MXPA01012905A

MXPA01012905A - Clasificacion de alto rendimiento de bibliotecas de adn expresado en hongo filamentos.

Info

Publication number: MXPA01012905A
Application number: MXPA01012905A
Authority: MX
Inventors: Jan Punt Peter
Original assignee: Mark Aaron Emalfarb
Priority date: 2000-04-13
Filing date: 2001-04-13
Publication date: 2002-11-22
Also published as: EP1272669A1; EP1272669B1; DK1272669T3; EA006873B1; CA2376552A1; JP2003530843A; WO2001079558A8; EA200200035A1; BR0105795A; AU5354401A; JP5138855B2; CN1380905A; ES2328011T3; DE60138947D1; EP1272669A4; CN102174551A; ATE433486T1; WO2001079558A1; IL146935A0

Abstract

La presente invencion proporciona un metodo para la expresion de bibliotecas de ADN exogeno en hongos filamentosos. Los hongos tienen la capacidad de procesar genes eucarioticos que contienen intron y tambien pueden llevar a cabo pasos de procesamiento de post-traduccion tales como glicosilacion y pliegue de proteina. La presente invencion proporciona el uso de hongos con morfologia alterada, que permiten la clasificacion de alto rendimiento y dirigen la evolucion molecular de las proteinas expresadas. Se pueden utilizar los mismos hongos transformados (tal como se muestra en la figura 1) para producir mayores cantidades de proteina para la elaboracion de pruebas de aislamiento, caracterizacion y aplicacion, y pueden ser adecuados tambien para la produccion comercial de la proteina.

Description

CLASIFICACIÓN DE ALTO RENDIMIENTO DE BIBLIOTECAS DE ADN EXPRESADO EN HONGO FILAMENTOS Campo del I nvento La presente invención proporciona un método para la expresión y subsecuente clasificación de bibliotecas de ADN , particularmente bibliotecas sintéticas, genómicas y de cADN en huéspedes fúng icos filamentosos. El sistema emplea cepas fúngicas filamentosas transformadas o transfectadas que generan elementos reproductivos transferibles, por ejemplo mediante esporulación eficiente en cultivo sumergido. El hongo exhibe preferentemente una morfolog ía que min imiza o elimina la formación de micelia enredada. Las cepas fúngicas particularmente preferidas, también tienen la capacidad de expresar cantidades que se pueden aislar de proteínas exógenas para evaluación . Las cepas fúngicas mutantes de la presente invención , están particularmente bien adaptadas para técnicas de clasificación de alto rendimiento, debido a su producción de elementos reproductores transferibles, niveles de expresión altos y muy baja viscosidad de cultivo. Antecedentes del Invento Las poblaciones de microorganismos que su rgen de manera natural, exhiben una amplia formación de diversidad bioquímica y metabólica. Debido en parte a las dificultades de aislamiento y cultivo de muchos microorganismos, se ha escapado la identificación de un vasto número de proteínas y polipéptidos potencialmente valiosos en estas poblaciones. De hecho se ha estimado que menos - tv?müiwiin ,n torfüfeii iriém i *^******.,.* ------ --^^^gj el 1 % de los microorganismos en el mundo han sido cultivados hasta la fecha. Permanece una constante necesidad de nuevos métodos para la caracterización de proteínas, polipéptidos y metabolitos procedentes de microorganismos todavía no cultivados e identificados, y también de microorganismos conocidos. (El término proteína tal como se utiliza en la presente invención, debe entenderse que comprende también péptidos y polipéptidos). También existe la necesidad de nuevos métodos para la identificación y aislamiento de genes que codifican estas proteínas, así como para permitir la modificación y/o producción de las proteínas. En las Patentes Norteamericanas Nos. 5,958,672; 6,001 ,574, 6,030,779 y 6,057, 1 03 (cuyos contenidos se encuentran incorporados a la presente invención como referencia) de Short se ha descrito un método para este problema. En este método, se prepara una biblioteca de ADN genómico directamente a partir de una muestra ambiental (por ejemplo, una muestra de tierra) , con o sin hacer un intento para aislar o cultivar cualesquiera organismos que pudieran estar presentes. La biblioteca de ADN se expresa en E. coli, y las proteínas expresadas son clasificadas, para una propiedad o actividad de interés. Short hace alusión a, pero no describe o hace posible, el uso de células huésped fúngicas en este método. El método tal como se describe, sufre de varias desventajas severas, una de las cuales es que E. coli no expresa en forma efectiva genes que tienen intrónes. Aproximadamente el 90% de las -l-j -Í.&?.Í. &*-* -«. ..... -..-------. * *"-* *- * especies de m icroorganismos en tierra son eucariotos (principalmente hongos) , los cuales generalmente tienen intrónes en su ADN genómico. Debido a que ya existen aproximadamente 100,000 especies de hongos eumycotan conocidas, con u n estimado 5 de 1 ,000,000 para ser descubierto (B. Kendrick, El Quinto Reino, Mycologue Publications 1999), el potencial para la diversidad de proteína y metabolitos es m ucho mayor entre los genomas fúngicos, aunque la presencia de los intrónes, pone a la mayor parte del repertorio de proteína y metabolitos fúngicos fuera del alcance de 10 sistemas de expresión bacteriana. No únicamente existen muchas clases de enzimas (por ejemplo, peroxidasas de lignina fúngica segregadoras y peroxidasas que dependen de manganeso) únicas para hongo, sino q ue pueden existir proteínas fúngicas, incluyendo enzimas (por ejemplo, peroxidazas de lignina invertasa A. niger), que 15 son glucosiladas, y tales proteínas podrían no ser glucosiladas si fueran expresadas mediante E. coli. El número mucho más alto y tamaño y complejidad mayor de los genomas fúngicos, la singularidad de muchas proteínas fúngicas, y la glucosilación de muchas proteínas fúngicas, todas indican que la fracción de la 20 proteína microbiana y diversidad de metabolito en una muestra ambiental determinada que pod ría ser detectada realmente mediante la expresión bacteriana del ADN genómico, es considerablemente menor al 1 0% . Debido en parte a la difusión de SIDA y a la creciente 25 población de receptores de trasplante de órganos, existe una . ---------<---------------Mu-------M^Md ¡M aH>Miite-------É-É-ÍM-Í-Í-Í-Í^MM-ÍÍÉ--i--l--. m- creciente población de individuos inmuno-comprometidos o inmuno- suprimidos, y el número y variedad de infecciones fúngicas a crecido (Infec. Med. 16:380-382, 385-386 (1999)). Existe la necesidad de identificar y caracterizar proteínas a partir de hongo patogénico en el 5 curso de la búsqueda de nuevos objetivos para fármacos antifúngicos, que requieren de la capacidad para clasificar bibliotecas de ADN derivadas de genomas fúngicos. N uevamente, la presencia de intrónes en los genomas fúngicos hace difícil la expresión de las bibliotecas de ADN genómico en la mayor parte de los huéspedes 10 bacterianos normalmente disponibles. También ha habido un crecimiento en la prevalencia de infecciones bacterianas resistentes a antibióticos, creando una necesidad de clasificación de alto rendimiento para nuevos metabolitos fúngicos que tienen actividad antibiótica. 15 Los genomas eucarióticos de organismos superiores, también son demasiado complejos para la expresión comprensiva de bibliotecas de ADN en bacterias. Cuando todas las especies eucarióticas son consideradas, la bacteria representa únicamente aproximadamente el 0.3% de todas las especies conocidas (E.O. 20 Wilson , "El Estado Corriente de Diversidad Biológica", en Biodiversidad , National Academy Press, Washington DC , 1988, Capítulo 1 ); por lo tanto la fracción de la diversidad genética mundial accesible para sistemas de expresión bacteriana, es extremadamente limitada.

Mi <*H m*mim* *. t ?<?? i .*.-&!* •.,. ., -. ... .--- ----.. -«,-, . . .» .-. . t.J... , . -. »,.-- . -. :. ,-i-^.. - « « -,...^-». ---,» -.. . ,...-i ,. !, * .< - 9 *- Para evitar problemas con intrónes, es posible preparar una biblioteca de cADN y expresarla en bacterias. Sin embargo, este método depende de la presencia de transcripciones de ARN , y cualesquiera genes que no estén siendo transcritos activamente no 5 serán representados en la biblioteca. Muchas proteínas deseables se expresan únicamente bajo condiciones específicas (por ejemplo, factores de virulencia en hongo patogénicos) y estas condiciones pueden no existir en el momento en que se recolecta el mARN . Además, con el objeto de obtener suficiente ARN para preparar una 10 biblioteca de ADN, es necesario cultivar una buena cantidad del organismo. Para organismos en muestras ambientales que no crecen bien en el cultivo, o microorganismos novedosos para los cuales no son conocidas las condiciones de cultivo adecuadas, un suficiente ARN no se podrá obtener en forma fácil y confiable. En contraste, se 15 puede obtener suficiente ADN genómico a partir de números muy pequeños de células individuales mediante amplificación PCR, utilizando ya sea cebadores aleatorios o cebadores designados para favorecer ciertas clases de genes. Finalmente, los genes que son expresados altamente en un organismo, tenderán a ser 20 sobrerepresentados en el mARN , y por lo tanto sobrerepresentados en el gasto de genes mínimamente expresados en una biblioteca de cADN . Con el objeto de tener un alto nivel de cobertura de las especies mARN presentes, un número mucho mayor de clones debe de ser clasificado si una biblioteca de cADN se emplea en lugar de 25 una biblioteca genómica, ya que la última tendrá una representación l---Ll.Í.------t A-----*.--—.,--, , ,,. .. » ..-> ..... ---q.--?------ |f- ?l .k ¡ casi igual de la variedad de genes presentes. De manera clara, si es posible, es más deseable clasificar una biblioteca de ADN genómico. Asimismo, E. coli no tiene la capacidad de secreción de muchas proteínas , y por lo tanto no es deseable como u na célula huésped para propósitos de clasificación , en donde la clasificación depende de la secreción del producto del gen. Una desventaja adicional de E. coli, y de huéspedes bacterianos en general, es que los procariotos no pueden proporcionar muchas de las modificaciones post-traducción requeridas para la actividad en numerosas proteínas eucarióticas. Además de la glucocilación, la disociación de subu nidad , formación de enlace de disulfido y el pliegue adecuado de proteínas, son ejemplos del procesamiento post-traducción que a menudo se requiere para producir una proteína activa. Para asegurar tal procesamiento, algu nas veces se pueden utilizar células mamíferas, aunque las células mamíferas son difíciles de mantener, requieren medios costosos y generalmente no son transformadas con alta eficiencia. Dichos sistemas de transformación , por lo tanto no son convenientes para la clasificación de proteínas de alto rendimiento, no obstante que se han realizado esfuerzos para emplear células mamíferas como huéspedes para la clasificación de bibliotecas de cADN (Schouten y asociados WO 99/64582) . Se ha descrito un método para fusionar protoplastos transformados con células mam íferas antes de la clasificación de bibliotecas (Patente Norteamericana No. 5,989,814), aunque la * * "" • i -*"•-**--- . .. . . . . — >. ""i-A-fa- - >-!»,-.- - .fl . |Tt 1ffltI_J í|j_[|J_ expresión de la biblioteca de proteínas ocurre en bacterias o levaduras antes de la fusión celular. Han habido esfuerzos para modificar enzimáticamente los patrones de glucosilación después de la expresión en células huésped (Meynial Salles y Combes, R. Biotecnol . , 46: 1 -14(1 996)) , aunque tales métodos deben ser confeccionados para productos específicos y no son adecuados para la expresión de proteínas procedentes de u na biblioteca de ADN . Más recientemente, Maras y asociados, R. Eur. Bioqu ím . , 249:701 -707(1 997) y (ver también la Patente Norteamericana No. 5,834,251 ) ha descrito una cepa de Trichoderma reesei construido para expresar transferasa GIcNac humana I . La enzima transfiere N-acetilglucosamina a residuos de mannosa u otras proteínas exógenas expresadas, un primer paso hacia una aproximación más cercana a productos mamíferos naturales. El uso de levadura como células huésped , soluciona alg unos de los problemas anteriores, pero introduce otros. La levadura tiende a hiper-g lucosilar proteínas exógenas (Bretthauer y Castellino, 1999, Aplic. Biotecnol. Bioqu ím . 30: 1 93-200) , y los patrones de glucosilación alterada a menudo convierten las proteínas mamíferas expresadas altamente antigénicas (C . Ballou en Biología Molecular de los Sacccharomyces de levadura, J. Strathern y asociados, eds, Cold Spring Harbor Laboratory Press, NY, 1 982 , 335-360). No obstante que la levadura tiene la capacidad de copiar con un número ilimitado de intrónes, generalmente no tiene la capacidad de manejar genes complejos procedentes de especies superiores, tales como I--S .-. - .-.-----«i---*------. --. . i-.--,.-»- - „ „>- .. .... . ' -**-»*• ÉHÉB ^n^^--j^^ vertebrados. Aunque los genes procedentes de hongo filamentoso, normalmente son demasiado complejos para que la levadura los transcriba en forma eficiente, y este problema está compuesto por diferencias en expresión y división de secuencias entre levadura y hongo filamentoso (ver por ejemplo, M . I n nis y asociados, Ciencia 1985 228:21 -26) . A pesar de estos inconvenientes, los sistemas de transformación y expresión de levadura, han sido extensamente desarrollados, generalmente para el uso con bibliotecas de cADN. Se han desarrollado sistema de expresión de levadura los cuales son utilizados para clasificar proteínas naturalmente seg regadas y de membrana de origen mam ífero (Klein , y asociados, Proc. Nati. Acad . Sci. EUA. 1 996 93:71 08-71 1 3; Treco, Patente Norteamericana No. 5,783,385), y para proteínas fúngicas heterólogas (Dalboge y Heldt-Hansen , Mol. Gen . Genet. 243:253-260 (1 994)) y proteínas mam íferas (Tekamp-Olson y Meryweather, Patente Norteamericana No. 6,01 7,731 ) . El término "levadura" tal como se utiliza dentro del contexto de los sistemas de expresión de levadura, generalmente se refiere a organismos del orden de Saccharomycetales, tal como S . Cerevisiae y Pichia pastoris. Para los propósitos de esta descripción, los términos "hongo" y "fungicontl" se deben entender como que se refieren a Basidiomicetes, Zigomycentes, Oomycetes, y Chythriomycetes, y Ascomycetes de la clase de Euascomycetes, los cuales no son del orden de Saccaharomycetales. El hongo filamentoso puede ser distinguido de la levadura por medio de su Í«t-A 4,ü <? l nÉ.. .ií.r mu IIGIIIH I li i '?l? i un ni i , MaMM^^A--------á--to------M-^----Ml----l-^--i-.ito extensión hifal durante el crecimiento vegetativo, y catabolismo de carbono obligadamente aeróbico (el crecimiento vegetativo en levadura se logra a través de la gemación a partir de un tallo unicelular y, la levadura puede emplear catabolismo fermentativo). La división de intrón adecuada, y glucosilación, y pliegue y otras modificaciones post-traducción de los productos de gen fúngico, podrían ser manejados de manera más eficiente a través de una especie huésped fúngica, haciendo los huéspedes superiores, de hongo filamentoso para la clasificación de ADN genómico a partir de muestras de tierra . También los hace excelentes huéspedes para la producción de enzimas fúngicas de interés comercial, tal como proteasas, celulasas y amilasas. También se ha descubierto que los hongo filamentosos, tienen la capacidad de transcribir, traducir, procesar y segregar los productos de otros genes eucarióticos, incluyendo genes mam íferos. La última propiedad huéspedes atractivos de hongo filamentoso para la producción de proteínas de interés biomédico. Los patrones de glucosilación introducidos por hongo filamentoso, se parece más a aquellas proteínas mamíferas que los patrones introducidos por levadura. Por estas razones, se ha hecho un g ran esfuerzo en el desarrollo de sistemas huéspedes fúngicos para la expresión de proteínas heterólogas y se ha desarrollado un número de sistemas de expresión fúngica. Para las revisiones de trabajo en esta área , se debe ver Maras y asociados, R. Glucoconjugado. 16:99-107(1999); Peberdy, Acta Microbiol. Inmunol. Hung. 46: 165-174 (1999); Kruszewsa, Acta Bioquim, Pol. 46: 181 -1 95(1 999) ; Archer y asociados, Crit. Rev. Biotecnol. 17:273-306(1997); y Genes y asociados. Biotec. Rev. Ing. Genet. 9:327-367 (1 991 ) . La expresión de alto rendimiento y el ensayo de bibliotecas ADN derivadas de genomas fúngicos, también podrían utilizarse en funciones de asignación para los muchos genes de mamíferos que normalmente tienen u na función desconocida. Por ejemplo, una vez que una proteína fúngica que tiene una propiedad de actividad de interés es identificada, la secuencia del gen de codificación puede compararse con la secuencia de genoma humano para buscar genes homólogos. Yelton y asociados, Patente Norteamericana No. 4,81 6,405, describe la modificación Ascomycetes filamentoso para producir y segregar proteínas heterólogas. Buxton y asociados, en la Patente Norteamericana No. 4,885,249, y en la publicación de Buxton y Radfor, Genet, Gen . Mol 196:339-344 (1 984), se describe la transformación de Aspergillus niger mediante un vector de ADN que contiene un marcador seleccionable que tiene la capacidad de ser incorporado en las células huésped . McKnight y asociados, Patente Norteamericana No. 4,935,349 y Boel en la Patente Norteamericana No. 5,536,661 , describen métodos para expresar genes eucarióticos en Aspergillus, involucrando promotores que tienen la capacidad de dirigir la expresión de genes heterólogos en Aspergillus y otros hongos filamentosos. Royer y asociados, en la Patente Norteamericana No. 5,837,847 y Berka y asociados en la Patente WO •t*""-t'" "*,'ab"-' -M. - -.-, HU . Z ,* . 00/56900, describen sistemas de expresión para utilizarse en Fusarium venenatum empleando promotores spp Fusarium naturales y mutantes . Con neely y asociados, en la Patente Norteamericana No. 5,955,316, describe construcciones de plásmido adecuadas para la expresión y producción de lactoferrina en Aspergillus. Se ha expresado la oxidasa de glucosa Cladosporium en Aspergillus (Patente Norteamericana No. 5,879,921 ) . Se han utilizado técnicas similares en Neuróspora. Lambowitz, en la Patente Norteamericana No. 4,486,533, describe un vector de ADN de replica autónoma para hongo filamentoso y su uso para la introducción y expresión de genes heterólogos en Neuróspora. Stuart y asociados, describe la cotransformación de esferoplastos Neuróspora crassa con genes mam íferos y elementos reg uladores de transcripción endógena en la Patente Norteamericana No. 5,695,965 y u na cepa mejorada de Neuróspora que tiene niveles reducidos de proteasa extracelular en la Patente Norteamericana No. 5,776,730. Los vectores para transformación de Neuróspora se describen en la Patente Norteamericana No. 5,834, 1 91 . Takagi y asociados describe un sistema de transformación para Rhizopus en la Patente Norteamericana No. 5,436, 1 58. Sisniega-Barroso y asociados, describe un sistema de transformación para hongo filamentoso en la Patente WO 99/51 756, el cual emplea promotores de los genes de deihdrogenasa de glutamato a partir de Aspergillus awamori. Dantas-Barbosa y asociados, Letras de Microbiolog ía FEMS 1 988 169: 1 85-190, describe la transformación de Humicola grísea var. termoidea i.-- - -i-.-. -- ------ — - *- - -t i..4 resistencia de higromicina B utilizando ya sea el método de acetato de litio o electroporación. Entre los sistemas de expresión fúngica más exitosos están aquellos de Aspergillus y Trichoderma, por ejemplo como lo describe Berka y asociados en la Patente Norteamericana No. 5,578,463; también ver la publicación de Devchand y Gwynne, R. Biotecnol 17:3-9 (1991) y Gouka y asociados, Aplic. Microbiol. Biotecnol. 47:1-11 (1997). Los ejemplos de las cepas transformadas de Micelioftora termofila, Acremonium alabamense, Tielavia terrestris y Sporotrichum cellulophilum se presentan en la Patente WO 96/02563 y en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,602,004, 5,604,129 y 5,695,985, los cuales describen ciertos inconvenientes de los sistemas de Aspergillus y Trichoderma y sugieren que otros hongos pueden ser más adecuados para la producción de proteínas a gran escala. También se conocen en la técnica métodos para la transformación de fila diferente a Ascomicetes; ver por ejemplo, la publicación de Munoz-Rivas y asociados, Genet. Gen. Mol. 1986 205:103-106 (Schizophyllum commune); van de Rhee y asociados, Genet. Gen. Mol. 1996 250:252-258 (Agaricus bisporus); Arnau y asociados, Genet. Gen. Mol 1991 225: 193-198 (Mucor circinelloides); Liou y asociados, Bioquím. Biotecnol. Biocie 1992 56:1503-1504 (Rhizopus niveus); Judelson y asociados, Interacción Microbiana en Plantas Moleculares 1991 4:602-607 (Phytophthora i- a-mm éiá*t* *mt?**i*?m M > infestans); y de Groot y asociados, Biotecnología de la Naturaleza 1998 16:839-842 (Agraricus bisporus). Además de los métodos usuales para la transformación de hongo filamentoso, tales como por ejemplo, fusión de protoplasto, Chakraborty y Kapoor, I nv. Ácidos N ucleicos 18:6737 (1 990) describe la transformación de hongo filamentoso mediante electroporación. De Groot y asociados, en Biotecnolog ía de la Naturaleza 16: 839-842 (1 998) describe la transformación transmitida por Agrobacterium tumefaciens de varios hongos filamentosos. Se ha llevado a cabo la introducción biolística de ADN en hongos; ver por ejemplo, Christiansen y asociados, Genet. Corriente 29: 1 00-1 02 (1 995) Durand y asociados Genet. Corriente 31 : 1 58-161 (1 997) y Barcellos y asociados Can . R. Microbiol 44: 1 137-1 141 (1998). El uso de partículas magnéticas para la transfección "magneto-biolísticas" de células se describen en las Patentes Norteamericanas Nos. 5,516,670 y 5,753,477, y se espera que pueda ser aplicable a hongos filamentosos. Es evidente que se ha realizado m ucho trabajo para desarrollar sistemas de expresión utilizando hongos como huéspedes. Sin embargo, los huéspedes fúngicos com unes todos son hongos filamentosos, que tienden a formar esteras enredadas de micelia en cultivos no agitados, y cultivos de suspensión altamente viscosa (sumergidos) en bioreactores de tanque agitado. Estas propiedades del hongo filamentoso, también originan que algunos problemas en la producción industrial de enzimas en células huésped t - * • TtiWnif- fúngicas. Por ejemplo, la alta viscosidad y/o la formación local de agregados densos de micelio, conduce a dificultades en agitación, aireación y difusión de nutrientes. En general, los hongos filamentosos no son receptivos para micropipetización de cultivos de suspensión en placas de microtitulación , debido a la viscosidad de los cultivos. Además, debido a la micelia enredada, un cultivo de un hongos filamentoso típico que expresa una biblioteca de ADN no es fácilmente separado en clones separados en una gran escala, lo cual evita la evaluación de los genotipos individ uales, tal como podría ser requerido en un sistema de ensayo de alto rendimiento. El hongo filamentosos típico, en ausencia de agitación constante , tiende a crecer en la forma de esteras en la superficie de un medio de cultivo líquido, en donde producen esporas airéales. Generalmente no se esporulan cuando están en un cultivo sumergido. Ambas de estas propiedades presentan obstáculos substanciales para el cultivo de clones fúngicos filamentosos en placas de microtitulación, y para la manipulación eficiente y uso de tales cultivos para clasificación de alto rendimiento. Las esporas suspendidas u otros elementos reproductivamente competentes, podrían ser adecuados para la separación y distribución en depósitos de microtitulación individual, en donde la producción de esporas airéales conducirá a la contaminación cruzada de depósitos de microtitulación si no se dejan formar esteras en la superficie. No es factible la agitación del medio en depósitos de microtitulación , hasta el punto en que se necesita para evitar la formación de esteras. -¿- -t-i. --fe---- _ ^^^|^ '""**•• . - ..>. - -"'-"mmtriiiiiiii- ^ * ^ .«demás del problema de esporas airéales difíciles de controlar, las esteras de la superficie interfieren con la transmisión de luz, haciendo que muchos ensayos sean (en particular ensayos de absorbancia espectrofotométrica) difíciles o imposibles. Las esteras 5 en la superficie también interfieren con procesos, tales como oxigenación, adición de reactivos y nutrientes y pipetización. Se ha reconocido la influencia de la morfología fúngica en las propiedades físicas del cultivo, y se han identificado cepas que ocurren de manera natural que tienen morfología más favorable, tal 10 como lo describe por ejemplo Jensen y Boominathan en la Patente Norteamericana No. 5,695,985. La distribución homogénea de micelium suelto, con ramificación pronunciada, se describió como una morfolog ía particularmente deseable. Schuster y Roger en la Solicitud de Patente I nternacional WO 97/26330 y la Patente 15 Norteamericana No. 6, 1 84,026 sugieren un método similar para identificar células fú ngicas que tienen morfolog ía más adecuada para la producción industrial de proteínas heterólogas. El método comprende la clasificación de mutantes de una línea celular fúngica paterna, en lugar de cepas de tipo natural, para encontrar una 20 morfología alterada específica, transformando el mutante y evaluando si un cultivo de mutante transformado produce más proteína heteróloga que la línea celular paterna. Se reclaman de manera particular los mutantes con por lo menos más del 1 0% de ramificación hifal. El método se ilustra para cepas de Tricoderma , -'— ' •- ^^i*«^.««.^^.-> ~-«<.^ .. . .«. » *— üJM Fusarium y Aspergillus, y se sugiere que es aplicable para otros numerosos géneros. El efecto de la ramificación de frecuencia en la viscosidad del cultivo de mutantes Aspergillus oryzae, fue examinada por Bocking y asociados, Bioing , Biotecnol 65:638-648 (1 999) ; las cepas más altamente ramificadas exhibieron una viscosidad inferior en este estudio. Van Wezel y asociados en la Solicitud PCT WO 00/00613, describe métodos para reducir la ramificación y/o aumento de fragmentación de microorganismos filamentosos, por lo que se reduce la viscosidad del cultivo. El método comprende la transformación de microorganismos con el gen SsgA de Streptómices griseus. El método se demuestra en bacterias filamentosas del orden de Actinomicetales, pero se manifiesta que será aplicable a hongo filamentoso. Dunn-Coleman y asociados, en la Solicitud PCT WO 00/56893, describe un mutante HbrA2 A. nidulans, el cual exhibe un fenotipo hiperramificado cuando es desarrollado en temperaturas arriba de 42°C, y se observó una relación lineal entre el grado de ramificación hifal y la viscosidad del cultivo. La mayoría de los efectos anteriores en el campo de los sistemas de expresión fúngica filamentosa, se han dirigido a la identificación de cepas adecuadas para la prod ucción industrial de enzimas, y por lo tanto se ha enfocado la atención en la viscosidad del cu ltivo, estabilidad de transformación , producción de proteína heteróloga por volumen de unidad y producción con un porcentaje de la biomasa. Se han expresado bibliotecas de ADN en hongo; ver por tM* ¿ É * x . i^ lj ^M^^^ ejemplo la publicación de Gems y Clutterbuck, Genet. Corriente. 1993 24:520-524, en donde se expresó una biblioteca de Aspergillus nidulans en A. nidulans y en la publicación de Gems y asociados, Genet. Gen . Mol 1 994 242:467-471 , en donde una biblioteca genómica de Penicillium se expresó en Aspergillus. N inguno de estos reportes describió o sugirió la clasificación de proteínas expresadas; fue a través de la complementación de alelos mutantes en el huésped , que se demostró la expresión de genes procedentes de la biblioteca de ADN . El método de complementación requiere un huésped mutante específico por cada actividad de proteína exógena que se desee detectar, y no proporciona una herramienta para la clasificación de la biblioteca en general. La clonación de un gen de invertasa Aspergillus niger a través de la expresión en Trichoderma reesei , fue descrita por Berges y asociados, Genet. Corriente. 1 993 24:53-59. Utilizando una biblioteca genómica A, niger construida en un vector cósm ido que contiene un marcador seleccionable, y utilizándola como el T. reesei huésped (el cual no tiene la capacidad de utilizar sacarosas) , se clonó un gen de invertasa A. niger por medio de un procedimiento de selección sib. Aquí, nuevamente, se requirió de una característica muy específica del huésped para detectar la presencia de una sola proteína exógena expresada, y no se describió o fue posible la clasificación de la biblioteca genómica. Las características de una célula huésped fú ngica adecuadas para la expresión de una biblioteca de ADN , son diferentes en i.i i-t i ? ií-fa-á---!-. -« .* mftft».«, .».->. - ....-..- .—». .--a..-. .- -.,--- . J.i..lé»-.«-.- Md ttüJÉliÉi muchos aspectos a las características de los huéspedes adecuados para la fabricación de proteína industrial. En términos generales, un huésped fúngico adecuado para la clasificación de alto rendimiento, debe cumplir con numerosos criterios; entre ellos están los siguientes: - El huésped debe de ser transformado con alta eficiencia. - El huésped debe procesar genes que contienen intrón y llevar a cabo cualq uier división necesaria. El huésped debe procesar post-trad ucción la proteína expresada de modo que se produzca en una forma activa. Cuando la librería será ensayada para una proteína, el huésped debe producir la proteína en una producción lo suficientemente alta para la detección a través del ensayo. El huésped debe aceptar una variedad de elementos reguladores de expresión , para facilitar el uso y versatilidad . El h uésped debe permitir el uso de marcadores fácilmente seleccionables. Los cultivos de la célula huésped deben ser de baja viscosidad . - El huésped debe ser deficiente en proteasas y/o ser receptible para la supresión de expresión de proteasa. El huésped debe perm itir clasificaciones de u na amplia variedad de actividades o propiedades de proteína exógena. El hifae en un cultivo del hongo huésped , no debe ser tan enredado para evitar el aislamiento de clones simples, y no debe i ¡ t i ser tan enredado para que surja la viscosidad hasta el punto de evitar la transferencia y replica eficiente en un formato de clasificación de alto rendimiento miniaturizado (por ejemplo, mediante micropipetización). - El huésped no debe formar esteras en la superficie, aunque preferencialmente debe ser crecido en la forma de un cultivo sumergido. El huésped debe permitir la producción eficiente de esporas sumergidas u otros propágulos bajo las condiciones de crecimiento proporcionadas en la clasificación de alto rendimiento. En caso en donde los metabolitos están siendo clasificados, lo cual podría ser conveniente si las células h uésped segregaron los metabolitos en el medio, en donde podrían ser fácilmente detectadas y/o ensayadas. Idealmente, el huésped debe segregar únicamente la proteína exógena. En caso en donde una proteína está siendo ensayada, lo cual podría ser particularmente conveniente si el h uésped también expresó la suficiente proteína heteróloga para permitir el aislamiento y purificación de la proteína. Una célula huésped con esta característica, podría ser posible caracterizar en forma adicional, todas las proteínas heterólogas de interés, meramente mediante el cultivo de células huésped, sin manipulaciones biológicas moleculares tardadas necesarias para transferir el gen a otro organismo. Preferentemente, el huésped debe tener la capacidad de .^ ^ X Ái ? íél segregar la proteína, ya que esto debía permitir ensayos más confiables y más variados. También podría ser ventajoso si la célula huésped fuera receptiva para el aislamiento rápido del ADN heterólogo, para que se puedan llevar a cabo estudios y modificaciones' adicionales del propio gen . Además de estas cualidades del huésped , el sistema de transformación también debe exhibir ciertas características. La frecuencia de transformación debe ser lo suficientemente alta para generar los números de transformante requeridos para clasificaciones significativas. Idealmente la expresión de la proteína exógena será inducida por un solo inductor, por una sola trayectoria, que actúa en un solo promotor. Hasta la fecha, no se ha desarrollado una combinación de células huésped y sistema de transformación que cumpla con todos, o casi todos estos criterios. Por lo tanto, permanece la necesidad de una célula huésped fúngica y sistemas de transformación que tengan la capacidad de expresar en forma eficiente los productos del gen de una biblioteca de ADN , especialmente bibliotecas de ADN genómico y/o genómico eucariótico. Breve Descripción del Invento La presente invención emplea hongo filamentoso que produce "elementos reproductores transferibles", cuando son desarrollados en un cultivo sumergido. Por "elemento reproductor transferible", se entiende una espora, propágulo, fragmento hifal, protoplasto, . . 1 -..-. i ~.. i ..*... ..*..*, i 1 .. micropellet u otro elemento fúngico que es (1 ) fácilmente separados de otros elementos en el medio de cultivo, y (2) capaz de reproducirse en un cultivo monoclonal. El hongo también exhibe preferentemente un fenotipo filamentoso menos pronunciado y/o una morfología de crecimiento compacto, y produce cultivos de baja viscosidad que son adecuados para las manipulaciones físicas involucradas en la clasificación de bibliotecas ADN de alto rendimiento. Particularmente preferidos son los hongos filamentosos, los cuales, aún en la ausencia de agitación, tienden a crecer como cultivos sumergidos en lugar de cómo esteras de la superficie. La presente invención tiene la ventaja de las propiedades del sistema de transformación descrito en las Solicitudes de Patente Internacional PCT/N L99/0061 8 y PCT/EP99/20251 6. Estas solicitudes describen un sistema de transformación eficiente para huéspedes fúngicos filamentos, tales como Chrysosporium lucknowense y Aspergillus sojae. Estas aplicaciones también describen que las cepas mutantes son fácilmente preparadas, y conservan todas las ventajas de las células huésped tipo natural, aunque han perdido parcialmente su fenotipo filamentoso y por lo tanto proporcionan cultivos de baja viscosidad . El hongo preferido para utilizarse en la presente invención , expresa y segrega grandes cantidades de proteína exógena, produciendo una alta proporción de proteína/biomasa relativa a los huéspedes hongo filamentosos conocidos anteriormente. La presente invención, proporciona un sistema de transformación el que exhibe Slüaát -a=j-á--.-.- .~Ji?±*?k£mt. . -_.. .,-*, . .-;_. -A— &-- £ ií w. altas cantidades de transformadores. La presente invención también proporciona bibliotecas de hongo transformador que expresa en forma eficiente los productos de proteína de insertos de cADN heterólogo, y especialmente insertos de ADN genómico. En otro aspecto de la presente invención , las bibliotecas de hongo transformado pueden utilizarse en la clasificación de actividades o propiedades de las proteínas heterólogas, o en la clasificación de metabolitos prod ucidos mediante el hongo transformado con una consecuencia de actividades de proteína exógena, o en la clasificación del ADN heterólogo o de transcripciones de ARN derivadas del mismo. Se apreciará que la presente invención también hace posible la clasificación de alto rendimiento de metabolitos de cepas no transformadas que tienen las características fenotípicas descritas anteriormente. El término "hongos filamentosos mutantes" tal como se utiliza en la presente invención , se refiere simplemente a un hongo no encontrado en la naturaleza. Las "mutaciones" q ue conducen a características fenotípicas deseables, tales como una forma de crecimiento compacto, baja viscosidad , niveles de proteasa reducidos, crecimiento sumergido, etcétera , pueden ser introducidas en forma aleatoria a través de cualquier medio clásico, tal como radiación UV y mutagénesis química, o a través de métodos biológicos moleculares tales como mutagénesis de cinta o pueden ser introducidos deliberadamente a través de métodos de ingeniería genética. Si se encuentra que un hongo que ocurre de manera i.*-- natural posee las propiedades necesarias, por supuesto se podrá utilizar en los métodos de la presente invención . Aún en otro aspecto de la presente invención , las bibliotecas de hongo transformado pueden ser clasificadas según las propiedades útiles de los propios hongos, tales como, altos niveles de producción de una proteína metabolito expresado en particular. Este aspecto de la presente invención se ilustra a través de un ensayo cuantitativo para la proteína expresada de interés, en donde se podría detectar el transformante en forma particular que tiene la combinación de producción de proteína, procesamiento de proteína y secreción de proteína más favorable. En otro aspecto de la presente invención, las bibliotecas de hongos transformados pueden ser clasificadas seg ún la presencia de secuencias de ADN con la capacidad de hibridación a una muestra de ácido nucleico de interés. Breve Descripción de las Figuras La Figura 1 , es un manchado Western , tal como se describe en los ejemplos. La Figura 2, es un mapa pUT720. La Figura 3, es un mapa pUT970G. La Figura 4, es un mapa pUT1 064. La Figura 5, es un mapa pUT1 065. La Figura 6, es un mapa pF6g . La Figura 7, es un mapa pUT1 150. La Figura 8, es un mapa pUT1 1 52. 1 & A 1 ,»Mia---t-<M-----j. . - ,j fct -1 LA La Figura 9, es un mapa pUT1 1 55. La Figura 1 0, es un mapa pUT1 160. La Figura 1 1 , es un mapa pUT1 162. La Figura 1 2 , es la estructu ra esq uemática de la proteína 5 pc1 A. La Figura 1 3A , es una fotomicrografía de Aspergillus niger de tipo natu ral. La Figura 1 3B, es una fotomicrografía de u n mutante Aspergillus niger pc1 A. 10 La Figura 14A, es una fotomicrografía de un Aspergillus sojae tipo natural. La Figura 14B, es una fotomicrografía de un mutante Aspergíllus sojae pc1 A. Las Figuras 1 5A a 1 5E presentan resultados de secuenciación 15 del gen pirE . El subrayado indica la secuencia de am inoácidos; este no es continuo debido a algunas dudas en la secuencia. Los aminoácidos indicados son los más probables. El tipo en negritas indica intrónes putativos/probables. Descripción Detallada del Invento 20 En su aspecto más amplio, la presente invención está dirigida a hongos filamentoso transformados que generan elementos reproductivos transferibles en suspensión , para bibliotecas de tales hongos, y a métodos para clasificar tales bibliotecas según propiedades biológicas de interés, tales como la actividad bioqu ímica 25 o biológica asociadas con proteínas exógenas expresadas o ***"*•**- fc*. asociadas con metabolitos, por ejemplo; productos de molécula pequeña producidos mediante enzimas endógenas y/o exógenas. La biblioteca de los hongos filamentosos de baja viscosidad comprende hongos que contienen secuencias de ácido n ucleico, codificando cada secuencia de ácido nucleico una proteína heteróloga, siendo enlazada en forma operable cada una de las secuencias de ácido nucleico a una región de reg ulación de expresión y opcionalmente a una secuencia de codificación de señal de secreción y/o una secuencia de codificación de proteína portadora. Preferentemente, una cepa transformada de acuerdo con la presente invención , segregará la proteína heteróloga. Los métodos de expresión y clasificación de la presente invención, y el hongo empleado en los m ismos, son útiles para producir hongos, proteínas, metabolitos y moléculas de ADN que tienen utilidad en una variedad de aplicaciones. Los métodos de la presente invención también son útiles para producir información de ácido nucleico y secuencia de proteína, y esta información es considerada como u n producto valioso de los métodos reclamados. Los hongos filamentosos preferidos de la presente ¡nvención , están caracterizados por la baja viscosidad del medio de cultivo. Mientras que un hongo filamentoso de grado industrial típico producirá cultivos con viscosidades de 200 centipoises (cP). y normalmente alrededor de 1 000 cP, y pueden alcanzar 1 0,000 cP, los hongos de la presente invención exhiben una viscosidad de cultivo menor a 200 cP, preferentemente menor a 100 cP, más preferentemente menor a 60 cP, y lo más preferente menor a 1 0 cP, después de 48 horas o más de cultivo en la presencia de nutrientes adecuados bajo condiciones de crecim iento óptimas o casi óptimas. Los hongos filamentosos de la presente invención , normalmente exhiben una morfología caracterizada por h ifae o micropellets cortos o independientes y no enredados. Los micropellets son recolecciones ligeramente enredadas o no enredadas de hifae que surgen de un solo clon , distintos de los pellets que son mucho más grandes y se derivan de clones enredados múltiples. Por ejemplo, la cepa del Chrysosporium lucknowense UV1 8-25 mutante (viscosidad < 1 0 cP) y la cepa Trichoderma longibrachiatum X-252 mutante morfológicamente sim ilar (viscosidad < 60 cP) , están caracterizadas por la presencia de hifae corto, distinto, no enredado de entre 1 00 y 200 mieras de longitud , y el mutante construido con baja viscosidad Aspergillus sojae pc1 A está caracterizado por una forma compacta con ramificación considerable e hifae corto (ver figu ra 14) . Mientras que los hongos de baja viscosidad descritos en la Solicitud WO97/26330 se describen como teniendo "ramificación hifal más extensa", algunos hongos de la presente invención tienen ramificación hifal equivalente o incluso ligeramente reducida cuando se comparan con las cepas no mutantes. Parece que la longitud del hifal, juega el papel importante en el control de la viscosidad del cultivo. Las cepas fúngicas particularmente preferidas, están caracterizadas por tener una alta proporción de proteína segregada exógena/biomasa. Esta proporción es preferentemente mayor a 1 : 1 , más preferentemente mayor a 2: 1 , e incluso más preferentemente a 6: 1 o mayor. Más preferentemente, la proporción es de 8: 1 o mayor. Tales proporciones altas son convenientes en un ambiente de clasificación de alto rendimiento, debido a que dan como resultado una concentración más alta de proteína exógena, permitiendo ensayos de clasificación más sensibles y/o más rápidos. Esto es de particular beneficio, conforme d isminuye el volumen de la solución de ensayo, por ejemplo yendo de placas de 96 depósitos a placas de 384 depósitos y de ahí a placas de 1 536 depósitos. Los métodos de la presente invención , son adecuados para cualesquiera de estos formatos de placa de microtitulación , y para la mayor parte de los otros formatos HTS que emplean muestras líquidas. Se contempla que se pueden convertir cualesquiera a hongos filamentosos, a través de los procesos de mutación descritos en la presente invención , en cepas mutantes adecuadas para utilizarse en la misma. Entre los géneros preferidos de hongos filamentosos se encuentran los Chrysosporium, Thielavia, Neuróspora, Aureobadidium , Filibasidium , Piromyces, Cryplococcus, Acremonium , Tolypocladium , Scytalidium , Schizophyllum , Sporotrichum , Penicillium , Gibberella , Myceliophthora, Mucor, Aspergillus, Fusarium , Humicola y Trichodema, y amorfos y teleomorfos de los mismos. Los más preferidos son Chrysosporium, Trichoderma, Aspergillus, y Fusarium . El más preferido es Chrysosporium. El género y especie de los hongos, se puede definir a través de A í? -Li- - ,..¿ . í <~ . .^¿a------------i-? ^^^^ -- Í.J-- v morfología consistente con la descrita en Barnett y Hunter, Géneros Ilustrados de Hongos I mperfectos, 3a Edición , 1 972 , Burgess Publishing Company. Una fuente que proporciona detalles con respecto a la clasificación de hongos del género Chrysosporium, es Van Oorschot, C.A. N . (1980) "una revisión de Chrysosporium y géneros aliados" en Estudios de Micolog ía No. 20, Central Bu reau voor Schimmelcultures (CBS) , Baarn , The Netherlands, páginas 1 a 36. De acuerdo con estas enseñanzas, el género Chrysosporium cae dentro de la familia Moniliaceae que pertenece al orden de Hipomicetales. Otra fuente lista que proporciona información con respecto a la nomenclatura fúngica, son los depositantes del tratado de Budapest, especialmente aquellos que proporcionan bases de datos en línea (las sig uientes direcciones de internet emplean un protocolo http). El ATCC (EUA) proporciona información en www.atcc.org. la CBS (N E)en www.cbs. knaw. nl. y la VKM (RU) en www.bdt.org . br. bdt. msd n .vkm/general. Otra fuente es NT.ars- grin .gov/fungaldatabases. Todas estas instituciones pueden proporcionar enseñanzas con respecto a las características distintivas de las especies fúngicas. U na taxonom ía alterna de la Ascomycota , se puede encontrar en www. ncbi. nlm .nih .gov/htbin- post/Taxonomi/wgetorg?mode=Undef&id=4890. De acuerdo con esta taxonomía alterna, el género Chrysosporium pertenece a la familia de Onygenaceae, orden Onygenales, filum Ascomycota .

. ~Ob..^i-lt.^.g. t, J.j?A---t3A jfci .. i, ^ I , La definición Chrysosporium incluye, pero no se limita a estas transformaciones: C. botryoides, C. carmichaelii, C. crassitunicatum, C. europae, C. evolceannui, C. farinicola, C. fastidium, C. filiforme, C. georgiae, C. globiferum, C. globiferum var. articulatum, C. globiferum var. niveum, C. hurundo, C. hispanicum, C. holmiii, C. indicum, C. inops, C. keratinophilum, C. kreiselii, C. kuzurovlanum, C. lignorum, C. lobatum, C. lucknowense, C. lucknowense Garg 27K, C. Médium, C. Médium var. spissescens, C. mephiticum, C. merdarium, C. merdarium var. roseum, C. ninor, C. pannicola, C. parvum, C. parvum var. crescens, C. pilosum, C. pseudomerdarium, C. py rif ormis, C. queensalandicum, C. sigleri, C. sulfureum, AC. synchronum, C. tropicum, C. undulatum, C. vallenarense, C. vesperitilium, C. zonatum. C. luchnowense es una especie de Chrysosporium que es de particular interés, ya que tiene proporcionado un productor superior natural de proteínas de celulasa (Solicitudes I nternacionales WO 98/1 5633, PCT/N L99/0061 8 , y las Patentes Norteamericanas No. 5,81 1 ,381 y 6,01 5, 707). Las cepas con los números de acceso de deposito internacional ATCC 44006, CBS 251 .72, CBS 143.77, CBS 272.77, y VKM F-3500D son ejemplos de cepas Chrysosporium lucknowense. También incluidas dentro de la definición de Chrysosporium, se encuentran las deformaciones derivadas de predecesores de Chrysosporium que incluyen aquellas que han mutado ya sea naturalmente o mediante mutagénesis inducida. Los métodos de la presente invención, en una modalidad , emplean mutantes de Chrysosporium, obtenidos a través de una combinación de radiación y mutagénesis inducida en forma química, que tienden a producir elementos reproductivos transferibles en suspensión, y que exhiben una morfología caracterizada por hifae corto, independiente, no enredado ("crecimiento compacto"), y un fenotipo caracterizado por crecimiento sumergido y viscosidad reducida del medio de fermentación cuando se cultiva en suspensión. En otra modalidad, la presente invención emplea mutantes fenotípicamente similares de Trichoderma. Aún en otras modalidades, la presente invención emplea mutantes genotípicamente similares de Aspergillius sojae o Aspergillius niger. Por ejemplo, VKM F-3500D (cepa "C1") fue mutagenizada sometiéndola a luz ultravioleta para generar la cepa UV13-6. Esta cepa fue adicionalmente en forma subsecuente con N-metil-N'-nítro-N-nitrosoguanidina para generar la cepa NG7C-19. La última cepa a su vez, fue sometida a mutación mediante luz ultravioleta dando como resultado una cepa UV18-25 (VKM F-3631D). Durante este proceso de mutación, las características morfológicas variaron un poco en el cultivo en líquido o en placas, así como bajo el microscopio. Con cada mutagénesis sucesiva, los cultivos mostraron menos de la apariencia esponjosa y afelpada en placas, que la que se describe como característica de Chrysosporium, hasta que las colonias lograron una apariencia plana y estereada. Se observo que un pigmento café con la cepa tipo natural en algunos medios, fue menos prevalente en cepas mutantes. En cultivo líquido el mutante «-AH ... ». j. ?*M..i . -^»«»- ..«--.- íi, » -. , . . . -- --, . ..--.,it---.-¿ - --«--..^.? „--.--. -. ... •.?.A.j i.

UV1 8-25 fue notablemente menos viscoso q ue la cepa tipo natural C 1 y los mutantes UV1 3-6 y NG7C-1 9. Aunque todas las cepas mantuvieron las características microscópicas generales de Chrysosporium, la micelia se volvió más angosta con cada mutación sucesiva y se podría observar con la fragmentación distinta de un UV1 8-25 o de la micelia. Esta fragmentación de micelia probablemente es una causa de la viscosidad inferior asociada con los cultivos de UV1 8-25. La capacidad de las cepas para esporulación aireal d isminuyó con cada paso mutagénico. Estos resu ltados dem uestran que una cepa puede pertenecer genéticamente al género Chrysosporium, mientras que exhibe desviaciones de las definiciones taxonómicas (morfológicas) tradicionales. En particular, la forma amorfa de Chrysosporium se ha encontrado adecuada para la aplicación de clasificación de acuerdo con la presente ¡nvención . El metabolismo del anamorfo, lo vuelve particularmente adecuado para un alto grado de expresión . Un telemorfo también debe ser adecuado, ya que la cubierta genética de los anamorfos y telemorfos es idéntica. La d iferencia entre amorfo y telemorfo es que uno es el estado asexual y el otro es el estado sexual; los dos estados exhiben diferente morfolog ía bajo ciertas condiciones. Otro ejemplo representa cepas mutantes construidas en forma genética de Aspergillus sojae. En uno de estos mutantes, se interrumpió un gen de codificación de endoproteasa específico. Esto * A-dL i AL XA dio como resultado un fenotipo de crecimiento compacto que exhibe ramificación fragmentada e hifae corto, y la formación de micropellets en cultivos sumergidos. Además el Aspergillus sojae referido en esta solicitud puede ser inducido para exhibir una esporulación eficiente bajo condiciones de cultivación sumergida específicas, que lo vuelve especialmente adecuado para utilizarse en un sistema de clasificación de alto rendimiento. En este caso, las condiciones que condujeron a la formación de los elementos reproductores transferibles, simplemente consistieron de un medio sintético que contiene 0.6g/ml de EDTA. Las condiciones de conducción variarán de un huésped a otro, auque es evidente que las condiciones ya serán conocidas si un huésped se ha encontrado como adecuado. Es preferible utilizar cepas fúngicas no-toxigénicas y no-patogénicas, de las que se conoce una cantidad en la técnica, ya que esto reducirá los riesgos para el terapeuta y simplificará el proceso de clasificación en general. En una modalidad preferida, el hongo también tendrá deficiencia de proteasa para minimizar la degradación de las proteínas exógenas, y/o la recepción para la supresión de producción de proteasa. El uso de cepas con deficiencia de proteasa como los huéspedes de expresión , es bien conocido; ver por ejemplo la Solicitud PCT WO 96/29391 . Las cepas con deficiencia de proteasa pueden ser producidas clasificando mutantes, o el gen de proteasa puede ser "eliminado" o desactivado de otra manera a través de métodos conocidos en el arte, tal como lo ¿ n fc- , describe por ejemplo Christensen y Hynes en la Patente Norteamericana No. 6,025, 1 85 (Aspergillus oryzae con gen areA no funcional) . Se ha descubierto que los mutantes Chrysosporium pueden ser elaborados para tener expresión reducida de proteasa, haciéndolos de este modo aún más adecuados para la producción de productos proteinaceos, especialmente si el producto proteinaceo es sensible a la actividad de proteasa. Por lo tanto, la presente invención , también puede emplear una cepa de Chrysosporium mutante que produce menos proteasa que la cepa Chrysosporium no mutante, por ejemplo menos que la cepa C. luknowense C 1 (VKM F-3500 D). En particular, la actividad de proteasa, (diferente a cualquier proteasa selectiva proyectada para disociar una proteína de fusión segregada) de tales cepas, es menor a la mitad de la cantidad, más preferentemente menor al 30% de la cantidad, y lo más preferentemente menor a aproximadamente el 1 0% de la cantidad producida por las cepas C 1 . La actividad de proteasa disminuida puede ser medida a través de métodos conocidos, tales como m idiendo el halo formado en las placas sin leche o a través de la degradación de albúmina o suero bovino (BSA). Puede ser deseable desactivar otros genes en los hongos filamentosos huéspedes tales como por ejemplo, aquellos que codifican celulasas y otras proteínas potencialmente segregadas con el objeto de minimizar la interferencia en el ensayo a través de las proteínas huéspedes. Los genes que codifican las proteínas li-t-l-É -i l. ? --------i - --- -i *z. -**> -- segregadas pueden ser eliminados o mutados, o los genes que controlan alternativamente el sistema de ind ucción u otras trayectorias involucradas en la expresión de las proteínas no deseadas, pueden ser modificados de tal forma que se reduzca la 5 expresión . Cuando se emplea un promotor endógeno en los vectores de la presente invención (ver más adelante), puede ser especialmente deseable desactivar los genes para otras proteínas bajo el control del mismo inductor. Los hongos receptores para la secreción de prod ucción de proteasa son aquellos en donde la 10 expresión de proteasa está bajo el control de un elemento regulador que responde a condiciones ambientales, de modo que estas condiciones (por ejemplo, concentración de aminoácidos) pueden ser manipuladas para minimizar la producción de proteasa. Preferentemente, se emplea una región de regulación de 15 expresión homologa que permite una alta expresión en el huésped seleccionado, en el vector de transformación . Las regiones de alta regulación de expresión derivados de un huésped heterólogo tal como procedente de Trichoderma o Aspergillus, son bien conocidos en la técnica y también se pueden utilizar. A manera de ejemplo, y 20 sin limitación , los ejemplos de proteínas conocidas por ser expresadas en g randes cantidades, y que por lo tanto proporcionan secuencias de regulación de expresión adecuadas para utilizarse en la presente invención , son hidrofobina, proteasa, amilasa, silanasa, pectinasa, esterasa, beta-galactosinasa, celulasa (por ejemplo, endo- 25 glucanasa, celobiohidrolasa) y poligalacturonasa. ?*ßmm? *liat4tllÍt*f& - -l -i-i-i.-- --- ---. .. ***•***.. -. .- . ._---,-- _-.--- --„ -^. , .^.^ - - ----.---n. ----h. __,-------- '¡ß. j^-^ . J-t- i- A í Una región de regulación de expresión comprende una secuencia promotora enlazada en forma operable a una secuencia de ácido nucleico que decodifica la proteína que será expresada. El promotor es enlazado de tal manera que el posicionamiento vis-á-vis del codón e iniciación de la secuencia que será expresado, permite la expresión . La secuencia promotora puede ser constitutiva aunque preferentemente es inducible. El uso de un promotor inducible y medios de inducción adecuados favorece la expresión de genes enlazados en forma operable al promotor. Se considera cualquier secuencia de regu lación de expresión procedente de una especie homologa, o precedente de una cepa heteróloga con la capacidad de permitir la expresión de una proteína. La secuencia de regulación de expresión es en forma adecuada una región de expresión reg ularizada fú ng ica, por ejemplo, una reg ión de regulación ascomycete. En forma adecuada, la región de reg ulación de expresión ascomycete es una región de reg ulación prodecente de cualesquiera de los siguientes géneros: Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, H umicola, Neuróspora, Tolypocladium , Fusarium , Penicillium , Talaromayces, o formas sexuales alternativas de los mismos, tales como Emericela e Hypocrea. El promotor de celobiohidrolasa procedente de Trichoderma; dehidrogenasa de alcohol A, dehidrogenasa de alcohol R, dehigrogenasa de glutamato, amilasa TAKA, glucoamilasa y promotores de dehidrogenasa de fosfato de gliceraldeh ído procedentes de Asperg illus; fosfoglicerato y promotores de control de vía cruzada de Neuróspora; promotor de A .: lipasa y proteinasa aspártica de Rhizomucor miehei; promotor de beta-galactosidasa de Penicillium canescen , y celobiohidrolasa, endoglucanasa, silanasa, gliceraldehidrogenasa-3-posfato dehidrogenasa A, y promotores de proteasa procedente de Chrysosporium, son ejemplos representativos. Es preferible una secuencia de regulación de expresión procedente del mismo género en la forma de la cepa huésped , ya q ue es más probable que sea específicamente adaptada al huésped . Las secuencias de expresión reguladas naturales procedentes de las cepas de Chrysosporium que expresan proteínas en cantidades extremadamente grandes, son particularmente preferidas. Los ejemplos de tales cepas han sido depositados de acuerdo con el Tratado de Budapest con el Instituto de Depósito de Toda la Recolección Rusa (VKM) en Moscú. La cepa C1 tipo natural tiene el mismo número VKM F-3500 D, y la fecha de depósito fue 29-08-1 996, el mutante C 1 UV1 3-6 fue depositado con el número VKM F-3632 D, y la fecha de depósito fue 02-09-1 998, el m utante C 1 NG7C-1 9 fue depositado con el número VKM F-3633 D, y la fecha de depósito fue 02-09-1 998 , y el m utante C 1 UV18-25 fue depositado con el número VKM F-3631 D y la fecha de depósito fue 02-09-1 998. Estas cepas también son preferidas como fuentes de la generación de mutantes de baja viscosidad ; de hecho, la cepa VKM F-3631 D ya exhibe el fenotipo de baja viscosidad necesario. U na cepa Trichoderma mutante de baja viscosidad , designada X-252, se obtuvo después de dos vueltas de radiación de Trichoderma longibranchiatum 1 8.2KK t . que a su vez fue derivada mediante mutación de la cepa QM 9414 de T. longibrachiatum (ATCC 26921 ). En otras modalidades la presente invención emplea mutantes fenotípicamente similares de Aspergillius sojae y Aspergillius niger. Preferentemente, cuando el huésped es Chrysosporium, se emplea una secuencia promotora de Chrysosporium para asegurar un buen reconocimiento de la misma por parte del huésped . Ciertas secuencias de regulación de expresión heterólogas también trabajan tan eficientemente en Chrysosporium como en secuencias Chrysosporium nativas. Esto permite construcciones bien conocidas y vectores que serán utilizados en la transformación de Chrysosporium, y ofrece otras numerosas posibilidades para construir vectores que permiten buenos rangos de transformación y expresión en este huésped . Por ejemplo, se pueden utilizar técnicas estándar de transformación de Aspergillus, tal como lo describe por ejemplo Christiansen y asociados en Bio/Tecnolog ía 1 988 6: 1419-1422. Otros documentos proporcionan detalles con respecto a los vectores de transformación del Aspergillius, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas No. 4,81 6,405, 5, 1 98,345, 5,503,991 , 5,364,770, 5,705,358, 5,728,547, y 5,578,463, EP-B-21 5.594 (también para Trichoderma) , y sus contenidos están incorporados a la presente invención como referencia . Ya que se ha observado rangos de expresión extremadamente altos de celulasa en cepas de Chrysosporium, las regiones de regularización de expresión de los genes de celulasa son particularmente preferidas.

Los vectores de la presente invención , pueden comprender una secuencia promotora derivada de un gen que codifica una enzima preferentemente una enzima segregada. Los ejemplos de enzimas adecuadas de las cuales se pueden tomar las secuencias promotoras, son enzimas de degradación de carbohidratos (por ejemplo, celulasas, silanasas, mananasas, manosidasas, pectinasas, amilasas, por ejemplo, glucoamilasas, a-amilasas y, a- y ß- galactosidasas, a- y ß-glucosidasas, ß-glucanasas, quitinisas, quitanasas) , proteasas (endoproteasas, amino-proteasas, amino y carboxipeptidasas) , otras hidrolasas (lipasas, esterasas, fitasas) , oxidoreductasas (catalasas, glucosa-oxidasas) , y transferasas (transglucosilasas, transglutaminasas, isomerasas e invertasas). En la Tabla A se presentan Varios ejemplos de Chrysosporium luknowense. Una construcción de ácido nucleico preferentemente comprenderá una región de regulación de expresión de ácido nucleico procedente de Chrysosporium, más preferentemente de Chrysosporium luknowense o un derivado de los mismos, enlazado en forma operable a una secuencia de ácido n ucleico que codifica una proteína que será expresada. Las construcciones de ácido nucleico particularmente preferidas, comprenderán una región de reg ulación de expresión procedente de Chrysosporium asociada con la expresión de celulasa o silanasa, preferentemente expresión celobiohidrolasa, más preferentemente expresión de la celobiohidrolasas 55kDa (CBH 1 ) descritas en la Tabla A. Como ejemplos adicionales, las secuencias promotoras de Chrysosporium de hidrofobina, proteasa, amilasa, silanasa, esterasa, pectinasa, beta-galactosidasa , celulasa (por ejemplo, endoglucanasa, celobiohidrolasa) y poligalcturonasa también están consideradas para caer dentro del alcance de la presente invención. Tabla A: Características de enzimas seleccionadas procedentes de Chrysosporium lucknowense Notas: *pesos moleculares mediante MALDI ; todos los otros mediante SDS PAG E Silo = silanasa endo = endoglucanasa gal = galactosidasa gluc = glucosidasa ~3k . ? % CBN = celbiohidrolasa PGU = poligalacturonasa Por ejemplo, se pueden emplear de manera adecuada cualesquiera de los promotores o reg iones de regulación de expresión de las enzimas descritas en la Tabla A. Las secuencias de ácido nucleico de estos promotores y regiones de regulación pueden ser fácilmente obtenidas a partir de una cepa de Chrysosporium. Los métodos a través de los cuales se pueden determinar las secuencias promotoras son n úmeros y bien conocidos en la técnica. Las secuencias promotoras, generalmente se encuentran inmediatamente antes del codón de inicio ATG al comienzo del gen relevante. Por ejemplo, las secuencias promotoras pueden ser identificadas eliminando la corriente ascendente de las secuencias del gen relevante, utilizando técnicas de ADN recombinante, y examinando los efectos de estas eliminaciones en la expresión del gen . Asimismo, por ejemplo, a menudo las secuencias promotoras pueden ser deducidas comparando la secuencia de la corriente ascendente de las regiones del gen relevante con secuencias promotoras de consenso. Por ejemplo, las secuencias promotoras de endoglucanasas C 1 fueron identificadas de esta manera (ver PCT/N L99/0061 8) clonando los genes correspondientes. Los promotores preferidos de acuerdo con la presente invención son celobiohídrolasa 55k Da (CBH 1 ) , dehidrogenasa gliceraldeh ído-3-fosfato A, y los promotores de silanasa (Xyl F) 30 kDa procedentes de la Chrysosporium, ya que 1 -J AA .1 A. .. i..? -. -i... .- A-triB-. -g j' ,f^ía.-¡---- -I-,^---l------ - --. -. .«J-l . i í-. estas enzimas se expresan en un alto nivel a través de sus propios promotores. Los promotores de las enzimas de degradación de carbohidratos de Chrysosporium luknowense en particular, especialmente C. luknowense GARG 27K, pueden utilizarse de manera conveniente para expresar bibliotecas de proteínas en otros organismos huéspedes fúngicos. Las modalidades particulares de las secuencias de ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención , son conocidas para Chrysosporium, Aspergillus y Trichoderma. Los promotores de Chrysosporium se describen en PCT/N L99/0061 8. La técnica anterior proporciona un número de regiones de regulación de expresión para utilizarse en Aspergillus, por ejemplo, las Patentes Norteamericanas Nos. 4,935,349; 5, 198,345; 5,252,726; 5,705,358; y 5,965, 384; y la Solicitud PCT WO 93/07277. La expresión en Trichoderma se describe en la Patente Norteamericana No. 6,022,725. Los contenidos de estas patentes están incorporadas en su totalidad a la presente invención como referencia. El gen hidrofobina es un gen fúngico que es altamente expresado. Por lo tanto se sugiere que la secuencia promotora de un gen de hidrofobina , preferentemente procedente de Chrysosporium, puede ser aplicada en forma adecuada como una secuencia de regulación de expresión en una modalidad adecuada de la presente invención . Las secuencias del gen Trichoderma reesei y Trichoderma harzianum para hid rofobina, se han descrito por ejemplo en la técnica anterior, así como una secuencia de gen para Aspergillus fumigatus y Aspergillus nidulans y, la información relevante a las secuencias está incorporada a la presente invención como referencia (Nakari-Setala y asociados, Eur. R. Bioqu ím . 1 996, 235:248-255; Parta y asociados, I nfect. I nmunol. 1 994 62:4389-4392 Muñoz y asociados, Genet Corriente. 1 997, 32:225-230; y Stringer y asociados Microbiolog ía Molecular. 1 995 16:33-44) . Utilizando esta información de la secuencia, u n experto en la materia puede obtener secuencias de regulación de expresión de genes de hidrofobina Chrysosporium sin la experimentación indebida, siguiendo técnicas estándar tales como las sugeridas anteriormente. U na cepa de Chrysosporium recombinante de acuerdo con la presente invención , puede comprender una región de regulación de hidrofobina enlazada en forma operable a la secuencia que codifica la proteína heteróloga. Una secuencia de regulación de expresión también puede contener en forma adicional u n aumentador o u n silenciador. Estas también son conocidas en la técnica anterior, y normalmente están localizadas a alguna distancia lejos del promotor. Las secuencias de reg ulación de expresión también pueden comprender promotores con sitios de enlace activadores y sitios de enlace represores. En algunos casos, tales sitios también pueden ser modificados para eliminar este tipo de regulación . Por ejemplo, se han descrito promotores fúngicos filamentosos en los cuales están presentes sitios creA. Los sitios creA pueden ser montados para asegurar que se elimina la represión de glucosa que normalmente resulta de la presencia de creA. El uso de tal promotor hace posible la producción .. . . Í i de una biblioteca de proteínas codificada por las secuencias de ácido nucleico reguladas por el promotor en la presencia de glucosa. El método se ejemplifica en la solicitud WO 94/1 3820 y WO 97/09438. Estos promotores pueden ser utilizados ya sea con o sin sus sitios creA. Los mutantes en los cuales se han mutado los sitios creA pueden ser utilizados como secuencias de regulación de expresión en una cepa recombinante de acuerdo con la presente invención y la biblioteca de secuencias de ácido nucleico que regula, posteriormente puede ser expresada en la presencia de glucosa. Tales promotores Chrysosporium asegura la desrepresión en una forma análoga a la que se ilustra WO 97/09438. La identidad de los sitios creA es conocida por la técnica anterior. De manera alternativa, es posible aplicar un promotor con sitios de enlace creA que no han sido mutados en una cepa huésped con una mutación en cualquier lugar en el sistema de represión , por ejemplo, en el propio gen creA, de modo que la cepa puede, no obstante la presencia de sitios de enlace creA, producir la biblioteca de proteínas en la presencia de glucosa. Las secuencias terminadoras, también son secuencias de regulación de expresión y estas están enlazadas en forma operable al termino 3 ' de las secuencias que serán expresadas. Probablemente, u na variedad de los terminadores fúngicos conocidos sean funcionales en las cepas huéspedes de la presente invención . Los ejemplos son el terminador A. Nidulans trpC, teminador alfa-glucosidasa A. niger, termínador de glucomylasa A. niger, terminador .¿ -fes- l -I- L de proteasa carboxilo Mucor miehei (ver EUA 5,578,463) , y el terminador de cellobiohydrolasa Trichoderma reesei. Las secuencias teminadoras Chrysosporium, por ejemplo, el term inador EG6 funcionarán bien en Chrysosporium. Un vector de transformación adecuado para utilizarse de acuerdo a la presente invención , puede tener opcionalmente las secuencias de ácido nucleico exógeno que serán expresadas enlazadas en forma operable a una secuencia que codifica una secuencia de señal. La secuencia de señal es una secuencia de aminoácidos la cual, cuando está enlazada en forma operable a la secuencia de aminoácidos de una proteína expresada , permite la secreción de la proteína a partir del organismo huésped. Tal secuencia de señal puede ser asociada con una proteína heteróloga o puede ser un nativo para el huésped . La secuencia de ácido nucleico que codifica la secuencia de señal, debe estar colocada en la estructura para permitir la traducción de la secuencia de señal y las proteínas heterólogas. Las secuencias de señal serán particularmente preferidas cuando la presente invención se utilice junto con evolución molecular dirigida , y esté involucrada una proteína exógena seg regada simple. Quedará entendido, que es menos conveniente incorporar una secuencia de señal en un vector que será utilizado para expresar una biblioteca, ya que esto disminuirá la probabilidad de expresar la proteína de interés . En una biblioteca genómica preparada mediante corte aleatorio de ADN y clonación en un vector, la probabilidad de t¿l .£ ---*. *L Á. j a -i--i --i B-1-.Í--L--. aM?'a ^t- mu.ii. - t --.. 1» _ i- - i l .i que se pueda obtener una fusión en estructura de una gen en la biblioteca para la secuencia de señal es baja. Asimismo, incluso cuando una fusión en estructura ha sido obtenida, la secuencia de señal elegida puede no trabajar con todos los genes. Por estas razones, puede ser preferible no emplear una señal de secuencia cuando se clasifica una biblioteca de ADN genómico, sino más bien clasificar según la actividad o presencia de proteína exógena intracelular. El análisis de la actividad o presencia de proteínas intracelulares se puede lograr tratando previamente la biblioteca transformadora con enzimas que convierten las células fúngicas a protoplastos, seguido por lisis. El procedimiento ha sido descrito por van Zeyl y asociados, J . Biotechnol. 59.221 -224 (1 997) . Este procedimiento ha sido aplicado a Chrysosporium para permitir la colonia PCR procedente de transformadores Chrysosporium desarrollados en placas de microtitulación . Se considera cualquier secuencia de señal con la capacidad de permitir la secreción de una proteína a partir de una cepa de Chrysosporium. Tal secuencia de señal es preferentemente una secuencia de señal fú ngíca, más preferentemente una secuencia de señal Ascomycete. Las secuencias de señal adecuadas pueden ser derivadas de eucariotos generalmente, preferentemente de levaduras o de cualesquiera de los géneros de hongos que se encuentran a continuación : Aspergillius, Trichoderma, Chrysosporium, Pichia, Neuróspora, Rhizomucor, Hansenula, Humicola, Mucor, Tolypocladium, Fusarium, Penicillium, Saccharomyces, Talaromyces - i.--,,-., «. - -i i--. - --. _. o formas sexuales alternativas de los mismos, tales como Emericella y Hipocrea. Las secuencias de señal que son particularmente útiles como aquellas asociadas en forma nativa con cellobiohidralasa, enduglucanasa, betagalactosidasa, xilanasa, pectinasa, esterase, hidrofobina, proteasa o amilasa. Los ejemplos incluyen amilasa o glucoamilasa de Aspergillus o Humicola, Amilasa TAKA de Aspergillus aryzaa, @ amilasa de Aspergilus niger, carobxil peptidasa de Mucor (EUA 5,578,463) una lipasa o proteínasa de Rhizomucor miehei, cellobiohidrilasa de Trichoderma , beta-galactosidasa de Penicillium caescens CBH de Chrysosporium, y el factor de Saccaromyces de correspondencia alfa. De manera alternativa, la secuencia de señal puede ser a partir de un gen de amilasa o subtilisina de una cepa de Bacillus. Una secuencia de señal procedente del mismo genero que la cepa huésped , es extremadamente adecuada ya que lo más probable es que sea adaptada específicamente al huésped especifico; por lo tanto cuando el Chrysosporium luckonowense es el h uésped , la secuencia de señal preferentemente es una secuencia de señal de Chrysosporium. Las cepas Chrysosporium C 1 , UV1 3-6, NG7C-19 y UV1 8-25 segregan proteínas en cantidades extremadamente grandes y las secuencias de señal de estas cepas son de particular interés. Las secuencias de señal procedentes de hongos filamentosos y levadura pueden ser útiles, así como las secuencias de señal de origen no fú ng ico.

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Un hongo huésped recomienda de acuerdo con cualesquiera de las modalidades de la presente invención , puede contener además un marcador seleccionable. Tal marcador seleccionable puede contener la selección de células transformadas o transfectadas. Un marcador seleccionable con frecuencia codifica un producto de gen proporcionando un tipo especifico de resistencia externa a la cepa no transformada . Esta puede ser resistencia a metales pesados, antibióticos o biócidos en general. La Prototrofía también es un marcador seleccionable de la variedad no antibiótica. Los marcadores Auxotróficos generan deficiencias nutricionales en las células huésped, y los genes que corrigen estas deficiencias se pueden utilizar para selección . Los ejemplos de marcadores de selección de resistencia y auxotróficos comúnmente utilizados son amdS (acetamidasa) , hph (fosforotransferasa de higromisina) , pyrG (decarboxilasa de orotidina-5 '-fosfato) y pyrE (transferasa de P-ribosilo orotato) trpC (sintasa de antranilato), argB (carbamoiltransferasa de ornitina), sC (adeniltransferasa de sulfato) , bar (acetiltransferasa de fosfinotricina), n iaD (red uctasa de nitrato), sh-ble (resistencia de bleomicina-fleomicina), sintasa de acetolactato mutante (resistencia de sulfonilurea) y fosfotransferasa de neomicina (resistencia de aminoglicósido) . Un marcador de selección preferido en Chrysosporium es transferasa de P-ribosilo de orotato. La selección se puede llevar a cabo mediante cotransformación donde el marcador de selección es un vector por separado o en donde el marcador de selección está en el m ismo fragmento de ácido nucleico I? J.*? A, ,..t * t . t d . -- &--I--.. ... j-ft. ..^-_ .t, .- --t-t- --. .----. t.JMmih ,.!! , i *-*& ii .l l 1 que la secuencia de codificación de proteína para la proteína heteróloga. Una mejora adicional de la frecuencia de transformación , se puede obtener mediante el uso de la secuencia de replica AMA 1 , la cual es útil por ejemplo en Aspergillus niger (Verdoes y asociados, Gene 146: 1 59-1 65 (1 994)) . Esta secuencia da como resultado un incremento de 10 a 100 pliegues en la frecuencia de transformación en un número de diferentes hongos filamentosos. Además, el ADN introducido es retenido en forma autónoma en las celular fúngicas, en un modo de copia múltiple, sin la integración en el genoma fúngico. Se espera que esto sea benéfico para el método de clasificación de alto rendimiento de la presente invención , ya que el estado no integ rativo reduce variaciones en el nivel de la expresión del gen entre los transformadores diferentes. Además, ya que el ADN introducido no es recombinado en el ADN huésped , no ocurrirán mutaciones indeseadas en el genoma huésped . Niveles uniformes de expresión de gen exógeno, se pueden obtener a través del uso vectores de replica autónoma tales como AMA1 , o alternativamente, se puede promover la replica autónoma en hongos mediante secuencia telomérica (ver por ejemplo A. Aleksenko y L. Ivanova, Genet. Gen , Mol. 1 998 260: 1 59-164) . Tal como se utiliza en la presente invención , el término "proteína heteróloga" es una proteína o polipéptido que normalmente no es expresado o segregado por la cepa huésped utilizada para la expresión de acuerdo con la presente invención . U na proteína heteróloga puede ser de origen procaiótico, o puede ser derivada de un hongo, planta, insecto, o animal superior tal como un mamífero. Para propósitos de clasificación farmacéutica, m uy a menudo existe la preferencia de proteínas humanas, por lo que una modalidad preferida será un huésped en donde la biblioteca de ADN sea de origen humano. Tales modalidades son por la tanto consideradas como ejemplos adecuados de la presente invención. Se espera que la expresión de una biblioteca de genes humanos, derivados de una biblioteca de ADN humana genóm ica, en el fungi fliamentoso de la presente invención sea eficiente por varias razones. Se sabe que el tamaño promedio de los genes humanos es de 3,000 a 5,000 bp, y que el promedio de intrones humano es de aproximadamente 75 hasta aproximadamente 1 50 bp (rango total 40->50,000) . Los hongos filamentosos tienen intrones de 40-75 bp, aunque pueden tratar con itrones de hasta 500 bp de longitud . En promedio, los genes humanos transportan de 3-5 intrones por gen (M . Deutsch , M . Long , inv. de ácidos nucleicos 1 999 27:321 9-3228; tabla B). Las secuencias de señal humana también son conocidas por funcionar en hongos filamentosos. Por estas razones, es probable que un gran número de genes humanos puedan ser expresados y segregados en altos niveles a través de los métodos de la presente invención .

. «JiA É ti- J.J Tabla B Por lo tanto, se espera que los métodos de la presente invención sean útiles para la expresión de bibliotecas de ADN derivadas tanto de genomas procariáticos como eucariáticos. Tal como se describe anteriormente, los métodos tienen la capacidad de expresión y descubrimiento de proteínas tanto segregadas como intracelulares, proporcionando un fácil acceso a un número extremadamente grande de genes y proteínas. Una aspecto adicional de la presente invención, incluye la construcción y clasificación de bibliotecas mutantes fúngicas y bibliotecas mutantes fúngicas preparadas a través de los métodos descritos en la presente invención. Las bibliotecas pueden ser obtenidas mediante transformación de los huéspedes fúngicos de acuerdo con la presente invención, con cualesquiera medios de transformación integrativa o no integrativa, utilizando métodos conocidos para los expertos en la materia. Esta biblioteca de hongos con base en las cepas del huésped preferido, pueden ser manejadas y clasificadas según las propiedades o actividades deseadas de proteínas exógenas en métodos de clasificación de formato miníaturizado y/o alto rendimiento. Por propiedad o actividad de interés, se entiende cualquier propiedad física, fisicoquímica, química, biológica, o catalítica, o cualquier mejora, incremento o disminución en dicha propiedad , asociada con una proteína exógena de un elemento de la biblioteca. La biblioteca puede también ser clasificada según los metabolitos, o según una propiedad o actividad asociada con un metabolito, producidos como el resultado de la presencia de las proteínas exógenas y/o endógenas. La biblioteca también puede ser clasificada según las cantidades de producción incrementadas o disminuidas de los hongos de dicha proteína o metabolito. En otro aspecto de la presente invención , la biblioteca de hongos transformados puede ser clasificada por la presencia de metabolitos fú ngicos que tienen las propiedades deseables. Los ejemplos de tales metabolitos incluyen poliq uétidos, alcaloides, y productos natu rales terpenoides. Se anticipa que se pueden transferir múltiples genes o grupos de genes (operones) se pueden transferir a las células huésped de la presente invención , y que los productos sin proteína generados mediante la acción de las enzimas codificadas posteriormente serán generadas en las células huésped . Por ejemplo, se ha mostrado que el ADN que codifica las proteínas necesarias para la producción de lovastatina pueden ser transferidas al Aspergillus oryzae (Patente Norteamericana 5,362,638; ver también Patente Norteamericana 5,849,541 ). En otra modalidad de la presente invención, la biblioteca de hongos transformados puede ser clasificada según la presencia de ? .t - -....?-r. ----l-- ¡. - . .--t-.--.. ... . .,<,-. n rfr'fc i -lr J -*•-— -"*•• " **»'"* ADN que híbrida a una muestra de ácido nucleico de interés. En esta modalidad , no es esencial la expresión y/o secreción de proteínas exógenas, au nq ue con frecuencia todavía es deseable. Cuando la expresión de proteína no es necesaria, se apreciará que no son necesarias las secuencias regulatorias en el vector. Aún en otra modalidad de la presente invención , la biblioteca de hongos transformados puede ser clasificada según algunas propiedades deseables de los propios hongos, tales como por ejemplo tolerancia al ambiente físicamente o químicamente extremo, o la capacidad para producir, modificar, degradar o metabolizar una sustancia de interés. Tales propiedad deseables pueden ser o no atribuibles a la presencia de una proteína exógena simple. Esta modalidad será de particular modalidad cuando se emplee como parte de un proceso de evolución dirigida . El ADN heterólogo puede ser ADN genómico o c ADN , preparado a partir de especímenes a través de métodos bien conocidos en la técnica. El espécimen biológico puede ser una muestra ambiental (por ejemplo, tierra, mantillo, desperdicio de bosque, agua de mar o ag ua fresca, o una muestra extractada, filtrada o centrifugada o de alguna otra manera concentrada del mismo) . Los cultivos mezclados del m icroorganismo derivados de muestras ambientales, también se pueden utilizar. La muestra biológica también puede ser derivada de cualquier espécimen simple del organ ismo, tal como un microorganismo cultivado o planta, insecto u otro animal tal como un mam ífero. Además, el ADN i.« --..- -., - »-.t.-.l--.i«t -^»..- ..-..- - i. *.~*—*i?¡a..±. •***• •-** ' •— A-A?..L?+ heterólogo puede ser sintético o semi-sintétíco, por ejemplo, secuencias de ADN aleatorio o ADN que comprende segmentos que surgen de manera natural que han sido revueltos, mutados o alterados de otra manera. Un ejemplo de una biblioteca nucleica semi sintética se encuentra en la solicitud de Wagner y asociados, WO 00/0632. El ADN procedente de muestras ambientales (o cultivos mezclados derivados de las mismas), serán convenientes para el descubrimiento de proteínas novedosas, en tanto que el uso de ADN procedente de una sola especia será conveniente ya que (1 ) un vector apropiado puede ser elegido en forma más juiciosa (2) , el terapeuta será dirigido a especies relacionadas o similares para la clasificación adicional si se identifica una proteína de interés. Comparado con los huéspedes fúngicos tradicionales, los rangos de transformación , expresión y secreción exceden en gran parte, cuando se utiliza una cepa de Chrysosporium que exhibe la morfología micelial compacta de la cepa UV1 8-25. Por lo tanto, una cepa recombinante de acuerdo con la presente invención , exhibirá preferentemente tal morfolog ía. Sin embargo, la presente invención también cubre cepas no recombinantes o cepas construidas de otra manera de hongos que exhiben esta característica. Una modalidad atractiva de la presente invención , podría emplear una cepa de Chrysosporium recombinante que exh ibe una viscosidad menor a la de la cepa NG7C-1 9, preferentemente menor a la UV1 8-25 bajo condiciones de cultívo correspondientes o idénticas. Hemos determinado que viscosidad de un cultivo UV1 8-25 está debajo de ,-j.j-. »A--ml .». .:- .. - .. ....¿.~± ?. ... ... ,» .-í ffirtHffcttattt-. uat-.-a*»-»' *¿ - --- ... ^ ¿AlJ ij 10cP , opuesto a la del Trichoderma reesei anteriormente conocido que es del orden de 200-600 cP, y con la del Aspergillus niger tradicional que es del orden de 1 550-2000 cP bajo condiciones de cultivo óptimas du rante etapas de fermentación de medias a avanzadas. Por lo tanto, la presente invención puede emplear cualqu ier hongo filamentoso construido o mutante que exhiba esta característica de baja viscosidad , tal como la cepa de Chrysosporium UV1 8-25 (VKM F-3631 D) , la cepa del Trichoderma X252, o A. Sojae pc1 A ( derivado de ATCC 1 1 906) o A. N iger pc1 A. La flu idez de los cultivos fúngicos filamentosos puede variar en un amplio rango, desde casi sólida hasta liquida que fluye libremente. La viscosidad puede ser fácilmente cuantificada mediante viscometría rotatoria de Brookfield , el uso tubos de viscosidad cinemática, viscómetro de caída de bola o viscómetro tipo copa. Los caldos de fermentación son fluidos no Newtonianos, y la viscosidad aparente dependerá hasta cierto punto del rango de corte (Goudar y asociados, aplicación de Biotecnol. Microbiol. 1 999 51 :31 0-31 5). Este efecto, es sin embargo mucho menos pronunciado para los cultivos de baja viscosidad empleados en la presente invención. El uso de tales cultivos de baja viscosidad en la clasificación de una biblioteca de u na expresión de acuerdo con el método de la presente invención , es altamente conveniente. La clasificación de bibliotecas de ADN expresadas en hongos filamentosos, hasta ahora ha estado limitada a métodos laboriosos y relativamente lentos. En general, una vez que el hongo ha sido transformado (y los transformadores opcionalmente seleccionados) , ha sido necesario preparar esporas o conidias, o interrumpir en forma mecánica la micelia, con el objeto de dispersar la biblioteca del hongo transformado en organismos individuales o elementos reproductivos. 5 Esta dispersión es necesaria, ya que los organ ismos separados pueden ser cultivados en colonias o cultivos de clonación . Las esporas, conidias o fragmentos miceliales, posteriormente son diluidos y "plateados" en plastas de cultivo estándar, y se inspecciona el color, alteraciones para el substrato u otra indicación 10 detectable de la presencia de la actividad de proteína o propiedad que está siendo observada de las colonias individuales. En otro método, las proteínas segregadas son transferidas de las colonias en una membrana, y la membrana es probada o examinada para una indicación de la presencia de actividad de proteína o propiedad de 15 interés. El uso de membranas ha sido probado como útil cuando la degradación proteolítica de la proteína exógena es un problema (Asgeirsdottir y asociados, aplic. Micorbiol, ambiental. 1 999, 65:2250-2252). Tales procedimientos son de trabajo intenso y no han probado ser receptivos para automatización y como un resultado de 20 la clasificación de alto rendimiento de proteínas expresadas en forma fúngica, hasta la fecha no se ha log rado con hongos filamentosos convencionales. Para propósitos de esta descripción , la clasificación de alto rendimiento se refiere a cualquier método de clasificación parcial o completamente automático que tiene la capacidad de 25 evaluar las propiedad expresadas mediante aproximadamente 1 000 o más transformadores por día, y particularmente a aquellos métodos que tienen la capacidad de evaluar a 5000 o más transformadores por día y más particu larmente a métodos que tienen la capacidad de evaluar 1 0,000 o más transformadores por d ía. La clasificación de alto rendimiento automática de una biblioteca de hongos transformados de acuerdo con la presente invención , puede ser llevada por lo tanto, en u n número de formas conocidas. Los métodos que son conocidos por ser aplicables a bacterias o levaduras, pueden ser aplicados en general a los hongos de baja viscosidad de la presenten invención . Esto se hace posible a través de la presencia de elementos reproductivos transferibles en combinación con el fenotipo de baja viscosidad , u na consecuencia de la morfología relativamente no enredada del hifae del hongo mutante empleado. En esencia el hongo mutante, /o sus elementos reproductivos transferibles, muchas bacterias sublevadoras individ uales durante las manipulaciones mecán icas involucradas en la clasificación de alto rendimiento automáticas. Esto es contraste con el hongo tipo natural, y también con la mayoría de los hongos adaptados industrialmente, que producen micelias altamente enredadas que no permiten la fácil separación de los organismos individuales uno del otro. Por ejemplo, una suspensión del hongo transformado de acuerdo con la presente invención , puede ser alicuotada a través de una m icro pipeta mecánica en depósitos de una micro placa de 96 depósitos. Se anticipa que el aparato que maneja líquidos, tiene una -..-¡..--Uí- á --. i ----t. .,^a¿í^^*tjl&t¿t» Léj*MM¿ ¡ í£t¿á^ ^*.» ~A. ^,. ± .j Es.iAk. i capacidad de pipetizar en micro placas de 384 ó 1 536 depósitos. También puede ser adaptado para la tarea de dispersión automática de los organismos en micro placas. La concentración de los organismos suspend idos, puede ser ajustada según se desee como para controlar el número promedio de organ ismos (u otros elementos reproductivos transferibles) por depósito. Se apreciará que cuando se alicuotan organ ismos individuales múltiples en los depósitos, la identificación o la actividad o propiedad de proteína deseada en dicho depósito, será seguida por la dilusión de los contenidos del depósito y el cultivo de los organismo presentes en colonias o cultivos de clonación individuales. De esta forma, el rendimiento del sistema puede ser incrementado, al costo de la necesidad para la resolución subsecuente de los contenidos de cada depósito que presenta un "toque". En una modalidad alternativa, se puede interponer un clasificador de células en la trayectoria del fluido, el cual tiene la capacidad de dirigir el flujo de cultivo a los depósitos de la micro placa al momento de la detección de un organismo u otro elemento reprod uctivo transferible en la célula detectora . Esta modalidad permite el abastecimiento razonablemente preciso de un organismo por depósito. El uso de un marcador ópticamente detectable, tal como proteína fluorescente verde, para identificar los transformadores, es particularmente útil en esta modalidad , ya que permite la selección automática de transformadores un clasificador celular activado por fluorescencia. rfa-'" ab * fc«.» .^, í..*e..*J»? *lláí*tt?*~.&?m?. .

Aún en otra modalidad , las colonias que crecen en medio sólidos pueden ser recolectadas mediante un recolector de colonias robotizado, y los organismos pueden ser transferidos por el robot a los depósitos de una placa de micro titulación . Las colonias bien separadas, darán surgimiento a colonias simples en cada depósito. Posteriormente, se deja que los organismos dispersos crezcan en cultivos de clonación en los depósitos de la micro placa. Se pueden agregar en vectores, nutrientes, etc. , según se desee, mediante el sistema de abastecimiento defin ido automático. El sistema también puede ser usado para agregar cualesquiera reactivos requeridos para hacer posible la detección de la actividad o propiedad de la proteína de interés. Por ejemplo, se pueden agregar substratos colorogén icos o fluorogénicos, para permitir la detección espectroscópica o fluorométrica de una actividad de la enzima. La viscosidad baja y el habitat de crecimiento sumergido de los cultivos en los depósitos de una placa de microtitulación , permite una rápida difusión de tales reactivos en el cultivo, aumentando en gran medida la sensibilidad y confiabilidad del ensayo. La difusión de oxígeno y nutrientes también se mejora en gran medida , facilitando el rápido crecimiento y máxima expresión y secreción de péptidos exógenos. Ciertos ensayos, tales como el ensayo de proximidad por centelleo dependen de la difusión de los componentes solubles para llegar a un estado de equ ilibrio; nuevamente la baja viscosidad de los cultivos fúngicos de la presente invención , hace posible este ensayo de alto rendimiento. Finalmente, en un sistema altamente automático, será deseable recolectar, aspirar o pipetizar en forma automática cultivos de clonación de interés de sus depósitos en la placa de micro titulación , y la baja viscosidad y habitat de crecimiento sumergido de los cultivos, hará esto posible. Todas las 5 operaciones anteriores serán difíciles o imposibles, debido a la viscosidad de los cultivos fúngicos filamentosos tradicionales, especialmente cultivos que crecen como esferas en la superficie en condiciones no agitadas, libres de corte de un depósito de la placa de micro titulación . 10 En otra modalidad , las células simples pasan a través de un aparato microfuídico, y la propiedad o actividad de interés se detecta ópticamente (Wada y asociados. , WO 99/67639). La baja viscosidad es esencial para la operación de un aparato de microfuidos, y se espera que los cultivos de los hongos mutantes de baja viscosidad 15 de la presente invención sean receptivos a manipulación microfluídica . Short y asociados, en la Patente Norteamericana 6, 1 74,673, ha descrito como se pueden emplear los substratos fluorogénicos para detectar una actividad enzimática de interés, y como las células huésped que expresan tal actividad pueden ser 20 aisladas con un clasificador celular activado por fluorescencia. Los métodos de la presente invención, son compatibles con este método de identificación de proteínas expresadas. En una modalidad , cuando los transformadores llevan una proteína fluorescente como marcador, la fluorescencia puede ser 25 cuantificada y empleada como una medida de la cantidad de expresión del gen y/o proteína expresada presente en un cultivo determinado. En esta modalidad, es posible no únicamente detectar una proteína exógena de interés, sino estimar la actividad específica la proteína , tal como lo describe Blyna y asociados en la solicitud WO 00/78997. Esta modalidad será particularmente preferida cuando el método de clasificación de la presente invención , se emplee como parte de un proceso de evolución dirigida. En aquellos casos en donde es aceptable una viscosidad mayor, una matriz de formación de gel puede proporcionar ciertas ventajas cuando se cultiva el hongo, y se conducen ensayos bioquímicos en un formato de microplaca, tal como lo describe Bochner en la Patente Norteamericana 6,046,021 . Otra clase de clasificaciones de alto rendimiento es mediante análisis fotométrico, mediante espectroscopia de generación de imagen digital de grandes cantidades de colonias individuales que crecen en un substrato sólido. Ver por ejemplo la publicación de Youvan y asociados, 1 994, Enzymol, met. 246:732-748. En este método, los cambios en la absorción general o emisión de especial de reactivos especializados, son indicativos de la presencia de una actividad o propiedad de proteína heteróloga de interés. La fácil dispersión de organismos individuales en el uso de mutantes de baja viscosidad , también hace posible el uso de hongos filamentosos en este método. La tendencia de colonias de hongos mutantes de la presente invención , exhibe menos crecimiento lateral, y produce colonias suaves, compactas y bien definidas en medios sólidos, y t-* -t- •"-"—* . -a-^J»^.---*.--*-*. „. , .- .. i. ^ H & también es conveniente en un sistema de clasificación. Además, las características de expresión y secreción superior de hongos, comparadas con las de las bacterias, proporcionan mayores cantidades de proteína para análisis espectral. Una herramienta que maneja microorganismos automáticos, se describe en la solicitud de Patente Japonesa publicación numero 1 1 -304666. Este aparato tiene una capacidad de transferir micro gotas que contienen células individuales, y se anticipa que las cepas fúngicas de la presente invención, en virtud de su morfología, serán receptivas a micro manipulación de clones individuales con este aparato. Un sistema de clasificación de alto rendimiento micro biológico automático, se describe en la publicación de Beydon y asociados, R. Biomol, clasificación 5: 1 3-21 (2000) . El sistema robotizado tiene una capacidad de transferir gotas con un volumen de 400 ni a placas de agar, y procesar 1 0,000 de clasificación por hora, y se ha utilizado para conducir clasificaciones de levadura de dos h íbridos. Se anticipa que los huéspedes fúngicos de la presenten invención , serán tan receptivos como la levadura a clasificación de alto rendimiento con sistemas de este tipo. Como una alternativa a las placas de micro titulación , los transformadores pueden ser desarrollados en placas y, en la forma de micro colonias, ensayadas ópticamente tal como se describe en la solicitud WO 00/78997.

IA^ .*.**^ . . *^*.. tt*t-^*t * "-"-• *- -----ÉSÉ-feÉ. i ? ? i ' " .-A ti ÁJ El desarrollo de clasificaciones de alto rendimiento, se describe en general en la publicación de Jayawickreme y Kost, Biotecnol. Opin . Corriente 8:629-634 (1 997) . Un clasificación de alto rendimiento para genes diferencialmente expresados raramente transcritos, se describe en la publicación de von Stein y asociados, inv. de ácidos nucleicos 35:2598-2602 (1 997) . La cepa de Chrysosporium UV 1 8-25 y la cepa de Trichoderma X 252 ilustran varios aspectos de la presente invención . La presente invención , emplea sin embargo otras cepas mutantes o de otra manera construidas de hongos filamentosos que producen elementos reproductivos transferibles en suspensión y exhiben baja viscosidad en cultivo. La morfología específica del hongo puede nos ser critica; los inventores de la presente invención han observado micelias cortas, no enredadas en estas dos cepas aunque, otras morfologías, tales como ramificación hifal cerrada y extensa, también puede conducir a viscosidad reducida. Las cepas fúngicas de acuerdo con la presente invención , son preferidas si exhiben condiciones de crecimiento óptimas en pH neutrales y temperaturas de 25 a 43°C. Tales condiciones de clasificación son convenientes para mantener la actividad de proteínas exógenas, en particular aquellas susceptibles a degradación o desactivación en un pH acídico. La mayoría de las proteínas mam íferas, y proteínas humanas, en particular, se han desarrollado el funcionar el pH temperatura fisiológica, y la clasificación para una actividad normal de una enzima h umana se lleva de mejor manera a cabo bajo tales condiciones. Las proteínas proyectadas para uso terapéutico, tendrán que funcionar bajo tales condiciones, las cuales también hacen que estas sean las condiciones de clasificación preferidas. Las cepas de Chrysosporium exhiben precisamente esta característica, creciendo también en un pH normal, y a una temperatu ra de 35 a 40°C, mientras que otras especies de huésped fúngico empleadas normalmente (por ejemplo Aspergillus y Trichoderma) , crecen mejor en un pH acídico y pueden ser menos adecuadas por esta razón . Otra aplicación del método de la presente invención , es en el proceso de "evolución dirigida" en donde se generan secuencias de ADN de codificación de proteína novedosas, se expresan las proteínas codificadas en la célula huésped , y se seleccionan aquellas secuencias que codifican proteínas que exhiben alguna característica deseada, se m utan y expresan nuevamente. El proceso se repite durante un número de ciclos hasta que se obtiene una proteína con las características deseadas. La revoltura del gen , construcción de proteína, el PCR de error-prono, la mutagénesis dirigida al sitio y la mutagénesis de combinación y aleatoria son ejemplos de procesos a través de los cuales se pueden generar secuencias de ADN novedosas que codifican proteínas exógenas. Las patentes Norteamericanas 5,223,409, 5,780,279 y 5,770,356 proporcionan enseñanzas con respecto a la evolución dirigida. También ver la publicación de Kuchner y Arnold , tendencias en Biotecnolog ía.1 5:523-530 ( 1 997); Schmidt-Dannert y Arnold , tendencias en Biotecnología, 17:135-136 (1999); Arnold y Volkov, opin. corriente. Quim. Biol. 3:54-59 (1999); Zhao y asociados, Manual de la Microbiología y Biotecnología Industrial, 2a. Edición, (Demain y Davies, eds.) páginas 597 a 604, ASM Press, Washington DC, 1999; Arnold y Wintrode, Enciclopedia de Tecnología de Bioproceso; Fermentación, Biocatálisis y Bioseparación (Flickinger y Drew, eds.) páginas 971 a 987, John Wiley & Sons, Nueva York, 1999; y Minshull y Stemmer, opin. Corriente. Quim. Biol.3:284-290. Una aplicación de la mutagénesis de combinación se describe en la publicación Hu y asociados, Bioquímica. 1998 37:10006.10015. La Patente Norteamericana 5,763,192 describe un proceso para obtener secuencias de ADN de codificación de proteína novedosas mediante secuencias sintéticas de generación estocástica, que las introducen en un huésped, y seleccionan células huésped con las características deseadas. Los métodos para efectuar la recombinación de gen artificial (revoltura de ADN) incluyen recombinación de preparación aleatoria (Z. Zhao y asociados, inv. Ácidos Nucleicos, 26:681.683 (1998)), los procesos de extensión o de etapas (H. Zhao y asociados, Biotecnología Natural, 16:258-262 (1998)), y recombinación heteroduplex (A. Volkov y asociados, inv. Ácidos Nucleicos, 27:e18 (1999)). El PCR error-prono Aún es otro método (Song y Rhee, Aplic. Microbiol. Ambiental. 66:890-894 (2000)). Existen dos métodos ampliamente practicados para llevar a cabo el paso de selección en un proceso de evolución dirigida. En un ád,. ? ^Í.?^^ . i.,.. -.A- *»»-. .--fa-tw-H-. ~^.. l ,..-.,.í ...........'.^.. ^^tS.^-rS,-^, ,.-.l-- -_, ,? - AJL..t~« < método, la actividad de la proteína de interés se hace esencial para supervivencia de las células huésped . Por ejemplo, si la actividad deseada es un activo de celulasa con un pH de 8, se podrían mutar e introducir en las células huésped un gen de celulasa. Los transformadores son crecidos con celulosa como la única fuente de carbono y el pH se eleva gradualmente hasta que únicamente permanecen algunos supervivientes. El gen de celulasa mutada de los supervivientes, el cual codifica presumiblemente una celulasa activa con un pH relativamente alto, es sometido a otra vuelta de mutación , y el proceso se repite hasta que se obtienen transformadores que pueden también crecer en celulosa con pH 8. Las variantes térmicas de las enzimas pueden igualmente ser desarrolladas, mediante ciclos de mutación de gen y cultivo de células huésped a alta temperatura (Liao y asociados, proc. Natel, acad . Cié. EUA 1 986 83:576-580; Giver y asociados, proc. Natel. Acad. Cié. EUA 1 998 95: 1 2809-1281 3. Para propósitos de la presente solicitud , la mutación de secuencias de ADN que codifican proteínas exógenas se puede lograr a través de cualesquiera de los métodos empleados para evolución dirigida, por ejemplo mediante revoltura de gen, recombinación in vivo, o mutagénesis de cinta. La ventaja principal de este método, es la naturaleza paralela en forma masiva del paso de selección "el superviviente de la prueba de adaptación". M illones o billones de mutaciones no exitosas son elim inadas en forma simultánea a partir de la consideración de no tener la necesidad de evaluarlos en forma individual. Sin embargo, no siempre es posible enlazar una actividad ezimática de interés al superviviente del huésped . Por ejemplo, cuando la propiedad de la proteína deseada es enlazada en forma selectiva a un objetivo de interés, probablemente es difícil realizar el enlace de la propiedad esencial al superviviente. Asimismo, la supervivencia bajo condiciones forzadas, tales como alta temperatu ra, o pH extremo, probablemente depende de múltiples factores, y no será seleccionada una mutación deseable y se perderá si la célula huésped no tiene la capacidad de sobrevivir por razones no relacionadas con las propiedades de la proteína mutante. Una alternativa para este método de "supervivencia a la prueba de adaptación" paralela en forma masiva, es la clasificación en serie. En este método los transformadores individuales son clasificados a través de métodos convencionales, tales como observación de zonas aclaradas o coloreadas alrededor de colonias que crecen en medio indicadores, ensayos enzimáticos colorimétricos o fluorométicos, inmunoensayos, ensayos de enlace, etc. Ver por ejemplo la publicación de Joo y asociados, Natu raleza 399:670-673 (1999), donde una mono oxigenasa de citocroma P450 no requiere de NADH como un cofactor, que fue desarrollado por ciclos de mutación y clasificación; May y asociados, Biotec. Natural 1 8:31 7-320 (2000) , donde una hidantoinasa de estereoselectividad inversa , fue desarrollada en modo similar; y Miyazaki y asociados, R. Mol. Biol. 297: 1 01 5-1 026 (2000), en donde se desarrollo una subtilisina termoestable.

El método de clasificación tiene ventajas claras con respecto a una "clasificación de supervivencia" simple, especialmente si se lleva a cabo en una forma de alto rendimiento que se acerca al rendimiento de la técnica de "clasificación de supervivencia" paralela en forma masiva. Por ejemplo, se ha introducido un grado de paralelismo, empleando medidas tales como generación de imagen digital de los organismos transformados (Joo y asociados, Química y Biología, 6:699-706 (1 999)) o evaluación espectroscópica digital de colonias (Youvan y asociados, 1 994, met. , Enzimol. 246:732-748) . Los ensayos en serie se automatizaron mediante el uso de clasificación celular (Fu y asociados, Biotec. Natural, 1 7: 1 1 09-1 1 1 1 (1 999)) . U n método bien establecido para clasificación de alto rendimiento comprende la evaluación automática de proteínas expresadas en placas de micro titulación , utilizando lectores de placa comercialmente disponibles, y el método de la presente invención está bien adaptado para la aplicación de este modo de clasificación de alto rendimiento a evolución dirigida . En esta modalidad de la presente invención , un gen que codifica una proteína de interés es mutado mediante cualquier método conocido de generación de una pluralidad de mutantes, el ADN que codifica la proteína m utante es introducido por medio de un vector de expresión adecuado en un huésped fúngico filamentoso de baja viscosidad de acuerdo con la presente invención , y los transformadores son opcionalmente seleccionados y cultivados. Posteriormente, las células huésped son dispersadas tal como se ***-*•*-*-«- HUÉi-üp n ii i-iil f ?~-? i inrt ?f n . • n " - i n i ??rmtt?lilt" íft f- f-J - describió anteriormente, en depósitos de una placa de micro titulación , o separados de otra manera en ubicaciones resolvibles, para proporcionar cultivos mono clonables individuales (o cultivos policlonables que tienen menos de aproximadamente 100 diferentes clones) . Las células son d ispersadas preferentemente en los depósitos de una placa de micro titulación . La proteína codificada por el ADN mutante, es segregada preferentemente en el medio en los depósitos de las placas de micro titulación . Cada u no de los cultivos dispersos es clasificado según la actividad de proteína de interés, y se seleccionan aquellos que exhiben de manera más acentuada la propiedad deseada. El gen que codifica la proteína de interés en los cultivos seleccionados es mutado nuevamente, el ADN mutante es introducido nuevamente en el huésped fúngico de baja viscosidad , y los transformadores son clasificados nuevamente. El proceso de mutación y reclasificación se repite hasta que el valor de la propiedad de interés alcanza un nivel deseado. En una modalidad alternativa , la evolución dirigida se lleva a cabo mediante mutación y reproducción del gen de interés en otro organismo, tal como E. coli, seguido de la transferencia de los genes mutantes a un hongo filamentoso de acuerdo con la presente invención , para clasificación . Los expertos en la materia apreciarán fácilmente, que una proteína que parece ser de interés con base en el ensayo de clasificación , no necesariamente tendrá todas las otras propiedades requeridas para utilidad comercial. Por ejemplo, la posesión de actividad enzimática, no obstante de la alta actividad específica, no indicará que la enzima mutante tiene el requisito térmico o estabilidad de pH , o resistencia a detergente o proteasa, o no inmunogenesidad, otra propiedad deseable o necesaria en un producto comercialmente viable. Existe la necesidad de métodos para determinar fácilmente si una proteína identificada tiene propiedades comercialmente útiles. Los métodos declasificación de la técn ica anterior, no han proporcionado una solución a esta necesidad , debido a que los organ ismos huéspedes (bacterias y levaduras) no fueron adaptados a la producción de cantidades de proteínas que se pueden aislar. Hasta ahora ha sido necesario transferir genes potencialmente útiles desde un organismo a otro, como se procede a través de la preparación de biblioteca de ADN , expresión de gen , clasificación , expresión de cantidades de investigación de los productos del gen, y sobre expresión en cepas de producción industrialmente adecuadas. Por otra parte, los hongos filamentosos mutantes de la presente invención , son excelentes sobreproductores y segregadores de proteínas exógenas, especialmente cuando se emplean con los vectores descritos en la presente invención . Se puede aislar suficiente proteína, no únicamente para propósitos de caracterización , sino para evaluación en pruebas de aplicación . De hecho, las cepas utilizadas en el método de clasificación de la presente invención , son adecuadas también para producción industrial, ya que poseen propiedades de producción deseables tales '" '•'' '• -J « --- '•*• «• • » t»a&~a-« . - --«-« •-« - ~- íA i .L i , como baja viscosidad , altos rangos de expresión y proporciones muy altas de proteína/biomasa . Por lo tanto, en una modalidad preferida de la presente invención , el método comprende además, el cultivo de una colonia o cultivo de clonación identificado de acuerdo con el método de la presente invención , bajo condiciones que permiten expresión y secreción de la proteína de biblioteca exógena (o un recurso de la misma), y la recuperación de la proteína producida en forma subsecuente para obtener la proteína de interés. La expresión de secreción de una proteína de biblioteca, puede ser facilitada creando una fusión en estructura del gen clonado con el gen de una proteína heteróloga (o un fragmento de la misma) con su correspondiente secuencia de señal, o con la secuencia de señal procedente de una tercera proteína, todas enlazadas en forma operable a una secuencia de regulación de expresión . A través de este método, se crea proteína de fusión que contiene una corriente ascendente de secuencias de aminoácidos heterólogos de la proteína de la biblioteca. De manera subsecuente, esta proteína precursora de fusión puede ser aislada y recuperada utilizando técnicas de purificación conocidas en la técnica. El método puede comprender opcionalmente, someter el precursor de proteína de fusión segregado a un paso de disociación para generar la biblioteca de proteína de interés. El paso de disociación se puede llevar a cabo con Kex-2, una proteasa similar a Kex-2 , u otra proteasa selectiva, cuando el vector es construido de modo que un sitio de d isociación de proteasa se enlace a un transportador de proteína bien segregada y a la proteína de interés. La fácil disponibilidad de la proteína mutante, directamente a partir de la clasificación del organismo huésped , no ha sido posible anteriormente con los huéspedes de la clasificación de la técnica anterior. La presente invención , proporciona por lo tanto, una ventaja ya que las proteínas mutantes consideradas de interés con base en la clasificación de alto rendimiento, pueden ser aisladas en cantidades suficientes (miligramos) para la caracterización adicional e incluso cantidades mayores (gramos a kilogramos) para pruebas de aplicación . Esta modalidad particular de la presente invención, permite por lo tanto al terapeuta seleccionar proteínas mutantes para la siguiente vuelta de evolución dirigida con base en cualquier número de propiedades deseables, y no meramente en la propiedad detectada en la clasificación de alto rendimiento. Los criterios de selección más estrictos son posibles a través de la presente invención , ya que conducen a un proceso de evolución dirigida más eficiente y efectivo en costo. El método de producción de una cepa de hongos filamentosos mutantes recombinantes de acuerdo con la presente invención, comprende introducir una biblioteca de secuencias de ADN que comprenden secuencias de ácido nucleico que codifican proteínas heterólogas en un hongo filamentoso mutante de baja viscosidad de acuerdo con la presente invención, siendo enlazadas en forma operable las secuencias de ácido nucleico a una región de regulación de expresión . La introducción de las secuencias de ADN puede llevarse a cabo en cualquier forma conocida , para transformar hongo filamentosos. Los expertos en la materia apreciarán q ue existen varios métodos bien establecidos, tales como captación de ADN estimulada por polietilenglicol-CaCI2 mediante protoplastos fúngicos (Johnstone y asociados, EMBO R. 1 985, 4: 1 307-1 31 1 ). En estos ejemplos, se describe un método de transformación de protoplastos. Los métodos alternativos de transformación de protoplasto o esferoplasto son conocidos y pueden ser utilizados, ya que han sido descritos en la técn ica anterior para otros hongos filamentosos. Los vectores adecuados para la integración de multicopias del ADN heterólogo en el genoma fúngico, son bien conocidos; por ejemplo ver la solicitud de Giuseppin y asociados, WO 91 /00920. El uso de plásmidos de replica autónoma ha sido bien conocido como una herramienta de transformación eficiente para hongos (Gems y asociados, Gen 1 991 98 :61 -67; Verdoes y asociados, Gen 1 994 146: 1 59-165; Aleksenko y Clutterbuck, Biol. Genéticas Fúngicas 1997 21 :373-387; Aleksenko y asociados, Genet. Gen . Mol, 253:242-246). Los detalles de tales métodos se pueden encontrar en muchas de las referencias mencionadas, y por lo tanto están incorporadas a la presente invención como referencia. Los métodos de ejemplo de acuerdo con la presente invención , comprenden la utilización de una cepa mutante de baja viscosidad de Chrysosporium o A. Sojae como material de partida para la I jai ??. ?.AA. --«--«fc * - -'-'^•- f— introducción de vectores que transportan ADN heterólogo, tal como se presentan más adelante. EJEMPLOS A DESARROLLO DE M UTANTES DE MORFOLOGÍA DE CRECIM I ENTO COM PACTO Varias solicitudes de Patente enseñan que los mutantes morfológicos pueden ser aislados a través de varias formas de clasificación . Las solicitudes WO 96/02653 y WO 97/26330 describen mutantes no definidos que exhiben morfología compacta. Se descubrió que una pro proteína que procesa el mutante de A. sojae tuvo un inesperado fenotipo de crecimiento aberrante (hiper ramificación) mientras que no se observaron efectos perjudiciales en la producción de proteínas. Los experimento de cultivo con esta cepa, revelaron un fenotipo de crecimiento muy compacto con micropellets. Las características observadas no estuvieron únicamente presentes en A. sojae, sino también en otros hongos mutados, como por ejemplo A. Niger. (D Construcción de una proproteína de procesamiento mutante A. Niger Para clonar en la convertasa que codifica el gen de A. Niger, se utilizó PCR. Con base en la comparación de varios genes de convertasa de proporteína procedentes de varias especies de levadura y eucaritos superiores, se designaron diferentes cebadores PCR que fueron degenerados, respectivamente, 4, 2 ,2, 51 2, 1 1 52, 4608 y 49152 veces. A partir de la amplificación utilizando cebadores PE4 y PE6, se obtuvieron dos clones individuales obtenidos de los cuales la secuencia de proteína codificada no mostró homología significativa con la secuencia S. cerevisiae KEX2. Estos clones fueron utilizados para experimentos adicionales. Con base en la homolog ía observada a otros genes de convertasa de proteína del fragmento PCR clonado, el gen A. niger correspondiente fue designado pc1 A (a partir de proproteína- convertasa-sim ilar) . El análisis Southern de digestiones genómicas de A. N iger revelaron que el gen pc1 A fue un gen de copia simple sin genes relacionados en forma cercana en el genoma A. N iger, incluso en condiciones de hibridación heteróloga (temperatura 50°C ; lavados a 6xSSC) no fueron señales evidentes de hibridación adicional. Una primera clasificación de una biblioteca genónica EMBL3de A. Niger N401 (van Hartingsveldt y asociados, Genet. Gen . Mol. 1 987 206:71 - 75) no dio como resultado ninguna placa de hibridación en forma positiva aunque se clasificaron aproximadamente equivalentes de 1 0 a 20 genomas. En una segunda clasificación se aisló una copia genómica de longitud completa del gen pc1 A de una biblioteca genómica de A. niger N400 en EM BL4 (Groosen y asociados, Genet. Corriente 1 1 :499-503 (1 987)) . De las 8 placas de hibridación que fueron obtenidas después de la clasificación de equivalentes de 5 a 1 0 genomas, 6 fueron positivas después de la primera reclasificación . Estos 6 clones transportaron en forma más parecida una copia total del gen pc1 A, como en todos los clones (tal como se observó en el ADN genómico) hibridando los dos fragmentos PCR fragmentos EcoRV de tres y cuatro KV que estuvieron presentes (el fragmento PCR contenía un sitio de restricción EcoRV). Con base en la comparación del tamaño de otras convertasas de propoteína, estos fragmentos juntos, contendrán el gen pc1 A completo con secuencias de flanqueo de 5 ' y 3 '. Los dos fragmentos EcoRV y un fragmento EcoRI 5kg de traslape, fueron subclonados para caracterización adicional. Con base en el mapa de restricción , la secuencia de ADN completa del gen pc1 A fue determinada a partir de dos subclones EcoRI y EcoRV. El análisis de la secuencia obtenida , reveló una estructura de lectura abierta con considerable similitud a la del gen S . cerevisiae KEX2 y otras convertasas de propoteína. Con base en la comparación adicional de dos, se identificaron dos secuencias de intrón putativo en la región de codificación . El análisis PCR subsecuente con cebadores que flanquean los intrones putativos, en un pEMBLyex con base en una biblioteca de cADN de A. niger, reveló que únicamente el 5 ' mayor de estas dos secuencia representó un intrón real. La estructura general de la proteína pc1 A codificada fue claramente similar a la de otras convertasas de propoteína. La similitud general de la proteína pc1 A con las otras convertasas de propoteína fue de aproximadamente el 50% . Para demostrar que el gen pc1 A clonado es un gen funcional que codifica una proteína funcional, la construcción de cepas evitó que se intentara el gen pc1 A. Por lo tanto, se generó pPCL1 , un vector de eliminación pc1 A, en el cual gran parte de la región de ..*»*-.. ».^&». '•*-* «^^ codificación pc1 A fue reemplazada por el marcador de selección A. orizae pyrG. De manera subsecuente, a partir de este vector, se utilizó el fragmento de inserto EcoRI 5 kb para la transformación de varias cepas A. niger. A partir de estas transformaciones (basadas en selección pyrG)se obtuvieron numerosos transformadores. De manera interesante, una fracción de transformadores (variación de 1 a 50%) desplegó un fenotipo aberrante muy distinto (figura 1 3) . El análisis Southern de varios transformadores naturales y aberrantes reveló que estos transformadores aberrantes que despliegan un fenotipo de crecimiento restringido (compacto), tuvieron la pérdida del gen pc1 A. todas las cepas que desplegaron crecim iento natural mostraron llevar una copia del fragmento del reemplazo integrado adyacente al gen pc1 A natural o en una posición no homologa. (2) Construcción de una propoteína de procesamiento mutante A. soiae Para construir el mutante correspondiente en A. sojae, la complementación fu ncional del mutante de baja viscosidad de A. niger, se llevó a cabo mediante la transformación de un mutante pc1 A con la biblioteca cosmida de A. sojae ATCC 1 1 906. A partir de los transformadores A. niger complementados resultantes, se aislaron clones cósmidos genómicos, que comprendieron la proteína A. sojae que procesa la protasa pc1 A. El análisis de secuencia parcial de las secuencias aisladas confirmó la clonación del gen A. sojae pc1 A. Con base en las secuencias A. sojae pc1 A clonadas, se l-l-t¿-- i..-.l-i>- .iJ- ---tt-»-. j¡. a . „ ..-- -, ...i ...... .. ..-.^-it-..-»-i.^ -i „..-te,w- ¡-. . *- generó un vector de reemplazo de gen siguiendo un método similar al descrito en cualquier parte de nuestros ejemplos, utilizando el marcador de selección pyrG reutilizable descrito en la solicitud WO 01 /09352. Además, se construyó un vector de interrupción de gen y transportando el marcador de selección pyrG y el fragmento truncado 5' y 3' desde el gen A. sojae pc1 A. se utilizaron tanto el reemplazo de gen como el vector de interrupción de gen para generar mutantes pc1 A en ATCC 1 1 906 y derivados de ATCC 1 1906. Los experimentos de cultivo con alg unos de los transformadores resu ltantes, revelaron características morfológicas mejoradas, en particular morfolog ía y micropellets de crecimiento compacto, (figs. 14A y 14B) (3)Aislamiento de mutanfes alternativos de crecimiento compacto A. soiae La transformación de A. sojae ATCC 1 1 906 y derivados, se puede llevar a cabo con fragmentos de ADN lineal q ue transportan un marcador de selección fúngico. Si no se proporcionan secuencias de réplica específicas, los transformantes obtenidos utilizando este procedimiento transportan el ADN introducido integrado en el genoma de la cepa huésped . Ya que el marcador de selección introducido es de origen heterólogo (A. niger) únicamente la recombinación heteróloga, conduciendo a una recolección de transformadores que transportan el ADN marcador en varias posiciones en el genoma. Esta integración es prono para dar como resultado la interrupción de las secuencias A. sojae endógeno, dando í.t .i.i. ii.^-. ,. ^.j. . - .-^..a^,, .- ,« ..-.,*.,,»-,. , -,., - -,-<< fa^...t-..^-^th. -». = ..,.... „.-„--. ^. ^* Í .?A ? . como resultado de este modo una recolección de cepas mutantes A. sojae. Esto se ejemplifica mediante el análisis de una gran recolección de transformadores obtenidos a partir de A. sojae ATCC 1 1 906alpApyrG utilizando un fragmento de ADN con el marcador de selección A. niger pyrG . En total, se analizaron varios miles de transformadores y a partir de estos de 5 a 10 mostraron un fenotipo morfológ icamente aberrante. Entre estos varios miles, hubo un fenotipo comparable con los mutantes pc1 A. Similar a lo descrito para la clonación del gen A. sojae pc1 A, el gen correspondiente para la mutación podrá ser aislado de la biblioteca del gen A. sojae mediante la complementación del fenotipo morfológico. Con base en el gen clonado, se pueden generar mutantes de interrupción/eliminación del gen correspondiente. (4)Aislamiento de mutantes de crecimiento compacto ChrvsosDorium Utilizando un PCR similar basado en método de clonación que se describe para el gen A. niger pc1 A, se clonó un fragmento de la proproteína de Chrysosporium que procesa el gen, denominado pcl1 , a partir de una biblioteca del gen Chrysosporium BLUESTAR (TM) . Un fragmento del gen que lleva la copia del gen genómico completa , fue subclonado a partir del clon pBLU ESTAR. Con base en el subclon obtenido, se generó un vector de interrupción del gen tal como se describió para A. sojae. En lugar del marcador pyrG , se utilizó para el Chrysosporium la versión flanqueada de repetición del gen A. niger pyrE. La interrupción-transformación del gen de Chrysosporium, dio como resultado cepas con un fenotipo de crecimiento compacto. B. DETERMINAC IONES DE VISCOS I DAD Se han determinado los siguientes rangos de datos parámetros de operación para fermentaciones fúngicas utilizando 5 diferentes organismos fúngicos. Los 5 organismo fúngicos comparados fueron cepas de Aspergillus niger, Trichoderma longibrach iatum 1 8.2KK ( formalmente T. reesei), Trichoderma longibrachiatum X 252, la cepa Chrysosporium luckowense UV1 8-25, y Aspergillus sojae pc1 A. La viscosidad de un cu ltivo fúngico varía durante el transcurso de una fermentación , y varía con la concentración de nutrientes. Para las medidas aquí reportadas, el medio que contiene entre 20 y 1 00 g/l de una fuente de carbono de carbohidrato (por ejemplo, celulosa, lactosa, sacarosa, xilosa , glucosa y similares), se incolula con el hongo, y el cultivo se deja proceder a través de una "fase de crecimiento" durante la cual se consume la fuente de carbono. Los cultivos del frasco de agitación , se agitan a 200 rpm , mientras que se agitan recientes de fermentación de un litro con un impulsador a 500- 100 rpm. La viscosidad máxima normalmente ocurre en o cerca del final de la fase de crecimiento. En este momento el cultivo es cambiado a un modo de lote de alimentación , en donde se alimenta una fuente de carbono al cultívo en un rango, de modo tal que la concentración de la fuente de carbono no se eleva arriba de aproximadamente 0.5 g/l. Es típico un rango de alimentación de entre 1 y 3 g/l/hr.

Se determinó la viscosidad en un viscómetro Brookfield LVF, utilizando en adaptador de muestra pequeña y el número de rueda 31 , operado a una temperatura de 30°C. Se colocó una muestra fresca del caldo de fermentación (10 ml) en la rueda de la muestra pequeña. La velocidad de la rueda se ajustó para proporcionar una lectura dentro del rango de 10 a 80. Después de cuatro minutos, se tomó una lectura a partir de la escala del viscómetro. La lectura fue multiplicada por el factor determinado abajo, para obtener la viscosidad en centipoíses (cP).

La viscosidad final se midió al termino de la fermentación: t-JUi -i « i i- t^o- .i, . . toJfc» . . J»» l««. ?-"~ *•*-&.- _-j--a Br .?,->»A^ -; at--, ...«:.»Ai¿-t ifc ij j C . TRANSFORMACIÓN DE CHRUSOSPORIUM. TRICHODERMA Y TOLYPOCLADI UM Los medios de transformación se utilizaron tal como se describe a continuación: Modelos Base Medio MnP: KH2P04 2.0 g/l Base Mandéis con (NH4)2S04 1.4 g/l Peptona 1 g/l MgS047H20 0.3 g/l MES 2 g/l CaCI2 0.3 g/l Sacarosa 100 g/l Oligoelmentos 1.0 ml/l Ajuste de pH a 5 MnR MnP Ca2+: MnP+sacaros 130 g/l Medio MnP + Estracto de levadura 2.5 g/l CaCI22H20, 50 mM Glucosa 2.5 g/l Ajuste de Ph a 6.5 Agar 15 g/l MnR Suave: MnR únicamente con 7.5 g/l de agar MPC: CaCI2 50 mM pH 5.8 MOPS 10mM PEG 40% Medios para selección y cultivos: GS: Glucosa 10 g/l Biosoyasa 5 g/l (Merieux) Agar 15 g/l El pH debe ser de 6.8 PDA: Agar de dextrosa de papa (Difco) 39 g/l: El pH debe ser de 5.5 MPG: Basel madels con 5 g/l Ftalato K 30 g/l Estracto de levadura 5 g/l IC1 0.5 g/L K2HP04 Ph 7.0 0.15 g/L MgS04-7H20 0.05 g/L KC1 0.007 g/L FeS04-7H20 1 g/L estracto de levadura (únicamente KAT) 10 g/L Peptona o farmamedio 10 g/L lactosa 10 g/L glucosa El medio de regeneración (MnR) suplementado con 50 µg/ml de fleomicina o de 1 00 a 1 50 µg/ml de higromicina, se utilizó para seleccionar los transformadores. El medio GS, suplementado con 5 µg/ml de fleomicina, se utilizó para confirmar la resistencia a antibióticos. PDA es un medio completo para crecimiento rápido y una buena esporulación . Los medio líquidos son inoculados con 1 /20 de suspensión de esporas (todas las esporas a partir de una placa PDA de 90mm en 5 ml 0.1 %Tween). Tales cultivos son desarrollados a una temperatura de 27°C en recipientes de agitación (200 rpm). Se probaron don cepas Chrysosporium C 1 no transformado y una cepa de referencia Trichoderma resei en dos medios (GS pH 6.8 y Pridham agar PA, pH 6.8) . para probar el nivel de resistencia a antibióticos, las esporas fueron recolectadas de las placas de PDA de siete d ías. Las placas selectivas fueron incubadas a una temperatura de 32°C y marcadas después de 2, 4 y 5 d ías. Las cepas C-1 BG7C-1 9 y UV1 8-25 tuvieron claramente un bajo nivel de resistencia basal, tanto para fleomicina como para h igromicina, comparable con la de una cepa de laboratorio T. reesei de referencia. Esta es una indicación clara de q ue estos marcadores seleccionables fúngicos estándar se pueden utilizar en cepas Chrysosporium. No se esperan con otros marcadores seleccionables fúngicos estándar. Se llevó a cabo en forma exitosa en 500 ug/ml la selección de las cepas de Chrysosporium transformada Sh-ble (resistencia a fleomicina) . Este también fue el nivel de selección utilizado para T. reesei, mostrando de este modo que la selección diferencial se puede lograr fácilmente en Chrysosporium. Los mismos comentarios son válidos para cepas transformadas para resistencia a higromicina en un nivel de 1 50 µg/ml. Se utilizó la técnica de transformación de protoplastos en Chrysosporium con base la tecnología de transformación fúngica más generalmente aplicada. Todas las esporas de una placa PDA 90mm , fueron recuperadas en 8 ml y C1 y transferidas en un recipiente de agitación de un medio IC 1 de 50 ml para incubación de 1 5 horas a una temperatura de 35°C y 200 rpm . Después de que este cultivo fue centrifugado, el pelet se lavó en Mn P, se llevó a la solución en 1 0 ml de MnP y 10 mg/ml de Cailasa C3, y se incubó durante 30 minutos a una temperatura de 35°C con agitación (1 50 rpm) . La solución se filtró y el filtrado se sometió a centrifugación durante 1 0 minutos a 3500 rpm. El pelet fue lavado con 1 0 ml de Mn P Ca2+. Este fue centrifugado du rante 10 minutos a una temperatura de 25°C. Posteriormente, se ag regaron 50 microlitros de MPC frío. La mezcla se mantuvo en hielo durante 30 minutos, en donde se agregó 2.5 ml de PMC . Después de 1 5 minutos a temperatura ambiente, se mezclaron 500 microlitros de los protoplastos tratados con 3 ml de Mn R suave e inmediatamente se plaquearon en una placa MnR que contiene fleomicina o higromicina como el agente de selección . Después de la incubación durante 5 días a una temperatura de 30°C, se analizaron los transformadores .kj i ?..? .„.-.* .-.ft, itt.-.a,. -,. ,.. . J.ÜI. -.SMLÍ, ^ ~±-.?.~. BÍ*.Í ,I A (los clones se volvieron visibles después de 48 horas). La eficiencia de transformación se determinó utilizando 1 0 µg del plásmido pAN8-1 de referencia. Los resultados se presentan en la tabla C que se presenta a continuación . Tabla C: Eficiencia de transformación (utilizando 10 µg del plásmido pAN8-1 de referencia ) Los resultados mostraron que la viabilidad del transformador de Chrysosporium es superior a la del Trichoderma. La capacidad de transformación de las cepas, es comparable y por lo tanto el número de transformadores obtenidos en un experimento es 4 veces mayor para Chrysosporium que para T. reesei. Por lo tanto, el sistema de transformación de Chrysosporium no únicamente se ig uala al sistema de T. reesei comúnmente utilizado, sino que incluso lo supera (revisar esta traducción) esta mejora puede probar una utilidad especialmente para vectores que tienen u na transformación menos eficiente que pAN8-1 . Se construyó un número de plásmidos de transformación de expresión con la proteína Chrysosporium homologa que codifica las secuencias, y también con la proteína heteróloga que codifica las secuencias para utilizarse en experimentos de transformación j« I ? .1 ?A hA*í conclusos. En las figuras de la 6 a la 1 1 se proporcionan los mapas del vector. La proteína homologa que será expresada , se seleccionó del grupo de celulasas producidas mediante Chrysosporium y consistió 5 de endogluconasa 6 que pertenece a la familia 6 (MW 43 kDa) y la proteína heteróloga fue endoglucanasa 3 que pertenece a la familia 12 (MW 24 kDa) de Penicillium . pF6g comprende el fragmento del promotor de endoglucanasa 6 de Chrysosporium enlazado a la secuencia de señal de 0 endoglucanasa 6 con la estructura de la lectura abierta de endoglucanasa 6 seguida de la secuencia de terminación de endoglucanasa 6. Se llevó a cabo la selección del transformador utilizando cotransformación con un vector seleccionable. pUT1 1 50 comprende el promotor de celobiohidrolasa Trichoderma reesei enlazado a la secuencia de señal de endoglucanasa 6 en la estructura con la estructura de lectura abierta de endoglucanasa 6 seguida de la secuencia de terminación de celobiohidrolasa de T. reesei. Además este vector transporta una segunda cinta de expresión con un marcador de selección, por ejemplo, el gen de resistencia a fleomicina (gen Sh-ble). pUT1 1 52 comprende el promotor de dehidrogenasa A de i* gliceraldehído-3-fosfato Aspergillus nidulans enlazado a la secuencia de señal de endoglucanasa 6 en la estructura con la estructura de lectura abierta de endoglucanasa 6 seguido de la secuencia de terminación de sintasa de antranilato de A. nidulans (trpC) . Además, este vector transporta una segunda cinta de expresión con un marcador de selección , por ejemplo, el gen de resistencia a fleomicina (gen Sh-ble) . pUT1 1 55 comprende un promotor de dehidrogenasa A de gliceraldeh ído-3-fosfato de A. nidulans enlazado a la secuencia de señal de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei en la estructura con el Sh-ble de proteína transportadora, el cual a su vez es enlazado a la estructura de lectura abierta de endoglucanasa 6 seguido de la secuencia de terminación de A. nidulans trpC. Este vector utiliza la tecnología de la proteína transportadora fusionada a la proteína de interés, la cual es conocida por mejorar en gran parte la secreción de la proteína de interés. pUT1 160 comprende el promotor de dehidrogenasa A de gliceraldehído-3-fosfato de Aspergillus nidulans enlazado a la secuencia de señal de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei en la estructura con la proteína transportadora Sh-ble la cual a su vez, está enlazada a la estructura de lectura abierta de endoglucanasa 3 de Penicillium seguido de la secuencia de terminación A. nidulans trpC. pUT1 162 comprende el promotor de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei enlazado a la secuencia de señal de endoglucanasa 3 en la estructu ra con la estructura de lectura abierta de endoglucanasa 3 de Penicillium seguido de la secuencia de terminación de celobiohidrolasa de T. reesei. Además este vector i.A..i -J..^ -..¿..«ai--t.il.» -A,^- transporta una segunda cinta de expresión con el marcador de selección asa del gen de resistencia a fleomicina (gen Sh-ble). Los expertos en la materia apreciaran que una muestra de ADN genómico o cADN puede ser fácilmente cortada o digerida en fragmentos de codificación de proteína, y los fragmentos ligados en vectores, tales como los ilustrados en la presente invención , para producir u na biblioteca de vectores de expresión . Se apreciará además que los métodos que emplean una cotransfección , son aplicables y que los vectores de réplica autónoma o vectores de integración se pueden emplear para transfectar el hongo filamentoso con una biblioteca de vectores.

-"" Q Tt d'.íAorm m t ¿ h (I •X La tabla D, muestra los resultados de la transformación tanto de Chrysosporium UV1 8-25 como de Tolypocladium geodes. El protocolo de transformación utilizado, se describirá más adelante en la sección de transformación heteróloga.

D. EXPRESIÓN HETEROLOGA Y HOMOLOGA EN TRANSFORMADORES CHRYSOSPORIUM Se probaron cepas C 1 (NG7C-1 9 y/o UV1 8-25) según su habilidad para segregar varias proteínas heterólogas: una proteína bacteriana (proteína de resistencia a fleomicina Streptoalloteichus hind ustanus, Sh-ble), una proteína fúngica (xilanasa de Trichoderma reesei I I , XYN2) y una proteína humana (la lisozima humana, HLZ). Los detalles de los procesos se encuentran a continuación : (1 ) Secreción C 1 de proteína de resistencia fleomicina Streptoalloteichus hindustanus (Sh-ble) . Se transformaron las cepas C1 NG7C-1 9 y UV1 8-25 mediante el plásmido pUT720 (ref. 1 ). Este vector presenta la siguiente cinta de expresión fúngica: - Promotor de dehidrogenasa de gliceraldeh ído-3-fosfato de Aspergillus nidulans (gpdA) (ref. 2) . - Una secuencia de señal sintética de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei I (cbh P (refs. 1 , 3) . Gen de resistencia a fleomicina Streptoalloteichus hindustanus Sh-ble (ref. 4). - Term inador de triptofán-sintasa de Aspergillus nidulans (trpC) (ref. 5) . El vector también transporta el gen de beta-lactamasa (bla) y el origen de réplica de E. coli a partir del plásmido pUC 1 8 (ref. 6). En la figura 2, se proporciona el mapa detallado del plásmido.

Se transformaron los protoplastos C 1 de acuerdo a Durand y Asociados (ref. 7) adaptados hacia C 1 : Todas las esporas de una placa PDA de 90mm de la cepa C 1 no transformada fueron recuperados en 8ml IC 1 y transferidos en un frasco de agitación con 50ml del medio IC 1 para incubación durante 1 5 horas a una temperatura de 35°C y 1 50 rpm . Acto seguido, el cultivo se hiló, el pellet se lavó en MnP, se resolvió en 1 0ml de Mn P + 10mg/ml de Cailasa C3, y se incubó 30 minutos a una temperatura de 35°C con agitación ( 1 50 rpm) La solución se filtró y el filtrado fue centrifugado durante 10 minutos a 3500 rpm . El pellet fue lavado con 1 0ml de Mn PCa2+. Este se hiló durante 1 0 minutos a 3500rpm y se recolectó el pellet en 1 ml de Mn PCa2+. Se agregaron 1 0µg de ADN pUT720 a 200µl de solución de protoplasto y se incubo durante 10 minutos a temperatura ambiente (ca. 20°C) . Posteriormente, se agregaron 50µl de MPC frío. La mezcla se mantuvo en hielo durante 30 minutos, en donde se agregó 2.5ml de PMC . Después de 1 5 minutos a temperatura ambiente, se mezclaron 500µl de los protoplastos tratados para 3ml de MnR Suave e inmediatamente se plaquearon en una placa MnR que contiene fleomicina (50µg/ml a pH6.5) como el agente de selección . Después de 5 d ías de incubación a una temperatura de 30°C, los transformadores fueron analizados (los clones comenzaron a ser visibles después de 48 horas). La producción Sh-ble de los transformadores C 1 (clones resistentes a fleomicina) se analizó tal como sigue: se recolectaron los dientes de los transformadores primarios para placas de t A . A--.-j--AA-a.-AH-- -. «-• -«-* A^^^^^i *j* « AA GS+fleomicina (5 µg/ml) y se desarrollaron durante 5 días a una temperatura de 32°C para la verificación de resistencia. Se subclonó cada clon resistente validado en placas GS. Se utilizaron dos subclones por transformador para inocular placas PDA con el objeto de obtener esporas para el inicio del cultivo líquido. Los cultivos líquidos en IC 1 fueron desarrollados durante 5 días a una temperatu ra de 27°C (agitación a 200 rpm) . Posteriormente, los cultivos fueron centrifugados (5000g , 10min .) y se recolectaron 500 µl de sobrenadante. A partir de estas muestras, las proteínas fueron precipitadas con TCA y suspendidas nuevamente en un Amortiguador de Muestra Western para 4 mg/ml de las proteínas totales (método Lowry, Ref. 8). Se cargaron 1 0µl (aproximadamente 40µg de las proteínas totales) en un gel de acrilamida/SDS al 12% y corrieron (sistema Mini trans-Blot™, BioRad Laboratories) . Se llevó a cabo el manchado Western de acuerdo con las instrucciones de BioRad (membrana de 0.2µm de Schleicher & Sch ull) utilizando antisuero de anti-Sh-ble de conejo (Societe Cayla, Tolouse FR, Catálogo # ANTI-001 0) como el anticuerpo primario. Los resultados se muestran en la figura 1 y en la tabla E. Tabla E: Niveles de producción estimados de Sh-ble en Cl Estos datos muestran que: 1 ) Las señales de transcripción/traducción heteróloga a partir de pUT720, son funcionales en Chrysosporium. 2) La secuencia de señal heteróloga de pUT720 es funcional en Chrysosporium. 3) El Chrysosporium puede utilizar un huésped para la secreción de proteínas bacterianas heterólogas. (2) Secreción C 1 de lisozima humana (HLZ) . Se transformaron cepas C1 NG7C-1 9 y UV1 8-25 mediante el plásmido pUT970G (ref. 9) . Este vector presenta las siguiente cinta de expresión fúngica: - Promotor de dehidrogenasa de glicerilaldehído-3-fosfato de Aspergillus nidulans (gpdA) (ref. 2). - Una secuencia de señal sintética de celobiohidrolasa de Trichoderma reesei I (cbh l ) (refs. 1 , 3) . - El gen de resistencia fleomicina de Streptoalloteichus hindustanus Sh-ble utilizado como proteína transportadora (ref. 1 0) . - Dominio de articulación de glucoamilasa de Aspergillus niger (glaA2) a partir del plásmido pAN56-2 (refs. 1 1 , 1 2) . - Un péptido enlazador (LGERK) que presenta un sitio de disociación de proteasa similar a KEX2 (ref. 1 ). - Un gen sintético de lisozima humana (hlz) (ref. 10) . - Terminador de triptofán-sintasa de Aspergillus nidulans (trpC) (ref. 5) .

- El vector también transporta el gen beta-lactamasa (bla) y el origen de réplica E. coli a partir del plásmido pUC 1 8-6. En la figura 3, se proporciona el mapa detallado del plásmido. Se transformaron protoplastos C1 con el plásmido pUT970G siguiendo el mismo procedimiento ya descrito en el ejemplo 1 . La proteína de fusión (Sh-ble : : articulación GAM : : H LZ) es funcional con respecto a la resistencia a fleomicina, permitiendo de este modo la fácil selección de los transformadores C1 . Además, el nivel de resistencia a fleomicina se correlaciona aproximadamente con el nivel de expresión hlz. La producción HLZ de los transformadores C1 (clones resistentes a fleom icina) , se analizó a través del ensayo de actividad de lisozima, tal como sigue: se recolectaron los dientes de los transformadores primarios para placas GS+fleomicina (5µg/ml) (verificación de resistencia) y también sobre placas LYSO (detección de actividad HLZ mediante vísualización de zona de aclaramiento (refs. 1 , 1 0). Las placas fueron desarrolladas durante 5 días a una temperatura de 32°C . Cada clon validado fue subclonado en placas LYSO. Se utilizaron dos subclones por transformador para inocular las placas PDA con el objeto de obtener esporas para el inicio de un cultivo líquido. Los cultivos líquidos en IC 1 fueron desarrollados durante 5 d ías a una temperatura de 27°C (agitación a 1 80 rpm) .

Posteriormente, los cultivos fueron centrifugados (5000g , 10 min.). A partir de estas muestras, se midió la actividad de lisozima de acuerdo con Mórsky y Asociados (ref. 1 3). ? i y i JL ti^.

Tabla F: Niveles de producción de HLZ activo en Cl Estos datos muestran que: 1 ) Están confirmados los puntos 1 y 2 del ejemplo 1 . 2) Sh-ble es funcional en Chrysosporium como marcador de resistencia. 3) Sh-ble es funcional en Chrysosporium como proteína transportadora. 4) El sitio de disociación de proteasa similar a KEX2 es funcional en Chrysosporium (de otra manera H LZ no podría ser activo) . 5) Se puede utilizar Chrysosporium como huésped para la secreción de proteínas mamíferas heterólogas. (3) Secreción C 1 de xilanasa de Trichoderma reesei I I (XYN2).

Se transformó la cepa C1 UV18-25 a través de los plásmidos pUT1 064 y pUT1 065. El pUT1 064 presenta las dos siguientes cintas de expresión fúngica. La primera cinta permite la selección de transformadores resistentes a fleomicina: - Promotor del gen de control de la trayectoria cruzada de Neuróspora crassa 1 (cpc-1) (ref. 14). Gen de resistencia a fleomicina Streptoalloteichus hindustanus Sh-ble (ref.4). - Terminador de triptofán-sintasa de Aspergillus nidulans (trpC) (ref.5). La segunda cinta es la cinta de producción de xilanasa: - Promotor de la cepa T. reesei TR2 cbhl (ref. 15). - Gen de la cepa T. reesei TR2xyn2 (incluyendo su secuencia de señal) (ref. 16). - Terminador de la cepa T. reesei TR2 cbhl (ref. 15) El vector también transporta un origen de réplica de E. coli a partir del plásmido pUC19 (ref. 6). En la figura 4, se proporciona el mapa detallado del plásmido. pUT1065 presenta la siguiente cinta de expresión fúngica: - Promotor de dehidrogenasa de glicerílaldehído-3-fosfato de A. nidulans (gpdA)(ref.2). - Secuencia de señal sintética de celobiohidrolasa de T. reesei I (cbhl) (refs. 1, 3). - Gen de resistencia a fleomicina de S. hindustanus Sh-ble 4 utilizado como una proteína transportadora (ref. 10). - Un péptido de enlace (SGERK) que presenta un sitio de disociación de proteasa similar a KEX2 (ref. 1). - Gen de la cepa T. reesei TR2xyn2 (sin secuencia de señal) (ref. 16). «¡til lif-ít lili tiltil f IT ÉHHÉITII Í - *-•> - -• - — - - • - -•*">*"«-•*"* ^-*- - ~~- r n-„n?< µ .

Un terminador de triptofán-sintasa de A. nidulans (trpC) (ref. 5) . El vector también transporta el gen beta-lactamasa (bla) y un origen de réplica de E. coli a partir del plásmido pUC 18 (ref. 6) . En la figura 5, se proporciona el mapa detallado del plásmido. Los protoplastos C 1 fueron transformados con el plásmido pUT1 064 o pUT1065 siguiendo el mismo procedimiento ya descrito en el ejemplo 1 . La proteína de fusión en el plásmido pUT1605 (Sh- ble : : XYN2) es funcional con respecto a la resistencia a fleomicina, permitiendo de este modo una fácil selección de los transformadores C 1 . Además, el nivel de resistencia de fleomicina se relaciona a aproximadamente con el nivel de expresión xyn2. En pUT1 064, se clonó xyn2 con su propia secuencia de señal. La producción de xilanasa de los transformadores C 1 (clones resistentes a fleomicina) , se analizó mediante el ensayo de actividad de xilanasa tal como sigue: se recolectaron los dientes de los transformadores primarios, para placas GS+fleomicina (5µg/ml) (verificación de resistencia) y también sobre placas XYLAN (ref. 1 7) , en donde la actividad de xilanasa se detectó mediante la observación de una zona de aclaramiento. Las placas fueron desarrolladas durante 5 días a una temperatura de 32°C . Cada clon validado fue subclonado en placas XYLAN . Se utilizaron dos subclones por transformador para inocular placas PDA con el objeto de obtener esporas para la inoculación de cultivo líquido. Los cultivos líquidos en IC 1 + 5g/l K+ Ftalato fueron desarrolladas durante 5 días a una temperatura de 27°C (agitación 1 80 rpm). Posteriormente, los cultivos fueron centrifugados (5000g, 10 min.). A partir de estas muestras, se inhibió la actividad de xilanasa a través de la técnica DNS de acuerdo con Miller y Asociados (ref. 18).

Tabla G: Niveles de producción de XYNZ activo en Cl (mejores productos) Estos datos muestran que: 1 ) Están confirmados los puntos del 1 al 4 del ejemplo 2. 2) C 1 se puede utilizar como huésped para la secreción de proteínas fúngicas heterólogas. (4) Resumen La tabla H muestra los resultados de los plásmidos con los que se llevó a cabo la transformación de UV1 8-25. La tabla muestra los niveles de expresión de endoglucanasa y celobiohidrolasa utilizando secuencias de regulación de expresión heterólogas y secuencias de señal, y también consecuencias de regulación de expresión homologa y secuencias de señal. Los detalles de los diferentes plásmidos se pueden derivar en cualquier parte dentro de la descripción y de las figuras. La producción surge con un pH alcalino a una temperatura de 35°C. fahtMfa-1-.il-átt---..Lit-itH. --L* J t. . - - ,- *,...— *v. a. A.^. .-,-,. ..a~±**.**m...* -...&*. - ... a..^,JA& A i.A-- Í-É- Tabla H: Datos de expresión de la cepa UV18-25 transformada (% relativo a la cepa UV18-25 paterna) Proteínas totales C Casa ß-glucanosa Valor de pH Cultivo mg/ml u/mi u/mg u/ml u/mg UV18-25 100% 100% 100% 100% 100% 7.9 1150-23 94% 105% 111% 140% 149% 7.9 -30 96% 105% 110% 145% 151% 8.1 1152-3 94% 112% 120% 147% 156% 7.85 -4 100% 105% 105% 132% 132% 7.9 1160-2 69% 81 % 118% 90% 131 % 7.9 -4 73% 72% 98% 83% 114% 8.35 -1 92% 95% 103% 120% 130% 8.45 1162-1 102% 105% 103% 145% 142% 8.2 -11 112% 109% 98% 115% 103% 8.2 F6g-20 104% 102% 98% 130% 125% 7.9 -25 Condiciones de cu! Itivo (frasco de agitación): 88h, 35°, 23° rpm E. CONSTRUCCIÓN DE UNA BIBLIOTECA DEL GEN ASPERGILLUS SOJAE (1 ) Biblioteca del Vector El ADN genómico de A. sojae fue aislado de los protoplastos obtenidos a partir de ATCC 1 1 906 utilizando un protocolo descrito previamente (Punt, van den Hondel, Métodos de Enzimología. 1992 216:447-457) . Después del aislamiento, se extracto el ADN de los protoplastos utilizando el protocolo descrito por Kolar y Asociados, Gen 1988 62: 127-34. De manera subsecuente, el ADN fue parcialmente digerido con Mbol para dar como resultado fragmentos de ADN de un tamaño promedio de 30 a 50 kb. El vector pAOpyrGcosarpl , el cual se utilizó para la construcción de la biblioteca del gen se construyó mediante ligación de un fragmento BamH I-Hindl l 3 kb de pANsCosI (Osiewacs, Genética Corriente 1 994 26:87-90) y un fragmento de Acc651 -Hindll l i¡á j.A.aA.-t-tt¿¿ - •Á.ij. . ^^^ ..--t---a.j-rf.4j- , 3.2 kb de pAO4.2 (De Ruiter-Jacobs y Asociados, Genética Corriente 1989 16:159-63) en el pHELPI digerido por Acc65l-BamHI (Gems y Asociados, Gen 1991 98:61-67). El vector cósmido transporta el marcador de selección A. oryzae pyrG y su autoréplica en hongos filamentosos. El ADN genómico digerido por Mbol fue ligado a pAOpyrGcosarpl , digerido por BamHl, y la mezcla de ligación fue empacada en partículas de fago utilizando el equipo de vector Estratagén Supéreos 1 (Estratagén Inc., La Jolla CA). Esto dio como resultado un total de ca. 30,000 clones individuales, que representan un aproximado de una representación de 30 pliegues del genoma A. sojae. Se almacenaron las pilas (en 15% de glicerol) de los grupos de los clones resultantes a una temperatura de -80°C para uso posterior. (2) Transformación de alta frecuencia Se seleccionó un mutante A. sojae ATCC 11906 pyrG como un derivado resistente a ácido fluoro-orótico del ATCC 11906, tal como se describe en la solicitud WO 01/09352. Esta cepa, A. sojae ATCC 11906pyrG, fue transformada con dos vectores que transportan el gen A. niger pyrG. Un vector pAB4-1 (van Hartingsveldt y Asociados, Genet. Gen. Mol. 206:71-75 (1987)) transporta únicamente el gen pyrG, mientras que pAB4-arp1 (Verdoes y Asociados, Gen 146:159-165 (1194)) transporta el gen pyrG y la secuencia A. nidulans AMA1. La transformación de ATCC 11906pyrG dio como resultado de 5 a 10 transformadores por microgramo de ADN de pAB4-1, mientras que con la frecuencia pAB4-arp1 fue por lo menos de 1 0 a 1 00 pliegues superior. El análisis fenotípico de los transformadores reveló que el fenotipo pyrG de los transformadores pAB4-arp1 se mantuvo únicamente bajo selección continua, mientras que los transformadores pAB4-1 fueron estables con y sin selección del fenotipo pyrG . Estos resultados confirman la réplica autónoma del ADN de plásmido introducido en transformadores pAB4-arp1 . Se obtuvieron resultados similares con vectores de transformación fúngica alternativos que transportan la secuencia AMA1 o derivados de la misma, por ejemplo, pAOpyrGcosarpl . (3) Construcción de una biblioteca de transformador fúngico Un mutante A. sojae ATCC 1 1 906pyrG o mutantes relevantes, en particular mutantes de morfolog ía compacta de los mismos, fue transformado con una biblioteca del gen A. sojae con base en el vector de transformación pAOpyrGcosarpl . Este vector dio como resultado una alta frecuencia de transformadores con copias de vector de réplica libre. Los protoplastos fúngicos fueron tratados tal como se describe en Punt y van den Hondel, Métodos de Enzimología 1992 21 6:447-457 con ADN procedente de una biblioteca cósmida que transporta clones de ADN fúngico genómico a partir de A. sojae o Chrysosporium y diluciones en serie y se plaquearon protoplastos transformados en placas de agar selectivas para determinar la frecuencia de transformación obtenida . Los protoplastos restantes fueron regenerados en un medio selectivo durante algunas horas y se almacenaron a una temperatura de 4°C. *-"*-»'-' -* * í *kÁ¿ Con base en los resultados obtenidos de la frecuencia de transformación (la cual depende del experimento alcanzará valores de hasta varios miles de transformadores por m icrogramo de ADN de biblioteca cósmida), se plaquearon las diluciones de limitación de los protoplastos regenerados en placas de microtitulación de 96,248 o algún formato de depósitos alternativo, dando como resultado un protoplasto transformado por depósito. Las placas fueron incubadas a una temperatura de 35°C para formar biomasa fúngica. La biblioteca del transformador resultante, se utilizó para experimentos posteriores. Se utilizó una estrategia similar para la construcción de una recolección de transformadores fúngicos que llevan alelos mutantes de Chrysosporium CBH 1 . Esta estrategia también se puede utilizar con una biblioteca de mutantes derivada de cualquier otro gen de interés, si se generó a través de métodos de mutagénesis, revoltura de gen o evolución de gen . F. I N DUCC IÓN DE ESPORULACIÓN EN FERM ENTACIÓN SUMERGIDA Muchos hongos, tales como Aspergillus sojae, no muestran esporulación bajo fermentación sumergida. Aquí describimos un método no conocido anteriormente para obtener esporulación bajo estas condiciones. A. sojae ATCC 1 1 906 y en particular, mutantes de morfología de crecimiento compacto del mismo, fueron desarrollados en un medio de crecimiento sintético suplementado con extracto de levadura. Bajo estas condiciones, ocurre una rápida combinación de i ,. jj. ahi n biomasa tanto en cultivos estáticos como agitados. Sin embargo, no ocurrió esporulación en el fluido del cultivo. U n medio de crecimiento similar con la adición de 0.6 g/kg EDTA, dio como resultado producciones considerables de esporas que alcanzan hasta esporas de 109 por ml de fluido de cultivo después de la incubación de 2 a 4 días a una temperatura de 35°C. MEDIO SINTÉTICO (+/- EDTA): medio g/kg KH2PO4 2.5 N NHH44CC11 7.2 MgSO4.7H20 0.7 CaC12.2H20 0.2 Extracto de Yeast 20 ZnSO4.7H20 0.015 CoCI2.6H20 0.005 CuSO4.5H20 0.016 FeSO4.7H20 0.040 H3BO4 0.005 Kl 0.003 M MnnCC 1122..22HH2200 0.01 2 Na2MoO4.2H20 0.003 EDTA (0.6 o 0.0) El PH se ajustó a 5.5 con NaOH/H3PO4 G. SISTEMAS DE TRANSFORMACIÓN PARA CHRYSOSPORIUM Y ASPERGILLUS ? . ,¿ ?¡Á* ? M ^^j*^^A <as^^*r£í #jí3 A^^^^^, (1 ) Clonación del gen de transferasa de p-ribosilo de orotato A. niger pyrE Numerosos sistemas de transformación versátil para hongos filamentosos, se basan en el uso de cepas mutantes que requieren uridina. Estas cepas mutantes son ya sea deficientes en decarboxilasa de fosfato de orotidina 5 (OMPD) o transferasa de p- ribocilo de orotato (OPRT) . (T. Goosen y Asociados, Genética Corriente 1 987, 1 1 :499-503; J. Begueret y Asociados, Gen 1984 32:487-92). Anteriormente hemos aislado el gen de A. niger OMPD pyrG (W. van Hartingsveldt y Asociados, Genet. Gen . Mol. 1 987 206:71 -5). La clonación del gen A. niger OPRT (pyrE) se llevó a cabo a través de la complementación de un mutante sin pyrG que requiere uridina resistente a FOA de A. niger. Para complemento, se utilizó una biblioteca cósmida A. niger en el vector pAOpyrGcosarp 1 . A partir de la complementación de los transformadores, se aislaron clones cósmidos genómicos, transportando el gen de complementación A. niger, determinado ahora como pyrE. Se clonó un fragmento Sstl l 5.5 kb que transporta el gen pyrE en pBLU ESCRI PT ™ (Estratagén) dando como resultado el vector pBLUEpyrE. Se secuenció un fragmento de 1 .6 kb de este vector que extiende la región de codificación pyrE para confirmar la ubicación del gen OPRT (ver fig . 1 5). (2) Sistema de transformación auxotrófica para Chrvsosporium lucknowense Se seleccionaron cepas de Chrysosporium lucknowense que requieren uridina como derivados resistentes al ácido fluoro-orótico derivados de C1 y UV18-25, a través de los métodos descritos en la publicación PCT WO 01 /09352 La selección de los derivados resistentes al ácido fluoro-orótíco, puede dar como resultado el aislamiento de dos tipos de mutantes que requieren uridina, por ejemplo, ya sea mutantes de decarboxilasa de fosfato de orotidina 5 (OMPD) o mutantes de transferasa de p-ribosilo de orotato (OPRT) (T. Goosen y Asociados, Genet. Corr. 1987, 1 1 :499-503). Para determinar la naturaleza de los mutantes de Chrysosporium obtenidos, se llevaron a cabo experimentos de transformación con los genes de A. niger pyrG disponibles (OMPD; vector pAB4-1 , W. van Hartingsveldt y Asociados, Genet. Gen. Mol. 1987 206:71 -5) y pyrE (pBLUE-pyrE; OPRT). Tal como se muestra en la tabla 1 , únicamente la transformación de las cepas mutantes con el gen pyrE dio como resultado transformadores prototróficos, implicando que las cepas de Chrysosporium son mutantes OPRT. Hemos adoptado que después de la nomenclatura del gen de Chrysosporium, los mutantes fueron designados como pyr5. (pyrE/pyrd) * 1. pAB4-1: W. van Hartingsveldt y Asociados, Genet. Gen. Mol. 1987206:71-5. 2. pAO4-2: Y. de Rutier-Jacobs y Asociados, Genet. Corr. 198916:159-63. 3. pDJB3: D. Ballance, G. Turner, Genet. Gen. Mol. 1986 202:271-5. 4. pBLUEpyrE: vide supra (3) Construcción v uso de vectores de transformación fúngica de réplica autónoma. Con base en el vector pBLUEpyrE, se generaron dos derivados que transportan secuencias que proporcionan características de réplica autónoma para los vectores, cuando se introducen en hongos filamentosos. Un fragmento Hindlll 5.5 kb que transporta las secuencias de Aspergillus nidulans AMA1 (J. Verdoes y Asociados, Gen 1994 146:159-65), se introdujo en el único sitio Hindlll de pBLUEpyrE dando como resultado pBLUEpyrE-AMA. Se introdujo un fragmento Hind 111 (parcial) 2.1 kb que transporta secuencias teloméricas humanas (A. Aleksenko, L. Ivanova, Genet. Gen. Mol. 1998 260:159-64) en el único sitio Hindlll de pBLUEpyrE dando como resultado pBLUEpyrE-TEL. Estos vectores fueron introducidos en las cepas del mutante Aspergillus y Chrysosporium OPRT dando como resultado transformadores prototrópicos. Varios de los transformadores obtenidos mostraron las características de fenotipo y regular de los transformadores que transportan plásmidos de réplica libre (J. Verdoes y Asociados, Gen 1994146:159-65). .-,:-. j -.-,, .i-,. í-.,-a-? . ¡ •» (4) Transformación de Chrvsosporium l?cknowense El protocolo se basó en un procedimiento utilizado originalmente para la transformación de Aspergillus (P. Punt, C. van den Hondel, Métodos en Enzimología 1992 216:447-457). Se inoculó el medio rico (250 ml) con esporas 106/ml del mutante de Chrysosporium pyr5 (supra) en un frasco de Erlenmeyer de 1 L. El cultivo fue desarrollado durante de 24 a 48 horas a una temperatura de 35°C en un incubador de aire (300 rpm). El micelio fue filtrado a través de un filtro estéril Miracloth(TM) (Calbiochem) y se lavó con ca. 100 ml 1700 mosmol NaCI/CaC12 (0.27 M CaC12/ 0.6 M NaC1 ). El micelio fue pesado y posteriormente se mantuvo en hielo. Se agregó Cailasa(TM) (Caila) (20 mg por gramo de micelio) y 1700 mosmol NaC1 /CaC12 (3.3ml/g micelio) y la suspensión 4 fue incubada en un incubador de aire a una temperatura de 33°C (100 rpm). El protoplasteo fue seguido bajo el microscopio. Después de 1 a 3 horas de incubación, la mayor parte del micelio fue digerido, dejando la mayoría de los protoplastos en la vista del microscopio de la preparación. Los protoplastos fueron filtrados a través de un filtro estéril Myracloth y el filtro fue lavado con un volumen de STC1700 frío (1 .2 M sorbitol/10 mM Tris. HCI pH 7.5/ 50 mM CaC12/ 35 mM NaC1 ). Los protoplastos fueron hilados a 2500 rpm durante 10 minutos a una temperatura de 4°C. El pellet fue suspendido nuevamente en STC1700 y centrifugado otra vez. Después de suspender nuevamente el pellet en STC1700, se contaron los » protoplastos. El STC1 700 fue agregado para una concentración final de protoplastos de 2 x 108 por ml. El ADN del vector (pAB4-1 o pBLU E-pyrE, 1 -1 0 µg) fue pipeteado en el fondo de un tubo estéril y se agregaron al ADN 1 µl de ATA 1 M (ácido aurintricarbónico) y 100 µl de protoplastos (ca. 2 x 107) . Se incluyó en el experimento un control negativo de ADN menor. Después del mezclado, los protoplastos fueron incubados a temperatura ambiente durante 25 minutos. Se agregó en porciones PEG6000 (60% PEG/50 mM CaC12/ 1 0 mM Tris pH 7.5) tal como sigue: 250 µl, mix, 250 µl, mix, 850 µl y mix. La solución se mantuvo a temperatura ambiente durante 20 minutos. Posteriormente, los tubos fueron llenados con 8 ml de STC1700, mezclados y centrifugados por 2500 rpm durante 10 minutos a una temperatura de 4°C, y el pellet fue suspendido en 250 µl de STC 1 700. Las alícuatas de la muestra se utilizaron para plaqueo en un medio selectivo. Para la selección pyr+, las placas fueron preparadas conteniendo 1 .5% de agar Daishin , 1 .2 M sorbitol, 1 x AspA con nitrato, 2mM MgSO4-7 H2O, 1 x de elementos de trazo, 0.1 % de casaminoácidos y 1 % de glucosa. Si se seleccionó amdS (y pyr+), las placas contenían 1 .5% de agar Oxoid, 1 .2 M sorbitol, 2mM MgSO4-7 H2O, 1 x elementos de trazo, 1 % glucosa, 1 x AsPA sin nitrato, 1 5mM CsC 1 y 10mM de acetamida o acrilamida. Las placas fueron incubadas a una temperatura de 30 ó 35°C. Las esporas y los protoplastos viables antes y después del tratamiento de PEG6000, fueron contadas plaqueando diluciones en .jH t * > STC 1 700 en placas de medio mínimo con nitrato y con o sin sorbitol. Se plaquearon 100 µl de 10"1 , 10"2 y 10 3 en placas sin sorbitol para el conteo de esporas y se plaquearon diluciones de 1 00 µl de 1 0"2, 10"3, 1 0~4 y 10"5 en placas con sorbitol para el conteo de protoplastos viables. Los resultados de las transformaciones se muestran en la tabla I . H . PROPORCION ES DE PROTEÍNA/BIOMASA Para las cepas de Chrysosporium, Trichoderma y Aspergillus que producen celu lasas o amilasas, se determ inaron los sólidos secos totales pasando una alícuota medida de todo el caldo a través de un filtro de prepesado, lavando con agua desionizada y secando la pasta y filtrando durante la noche a una temperatura de 60°C y durante 1 hora más a una temperatura de 1 00°C. Después del enfriamiento en un secador, la biomasa fue determinada substrayendo el peso del filtro del peso del filtro seco más la pasta del filtro y dividiéndolo entre el volumen del caldo removido. Para las cepas Trichoderma y Aspergillus, la biomasa fue asumida para ser igual a los sólidos secos totales, ya que existió poco material insoluble diferente a la biomasa en el momento en que se tomaron las medidas. Para las cepas de Chrysosporium que producen celulasa, existió una cantidad significativa de celulosa en el medio, por lo que se determinó la biomasa como la diferencia entre el total de sólidos secos y celulosa. La celulosa se ensayó tal como sigue: t.i j i ? .i X- .ML, Se centrifugaron alícuatas medidas de todo el caldo para remover sólidos y se eliminó el sobrenadante. El pellet fue suspendido nuevamente en un volumen de 0.1 N NaOH igual al volumen del caldo original y se agregó una décima del volumen de 0.5 N NaOH. La mezcla fue incubada durante cuatro horas a una temperatura de 65°C. Este tratamiento disolvió cualquier cosa excepto la celulosa. Se enfrió y centrifugó la mezcla alcalina, y se eliminó el sobrenadante. El pellet resultante fue lavado dos veces mediante resuspensión en agua desionizada y centrifugación. El pellet lavado fue resuspendido en agua desionizada, transferido a una cacerola pesada previamente y secado tal como se describió anteriormente. La concentración de celulosa se determinó dividiendo el peso seco entre el volumen de la alícuota ensayada. La proteína fue determinada por el procedimiento de enlace de tinte Bradford (M. Bradford, 1976, Anal. Bioquim. 72:248) utilizando un estándar de inmunoglobulina. Las proporciones de proteína/biomasa para las proteínas expresadas seleccionadas en varias cepas fúngicas filamentosas, se presentan en la tabla J. Tabla J É?-I A i ?,é.. Á?.^.^.

* I. EXPRESIÓN Y SECRECIÓN DE PROTEÍNA FLUORESCENTE VERDE EN A. SOJAE Y C. LUCKNOWENSE Como un ejemplo de una proteína reportera versátil y que se puede clasificar fácilmente, se expresó la Proteína Fluorescente Verde (GFP) procedente de Aequoria victoria de medusa en A. sojae y C. lucknowense. Se modificaron los vectores que transportan GFP (A. Santerre Henriksen y Asociados, Microbiología 1 999, 145:729- 734) y genes de fusión Glucoamilasa-GFP (pGPDGFP, C. Gordon y Asociados, Microbiología 2000 146:41 5-26) , reemplazando el promotor g l aA con el promotor de A. nidulans constitutivamente expresado gpdA. Los vectores fueron introducidos en A. sojae mediante cotransformación , utilizando ya sea el marcador de selección pyrG o amdS. El vector pGPDGFP y sus derivados fueron introducidos en Chrysosporium mediante cotransformación, utilizando ya sea el marcador de selección pyrE o amdS. La expresión dio como resultado los transformadores A. sojae y Chrysosporium brillantemente fluorescentes, confirmando la expresión de GFP mediante ambos vectores. La fluorescencia de los sobrenadantes del cultivo a partir de los transformadores que expresan la proteína de fusión Glucoamilasa-GFP, indicaron la secreción de la proteína de fusión fluorescentemente activa. La expresión de la proteína fluorescente también se observó en las esporas (o propágulos similares a esporas) obtenidas de los diferentes transformadores que expresan la versión citoplásmica no segregada de las proteínas fluorescentes. iAÍ ,* i .8 i fc -iA . > .i. -' :. . »...* -.- * J. TRANSFERENCIA DE UNIDADES DE CRECIMEINTO FÚNGICO Se cargaron los depósitos de una placa de microtitulación de 96 depósitos con un medio adecuado, ya sea en forma manual o con una pipeta de multicanal o por medio de un sistema de manejo de placa automático. Un gran volumen incrementa la oportunidad de infección cruzada, por lo que para evitar problemas con la evaporación el volumen no debe ser demasiado pequeño. Si se utiliza la placa de fondo redondo COSTAR(TM) 3799, por ejemplo, 150 µl es u n volumen adecuado para trabajar. Las placas son inoculadas con esporas procedentes de colonias de crecimiento de placa utilizando recolecciones de dientes para transferencia. De manera alternativa, las placas pueden ser inoculadas pipetizando pequeñas alícuotas de suspenciones de esporas, protoplastos o elementos hifales. Estas suspenciones pueden ser derivadas de soluciones de esporas/protoplastos aislados o de cultivos de esporulación de crecimiento en microplaca. La inoculación también se puede llevar a cabo a partir de placas de microtitulación con el uso de una aguja o una herramienta de 96 agujas. Subsecuentemente, las placas son incubadas a una temperatura de 35°C. Para minimizar la evaporación , se pueden emplear placas tapadas, o las placas pueden ser selladas con una membrana que permite el intercambio de O2, H2O y CO2 y se pega a la superficie de la placa. Para limitar adicionalmente la evaporación, se puede utilizar un incubador de atmósfera controlada. ,-,. . tfM .-... fc .-t-AM - +?J?t*b *?íi&. ?&ka?k± ?> ^-^ iAé t > Después de tres a cuatro días de incubación, la cantidad de biomasa es adecuada para transferirse en forma eficiente a nuevas placas de microtitulación que contienen un medio fresco. Para la preparación de placas de réplica, se utiliza una herramienta de 96 agujas. Las placas hijo que tienen diferentes ajustes de los cultivos, pueden ser preparadas mediante transferencia manual, o pipetización robótica o transferencia por aguja. Para asegurar la presencia de elementos de reproducción transferible en agujas de transferencia, la herramienta de agujas es sumergida en el cultivo de la placa de microtitulación y agitada durante 20 segundos. Posteriormente, la herramienta de agujas es removida cuidadosamente de la placa de partida y se hace una impresión en una nueva placa de microtitulación. También se puede lograr un procedimiento de transferencia similarmente eficiente utilizando una pipeta de multicanal, que transfiere aproximadamente 1 µl del cultivo de placa de microtitulación paterna. En ambos casos se logra la transferencia eficiente, debido a la presencia de los elementos reproductivos transferibles, tales como esporas, propágulos similares a esporas, protoplastos o fragmentos hifales o miceliales. Los protoplastos pueden ser generados en los depósitos de microplaca mediante el tratamiento con una pared celular que degrada las enzimas y posteriormente transfiere estos protoplastos. La formación de protoplastos en microplacas ha sido descrita por C. van Zeijl y Asociados, R. Biotecnología 1 997 59:221 -224. iÜ.tá Í ll. l S. í.-í,tÍ .L. ¿.XS.C - A i--,. -Arvf-. --t.ttK * Se obtiene una mejora adicional de la transferencia, incubando los cultivos de la placa de microtitulación en un agitador de placa de microtitulación a una temperatura de 35°C . Esto incrementa el número de elementos reproductivos transferibles en los cultivos. Para almacenar los cultivos de la placa de microtitulación, se agrega glicerol a una concentración final del 15%, y se almacenan las placas a una temperatura de -80°C. Para experimentos de transferencia subsecuentes, las placas son descongeladas y se lleva a cabo la transferencia tal como se describió anteriormente. La transferencia eficiente con cepas naturales o comerciales de A. niger y A. sojae no fue factible bajo las condiciones aquí utilizadas, ya que estas cepas mostraron crecimiento de superficie vigoroso y esporulación aerial después de un d ía. La esporulación aerial origina la contaminación cruzada masiva durante la transferencia, y el crecimiento de la superficie que cubre los depósitos, subsecuentemente excluye una gran proporción de los métodos de ensayo conocidos. K. CONSTRUCC IÓN DE UNA BI BLIOTECA DE EXPRESIÓN FÚNGICA PARA EL DESCUBRIM I ENTO DEL GEN Con base en el vector de expresión fúngica pAN52-1 NOT (EMBL acceso Z32524) o uno de sus derivados, se construyó un vector en el cual está presente un único sitio de clonación BamH l directamente en la corriente descendente del promotor del rango huésped fúngico expresado ampliamente en forma constitutiva para el gen de A. nidulans gpdA (P. Punt y Asociados, R. Biotecnología * V 1991 1 7: 19-33). Este vector fue construido de tal manera que los fragmentos de ADN genómico que transportan un codón de arranque de inicio de traducción (ATG) pueden ser expresados. Para proporcionar un marcador de selección para este vector, se clonó un fragmento de Notl-BamH I a partir de pBLU EpyrE en el vector de expresión digerido por Notl-Bg 1 11 denominado como pAN52-BamHI , dando como resultado el vector pAN52-pyrE. Los fragmentos de ADN genómico de Chrysosporium, en un rango de tamaño de 3 a 6 kb, fueron obtenidos mediante digestión parcial Sau3A. Después de la ligación de estos fragmentos en el vector pAN52-pyrE de expresión digerida por Bam H l , se obtuvo un número de clones recombinantes suficientes para cubrir completamente varias veces el genoma Chrysosporium. Se reunió un número de estos clones para cubrir por lo menos de 5 a 1 0 equivalentes de genoma fúngico. El ADN del plásmido de estos grupos, fue preparado y utilizado para la transformación de los mutantes Chrysosporium pyr5 o Aspergillus pyrE. Las recolecciones de transformadores fueron generadas en un formato de microplaca, tal como se describió anteriormente, y se utilizaron para clasificación de función/actividad adicional. De manera alternativa, se puede construir una biblioteca de expresión utilizando promotores de Chrysosporium específicamente regulados, tal como se describe en la publicación PCT/N L99/0061 8. (Los contenidos de lo siguiente y todas las patentes y referencias citadas anteriormente, están incorporadas a la presente invención como referencia) : 1. Calméis T.P., Martin F., Durand H. y Tiraby G. (1991) Eventos Proteolíticos en el procesamiento de proteínas segregadas en hongos(Proteolytic events in the processing of secreted proteins in fungi). R. Biotecnología 17(1):51-66. 2. Punt P.J., Díngemanse M.A., Jacobs-Meijsing B.J., Pouwels P.H. y van den Hondel C.A. (1988) Aislamiento y caracterización del gen de dehidrogenasa de gliceraldehído-3-fosfato de Aspergillus nidulans (Isolation and characterization of the glyceraldehyde-3- phosphate dehydrogenase gene of Aspergillus nidulans). Gen 69(1):49-57. 3. Shoemaker S., Schweickart V., Ladner M., Gelfand D., Kwok S., Myambo K. y Innis M. (1983) Clonación molecular de exo- celobiohidrolasa I derivada de la cepa Trichoderma reesei L27 (Molecular cloning of exo-cellobiohydrolase I derived from Trichoderma reesei strain L27). Bio/Tecnología Oct.:691-696. 4. Drocourt D., Calméis T., Reynes J.P., Barón M. y Tíraby G. (1990) Cintas del gen Streptoalloteichus hindustanus para la transformación de eucariotos inferiores y superiores para la resistencia a fleomicina (Cassettes of the Streptoalloteichus hindustanus ble gene for transformation of lower and higher eukaryotes to phleomycin resistance). Inv. de Ácidos Nucleicos 18(13):4009. 5. Mullaney E.J., Hamer J.E., Roberti K.A., Yelton M.M. y Timberlake W.E. (1985) Estructura primaria del gen trpC de Aspergillus nidulans (Primary structure of the trpC gene from Aspergillus nidulans). Genet. Gen. Mol. 199(1):37-45. 6. Yanisch-Perron C, Vieira J. y Messing J. (1987) Vectores de clonación de fago M13 mejorados y cepas huésped: secuencias nucleótidas de los vectores M13mp18 y pUC19 (Improved M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide sequences of the M13mp18 and pUC19 vectors). Gen 33:103-119. 7. Durand H., Barón M., Calméis T. y Tiraby G. (1988) Genéticas clásicas y moleculares aplicadas a Trichoderma reesei para la selección de cepas industriales celulolíticas mejoradas en Bioquímica y genéticas de degradación de celulosa (Classical and molecular genetics applied to Trichoderma reesei for the selection of improved cellulolytic industrial strains, in Biochemistry and genetics of cellulose degradation), J.P. Aubert, Editor, Academic Press. Páginas 135 a 151. 8. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L. y Randall R.J. (1951) Medidas de proteína con el reactivo de fenol folín (Protein measurements with the folin phenol reagent.) R. Biol. Quim. 193, 265-275. 9. Parriche M., Bousson J.C., Barón M. y Tiraby G. Desarrollo de sistemas de secreción de proteína heteróloga en hongos filamentosos en la 3a Conferencia Europea de Genéticas Fúngicas (Development of heterologous protein secretion systems in filamentous fungi. in 3rd Conference on Fungal Genetics). 1996. Münster, Alemania. 10. Barón M., Tiraby G., Calméis T., Parriche M. y Durand H. (1992) Secreción eficiente de lisozyma humana fusionada a la proteína de resistencia a fleomicina Sh-ble a través de los geodos Tolypocladium de hongos (Efficient secretion of human lysozyme fused to the Sh-ble phleomycin resistance protein by fungus Tolypocladium geodes). R. Biotecnol.24(3):253-266. 11. Jeenes D.J., Marczinke B., MacKenzie D.A. y Archer D.B. (1993) Una fusión de gen de glucoamilasa truncada para la secreción de proteína heteróloga de Aspergillus niger (A truncated glucoamilase gene fusión for heterologous protein secretion from Aspergillus niger). Cartas de Microbiología FEMS 107(2-3):267-271. 12. Stone P.J., Makoff A.J., Parish J.H. y Radford A. (1993) Clonación y análisis de secuencia del gen glucoamilasa de neuroespora-crassa (Cloning and sequense-analysis of the glucoamylase gene of Neuróspora-crassa). Genéticas Corrientes 24(3):205-211. 13. Mórsky P. (1983) Determinación turbídimétrica de lisozima con células Micrococcus lysodeikticus: Nueva examinación de condiciones de reacción (Turbidimetric determination of lysozyme with Micrococcus lysodeikticus cells: Reexamination of reaction conditions). Bioquímica Analítica 128:77-85. 14. Paluh J.L., Orbach M.J., Legerton T.L. y Yanofsky C. (1988) El gen de control de la vía cruzada de Neuróspora crassa, cpc-1, codifica una proteína similar a GCN4 de levadura y el dominio de enlace de ADN de la proteína codificada por v-jun del oncogen l?.*~*? A~^.>?**k Btt-...~ c^t---^.AÍ fa.i.t * **¿, ~-d*M?µ*n r*.^f* ^á?íá.*uM t *Jk í? (The cross-pathway control gene of Neuróspora crassa, cpc-1, encodes a protein similar to GCN4 of yeast and the DNA-binding domain of the oncogene v-jun-encoded protein) Proc. Nati. Acad. Cié. EUA 85(11):3728-32. 15. Nakari T., Onnela M.L., limen M., Nevalainen K. y Penttilá M. (1994) Promotores fúngicos activos en la presencia de glucosa (Fungal promoters active in the presence of glucose), Solicitud de Patente Internacional WO 94/04673. 16. Torronen A., Mach R.L., Messner R., González R., Kalkkinen N., Harkki A. y Kubicek C.P. (1992) Las dos xilanasas mayores de Trichoderma reesei: Caracterización tanto de enzimas como genes (The two major xilanases from Trichoderma reesei: characterization of both enzymes and genes). Biotecnología 10(11):1461-5. 17. Farkas V. (1985) Medios novedosos para la detección de productores microbianos de celulosa y xilanasa (Novel media for detection of microbíal producers of cellulase and xylanase). Cartas de Microbiología FEMS 28:137-140. 18. Miller G.L. (1959) Uso del reactivo de ácido dinitrosalicílico para la determinación de reducción de azúcar (Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar). Quim. Anal. 31:426-428. 19. Punt P.J., Mattern I.E., van den Hondel C. A.M. J.J. (1988) Un vector para la transformación de Aspergillus que otorga resistencia a fleomicina (A vector for Aspergillus transformation conferring phleomycin resistance). Nuevas cartas de Genéticas Fúngicas 35, 25-30.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Un método para expresar una pluralidad de proteínas codificadas por una biblioteca de vectores de ADN, en donde la biblioteca de los vectores comprende una secuencia diferente de ácido nucleico que codifica la proteína, estando enlazada en forma operable la secuencia de ácido nucleico a una región de regulación de expresión y opcionalmente a una secuencia de codificación de señal de secreción, en donde el método comprende los pasos de: (a) proporcionar un hongo filamentoso que tiene un fenotipo caracterizado por el crecimiento en suspensión, y caracterizado por la producción de elementos reproductivos transferibles en suspensión; (b) transformar en forma estable los hongos filamentosos con la biblioteca de vectores de ADN, para introducir en cada pluralidad del hongo individual por lo menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína heteróloga; (c) cultivar los hongos filamentosos mutantes transformados bajo condiciones que conducen a la formación de elementos reproductivos transferibles en suspensión; (d) separar entre sí una pluralidad de elementos reproductivos transferibles; y (e) cultivar en cultivos monoclonales o colonias monoclonales los elementos reproductivos transferibles individuales, bajo condiciones que conducen a la expresión de las proteínas i *.. .?i? -¿toá.*L. i A-ama .. ...... »--J -. -.,. -. . --, üJ, M ....tJaJ. . ->.-----t..Jifc~^. ..-a-M-A--* A-É.ia -. heterólogas codificadas por las secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína heteróloga. 2. Un método para clasificar una pluralidad de proteínas codificadas por una biblioteca de vectores de ADN para una actividad o propiedad de interés, en donde el método comprende los pasos de: (a) expresar la pluralidad de proteínas en cultivos fúngicos filamentosos monoclonales o colonias fúngicas filamentosas monoclonales, por medio del método de la reivindicación 1 ; y (b) clasificar cultivos de clonación o colonias de clonación individuales para la actividad o propiedad de interés. 3. Un método para producir una molécula de ADN que codifica una proteína que tiene una actividad o propiedad de interés, en donde el método comprende los pasos de: (a) expresar una pluralidad de proteínas en cultivos fúngicos filamentosos monoclonales o colonias fúngicas filamentosas monoclonales, por medio del método de la reivindicación 1 ; (b) clasificar cultivos de clonación o colonias de clonación individuales para la actividad o propiedad de interés; y (c) aislar el ADN de un cultivo de clonación o colonia de clonación que exhibe la actividad o propiedad de interés. 4. Un método para producir la secuencia de ácido nucleótido de una molécula de ADN que codifica una proteína que tiene una actividad o propiedad de interés, en donde el método comprende los pasos de: (a) aislar el ADN de un cultivo de clonación o colonia de clonación que exhibe la actividad o propiedad de interés, por medio del método de la reivindicación 3; y (b) secuenciar el ADN . 5. Un método para producir la secuencia de aminoácido de una proteína que tiene una actividad o propiedad de interés, en donde el método comprende los pasos de: (a) producir la secuencia de ADN de la proteína que tiene una actividad o propiedad de interés, por medio del método de la reivindicación 4; y (b) convertir la secuencia de ADN en una secuencia de aminoácidos. 6. El método para clasificar una pluralidad de cultivos fúngicos filamentosos monoclonales o colonias fúngicas filamentosas monoclonales para un metabolito que tiene una actividad o propiedad de interés, en donde el método comprende los pasos de: (a) expresar una pluralidad de proteínas en cultivos fúngicos filamentosos monoclonales o colonias fúngicas filamentosas monoclonales, por medio del método de la reivindicación 1 ; y (b) clasificar cada cultivo de clonación o colonia de clonación individual para la actividad o propiedad de interés. 7. Un método para optimizar una actividad o propiedad de interés de la proteína, en donde el método comprende los pasos de: (a) proporcionar una biblioteca de vectores que comprende secuencias de ADN que codifican las formas mutantes de la proteína; i I ? í ..? . ? & .. . ...-*.; - . At ^ fa >-- <* \ (b) proporcionar un hongo filamentoso que tiene un fenotipo caracterizado por el crecimiento en suspensión y por la producción de elementos reproductivos transferibles en la suspensión; (c) transformar en forma estable el hongo filamentoso con la biblioteca de vectores de ADN , para introducir en cada pluralidad del hongo individual por lo menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína heteróloga; (d) cultivar el hongo filamentoso transformado bajo condiciones que conducen a la formación de elementos reproductivos transferibles; (e) separar entre sí una pluralidad de elementos reproductivos transferibles; (f) cultivar en cultivos de clonación o colonias de clonación los elementos reproductivos transferibles, bajo condiciones que conducen a la expresión de las proteínas heterólogas codificadas por las secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína heteróloga; (g) clasificar cada organismo individual, cultivo de clonación o colonia de clonación para una proteína expresada que tiene la actividad de propiedad de interés. ; (h) aislar uno o más organismos individuales, cultivos de clonación o colonias de clonación que expresan una proteína que exhibe la actividad o propiedad de interés; & - I * ? A í i , ¿ . - . 1¿a¡fcß í£ ^^^-ß_^¿¿a^_^^^¿^¿^fc^ Ai áiiAJ. (i) mutar el ADN de los organismos individuales aislados, cultivos de clonación y colonias de clonación que codifican la proteína que exhibe la actividad o propiedad de interés; (j) proporcionar una biblioteca de vectores que comprende las secuencias de ADN mutado obteniéndose en el paso (i); y (k) repetir los pasos del (b) al (g), hasta que la propiedad o actividad de interés ya sea alcance un nivel deseable o ya no se pueda mejorar más. 8. El método de conformidad con la reivindicación 7, que comprende además entre los pasos (h) e (i) los pasos de: cultivar uno o más de los organismos individuales, cultivos de clonación o colonias de clonación aisladas en el paso (h); aislar la proteína expresada que exhibe la actividad o propiedad de interés; y evaluar la proteína aislada para la propiedad de interés. 9. El método de conformidad con la reivindicación 2, en donde el paso de clasificación se lleva a cabo mediante clasificación de alto rendimiento. 1 0. El método de conformidad con la reivindicación 3, en donde el paso de clasificación se lleva a cabo mediante clasificación de alto rendimiento. 1 1 . El método de conformidad con la reivindicación 4, en donde el paso de clasificación se lleva a cabo mediante clasificación de alto rendimiento. 12. El método de conformidad con la reivindicación 5, en donde el paso de clasificación se lleva a cabo mediante clasificación de alto rendimiento. 13. El método de conformidad con la reivindicación 6, en donde el paso de clasificación se lleva a cabo mediante clasificación de alto rendimiento. 14. El método de conformidad con la reivindicación 7, en donde el paso de clasificación se lleva a cabo mediante clasificación de alto rendimiento. 15. El método de conformidad con la reivindicación 8, en donde el paso de clasificación se lleva a cabo mediante clasificación de alto rendimiento. 16. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, en donde el hongo tiene un fenotipo caracterizado por una viscosidad de cultivo, cuando se cultiva en suspensión, o menor a 200 cP al final de la fermentación cuando se desarrolla con nutrientes adecuados bajo condiciones óptimas o casi óptimas. 17. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 1 5, en donde el hongo tiene un fenotipo caracterizado por una viscosidad de cultivo, cuando se cultiva en suspensión, o menor a 100 cP al final de la fermentación cuando se desarrolla con nutrientes adecuados bajo condiciones óptimas o casi óptimas. 5 . 18. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 1 5, en donde el hongo tiene un fenotipo caracterizado por una viscosidad de cultivo, cuando se cultiva en suspensión, o menor a 60 cP al final de la fermentación cuando se desarrolla con nutrientes adecuados bajo condiciones óptimas o casi óptimas. 19. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, en donde el hongo tiene un fenotipo caracterizado por una viscosidad de cultivo, cuando se cultiva en suspensión, o menor a 10 cP al final de la fermentación cuando se desarrolla con nutrientes adecuados bajo condiciones óptimas o casi óptimas. 20. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 1 5 en donde los vectores comprenden una secuencia de señal fúngica. 21 . El método de conformidad con la reivindicación 20, en donde la secuencia de señal fúngica es la secuencia de señal de un gen fúngico que codifica una proteína seleccionada del grupo que consiste de celulasa, ß-galactosidasa, xilanasa, pectinasa, esterasa, proteasa, amilasa, poligalacturonasa e hidrofobina. 22. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, en donde los vectores comprenden una secuencia de nucleótidos que codifica un marcador seleccionable. 23. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15 en donde los vectores comprenden una región de regulación de expresión enlazada en forma operable a la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína. 24. El método de conformidad con la reivindicación 23, en donde la región de regulación de expresión comprende un promotor inducible. 25. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, en donde el hongo es de la clase de Euascomycetes. 26. El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde el hongo es del orden Onygenales. 27. El método de conformidad con la reivindicación 25, en donde el hongo es del orden de Eurotiales. 28. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 1 5, en donde el hongo es de la división Ascomycota, con la provisión de que no es del orden de Saccharomycetales. 29. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 1 5, en donde el hongo es de un género seleccionado de un grupo que consiste de: Aspergillus, Trichoderma, Chrysosporium, Neuróspora, Rhizomucor, Hansenula, Humicola, Mucor, Tolypocladium , Fusarium, Penicillium , Talaromyces, Emericella y Hypocrea. 30. El método de conformidad con la reivindicación 29, en donde el hongo es de un género seleccionado del grupo que consiste de Aspergillus, Fusarium, Chrysosporium y Trichoderma. 31 . El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde el hongo es la cepa de Chrysosporium UV1 8-25 que tiene número de acceso VKM F-3631 D. 32. El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde el hongo es la cepa Trichoderma longibrachiatum X-252. 33. El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde el hongo es la cepa Aspergillus sojae pc1 A. 34. El método de conformidad con la reivindicación 30, en donde el hongo es la cepa Aspergillus niger pc1 A. 35. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, en donde la proporción de proteína expresada a biomasa es de por lo menos 1 : 1 . 36. El método de conformidad con la reivindicación 35, en donde la proporción de proteína expresada a biomasa es de por los menos 2: 1 . 37. El método de conformidad con la reivindicación 36, en donde la proporción de proteína expresada a biomasa es de por los menos 6: 1 . 38. El método de conformidad con la reivindicación 37, en donde la proporción de proteína expresada a biomasa es de por los menos 8: 1 . *< *- *• - •** * — * «, - <¿»fc. » .«A-ri-li-. -~a . *Mk.k i *r 39. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, en donde los elementos reproductivos transferibles son células fúngicas individuales. 40. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, en donde los elementos reproductivos transferibles son esporas. 41 . El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, en donde los elementos reproductivos transferibles son fragmentos hifales. 42. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, en donde los elementos reproductivos transferibles son micropellets. 43. El método de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones de la 1 a la 15, en donde los elementos reproductivos transferibles son protoplastos. 44. Un método para obtener una proteína que tiene una actividad o propiedad de interés, en donde el método comprende los pasos de: (a) clasificar una pluralidad de proteínas codificadas por una biblioteca de vectores de ADN para una actividad o propiedad de interés, a través del método de la reivindicación 2; (b) cultivar en una escala adecuada el cultivo monoclonal o colonia monoclonal que expresa la actividad o propiedad de interés, bajo condiciones que conducen a la expresión de las proteínas j^ AtA- ~~. „ ; <SA jLÍ-.-. -. *r heterólogas codificadas mediante las secuencias de ácido nucleico que codifican la proteína heteróloga; y (c) aislar la proteína expresada. 45. Un método para obtener una proteína que tíene una actividad o propiedad de interés, que comprende optimizar la actividad o propiedad de interés a través del método de la reivindicación 7 o de la reivindicación 8, cultivar en una escala adecuada un organismo individual, cultivo de clonación o colonia de clonación aislados en el paso final (h), y aislar del cultivo la proteína expresada. 46. Un método para elaborar una biblioteca de hongos filamentosos transformados, que comprende los pasos de: (a) proporcionar un hongo filamentoso que tiene un fenotipo caracterizado por el crecimiento en suspensión y caracterizado por la producción de elementos reproductivos transferibles en la suspensión; y (b) transformar en forma estable el hongo filamentoso con una biblioteca de vectores de ADN para introducir en cada pluralidad del hongo individual, por lo menos una secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína heteróloga; en donde la biblioteca de vectores de ADN comprende una pluralidad de vectores diferentes, comprendiendo cada vector diferente una secuencia diferente de ácido nucleico que codifica la proteína, estando enlazada en forma operable la secuencia de ácido ig nucleico a una región de regulación de expresión y opcionalmente a una secuencia de codificación de señal de secreción. 47. Una biblioteca de hongos filamentosos transformados, preparada a través del método de la reivindicación 43. 48 Un método para obtener un huésped fúngico filamentoso transformado que expresa una proteína que tiene una actividad o propiedad de interés, en donde el método comprende los pasos de: (a) clasificar una pluralidad de proteínas codificadas por una biblioteca de vectores de ADN para una actividad o propiedad de interés, a través del método de la reivindicación 2; y (b) aislar el cultivo monoclonal o colonia monoclonal que expresa la actividad o propiedad de interés. IA » , K. i.^ .. ^.. i ,íAui . ..i ,1 ^ * <9 RESUMEN La presente invención proporciona un método para la expresión de bibliotecas de ADN exógeno en hongos filamentosos. Los hongos tienen la capacidad de procesar genes eucarióticos que contienen 5 intrón y también pueden llevar a cabo pasos de procesamiento de post-traducción tales como glicosilación y pliegue de proteína. La presente invención proporciona el uso de hongos con morfología alterada, que permiten la clasificación de alto rendimiento y dirigen la evolución molecular de las proteínas expresadas. Se pueden 10 utilizar los mismos hongos transformados (tal como se muestra en la figura 1 ) para producir mayores cantidades de proteína para la elaboración de pruebas de aislamiento, caracterización y aplicación, y pueden ser adecuados también para la producción comercial de la proteína. o | ¡ Z^oS AAA. J