EA006873B1 - Трансформированные грибы-гифомицеты, способ их получения и способы экспрессии и получения белков при их использовании - Google Patents

Abstract

В изобретении предлагается способ экспрессии экзогенных библиотек ДНК в гифомицетах. Грибы способны осуществлять процессинг содержащих интроны генов эукариот, а также могут осуществлять стадии посттрансляционного процессинга, такие как гликозилирование и укладка белка. В изобретении предлагается применение грибов с измененной морфологией, обеспечивающее высокопроизводительный скрининг и направленную молекулярную перестройку экспрессируемых белков. Те же самые трансформированные грибы могут быть применены (как показано на фиг. 1) для получения больших количеств белка для его выделения, характеристики и проверки на применимость, а также могут быть пригодны для промышленного получения белка.

Description

В изобретении предлагается способ экспрессии и последующего скрининга библиотек ДНК, особенно синтетических, геномных библиотек и библиотек кДНК в гифомицетах в качестве хозяев. В системе применяются трансформированные или трансфецированные штаммы гифомицетов, которые генерируют переносимые элементы репродукции, например, путем эффективной споруляции в погруженной культуре. Грибы предпочтительно характеризуются морфологией, которая сводит к минимуму или препятствует образованию сплетенного мицелия. Особенно предпочтительные штаммы грибов также способны экспрессировать выделяемые количества экзогенных белков для оценки. Мутантные штаммы грибов согласно настоящему изобретению особенно хорошо подходят для методов высокопроизводительного скрининга за счет продуцирования ими переносимых элементов репродукции, высоких уровней экспрессии и очень низкой вязкости культуры.

Известный уровень техники

Существующие в природе популяции микроорганизмов проявляют широкий спектр биохимического и метаболического разнообразия. Частично из-за сложности в выделении и культивировании многих микроорганизмов большое число потенциально ценных белков и полипептидов, присутствующих в данных популяциях, ускользает от идентификации. Действительно, определено, что менее одного процента существующих в мире микроорганизмов культивируется в настоящее время. Таким образом, существует настоятельная необходимость применения новых подходов для характеристики белков, полипептидов и метаболитов из до сих пор некультивированных, неидентифицированных микроорганизмов, а также из известных микроорганизмов. (Применяемый здесь далее термин белок должен пониматься как охватывающий в одинаковой степени пептиды и полипептиды). Сохраняется также необходимость в новых подходах для идентификации и выделения генов, кодирующих данные белки, с тем, чтобы быть в состоянии модифицировать и/или продуцировать данные белки.

Один из подходов к данной проблеме описан 8йой в патентах США 5958672; 6001574, 6030779 и 6057103 (содержание которых включено здесь в качестве ссылки). В данном подходе библиотеку геномной ДНК получают прямо из образца окружающей среды (например, из образца почвы), не предпринимая или предпринимая попытку выделить или культивировать какие-либо организмы, которые могут там присутствовать. Библиотеку ДНК экспрессируют в Е. сой и проводят скрининг экспрессируемых белков на интересующее свойство или активность. В данном способе кратко упоминается, но не описывается или адаптируется применение клеток гриба в качестве хозяина.

Подход, как описано, страдает несколькими серьезными недостатками, одним из которых является то, что Е. сой неэффективно экспрессирует гены, имеющие интроны. Приблизительно 90% видов микроорганизмов почвы являются эукариотами (преимущественно грибы), которые обычно действительно имеют интроны в их геномной ДНК. Принимая во внимание, что известно уже около 100000 видов эумикотных грибов, при этом подсчитано, что 1000000 еще должно быть открыто (В.Кепкйск, Тйе Ийй Ктдкот, Мусо1одие Риййсайопз 1999), потенциал разнообразия белков и метаболитов среди геномов грибов гораздо выше, но присутствие интронов создает препятствия для основного спектра белков и метаболитов грибов при использовании в бактериальных экспрессионных системах. Существует не только много классов ферментов (например, секретируемые пероксидазы лигнина грибов и магнийзависимые пероксидазы), уникальных для грибов, но существует много белков грибов, включая ферменты (например, пероксидазы лигнина, инвертазу А. шдег), которые гликозилированы, а такие белки не будут гликозилированы при экспрессии в Е. сой. Намного большее число и больший размер, а также сложность геномов грибов, уникальность многих белков грибов и гликозилирование многих белков грибов - все это указывает на то, что фракция разнообразных микробных белков и метаболитов в данном образце окружающей среды, которая действительно может быть определена с помощью бактериальной экспрессии геномной ДНК, составляет значительно меньше 10%.

Частично из-за распространения СПИДа и растущей популяции реципиентов для трансплантации органов существует растущая популяция индивидуумов с дефектной или подавленной иммунной системой, а число и разнообразие грибковых инфекций быстро растет (1пБес1. Мек. 16:380-382, 385-386 (1999)). Существует необходимость в идентификации и характеристике белков патогенных грибов в текущем поиске новых мишеней для противогрибковых лекарств, который требует возможности скрининга библиотек ДНК, происходящих из геномов грибов. Опять же присутствие интронов в геномах грибов делает экспрессию библиотек геномных ДНК трудной в большинстве доступных в настоящее время бактериальных хозяев. Наблюдается также увеличение преобладания устойчивых к антибиотикам бактериальных инфекций, что создает необходимость в высокопроизводительном скрининге новых грибковых метаболитов, имеющих активность антибиотиков.

Эукариотные геномы высших организмов являются также слишком сложными для всеобъемлющей экспрессии библиотек ДНК в бактериях. Когда рассматривают все эукариотные виды, бактерии составляют только приблизительно 0,3% от всех известных видов (Е.О. ^1коп, Тйе Сштеп! 81а1е о£ Вю1ощса1 Огуегзйу, 1п Вюк1уег8Йу, Иайопа1 Асакету Ргезз, ХУазйшДоп ОС, 1988, Сйар1ег 1); таким образом, часть всемирного генетического разнообразия, доступная для бактериальных экспрессионных систем, крайне ограничена.

- 1 006873

Чтобы избежать проблемы с интронами, можно получить библиотеку кДНК и экспрессировать ее в бактериях. Однако такой подход предполагает присутствие транскриптов РНК, и любые гены, которые активно не транскрибируются, не будут представлены в библиотеке. Много желаемых белков экспрессируются только при конкретных условиях (например, факторы вирулентности в патогенных грибах), и данные условия могут не иметь место во время получения РНК. Более того, для того, чтобы получить достаточно РНК для создания библиотеки кДНК, необходимо культивировать значительное количество организмов. Для организмов в образцах окружающей среды, которые плохо растут в культуре, или для новых микроорганизмов, для которых неизвестны подходящие условия культивирования, не может быть легко или надежно получено достаточное количество РНК. Напротив, достаточное количество геномной ДНК может быть получено из очень малого количества индивидуальных клеток при амплификации с помощью ПЦР, с применением случайных праймеров или праймеров, созданных для узнавания определенных классов генов. Наконец, гены, которые интенсивно экспрессируются в организме, будут иметь тенденцию к гиперэкспрессии их РНК и, таким образом, они представлены в библиотеке кДНК в повышенной степени за счет минимально экспрессирующихся генов. Для того чтобы иметь высокую степень охвата представленных видов мРНК, должен быть проведен скрининг намного большего количества клонов при применении библиотеки кДНК вместо геномной библиотеки, так как последняя будет иметь близкую к почти равномерной представленность множества присутствующих генов. Ясно, что более желательно проводить скрининг библиотеки геномной ДНК, если это в принципе возможно.

Е.сой также не способна секретировать многие белки и, таким образом, не желательна в качестве клетки-хозяина для целей скрининга, когда скрининг основывается на секреции продукта гена. Дополнительным недостатком в отношении Е. сой и бактериальных хозяев в целом является то, что прокариоты не могут обеспечить многие из посттрансляционных модификаций, требуемых для активности множества эукариотных белков. Примерами посттрансляционного процессинга, часто требуемого для получения активного белка, являются, кроме гликозилирования, расщепление субъединиц, образование дисульфидных связей и правильная укладка белков.

Для обеспечения такого процессинга иногда можно использовать клетки млекопитающих, но клетки млекопитающих трудно поддерживать, они требуют дорогих сред и обычно не трансформируются с высокой эффективностью. Такие трансформационные системы являются, следовательно, непригодными для высокопроизводительного скрининга белков, хотя делались попытки применять клетки млекопитающих в качестве хозяев для скрининга библиотек кДНК (8сйои(еп с1 а1., заявка \УО 99/64582). Описан подход, включающий слияние трансформированных протопластов с клетками млекопитающих до скрининга библиотеки (патент США 5989814), но экспрессия библиотеки белков происходит в бактериях или дрожжах до слияния клеток. Были попытки модифицировать характер гликозилирования ферментативно после экспрессии в клетках-хозяевах (Меуша1-8а11ех апй СотЬех, 1. Вю1ссйпо1.. 46:1-14 (1996)), но такие способы должны быть специально приспособлены для специфических продуктов и не подходят для экспрессии белков из библиотек ДНК. Позднее Магах е1 а1., Еиг. 1. Вюсйет., 249:701-707 (1997) (см. также патент США 5834251) описали штамм Тйсйойетта геехе1, сконструированный для экспрессии О1сЫАс трансферазы I человека. Фермент переносит Ν-ацетилглюкозамин к остаткам маннозы на других экспрессируемых экзогенных белках, что является первым этапом более полного приближения к природным продуктам млекопитающих.

Применение дрожжей в качестве клеток-хозяев решает некоторые из упомянутых выше проблем, но создает новые. Дрожжи имеют тенденцию к повышенному гликозилированию экзогенных белков (Вте((йаиет апй Сах1е1йпо, 1999, Вю(есйпо1. Арр1. Вюсйет. 30:193-200) и измененный характер гликозилирования часто ведет к повышению антигенных свойств экспрессируемых белков млекопитающих (С. Ва11ои, ίη Мо1еси1аг Вю1оду о£ 1йе Уеах1 8ассйаготусех, 1. 81га1йегп е1 а1., ейх., Со1й 8рппд НагЬог ЬаЬота1огу Ргехх, ΝΥ, 1982, 335-360). Хотя дрожжи способны копировать ограниченное число интронов, они обычно не способны обращаться со сложными генами высших видов, таких как позвоночные. Даже гены гифомицетов обычно слишком сложны для дрожжей в отношении эффективной транскрипции, и данная проблема сочетается с различиями в экспрессии и сплайсинговых последовательностях между дрожжами и гифомицетами (см., например, М. 1пшх е1 а1., 8с1епсе 1985 228:21-26). Несмотря на данные препятствия, трансформационные и экспрессионные системы для дрожжей интенсивно разрабатываются, особенно для применения с библиотеками кДНК. Разработаны экспрессионные системы дрожжей, которые применяют для скрининга мембранных и секретируемых белков млекопитающих (К1ет, е1 а1., Ргос. №111. Асай. 8ск И8А 1996 93:7108-7113; Тгесо, патент США 5783385), и для гетерологичных белков грибов (ЭаШоде апй Не1й(-Напхеп, Мо1. Оеп. Сепе1. 243:253:260 (1994)), а также для белков млекопитающих (ТекатрО1хоп апй Метутееа1йег, патент США 6017731).

Термин дрожжи, применяемый в контексте экспрессионных систем дрожжей, обычно относится к организмам порядка 8ассйатотусе1а1ех, таким как 8. сетеу1х1ае и РюЫа рахЮпх. В настоящем описании термины грибы и грибковый должны быть поняты как относящиеся к Вах1йютусе(ех, 2удотусе(ех, Оотусе1ех и Сйу(йпйютусе1ех, а также Ахсотусе1ех класса Еиахсотусе(ех, которые не принадлежат к порядку 8ассйатотусе1а1ех. Гифомицеты можно отличить от дрожжей по удлинению их гиф в течение вегетативного роста и обязательному аэробному метаболизму углерода (вегетативный рост у дрожжей

- 2 006873 сопровождается почкованием одноклеточного таллома, и дрожжи могут использовать ферментативный катаболизм).

Свойственный интронам сплайсинг и гликозилирование, укладка и другие посттрансляционные модификации генных продуктов грибов должны быть наиболее эффективно осуществлены грибковыми видами хозяев, что делает гифомицеты лучшими хозяевами для скрининга геномной ДНК из образцов почвы. Это делает их также прекрасными хозяевами для продукции ферментов грибов, представляющих коммерческий интерес, таких, как протеазы, целлюлазы и амилазы. Обнаружено, что гифомицеты способны транскрибировать, транслировать, осуществлять процессинг и секретировать продукты других эукариотных генов, включая гены млекопитающих. Последнее свойство делает гифомицеты привлекательными хозяевами для продукции белков биомедицинского назначения. Типы гликозилирования, осуществляемые гифомицетами, более близки к таковым белков млекопитающих, чем к типам, вводимым с помощью дрожжей. По данным причинам огромное количество усилий тратилось на разработку систем хозяев-грибов для экспрессии гетерологичных белков и разработан ряд грибковых экспрессионных систем. Для обзора работ в данной области см. Магаз е! а1. С1усосоп)ида!е ί.. 16:99-107 (1999); РеЬегбу, Ас!а М1стоЬю1. 1ттипо1. Нипд. 46:165-174 (1999); Кгизхе^за, Ас!а ВюсЫт, Ро1. 46:181-195 (1999); Агсйег е! а1. Стй. Реу. Вю!ес1по1. 17:273-306 (1997) и 1еепез е! а1. Вю!есй. Сепе!. Епд. Кеу. 9:327-367 (1991).

Высокопроизводительная экспрессия и тестирование библиотек ДНК, которые происходят из геномов грибов, также должны быть полезными для определения функций многих генов млекопитающих, которые в настоящее время имеют неизвестную функцию. Например, если идентифицирован белок гриба, обладающий интересующей активностью, последовательность кодирующего его гена может быть сравнена с последовательностью генома человека для поиска гомологичных генов.

Уе1!оп е! а1., патент США № 4816405, описывает модификацию гифомицета Азсотусе!ез для продукции и секреции гетерологичных белков. Вих!оп е! а1. в патенте США № 4885249 и в Вих!оп апб Раб£отб, Мо1. Оеп. Сепе!. 196:339-344 (1984) описывают трансформацию АзретдШиз шдет с помощью ДНКвектора, который содержит селективный маркер, способный включаться в клетки хозяина. МсКшдй! е! а1., патент США 4935349 и Вое1 в патенте США 5536661 описывают способы экспрессии эукариотных генов в АзретдШиз, включая промоторы, способные направлять экспрессию гетерологичных генов в АзретдШиз и в других гифомицетах. Роует е! а1. в патенте США 5837847 и Ветка е! а1. в заявке νθ 00/56900 описывают экспрессионные системы для применения в Еизатшт уепепа!ит с применением промоторов природных и мутантных Еизатшт зрр. Соппее1у е! а1. в патенте США 5955316 описывают плазмидные конструкты, которые подходят для экспрессии и получения лактоферрина в АзретдШиз. Глюкозооксидаза С1абозротшш была экспрессирована в АзретдШиз (патент США 5879921).

Сходная технология применена для Ыеитозрога. катЬо\\'Цх в патенте США 4486533 описывает автономно реплицирующийся ДНК-вектор для гифомицетов и его применение для введения и экспрессии гетерологичных генов в Ыеитозрога. 8!иат! е! а1. описывают совместную трансформацию сферопластов Ыеигозрога сгазза с генами млекопитающих и эндогенными регуляторными элементами транскрипции в патенте США 5695965 и улучшенный штамм Ыеитозрога, имеющий сниженный уровень внеклеточной протеазы, в патенте США 5776730. Векторы для трансформации Ыеитозрога описаны в патенте США 5834191. Такащ е! а1. описывают систему трансформации для РЫхорпз в патенте США 5436158. 81зшедаВаггозо е! а1. описывают систему трансформации для гифомицетов в заявке XVО 99/51756, в которой применяют промоторы генов глутаматдегидрогеназы из АзретдШиз а\\'атоп. Эап!аз-ВагЬоза е! а1., ЕЕМ8 М1стоЬю1. Ьей. 1998 169:185-190, описывают трансформацию Ншшсо1а дпзеа уат. !11егшо1беа для устойчивости к гигромицину В с применением способа либо с применением ацетата лития, либо путем электропорации.

Среди более успешных грибковых экспрессионных систем находятся системы АзретдШиз и Тпс1юбегта, например, описанные Ветка е! а1. в патенте США 5578463; см. также ЭеусНапб апб С^уппе, 1. ВюШесйпо1. 17:3-9 (1991) и Сойка е! а1., Арр1. МюгоЬю1. ВюШесЬпок 47:1-11 (1997). Примеры трансформированных штаммов Мусе1юрй!йога Шетшоркба, Астетошит а1аЬатепзе, ТЫекпаа !еггез!пз и 8рого!пс11ит се11и1орЫ1ит представлены в заявке νθ 96/02563 и патентах США 5602004, 5604129 и 4695985, которые описывают определенные недостатки систем АзретдШиз и ТпсНобегта и предполагают, что другие грибы могут быть более подходящими для продукции белков в большом масштабе.

В данной области техники известны способы трансформации типов, отличных от Азсотусе!ез; см., например, Мипох-РАаз е! а1., Мо1. Сеп. Сепе!. 1986 205:103-106 (8с1ихор11у11ит соттипе); уап бе Р1ее е! а1., Мо1. Сеп. Сепе!. 1996 250:252-258 (Адапсиз Ызрогиз); Агпаи е! а1., Мо1. Сеп. Сепе!. 1991 225:193-198 (Мисог с1тсте11о1без); Мои е! а1., Вюзск Вю!ес1по1. Вюсйет. 1992 56:1503-1504 (РЫхориз пгуеиз); бибе1зоп е! а1., Мо1. Р1ап! МкгоЬе 1п!егас!. 1991 4:602-607 (Рйу!орйШота ш£ез!апз); и бе Сгоо! е! а1., Ыа!иге Вю!ЬесЬпо1. 1998 16:839-842 (Адапсиз Ызрогиз).

В дополнение к обычным способам трансформации гифомицетов, таким как, например, слияние протопластов, СйактаЬобу апб Кароог, Мис1е1с Ас1бз Рез. 18:6737 (1990) описывают трансформацию гифомицетов путем электропорации. Эе Сгоо! е! а1. ΐπ ЫаЫге Вю!11ес11по1. 16: 839-842 (1998) описывают трансформацию нескольких видов гифомицетов, опосредуемую АдтоЬас!етшт !ите£ас1епз. Выполнено баллистическое введение ДНК в грибы; см., например, Сйпзбапзеп е! а1., Сигг. Сепе!. 29:100-102 (1995);

- 3 006873

Оигапб е! а1., Сигг. Сепе!. 31:158-161 (1997) и Вагсе11оз е! а1., Сап. 1. М1сгоЫо1. 44:1137-1141 (1998). Применение магнитных частиц для магнето-баллистической трансфекции клеток описывается в патентах США 5516670 и 5753477 и как предполагается применимо к гифомицетам.

Очевидно, что проделано много работы для разработки экспрессионных систем с применением грибов в качестве хозяев. Однако обычные грибковые хозяева все представляют собой гифомицеты, которые имеют тенденцию образовывать мицелиальные пленки в неперемешиваемых культурах и суспензионные (погруженные) культуры с высокой вязкостью в перемешиваемых резервуарах биореакторов. Данные свойства гифомицетов также создают ряд проблем для промышленного получения ферментов в грибковых клетках-хозяевах. Например, высокая вязкость и/или местное образование плотных агрегатов мицелия приводит к трудностям в перемешивании, аэрации и проникновении питательных веществ. В целом гифомицеты не поддаются микропипетированию в планшеты для микротитрования в виде суспензионных культур из-за вязкости культур. Более того, из-за перепутанных мицелиев культуру типичного гифомицета, экспрессирующего библиотеку ДНК, нелегко разделить на отдельные клоны в широком масштабе, что препятствует оценке индивидуальных генотипов, что должно требоваться в системе высокопроизводительного анализа.

Типичные гифомицеты в отсутствие постоянного перемешивания имеют тенденцию к росту в форме пленки на поверхности жидкой культуральной среды, где они продуцируют воздушные споры. Они обычно не спорулируют в погруженной культуре. Оба данных свойства представляют существенную помеху для культивирования клонов гифомицетов в планшетах для микротитрования и для эффективных манипуляций и применения таких культур для высокопроизводительного скрининга. Суспендированные споры или другие компоненты репродуктивных элементов должны подходить для разделения и распределения в индивидуальные лунки для микротитрования, в то время, как продукция воздушных спор будет вести к перекрестному загрязнению лунок для микротитрования, если давать возможность образовываться поверхностным пленкам. Перемешивание среды в лунках для микротитрования до степени, необходимой для предотвращения образования пленки, не осуществимо. В дополнение к проблеме трудности контролирования формирования воздушных спор поверхностные пленки мешают проникновению света, делая многие тесты (в частности, методы спектрофотометрического поглощения) трудными или невыполнимыми. Поверхностные пленки мешают также таким процессам, как оксигенация, добавление реагентов и питательных веществ и пипетирование.

Изучено влияние морфологии грибов на физические свойства культуры и идентифицированы существующие в природе штаммы, имеющие более благоприятную морфологию, как описано, например, 1епзеп апб Воошта1йап в патенте США 5695985. Гомогенное распределение свободного мицелия с хорошо выраженным ветвлением описано как особенно желаемая морфология. 8сйиз!ег апб Роуег в международной патентной заявке \¥О 97/26330 и в патенте США 6184026 предлагают сходный способ идентификации клеток грибов, имеющих более подходящую морфологию, для промышленного получения гетерологичных белков. Способ включает скрининг мутантов родительской линии грибов, отличных от штаммов дикого типа, для нахождения специфической измененной морфологии, трансформации мутанта и оценки того, будет ли культура трансформированного мутанта продуцировать больше гетерологичного белка, чем родительская клеточная линия. Особенно заявляются мутанты с по меньшей мере на 10% большим ветвлением гифы. Способ иллюстрируется для штаммов Тпсйобегта. Ризалит и АзрегдШиз и предполагается, что он применим для многих других видов.

Влияние частоты ветвления на вязкость культуры мутантов АзрегдШиз огухае исследована Воскшд е! а1., Вю1ес11по1. Вюепд. 65:638-648 (1999); более высоко разветвленные штаммы проявляли меньшую вязкость в данном исследовании. Уап \Уехе1 е! а1. в заявке РСТ \УО 00/00613 описывает способы снижения ветвления и/или увеличения фрагментации нитевидных микроорганизмов, в результате чего вязкость культуры снижается. Способ включает трансформацию микроорганизмов геном 8здА 81гер!отусез βπзеиз. Способ продемонстрирован на нитевидных бактериях порядка Асйпотусе1а1ез, но установлено, что он применим для гифомицетов. Пипи-Со1етап е! а1. в заявке \¥О 00/56893 описывают НЬгА2 мутант А. шби1апз, который проявляет гиперразветвленный фенотип при росте при температуре выше 42°С и отмечают линейные взаимоотношения между степенью ветвления гифы и вязкостью культуры.

Большинство предшествующих попыток в области экспрессионных систем гифомицетов было направлено на идентификацию штаммов, подходящих для промышленного получения ферментов и, следовательно, внимание было сфокусировано на вязкости культуры, стабильности трансформации, выходе гетерологичного белка на единицу объема и выходе в виде процента биомассы. Библиотеки ДНК экспрессировали в грибах; см., например, Сетз аиб С1и!!егЬиск, Сигг. Сепе!. 1993 24:520-524, где библиотеку АзрегдШиз шби1апз экспрессировали в А. шби1апз, и Сетз е! а1., Мо1. Сеп. Сепе!. 1994 242:467-471, где геномную библиотеку РешсШшт экспрессировали в АзрегдШиз. Ни одно из этих сообщений не раскрывало или предполагало скрининг экспрессируемых белков; только благодаря комплементарности мутантных аллелей у хозяина была продемонстрирована экспрессия генов из библиотеки ДНК. Метод комплементарности требует специфического мутантного хозяина для каждой активности экзогенного белка, которую хотят определить, и не дает инструмента для общего скрининга библиотеки.

- 4 006873

Клонирование гена инвертазы ЛхрегдШнх шдет с помощью экспрессии в Тпейобегта геехе! описано Вегдех е! а1.. Сигг. Сенек 1993 24:53-59. Применяя геномную библиотеку А. шдет. созданную в космидном векторе. содержащем селективный маркер. и используя в качестве хозяина Т. геехе! (который не способен утилизировать сахарозу). был клонирован ген инвертазы А. шдет с помощью процедуры селекции сибсов. В этом случае опять требовались очень специфичные характеристики хозяина для определения присутствия единичного экспрессируемого экзогенного белка. и скрининг геномной библиотеки не был описан или представлен возможным.

Характеристики клетки гриба-хозяина. подходящей для экспрессии библиотеки ДНК. отличны во многих отношениях от характеристик хозяев. подходящих для промышленного производства белка. В целом гриб-хозяин. подходящий для высокопроизводительного скрининга. должен отвечать многочисленным критериям. среди них представлены следующие:

хозяин должен быть трансформирован с высокой эффективностью;

хозяин должен осуществлять процессинг генов. содержащих интроны. и выполнять любой необходимый сплайсинг;

хозяин должен осуществлять посттрансляционный процессинг экспрессируемого белка так. чтобы он продуцировался в активной форме;

когда библиотеку исследуют для белка. хозяин должен продуцировать белок с высоким выходом. достаточным для его определения с помощью теста;

хозяин должен акцептировать множество экспрессионных регуляторных элементов для облегчения и многосторонности применения;

хозяин должен позволять применение легко отбираемых маркеров;

культуры клеток хозяина должны быть с низкой вязкостью;

хозяин должен характеризоваться недостаточностью протеаз и/или быть в состоянии подавлять экспрессию протеаз;

хозяин должен давать возможность скринингу большого разнообразия активностей и свойств экзогенных белков;

гифы в культуре гриба-хозяина не должны быть запутанными настолько. чтобы препятствовать выделению отдельных клонов. и не должны быть запутанными настолько. чтобы вызывать рост вязкости до точки предотвращения эффективного переноса и репликации при миниатюризированном формате высокопроизводительного скрининга (например. с помощью микропипетирования);

хозяин не должен образовывать поверхностные пленки. но должен предпочтительно расти как погруженная культура;

хозяин должен давать возможность эффективной продукции погруженных спор или артроспор в условиях роста. обеспечивающих высокопроизводительный скрининг.

В случаях. когда скринингу подвергаются метаболиты. должно быть благоприятным. чтобы клетки хозяина секретировали метаболиты в среду. где они могли быть легко определены и/или испытаны. В идеале хозяин должен секретировать только экзогенный белок.

В случаях. когда с белком проводят тесты. должно быть особенно выгодным. чтобы хозяин экспрессировал также достаточно гетерологичного белка для выделения и очистки белка. Клетка хозяина с такой характеристикой должна давать возможность для дополнительной характеристики всех интересующих гетерологичных белков только путем культивирования клеток хозяина без требующих времени молекулярно-биологических манипуляций. необходимых для переноса гена в другой организм. Предпочтительно хозяин должен быть способен секретировать белок. так как это должно позволять проводить более надежные и более разнообразные тесты.

Должно быть также выгодным. чтобы из клетки хозяина можно было легко выделить гетерологичную ДНК так. чтобы могли быть выполнены дополнительные исследования и модификации гена.

В дополнение к данным качествам хозяина система трансформации должна также проявлять определенные свойства. Частота трансформации должна быть достаточно высокой для получения числа трансформантов. требуемого для значимого скрининга. В идеале экспрессия экзогенного белка должна быть индуцирована с помощью единственного индуктора по единственному пути. действующему на единственный промотор.

К настоящему времени не разработано ни сочетания клеток хозяина. ни системы трансформации. которые бы имели все или даже большинство данных критериев. Следовательно. остается потребность в клетке гриба-хозяина и в системах трансформации. которые способны эффективно экспрессировать продукты генов библиотеки ДНК. особенно геномной и/или эукариотной геномной библиотек ДНК.

Краткое описание изобретения

В настоящем изобретении применяют гифомицеты. которые продуцируют переносимые элементы репродукции при росте в погруженной культуре. Под переносимым элементом репродукции подразумевается спора. артроспора. фрагмент гифы. протопласт. микрочастица или другой элемент грибов. который (1) легко отделяется от других таких же элементов в культуральной среде и (2) способен воспроизводить себя в моноклональной культуре. Грибы предпочтительно также проявляют менее выраженный нитевидный фенотип и/или компактную морфологию роста и создают культуры с низкой вязкостью. ко

- 5 006873 торые подходят для физических манипуляций, применяемых для высокопроизводительного скрининга библиотеки ДНК. Особенно предпочтительны гифомицеты, которые даже в отсутствие перемешивания имеют тенденцию к росту в виде погруженных культур, отличающихся от поверхностных пленок.

Настоящее изобретение характеризуется преимуществами системы трансформации, раскрытыми в международных патентных заявках РС1ЖЬ 99/00618 и РСТ/ЕР 99/202516. Данные заявки описывают эффективную систему трансформации для хозяев-гифомицетов, таких как Сйгукокрогшт 1иекпо\\'сп5С и АкрегдШик 5о)ас. Данные заявки также показывают, что легко получить мутантные штаммы, которые сохраняют все преимущества клеток хозяина дикого типа, но которые частично потеряли свой нитевидный фенотип и таким образом обеспечивают культуры с низкой вязкостью.

Предпочтительные для применения в изобретении грибы экспрессируют и секретируют большие количества экзогенного белка, давая высокое соотношение белок/биомасса по сравнению с ранее известными хозяевами-гифомицетами. В изобретении предлагается система трансформации, которая дает высокие выходы трансформантов. В изобретении также предлагаются библиотеки грибов-трансформантов, которые эффективно экспрессируют белковые продукты вставок гетерологичных кДНК и особенно вставок геномной ДНК. В другом варианте изобретения библиотеки трансформированных грибов могут быть использованы для скрининга активности и свойств гетерологичных белков или для скрининга метаболитов, продуцируемых трансформированными грибами в результате активности экзогенных белков, или для скрининга гетерологичных ДНК или образуемых с них транскриптов РНК. Следует принимать во внимание, что настоящее изобретение также делает возможным высокопроизводительный скрининг метаболитов нетрансформированных штаммов, имеющих фенотипические характеристики, описанные выше.

Применяемый здесь термин мутантный гифомицет относится просто к грибам, не найденным в природе. Мутации, которые ведут к желаемым фенотипическим характеристикам, таким как компактная форма роста, низкая вязкость, сниженные уровни протеаз, рост при погружении и т.п., могут быть введены случайным образом либо с помощью классических средств, таких как УФ-облучение и химический мутагенез, либо с помощью способов молекулярной биологии, таких как кластерный мутагенез, или они могут быть введены преднамеренно методами генной инженерии. Если обнаружится, что существующий в природе гриб обладает необходимыми свойствами, он будет, конечно, применим в способах изобретения.

В еще одном варианте изобретения можно провести скрининг библиотек трансформированных грибов на полезные свойства самих грибов, таких как, например, высокие уровни продукции конкретного экспрессируемого белка или метаболита. Данный вариант изобретения иллюстрируется количественным анализом экспрессии интересующего белка, с помощью которого должен быть определен конкретный трансформант, имеющий наиболее благоприятное сочетание продукции белка, процессинга белка и секреции белка.

В другом варианте изобретения можно провести скрининг библиотек трансформированных грибов на присутствие последовательностей ДНК, способных гибридизоваться с интересующим нуклеотидным зондом.

Описание чертежей

Фиг. 1 представляет собой иммуноблоттинг, как описано в примерах;

фиг. 2 - карту рИТ720;

фиг. 3 - карту рИТ970О;

фиг. 4 - карту рИТ1064;

фиг. 5 - карту рИТ1065;

фиг. 6 - карту рР6д;

фиг. 7 - карту рИТ1150;

фиг. 8 - карту рИТ1152; фиг. 9 - карту рИТ1155; фиг. 10 - карту рИТ1160; фиг. 11 - карту рИТ1162; фиг. 12 - схематическую структуру белка рс1А; фиг. 13 А - фотографию АкрегдШик шдег дикого типа; фиг. 13В - фотографию мутанта рс1А АкрегдШик шдег; фиг. 14А - фотографию АкрегдШик 5о)ае дикого типа; фиг. 14В - фотографию мутанта рс1А АкрегдШик 5о)ае;

фиг. 15А-Е - результаты секвенирования гена ругЕ. Подчеркивание показывает аминокислотную последовательность; она не непрерывна из-за некоторых неопределенностей последовательности. Указанные аминокислоты являются наиболее вероятными. Жирный шрифт показывает предполагаемые/вероятные интроны.

Подробное описание изобретения

В наиболее широком варианте изобретение направлено на трансформированные гифомицеты, которые генерируют переносимые элементы репродукции в суспензии, на библиотеки таких грибов и на спо

- 6 006873 собы скрининга таких библиотек на интересующие биологические свойства, такие как биохимическая или биологическая активность, связанная с экспрессируемыми экзогенными белками или с метаболитами, т.е. низкомолекулярными продуктами, получаемыми под действием эндогенных и/или экзогенных ферментов. Библиотека гифомицетов с низкой вязкостью включает грибы, содержащие последовательности нуклеиновой кислоты, причем каждая последовательность нуклеиновой кислоты кодирует гетерологичный белок, причем указанные последовательности нуклеиновой кислоты функционально связаны с районом, регулирующим экспрессию, и необязательно с последовательностью, кодирующей секреторный сигнал и/или с последовательностью, кодирующей белок-носитель. Предпочтительно, чтобы трансформированный штамм в соответствии с изобретением секретировал гетерологичный белок.

Экспрессия и способы скрининга настоящего изобретения и применяемые в нем грибы полезны для получения грибов, белков, метаболитов и молекул ДНК, использующихся для разнообразного применения. Способы настоящего изобретения также полезны для получения информации о нуклеотидной последовательности и аминокислотной последовательности белка, и такая информация сама по себе рассматривается как ценный продукт заявленных способов.

Предпочтительные гифомицеты настоящего изобретения характеризуются низкой вязкостью культуральной среды. В то время как типичный гифомицет промышленного качества дает культуры с вязкостью со степенью выше, чем 200 сантипуаз (сП) и обычно выше 1000 сП, и она может достигать 10000 сП, грибы настоящего изобретения характеризуются вязкостью в культуре менее 200 сП, предпочтительно менее 100 сП, более предпочтительно менее 60 сП и наиболее предпочтительно менее 10 сП после культивирования в течение 48 ч или более в присутствии адекватных питательных веществ при оптимальных или близких к оптимальным условиях роста. Гифомицеты настоящего изобретения обычно демонстрируют морфологию, характеризующуюся короткими, дискретными, несплетенными гифами или микрочастицами. Микрочастицы представляют собой слегка сплетенные или несплетенные скопления гиф, происходящих из одного клона, что отличает их от частиц, которые намного крупнее и происходят от множества сплетенных клонов. Например, мутантный штамм ИУ 18-25 Сбгузозрогшт 1искпо\\'епзе (вязкость <10 сП) и морфологически сходный мутантный штамм Х-252 Тпсбобегта 1опд1ЬгасЫа!ит (вязкость <60 сП) характеризуются присутствием коротких, раздельных, несплетенных гиф длиной между 100 и 200 мкм, а генно-инженерный мутант рс1А АзрегдШиз зо)ае с низкой вязкостью характеризуется компактной формой с существенно разветвленными и короткими гифами (см. фиг. 14). В то время как грибы с низкой вязкостью описаны в заявке XVО 97/26330 как имеющие более сильное ветвление гифы, некоторые грибы настоящего изобретения имеют эквивалентное или даже слегка сниженное ветвление гифы по сравнению с немутантными штаммами. Очевидно, длина гифы играет доминантную роль в контролировании вязкости культуры.

Особенно предпочтительные штаммы грибов характеризуются как имеющие высокое соотношение экзогенный секретируемый белок/биомасса. Данное соотношение составляет предпочтительно более 1:1, более предпочтительно более 2:1 и даже более предпочтительно более 6:1 или выше. Наиболее предпочтительно, чтобы соотношение составляло 8:1 или выше. Такие высокие соотношения являются выгодными для среды для высокопроизводительного скрининга, поскольку они ведут к более высокой концентрации экзогенного белка, позволяя осуществлять более чувствительные и/или более быстрые анализы скрининга. Это особенно выгодно, так как объем тестируемого раствора снижается, например, при переходе от 96-луночных планшетов к 384-луночным планшетам и оттуда к 1536-луночным планшетам. Способы настоящего изобретения подходят для любых форматов данных планшетов для микротитрования и для большинства других форматов НТ8, применяющих жидкие образцы.

Рассматривается, что любой гифомицет может быть превращен с помощью описанных здесь способов создания мутаций в мутантные штаммы, которые подходят для применения в настоящем изобретении. Среди предпочтительных родов гифомицетов находятся Сбгузозрогшт, ТЫе1ау1а, Иеигозрога, АигеоЬаыбшт, РШЬаз1бшт, Рпотусез, Сгур1ососсиз, Асгетошит, То1урос1абшт, 8су!а11бшт, 8с1ихор11у11шп. 8рого!г1сйит, РешсШшт, С1ЬЬеге11а, МусеборЫйога, Мисог, АзрегдШиз, Ризалит, Нитюо1а и Тпсбобегта и их анаморфы и телиоморфы. Более предпочтительными являются Сбгузозролцт, Тлсйобегта, АгрегдШиз и Ризалит. Наиболее предпочтительным является Сбгузозрогшт. Род и виды грибов могут быть определены по морфологии в соответствии с раскрытой Вагпей апб Найег, 111из1га!еб Сепега оГ 1трегГес! Рипд1, 3гб Ебйюп, 1972, Вигдезз РиЬбзЫпд Сотрапу. Источником, обеспечивающим подробностями, касающимися классификации грибов рода Сбгузозрогшт, является Уап Оогзсйо!, С.А.Ы. (1980) А геу1зюп оГ Сбгузозрогшт апб а1Иеб депега в 81иб1ез т Мусо1оду Ио. 20, Сеп1гаа1 Вигеаи уоог 8сЫтте1сиЙигез (СВ8), Ваагп, Т1е №Шег1апбз, рр. 1-36. В соответствии с этими данными род Сбгузозрогшт принадлежит к семейству МопШасеае, которое принадлежит к порядку Нурйотусе!а1ез.

Другим готовым источником, предлагающим информацию о номенклатуре грибов, являются коллекции Будапештского договора, особенно те, которые предлагают базы данных в открытом доступе (следующие адреса Интернета применяют протокол ййр). АТСС (США) предлагает информацию на те^те.а!сс.огд, СВ8 (Нидерланды) на \\л\лс.сЬз.кпа\\'.п1 и УКМ (Россия) на \\л\лс.Ьб1.огс.|.Ьг.Ьб1.тзбпл'кт/ депега1. Другим источником является ЫТ.агз-длп.доу/ Гцпда1ба!аЬазез. Все данные институты могут обеспечить указаниями по отличительным характеристикам видов грибов. Альтернативная систематика Аз

- 7 006873 сотусо!а может быть найдена по адресу \у\у\у.псЫ.п1т.пШ.с|оу/1иЫп-роз1/ТахопотуЛ\де1огд?тобе= ИпбеГ&|б=4890. В соответствии с данной альтернативной систематикой род Сйгузозройит принадлежит к семейству Опудепасеае. порядку Опудепа1ез. типу Азсотусо!а.

Определение Сйгузозройит включает, но не ограничивается данными штаммами: С. Ьойуо1без. С. саттюйаеШ. С. сгаззйишсаШт. С. еигорае, С. еуо1сеаииш. С. £апшсо1а. С. Газйбшт. С. ГШГогте. С. деогщае. С. д1оЬйегит. С. д1оЬйегит уаг. агйси1а!ит. С. д1оЬйегит уаг. шуеит. С. Ыгиибо. С. Ызрашсит. С. 1ю1ти. С. шбюит. С. шорз. С. кегайпорййит. С. кге1зеШ. С. кихигоу1апит. С. Ндпогит. С. 1оЬа!ит. С. 1искпо\уепзе. С. 1испо\уепзе Оагд 27К. С. тебшт. С. тебшт уаг. зр1ззезсепз. С. терЫйсит. С. тегбапит. С. тегбапит уаг. гозеит. С. тшог. С. раптсо1а. С. рагуит. С. рагуит уаг. сгезсепз. С. рбозит. С. рзеиботегбайит. С. рупГопшз. С. с.|еепз1апб1сит. С. з1д1егк С. зийигеит. С. зупсйгопит. С. йоркит. С. ипби1а!ит. С. уайепагепзе. С. уезрегййит. С. хопаШт.

С. 1искпо\уепзе представляет собой вид Сйгузозройит. который представляет особый интерес. поскольку он предлагается как природный продуцент целлулазных белков (международные заявки XV О 98/15633. РСТ/ЫЬ 99/00618 и патенты США 5811381 и 6015707). Штаммы с инвентарными номерами международного хранилища АТСС44006. СВ8 251.72. СВ8 143.77. СВ8 272.77 и УКМ Ρ-3500Ό являются примерами штаммов Сйгузозройит 1искпо\уепзе. Включаемыми в определение Сйгузозройит являются также штаммы. которые произошли от предков Сйтузозройит. включая те из них. которые мутировали либо в природных условиях. либо под действием индуцируемого мутагенеза. В способах настоящего изобретения в одном осуществлении применяются мутанты Сйтузозройит. полученные сочетанием облучения и химически индуцируемого мутагенеза. которые имеют тенденцию продуцировать переносимые элементы репродукции в суспензии и которые имеют морфологию. характеризуемую короткими. дискретными. несплетенными гифами (компактный рост). и фенотип. характеризуемый ростом в погруженном состоянии и пониженной вязкостью среды для ферментации при культивировании в суспензии. В другом осуществлении в изобретении применяются фенотипически сходные мутанты Тйсйобегта. В других осуществлениях в изобретении применяются фенотипически сходные мутанты АзрегдШиз зо_)ае или АзрегдШиз шдег.

Например. мутацию УКМ Ρ-3500Ό (штамм С1) вызывали действием на него ультрафиолетового света для создания штамма ИУ13-6. Впоследствии получали дополнительную мутацию штамма ИУ13-6 под действием Ы-метил-Ы'-нитро-Ы-нитрозогуанидина для создания штамма N070-19. В свою очередь. получали мутацию последнего штамма действием на него ультрафиолетового света для создания штамма иУ18-25 (УКМ Ρ-3631Ό). В течение данного мутагенного процесса морфологические характеристики варьировались частично в культуре в жидкой среде или в планшетах. а также под микроскопом. С каждым последующим мутагенезом культуры проявляли меньшую взбитость и ворсистость на планшетах. что описывается как характерное свойство Сйтузозройит. до тех пор. пока колонии не достигнут вида плоской пленки. Коричневый пигмент. наблюдаемый в штамме дикого типа в некоторых средах. был менее превалирующим в мутантных штаммах. В жидкой культуре мутант ИУ18-25 был заметно менее вязким. чем штамм С1 дикого типа и мутанты ИУ13-6 и ЫС7С-19. В то время. как все штаммы сохраняли микроскопические характеристики роста Сйтузозройит. мицелии становились более узкими с каждой последующей мутацией и в случае ИУ18-25 можно было наблюдать четкую фрагментацию мицелия. Данная фрагментация мицелия. по-видимому. является причиной более низкой вязкости. характерной для культур иУ18-25. Способность штаммов к воздушной споруляции снижалась с каждым этапом мутагенеза. Данные результаты показывают. что штамм может генетически принадлежать к роду Сйтузозройит. в то же время проявляя отклонения от традиционных таксономических (морфологических) определений.

В частности было найдено. что анаморфная форма Сйтузозройит подходит для скрининга. применяемого в соответствии с настоящим изобретением. Метаболизм анаморфа делает его особенно подходящим для высокой степени экспрессии. Телеморф также должен подходить. так как генетическая основа анаморфов и телеморфов идентична. Различие между анаморфом и телеморфом состоит в том. что один представляет собой неполовую стадию. а другой - половую стадию; две стадии проявляют различную морфологию при определенных условиях.

В другом примере охватываются штаммы АзрегдШиз зо_)ае. созданные генно-инженерным способом. В одном из таких мутантов разрушен ген специфической эндопротеазы. Это ведет к фенотипу компактного роста. характеризуемому увеличенным ветвлением и короткой гифой. а также к образованию микрочастиц при культивировании в погруженном состоянии. Более того. АзрегдШиз зо_)ае. на который ссылаются в данной заявке. может быть стимулирован для появления эффективной споруляции в специфических условиях культивирования в погруженном состоянии. что делает его особенно подходящим для применения в системе высокопродуктивного скрининга. В данном случае состояния. которые приводили к образованию переносимых элементов репродукции. просто представляли собой синтетическую среду. содержащую 0.6 г/мл ЭДТА. Приводящие к этому состояния будут варьироваться от одного хозяина к другому. но очевидно. что состояния уже должны быть известны. если хозяин найден подходящим.

- 8 006873

Предпочтительно применять нетоксичные и непатогенные штаммы грибов, ряд из которых известен специалистам в данной области, и это должно снизить риск для специалиста-практиканта и упростить общий скрининг. В предпочтительном осуществлении грибы должны также характеризоваться недостаточностью протеаз для того, чтобы свести к минимуму деградацию экзогенных белков, и/или способностью к подавлению продукции протеаз. Применение дефицитных по протеазам штаммов в качестве хозяев для экспрессии хорошо известно; см., например, заявку РСТ νθ 96/29391. Дефицитные по протеазам штаммы могут быть получены путем скрининга мутантов, или ген(ы) протеаз(ы) могут быть выбиты или инактивированы другим образом с помощью способов, известных в данной области техники, как описано, например, ОшзЮпзеп апб Нуиез в патенте США 6025185 (АзретдШиз огухае с нефункционирующим геном агеА).

Обнаружено, что могут быть получены мутанты Сйтузозролит, которые имеют сниженную экспрессию протеазы, что делает их даже более пригодными для получения белковых продуктов, особенно, если белковый продукт чувствителен к протеазной активности. Таким образом, в изобретении может применяться мутантный штамм Сйтузозротшт, который продуцирует меньше протеазы, чем немутантный штамм Сйтузозротшт, например, меньше, чем штамм С1 С. 1искпо\\'епзе (УКМ Р-3500 Ό). В частности, протеазная активность (отличная от любой селективной протеазы, предназначенной для расщепления секретируемого гибридного белка) таких штаммов составляет менее половины от количества, более предпочтительно менее 30% от количества, наиболее предпочтительно менее приблизительно 10% от количества, продуцируемого штаммом С1. Пониженная протеазная активность может быть измерена с помощью известных способов, таких как измерение ореолов, образованных на чашках со снятым молоком, или измерение деградации бычьего сывороточного альбумина (В8А).

Может быть желательной инактивация других генов в гифомицете-хозяине, таких как, например, генов, кодирующих целлюлазы и другие усиленно секретируемые белки, для того, чтобы свести к минимуму вмешательство белков хозяина в тестирование. Гены, кодирующие секретируемые белки, могут быть удалены или мутированы, или в другом варианте гены, контролирующие систему индукции или другие пути, вовлеченные в экспрессию нежелательных белков, могут быть модифицированы таким образом, чтобы снизить их экспрессию. Когда в векторах настоящего изобретения применяют эндогенный промотор (см. ниже), может быть особенно желательной инактивация генов других белков, находящихся под контролем того же индуктора. Грибы, способные к подавлению секреции протеаз, представляют собой те, в которых экспрессия протеаз находится под контролем регуляторного элемента, который отвечает на состояние окружающей среды, так, что данными состояниями (например, концентрацией аминокислот) можно манипулировать для сведения к минимуму продукции протеаз.

В трансформирующем векторе предпочтительно применяется гомологичный регулирующий экспрессию район, облегчающий высокую экспрессию в выбранном хозяине. Районы, регулирующие высокую экспрессию, которые происходят от гетерологичного хозяина, такого как Тпсйобегша или Азретдй1из, хорошо известны в данной области техники и также могут быть использованы. Демонстративными, но не ограничивающими примерами белков, известных как экспрессируемые в больших количествах и в результате этого обеспечивающие регулирующие экспрессию последовательности, подходящие для применения в настоящем изобретении, являются гидрофобин, протеаза, амилаза, ксиланаза, пектиназа, эстераза, бета-галактозидаза, целлюлаза (например, эндоглюканаза, целлобиогидролаза) и полигалактуроназа.

Область, регулирующая экспрессию, включает промоторную последовательность, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который должен экспрессироваться. Промотор присоединен таким образом, чтобы положение кодона инициации экспрессируемой последовательности делало возможным экспрессию. Последовательность промотора может быть конститутивной, но предпочтительно является индуцибельной. Применение индуцибельного промотора и подходящие среды для индукции благоприятствуют экспрессии генов, функционально связанных с промотором. Предусматривается любая последовательность, регулирующая экспрессию, гомологичных видов или гетерологичного штамма, способного разрешать экспрессию белка. Подходящей последовательностью, регулирующей экспрессию, является область, регулирующая экспрессию, у грибов, например регуляторная область аскомицетов. Подходит, если область, регулирующая экспрессию, аскомицетов представляет собой регуляторную область любого из следующих родов: АзретдШиз, Тпейобегта. Сйтузозротшт, Нит1ео1а, Ыеигозрога, То1урос1абшт, Ризалит, РешсШит, Та1аготусез, или их альтернативных половых форм, таких как Етепсе1а и Нуросгеа. Показательными примерами являются промотор целлобиогидролазы от Тпсйобегша; промоторы алкогольдегидрогеназы А, алкогольдегидрогеназы В, глутамат-дегидрогеназы, амилазы ТАКА, глюкоамилазы и глицеральдегидфосфатдегидрогеназы от АзретдШиз; промотор фосфоглицерата и контрольный промотор перекрестного пути от Ыеигозрога; промоторы липазы и аспартатной протеиназы от ВЫхотисог т1ейе1; промотор бета-галактозидазы от РешсИ1шт саиезсеиз и промоторы целлобиогидролазы, эндоглюканазы, ксиланазы, глицеральдегид-3фосфатдегидрогеназы А и протеазы от Сйтузозротшт. Предпочтительной является последовательность, регулирующая экспрессию, от того же самого рода, что и штамм хозяина, так как более вероятно, что она будет специфически адаптирована к хозяину.

- 9 006873

Особенно предпочтительны природные последовательности, регулирующие экспрессию, от штаммов Сйтукокрогшт, которые экспрессируют белки в предельно высоких количествах. Образцы таких штаммов положены на хранение в соответствии с Будапештским договором во Всероссийскую коллекцию (УКМ) института-депозитария в Москве. Штамм С1 дикого типа имеет номер УКМ Б-3500 Ό, дата депонирования 29-08-1996, мутант С1 υνΐ3-6 положен на хранение под номером УКМ Б-3632 Ό с датой депонирования 02-09-1998, мутант С1 ЫО7С-19 положен на хранение под номером УКМ Б-3633 Ό с датой депонирования 02-09-1998 и мутант С1 ЦУ18-25 положен на хранение под номером УКМ Б-3631 Ό с датой депонирования 02-09-1998. Данные штаммы также предпочтительны как источники для создания мутантов с низкой вязкостью, действительно, штамм УКМ Б-3631 Ό уже проявляет фенотип необходимой низкой вязкости. Мутант штамма Тпсйобегша с низкой вязкостью, обозначенный Х-252, был получен после двух циклов облучения Тпсйобегша 1опд1ЬтасЫа1ит 18.2КК, который, в свою очередь, является полученным в результате мутации штамма ОМ 9414 Т. 1опд1ЬтасЫа1ит (АТСС 26921). В других осуществлениях в настоящем изобретении применяются фенотипически сходные мутанты АкретдШик 5о)ас и АкретдШш шдег.

Предпочтительно, чтобы, когда хозяином является Сйтукокрогшт, применялась последовательность промотора Сйтукокрогшт для обеспечения ее хорошего узнавания хозяином. Определенные гетерологичные последовательности, регулирующие экспрессию, работают в Сйтукокропит также эффективно, как природные последовательности Сйтукокрогшт. Это позволяет использовать хорошо известные конструкты и векторы для трансформации Сйтукокрогшт и дает множество других возможностей для создания векторов, дающих хорошую степень трансформации и экспрессии в данном хозяине. Например, может быть применена стандартная технология трансформации АкретдШик, как описано, например, С11П5Бащеп е1 а1. в Вю/Тес11по1оду 1988 6:1419-1422. Другие документы, предлагающие подробности векторов для трансформации АкретдШик, например патенты США 4816405, 5198345, 5503991, 5364770, 5705358, 5728547 и 5578463, ЕР-В-215594 (также для Тпсйобегша) и их содержание, включены здесь в качестве ссылки. Так как в штаммах Сйтукокрогшт наблюдалась предельно высокая степень экспрессии целлюлазы, области, регулирующие экспрессию генов целлюлазы, особенно предпочтительны.

Векторы изобретения могут включать последовательность промотора, которая происходит от гена, кодирующего фермент, предпочтительно секретируемый фермент. Примерами подходящих ферментов, от которых могут быть взяты промоторные последовательности, являются ферменты деградации углеводов (например, целлюлазы, ксиланазы, маннаназы, маннозидазы, пектиназы, амилазы, например, глюкоамилазы, α-амилазы, α- и β-галактозидазы, α- и β-глюкозидазы, β-глюканазы, хитиназы, хитаназы), протеазы (эндопротеазы, аминопротеазы, амино- и карбоксипептидазы), другие гидролазы (липазы, эстеразы, фитазы), оксидоредуктазы (каталазы, глюкозооксидазы) и трансферазы (трансгликозилазы, трансглутаминазы, изомеразы и инвертазы). Некоторые примеры от Сйтукокрогшт 1искпо\\'еп5е представлены в табл. А.

Конструкт нуклеиновой кислоты должен предпочтительно включать область, регулирующую экспрессию нуклеиновой кислоты, от Сйтукокрогшт, более предпочтительно от Сйтукокропит 1искпо\\'еп5е или его производного, функционально связанную с последовательностью нуклеиновой кислоты, кодирующей белок, который должен экспрессироваться. Особенно предпочтительные конструкты нуклеиновой кислоты должны включать область, регулирующую экспрессию от Сйтукокрогшт, связанную с экспрессией целлюлазы или ксиланазы, предпочтительно с экспрессией целлобиогидролазы, наиболее предпочтительно с экспрессией целлобиогидролазы с М.м. 55 кДа (СВН1), описанной в табл. А. В качестве дополнительных примеров рассматриваются также последовательности промоторов Сйтукокрогшт для гидрофобина, протеазы, амилазы, ксиланазы, эстеразы, пектиназы, β-галактозидазы, целлюлазы (например, эндоглюканазы, целлобиогидролазы) и полигалактуроназы, как попадающие в объем изобретения.

- 10 006873

Таблица А

Характеристики выбранных ферментов СИгузозрогшт 1искпо\¥еп§е

Пример	Ыо аминокислот	Наивысший рН, при котором сохраняется >50% активности	Наивысший рН, при котором сохраняется >70% активности	Стабильность, 20 час, 50°С,
рН	7,5/8
		СМСаза	ввв	Другие	СМСаза	квв	Другие	Остающийся
			СМСаза	субс-		СМСаза	субс-	%	от макс.
				траты			траты	активности
1	2	3	4	5	6	7	8	9
30 кДа		-	-	12,5	-	-	12,0		-
щелочная
протеаза
30 кДа	333	-	-	10,0	-	-	8,5		80
Ху1
(щелоч-
ная)
51 кДа		-	-	8,0	-	-	7,5		-
Ху1
60 кДа		-	-	9,5	-	-	9,0		85
Ху1
30 кДа	247
эндо (ЕСЗ)
4 5 кДа		7,0	8,0	-	6,5	7,0	-		75
эндо
55 кДа	247	8,0	8,0	-	7,0	7,0	-		55
эндо
1	2	3	4	5	6	7	8	9
25 кДа	225	7,5	10,0	-	6, 5	9,0	-		80
(21,8 кДа)
эндо (ЕС5)
43 кДа	395	8,0	8,0	-	7,2	7,2	-		-
(39,6
вДа·) эндо
(Е66)
4 5 кДа		-	-	6, 8	-	-	5,7		-
сх г β—Са1 /
β-ΟΙιιο
4 8 кДа		5,2	7,5	8,0	5,0	6,8	-		-
СВН
55 кДа	526	8,0	9,0	-	7,4	8,5'	-		70
СВН1
65 кДа		-	-	8,0	-	-	7,3		-
реи
90 кДа		-	-	9,0	-	-	9,0		-
протеаза
100 кДа		-	-	9,0	-	-	9,0		-
эстераза

- 11 006873

Примечания: · молекулярные массы по МАЙЭ1; все остальные по ЭФ в ПААГ с Να-ДДС ху1 = ксиланаза епбо = эндоглюканаза да1 = галактозидаза д1ис = глюкозидаза

Ο’ΒΝ = целлобиогидролаза РОЙ = полигалактуроназа

Любой из промоторов или регуляторных областей экспрессии ферментов, раскрытых, например, в табл. А, может быть применен подходящим образом. Последовательности нуклеиновой кислоты данных промоторов и регуляторных областей могут быть легко получены из штамма Сйтузозропит. Существует множество способов, с помощью которых могут быть определены последовательности промоторов, и они хорошо известны в данной области техники. Последовательности промоторов обычно находят непосредственно перед стартовым кодоном АТС перед началом интересующего гена. Например, последовательности промоторов могут быть идентифицированы с помощью делеций последовательностей выше интересующего гена с применением технологии рекомбинантной ДНК и проверки влияния данных делеций на экспрессию гена. Также, например, о последовательности промоторов можно часто судить при сравнении последовательности районов выше интересующего гена с консенсусной последовательностью промотора.

Например, последовательности промоторов эндоглюканаз С1 были идентифицированы данным способом (см. патент РСТ/ΝΤ 99/00618) с помощью клонирования соответствующих генов. Предпочтительные промоторы в соответствии с изобретением представляют собой промоторы целлобиогидролазы с М.м. 55 кДа (СВН1), глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы А и ксиланазы с М.м. 30 кДа (Ху1Т) от Сйту8О8рогшт, так как данные ферменты экспрессируются на высоком уровне под своими собственными промоторами. Промоторы ферментов, деградирующих углеводы, в частности, от Сйтузозрогшт 1искпо\\'сп8с. особенно САКС 27К С.1искпо\\'сп8с. могут быть удачно использованы для экспрессионных библиотек белков в других организмах грибов-хозяев.

Конкретные осуществления последовательностей нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением известны для Сйтузовропит, АзрегдШив и Тпсйобегта. Промоторы для Сйтузозрогшт описываются в заявке РСТ/ΝΤ 99/00618. В предшествующем уровне техники предлагается ряд областей, регулирующих экспрессию, для применения в АзрегдШив, например в патентах США 4935349: 5198345: 5252726; 5705358 и 5965384, а также в заявке РСТ XVО 93/07277. Экспрессия в Тпсйобегша раскрыта в патенте США 6022725. Содержание данных патентов включено здесь полностью в качестве ссылки.

Ген гидрофобина представляет собой ген гриба, который экспрессируется в высокой степени. Таким образом, предполагается, что последовательность промотора гена гидрофобина, предпочтительно от Сйтузозрогшт, может подходить для применения в качестве последовательности, регулирующей экспрессию, в подходящем осуществлении настоящего изобретения. Последовательности гена гидрофобина Тпсйобегта теезе! и Тпсйобегша йагаапит раскрыты, например, на предшествующем уровне техники, также как последовательность гена для АзрегдШиз Гитщаи.18 и АзрегдШиз шби1аи8, и информация о соответствующих последовательностях включена здесь в качестве ссылки (№1кап-3е1а1а е! а1., Еиг. 1. Вюсйет. 1996, 235:248-255; Райа е! а1., 1пГес!. 1ттип. 1994 62:4389-4395; Μπμζ е! а1., Сигг. Сепе!. 1997, 32:225-230; и §!ппдег е! а1., Мо1. М1сгоЬю1. 1995 16:33-44). При применении информации о данных последовательностях специалистом в данной области техники могут быть получены последовательности, регулирующие экспрессию генов гидрофобина Сйтузозрогшт, без излишнего экспериментирования следуя стандартным способам, таким как предложенные выше. Рекомбинантный штамм Сйтузозрогшт в соответствии с настоящим изобретением может включать регулирующую область гена гидрофобина, функционально связанную с последовательностью, кодирующей гетерологичный белок.

Регулирующая экспрессию последовательность может также дополнительно включать энхансер или сайленсер. Из предшествующего уровня техники также хорошо известно, что они обычно расположены на некотором расстоянии от промотора. Последовательности, регулирующие экспрессию, могут также включать промоторы со связывающими сайтами для активатора и связывающими сайгами для репрессора. В некоторых случаях такие сайты могут также модифицироваться для уничтожения такого типа регуляции. Например, описаны промоторы гифомицетов, в которых присутствуют сайты сгеА. Сайты сгеА могут подвергаться мутации для обеспечения того, чтобы подавление глюкозой, обычно возникающее в результате присутствия сгеА, исчезало. Применение такого промотора позволяет получать библиотеку белков, кодируемых последовательностями нуклеиновой кислоты, регулируемыми промотором в присутствии глюкозы. Примеры способа представлены в заявках νθ 94/13820 и νθ 97/09438. Данные промоторы могут быть применены либо с, либо без их сайтов сгеА. Мутанты, в которых сайты сгеА подверглись мутации, могут быть использованы в качестве регулирующих экспрессию последовательностей в рекомбинантном штамме в соответствии с настоящим изобретением, и библиотека последовательностей нуклеиновой кислоты, которую они регулируют, может затем экспрессироваться в присутствии глюкозы. Такие промоторы Сйтузовропит обеспечивают дерепрессию аналогичным способом, что и

- 12 006873 проиллюстрированный в заявке \¥О 97/09438. Идентичность сайтов сгеА известна из предшествующего уровня техники. В противоположном варианте можно применить промотор со связывающими сайтами сгеА, которые не подверглись мутации в штамме хозяина, с мутацией где-либо в другом месте системы репрессии, например, в самом гене сгеА, таким образом, что штамм может вопреки присутствию связывающих сайтов сгеА продуцировать библиотеку белков в присутствии глюкозы.

Концевые последовательности также являются последовательностями, регулирующими экспрессию, и они функционально связаны с З'-концами последовательностей, которые должны экспрессироваться. Множество различных терминаторов грибов, по-видимому, являются функционирующими в штаммах-хозяевах настоящего изобретения. Примерами являются терминатор 1грС А. шйи1апк, терминатор альфа-глюкозидазы А. шдег, терминатор глюкоамилазы А. шдег, терминатор карбоксипротеазы Мисог Щ1ейе1 (см. патент США 5578463) и терминатор целлобиогидролазы Тпсйойегша геекек Последовательности терминатора Сйгукокрогшт, например, терминатора ЕС6, должны, конечно, хорошо функционировать в Сйгукокрогшт.

Подходящий вектор для трансформации для применения в соответствии с изобретением может необязательно содержать последовательности экзогенных нуклеиновых кислот, которые нужно экспрессировать, в функциональной связи с последовательностью, кодирующей сигнальную последовательность. Сигнальная последовательность представляет собой аминокислотную последовательность, которая при функциональной связи с аминокислотной последовательностью экспрессируемого белка дает возможность белку секретироваться из организма хозяина. Такая сигнальная последовательность может быть или связана с гетерологичным белком, или может быть природной по отношению к хозяину. Последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующая сигнальную последовательность, должна находиться в рамке для возможности трансляции сигнальной последовательности и гетерологичных белков. Сигнальные последовательности должны быть особенно предпочтительны, когда настоящее изобретение применяют в связи с направленной молекулярной перестройкой и единственным секретируемым экзогенным белком, который подвергся преобразованию.

Должно быть понятно, что менее выгодно включать сигнальную последовательность в вектор, который используется для экспрессии библиотеки, так как это должно снижать вероятность экспрессии интересующего белка. В геномной библиотеке, полученной путем случайного расщепления ДНК и клонирования в вектор, мала вероятность того, что должно получиться слияние в рамке гена в библиотеке с сигнальной последовательностью. Также, если даже получено слияние в рамке, выбранная сигнальная последовательность может не работать со всеми генами. По данным причинам может быть предпочтительным не применять сигнальную последовательность, когда проводится скрининг библиотеки геномной ДНК, но скорее применять ее для скрининга активности или присутствия внутриклеточного экзогенного белка. Анализ активности или присутствия внутриклеточных белков может достигаться путем предварительной обработки библиотеки трансформантов ферментами, которые превращают клетки грибов в протопласты с последующим лизисом. Процедура описана 2еу1 е1 а1., 1. Вю1есйпо1. 59:221-224 (1997). Данная процедура применена к Сйгукокрогшт, чтобы позволить колониям РСК из трансформантов Сйгукокрогшт расти в планшетах для микротитрования.

Предусматривается любая сигнальная последовательность, способная обеспечивать секрецию белка из штамма Сйгукокропит. Такая сигнальная последовательность является предпочтительно сигнальной последовательностью гриба, более предпочтительно сигнальной последовательностью Аксотусе1е. Подходящие сигнальные последовательности могут происходить в целом от эукариот, предпочтительно от дрожжей или от любого из следующих родов грибов: АкрегдШик, Тпсйойегта, Сйгукокрогшт, РюЫа, Иеигокрога, КЫ/отисог, Напкепи1а, Нит1со1а, Мисог, То1урос1айшт, Еикапит, РешсШшт, 8ассйаготусек, Та1аготусек или их альтернативные половые формы, такие как Етепсе11а и Нуросгеа. Сигнальными последовательностями, которые особенно пригодны, являются те, которые природно связаны с целлобиогидролазой, эндоглюканазой, β-галактозидазой, ксиланазой, пектиназой, эстеразой, гидрофобином, протеазой или амилазой. Примеры включают амилазу или глюкоамилазу АкрегдШик или Нит1со1а, амилазу ТАКА АкрегдШик огу/ае, α-амилазу АкрегдШик шдег, карбоксипептидазу Мисог (патент США 5578463), липазу или протеиназу КЫ/отисог пиейег целлобиогидролазу Тпсйойегта, β-галактозидазу РешсШшт сапексепк СВН1 из Сйгукокрогшт и половой фактор альфа 8ассйаготусек.

В противоположном варианте сигнальная последовательность может быть от гена амилазы или субтилизина штамма ВасШик. Сигнальная последовательность из того же самого рода, что и штамм хозяина, является чрезвычайно подходящей, так как она наиболее вероятно является специфически приспособленной к конкретному хозяину; таким образом, когда хозяином является Сйгукокропит 1искпо^епке, сигнальная последовательность предпочтительно является сигнальной последовательностью Сйгукокрогшт. Штаммы Сйгукокрогшт С1, ИУ13-6, ИС7С-19 и ИУ18-25 секретируют белки в очень больших количествах и сигнальные последовательности от данных штаммов представляют собой особый интерес. Могут быть пригодны сигнальные последовательности от гифомицетов и дрожжей, так же как сигнальные последовательности негрибкового происхождения.

- 13 006873

Трансформированный рекомбинантный гриб-хозяин в соответствии с любыми осуществлениями настоящего изобретения может дополнительно включать маркер селекции. Такой маркер селекции позволяет отбирать трансформированные или трансфецированные клетки. Маркер селекции часто кодирует генный продукт, обеспечивающий специфический тип устойчивости, не встречающийся у нетрансформированного штамма. Это может быть устойчивость к тяжелым металлам, антибиотикам или биоцидам в целом. Прототрофия представляет собой также полезный маркер селекции из разнообразных неантибиотиковых маркеров. Ауксотрофные маркеры создают недостаточность питания клеток хозяина, и гены, корректирующие такую недостаточность, могут быть применены для селекции. Примерами обычно применяемых ауксотрофных маркеров селекции и маркеров устойчивости являются ат <48 (ацетамидаза), Ιιρίι (гигромицинфосфотрансфераза), ругО (оротидин-5'-фосфатдекарбоксилаза) и ругЕ (оротат-Ррибозилтрансфераза), 1грС (антранилатсинтаза), ап* В (орнитин-карбамоилтрансфераза), зС (сульфатаденилтрансфераза), Ьаг (фосфинотрицинацетилтрансфераза), шаЭ (нитратредуктаза), 811-Ые (устойчивость к блеомицину-флеомицину), мутантная ацетолактат-синтаза (устойчивость к сульфонилмочевине) и неомицин-фосфотрансфераза (устойчивость к аминогликозиду). Предпочтительным маркером селекции у Сйгузозропиш является оротат-Р-рибозилтрансфераза. Селекция может быть осуществлена путем котрансформации, когда маркер селекции находится в отдельном векторе или когда маркер селекции находится в том же самом фрагменте нуклеиновой кислоты, что и кодирующая белок последовательность для гетерологичного белка.

Дополнительное улучшение частоты трансформации может быть получено с помощью применения последовательности репликатора АМА1, которую применяют, например, в Азрег§Д1из ш§ег (Уегбоез е! а1., Степе 146:159-165 (1994)). Данная последовательность вызывает от 10- до 100-кратное увеличение частоты трансформации в ряде различных гифомицетов. Более того, введенная ДНК остается автономной в клетках гриба в виде множественных копий без интеграции в геном гриба. Ожидается, что это должно быть выгодным для способа высокопроизводительного скрининга настоящего изобретения, так как неинтегративное состояние снижает вариации в уровне генной экспрессии между различными трансформантами. Более того, так как введенная ДНК не вступает в рекомбинацию с ДНК хозяина, не должны происходить нежелательные мутации в геноме хозяина. Сходные уровни экспрессии экзогенных генов могут быть получены с помощью применения автономно реплицирующихся векторов, таких как АМА1, или наоборот автономная репликация в грибах может быть усилена с помощью теломерных последовательностей (см., например, А. А1екзепко апб Б. Папоуа, Мо1. (Беп. Оепек 1998 260:159-164).

Применяемый здесь термин гетерологичный белок представляет собой белок или полипептид, не экспрессирующийся или не секретирующийся штаммом хозяина в обычных условиях, применяемый для экспрессии в соответствии с настоящим изобретением. Гетерологичный белок может иметь прокариотное происхождение или он может происходить от гриба, растения, насекомого или высшего животного, такого как млекопитающее. Для целей фармакологического скрининга, несомненно, часто предпочтение отдается белкам человека, таким образом, в предпочтительном осуществлении хозяином будет тот организм, в котором библиотека ДНК происходит от человека. Такие осуществления, следовательно, также рассматриваются как подходящие примеры настоящего изобретения.

Экспрессия библиотеки генов человека, которая происходит от библиотеки геномной ДНК человека, в гифомицетах настоящего изобретения, как ожидается, будет эффективной по нескольким причинам. В настоящее время известно, что средний размер генов человека составляет 3000-5000 п.н., а интронов человека - в среднем от приблизительно 75 до приблизительно 150 п.н. (суммарный интервал 40>50000). Гифомицеты имеют интроны размером 40-75 п.н., но они могут использовать интроны размером до 500 п.н. в длину. В среднем гены человека несут 3-5 интронов на ген (М. Пеи1зс11, М. Боп§, Ыис1. Αοΐάδ Кез. 1999 27:3219-3228; табл. В). Известно также, что сигнальные последовательности человека функционируют в гифомицетах. По данным причинам очевидно, что большое число генов человека может экспрессироваться и секретироваться на высоком уровне при применении способов настоящего изобретения.

Таблица В

Организм	Интроны на ген	Средний размер интрона (н) (диапазон)	Структура интронов
Животное/ Растение	3-5	75-150 (40->50000) 80% до 150 н	СТппСб...С11хАС...уАС
Грибы	3	40-75 (40-500)	СТАпСу...СбхАС...уАС
Дрожжи	0,01	50-60 (?-?)	СТАТСТ...ТАСТААС. . уАС

- 14006873

Таким образом. ожидается. что способы настоящего изобретения пригодны для экспрессии библиотек ДНК. берущих начало как от прокариотных. так и от эукариотных геномов. Как описано выше. данные способы могут обеспечивать экспрессию и обнаружение как секретируемых. так и внутриклеточных белков. что дает легкий доступ к чрезвычайно большому количеству генов и белков.

Другой аспект настоящего изобретения включает конструирование и скрининг мутантных библиотек грибов и мутантных библиотек грибов. полученных с помощью раскрытых здесь способов. Библиотеки могут быть получены трансформацией грибов-хозяев в соответствии с данным изобретением с помощью интегративной или неинтегративной трансформации с применением способов. известных специалистам. Данная библиотека грибов. основанная на предпочтительных штаммах хозяина. может обрабатываться или подвергаться скринингу на желаемые свойства или виды активности экзогенных белков с помощью способов скрининга в миниатюризированном или высокопроизводительном формате. Под интересующим свойством или активностью понимается любое физическое. физико-химическое. химическое. биологическое или каталитическое свойство или любое улучшение. повышение или снижение такого свойства. связанное с экзогенным белком члена библиотеки. Библиотека также может быть подвергнута скринингу на метаболиты или на свойство или активность. связанные с метаболитом. образуемым за счет присутствия экзогенных и/или эндогенных белков. Библиотека также может быть подвергнута скринингу на грибы. продуцирующие повышенное или пониженное количество такого белка или метаболита.

В другом варианте настоящего изобретения библиотека трансформированных грибов может быть подвергнута скринингу на наличие метаболитов грибов. обладающих желаемыми свойствами. Примеры таких метаболитов включают поликетиды. алкалоиды и терпеноидные природные продукты. Ожидается. что многочисленные гены или кластеры генов (опероны) могут быть перенесены в клетки-хозяева настоящего изобретения и что небелковые продукты. образуемые за счет действия кодируемых ферментов. будут затем образовываться в клетках-хозяевах. Например. было показано. что ДНК. кодирующая белки. необходимые для образования ловастатина. может быть перенесена в ЛхрегдШих огухае (патент США 5362638; см. также патент США 5849541).

В другом осуществлении изобретения библиотеку трансформированных грибов можно подвергнуть скринингу на наличие ДНК. которая гибридизуется с интересующим нуклеотидным зондом. В данном осуществлении экспрессия и/или секреция экзогенных белков несущественна. хотя часто все еще желаема. Следует понимать. что когда экспрессия белка не является необходимой. присутствие в векторе регуляторных последовательностей не требуется.

В еще одном осуществлении настоящего изобретения библиотека трансформированных грибов может быть подвергнута скринингу на некое желаемое свойство самих грибов. такое как. например. устойчивость к физически или химически экстремальной среде или способность образовывать. модифицировать. разрушать или метаболизировать интересующее вещество. Такие желаемые свойства могут быть или могут не быть приписаны присутствию одиночного экзогенного белка. Данное осуществление должно быть особенно применимо при использовании в качестве части процесса направленного преобразования.

Гетерологичная ДНК может быть геномной ДНК или кДНК. полученной из биологических образцов с помощью способов. хорошо известных в технике. Биологический образец может быть образцом окружающей среды (например. почвы. компоста. лесной подстилки. морской воды или пресной воды) или ее образцом. экстрагированным. отфильтрованным. отцентрифугированным или другим образом сконцентрированным. Могут быть также применены смешанные культуры микроорганизмов. берущие начало от образцов из окружающей среды. Биологический образец может также вести начало от единственного вида организма. такого как культивируемый микроорганизм. растение. насекомое или другое животное. такое как млекопитающее. Кроме того. гетерологичная ДНК может быть синтетической или полусинтетической. например. случайные последовательности ДНК или ДНК. включающая природные сегменты. которые были перемешаны. мутированы или изменены другим способом. Пример полусинтетической нуклеотидной библиотеки можно найти у Уадпег е! а1.. УО 00/0632. ДНК из образцов окружающей среды (или берущих от них начало смешанных культур) должна способствовать открытию новых белков. тогда как применение ДНК из единственного вида должно быть полезным в том. что (1) подходящий вектор может быть выбран более рационально и (2) в случае идентификации интересующего белка специалист-практик будет стремиться к дополнительному скринингу родственных или сходных видов.

По сравнению с традиционными грибами-хозяевами. при применении штамма ИУ18-25 Сйгухохропит с компактной морфологией мицелия уровни трансформации. экспрессии и секреции оказываются весьма высокими. Таким образом. рекомбинантный штамм в соответствии с настоящим изобретением должен предпочтительно проявлять такую морфологию. Настоящее изобретение. однако. также охватывает нерекомбинантные штаммы или иные созданные штаммы грибов. проявляющие данное свойство. В привлекательном осуществлении изобретения следовало бы использовать рекомбинантный штамм С11гухохропит. проявляющий вязкость ниже. чем вязкость штамма ЫО7С-19. предпочтительно ниже вязкости ИУ18-25 при соответствующих или одинаковых условиях культивирования. Заявители определили. что

- 15 006873 вязкость культуры ИУ18-25 составляет менее 10 сП, что несопоставимо с ранее установленной вязкостью Тпсйокегта геезег равной величине порядка 200-600 сП, и вязкостью традиционного АзрегдШиз шдег, равной величине порядка 1500-2000 сП, при оптимальных условиях культивирования во время средней или поздней стадии ферментации. Соответственно, в данном изобретении может применяться любой созданный или мутантный гифомицет, проявляющий данное свойство низкой вязкости, такой как штамм ИУ18-25 (УКМ Ρ-3631Ό) Сйгузозрогшт, штамм Х 252 Тпсйокегта или рс1А (ведущий начало от АТСС 11906) А. зо)ае или рс1А А. шдег.

Текучесть культур гифомицетов может варьировать в широком диапазоне от почти твердого состояния до свободно текущей жидкости. Вязкость может быть легко количественно определена с помощью ротационной вискозиметрии Вгоокйе1к, применения пробирок с кинематической вязкостью, вискозиметра с падающим шаром или вискозиметра чашечного типа. Бульоны ферментации являются неньютоновскими жидкостями, и кажущаяся вязкость будет зависеть в некоторой степени от скорости сдвига (Соикаг е1 а1., Арр1. М1сгоЫо1. В1о1есйпо1. 1999 51:310-315). Данный эффект, однако, значительно менее выражен для культур с низкой вязкостью, применяемых в данном изобретении.

Применение таких культур с низкой вязкостью для скрининга экспрессионной библиотеки в соответствии со способом настоящего изобретения очень выгодно. Скрининг библиотек ДНК, экспрессированных в гифомицетах, прежде был ограничен относительно медленными и трудоемкими методами. В целом, после трансформации грибов (и необязательной для этого селекции трансформантов) необходимо было получить споры или конидии или механически разрушить мицелий для дисперсии библиотеки трансформированных грибов на отдельные организмы или репродуктивные элементы. Данное диспергирование необходимо для того, чтобы отдельные организмы могли быть прокультивированы в клональные колонии или культуры. После этого споры, конидии или фрагменты мицелия разводят и помещают в стандартные культуральные чашки, и отдельные колонии контролируют по цвету, изменениям на субстрате или другому выявляемому показателю наличия искомой активности или свойства белка. При другом подходе делают отпечатки секретируемых белков колоний на мембрану, и мембрану зондируют или исследуют на присутствие интересующей активности или свойства белка. Было доказано, что применение мембран является полезным, когда проблемой является протеолитическое разрушение экзогенного белка (АздеивкоШг е1 а1., Арр1. Епуйоп. М1сгоЫо1. 1999, 65:2250-2252). Такие процедуры являются трудоемкими, и для них не было показано возможности автоматизации, в результате чего высокопроизводительный скрининг экспрессируемых в грибах белков пока не был осуществлен с традиционными гифомицетами. Для целей данного раскрытия понятие высокопроизводительный скрининг относится к любому частично или полностью автоматизированному способу скрининга, способного обеспечить оценку белков, экспрессируемых приблизительно 1000 или более трансформантами в день, и в особенности к тем способам, которые способны обеспечить оценку 5000 или более трансформантов в день, и в наибольшей степени применительно к способам, которые способны обеспечить оценку 10000 или более трансформантов в день.

Соответственно, автоматизированный высокопроизводительный скрининг библиотеки трансформированных грибов согласно настоящему изобретению может быть произведен с помощью ряда известных подходов. Способы, для которых известна применимость к бактериям и дрожжам, в целом могут быть применены к грибам с низкой вязкостью настоящего изобретения. Это становится возможным благодаря наличию переносимых репродуктивных элементов в сочетании с фенотипом низкой вязкости, являющимся следствием относительно непереплетенной морфологии гиф применяемых мутантных грибов. По существу, мутантные грибы и/или их переносимые репродуктивные элементы ведут себя очень похоже на отдельные бактерии или дрожжи во время механических манипуляций, включаемых в автоматизированный высокопроизводительный скрининг. Это контрастирует с грибами дикого типа, а также большинством грибов, адаптированных для промышленности, которые образуют крайне переплетенные мицелии, не позволяющие легко разделить отдельные организмы друг от друга.

Например, разбавленная суспензия трансформированных грибов согласно настоящему изобретению может быть перенесена в виде аликвот в лунки 96-луночного микропланшета с помощью механической микропипетки. Ожидается, что аппарат, оперирующий с жидкостями, способный осуществлять пипетирование в 384- или 1536-луночные микропланшеты, также может быть приспособлен к автоматизированному разнесению организмов в микропланшеты. Концентрация суспендированных организмов может быть изменена по желанию для контроля среднего количества организмов (или других переносимых репродуктивных элементов) в лунке. Следует понимать, что когда множество отдельных организмов вносится в лунки в виде аликвот, идентификация желаемой активности или свойства белка в данной лунке должна отслеживаться с помощью разведения содержимого лунки и культивирования присутствующих организмов в отдельные клональные колонии или культуры. Таким способом производительность системы может быть увеличена с затратами, требующимися для последующего установления содержимого каждой лунки, являющейся «удачной».

В другом осуществлении на пути жидкости может быть помещено устройство для сортировки клеток, способное направлять поток культуры в лунки микропланшета после выявления организма или другого переносимого репродуктивного элемента в детекторе клеток. Данное осуществление обеспечивает

- 16 006873 разнесение по одному организму на лунку с рациональной точностью. Применение оптически выявляемого маркера, такого как зеленый флуоресцентный белок, для идентификации трансформантов является особенно полезным в данном осуществлении, поскольку оно дает возможность автоматического отбора трансформантов с помощью активируемого флуоресценцией устройства для сортирования клеток.

В еще одном осуществлении колонии, выращенные на твердых средах, могут отбираться автоматизированным сборщиком колоний и переноситься роботом в лунки планшета для микротитрования. Хорошо разделенные колонии должны давать одиночные клоны в каждой лунке.

После этого диспергированным организмам дают расти в клональные культуры в лунках микропланшета. По желанию, с помощью автоматизированной системы разнесения жидкости могут быть добавлены индукторы, питательные вещества и т.д. Система может быть также применена для добавления любых реагентов, необходимых для обеспечения выявления интересующей активности или свойства белка. Например, для обеспечения спектроскопического или флуориметрического выявления ферментативной активности могут быть добавлены дающие окраску или флуоресценцию субстраты. Низкая вязкость и способность к росту культур в погруженном состоянии в лунках планшета для микротитрования обеспечивают быструю диффузию таких реагентов в культуру, что значительно повышает чувствительность и надежность анализа. Диффузия кислорода и питательных веществ также значительно возрастает, что способствует быстрому росту и максимальной экспрессии и секреции экзогенных пептидов. Некоторые виды анализа, такие как сцинтилляционный анализ близости, зависят от диффузии растворимых соединений для достижения состояния равновесия; и в этом случае низкая вязкость культур грибов настоящего изобретения делает возможным данный высокопроизводительный анализ. Наконец, в высокоавтоматизированной системе было бы желательно автоматически отбирать, отсасывать или пипетировать интересующие клональные культуры из их лунок в планшете для микротитрования, и низкая вязкость и способность культур к росту в погруженном состоянии должны делать это возможным. Все указанные выше операции были бы затруднены или невозможны при вязкости культур традиционных гифомицетов, в особенности культур, растущих в виде поверхностных пленок в неперемешиваемых, лишенных перемещения условиях лунки планшета для микротитрования.

В другом осуществлении одиночные клетки пропускают через аппарат для микрообъемов жидкости, и интересующее свойство или активность определяют оптическим способом (^аба с1 а1., XVО 99/67639). Низкая вязкость существенна для работы приспособления для микрообъемов жидкости, и ожидается, что культуры с низкой вязкостью мутантных грибов настоящего изобретения могут быть подвержены манипуляции с микрообъемами жидкости. 81юг1 с1 а1., в патенте США 6174673 описали, как можно применять флуорогенные субстраты для определения интересующей ферментативной активности и как клетки-хозяева, экспрессирующие такую активность, могут быть выделены с помощью активируемого флуоресценцией устройства для сортирования клеток. Способы настоящего изобретения совместимы с данным способом идентификации экспрессируемых белков.

В одном осуществлении, где трансформанты несут флуоресцентный белок в качестве маркера, флуоресценцию можно количественно определять и применять в качестве показателя степени экспрессии гена и/или количества экспрессированного белка, находящегося в данной культуре. В данном осуществлении можно не только определять интересующий экзогенный белок, но и устанавливать удельную активность белка, как описано В1упа с1 а1. в νθ 00/78997. Данное осуществление должно быть особенно предпочтительным, когда способ скрининга изобретения применяют в качестве части процесса направленного преобразования.

В тех случаях, когда приемлема более высокая вязкость, образующий гель матрикс может обеспечивать определенные преимущества при культивировании грибов и проведении биохимических анализов в микропланшетном формате, как описано Восйпег в патенте США 6046021.

Другой класс высокопроизводительного скрининга составляет фотометрический анализ, цифровая спектроскопия изображения больших количеств отдельных колоний, растущих на твердом субстрате. См., например, Уоиуап е1 а1., 1994, Ме111. Епхушо1. 246:732-748. В данном способе изменения в суммарных спектрах поглощения или эмиссии специальных реактивов служат показателем присутствия интересующей активности или свойства гетерологичного белка. Легкость разделения отдельных организмов, свойственная применению мутантов с низкой вязкостью, также делает возможным применение гифомицетов в данном способе. Склонность колоний мутантных грибов настоящего изобретения проявлять меньший латеральный рост и образовывать гладкие, компактные и четко очерченные колонии на твердых средах также выгодна при такой системе скрининга. Более того, превосходные характеристики экспрессии и секреции грибов по сравнению с бактериями обеспечивает большие количества белка для спектрального анализа.

Автоматизированный аппарат для работы с микроорганизмами описан в японской патентной заявке, номер публикация 11-304666.

Данное приспособление способно переносить микрокапли, содержащие отдельные клетки, и ожидается, что штаммы грибов настоящего изобретения благодаря своей морфологии будут пригодны для микроманипулирования с отдельными колониями с помощью данного приспособления.

- 17 006873

Автоматизированная микробиологическая высокопроизводительная система скрининга описана Веудоп е1 а1., 1. Вюто1. 8сгеешпд 5:13-21 (2000). Роботизированная система способна переносить капельки объемом 400 нл на чашки агара и обрабатывать 10000 точек скрининга за час, и она была применена для проведения скрининга двойных гибридов у дрожжей. Ожидается, что хозяева-грибы настоящего изобретения, как и дрожжи, пригодны для высокопроизводительного скрининга с помощью систем данного типа.

В качестве альтернативы планшетам для микротитрования, трансформанты можно выращивать на чашках и в форме микроколоний анализировать оптическим способом, как описано в νθ 00/78997.

Развитие высокопроизводительных способов скрининга в целом обсуждается 1ауате1скгете апд Кой, Сигг. Орт. Вю1есНпо1. 8:629-634(1997). Высокопроизводительный скрининг для редко транскрибируемых, дифференциально экспрессируемых генов описан уоп 8(ет е1 а1., ШОею Ас1д Век. 35:2598-2602 (1997).

Штамм ИУ18-25 СНгукокрогшт и штамм X 252 ТпсНодегта очень хорошо иллюстрируют различные аспекты настоящего изобретения. В изобретении, однако, могут применяться другие мутантные или другим образом созданные штаммы гифомицетов, которые продуцируют переносимые репродуктивные элементы в суспензии и проявляют низкую вязкость в культуре. Специфическая морфология грибов может не иметь решающего значения; заявители настоящего изобретения наблюдали короткие, непереплетенные мицелии двух данных штаммов, но с иной морфологией, такой как близкое и интенсивное ветвление гиф, что также может вести к сниженной вязкости. Штаммы грибов согласно настоящему изобретению являются предпочтительными, если они проявляют оптимальный рост при условиях нейтрального рН и температурах 25-43°С. Такие условия скрининга являются благоприятными для поддержания активности экзогенных белков, в особенности таких, которые подвержены деградации или инактивации при кислых значениях рН. Большинство белков млекопитающих, и, в частности, белков человека, эволюционировали для работы при физиологических рН и температуре, и скрининг на естественную активность фермента человека лучше всего проводить при таких условиях. Белки, предназначенные для терапевтического применения, должны функционировать при данных условиях, что делает данные условия предпочтительными для скрининга. Штаммы СНгукокрогшт в точности проявляют данное свойство, хорошо вырастая при нейтральных рН и 35-40°С, тогда как другие обычно применяемые виды грибовхозяев (например, АкрегдШик и ТпсНодегта) лучше растут при кислых рН, и по этой причине могут быть менее пригодными.

Другое применение способа настоящего изобретения состоит в процессе «направленной перестройки», в котором создаются новые кодирующие белок последовательности ДНК, кодируемые белки экспрессируются в клетке-хозяине, и последовательности, кодирующие белки, проявляющие желаемые свойства, подвергают селекции, мутации и вновь экспрессируют. Процесс повторяют на протяжении нескольких циклов до получения белка с желаемыми свойствами. Примерами процесса, с помощью которого могут быть получены новые последовательности ДНК, кодирующие экзогенные белки, являются перемешивание генов, белковая инженерия, склонная к ошибкам ПЦР, сайт-направленный мутагенез и комбинаторный и случайный мутагенез. Патенты США 5223409, 5780279 и 5770356 описывают направленную перестройку. См. также КисНпег апд Ато1д, Тгепдк ш Вю1есНпо1оду. 15:523-530 (1997); 8с1шид1ОаппеП апд Ато1д, Тгепдк ш Вю1есй., 17:135-136 (1999); Ато1д апд Уо1коу, Сигг. Орт. СНет. Вю1., 3:5459 (1999); 2Нао е1 а1., Мапиа1 о£ 1пдик1па1 МюгоЬю1о§у апд В^оΐесНио1оду, 2^пд Ед., (Оетат апд Пау1ек, едк.) рр. 597-604, А8М Ргекк, VакН^и8Юи ОС, 1999; Агпо1д апд Епсус1оред1а о£ Вюргосекк ТесНпо1оду: Бегтеп1айоп, Вюса1а1ук1к, апд Вюкерагайоп (БНсктдег апд Эгете, едк), рр. 971-987, 1оНп \νίΕ\· & 8опк, №\ν Уогк, 1999 и М1пкНи11 апд 81еттег, Сигг. Орт. СНет. Вю1. 3:284-290.

Применение комбинаторного мутагенеза раскрыто Ни е1 а1., Вюсйеткйу, 1998 37:10006-10015. В патенте США 5763192 описан процесс получения новых кодирующих белок последовательностей ДНК путем создания случайных синтетических последовательностей, введения их хозяину и селекции клетокхозяев с желаемым свойством. Способы осуществления рекомбинации искусственных генов (перетасовки ДНК) включают рекомбинацию со случайным праймером (Ζ. 8Нао, е1 а1., Ыискю Ас1дк Век., 26:681683 (1998)), процесс колеблющегося удлинения (Н. ΖНао е1 а1., №1Шге Вю1есй., 16:258-262 (1998)) и гетеродуплексную рекомбинацию (А. Уо1коу е1 а1., Ыискю Ас1дк Век., 27:е18 (1999)). Другим подходом служит склонная к ошибкам ПЦР (8опд апд ВНее, Арр1. Епуйоп. МюгоЬю1. 66:890-894 (2000)).

Существует два широко применяемых способа проведения этапа селекции в процессе направленной перестройки. В одном способе интересующую активность белка каким-либо образом делают необходимой для выживания клеток-хозяев. Например, если желаемой активностью является целлюлаза, активная при рН 8, можно вызвать мутацию гена целлюлазы и ввести его в клетки-хозяева. Трансформанты выращивают с целлюлозой в качестве единственного источника углерода, и рН постепенно повышают до тех пор, пока не остается лишь несколько уцелевших организмов. Мутантный ген целлюлазы из уцелевших организмов, который предположительно кодирует целлюлазу, активную при относительно высоком рН, подвергают еще одному циклу мутации, и процесс повторяют до тех пор, пока не будут получены трансформанты, которые могут хорошо расти на целлюлозе при рН 8. Термостабильные варианты ферментов могут создаваться сходным образом, с помощью циклов мутации генов и культивирования клеток-хозяев

- 18 006873 при высокой температуре (Мао е! а1., Ргос. №111. Асаб. δα. И8А 1986 83:576-580; С1уег е! а1., Ргос. №111. Асаб. δα. И8А 1998 95:12809-12813. Для целей настоящей заявки мутация последовательностей ДНК, кодирующих экзогенные белки, может быть осуществлена любым из нескольких способов, применяемых для направленной перестройки, например, с помощью перетасовки генов, рекомбинации ш у1уо и кассетного мутагенеза.

Главным достоинством данного способа служит природа с массовым параллелизмом стадии селекции «выживания наиболее приспособленных». Миллионы или миллиарды неудачных мутаций одновременно снимаются с рассмотрения без необходимости их индивидуальной оценки. Однако не всегда возможно связать интересующую ферментативную активность с выживанием хозяина. Например, когда желаемым свойством белка является избирательное связывание с интересующей мишенью, по-видимому, трудно сделать способность к связыванию необходимой для выживания. Кроме того, выживание при экстремальных условиях, таких как высокая температура или предельные рН, вероятно, зависит от множества факторов, и желаемую мутацию не удастся отобрать, и она будет утрачена, если клетка-хозяин не способна к выживанию по причинам, не имеющим отношения к свойствам мутантного белка.

Альтернативой подходу с массовым параллелизмом «выживания наиболее приспособленных» служит последовательный скрининг. В данном подходе отдельные трансформанты подвергают скринингу традиционными способами, такими как наблюдение осветленных или окрашенных зон вокруг колоний, растущих на индикаторных средах, колориметрические или флуориметрические ферментативные анализы, иммунологические анализы, анализы связывания и т.д. См., например, 1оо е! а1., №а!иге 399:670-673 (1999), где цитохром-Р450-монооксигеназу, не нуждающуюся в ΝΛΩΗ в качестве кофактора, перестраивали с помощью циклов мутаций и скрининга; Мау е! а1., №а!иге Вю!есЬ. 18:317-320 (2000), где гидантоиназу с обратной стереоспецифичностью перестраивали сходным образом; и М1уахак1 е! а1., 1. Мо1. Вю1. 297:1015-1026 (2000), где был создан термостабильный субтилизин.

Скрининговый подход имеет явные преимущества по сравнению с простым «скринингом на выживание», в особенности, если его можно проводить в высокопроизводительном варианте, достигающем производительности техники «скрининга на выживание» с массовым параллелизмом. Например, степень параллелизма была введена с помощью применения таких измерений, как цифровое изображение трансформированных организмов (боо е! а1., Скет1з!гу & Вю1о§у, 6:699-706 (1999)) или цифровая спектроскопическая оценка колоний (Уоиуап е! а1., 1994, Ме111. Епхуто1. 246:732-748). Серийные анализы могут быть автоматизированы путем применения устройства для сортирования клеток (Ри е! а1., №а!иге Вю!еск., 17:1109-1111 (1999)). Хорошо обоснованный подход к высокопроизводительному скринингу включает автоматизированную оценку экспрессированных белков в планшетах для микротитрования с применением имеющихся в продаже планшетных ридеров, и способ настоящего изобретения хорошо приспособлен к применению данного типа высокопроизводительного скрининга желаемой перестройки.

В данном осуществлении настоящего изобретения ген, кодирующий интересующий белок, подвергают мутации с помощью любого известного способа создания множества мутантов, мутантную кодирующую белок ДНК вводят с помощью подходящего экспрессионного вектора в гифомицетного хозяина с низкой вязкостью согласно настоящему изобретению, и трансформанты не обязательно подвергают селекции и культивируют. После этого клетки-хозяева вносят, как описано ранее, в лунки планшета для микротитрования или каким-либо другим способом пространственно разделяют с тем, чтобы получить моноклональные культуры (или поликлональные культуры, содержащие менее чем приблизительно 100 различных колоний). Клетки предпочтительно вносят в лунки планшета для микротитрования. Кодируемый мутантной ДНК белок предпочтительно секретируется в среду в лунках планшета для микротитрования. Каждую из высеянных культур подвергают скринингу на интересующую активность белка, и отбирают наиболее сильно проявляющие желаемое свойство. Ген, кодирующий желаемый белок в отобранных культурах, подвергают повторной мутации, и мутантную ДНК вновь вводят хозяину-грибу с низкой вязкостью, и трансформанты подвергают повторному скринингу. Процесс мутирования и повторного скрининга повторяют до тех пор, пока величина интересующего свойства не достигнет желаемого уровня.

В другом осуществлении желаемую перестройку осуществляют за счет мутации и репродукции интересующего гена в другом организме, в таком как Е. со11, с последующим переносом мутантных генов в гифомицет согласно настоящему изобретению для скрининга.

Специалисты в данной области техники должны хорошо понимать, что белок, который, повидимому, является интересным по результатам скрининга, необязательно должен обладать всеми другими свойствами, необходимыми для промышленного применения. Например, наличие ферментативной активности даже с высокой удельной активностью не является указанием на то, что мутантный фермент обладает необходимой стабильностью в отношении температуры или рН, или устойчивостью к детергенту или протеазе, или характеризуется отсутствием иммуногенности, или обладает другим свойством, которое могло бы быть желательным или необходимым для промышленной конкурентоспособности продукта. Существует потребность в способах простого определения того, обладает ли выявленный белок промышленно-полезными свойствами.

- 19 006873

Предшествующие подходы к скринингу не обеспечили решения данной проблемы, поскольку организмы-хозяева (бактерии и дрожжи) не были приспособлены для продукции выделяемых количеств белка. Ранее существовала необходимость переноса потенциально полезных генов из одного организма в другой, поскольку было необходимо пройти через получение библиотеки ДНК, экспрессию генов, скрининг, экспрессию аналитических количеств продуктов гена и гиперэкспрессию в пригодных для промышленности продуцирующих штаммах. Мутантные гифомицеты настоящего изобретения, с другой стороны, являются прекрасными гиперпродуцирующими и секретирующими экзогенные белки организмами, в особенности при их применении с описанными здесь векторами. Достаточное количество белка может быть выделено не только для целей характеристики, но и для оценки в тестах на применение. Действительно, штаммы, применяемые в способе скрининга настоящего изобретения, пригодны также для промышленного производства, поскольку они обладают желаемыми промышленными свойствами, такими как низкая вязкость, высокие скорости экспрессии и очень высокие соотношения белок/биомасса.

Соответственно, в предпочтительном осуществлении настоящего изобретения способ дополнительно включает культивирование клональной колонии или культуры, идентифицированных в соответствии со способом настоящего изобретения, при условиях, обеспечивающих экспрессию и секрецию библиотеки экзогенных белков (или их предшественников), и выявление продуцированного затем белка для получения интересующего белка. Экспрессия и секреция белка библиотеки может быть облегчена созданием слияния в рамке клонированного гена с геном гетерологичного белка (или его фрагмента) с его соответствующей сигнальной последовательностью или с сигнальной последовательностью от третьего белка, причем все они функционально связаны с последовательностью, регулирующей экспрессию. С помощью данного подхода создают гибридный белок, который содержит гетерологичные аминокислотные последовательности, расположенные перед белком библиотеки. Затем данный гибридный белокпредшественник может быть изолирован и выделен с применением способов очистки, известных в данной области техники. Способ может необязательно включать стадию расщепления секретируемого гибридного белкового предшественника для создания интересующего белка библиотеки. Стадию расщепления можно проводить с помощью Кех-2, Кех-2-подобной протеазы или другой избирательной протеазы, когда вектор конструируют таким образом, что сайт расщепления протеазой соединяет хорошо секретируемый носитель белка и интересующий белок.

Легкая доступность мутантного белка непосредственно в результате скрининга организма-хозяина ранее была невозможна с применявшимися ранее хозяевами для скрининга. Таким образом, в настоящем изобретении предлагается преимущество в том, что мутантные белки, считающиеся интересными на основании высокопроизводительного скрининга, могут быть выделены в значительных количествах (миллиграммах) для дальнейшей характеристики, и даже в больших количествах (от граммов до килограммов) для испытаний на применение. Данное конкретное осуществление изобретения, таким образом, позволяет исполнителю отобрать мутантные белки для следующего цикла направленной перестройки на основании любого количества желаемых свойств, а не только одного свойства, определенного при высокопроизводительном скрининге. Более жесткие критерии селекции, ставшие возможными благодаря настоящему изобретению, должны вести к более эффективным и оправданным по затратам процессам направленной перестройки.

Способ получения рекомбинантного мутантного штамма гифомицета согласно настоящему изобретению включает введение библиотеки последовательностей ДНК, включающей последовательности нуклеиновой кислоты, кодирующие гетерологичные белки, в мутантный гифомицет с низкой вязкостью в соответствии с изобретением, причем последовательности нуклеиновой кислоты функционально связаны с областью регуляции экспрессии. Введение последовательностей ДНК может быть осуществлено любым известным самим по себе способом трансформации гифомицетов. Специалистам должно быть ясно, что существует несколько хорошо апробированных способов, таких как стимулированный СаС12полиэтиленгликолем захват ДНК протопластами грибов (Ло11пх1опе е1 а1., ЕМВО 1., 1985, 4:1307-1311). Способ трансформации протопластов описан в примерах. Альтернативные способы трансформации протопластов или сферопластов известны и могут быть применены, как это было описано на предшествующем уровне техники, для других гифомицетов. Векторы, пригодные для интеграции гетерологичной ДНК во множестве копий в геном гриба, хорошо известны; см., например, Сшхеррт е1 а1., заявка \¥О 91/00920. Применение автономно реплицируемых плазмид в течение длительного времени было известно в качестве эффективного инструмента для трансформации грибов (Сетх е1 а1.. Сепе 1991 98:61-67; Уегйоех е1 а1., Сепе 1994, 146:159-165; А1екхепко апй С1ийегЬиск, Рипда1 Сепейсх Вю1. 1997 21:373-387; А1екхепко е1 а1., Мо1. Сеп. Сепе!. 1996, 253:242-246). Подробности каждого способа можно найти во многих из цитированных ссылок, и они включены таким образом в качестве ссылки.

Демонстрационные способы в соответствии с настоящим изобретением, включающие применение мутантного штамма Сйгухохрогшт или А. хо_)ае с низкой вязкостью в качестве исходного материала для введения векторов, несущих гетерологичную ДНК, представлены ниже.

- 20 006873

Примеры

А. Создание мутантов с компактной морфологией роста.

В различных патентных заявках показано. что морфологические мутанты могут быть выделены с помощью различных способов скрининга. В УО 96/02653 и УО 97/26330 описаны неопределенные мутанты. обладающие компактной морфологией. Было обнаружено. что осуществляющий процессинг пробелка мутант А. хо_)ае обладает неожиданным. необычным ростовым фенотипом (сверхветвящимся). и при этом не наблюдалось нежелательного влияния на образование белка. Эксперименты с культивированием данного штамма показали фенотип очень компактного роста с микродебрисами. Данные особенности наблюдались не только в случае А. хо_)ае. но и в случае других мутантных грибов. например. А. шдег.

(1) . Создание осуществляющего процессинг пробелка мутанта А. шдег.

Для клонирования гена А. шдег. кодирующего конвертазу пробелка. применяли ПЦР. На основе сравнения генов различных конвертаз пробелков различных видов дрожжей и высших эукариот были созданы различные вырожденные в 4. 2. 2. 512. 1152. 4608. 2048 и 49152 раз. соответственно. праймеры для ПЦР. В результате амплификации с применением праймеров РЕ4 и РЕ6 были получены два отдельных клона. в которых в последовательности кодируемого белка не было обнаружено значительной гомологии с последовательностью КЕХ2 8. сегеу1Х1ае. Данные клоны были применены в дальнейших экспериментах.

На основании наблюдаемой гомологии клонированного ПЦР-фрагмента с другими генами конвертазы пробелка соответствующий ген А. шдег был обозначен как рс1А (от подобного конвертазе пробелка). Анализ по Саузерну продуктов гидролиза геномной ДНК А. шдег показал. что ген рс1А существует в виде гена в единичной копии. который не имеет близкородственных генов в геноме А. шдег. поскольку даже в условиях гетерологичной гибридизации (50°С; отмывка 6х88С) не наблюдалось дополнительных сигналов гибридизации. Первый скрининг геномной библиотеки в ЕМВЬ3 А. шдег N401 (уаи НайшдхуеИ! е! а1.. Мо1. Сеп. Сепе!. 1987 206:71-75) оказался безрезультатным в получении позитивно гибридизуемых бляшек. хотя для скрининга было использовано приблизительно 10-20 геномных эквивалентов. При втором скрининге геномной библиотеки в ЕМВЬ4 А. шдег N400 была выделена полноразмерная геномная копия гена рс1А (Соохеп е! а1.. Сигг. Сепе!. 11:499-503 (1987)).

Из 8 гибридизуемых бляшек. которые были получены после скрининга 5-10 геномных эквивалентов. 6 оставались позитивными после первого повторного скрининга. Все эти 6 клонов. по-видимому. несли полную копию гена рс1А. поскольку во всех клонах (как это наблюдалось для геномной ДНК) с фрагментом ПЦР присутствовали два гибридизуемых ЕсоКУ-фрагментов размером 3 и 4 т.п.н. (фрагмент ПЦР содержал сайт рестрикции для ЕсоКУ). На основании сравнения с размером других конвертаз пробелка. совместно данные фрагменты должны были содержать полный ген рс1А с 5'- и 3'-примыкающими последовательностями. Два ЕсоКУ-фрагмента и перекрывающий ЕсоКУ-фрагмент размером 5 т.п.н. субклонировали для дальнейшей характеристики.

На основании рестрикционной карты была определена полная последовательность ДНК гена рс1А по субклонам ЕсоК! и ЕсоКУ. Анализ полученной последовательности выявил открытую рамку считывания со значительным сходством с таковой гена КЕХ2 8. сегеу1Х1ае и других конвертаз пробелка. На основании последующего сравнения в кодирующей области были идентифицированы две потенциальные интронные последовательности. Последующий ПЦР-анализ библиотеки кДНК А. шдег в рЕМВЬуех с праймерами. примыкающими к потенциальным интронам. показал. что лишь более близкая к 5'-концу из этих двух последовательностей представляет собой истинный интрон. Общая структура кодируемого рс1А-белка была явно похожа на таковую других конвертаз пробелка. Общее сходство белка рс1А с другими конвертазами пробелка составляло приблизительно 50%.

Для того чтобы показать. что клонированный рс1А ген является функциональным геном. кодирующим функциональный белок. была предпринята попытка создания штаммов. лишенных гена рс1А. Для этого был создан делеционный вектор рс1А. рРСЬ1А. в котором большая часть кодирующей области рс1А была заменена маркером селекции ругС А. огу/ае. Затем вставочный ЕсоК1-фрагмент размером 5 т.п.н. из данного вектора использовали для трансформации различных штаммов А. шдег.

На основе данных трансформаций (основанных на ругС селекции) было получено множество трансформантов. Интересно. что часть трансформантов (варьирующих от 1 до 50%) проявила очень четкий аберрантный фенотип (фиг. 13). Анализ по Саузерну нескольких штаммов дикого типа и аберрантных трансформантов показал. что те аберрантные трансформанты. которые проявляли жестко ограниченный (компактный) ростовой фенотип. утратили ген рс1А. Все штаммы. проявляющие рост дикого типа. как было показано. несли копию замещающего фрагмента. интегрированную рядом с геном рс1А дикого типа или в негомологичном положении.

(2) . Создание мутанта А. хо)ае по процессингу пробелка.

Для создания соответствующего мутанта А. хо_)ае была произведена функциональная комплементация мутанта А. шдег с низкой вязкостью путем трансформации мутанта А. шдег по рс1А космидной библиотекой АТСС 11906 А. хо_)ае. Из полученных дополненных трансформантов А. шдег были выделены клоны с геномными космидами. которые включали протеазу процессинга белка рс1А из А. хо_)ае. Анализ частичной последовательности выделенных последовательностей подтвердил клонирование гена рс1А А.

- 21 006873 зсдае. На основании клонированных последовательностей рс1А А. зодае был создан замещающий ген вектор в соответствии с подходом, сходным с описанным в других примерах заявителя, с применением маркера селекции ругСг многократного применения, описанного в заявке XVО 01/09352.

Кроме того, был сконструирован разрушающий ген вектор, несущий маркер селекции ругО и укороченный по 5'- и З'-концам фрагмент гена рс1А А. зодае. Для создания мутантов по рс1А в АТСС 11906 и производных АТСС 11906 применяли векторы и замены гена и разрушения гена. Эксперименты с культурами некоторых из полученных трансформантов выявили улучшенные морфологические характеристики, в частности, компактную ростовую морфологию и микродебрисы (фиг. 14А и 14В).

(3) . Выделение альтернативных мутантов А. зо]ае по компактному росту.

Трансформация А. зодае АТСС 11906 и производных может быть произведена линейными фрагментами ДНК, несущими маркер грибковой селекции. Если не применяют специальных последовательностей репликации, то полученные с помощью данной процедуры трансформанты несут введенную ДНК, интегрированную в геном штамма-хозяина. Поскольку введенный маркер селекции имеет гетерологичное происхождение (А. ш§ег), должна происходить только гетерологичная рекомбинация, ведущая к набору трансформантов, несущих маркерную ДНК в различных положениях генома. Данная интеграция склонна приводить к разрушению эндогенных для А. зодае последовательностей, что тем самым ведет к набору мутантных штаммов А. зодае. Это иллюстрируется анализом большой коллекции трансформантов, полученных из А. зо^ае АТСС 11906а1рАругС с применением фрагмента ДНК с маркером селекции ругСг А. ш§ег. Было проанализировано в общей сложности несколько тысяч трансформантов, из которых 5-10 проявили морфологически аберрантный фенотип. Среди них несколько имели фенотип, сопоставимый с мутантами рс1А. Сходно с описанным для клонирования гена рс1А А. зо]ае, из генной библиотеки А. зо]ае с помощью комплементации морфологического фенотипа мог быть выделен соответствующий мутации ген. На основе клонированного гена могут быть созданы мутанты с разрушением/делецией соответствующего гена.

(4) . Выделение мутантов СИгузозрогшт с компактным ростом.

С помощью основанного на ПЦР подхода к клонированию, сходного с описанным для гена рс1А А. пщег, из ВБиЕЗТАК (ТМ) генной библиотеки СИгузозрогшт был клонирован фрагмент гена СИгузозрогшт процессинга пробелка, названный рс11. Фрагмент гена, несущий полную копию геномного гена, субклонировали из клона рВЕЕГЕЗТАК. На основе полученного субклона был создан разрушающий ген вектор, как описано для А. зодае. Вместо маркера ругС, для СИгузозрогшт применяли фланкируемую повтором версию гена ругЕ А. ш§ег. (Разрушающая ген)-трансформация СИгузозрогшт давала штаммы с фенотипом компактного роста.

В. Определение вязкости.

Для грибковой ферментации с применением пяти различных грибковых организмов были определены следующие диапазоны рабочих параметров. Сравниваемыми пятью грибковыми организмами служили штаммы АзреццПиз пщег, ТпсНобегта 1оп§1ЬгасЫа1ит 18.2КК (исходно Т. геезе1), ТпсИобегта 1опщЬгасЫаШт X 252, СИгузозрогшт 1искпо\¥епзе штамм υνί8-25 и АзрегщПиз зодае рс1А. Вязкость грибковой культуры меняется в ходе ферментации и зависит от концентрации питательных веществ. Для сообщаемых здесь измерений среду, содержащую от 20 до 100 г/л источника углеводного углерода (например, целлюлозы, лактозы, сахарозы, ксилозы, глюкозы и им подобного), инокулируют грибом и культуре дают пройти через «фазу роста», во время которой источник углерода расходуется. Встряхиваемые культуры в бутылях встряхивают при 200 об/мин, а однолитровые сосуды для ферментации перемешивают с помощью мешалки при 500-1000 об./мин. Максимальная вязкость обычно имеет место в конце или незадолго до конца фазы роста. В это время тип питания культуры переключают на порционный, когда источник углерода подают в культуру с такой скоростью, что концентрация источника углерода не возрастает выше приблизительно 0,5 г/л. Типичной является скорость подачи между 1 и 3 г/л/ч.

Вязкость определяли на вискозиметре ВгоокйеМ БУЕ с применением адаптера для малых образцов и шпинделя номер 31 при рабочей температуре 30°С. В шпиндель для малого образца помещали свежий образец бульона ферментации (10 мл). Скорость шпинделя доводили таким образом, чтобы получить показание в диапазоне 10-80. Через четыре минуты снимали показание со шкалы вискозиметра. Показание умножали на приводимый ниже коэффициент для получения вязкости в сантипуазах (сП).

Скорость шпинделя Множитель

650

1225

3010

605

Конечную вязкость измеряли в конце ферментации.

-22006873

Штамм Конечная вязкость, спз (среднее ± ст.откл.)

т.	1опд1ЬгасМаРит	(297±173)
18	. 2КК
А.	птдег	1500-2000
Т.	1опд1ЬгасП1абит Х-252	<60
С.	1искпомепзе υνΐ8-25	<10
А.	зо^ае рс1А	Не опред.

С. Трансформация СЬтузозрогшт, ТпсНоДегта и То1урос1аТшт. Применяли следующие среды для трансформации:

Основание Мапс1е1з:	Среда МпР:
КН2РО4	2 г/л	Основание Мапде1з
(ΝΗ4)23Ο4	1,4 г/л	Пептоном 1 г/л
МдЗО4-7Н2О	0,3 г/л	МЕЗ 2 г/л
СаС12	0,3 г/л	Сахарозой 100 г/л
Микроэлементы	1,0 мл/л	Довести рН до 5
МпР		МпР Са2+:
МпР+сахароза	130 г/л	Среда МпР +
Дрожжевой экстракт	2,5 г/л	СаС12-2Н2О, 50 мМ
Глюкоза	2,5 г/л	Довести рН до 6,5
Агар	15 г/л
Соль МпР:	МпР только с	агаром 7,5 г/л
МРС:
СаС12	50 мМ	рН 5,8
МОРЗ	10 мМ
РЕС	40%

Среды для селекции и культивирования:

-23 006873

03:

Глюкоза

Вгозоуазе

Агар г/л г/л г/л

ΡϋΑ:

Агар декстрозы 39 г/л картофеля (ϋίίοο)

МРС:

Основание Мапс1е1з с

Фталатом К 5 г/л

Глюкозой 30 г/л

Дрожжевым 5 г/л экстрактом

1С1

0,5 г/л К₂НРО₄ рН 7,0 [Мег1еих] рН должен быть 6,8 рН должен быть 5,5

0, 15 г/л МдЗО₄-7Н₂О

0,05 г/л КС1

0,007 г/л

ГеЗО₄-7Н₂О г/л Дрожжевой экстракт (оЫу КАТ) г/л Пептон или

РИагтатесНа г/л лактоза г/л глюкоза

Для селекции трансформантов применяют среду для регенерации (МпК) с добавкой 50 мкг/мл флеомицина или 100-150 мкг/мл гигромицина. Для подтверждения устойчивости к антибиотику применяют среду 08 с добавкой 5 мкг/мл флеомицина.

РЭА представляет собой полную среду для быстрого роста и хорошей споруляции. Жидкие среды инокулируют 1/20-й суспензии спор (все споры с одной 90 мм РЭА-чашки в 5 мл 0,1% Твина). Такие культуры выращивают при 27°С во встряхиваемых бутылях (200 об./мин).

Два нетрансформированных штамма СИгузозрогшт С1 и один штамм сравнения ТпсИойепиа геезе1 тестировали в двух средах (08 с рН 6,8 и агаре РпсШат, РА, с рН 6,8). Для тестирования степени устойчивости к антибиотику споры собирали с 7-дневных чашек РЭА. Чашки для селекции инкубировали при 32°С, и показания снимали через 2, 4 и 5 дней. Штаммы С-1 N070-19 и υνί8-25 четко показали низкий уровень базальной устойчивости как к флеомицину, так и к гигромицину, сопоставимый с таковым лабораторного штамма сравнения Т. геезег Это служит четким указанием на то, что данные стандартные селектируемые маркеры грибов могут быть применены в штаммах СИгузозрогшт. Не ожидается проблем с другими стандартными селектируемыми маркерами грибов.

Селекция 811-Ые (резистентных к флеомицину) трансформированных штаммов СИгузозрогшт была успешно проведена при 50 мкг/мл. Эта величина была и уровнем селекции, примененной для Т. геезеу что таким образом показывает, что в случае СИгузозрогшт может быть легко достигнута дифференциальная селекция. Те же комментарии справедливы в отношении штаммов, трансформированных на устойчивость к гигромицину при уровне 150 мкг/мл.

К СИгузозрогшт была применена техника протопластной трансформации, основанная на наиболее широко применяемой по отношению к грибам технике трансформации. Все споры с одной 90 мм чашки

-24006873

ΡϋΑ собирали в 8 мл 1С1 и переносили во встряхиваемую бутыль с 50 мл среды 1С1 для инкубации в течение 15 ч при 35°С и 200 об./мин. После этого культуру центрифугировали, осадок промывали МпР, вновь переносили в раствор 10 мл МпР с 10 мг/мл Сау1азе Сз и инкубировали в течение 30 мин при 35°С при встряхивании (150 об./мин).

Раствор фильтровали и фильтрат подвергали центрифугированию в течение 10 мин при 3500 об./мин. Осадок промывали 10 мл МпР Са²⁺. Содержимое центрифугировали в течение 10 мин при 25°С. Затем добавляли 50 мкл холодной МРС. Смесь оставляли на льду в течение 30 мин, после чего добавляли 2,5 мл РМС. Через 15 мин при комнатной температуре смешивали 500 мкл обработанных протопластов с 3 мл МпК Зой и немедленно переносили на чашку с МпК, содержащей флеомицин или гигромицин в качестве агента селекции. После инкубации в течение пяти дней при 30°С трансформанты анализировали (клоны становились видимыми через 48 ч). Эффективность трансформации определяли с помощью 10 мкг плазмиды сравнения ρΑΝ8-1. Результаты представлены в следующей табл. С.

Таблица С

Эффективность трансформации (с применением 10 мкг плазмиды сравнения ρΑΝ8-1)

	Т	геезет	ЫС7С-19	υνΐ8-25
Выживаемость	10б/200 мкл	5х106/200 мкл	5х10б/200 мкл
Трансформанты на 200 мкл		2500	104	104
Трансформанты на 106 жизнеспособных клеток		2500	2000	2000

Результаты показывают, что выживаемость трансформанта СЫузозропшп превосходит таковую Тпсйобегта. Способность штаммов к трансформации сопоставима, и, таким образом, количество трансформантов, полученных в одном эксперименте для СЫузозропшп, в 4 раза превышает таковое для Т. геезег Таким образом, система трансформации СЫузозропшп не только не уступает общеприменимой системе Т. геезец но даже превосходит ее. Данное улучшение может оказаться особенно полезным для векторов с меньшей чем у ρΑΝ8-1 эффективностью трансформации.

Ряд других трансформирующих и экспрессионных плазмид был сконструирован с применением гомологичных последовательностей, кодирующих белок СЫузозропшп, а также гетерологичных кодирующих белок последовательностей для применения в экспериментах по трансформации СЫузозропшп. Карты векторов представлены на фиг. 6-11.

Подлежащий экспрессии гомологичный белок выбирали из группы продуцируемых Ойгузозропит целлюлаз, состоящей из эндорлюканазы 6, которая принадлежит к семейству 6 (мол. масса 43 кДа), а гетерологичным белком была эндоглюканаза 3, которая принадлежит к семейству 12 (мол. масса 25 кДа) РешсШшгп.

рРбд включает промоторный фрагмент эндоглюканазы 6 СЫузозропшп, присоединенный к сигнальной последовательности эндоглюканазы 6 в одной рамке с открытой рамкой считывания эндоглюканазы 6 и последующей терминаторной последовательности эндоглюканазы 6. Селекцию трансформантов производят с помощью котрансформации вектором селекции.

_РиТ1150 включает промотор целлобиогидролазы Тпсйобегта геезец присоединенный к сигнальной последовательности эндоглюканазы 6 в одной рамке с открытой рамкой считывания эндоглюканазы 6 и последующей терминаторной последовательности целлобиогидролазы Т. геезег Кроме того, данный вектор несет вторую экспрессионную кассету с маркером селекции, т.е. геном устойчивости к флеомицину (ген 811-Ые).

рЦТ1152 включает промотор глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы А АзрегдШиз шсЫапз, присоединенный к сигнальной последовательности эндоглюканазы 6 в одной рамке с открытой рамкой считывания эндоглюканазы 6 и последующей терминаторной последовательности антранилатсинтазы (1грС) А. пЫЫапз. Кроме того, данный вектор несет вторую экспрессионную кассету с маркером селекции, т.е. геном устойчивости к флеомицину (ген 811-Ые).

рЦТ1155 включает промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы А А. шсЫапз, присоединенный к сигнальной последовательности целлобиогидролазы Тпсйобегта геезе1 в одной рамке с переносящим белком 811-Ые, который, в свою очередь, присоединен в одной рамке к открытой рамке считывания эндоглюканазы 6 и последующей терминаторной последовательности 1грС А. шсЫапз. Данный вектор применяет технологию переносящего белка, слитого с интересующим белком, которая, как известно, очень значительно улучшает секрецию интересующего белка.

рЦТПбО включает промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы А АзрегдШиз шсЫапз, присоединенный к сигнальной последовательности целлобиогидролазы Тпсйобегта геезе! в одной рамке с

-25 006873 переносящим белком 811-Ые, который, в свою очередь, присоединен в одной рамке к эндоглюканазе 3 РешсШшт с открытой рамкой считывания и последующей терминаторной последовательности 1грС А. шбЫапз.

риТ1162 включает промотор целлобиогидролазы ТпсНобегта геезе1, присоединенный к сигнальной последовательности эндоглюканазы 3 в одной рамке с открытой рамкой считывания эндоглюканазы 3 РетсШшш и последующей терминаторной последовательности целлобиогидролазы Т. геезет Кроме того, данный вектор несет вторую экспрессионную кассету с геном устойчивости к флеомицину (ген 811-Ые) в качестве маркера селекции.

Для специалистов должно быть ясно, что образец геномной или кДНК может быть легко разрезан или расщеплен до кодирующих белок фрагментов, и фрагменты лигируются в векторы, такие как иллюстрированы здесь, таким образом, чтобы получить библиотеку экспрессионных векторов. Кроме того, должно быть ясно, что применимы способы, использующие котрансфекцию, и что для трансфекции гифомицетов такими библиотеками векторов могут быть применены автономно реплицируемые векторы или интегрируемые векторы.

Таблица Ώ

Сравниваемые трансформанты

Вектор	Штамм	Трансформация	Кол-во трансформ.
РОТ1150	□νΐ8-25	селекция на флеомицин	285
	Т. деойез	селекция на флеомицин	144
РОТ1152	υνΐ8-25	котрансформация ρΑΝ8.1	398
	Т. деос!ез	котрансформация ρΑΝ8.1	45
рГбд	0νΐ8-25	котрансформация ρΑΝ8.1	252
	Т. деодез	котрансформация ρΑΝ8.1	127
ρϋΤ1162	0νΐ8-25	селекция на флеомицин	>400
	Т. деодез	(не опред.)

Табл. Ώ показывает результаты трансформации СНгузозрогшт υνί8-25 и То1урос1ас1шт ^еобез. Примененный протокол трансформации описан ниже в разделе гетерологичной трансформации.

Ώ. Гетерологичная и гомологичная экспрессия в трансформантах СЫузозрогшт.

Штаммы С1 (N070-19 и/или υνί8-25) тестировали на их способность секретировать различные гетерологичные белки: бактериальный белок (белок устойчивости к флеомицину, 811-Ые, 81гер1оа11о1е1с1щ8 Ыпби81апи8), белок гриба (ксиланазу II, ΧΥΝ2, ТпсНобегта геезе!) и белок человека (лизоцим человека, ΗΓΖ). Подробности процесса описаны ниже.

(1). Секреция С1 белка устойчивости к флеомицину (811-Ые) 81гер1оа11о1е1с1щ8 Ыпби81апи8.

Штаммы С1 N070-19 и υνΐ8-25 трансформировали с помощью плазмиды риТ720 (ссылка 1). Данный вектор представляет следующую экспрессионную кассету грибов:

промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (§ράΑ) АзрегщПиз шскйапз (ссылка 2); синтетическая сигнальная последовательность целлобиогидролазы I (сЫ11) ТпсНобегта геезе! (ссылки 1,3);

ген устойчивости к флеомицину 811-Ые 81гер1оа11о1е1с1шз Ыпбиз1апиз (ссылка 4);

терминатор триптофансинтазы (ОрС) Азрегщ11из шбЫапз (ссылка 5).

Вектор также несет ген бета-лактамазы (Ыа) и старт репликации Е. сой из плазмиды риС18 (ссылка 6). Подробная карта плазмиды представлена на фиг. 2.

С1 протопласты трансформировали по Оигапс! е! а1. (ссылка 7) в адаптации для С1: все споры из одной 90-мм чашки ΡϋΑ ^трансформированного штамма С1 собирали в 8 мл 1С1 и переносили во встряхиваемую бутыль с 50 мл среды 1С1 для инкубации в течение 15 ч при 35°С и 150 об./мин. После этого культуру центрифугировали, осадок промывали в МпР, вновь растворяли в 10 мл МпР +10 мг/мл Сау1азе Сз и инкубировали 30 мин при 35°С при встряхивании (150 об./мин). Раствор фильтровали и фильтрат центрифугировали 10 мин при 3500 об./мин. Осадок промывали 10 мл МпРСа²⁺. Содержимое центрифугировали 10 мин при 3500 об./мин и осадок собирали в 1 мл МпРСа²⁺. К 200 мкл раствора протопластов добавляли 10 мкг ДНК рЦГ720 и инкубировали 10 мин при комнатной температуре (приблизительно 20°С). Затем добавляли 50 мкл холодной МРС. Смесь оставляли на льду в течение 30 мин, после чего добавляли 2,5 мл РМС. Через 15 мин при комнатной температуре 500 мкл обработанных протопластов смешивали с 3 мл МпК 8ой и немедленно переносили на чашку с МпК, содержащей флеомицин 50 мкг/мл при рН 6,5) в качестве агента селекции. После 5-дневной инкубации при 30°С трансформанты анализировали (клоны становились видимыми через 48 ч).

-26006873

Образование 811-Ые трансформантами С1 (устойчивыми к флеомицину клонами) анализировали следующим образом. Первичные трансформанты переносили на чашки с О8+флеомицин (5 мкг/мл) и выращивали в течение 5 дней при 32°С для подтверждения устойчивости. Каждый клон с подтвержденной устойчивостью субклонировали на чашках 08. Для получения спор для инициирования жидкой культуры применяли по два субклона на трансформант для инокуляции чашек ΡΌΑ. Жидкие культуры в 1С1 выращивали 5 дней при 27°С (встряхивание при 200 об./мин). После этого культуры центрифугировали (5000§, 10 мин) и отбирали 500 мкл супернатанта. Из этих образцов с помощью ТХУ осаждали белки, которые ресуспендировали в ХУеШегп 8ашр1е Вийег до концентрации суммарного белка 4 мг/мл (способ Ьомту, ссылка 8). 10 мкл (приблизительно 40 мкг суммарного белка) наносили на 12% акриламидный/Ла-ДДС гель и разделяли (система Μϊηΐ Тгапз-ΒΙοΐ™, ВюКаб ГаЬога(опе§). Иммуноблоттинг проводили в соответствии с инструкциями ВюКаб (мембрана 8сЫе1с11ег & 8с1ш11, 0,2 мкм) с применением антисыворотки кролика против 811-Ые (8ос1е1е Сау1а, ТоЬизе ГК, Са1а1о§ &ΑΝΤΙ-0010) в качестве первичного антитела. Результаты показаны на фиг. 1 и в табл. Е.

Таблица Е

Выявленные уровни продукции 811-Ые в С1

	Выявленное количество Зй-Ые на иммуноблотте	Выявленная концентрация ЗЬЫе в среде продукции
{-^трансформированный N070-19	Не определяется
N070-19::720 клон 4-1	25 нг	0,25 мг/л
N070-19::720 клон 5-1	25 нг	0,25 мг/л
N070-19::720 клон 2-2	250 нг	2,5 мг/л
^трансформированный υνΐ8-25	Не определяется
υνΐ8-25::720 клон 1-2	500 нг	5,0 мг/л
υνΐ8-25::720 клон 3-1	250 нг	2,5 мг/л

Данные результаты показывают, что

1) гетерологичные сигналы транскрипции/трансляции с рИТ720 являются функциональными в СНгузозрогшт;

2) гетерологичная сигнальная последовательность рИТ720 является функциональной в СНгузозропиш;

3) СНгузозрогшт может быть применен в качестве хозяина для секреции гетерологичных бактериальных белков.

(2). Секреция С1 лизоцима человека (ΗΕΖ).

Штаммы С1 N070-19 и ИУ18-25 трансформировали плазмидой рИТ970О (ссылка 9). Данный вектор представляет следующую экспрессионную кассету грибов:

промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (§ράΑ) А§регщ11и§ шсЫапз (ссылка 2); синтетическая сигнальная последовательность целлобиогидролазы I (сЫй) Тпсйобегша гее§е1 (ссылки 1,3);

ген 811-Ые устойчивости к флеомицину 81гер1оа11о1е1с1щ8 ЫпсЫШапиз, примененный в качестве белка-носителя (ссылка 10);

шарнирный домен глюкоамилазы (ДаА2) А§регщ11и§ пщег, клонированный из плазмиды ρΑΝ56-2 (ссылки 11,12);

линкерный пептид (БОЕКК), сходный с КЕХ2-подобным сайтом расщепления протеазой (ссылка 1);

синтетический ген лизоцима человека (Ιιΐζ) (ссылка 10); терминатор триптофансинтазы (йрС) А§регщ11и§ шсЫапз (ссылка 5).

Вектор также несет ген бета-лактамазы (Ыа) и старт репликации Е. сой из плазмиды р1ЭС18 (6). Подробная карта плазмиды представлена на фиг. 3.

Протопласты С1 трансформировали плазмидой рИТ970О, следуя процедуре, уже описанной в примере 1. Гибридный белок (811-Ые::шарнир ΘΑΜ::ΗΕΖ) является функциональным в отношении устойчивости к флеомицину, что тем самым обеспечивает легкую селекцию трансформантов С1. Более того, степень устойчивости к флеомицину приблизительно коррелирует с уровнем экспрессии Ιιΐζ.

Образование ΗΕΖ трансформантами С1 (устойчивыми к флеомицину клонами) анализировали с помощью теста на активность лизоцима следующим образом. Первичные трансформанты переносили на чашки с О8+флеомицин (5 мкг/мл) (подтверждение устойчивости), а также на чашки БУ8О (определение

-27006873 активности ΗΣΖ визуализацией просветления зон (ссылки 1, 10)). Чашки выращивали в течение 5 дней при 32°С. Каждый подтвержденный клон субклонировали на чашках ΓΥ8Ο. Для получения спор для инициирования жидкой культуры применяли по два субклона на трансформант для инокуляции чашек ΡΏΑ. Жидкие культуры в 1С1 выращивали 5 дней при 27°С (встряхивание при 180 об./мин). После этого культуры центрифугировали (5000§, 10 мин). В полученных образцах измеряли активность лизоцима согласно Могзку е! а1. (ссылка 13).

Таблица Р

Уровни образования активного ΗβΖ в С1

	Концентрация активного НЬ2 в культуральной среде
Нетрансформированный N070-19	0 мг/л
N070-19::9700 клон 4	4 мг/л
N070-19::9700 клон 5	11 мг/л
Нетрансформированный ϋνΐ8-25	0 мг/л
υνΐ8-25::9700 клон 1	8 мг/л
υνΐ8-25::9700 клон 2	4 мг/л
□ν18-25::9700 клон 3	2 мг/л
ϋνΐ8-25::9700 клон 4	2,5 мг/л

Данные результаты показывают, что

1) пункты 1 и 2 примера 1 подтверждаются;

2) 811-Ые является функциональным в СНгузозрогшт в качестве маркера селекции;

3) 811-Ые является функциональным в СНгузозрогшт в качестве белка-носителя;

4) КЕХ2-подобный сайт расщепления протеазой является функциональным в СЬтузозрогшт (в противном случае ΗΕΖ не был бы активным);

5) СНгузозрогшт может быть применен в качестве хозяина для секреции гетерологичных белков млекопитающих.

(3). Секреция С1 ксиланазы II (ΧΥΝ2) ТпсНойегта геезеЁ

Штамм С1 иУ18-25 трансформировали плазмидами р1ЛТ064 и риТ1065. Плазмида риТ1064 представляет две следующие экспрессионные кассеты грибов.

Первая кассета обеспечивает селекцию устойчивых к флеомицину трансформантов: промотор гена 1 контроля перекрестного пути (срс-1) Хеигозрога сгазза (ссылка 14); ген 811-Ые устойчивости к флеомицину 81гер1оа11о1е1с1ш8 ЫпйиМапиз (ссылка 4); терминатор триптофансинтазы (1грС) А§регщ11и§ тпс1и1ап§ (ссылка 5).

Вторая кассета является кассетой образования ксиланазы: промотор сЫ11 штамма ТК2 Т. геезе! (ссылка 15);

ген хуп2 (включая ее сигнальную последовательность) штамма ТК2 Т. гее§е1 (ссылка 16);

терминатор сЫ11 штамма ТК2 Т. гее§е1 (ссылка 15). Вектор также несет старт репликации Е. сой из плазмиды риС 19 (ссылка 6). Подробная карта плазмиды представлена на фиг. 4.

риТ1065 представляет следующую экспрессионную кассету грибов:

промотор глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (§ράΑ) А§регщ11и§ тпс1и1ап§ (ссылка 2);

синтетическая сигнальная последовательность целлобиогидролазы I (сЫ11) ТпсНойегта гее§е1 (ссылки 1,3);

ген 811-Ые устойчивости к флеомицину 81гер1оа11о1е1сНи§ 1ппс1и§1апи§, примененный в качестве белка-носителя (ссылка 10);

линкерный пептид (8ОЕКК), сходный с КЕХ2-подобным сайтом расщепления протеазой (ссылка ^1); ген хуп2 (без сигнальной последовательности) штамма ТК2 Т. гее§е1 (ссылка 16);

терминатор триптофансинтазы (1грС) А§регщ11и§ тпс1и1ап§ (ссылка 5).

Вектор также несет ген бета-лактамазы (Ыа) и старт репликации Е. сой из плазмиды рЕГС18 (ссылка

6). Подробная карта плазмиды представлена на фиг. 5.

Протопласты С1 трансформировали плазмидой риТ1064 или риТ1065, следуя процедуре, уже описанной в примере 1. Гибридный белок (811-Ые::ΧΥΝ2) в плазмиде ρϋΤ1065 является функциональным в отношении устойчивости к флеомицину, что тем самым обеспечивает легкую селекцию трансформантов С1. Более того, степень устойчивости к флеомицину приблизительно коррелирует с уровнем экспрессии хуп2. В риТ1064 хуп2 клонировали со своей собственной сигнальной последовательностью.

Образование ксиланазы трансформантами С1 (устойчивыми к флеомицину клонами) анализировали с помощью теста на активность ксиланазы следующим образом. Первичные трансформанты переносили

-28006873 на чашки с ОЗ+флеомицин (5 мкг/мл) (подтверждение устойчивости), а также на чашки ΧΥΣΑΝ (ссылка

17) , на которых активность ксиланазы определяют посредством наблюдения просветления зон. Чашки выращивали в течение 5 дней при 32°С. Каждый подтвержденный клон субклонировали на чашках ΧΥΣΑΝ. Для получения спор для инокуляции жидкой культуры применяли по два субклона на трансформант для инокуляции чашек ΡΌΑ. Жидкие культуры в 1С1 + 5 г/л К⁺ фталат выращивали 5 дней при 27°С (встряхивание при 180 об./мин). После этого культуры центрифугировали (5000§, 10 мин). В полученных образцах измеряли активность ксиланазы с помощью метода ΌΝ8 согласно МШег е! а1. (ссылка

18) .

Таблица О

Уровни образования активной ΧΥΝ2 в С1 (лучшими продуцентами)

	Концентрация активной ксиланазы в культуральной среде	Удельная активность ксиланазы II в культуральной среде
^трансформированный υνΐδ-25	3,9 Ед/мл	3,8 Ед/мг суммарного бел.
υνΐ8-25::1064 клон 7-1	4,7 Ед/мл	4,7 Ед/мг суммарного бел.
υνΐ8-25::1064 клон 7-2	4,4 Ед/мл	4,3 Ед/мг суммарного бел.
υνΐ8-25: :1065 клон 1τ-1	29,7 Ед/мл	25,6 Ед/мг. суммарного бел.
υνΐ8-25::1065 клон 1-2	30,8 Ед/мл	39,4 Ед/мг суммарного бел.

Данные результаты показывают, что

1) пункты с 1 по 4 примера 2 подтверждаются;

2) С1 может быть применен в качестве хозяина для секреции гетерологичных белков грибов.

(4). Заключение.

В табл. Н показаны результаты для плазмид, с помощью которых проводили трансформацию ЦУ1825. Таблица показывает уровни экспрессии эндоглюканазы и целлобиогидролазы с применением гетерологичных регулирующих экспрессию последовательностей и сигнальных последовательностей, а также с применением гомологичных регулирующих экспрессию последовательностей и сигнальных последовательностей. Особенности различных плазмид можно найти в других частях описания, а также на фигурах. Образование происходит при щелочном рН при температуре 35°С.

Таблица Н

Данные по экспрессии трансформированным штаммом υνί8-25 (% относительно исходного штамма υν 18-25)

Культура	Суммарный белок мг/мл	СМСаза	β-глюканаза	Величина рН
ед/мл	ед/мг
ед/мл |	ед/мг
ЧУ 18-25	100%	100%	100%	100%	100%	7.90
1150-23	94%	105%	111%	140% '	149%	7,90
-30	96%	105%	110%	145%	151%	8.10
1152-3	94%	112%	120%	147%	156%	7.85
-4	100%	105%	105%	132%	132%	7,90
1160-2	69%	81%	118%	90%	131%	7.90
4	73%	72%	98%	83%	114%	8.35
-1	92%	95%	103%	120%	130%	8,45
1162-1	102%	105%	103%	145%	142%	8.20
-11	112%	109%	98%	115%	103%	8,20
Г6§-20	104%	102%	98%	130%	125%	7.90
-25	-	-	-		-	-

-29006873

Условия культивирования (встряхиваемые бутыли): 88 ч, 35°С, 230 об./мин.

Е. Конструирование генной библиотеки АзрещШиз зо)ае.

(1) . Векторная библиотека.

Геномную ДНК А. зо_)ае выделяли из протопластов, полученных из АТСС 11906, с помощью ранее описанного протокола (Рип!, уап беп Нопбе1, Ме!Ьобз Епхуто1. 1992 216:447-457). После изолирования ДНК экстрагировали из протопластов с применением протокола, описанного Ко1аг е! а1., Сепе 1988 62:127-34. После этого ДНК частично расщепляли с помощью МЬо1 для получения фрагментов ДНК со средним размером 30-50 т.п.н.

Вектор рАОругСсозагр1, который применяли для создания генной библиотеки, был сконструирован лигированием ВатН1-Нтб11-фрагмента размером 3 т.п.н. из рА№зСоз1 (Оз1етас/, Сигг Сепе!. 1994, 26:87-90) и Асс651-Нтб111-фрагмента размером 3,2 т.п.н. из рАО4.2 (Эе Кш!ег-1асоЬз е! а1., Сигг. Сепе!. 1989 16:159-63) в Асс651-ВатН1-расщепленную рНЕЬР1 (Сетз е! а1., Сепе 1991 98:61-67). Космидный вектор несет маркер селекции ругС А. огухае и самореплицируется в гифомицетах.

Расщепленную с помощью МЬо1 геномную ДНК лигировали с ВатН1-расщепленным рАОругСсозагр1, и смесь лигирования упаковывали в фаговые частицы с помощью векторного набора 81га1адепе 8ирегсоз1 (8!га!а§епе 1пс., Ьа бо11а СА). Это дало в общей сложности приблизительно 30000 индивидуальных клонов, обеспечивающих приблизительно 30-кратное представительство генома А. зо_)ае. Запас (в 15% глицерине) пулов полученных клонов хранили при -80°С для последующего использования.

(2) . Высокочастотная трансформация.

В качестве устойчивого к фтороротовой кислоте производного АТСС 11906 был выбран мутант А. зо)ае АТСС 11906ругС, как описано в заявке XVО 01/09352. Данный штамм, А. зо)ае АТСС 11906ругС, трансформировали двумя векторами, несущими ген ругС А. шдег. Один вектор, рАВ4-1 (Уап Нагйпдзуе1б! е! а1., Мо1. Сеп. Сепе!. 206:71-75 (1987)), несет лишь ген ругС, тогда как рАВ4-агр1 (Уегбоез е! а1., Сепе 146:159-165 (1994)) несет ген ругС и последовательность АМА1 А. шби1апз. Трансформация АТСС 11906ругС дала 5-10 трансформантов на микрограмм ДНК из рАВ4-1, тогда как частота с рАВ4-агр1 была по меньшей мере в 10-100 раз выше. Фенотипический анализ трансформантов показал, что фенотип ругС трансформантов рАВ4-агр1 поддерживается лишь при постоянной селекции, тогда как трансформанты рАВ4-1 были стабильными при наличии или в отсутствие селекции на фенотип ругС. Данные результаты подтверждают автономную репликацию введенной плазмидной ДНК в трансформантах рАВ4агр1. Сходные результаты были получены с другими векторами трансформации грибов, несущими последовательность АМА1 или ее производные, например с рАОругСсозагр1.

(3) . Конструирование трансформантной библиотеки грибов.

А. зо_)ае АТСС 11906ругС или родственные мутанты, в частности его мутанты с компактной морфологией, трансформировали генной библиотекой А. зо_)ае, основанной на векторе трансформации рАОругСсозагр1. Данный вектор ведет к высокой частоте трансформантов с легко реплицируемыми копиями вектора. Протопласты грибов обрабатывали, как описано в работе Рип! и уап беп Нопбе1, Ме!Ьобз Епхуто1. 1992 216:447-457, ДНК из космидной библиотеки, несущей клоны геномной ДНК грибов из А. зо)ае или СЬгузозрогшт, и последовательные разведения трансформированных протопластов помещали на селективные чашки агара для определения полученной частоты трансформаций. Оставшиеся протопласты восстанавливали в селективной среде в течение нескольких часов и хранили при 4°С. На основании результатов, полученных для частоты трансформаций (которая в зависимости от эксперимента может достигать нескольких тысяч трансформантов на микрограмм ДНК космидной библиотеки), предельные разведения восстановленных протопластов наносили на планшеты для микротитрования 96,248 или планшеты с другим форматом лунок, что давало один трансформированный протопласт на лунку. Планшеты инкубировали при 35°С до образования биомассы гриба. Полученную библиотеку трансформантов применяли в дальнейших экспериментах.

Сходную стратегию применяли для конструирования набора трансформантов грибов, несущих мутантные аллели СЬгузозрогшт СВН1. Данная стратегия может быть также использована с библиотекой мутантов, полученных для любого интересующего гена, созданных с помощью подходов с применением мутагенеза, перетасовки генов или генной эволюции.

Р. Индукция споруляции при ферментации погруженной культуры.

Многие грибы, такие как АзрегдШиз зо_)ае, не проявляют споруляции при погруженной ферментации. Здесь заявители описывают ранее неизвестный подход к получению споруляции при данных условиях. А. зо_)ае АТСС 11906, и, в частности, его мутанты с компактной морфологией роста выращивали в синтетической ростовой среде с добавкой дрожжевого экстракта. При данных условиях происходит быстрое накопление биомассы как в покоящихся, так и во встряхиваемых культурах. Однако в культуральной жидкости споруляция не происходит.

Сходная ростовая среда с добавлением 0,6 г/кг ЭДТА дает значительный выход спор, достигающий 10⁹ спор на мл культуральной жидкости после инкубации в течение 2-4 дней при 35°С.

- 30 006873

Синтетическая среда (+/-ЭДТА) г/кг среды

ΚΗ,ΡΟ*	2,5
Ш4С1	7,2
Мв5О4-7Н20	0,.7
СаС12-2Н20	0,2
Дрожжевой экстракт	20
Ζη5Ο4·7Η20	0г015
ΟοΟΙς'όΉχΟ	0,005
Си5О4>5Н20	0,016
Ре8О4 ,7Н20	0,040
НзВО4	0,005
ΚΙ	0.003
МпС1г-2Н20	0,012
МагМоО.-гнго	0,003
НОТА	(0,6 или 0,0)

рН доводят до 5,5 с помощью ХаОН/Н₃РО₄.

О. Системы трансформации для СЬгузозропит и АзрепрПиз.

(1) . Клонирование генаругЕ оротат-р-рибозилтрансферазы А. Νίςετ.

Многочисленные разнообразные системы трансформации для гифомицетов основываются на применении нуждающихся в уридине мутантных штаммов. Данные мутантные штаммы дефектны либо по оротидин-5-фосфатдекарбоксилазе (ΟΜΡΌ), либо по оротат-п-рибозилтрансферазе (ОРКТ). (Т. Ооозеп е! а1., Сигг Оепе!. 1987, 11:499-503; 1. Вериеге! е! а1., Оепе. 1984 32:487-92). Ранее заявители выделили ген ругО ΟΜΡΌ А. ш§ег (XV. Уап НагРпддуеМ! е! а1., Мо1. Оеп. Оепе!. 1987 206:71-5). Клонирование гена ОРКТ (ругЕ) А. ш§ег производили путем комплементации лишенного ругСг мутанта А. ш§ег, устойчивого к РОА, нуждающегося в уридине. Для комплементации применяли космидную библиотеку А. ш§ег в векторе рАОругОсозагрЕ Из комплементированных трансформантов были выделены геномные космидные клоны, несущие комплементирующий ген А. ш§ег, названный теперь ругЕ. ЗзШ-фрагмент размером 5,5 т.п.н., несущий ген ругЕ, клонировали в рВШЕЗСКГРТ (ТМ) (8!га!а§епе), что дало вектор рВШЕругЕ. Фрагмент размером 1,6 т.п.н. данного вектора, охватывающий кодирующую область ругЕ, секвенировали для подтверждения наличия гена ОРКТ (см. фиг. 15).

(2) . Ауксотрофная система трансформации для Сйгузозрогшт Ыскпомюпзе.

Нуждающиеся в уридине штаммы Сйгузозрогшт 1искпо!¥еп8е отбирали как устойчивые к фтороротовой кислоте производные С1 и ИУ 18-25 с помощью способов, описанных в РСТ публикации ХУО 01/09352. Селекция устойчивых к фтороротовой кислоте производных может вести к выделению двух типов нуждающихся в уридине мутантов, т.е. мутантов по оротидин-5-фосфатдекарбоксилазе (ΟΜΡϋ), либо мутантов по оротат-п-рибозилтрансферазе (ОРКТ) (Т. Ооозеп е! а1., Сигг Оепе!. 1987, 11:499-503). Для определения природы полученных мутантов Сйгузозропшп эксперименты по трансформации проводили с имеющимися в наличии генами А. П1§ег ругО (ΟΜΡΌ; вектор рАВ4-1, XV. Уап Наг!шрз\е1с1! е! а1., Мо1. Оеп. Степе!. 1987 206:71-5) и ругЕ (рВШЕ-ругЕ; ОРКТ). Как показано в табл. I, лишь трансформация мутантных штаммов геном ругЕ вела к образованию прототрофных трансформантов, что указывает на то, что штаммы Сйгузозропшп являются мутантами по ОРКТ. В соответствии с генной номенклатурой Сйгузозропшп, принятой заявителями, мутанты были обозначены как руг5.

Таблица I

Ген	Источник	Вектор1 4	□νΐ8ΕΟΑκ#4	С1#В
ΟΜΡϋ (РугО/руг4)	АзрегдШиз птдег	рАВ4-1	-	-
АзрегдШиз огугае	рАО4-2	-	-
Меигозрога сгазза	рОЭВЗ	-	-
ОРЕТ (ругЕ/руг5)	АзрегдШиз птдег	рВЫЗЕругЕ	+	+

1. рАВ4-1: XV. Уап НаПт»5\е1с1! е! а1., Мо1. Оеп. Оепе!. 1987 206:71-5.

2. рАО4-2: Υ. Ое Кш!ег-1асоЬз е! а1., Сигг. Оепе!. 1989 16:159-63.

3. ρϋΙΒ3: Э ВаПапсе, О. Тигпег, Мо1. Оеп. Оепе!. 1986 202:271-5.

4. рВЬиЕругЕ: см. выше.

-31 006873 (3) . Конструирование и применение автономно реплицируемых векторов трансформации грибов.

Основываясь на векторе рВЬиЕругЕ, были получены два производных, несущих последовательности, придающие свойство автономной репликации векторам, вводимым в гифомицеты. ΗίηάΙΙΙ-фрагмент размером 5,5 т.п.н., несущий последовательность АМА1 АкрегдШик ηίάιιίαηκ (I. Усгйоск с! а1., Оепе 1994 146:159-65) был введен в уникальный ΗίηάΙΙΙ-сайт рВЬиЕругЕ, что дало рВЬиЕрутЕ-АМА. ΗίηάΙΙΙфрагмент (частичный) размером 2,1 т.п.н., несущий теломерные последовательности человека (А. А1еккепко, Ь. Ιναηονα, Мо1. Осп. Оспе!. 1998 260:159-64), был введен в уникальный ΗίηάΙΙΙ-сайт рВЬиЕругЕ, что дало рВЬиЕругЕ-ТЕЬ. Данные векторы были введены в мутантные по ОРКТ штаммы АкрегдШик и Сйгукокрогшт, что дало прототрофные трансформанты. Несколько из полученных трансформантов проявили клочковатый фенотип, характерный для трансформантов, несущих свободно реплицируемые плазмиды (1. УеШоск е! а1., Сенс 1994 146:159-65).

(4) . Трансформация Сйтукокрогшш Шск^х-сикс.

Протокол основан на процедуре, исходно примененной для трансформации АкрегдШик (Р. РиШ, С. ναη άеη Ηηηάοΐ, МеШоάκ ίη Еηζуто1оду 1992 216:447-457). Обогащенную среду (250 мл) инокулировали спорами 10⁶ /мл мутанта Сйтукокрогшш руг5 (см. выше) в 1-л эрленмейеровской бутыле. Культуру выращивали в течение 24-48 ч при 35°С в воздушном инкубаторе (300 об./мин). Мицелий фильтровали через стерильный фильтр М1тас1оШ(ТМ) (Са1Ьюсйет) и промывали приблизительно 100 мл раствора №С1/СаС1₂ 1700 мосмоль (0,27 М СаС1₂/0,6 М ЫаС1). Мицелий взвешивали, после чего хранили на льду. Добавляли Сау1аке (ТМ) (Сау1а) (20 мг на грамм мицелия) и 1700 мосмоль ЫаС1/СаС1₂ (3,3 мл/г мицелия), и суспензию инкубировали при 33°С в воздушном инкубаторе (100 об./мин). Образование протопластов отслеживали с помощью микроскопа. Через 1-3 ч инкубации основная часть мицелия разрушалась, и в препарате в поле зрения микроскопа оставались преимущественно протопласты. Протопласты фильтровали через стерильный фильтр Мутас1оШ и фильтр промывали 1 объемом холодного 8ТС1700 (1,2 М сорбит/10 мМ Трис.НС1 рН 7,5/50 мМ СаС1₂/35 мМ ЫаС1). Протопласты осаждали центрифугированием при 2500 об./мин в течение 10 мин при 4°С. Осадок ресуспендировали в 8ТС1700 и вновь центрифугировали. После ресуспендирования осадка в 8ТС1700 определяли количество протопластов. Добавляли 8ТС1700 для получения конечной концентрации протопластов 2 х 10⁸ на мл.

ДНК-вектор (рАВ4-1 или рВЬиЕ-рутЕ, 1-10 мкг) наносили на дно стерильной пробирки и к ДНК добавляли 1 мкл 1М АТА (ауринтрикарбоновой кислоты) и 100 мкл протопластов (приблизительно 2 х 10⁷). В эксперимент включали отрицательный контроль с отсутствием ДНК. После перемешивания протопласты инкубировали при комнатной температуре в течение 25 мин. РЕС6000 (60% РЕС/50 мМ СаС12/10 мМ Трис рН 7,5) добавляли порциями следующим образом: 250 мкл, перемешивание, 250 мкл, перемешивание, 850 мкл и перемешивание. Раствор оставляли при комнатной температуре на 20 мин. После этого пробирки заполняли 8 мл 8ТС1700, перемешивали и центрифугировали при 2500 об./мин в течение 10 мин при 4°С, и осадок суспендировали в 250 мкл 8ТС1700. Аликвоты образца использовали для нанесения на селективную среду. Для селекции руг⁺ готовили чашки, содержащие 1,5% агар НаЦЕт, 1,2 М сорбит, 1х АкрА с нитратом, 2 мМ Мд8О₄-7Н₂О, 1х микроэлементы, 0,1% сакатшоа^к и 1% глюкозу. Для селекции на атά8 (и руг⁺) чашки содержали 1,5% агара Оxо^ά, 1,2 М сорбит, 2 мМ МдЗО^ЩО, 1х микроэлементы, 1% глюкозу, 1х АкрА без нитрата, 15 мМ СкС1 и 10 мМ ацетамида или акриламида. Чашки инкубировали при 30 или 35°С.

Споры и жизнеспособные протопласты до и после обработки РЕС6000 подсчитывали путем нанесения разведений в 8ТС1700 на чашки с минимальной средой с нитратом и с сорбитом или без него. На чашки без сорбита наносили 100 мкл разведении 10^-1, 10^-2 и 10^-3 для подсчета спор, и на чашки с сорбитом наносили 100 мкл разведении 10^-2, 10^-3 10^-4 и 10^-5 для подсчета жизнеспособных протопластов.

Результаты трансформаций показаны в табл. Ι.

Н. Отношение белок/биомасса.

Для штаммов Сйгукокрогшт, Т^^сйоάе^та и АкрегдШик, продуцирующих целлюлазы или амилазы, определяли сухое твердое вещество путем пропускания отмеренной аликвоты цельного бульона через предварительно взвешенный фильтр, промывки деионизированной водой и высушивания осадка и фильтра в течение ночи при 60°С и одного часа при 100°С. После охлаждения в эксикаторе биомассу определяли вычитанием массы фильтра из массы сухого фильтра плюс осадок и делением на объем отобранного бульона.

Для штаммов Т^^с1юάеπηа и АкрегдШик принимали, что биомасса равна суммарному твердому веществу, поскольку нерастворимого материала, отличного от биомассы, было мало в примененные периоды времени. В случае штаммов Сйгу ко кропит, продуцирующих целлюлазу, в среде находилось значительное количество целлюлозы, поэтому биомассу определяли по разнице между суммарными твердыми веществами и целлюлозой. Целлюлозу определяли следующим образом.

Отмеренные аликвоты цельного бульона центрифугировали для удаления твердых веществ и супернатант отбрасывали. Осадок ресуспендировали в объеме 0,1н. №1ОИ. равном исходному объему бульона, и добавляли одну десятую объема 0,5н. №1ОИ. Смесь инкубировали в течение 4 ч при 65°С. Данная обработка приводила к растворению всего, исключая целлюлозу. Щелочную смесь охлаждали и

- 32 006873 центрифугировали и супернатант отбрасывали. Полученный осадок дважды промывали путем ресуспендирования в деионизированной воде и центрифугирования. Промытый осадок ресуспендировали в деионизированной воде, переносили на предварительно взвешенную чашку и высушивали, как описано выше. Концентрацию целлюлозы определяли делением сухой массы на объем анализируемой аликвоты.

Белок определяли с помощью процедуры связывания красителя по Вгасйогс! (М. Вгасйогс!, 1976, Апа1. Вюсйеш. 72:248) с применением в качестве стандарта иммуноглобулина. Соотношение белок/биомасса для отдельных экспрессируемых белков в различных штаммах гифомицетов представлено в табл. I.

Таблица I

Фермент	Штамм	г белка на г биомассы
Нейтральная целлюлаза	СЕгузозрогтшп 1искпомепзе υνΐ8-25	8,2
Нейтральная целлюлаза	Сйгузозрогьит 1искпомепзе υν26-2	6,0
а-Амилаза	АзрегдШиз огугае 108-318	0,89
Глюкоамилаза	АзрегдШиз птдег	0,78
Глюкоамилаза	АзрегдШиз птдег	1,11
Кислая целлюлаза	Тг1с1эос1егта геезет А-34	0,89
Кислая целлюлаза	Тгьсйойегта геезеь А-1391	0, 65
Ксиланаза	Тгтсйодегта геезет Х-252	2,4

I. Экспрессия и секреция зеленого флуоресцентного белка у А. зо)ае и С. кюкпотуепзе.

В качестве примера универсального и поддающегося скринингу репортер но го белка в А. зо)ае и С. 1искпо\уеп8е экспрессировали зеленый флуоресцентный белок (ОГР) медузы Аесщопа У1с1опа. Векторы, несущие ген ОГР (А.8ап1егге Неппкзеп е! ак, М1сгоЫо1о§у. 1999, 145:729-734) и гибридный ген глюкоамилаза-ОГР (ρΟΡϋΟΓΡ, С.Оогйоп е! а1., М1сгоЫо1о§у. 2000 146:415-26), модифицировали заменой промотора §1аА на конститутивно экспрессируемый промотор §ράΑ А. шйи1ап8. Векторы вводили в А. зо)ае путем совместной трансформации, применяя в качестве маркера селекции либо ругО, либо ашй8. Вектор ρΟΡΌΟΓΡ и его производные вводили в Сйгузозропшп путем совместной трансформации, применяя в качестве маркера селекции либо ругЕ, либо атс18. Экспрессия давала ярко флуоресцирующие трансформанты А. 8о)ае и Сйгузозропшп, что служило подтверждением экспрессии ОГР обоими векторами. Флуоресценция культуральных супернатантов от трансформантов, экспрессирующих гибридный белок глюкоамилаза-ОГР, указывала на секрецию флуоресцентно активного гибридного белка. Экспрессия флуоресцентного белка наблюдалась также в спорах (или спороподобных артроспорах), полученных от различных трансформантов, экспрессирующих несекретируемый цитоплазматический вариант флуоресцентных белков.

I. Перенос ростовых единиц грибов.

Лунки 96-луночного планшета для микротитрования заполняют соответствующей средой либо вручную с помощью многоканальной пипетки, либо с помощью автоматической системы обработки планшетов. Большой объем повышает вероятность перекрестной инфекции, но для избежания проблем упаривания объем не должен быть слишком малым. Например, при применении круглодонного планшета СО8ТАК(ТМ) подходящим рабочим объемом является объем 150 мкл. Планшеты инокулируют спорами из растущих на чашках колоний, применяя для переноса зубочистки. В другом варианте планшеты можно инокулировать нанесением пипеткой маленьких аликвот суспензий спор, протопластов или элементов гиф. Данные суспензии могут брать начало от выделенных растворов спор/протопластов или от выращиваемых в микропланшете спорулируюших культур. Инокуляцию можно проводить также из планшетов для микротитрования с применением иглы или приспособления с 96 иглами.

После этого планшеты инкубируют при 35°С. Для снижения упаривания до минимума можно использовать планшеты с крышкой, или планшеты можно запаивать в мембрану, обеспечивающую обмен О₂, Н₂О и СО₂, и использовать наклейки на поверхность планшета. Для дополнительного ограничения упаривания можно применять инкубатор с контролируемой атмосферой.

После трех-четырех дней инкубации количество биомассы является достаточным для эффективного переноса на новые планшеты для микротитрования, содержащие свежую среду. Для получения реплик планшетов применяют приспособление с 96 иглами. Дочерние планшеты, содержащие другой порядок

-33 006873 культур. могут быть получены с помощью ручного или автоматического пипетирования или переносом с помощью иглы. Для того чтобы быть уверенным в наличии переносимых репродуктивных элементов на переносящих иглах. игольчатое приспособление погружают в культуру планшета для микротитрования и встряхивают в течение 20 с. После этого игольчатое приспособление осторожно вынимают из исходного планшета и делают отпечаток на новом планшете для микротитрования. Процедура переноса со сходной эффективностью может быть реализована также с применением многоканальной пипетки. переносящей приблизительно 1 мкл культуры исходного планшета для микротитрования. В обоих случаях эффективный перенос достигается благодаря присутствию переносимых репродуктивных элементов. таких как споры. спороподобные артроспоры. протопласты или фрагменты гиф или мицелия. Протопласты можно генерировать в лунках микропланшета обработкой ферментами. разрушающими клеточную стенку. с последующим переносом данных протопластов. Образование протопластов в микропланшетах было описано С. уап 2ец1 е! а1.. 1. Вю!есЬпо1. 1997 59:221-224.

Дополнительное улучшение переноса получают инкубацией культур планшета для микротитрования на шейкере для планшетов для микротитрования при 35°С. Это повышает количество способных к переносу репродуктивных элементов в культурах. Для хранения культур в планшете для микротитрования добавляют глицерин до конечной концентрации 15. и планшеты хранят при -80°С. Для последующих экспериментов по переносу планшеты размораживают. и перенос производят. как описано выше. Эффективный перенос штаммов А. шдег и А. зо_)ае дикого типа или их штаммов. имеющихся в продаже. в примененных здесь условиях был невозможен. поскольку эти штаммы проявляли сильный поверхностный рост и воздушную споруляцию через один день. Воздушная споруляция вызывает массовое перекрестное загрязнение во время переноса. а поверхностный рост. закрывающий лунки. затем препятствует проведению большой части известных способов анализа.

К. Конструирование экспрессионной библиотеки грибов для обнаружения генов.

На основе экспрессионного вектора грибов рАЫ52-1ЫОТ (доступ в ЕМВЬ Ζ32524) или одного из его производных был сконструирован вектор. в котором имеется уникальный сайт клонирования ВатН1 сразу после конститутивно экспрессируемого промотора широкого спектра хозяев-грибов гена дрбА А. шби1аиз. (Р. Рип! е! а1.. I. ВкксЬпоЕ 1991 17:19-33). Данный вектор был сконструирован таким образом. что фрагменты геномной ДНК. несущие кодон старта трансляции (АТС). могут экспрессироваться. Для обеспечения данного вектора маркером селекции клонировали Ыо!1-ВатН1-фрагмент из рВЬИЕругЕ в ЫоЙ-ВдШ-расщепленный экспрессионный вектор. названный рАЫ52-ВатН1. что дало вектор рАЫ52ругЕ. Фрагменты геномной ДНК СЬгузозропит размером в диапазоне 3-6 т.п.н. получали частичным расщеплением с помощью 8аи3А. После лигирования этих фрагментов в ВатН1-расщепленный экспрессионный вектор рАЫ52-ругЕ был получен ряд рекомбинантных клонов. достаточный для того. чтобы несколько раз охватить весь геном СЬгузозропит. Ряд этих клонов объединяли для охвата. по меньшей мере. 5-10 экв. генома гриба. Получали плазмидную ДНК данных пулов и применяли для трансформации мутантов СЬгузозропит руг5 или АзрегдШиз ругЕ. Коллекции трансформантов получали в микропланшетном формате. как описано выше. и применяли для последующего скрининга функции/активности. В другом варианте экспрессионную библиотеку можно сконструировать с применением специфически регулируемых промоторов СЬгузозропит. как описано в РСТ/ЫЬ 99/00618.

Ссылки. цитированные в примерах (Содержание следующих и все патенты и ссылки. цитированные здесь выше. включены здесь в качестве ссылки):

1. Са1те1з Т.Р.. Магйп Е.. Эигапб Н.. апб ТиаЬу С. (1991) Рго1ео1у11с еуеШз т Ше ргосеззтд оГ зесге!еб рго!етз т Гипдг I. Вю1есЬпо1. 17(1):51-66.

2. Рип! Р.Е. Вз^етате М.А.. .(асоЬз-Меузтд В.Е. Рои\\'е1з Р.Н.. апб уап беп Напбе1 С.А. (1988) 1зо1айоп апб сЬагас1епха1кп оГ !Ье д1усега1беЬубе-3-рЬозрЬа!е беЬубгодепазе депе оГ АзрегдШиз шбЫапз. Сепе 69(1):49-57.

3. 8Ьоетакег 8.. 8сЬ\геккаг1 V.. Ьабпег М.. Се1Гапб Ό.. К\\'ок 8.. МуатЬо К.. апб 1птз М. (1983) Мо1еси1аг с1оптд оГ ехо-се11оЫоЬубго1азе I бейуеб Ггот ТпсЬобегта геезеп зйат Ь27. Вк/ТесЬпокду Ос!:691-696.

4. Вгосоий Ό.. Са1те1з Т.. Воупез ЕР.. Вагоп М.. апб ТиаЬу С. (1990) Саззейез оГ !Ье 8!гер!оа11о!е1сЬиз Ьтбиз!ашз Ь1е депе Гог ί^аизГо^тайои оГ 1о\гег апб ЫдЬег еикагуо!ез !о рЬ1еотуст гез1з1апсе. Ыис1е1с Ас1бз Все. 18(13):4009.

5. Мийапеу Е.Е. Натег ЕЕ.. ВоЬегй К.А.. УеЬоп М.М.. апб Т1тЬег1аке №.Е. (1985) Рйтагу з!гис!иге оГ Ше !грС депе Егот АзрегдШиз шбкапз. Мо1. Сеп. Сепе!. 199(1):37-45.

6. УашзсЬ-Реггоп С.. Укие I.. апб Меззтд I. (1987) 1тргоуеб М13 рЬаде с1оптд уес!огз апб Ьоз! зйатз: пискойбе зесщепсез оГ !Ье М13тр18 апб рИС19 уес!огз. Сепе 33:103-119.

7. Бигапб Н.. Вагоп М.. Са1те1з Т.. апб ТиаЬу С. (1988) С1аззка1 апб то1еси1аг депейсз аррйеб !о ТпсЬобегта геезе1 Гог Ше зексйоп оГ 1тргоуеб се11и1о1уйс тбиз!йа1 зйатз. т ВксЬет1зйу апб депейсз оГ се11и1озе бедгабайоп. ЕР. АиЬей. Ебйог. Асабетк Ргезз. рр. 135-151.

8. ЬоМу О.Н.. ВозеЬгоидЬ Ы.Е. Еагг А.Ь.. апб Вапба11 В.Е (1951) Рго!ет теазпгетеШз \\Ш1 !Ье Го1т рЬепо1 геадеп!. I. Вю1. СЬет 193. 265-275.

- 34 006873

9. Рапкско М.. Воиххоп ЕС.. Вагоп М.. апк Т1гаЬу С. Оеуе1ортеп1 оГ ке!его1одоих рго!еш хесгейоп хух!етх ш ГкатепЮих Гипдк т 3гк Еигореап СопГегепсе оп Рипда1 Сепексх. 1996. Мипх!ег. Сегтапу.

10. Вагоп М.. Т1гаЬу С.. Са1те1х Т.. Раггкке М.. апк. Опгапк Н. (1992) ЕГГккп! хесгекоп оГ китап 1ухохуте Гихек !о !ке 8к-Ь1е рккотуст гех1х1апсе рго!ет Ьу !ке Гипдих То1урос1акшт деокех. ЕВю1ескпо1. 24(3):253-266.

11. кепех Ό.Ε. Магсхтке В.. МасКеп/1е Ό.Λ.. апк Агскег Э.В. (1993) А 1гппса1ек д1исоату1ахе депе Гихюп Гог ке!его1одоих рго!еш хесге!юп Ггот АхрегдШих шдег. РЕМ8 МкгоЬюк Ье!!. 107(2-3):267-271.

12. 8!опе Р.Е. МакоГГ А.Е. Рапхк ЕН.. апк КакГогк А. (1993) С1ошпд апк хедпепсе-апа1ух1х оГ !ке д1исоату1ахе депе оГ пеигохрога-сгахха. Сиггеп! Сепексх 24(3):205-211.

13. Могхку Р. (1983) ТигЫШтейк ке!егт!пайоп оГ 1ухохуте \\Ш1 Мкгососсих 1ухоке1кйсих се11х: Кеехатшакоп оГГ геаскоп сопкйюпх. Апа1уйса1 Вюскет. 128:77-85.

14. Ра1ик ЕЬ. ОгЬаск МЛ.. ЬедегЮп. Т.Ь.. апк УепоГхку С. (1988) Тке сгохх-ра!ктеау соп!го1 депе оГ №игохрога сгахха. орс-1. епсокех а рго!еш х1тйаг !о ССШ оГ уеах! апк !ке ^NА-Ь^πк^πд коташ оГ !ке опсодепе удип-епсокек рго!еш. Ргос. №111. Асак. 8ск И8А 85(11):3728-32.

15. №1кап Т.. Оппе1а М.Ь.. 11теп М.. №уа1ашеп К.. апк РепйПа М. (1994) Рипда1 ргото!егх аскуе ш !ке ргехепсе оГ д1исохе. 1п!етайипа1 ра!еп! аррксакоп \УО 94/04673.

16. Тоггопап А.. Маск К.Ь.. Меххпег К.. Сопхакх К.. Ка11е1етеп N.. Нагкк1 А. апк КиЫсек С.Р. (1992) Тке Его та.)ог ху1апахех Ггот Тпскокегта геехек скагасЮпхакоп оГ Ьо!к епхутех апк депех. Вюкскпокду 10(11): 1461-5.

17. Рагках У. (1985) №ус1 текк Гог ке!ес!юп оГ ткгоЫа1 ргокисегх оГ се11и1аха апк ху1апахе. РЕМ8 МкгоЬю1 Ьейегх 28:137-140.

18. М111ег С.Ь. (1959) Ихе оГ к1п11гохаНсу 11с ас1к геадеп! Гог кекгтшайоп оГ гекистд хидаг. Апа1. Скет. 31:426-428.

19. Рип! Р.Е. Ма!!егп ЕЕ.. уап кег Нопке1 С.А.М.ЕЕ (1988) А уес!ог Гог АхрегдШих (гапхГогтаЕоп сопГетпд рккотуст гех1х1апсе. Рипда1 Сепейсх №\\'х1е11ег 35. 25-30.

Claims (32)

1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

   1. Способ экспрессии множества белков. кодируемых библиотекой ДНК-векторов. включающей многочисленные различные векторы. причем каждый вектор содержит отдельную кодирующую белок последовательность нуклеиновой кислоты. функционально связанную с областью. регулирующей экспрессию. и. необязательно. с последовательностью. обеспечивающей секрецию белка. включающий следующие стадии:

   (a) получение гриба гифомицета. имеющего фенотип. характеризующийся ростом в суспензии и образованием переносимых репродуктивных элементов в суспензии;

   (b) стабильную трансформацию указанного гриба гифомицета указанной библиотекой ДНКвекторов таким образом. чтобы ввести в каждый индивидуальный гриб по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты. кодирующей белок;

   (c) культивирование трансформированных гифомицетов в условиях. обеспечивающих образование переносимых репродуктивных элементов в суспензии;

   (к) отделение друг от друга указанных переносимых репродуктивных элементов и (е) культивирование индивидуальных переносимых репродуктивных элементов с получением моноклональных культур или моноклональных колоний в условиях. обеспечивающих экспрессию указанных белков.
2. 2. Способ по п.1. дополнительно включающий после стадии (е) следующие стадии: выделение указанных белков и оценку белка в отношении интересующей активности или свойства.
3. 3. Способ скрининга множества белков. кодируемых библиотекой ДНК-векторов. на интересующую активность или свойство. включающий следующие стадии:

   (a) обеспечение экспрессии многочисленных белков в моноклональных культурах или моноклональных колониях грибов гифомицетов с помощью способа по п.1 и (b) скрининг индивидуальных моноклональных культур или моноклональных колоний на интересующую активность или свойство.
4. 4. Способ получения ДНК. кодирующей белок. обладающий интересующей активностью или свойством. включающий следующие стадии:

   (a) обеспечение экспрессии многочисленных белков в моноклональных культурах или колониях грибов гифомицетов с помощью способа по п.1;

   (b) скрининг индивидуальных моноклональных культур или моноклональных колоний на интересующую активность или свойство и (c) выделение ДНК из моноклональной культуры или моноклональной колонии. проявляющей интересующую активность или свойство.
5. 5. Способ по п.4. дополнительно включающий секвенирование указанной ДНК.

   - 35 006873
6. 6. Способ скрининга многочисленных моноклональных культур или колоний грибов гифомицетов на метаболиты, обладающие интересующей активностью или свойствами, включающий следующие стадии:

   (a) обеспечение экспрессии многочисленных белков в моноклональных культурах или колониях грибов гифомицетов с помощью способа по п.1 и (b) скрининг каждой индивидуальной моноклональной культуры или моноклональной колонии на интересующую активность или свойство.
7. 7. Способ оптимизации интересующей активности или свойства белка, включающий следующие стадии:

   (a) получение библиотеки векторов, которая включает последовательности ДНК, кодирующие мутантные формы белка;

   (b) получение гриба гифомицета, имеющего фенотип, характеризующийся ростом в суспензии и образованием переносимых репродуктивных элементов в суспензии;

   (c) стабильную трансформацию указанного гриба гифомицета указанной библиотекой ДНКвекторов таким образом, чтобы ввести в каждый индивидуальный переносимый репродуктивный элемент по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок;

   (д) культивирование трансформированных грибов гифомицетов в условиях, обеспечивающих образование переносимых репродуктивных элементов в суспензии;

   (е) отделение друг от друга множества переносимых репродуктивных элементов;

   (ί) культивирование индивидуальных переносимых репродуктивных элементов с получением моноклональных культур или моноклональных колоний в условиях, обеспечивающих экспрессию указанных белков;

   (д) скрининг каждой индивидуальной моноколональной культуры или моноклональной колонии на интересующую активность или свойство экспрессируемого белка;

   (Н) выделение одной или более индивидуальных моноклональных культур или моноклональных колоний, которые экспрессируют белок, проявляющий интересующую активность или свойство;

   (ί) осуществление мутагенеза ДНК, которая кодирует белок, проявляющий интересующую активность или свойство, из выделенных индивидуальных моноклональных культур или моноклональных колоний, которые экспрессируют белок, проявляющий интересующую активность или свойство;

   (ί) получение библиотеки векторов, содержащих мутантные последовательности ДНК, полученные на стадии (1); и (к) повторение этапов с (Ь) по (д) до тех пор, пока либо не будет достигнут желаемый уровень интересующего свойства или активности, либо не будет прекращено дальнейшее улучшение.
8. 8. Способ по п.7, дополнительно включающий между стадиями (Н) и (ί) стадии культивирования одной или более индивидуальных моноклональных культур или моноклональных колоний, выделенных на стадии (Н); выделение экспрессируемого белка, проявляющего интересующую активность или свойство и оценку выделенного белка в отношении интересующего свойства.
9. 9. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому гриб имеет фенотип, характеризующийся вязкостью культуры менее 200 сП в конце ферментации при выращивании в суспензии с адекватными питательными веществами при оптимальных или близких к оптимальным условиях.
10. 10. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому гриб имеет фенотип, характеризующийся вязкостью культуры менее 100 сП в конце ферментации при выращивании в суспензии с адекватными питательными веществами при оптимальных или близких к оптимальным условиях.
11. 11. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому гриб имеет фенотип, характеризующийся вязкостью культуры менее 60 сП в конце ферментации при выращивании в суспензии с адекватными питательными веществами при оптимальных или близких к оптимальным условиях.
12. 12. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому гриб имеет фенотип, характеризующийся вязкостью культуры менее 10 сП в конце ферментации при выращивании в суспензии с адекватными питательными веществами при оптимальных или близких к оптимальным условиях.
13. 13. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому векторы содержат сигнальную последовательность гриба.
14. 14. Способ по п.13, согласно которому сигнальная последовательность гриба представляет собой сигнальную последовательность целлюлазы, β-галактозидазы, ксиланазы, пектиназы, эстеразы, протеазы, амилазы, полигалактуроназы или гидрофобина.
15. 15. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому векторы содержат нуклеотидную последовательность, кодирующую селектируемый маркер.
16. 16. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому векторы содержат область регуляции экспрессии, функционально связанную с кодирующей белок последовательностью нуклеиновой кислоты.
17. 17. Способ по п.16, согласно которому область регуляции экспрессии представляет собой индуцируемый промотор.
18. 18. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому гриб относится к классу Еиаксотусе1ек.
19. 19. Способ по п.18, согласно которому гриб относится к порядку Опудепа1ек или Еиго11а1ек.

    - 36 006873
20. 20. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому гриб относится к типу Азсотусо1а при условии, что он не относится к порядку 8ассйаготусе1а1ез.
21. 21. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому гриб относится к роду, выбранному из группы, состоящей из АзрегдШиз, Тпсйокегта, Сйгузозропит, Ыеигозрога, РЫхотисог, Напзепи1а, Нитко1а, Мисог, То1урос1акшт, Ризалит, РешсШшт, Та1аготусез, Етепсе11а и Нуросгеа.
22. 22. Способ по п.21, согласно которому гриб относится к роду, выбранному из группы, состоящей из АзрегдШиз, Ризалит, Сйгузозропит и Тпсйокегта.
23. 23. Способ по п.22, согласно которому гриб представляет собой штамм ИУ18-25 Сйгузозропит 1искпо\\'епсе УКМ Р-3631 Ό, или штамм Х-252 Тпсйокегта 1опд1ЬгасЫа1ит, или штамм рс1А АзрегдШиз зо.)ае, или штамм рс1А АзрегдШиз шдег.
24. 24. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому отношение экспрессируемого белка к биомассе гриба составляет по меньшей мере 1:1, предпочтительно по меньшей мере 2:1, более предпочтительно по меньшей мере 6:1, наиболее предпочтительно по меньшей мере 8:1.
25. 25. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому переносимыми репродуктивными элементами являются индивидуальные клетки гриба.
26. 26. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому переносимыми репродуктивными элементами гриба являются споры, фрагменты гиф или микрочастицы.
27. 27. Способ по любому из пп.1-8, согласно которому переносимыми репродуктивными элементами являются протопласты.
28. 28. Способ получения белка, обладающего интересующей активностью или свойством, включающий следующие стадии:

    (a) скрининг многочисленных белков, кодируемых библиотекой ДНК-векторов, на интересующую активность или свойство с помощью способа по п.3;

    (b) культивирование в подходящем масштабе моноклональной культуры или моноклональной колонии, проявляющей интересующую активность или свойство, в условиях, обеспечивающих экспрессию белков; и (c) выделение экспрессированного белка.
29. 29. Способ получения белка, обладающего интересующей активностью или свойством, включающий оптимизацию указанной интересующей активности или свойства с помощью способа по п.7 или 8, путем культивирования в подходящем масштабе индивидуальной моноклональной культуры или моноклональной колонии, выделенной, как указано на стадии (й) п.7, и выделение экспрессированного белка из указанной культуры или колонии.
30. 30. Способ получения коллекции индивидуальных трансформированных грибов гифомицетов, включающий следующие стадии:

    (a) получение гриба гифомицета, имеющего фенотип, характеризующийся ростом в суспензии и образованием переносимых репродуктивных элементов в суспензии; и (b) стабильную трансформацию указанного гриба гифомицета библиотекой ДНК-векторов таким образом, чтобы ввести в каждый индивидуальный переносимый репродуктивный элемент по меньшей мере одну последовательность нуклеиновой кислоты, кодирующую белок;

    причем указанная библиотека ДНК-векторов включает многочисленные различные векторы, причем каждый вектор содержит отдельную кодирующую белок последовательность нуклеиновой кислоты, функционально связанную с областью, регулирующей экспрессию и, необязательно, с последовательностью, обеспечивающей секрецию белка.
31. 31. Коллекция индивидуальных трансформированных грибов гифомицетов, полученная с помощью способа по п.30.
32. 32. Способ получения трансформированного гифомицета-хозяина, экспрессирующего белок с интересующей активностью или свойством, включающий следующие стадии:

    (a) скрининг множества белков, кодируемых библиотекой ДКН-векторов, на интересующую активность или свойство с помощью способа по п.3; и (b) выделение моноклональной культуры или моноклональной колонии указанного гифомицетахозяина, экспрессирующей белок с интересующей активностью или свойством.