expresión fúngica siguiente:
- -
- promotor de gliceraldehído-3-fosfato-deshidrogenasa (gpdA) de A. nidulans (Ref. 2)
- -
- una secuencia señal de celobiohidrolasa I sintética (cbhl) de T. reesei (refs. 1, 3) - gen Sh-ble 4 de resistencia a la fleomicina de S. hindustanus usado como proteína portadora (Ref. 10)
- -
- un péptido de enlace (SGERK) representando un sitio de seccionamiento de proteasa tipo KEX2 (Ref. 1)
- -
- gen xyn2 de la cepa TR2 de T. reesei (sin secuencia señal) (Ref. 16)
- -
- terminador triptófano-sintasa de A. nidulans (trpC) (Ref. 5)
El vector también lleva el gen de
beta-lactamasa (bla) y un origen de replicación de
E. coli del plásmido pUC18 (Ref. 6). El mapa detallado del
plásmido está provisto en la Figura 5.
Los protoplastos C1 fueron transformados con el
plásmido pUT1064 o pUT1065 siguiendo el mismo procedimiento ya
descrito en el ejemplo 1. La proteína de fusión en el plásmido
pUT1065 (Sh-ble:: XYN2) es funcional con respecto a
la resistencia a la fleomicina permitiendo así una selección fácil
de los transformantes de C1. Además, el nivel de resistencia a la
fleomicina se correlaciona ligeramente con el nivel de expresión de
xyn2. En pUT1064, xyn2 fue clonado con su secuencia
señal.
La producción de xilanasa de transformantes de
C1 (clones resistentes a la fleomicina) fue analizada por el ensayo
de actividad xilanasa como sigue: los transformantes primarios
fueron pinchados con palillos a placas de GS+fleomicina (5
\mug/ml) (verificación de resistencia) y también en placas de
xilano (Ref. 17), donde la actividad xilanasa es detectada por
observación de una zona de compensación. Las placas fueron crecidas
durante 5 días a 32ºC. Cada clon validado fue subclonado sobre
placas de xilano. Dos subclones por transformante fueron usados
para inocular placas de PDA para obtener esporas para inoculación
de cultivo líquido. Los cultivos líquidos en IC1 + 5 g/l de Ftalato
K^{+} fueron dejados crecer 5 días a 27ºC (agitación 180 r.p.m.).
Luego, los cultivos fueron centrifugados (5000 g, 10 min.). De estas
muestras, la actividad xilanasa fue medida por la técnica DNS según
Miller et al. (ref 18)
Estos datos muestra que:
- 1)
- los puntos 1 a 4 del ejemplo 2 están confirmados.
- 2)
- C1 puede ser usado como huésped para la secreción de proteínas heterólogas fúngicas.
\vskip1.000000\baselineskip
La Tabla H muestra los resultados para los
plásmidos con los cuales se efectuó la transformación de
UV18-25. La tabla muestra niveles de expresión para
endoglucanasa y celobiohidrolasa usando secuencias reguladoras de la
expresión heterólogas y secuencias señal y también con secuencias
reguladoras de la expresión homólogas y secuencias señal. Los
detalles de los distintos plásmidos pueden ser derivados en otro
lugar en la descripción y a partir de las figuras. La producción
ocurre a pH alcalino a una temperatura de 35ºC.
ADN genómico de A. sojae fue aislado de
protoplastos obtenidos de ATCC 11906 usando un protocolo
previamente descrito (Punt, van den Hondel, Methods Enzymol. 1992
216:447-457). Después del aislamiento el ADN fue
extraído de los protoplastos usando el protocolo descrito por Kolar
et al., Gene 1988 62:127-34. Posteriormente
el ADN fue parcialmente digerido con MboI para resultar en
fragmentos de ADN de un tamaño promedio de 30-50
kb.
El vector pAOpyrGcosarp1, que fue usado para la
construcción de la genoteca fue construido por unión de un
fragmento BamHI-HindII de 3 kb de pANsCos1
(Osiewacz, Curr Genet. 1994 26:87-90) y un fragmento
Acc651-HindIII de 3.2 kb de pAO4.2 (De
Ruiter-Jacobs et al., Curr. Genet. 1989
16:159-63) en pHELP1 digerido con
Acc65I-BamHI (Gems et al., Gene 1991
98:61-67). Este vector cósmido lleva el marcador de
selección pyrG de A. oryzae y es autorreplicativo en hongos
filamentosos.
El ADN genómico digerido con MboI fue unido a
pAOpyrGcosarp1 digerido con BamHI, y la mezcla de unión fue
envuelta en partículas de fago usando el kit de vectores Stratagene
Supercos1 (Stratagene Inc., La Jolla CA). Esto resultó en un total
de aprox. 30.000 clones individuales, que representan una
representación de 30 veces aproximadamente del genoma de A.
sojae. Reservas (en 15% de glicerol) de depósitos de los clones
resultantes fueron almacenadas a -80ºC para uso posterior.
\vskip1.000000\baselineskip
Un mutante pyrG de ATCC 11906 de A. sojae
fue seleccionado como un derivado resistente al ácido fluoroorótico
de ATCC 11906, como se describe en WO 01/09352. Esta cepa, ATCC
11906pyrG de A. sojae, fue transformada con dos vectores
llevando el gen pyrG de A. niger. Un vector
pAB4-1 (van Hartingsveldt et al., Mol. Gen.
Genet. 206:71-75 (1987)) lleva sólo el gen pyrG,
mientras que pAB4-arp1 (Verdoes et al., Gene
146:159-165 (1994)) lleva el gen pyrG y la
secuencia AMA1 de A. nidulans. La transformación de ATCC
11906pyrG resulta en 5-10 transformantes por
microgramo de ADN de pAB4-1, mientras que con la
frecuencia pAB4-arp1 fueron al menos
10-100 veces mayores. El análisis fenotípico de los
transformantes reveló que el fenotipo pyrG de los transformantes
pAB4-arp1 fue mantenido sólo bajo selección
continua, mientras que los transformantes pAB4-1
fueron estables con y sin selección para el fenotipo pyrG. Estos
resultados confirman la replicación autónoma del ADN plásmido
introducido en transformantes pAB4-arp1. Resultados
similares fueron obtenidos con vectores de transformación fúngica
alternativos llevando la secuencia AMA1 o derivados de la misma., p.
ej. pAOpyrGcosarp1.
\vskip1.000000\baselineskip
ATCC 11906pyrG de A. sojae o los mutantes
pertinentes, en particular mutantes de morfología compacta de los
mismos, fueron transformados con una genoteca de A. sojae
basada en el vector de transformación pAOpyrGcosarp1. Este vector
resulta en una alta frecuencia de transformantes con copias de
vector que se replican libremente. Los protoplastos fúngicos fueron
tratados como se describe en Punt y van den Hondel, Methods
Enzymol. 1992 216:447-457 con ADN de una biblioteca
de cósmidos que lleva clones genómicos de ADN fúngico de A.
sojae o Chrysosporium y diluciones en serie de los
protoplastos transformados fueron puestos en placas de agar
selectivas para determinar la frecuencia de transformación obtenida.
Los protoplastos restantes fueron regenerados en medio selectivo
durante unas horas y almacenados a 4ºC. Con base en los resultados
obtenidos para la frecuencia de transformación (que dependiendo del
experimento alcanzará valores de hasta varios miles de
transformantes por microgramo de ADN de la biblioteca de cósmidos),
las diluciones limitadoras de los protoplastos regenerados fueron
puestas en placas de microtitulación de 96, 248, o un formato de
pocillos alternativo, dando como resultado un protoplasto
transformado por pocillo. Las placas fueron incubadas a 35ºC para
formar biomasa fúngica. La biblioteca de transformantes resultante
se usa para experimentos sucesivos.
Una estrategia similar fue usada para la
construcción de una recogida de transformantes fúngicos que llevan
alelos mutantes de Chrysosporium CBH1. Esta estrategia puede
también ser usada con una biblioteca de mutantes derivados de
cualquier otro gen de interés, si se genera por mutagénesis, la
transposición de genes o enfoques de evolución de genes.
\vskip1.000000\baselineskip
Muchos hongos, tales como Aspergillus
sojae, no muestran esporulación bajo fermentación sumergida.
Aquí describimos un enfoque previamente desconocido para obtener
esporulación bajo estas condiciones. ATCC 11906 de A. sojae
y en particular mutantes de morfología de crecimiento compacto del
mismo fueron dejados crecer en un medio de crecimiento sintético
suplementado con extracto de levadura. Bajo estas condiciones la
acumulación rápida de biomasa ocurre en cultivos tanto estáticos
como agitados. No obstante, no ocurre ninguna esporulación en el
fluido de cultivo. Un medio de crecimiento similar con la adición
de 0,6 g/kg de EDTA resulta en rendimientos considerables de
alcance de esporas hasta 10^{9} esporas por ml de fluido de
cultivo tras la incubación de 2-4 días a 35ºC.
Medio sintético (+/- EDTA):
\vskip1.000000\baselineskip
Numerosos sistemas de transformación versátiles
para hongos filamentosos se basan en el uso de cepas mutantes que
requieren uridina. Estas cepas mutantes son bien deficitarias en
orotidina 5 fosfato descarboxilasa (OMPD) u orotato
p-ribosil transferasa (OPRT). (T. Goosen et
al., Curr Genet. 1987,11:499-503; J. Begueret
et al., Gene. 1984 32:487-92). Previamente
hemos aislado el gen pyrG OMPD de A. niger (W. van
Hartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet. 1987
206:71-5). La clonación del gen OPRT (pyrE) de
A. niger se efectuó por complementación de un mutante
distinto de pyrG que requiere uridina resistente a FOA de A.
niger. Para la complementación se usó una biblioteca de
cósmidos de A. niger en el vector pAOpyrGcosarp1. De los
transformantes de complementación, los clones de cósmidos genómicos
fueron aislados, llevando el gen de A. niger de
complementación, denominado ahora pyrE. Un fragmento Sstll de 5.5 kb
que lleva el gen pyrE fue clonado en el vector pBLUESCRIPT (TM)
(Stratagene) dando como resultado el vector pBLUEpyrE. Un fragmento
de 1.6 kb de este vector que abarca la región codificante de pyrE
fue secuenciado para confirmar la ubicación del gen OPRT (véase
Fig. 15).
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas de Chrysosporiun luknowense que
requerían uridina fueron seleccionadas como derivados resistentes
al ácido fluoroorótico de C1 y UV18-25 por los
métodos descritos en la publicación PCT WO 01/09352. La selección
de derivados resistentes al ácido fluoroorótico pueden suponer el
aislamiento de dos tipos de mutantes que requieren uridina, es
decir, bien mutantes de orotidina 5 fosfato descarboxilasa (OMPD) o
bien mutantes de orotato P-ribosil transferasa
(OPRT) (T. Goosen et al., Curr Genet. 1987, 11:
499-503). Para determinar la naturaleza de los
mutantes de Chrysosporium obtenidos, se realizaron
experimentos de transformación con los genes pyrG de A. niger
disponibles (OMPD; vector pAB4-1, W. van
Hartingsveldt et al., Mol. Gen. Genet. 1987
206:71-5) y pyrE (pBLUE-pyrE; OPRT).
Como se muestra en la Tabla 1, sólo la transformación de las cepas
mutantes con el gen pyrE resultó en transformantes prototróficos,
implicando que las cepas de Chrysosporium son mutantes de
OPRT. Después de la nomenclatura génica de Chrysosporium que
hemos adoptado, los mutantes fueron designados pyr5.
Con base en el vector pBLUEpyrE dos derivados
fueron generados que llevaban secuencias que suministraban
características de replicación autónoma a los vectores al
introducirse en hongos filamentosos. Un fragmento HindIII de 5.5 kb
llevando las secuencias AMA1 de Aspergillus nidulans (J:
Verdoes et al., Gene 1994 146:159-65) fue
introducido en el único sitio HindIII de pBLUEpyrE dando como
resultado pBLUEpyrE-AMA. Un fragmento de HindIII
(parcial) de 2.1 kb que lleva secuencias teloméricas humanas (A.
Aleksenko, L. Ivanova, Mol. Gen. Genet. 1998
260:159-64) fue introducido en el único sitio
HindIII de pBLUEpyrE dando como resultado
pBLUEpyrE-TEL. Estos vectores fueron introducidos
en cepas mutantes OPRT de Aspergillus y Chrysosporium
dando como resultado transformantes prototróficos. Varios de los
transformantes obtenidos mostraron la característica de fenotipo
rasgado de transformantes que llevan plásmidos que se replican
libremente (J. Verdoes et al., Gene 1994
146:159-65).
El protocolo se basa en un procedimiento
originalmente usado para transformación de Aspergillus (P.
Punt, C. van den Hondel, Methods in Enzymology 1992
216:447-457). Medio rico (250 ml) fue inoculado con
10^{6} esporas/ml del mutante Chrysosporium pyr5
(supra) en un matraz de Erlenmeyer de 1L. El cultivo fue
dejado crecer durante 24-48 horas a 35ºC en una
incubadora de aire (300 r.p.m.). El micelio fue filtrado a través de
un filtro Miracloth(TM) estéril (Calbiochem) y lavado con
aprox. 100 ml 1700 mosmol NaCl/CaCl_{2} (0.27 M CaCl_{2}/0.6 M
NaCl). El micelio fue pesado y luego mantenido en hielo.
Caylase(TM) (Cayla) fue añadido (20 mg por gramo de micelio)
y 1700 mosmol NaCl/CaCl_{2} (3.3 ml/g micelio) y la suspensión fue
incubada en una incubadora de aire a 33ºC (100 r.p.m.). La
protoplastización fue vigilada bajo el microscopio. Después de
1-3 horas de incubación, la mayor parte del micelio
fue digerida, dejando principalmente protoplastos en la vista
microscópica de la preparación. Los protoplastos fueron filtrados a
través de un filtro Miracloth estéril y el filtro fue lavado con 1
volumen de STC1700 frío (1.2 M sorbitol/10 mM Tris.HCl pH 7.5/50 mM
CaCl_{2}/35 mM NaCl). Los protoplastos fueron centrifugados a
2500 r.p.m. durante 10 minutos a 4ºC. El granulado fue resuspendido
en STC1700 y centrifugado otra vez. Después de resuspender el
granulado en STC1700, los protoplastos fueron contados. STC1700 fue
añadido a una concentración final de 2 x 10^{8} protoplastos por
ml.
El ADN del vector (pAB4-1 o
pBLUE-pyrE, 1-10 \mug) fue
pipetado en el fondo de un tubo estéril y 1 \mul de ATA 1M (ácido
aurintricarbónico) y 100 \mul de protoplastos (aprox. 2 x
10^{7}) fueron añadidos al ADN. Un control negativo de ADN
negativo fue incluido en el experimento. Después de la mezcla, los
protoplastos fueron incubados a la temperatura ambiente durante 25
minutos. PEG6000 (60% PEG/50 mM CaCl_{2}/10 mM tris pH 7.5) fue
añadida a porciones como sigue: 250 \mul, mezcla, 250 \mul,
mezcla, 850 \mul y mezcla. La solución fue mantenida a la
temperatura ambiente durante 20 minutos. Los tubos fueron luego
llenados con 8 ml de STC1700, mezclados y centrifugados a 2500
r.p.m. durante 10 minutos a 4ºC, y el granulado fue suspendido en
250 \mul de STC1700. Alícuotas de la muestra fueron usadas para
colocar en placas en un medio selectivo. Para la selección de
pyr^{+}, se prepararon placas conteniendo 1.5% de Daishin
agar, 1.2 M de sorbitol, 1x AspA con nitrato, 2 mM de MgSO_{4}.7
H_{2}O, 1x elementos traza, 0.1% casaminoácidos y 1% glucosa. Si
se selecciona para amdS (y pyr^{+}), las placas contenían
1.5% de agar Oxoid, 1.2 M de sorbitol, 2 mM MgSO_{4}.7 H_{2}O,
1x elementos traza, 1% glucosa, 1x AspA sin nitrato, 15 mM CsCl y
10 mM de acetamida o acrilamida. Las placas fueron incubadas a 30 o
35ºC.
Las esporas y protoplastos viables antes y
después del procesamiento de PEG6000 fueron contados colocando en
placas diluciones en STC1700 en placas de medio mínimo con nitrato
y con o sin sorbitol. 100 \mul de 10^{-1}, 10^{-2} y
10^{-3} diluciones fueron colocadas en placas sin sorbitol para
contar esporas y 100 \mul de 10^{-2}, 10^{-3}, 10^{-4} y
10^{-5} diluciones fueron colocadas en placas con sorbitol para
contar los protoplastos viables.
Los resultados de las transformaciones están
mostrados en la tabla I.
Para cepas de Chrysosporium,
Trichoderma, y Aspergillus productoras de celulasas o
amilasas, sólidos secos totales fueron determinados pasando una
alícuota medida del caldo entero a través de un filtro prepesado,
lavando con agua desionizada, y secando el pastel y filtro durante
toda la noche a 60ºC y durante una hora a 100ºC. Tras el
enfriamiento en un desecante, la biomasa fue determinada
substrayendo el peso del filtro del peso del filtro seco más la
torta de filtración y dividiendo por el volumen de caldo
eliminado.
Para cepas de Trichoderma y
Aspergillus, se presumió que la biomasa era igual a los
sólidos totales secos puesto que allí hubo poco material insoluble
a parte de la biomasa en el momento en que se tomaron las
mediciones. Para cepas de Chrysosporium productoras de
celulasa, hubo una cantidad significante de celulosa en el medio,
así la biomasa fue determinada como la diferencia entre sólidos
totales secos y celulosa. La celulosa fue evaluada como sigue.
Partes alícuotas medidas del caldo entero fueron
centrifugadas para eliminar sólidos y el sobrenadante fue
descartado. El granulado fue resuspendido en un volumen de 0.1 N de
NaOH igual al volumen de caldo original y fue añadido un décimo
volumen de 0.5 N de NaOH. La mezcla fue incubada durante cuatro
horas a 65ºC. Este procesamiento disolvió todo excepto la celulosa.
La mezcla alcalina fue enfriada y centrifugada, y el sobrenadante
fue descartado. El resultante granulado fue lavado dos veces por
resuspensión en agua desionizada y centrifugado. El granulado lavado
fue resuspendido en agua desionizada, transferido a un recipiente
prepesado y secado como se ha descrito anteriormente. La
concentración de celulosa fue determinada dividiendo el peso en
seco por el volumen de la alícuota evaluada.
La proteína fue determinada por el procedimiento
de unión de colorante de Bradford (M. Bradford, 1976, Anal.
Biochem. 72:248) usando un estándar de inmunoglobulina. Las
proporciones de proteína/biomasa para proteínas seleccionadas
expresadas en varias cepas filamentosas fúngicas están presentadas
en la Tabla J.
Como un ejemplo de una proteína indicadora
versátil y fácilmente seleccionablle, proteína verde fluorescente
(GFP) de la medusa Aequoria victoria fue expresada en A.
sojae y C. lucknowense. Vectores que llevan GFP (A.
Santerre Henriksen et al., Microbiology. 1999,
145:729-734) y genes de fusión de
glucoamilasa-GFP (pGPDGFP, C. Gordon et al.,
Microbiology. 2000 146:415-26) fueron modificados
por sustitución del promotor glaA con el promotor gpdA de A.
nidulans expresado constitutivamente. Los vectores fueron
introducidos en A. sojae por cotransformación, usando bien el
marcador de selección pyrG o amdS. El vector pGPDGFP
y sus derivados fueron introducidos en Chrysosporium por
cotransformación usando bien el marcador de selección pyrE o
amdS. La expresión resultó en transformantes fluorescentes
luminosamente de A. sojae y Chrysosporium, confirmando
la expresión de GFP por ambos vectores. La fluorescencia de
sobrenadantes de cultivo de los transformantes que expresan la
glucoamilasa-proteína de fusión GFP indica la
secreción de la proteína de fusión fluorescentemente activa. La
expresión de la proteína fluorescente fue también observada en
esporas (o propágulos tipo esporas) obtenidas de los distintos
transformantes que expresan la versión citoplásmica no segregada de
las proteínas fluorescentes.
Los pocillos de una placa de microtitulación de
96 pocillos son cargados con un medio apropiado, bien manualmente
con una pipeta multicanal o mediante un sistema de manipulación de
placa automatizada. Un volumen grande aumenta la posibildad de
infección cruzada, mientras que para evitar problemas con la
evaporación del volumen éste no debería ser demasiado pequeño. Si
se usa la placa de fondo redondo COSTAR(TM) 3799, por
ejemplo, 150 \mul es un volumen apropiado para trabajar. Las
placas son inoculadas con esporas de colonias crecidas en placas
usando palillos para la transferencia. De forma alternativa, las
placas pueden ser inoculadas pipetando partes alícuotas pequeñas de
suspensiones de esporas, protoplastos o elementos hifales. Estas
suspensiones pueden ser derivadas de soluciones de
esporas/protoplastos aislados o de cultivos esporulantes crecidos en
microplacas. La inoculación puede también efectuarse a partir de
placas de microtitulación usando una herramienta de una punta o una
de 96 puntas.
Posteriormente las placas son incubadas a 35ºC.
Para minimizar la evaporación, placas tapadas pueden ser empleadas,
o las placas pueden ser selladas con una membrana que permite el
intercambio de O_{2}, H_{2}O y CO_{2} y bastones a la
superficie de la placa. Para limitar adicionalmente la evaporación,
una incubadora de atmósfera controlada puede ser usada.
Después de tres a cuatro días de incubación, la
cantidad de biomasa es apropiada para una transferencia eficaz a
placas de microtitulación nuevas que contienen medio fresco. Para
la preparación de placas de réplica, se usa una herramienta de 96
puntas. Las placas hijas que tienen dispositivos diferentes de los
cultivos pueden ser preparadas por pipetado manual o robótico o
transferencia con puntas. Para asegurar la presencia de elementos de
reproducción transferibles en las puntas de transferencia, la
herramienta de punta es sumergida en el cultivo de placa de
microtitulación y agitada durante 20 segundos. La herramienta de
puntas es luego cuidadosamente eliminada de la placa inicial y se
hace una impresión en una placa de microtitulación nueva. Un
procedimiento de transferencia eficaz de forma similar puede también
ser conseguido usando una pipeta de canales múltiples,
transfiriendo aproximadamente 1 \mul del cultivo de la placa de
microtitulación parental. En ambos casos una transferencia eficaz
es conseguida debido a la presencia de elementos reproductivos
transferibles, tales como esporas, propágulos tipo espora,
protoplastos, o fragmentos hifales o miceliales. Los protoplastos
pueden ser generados en los pocillos de microplaca por procesamiento
con enzimas degradadoras de la pared celular y luego transferir
estos protoplastos. La formación de protoplastos en microplacas ha
sido descrita por C. van Zeijl et al., J Biotechnol. 1997
59:221-224.
Otra mejora de la transferencia es obtenida
incubando los cultivos de la placa de microtitulación en un
agitador de placa de microtitulación a 35ºC. Esto aumenta el número
de elementos reproductivos transferibles en los cultivos. Para
almacenar los cultivos de la placa de microtitulación, se añade
glicerol hasta una concentración final del 15%, y las placas son
almacenadas a -80ºC. Para experimentos de transferencia
posteriores, las placas son descongeladas y se realiza la
transferencia como se ha descrito antes. Transferencia eficaz con
cepas tipo salvaje o comerciales de A. niger y A.
sojae no fue realizable según las condiciones usadas aqui,
puesto que estas cepas mostraron un crecimiento de superficie
vigoroso y esporulación aérea después de un día. La esporulación
aérea causa contaminación cruzada masiva durante la transferencia,
y el crecimiento de la superficie que cubre los pocillos
posteriormente excluye una proporción grande de métodos de ensayo
conocidos.
Con base en el vector de expresión fúngica
pAN52-1 NOT (registro de EMBL Z32524) o uno de sus
derivados, un vector fue construido en el que está presente un
único sitio de clonación de BamHI directamente corriente abajo del
promotor de rango huésped fúngico amplio expresado constitutivamente
para el gen gpdA de A. nidulans (P. Punt et al., J.
Biotechnol. 1991 17:19-33). Este vector fue
construido de manera que los fragmentos de ADN genómico que llevan
el codón de iniciación de la traducción (ATG) puedan ser expresados.
Para proporcionar un marcador de selección para este vector, un
fragmento NotI-BamHI de pBLUEpyrE fue clonado en el
vector de expresión digerido con NotI BglII denominado
pAN52-BamHI, dando como resultado el vector
pAN52-pyrE. Los fragmentos de ADN genómico de
Chrysosporium en un rango de tamaño de 3-6
kb fueron obtenidos con digestión parcial de Sau3A. Después de la
unión de estos fragmentos en el vector de expresión
pAN52-pyrE digerido con BamHI, se obtuvieron varios
clones recombinantes suficientes para cubrir el genoma de
Chrysosporium entero varias veces. Varios de estos clones
fueron agrupados para cubrir al menos 5-10
equivalentes del genoma fúngico. El ADN plásmido de estas
agrupaciones fue preparado y usado para la transformación de
mutantes pyr5 de Chrysosporium o pyrE de Aspergillus.
Las colecciones de transformantes fueron generadas en un formato de
microplaca como se ha descrito anteriormente, y usadas para
selección adicional funcional/actividad. De forma alternativa, una
biblioteca de expresión puede ser construida usando promotores de
Chrysosporium específicamente regulados, como se describe en
PCT/NL99/00618.
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[0187]
Claims (29)
-
\global\parskip0.950000\baselineskip
1. Método para expresar una pluralidad de proteínas codificadas por una biblioteca de vectores de ADN, donde la biblioteca de vectores comprende una pluralidad de vectores diferentes, cada vector diferente comprendiendo una secuencia de ácidos nucleicos que codifica proteínas diferentes, dicha secuencia de ácidos nucleicos siendo operativamente enlazada a una región reguladora de la expresión y opcionalmente una secuencia que codifica una señal de secreción, el método incluyendo las etapas de:- (a)
- suministar una pluralidad de hongos filamentosos individuales, dichos hongos teniendo un fenotipo caracterizado por el crecimiento en suspensión y caracterizado por la producción de elementos transferibles reproductivos que son monoclonales y fácilmente separados los unos de los otros en suspensión;
- (b)
- transfomar de forma estable dichos hongos filamentosos con dicha biblioteca de vectores de ADN para introducir en cada uno de una pluralidad de los hongos individuales al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifica proteínas heterólogas u homólogas;
- (c)
- cultivar los hongos filamentosos transformados en suspensión bajo condiciones propicias para la formación de elementos reproductivos transferibles;
- (d)
- separar entre sí una pluralidad de elementos reproductivos transferibles; y
- (e)
- cultivar en cultivos monoclonales o colonias monoclonales los elementos reproductivos transferibles individuales, bajo las condiciones propicias para la expresión de las proteínas codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos que codifican las proteínas heterólogas u homólogas.
\vskip1.000000\baselineskip
- 2. Método para seleccionar una pluralidad de proteínas codificadas por una biblioteca de vectores de ADN para una actividad o propiedad de interés, que incluye las etapas de:
- (a)
- expresar la pluralidad de proteínas en cultivos fúngicos monoclonales filamentosos o colonias fúngicas monoclonales filamentosas, por el método según la reivindicación 1; y
- (b)
- seleccionar los cultivos clonales individuales o colonias clonales para la actividad o propiedad de interés.
\vskip1.000000\baselineskip
- 3. Método para producir una molécula de ADN que codifica una proteína con una actividad o propiedad de interés, que incluye las etapas de:
- (a)
- expresar una pluralidad de proteínas en cultivos fúngicos monoclonales filamentosos o colonias fúngicas monoclonales filamentosas, por el método según la reivindicación 1;
- (b)
- seleccionar cultivos clonales individuales o colonias clonales para la actividad o propiedad de interés; y
- (c)
- aislar ADN de un cultivo clonal o colonia clonal que presenta la actividad o propiedad de interés.
\vskip1.000000\baselineskip
- 4. Método para producir la secuencia de nucleótidos de una molécula de ADN que codifica una proteína con una actividad o propiedad de interés, que incluye las etapas de:
- (a)
- aislar ADN de un cultivo clonal o colonia clonal que presenta la actividad o propiedad de interés, por el método según la reivindicación 3; y
- (b)
- secuenciar dicho ADN.
\vskip1.000000\baselineskip
- 5. Método para producir la secuencia de aminoácidos de una proteína con una actividad o propiedad de interés, que incluye las etapas de:
- (a)
- producir la secuencia de ADN de la proteína con una actividad o propiedad de interés, por el método según la reivindicación 4; y
- (b)
- convertir dicha secuencia de ADN en una secuencia de aminoácidos.
\vskip1.000000\baselineskip
- 6. Método para optimizar una actividad o propiedad de proteína de interés, que incluye las etapas de:
- (a)
- suministrar una biblioteca de vectores que comprenden secuencias de ADN que codifican formas mutantes de la proteína;
\global\parskip1.000000\baselineskip
- (b)
- suministrar una pluralidad de hongos filamentosos individuales, dichos hongos teniendo un fenotipo caracterizado por el crecimiento en suspensión y por la producción de elementos reproductivos transferibles que son monoclonales y fácilmente separados el uno del otro en suspensión;
- (c)
- transformar de forma estable dichos hongos filamentosos con dicha biblioteca de vectores de ADN para introducir en cada uno de una pluralidad de hongos individuales al menos una secuencia de ácidos nucleicos que codifican proteínas heterólogas u homólogas;
- (d)
- cultivar los hongos transformados filamentosos en suspensión bajo condiciones propicias para la formación de elementos reproductivos transferibles en suspensión;
- (e)
- separar entre sí una pluralidad de elementos reproductivos transferibles;
- (f)
- cultivar en cultivos clonales o colonias clonales los elementos reproductivos individuales transferibles, bajo condiciones propicias para la expresión de las proteínas codificadas por las secuencias de ácidos nucleicos que codifican proteínas heterólogas u homólogas;
- (g)
- seleccionar cada organismo individual, cultivo clonal, o colonia clonal para una proteína expresada que tenga la actividad o propiedad de interés;
- (h)
- aislar uno o más organismos individuales, cultivos clonales, o colonias clonales que expresan una proteína que presenta la actividad o propiedad de interés;
- (i)
- mutar el ADN de los organismos individuales aislados, cultivos clonales, o colonias clonales que codifican la proteína que presenta la actividad o propiedad de interés;
- (j)
- suministrar una biblioteca de vectores que comprenden las secuencias de ADN mutado obtenidas en la fase (i); y
- (k)
- repetir las fases (b) a (g), hasta que la propiedad o actividad de interés bien alcanza un nivel deseable o bien ya no mejora más.
\vskip1.000000\baselineskip
- 7. Método según la reivindicación 6, comprendiendo además entre fases (h) y (i) las fases de:cultivar uno o más de los organismos individuales, cultivos clonales, o colonias clonales aisladas en la fase (h);aislar la proteína expresada que presenta la actividad o propiedad de interés; yevaluar la proteína aislada para la propiedad de interés.
\vskip1.000000\baselineskip
- 8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 2-7, donde la fase de selección se realiza por selección de alto rendimiento.
- 9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la viscosidad de la suspensión es inferior a 200 cP.
- 10. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la viscosidad de la suspensión es inferior a 100 cP.
- 11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la viscosidad de la suspensión es inferior a 60 cP.
- 12. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la viscosidad de la suspensión es inferior a 10 cP.
- 13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde los vectores comprenden una secuencia señal fúngica.
- 14. Método según la reivindicación 13, donde la secuencia señal fúngica es la secuencia señal de un gen fúngico que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste en celulasa, \beta-galactosidasa, xilanasa, pectinasa, esterasa, proteasa, amilasa, poligalacturonasa e hidrofobina.
- 15. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde los vectores comprenden una secuencia de nucleótidos que codifican un marcador seleccionable.
- 16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde los vectores comprenden una región reguladora de la expresión operativamente enlazada a la secuencia de ácidos nucleicos que codifica la proteína.
- 17. Método según la reivindicación 16, donde la región reguladora de la expresión comprende un promotor inducible.
- 18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el hongo es de la clase Euascomycetes.
- 19. Método según la reivindicación 18 donde el hongo es del orden Onygenales o Eurotiales.
- 20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el hongo es de la división Ascomycota, con la condición de que no sea del orden Saccharomycetales.
- 21. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el hongo es de un género seleccionado del grupo que consiste en: Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Neurospora, Rhizomucor, Hansenula, Humicola, Mucor, Tolypocladium, Fusarium, Penicillium, Talaromyces, Emericella e Hypocrea.
- 22. Método según la reivindicación 21 donde el hongo es de un género seleccionado del grupo que consiste en Aspergillus, Fusarium, Chrysosporium, y Trichoderma.
- 23. Método según la reivindicación 22, donde el hongo es la cepa UV18-25 de Chrysosporium que tiene número de registro VKM F 3631 D, la cepa X-252 de Trichoderma longibrachiatum, la cepa pclA de Aspergillus sojae o la cepa pclA de Aspergillus niger.
- 24. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde la proteína expresada homóloga o heteróloga es segregada en el medio de cultivo.
- 25. Método según cualquiera de reivindicaciones 1-8, donde los elementos reproductivos transferibles son células micóticas individuales.
- 26. Método según cualquiera de reivindicaciones 1-8, donde los elementos reproductivos transferibles son esporas, fragmentos hifales o microgránulos.
- 27. Método según cualquiera de reivindicaciones 1-8, donde los elementos reproductivos transferibles son protoplastos.
- 28. Método según la reivindicación 2 comprendiendo además (c) el aislamiento de la proteína expresada.
- 29. Método para obtener un huésped fúngico transformado filamentoso que expresa una proteína con una actividad o propiedad de interés, que incluye las etapas de:
- (a)
- seleccionar una pluralidad de proteínas codificadas por una biblioteca de vectores de ADN para una actividad o propiedad de interés, por el método según la reivindicación 2; y
- (b)
- aislar el cultivo monoclonal o colonia monoclonal que expresa la actividad o propiedad de interés.
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