JP2020503037A - 遺伝子操作および株精製のための自動化ステップを使用する真菌産生株を構築する方法 - Google Patents

遺伝子操作および株精製のための自動化ステップを使用する真菌産生株を構築する方法 Download PDF

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Abstract

本開示は、自動化を利用する、糸状菌細胞の形質転換、スクリーニング、および選択のためのハイスループット（ＨＴＰ）微生物ゲノム操作方法およびシステムを提供する。本方法およびシステムは、ホモカリオンの形質転換糸状菌細胞を精製するために、ＨＴＰ選択および対抗選択を利用する。さらに、本開示は、糸状菌細胞に由来するプロトプラストの産生および長期保存のための方法を提供する。本開示は、自動化されたハイスループットプラットフォームにおける糸状菌の遺伝子操作に固有の課題の多くを克服する。

Description

関連出願への相互参照
この出願は、２０１６年１２月３０日に出願された米国仮出願第６２／４４１，０４０号（これは、全ての目的のためにその全体が参考として本明細書に援用される）からの優先権を主張する。
本開示は、自動化された真菌ゲノム操作を対象とする。本開示の自動化されたゲノム操作プラットフォームは、真菌産生株を生成するだけでなく、その精製を容易にするための糸状菌の遺伝子操作を伴う。結果として生じる真菌産生株は、例えば、目的の産物（例えば、抗生物質、代謝産物、タンパク質など）を商業適用で大規模産生するために、液内培養下で増殖させるのによく適している。
真核細胞は、ポリペプチドおよび二次代謝産物の産生に好適な生物である。実際、糸状菌は、天然タンパク質および異種タンパク質を高いレベルまで発現させることができることから、工業、医薬品、動物の健康、ならびに食品および飲料の適用で酵素および他のタンパク質を大規模産生するのによく適している。しかしながら、目的の産物の大規模産生のための糸状菌の使用は、多くの場合、前記真菌の遺伝子操作、ならびに自動化された機械類および機器の使用を必要とし、糸状菌の生活環のある特定の態様は、遺伝子操作およびハンドリングを困難にする場合がある。
例えば、真菌に導入されたＤＮＡは、ゲノム内でランダムに組み込まれ、かなりの頻度で複数のタンデムリピートとして組み込まれ得る、主にランダムに組み込まれたＤＮＡ断片をもたらす（例えば、Ｃａｓｑｕｅｉｒｏら、１９９９年、Ｊ． Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．、１８１巻：１１８１〜１１８８頁を参照されたい）。発現カセットのこうした無制御の「ランダムな多重組込み」は、宿主のゲノムの望まれない改変をもたらし得る、潜在的に有害なプロセスであり得る。
さらに、糸状菌のための現在のトランスフェクションシステムは、非常に面倒であり（総説については、Ｆｉｎｃｈａｍ、１９８９年、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｒｅｖ．、５３巻：１４８〜１７０頁を参照されたい）、本質的に比較的小規模であり得る。これには、プロトプラストの形成、粘性液体のハンドリング（すなわち、ポリエチレングリコール溶液）、ガラス管の１つずつの回旋、およびその後の選択的平板培養が伴い得る。さらに、プロトプラスト形成（ｐｒｏｔｏｐｌａｓｔｉｎｇ）のための条件は、決定するのが困難な場合があり、収率は、多くの場合、かなり低い場合がある。さらに、プロトプラストは、複数の核を含有する場合があり、その結果、所望の遺伝子操作の導入は、ホモカリオン状プロトプラストから分離するのが困難であり得るヘテロカリオン状プロトプラストの形成をもたらし得る。
さらに、プロトプラストに由来するものを含む典型的な糸状菌細胞は、菌糸体と呼ばれる菌糸の密なネットワークを形成し得る、菌糸と呼ばれる長い繊維として増殖する。これらの菌糸は、遺伝子型が互いと異なり得る複数の核を含有する場合がある。菌糸は、分化し、空気中に容易に分散し得る無性胞子を形成することができる。菌糸が遺伝子型の異なる核を含有する場合、胞子もまた、核の混合物を含有することになる。真菌増殖のこの態様のため、遺伝子操作は、本質的に、作られた遺伝子変化の何らかの効果を評価するために均一になるまで精製されなければならない混合集団をもたらす。さらに、自動化された環境では、胞子が機器の汚染を引き起こす場合があり、これにより、株を精製する能力が悪影響を受ける可能性があり、かつ機器に対して実施された何らかの他の作業で汚染が生じ得る。
胞子の空気分散を軽減するため、糸状菌を液内培養下で増殖させることがある。しかしながら、液内培養下の糸状菌菌糸増殖によって形成された菌糸体は、ブロスのレオロジー特性に影響を及ぼす場合がある。一般に、ブロスの粘度が高いほど、酸素および栄養分の分布は不均一になり、培養物を撹拌するために、より多くのエネルギーが必要になる。一部の場合では、糸状菌菌糸増殖に起因するブロスの粘度は、酸素および栄養分の溶解に著しく干渉するほど十分に高くなり、それにより、真菌の増殖、そして最終的には、任意の所望される目的の産物の収率および生産性に有害な影響を及ぼす。
Ｃａｓｑｕｅｉｒｏら、Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．（１９９９年）１８１巻：１１８１〜１１８８頁 Ｆｉｎｃｈａｍ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．（１９８９年）５３巻：１４８〜１７０頁
よって、当技術分野において、真菌における従来型の株構築プログラムに固有の上述した欠点がなく、有益な変異を発見および併合するプロセスを大いに加速する、糸状菌を操作する新しい方法についての大きな必要性が存在する。
本開示は、自動化されたハイスループットプラットフォームにおける糸状菌の遺伝子操作に固有の課題の多くを克服する。本明細書に提供される方法は、自動化された同時形質転換、または自動化されたスプリットマーカー設計の形質転換を、形質転換体の自動化されたスクリーニングと組み合わせて使用し、遺伝子変化を組み込むことにより、真菌産生株を生成するように設計されており、これにより、有性交配（ｓｅｘｕａｌ ｃｒｏｓｓ）を経由することなく、２つの株間の遺伝形質の交換が可能になる。本開示は、多数のプロトプラストを生成するための手順、およびそれらを後に使用するために保存する手段も提供する。大量の容易に利用可能なコンピテント細胞は、自動化を大幅に促進することができる。
一局面では、本明細には、糸状菌株を産生するための方法であって、ａ）糸状菌細胞の培養物から調製された、複数のプロトプラストを提供するステップと、ｂ）前記複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換するステップであって、前記第１のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接した第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の第２の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接した第２のポリヌクレオチドを含み、形質転換が、相同組換えによる、前記第１の遺伝子座への前記第１のコンストラクトの組込み、および前記第２の遺伝子座への前記第２のコンストラクトの組込みをもたらし、少なくとも前記第２の遺伝子座が、前記プロトプラストゲノム内の第１の選択可能マーカー遺伝子であり、前記第１のポリヌクレオチドが、変異および／または遺伝子制御エレメントを含む、ステップと、ｃ）選択および対抗選択を実施することにより、ホモカリオンの形質転換体を精製するステップと、ｄ）前記糸状菌細胞の再生を促す培地において、精製された前記形質転換体を増殖させるステップとを含む、方法が提供される。別の局面では、本明細には、糸状菌株を産生するための方法であって、ａ）糸状菌細胞の培養物から調製された、複数のプロトプラストを提供するステップと、ｂ）前記複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換するステップであって、前記第１のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の遺伝子座に相同なヌクレオチドが隣接した第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の前記遺伝子座に相同なヌクレオチドが隣接した第２のポリヌクレオチドを含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、選択可能マーカーの相補的な部分を含み、前記第１のコンストラクトおよび／または前記第２のコンストラクトが、変異または遺伝子制御エレメントをさらに含み、形質転換が、相同組換えによる、前記遺伝子座への前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドならびに前記変異または前記遺伝子制御エレメントの組込みをもたらす、ステップと、ｃ）選択および対抗選択を実施することにより、ホモカリオンの形質転換体を精製するステップと、ｄ）前記糸状菌細胞の再生を促す培地において、精製された前記形質転換体を増殖させるステップとを含む、方法が提供される。
一部の場合では、前記複数のプロトプラストのうちの各プロトプラストは、複数の第１のコンストラクトのうちの単一の第１のコンストラクトおよび複数の第２のコンストラクトのうちの単一の第２のコンストラクトで形質転換され、前記複数の第１のコンストラクトのうちそれぞれの第１のコンストラクトにおける前記第１のポリヌクレオチドが、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを含み、前記複数の第２のコンストラクトのうちそれぞれの第２のコンストラクトにおける前記第２のポリヌクレオチドが同一である。一部の場合では、前記方法は、ステップａ〜ｄを繰り返して糸状菌細胞のライブラリーを生成するステップをさらに含み、前記ライブラリーにおける各糸状菌細胞が、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを有する第１のポリヌクレオチドを含む。一部の場合では、前記第１のポリヌクレオチドは、標的糸状菌遺伝子または異種遺伝子をコードする。一部の場合では、前記変異は、一塩基多型である。一部の場合では、遺伝子制御は、プロモーター配列および／またはターミネーター配列である。一部の場合では、前記複数のプロトプラストは、マイクロタイタープレートのウェルに分配される。一部の場合では、ステップａ〜ｄは、マイクロタイタープレートのウェルにおいて実施される。一部の場合では、前記マイクロタイタープレートは、９６ウェル、３８４ウェル、または１５３６ウェルのマイクロタイタープレートである。一部の場合では、前記糸状菌細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはこれらの完全世代もしくは不完全世代および同義語もしくは分類学的等価物から選択される。一部の場合では、前記糸状菌細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒである。一部の場合では、前記糸状菌細胞は、菌糸体を形成しない表現型を有する。一部の場合では、前記真菌細胞は、非機能性の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）経路を有する。一部の場合では、前記ＮＨＥＪ経路は、前記ＮＨＥＪ経路のコンポーネントに対する抗体、化学阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、またはアンチセンスもしくはＲＮＡｉ分子に前記細胞を曝露することによって非機能性にされている。一部の場合では、前記第１の遺伝子座は、前記標的糸状菌遺伝子のためのものである。一部の場合では、前記第１の遺伝子座は、前記プロトプラストゲノムにおける第２の選択可能マーカー遺伝子のためのものである。一部の場合では、前記第２の選択可能マーカー遺伝子は、栄養要求性マーカー遺伝子、発色マーカー遺伝子、または方向性マーカー遺伝子から選択される。一部の場合では、前記第１の選択可能マーカー遺伝子は、栄養要求性マーカー遺伝子、発色マーカー遺伝子、または方向性マーカー遺伝子から選択される。一部の場合では、前記第２のポリヌクレオチドは、栄養要求性マーカー遺伝子、方向性マーカー遺伝子、または抗生物質耐性遺伝子から選択される。一部の場合では、前記発色マーカー遺伝子は、ａｙｇＡ遺伝子である。一部の場合では、前記栄養要求性マーカー遺伝子は、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される。一部の場合では、前記方向性マーカー遺伝子は、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子、硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）、または硫酸パーミアーゼ（Ｓｕｔ Ｂ）遺伝子から選択される。一部の場合では、前記抗生物質耐性遺伝子は、ｂｌｅ遺伝子であり、前記ｂｌｅ遺伝子は、フレオマイシン（ｐｈｅｏｍｙｃｉｎ）への耐性を付与する。一部の場合では、前記第１の選択可能マーカー遺伝子は、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドは、ｐｙｒＧ遺伝子である。一部の場合では、前記第１の選択可能マーカー遺伝子は、ｍｅｔ３遺伝子であり、前記第２の選択可能マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドは、ｐｙｒＧ遺伝子である。一部の場合では、前記複数のプロトプラストは、糸状菌細胞の前記培養物中の前記糸状菌細胞から細胞壁を除去するステップと、前記複数のプロトプラストを単離するステップと、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む混合物中に、単離された前記複数のプロトプラストを再懸濁させるステップであって、ＤＭＳＯの最終濃度が７％ｖ／ｖまたはそれ未満である、ステップとによって調製される。一部の場合では、前記混合物は、ステップａ〜ｄを実施する前に少なくとも−２０℃または−８０℃で保存される。一部の場合では、前記培養物は、少なくとも１リットルの体積である。一部の場合では、前記培養物は、前記プロトプラストの調製前に少なくとも１２時間にわたって増殖させられる。一部の場合では、真菌培養物は、前記プロトプラストの少なくとも７０％がより小さくなり、かつより少ない核を含有する条件下で増殖させられる。一部の場合では、前記細胞壁を除去するステップは、酵素消化によって実施される。一部の場合では、前記酵素消化は、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実施される。一部の場合では、前記方法は、前記プロトプラストを保存する前に、ＤＭＳＯを含む前記混合物に４０％ｖ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加するステップをさらに含む。一部の場合では、前記ＰＥＧは、８％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度まで添加される。一部の場合では、ステップａ〜ｄが自動化されている。
別の局面では、本明細書において、保存のための糸状菌細胞を調製するための方法であって、糸状菌細胞を含む真菌培養物からプロトプラストを調製するステップであって、前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞から細胞壁を除去することを含む、ステップと、前記プロトプラストを単離するステップと、７％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む混合物中に、単離された前記プロトプラストを再懸濁させるステップとを含む、方法が提供される。一部の場合では、前記混合物は、少なくとも−２０℃または−８０℃で保存される。一部の場合では、前記真菌培養物は、少なくとも１リットルの体積である。一部の場合では、前記真菌培養物は、前記プロトプラストの調製前に少なくとも１２時間にわたって増殖させられる。一部の場合では、前記真菌培養物は、前記プロトプラストの少なくとも７０％がより小さくなり、かつより少ない核を有する条件下で増殖させられる。一部の場合では、前記細胞壁を除去するステップは、酵素消化によって実施される。一部の場合では、前記酵素消化は、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実施される。一部の場合では、前記方法は、前記プロトプラストを保存する前に、ＤＭＳＯを含む前記混合物に４０％ｖ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加するステップをさらに含む。一部の場合では、前記ＰＥＧは、８％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度まで添加される。一部の場合では、前記方法は、前記プロトプラストを保存する前に、前記プロトプラストをマイクロタイタープレートに分配するステップをさらに含む。一部の場合では、前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞は、菌糸体を形成しない表現型を有する。一部の場合では、前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはこれらの完全世代もしくは不完全世代および同義語もしくは分類学的等価物から選択される。一部の場合では、前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはその完全世代もしくは不完全世代である。
なお別の局面では、本明細書において、真菌産生株を生成するためのシステムであって、１つまたは複数のプロセッサー、ならびに前記１つまたは複数のプロセッサーのうちの少なくとも１つに作動可能にカップリングされた１つまたは複数のメモリーであって、前記１つまたは複数のプロセッサーのうちの少なくとも１つによって実行されるとき、前記システムに、ａ．）糸状菌細胞の培養物に由来する複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換するステップであって、前記第１のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接した第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の第２の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接した第２のポリヌクレオチドを含み、形質転換が、相同組換えによる、前記第１の遺伝子座への前記第１のコンストラクトの組込み、および前記第２の遺伝子座への前記第２のコンストラクトの組込みをもたらし、少なくとも前記第２の遺伝子座が、前記プロトプラストゲノム内の第１の選択可能マーカー遺伝子であり、前記第１のポリヌクレオチドが、変異および／または遺伝子制御エレメントを含む、ステップと、ｂ．）選択および対抗選択を実施することにより、ホモカリオンの形質転換体を精製するステップと、ｃ．）前記糸状菌細胞の再生を促す培地において、精製された前記形質転換体を増殖させるステップとをさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリーを含む、システムが提供される。一部の場合では、前記複数のプロトプラストのうちの各プロトプラストは、複数の第１のコンストラクトのうちの単一の第１のコンストラクトおよび複数の第２のコンストラクトのうちの単一の第２のコンストラクトで形質転換され、前記複数の第１のコンストラクトのうちそれぞれの第１のコンストラクトにおける前記第１のポリヌクレオチドは、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを含み、前記複数の第２のコンストラクトのうちそれぞれの第２のコンストラクトにおける前記第２のポリヌクレオチドが同一である。一部の場合では、システムは、ステップａ〜ｃを繰り返して糸状菌細胞のライブラリーを生成するステップをさらに含み、前記ライブラリーにおける各糸状菌細胞は、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを有する第１のポリヌクレオチドを含む。一部の場合では、前記変異は、一塩基多型である。一部の場合では、遺伝子制御は、プロモーター配列および／またはターミネーター配列である。一部の場合では、ステップａ〜ｃは、マイクロタイタープレートのウェルにおいて実施される。一部の場合では、前記マイクロタイタープレートは、９６ウェル、３８４ウェル、または１５３６ウェルのマイクロタイタープレートである。一部の場合では、前記糸状菌細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはこれらの完全世代もしくは不完全世代および同義語もしくは分類学的等価物から選択される。一部の場合では、前記糸状菌細胞は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒである。一部の場合では、前記糸状菌細胞は、菌糸体を形成しない表現型を有する。一部の場合では、前記真菌細胞は、非機能性の非相同末端接合経路を有する。一部の場合では、前記ＮＨＥＪ経路は、前記ＮＨＥＪ経路のコンポーネントに対する抗体、化学阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、またはアンチセンスもしくはＲＮＡｉ分子に前記細胞を曝露することによって非機能性にされている。一部の場合では、前記第１の遺伝子座は、前記標的糸状菌遺伝子のためのものである。一部の場合では、前記第１の遺伝子座は、前記プロトプラストゲノムにおける第２の選択可能マーカー遺伝子のためのものである。一部の場合では、前記第２の選択可能マーカー遺伝子は、栄養要求性マーカー遺伝子、発色マーカー遺伝子、または方向性マーカー遺伝子から選択される。一部の場合では、前記第１の選択可能マーカー遺伝子は、栄養要求性マーカー遺伝子、発色マーカー遺伝子、または方向性マーカー遺伝子から選択される。一部の場合では、前記第２のポリヌクレオチドは、栄養要求性マーカー遺伝子、方向性マーカー遺伝子、または抗生物質耐性遺伝子から選択される。一部の場合では、前記発色マーカー遺伝子は、ａｙｇＡ遺伝子である。一部の場合では、前記栄養要求性マーカー遺伝子は、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される。一部の場合では、前記方向性マーカー遺伝子は、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子、硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｌａＤ）、または硫酸パーミアーゼ（Ｓｕｔ Ｂ）遺伝子から選択される。一部の場合では、前記抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌｅ遺伝子であり、前記ｂｌｅ遺伝子が、フレオマイシン（ｐｈｅｏｍｙｃｉｎ）への耐性を付与する。一部の場合では、前記第１の選択可能マーカー遺伝子は、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドは、ｐｙｒＧ遺伝子である。一部の場合では、前記第１の選択可能マーカー遺伝子は、ｍｅｔ３遺伝子であり、前記第２の選択可能マーカー遺伝子は、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドが、ｐｙｒＧ遺伝子である。一部の場合では、前記複数のプロトプラストは、糸状菌細胞の前記培養物中の前記糸状菌細胞から細胞壁を除去するステップと、前記複数のプロトプラストを単離するステップと、７％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む混合物中に、単離された前記複数のプロトプラストを再懸濁させるステップステップとによって調製される。一部の場合では、前記混合物は、ステップａ〜ｃを実施する前に少なくとも−２０℃または−８０℃で保存される。一部の場合では、前記培養物は、少なくとも１リットルの体積である。一部の場合では、前記培養物は、前記プロトプラストの調製前に少なくとも１２時間にわたって増殖させられる。一部の場合では、真菌培養物は、前記プロトプラストの少なくとも７０％がより小さくなり、かつより少ない核を有する条件下で増殖させられる。一部の場合では、前記細胞壁を除去するステップは、酵素消化によって実施される。一部の場合では、前記酵素消化は、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実施される。一部の場合では、前記システムは、前記プロトプラストを保存する前に、ＤＭＳＯを含む前記混合物に４０％ｖ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加するステップをさらに含む。一部の場合では、前記ＰＥＧは、８％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度まで添加される。
図１Ａは、本明細書に提供され、実施例１に記載されているホモカリオン状プロトプラストの自動化された形質転換、スクリーニング、および精製の概要を示す。
図１Ｂは、スプリットマーカーシステムを使用して、どのようにＳＮＰを糸状菌中の特定の遺伝子座に標的化するかの表現である。マーカー遺伝子（この例ではｐｙｒＧ）は、遺伝子機能を回復する相同組換えなしでは標的株における変異を補完することができない２つのコンポーネントとして増幅される。これらの断片には、遺伝子座に標的化しようとするＳＮＰをそれぞれが含有するＤＮＡのダイレクトリピートが隣接している。各コンストラクトの非リピートＤＮＡ配列は、天然の相同組換え経路による適切な組込みを促進する。これらのコンストラクトは、図１Ｄのステップ２の間に標的株に入れられる。
図１Ｃは、マーカー遺伝子に隣接するダイレクトリピートが不安定であり、ダイレクトリピート間の相同組換えによるマーカーの除去をもたらすことを例示する。マーカーの除去は、図１Ｄのステップ６に表されているマーカーの対抗選択を含有する培地を使用して実行される。このプロセスは、「ループアウト（ｌｏｏｐｏｕｔ）」または「ルーピングアウト（ｌｏｏｐｉｎｇ ｏｕｔ）」と呼ばれることが多い。
図１Ｄは、糸状菌におけるＳＮＰスワッピングのプロセスにおけるステップを例示する。
図１Ｅは、適切な組込みについて形質転換体をスクリーニングするプロセスにおけるステップを例示する。
図２は、実施例２に記載されている自動化された形質転換およびスクリーニング後の、アルギニンありおよびなしの最少培地上のＡ．ｎｉｇｅｒ変異体株の増殖を観察することによる、ａｒｇＢマーカーを利用したＡ．ｎｉｇｅｒ変異体株のスクリーニングを示す。
図３は、実施例３に記載されている自動化された形質転換およびスクリーニング後の、最少培地上のＡ．ｎｉｇｅｒ変異体株の増殖を観察することによる、ａｙｇＡ発色遺伝子マーカーを利用したＡ．ｎｉｇｅｒ変異体株のスクリーニングを示す。ホモカリオン状プロトプラストに由来するコロニーは、純粋な黄色であり、黒色の胞子を欠いていた。
図４Ａおよび図４Ｂは、本開示の方法に従う、Ａ．ｎｉｇｅｒの形質転換および検証の結果を示す。図４Ａは、Ａ．ｎｉｇｅｒの形質転換体の９６ウェル培地プレートの写真である。形質転換された培養物は、ａｙｇＡ中の変異を含み、このことにより、細胞が、黒色の代わりに、より薄い黄色に見えるようになる（形質転換されたウェルは、白色の円で囲まれている）。図４Ｂは、形質転換されたＡ．ｎｉｇｅｒの変異体の次世代シーケンシングの結果を示す。Ｘ軸は、形質転換されていない親株との標的ＤＮＡの配列同一性を表す。Ｙ軸は、期待される変異との標的ＤＮＡの配列同一性を表す。チャートの右下に向かうデータ点は、親株との高い類似性、および期待される形質転換された配列との低い類似性を示す。チャートの左上に向かうデータ点は、期待される形質転換された配列に対する高い類似性、および親株との低い同一性を示す。中央にあるデータ点は、複数の核を有するヘテロカリオンを表す可能性が高い。 図４Ａおよび図４Ｂは、本開示の方法に従う、Ａ．ｎｉｇｅｒの形質転換および検証の結果を示す。図４Ａは、Ａ．ｎｉｇｅｒの形質転換体の９６ウェル培地プレートの写真である。形質転換された培養物は、ａｙｇＡ中の変異を含み、このことにより、細胞が、黒色の代わりに、より薄い黄色に見えるようになる（形質転換されたウェルは、白色の円で囲まれている）。図４Ｂは、形質転換されたＡ．ｎｉｇｅｒの変異体の次世代シーケンシングの結果を示す。Ｘ軸は、形質転換されていない親株との標的ＤＮＡの配列同一性を表す。Ｙ軸は、期待される変異との標的ＤＮＡの配列同一性を表す。チャートの右下に向かうデータ点は、親株との高い類似性、および期待される形質転換された配列との低い類似性を示す。チャートの左上に向かうデータ点は、期待される形質転換された配列に対する高い類似性、および親株との低い同一性を示す。中央にあるデータ点は、複数の核を有するヘテロカリオンを表す可能性が高い。
図４Ｃは、本開示の方法に従う、Ａ．ｎｉｇｅｒスプリットマーカー設計の形質転換および検証の結果を示す。データは、（スプリットマーカーによって）形質転換されたＡ．ｎｉｇｅｒ変異体の次世代シーケンシングを使用して生成された。また、標的における変異とのマッチを、標的における親とのマッチと対比した分布である。このグラフの左上隅における試料はすべて正確であり、ＱＣに合格した。円内の試料は、遺伝子座に変異体および親の両方を含有し、ＱＣに合格し得る単離株を生成するために図１Ｄのステップ４および５によって再度処理され得る。
図５は、Ａ．ＮｉｇｅｒにおけるＳＮＰスワップ実装形態を示す。図５の左側は、ＳＮＰスワップの各ＳＮＰについての遺伝子編集の設計を例示する。この図はさらに、ｐｙｒＧ遺伝子をａｙｇＡ野生型遺伝子の遺伝子座に導入する同時形質転換を例示する。図５の右側は、Ａ．ｎｉｇｅｒ形質転換体をスクリーニングするための９６ウェル培地プレートの２つの写真を示す。薄黄色のコロニーは、ａｙｇＡ遺伝子の破壊に成功した形質転換体を表す。図５に示されている変異体株を構築するために使用したＡ．ｎｉｇｅｒ株は、ＮＨＥＪ経路活性が低減した株であった。
図６は、ＳＮＰＳＷＰキャンペーンからの次世代シーケンシングデータのグラフ表現である。この例では、図１Ｂに提示したように設計したコンストラクトを使用して、３１個の遺伝子座を標的化した。ここでは、個々の試料すべてからの各アンプリコン集団をシーケンシングすることにより、合計１２６４個の単離株をスクリーニングした。このデータセットは、１００万個超のシーケンシングされたアンプリコンを含有していた。すべてのＱＣ要件に合格した試料は１１９個あった。品質管理は、遺伝子座における親の変異の存在について調べることを含み、ウェルからのアンプリコンのすべてが、アンプリコン全体にわたって標的ＤＮＡにマッチしなければならない。赤色（＋記号）の試料は正確であり、青色（ドット記号）の試料は、親および変異の両方を含有し得る。
図７は、本開示の自動化システムの一実施形態を示す。本開示は、宿主生物のクローニング、形質転換、培養、スクリーニングおよび／またはシーケンシングが可能な様々なモジュールを有する自動化されたロボットシステムの使用を教示する。
図８は、本開示の実施形態に従う、コンピュータシステムの実施形態を図示する。
定義
以下の用語は、当業者であればよく理解していると考えられるが、以下の定義を、本開示の主題の説明を容易にするために示す。
用語「ａ」または「ａｎ」は、そのエンティティの１つまたは複数を指し、すなわち、複数形の指示対象を指すことができる。したがって、用語「ａ」または「ａｎ」、「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」は、本明細書で互換的に使用される。さらに、不定冠詞「ａ」または「ａｎ」による「要素」への言及は、文脈により唯一の要素が存在することが明確に要求されない限り、１つを超える要素が存在する可能性を除外しない。
本明細書で使用される場合、用語「細胞生物」、「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」、または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」は、広く解釈されるべきである。これらの用語は、互換的に使用され、これらに限定されないが、２つの原核生物ドメイン、細菌および古細菌、ならびにある特定の真菌および原生生物を含む。一部の実施形態では、本開示は、本開示内に存在するリスト／表および図面の「微生物（ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍ）」または「細胞生物」または「微生物（ｍｉｃｒｏｂｅ）」に言及する。この特徴付けは、表および図面の同定された分類学的な属だけでなく、同定された分類学的な種、ならびに前記表または図面内の任意の生物体の様々な新規のおよび新しく同定または設計された株も参照することができる。同じ特徴付けが、実施例などの本明細書の他の部分におけるこれらの用語の記述にも当てはまる。
用語「原核生物」は、当技術分野で認識されており、核または他の細胞小器官を含有しない細胞を指す。原核生物は一般に、２つのドメイン、細菌および古細菌の１つに分類される。古細菌と細菌ドメインの生物体間の決定的な差異は、１６ＳリボソームＲＮＡ内のヌクレオチド塩基配列の基本的な差異に基づく。
用語「古細菌」は、Ｍｅｎｄｏｓｉｃｕｔｅｓ門の生物体のカテゴリー分類を指し、典型的には、珍しい環境内で見つかり、リボソームタンパク質の数および細胞壁におけるムラミン酸の欠如を含めたいくつかの判定基準によって原核生物の残りと区別される。ｓｓｒＲＮＡ分析に基づいて、古細菌は、２つの系統学的に別個の群：ＣｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａおよびＥｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａからなる。これらの生理機能に基づいて、古細菌は、３つのタイプ：メタン生成菌（メタンを産生する原核生物）；高度好塩菌（非常に高濃度の塩（ＮａＣｌ）で生きる原核生物）；および高度（超）好熱菌（ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）（非常に高温で生きる原核生物）へと整理することができる。古細菌を細菌と区別する統一的古細菌フィーチャ（すなわち、細胞壁内にムレインが無いこと、エステル連結膜脂質など）に加えて、これらの原核生物は、これらをその特定の生息環境に適応させるユニークな構造的または生化学的属性を呈する。Ｃｒｅｎａｒｃｈａｅｏｔａは、超好熱性硫黄依存性原核生物から主になり、Ｅｕｒｙａｒｃｈａｅｏｔａは、メタン生成菌および高度好塩菌を含有する。
「細菌」または「真正細菌」は、原核生物体のドメインを指す。細菌は、以下の少なくとも１１の別個の群を含む：（１）２つの主要な亜門：（１）高Ｇ＋Ｃ群（Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉａ、Ｍｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ、その他）（２）低Ｇ＋Ｃ群（Ｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉａ、Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｉ、Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｉ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａｓ）が存在するグラム陽性（グラム＋）細菌；（２）Ｐｒｏｔｅｏｂａｃｔｅｒｉａ、例えば、紅色光合成＋非光合成グラム陰性細菌（最も「一般的な」グラム陰性細菌を含む）；（３）ラン藻類、例えば、酸素発生型光合成生物；（４）スピロヘータおよび関連種；（５）Ｐｌａｎｃｔｏｍｙｃｅｓ；（６）Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ、Ｆｌａｖｏｂａｃｔｅｒｉａ；（７）Ｃｈｌａｍｙｄｉａ；（８）緑色硫黄細菌；（９）緑色非硫黄細菌（嫌気性光合成生物も）；（１０）放射線抵抗性ミクロコッカスおよび類縁体；（１１）ＴｈｅｒｍｏｔｏｇａおよびＴｈｅｒｍｏｓｉｐｈｏ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｅｓ。
「真核生物」は、細胞が、膜内に囲まれた核および他の小器官を含有する任意の生物である。真核生物は、分類群ＥｕｋａｒｙａまたはＥｕｋａｒｙｏｔａに属する。真核細胞を原核細胞（上記の細菌および古細菌）から分離する決定的なフィーチャは、これらが膜結合型小器官、特に、遺伝物質を含有し、核膜によって囲まれている核を有することである。
用語「遺伝的に改変された宿主細胞」、「組換え宿主細胞」、および「組換え株」は、本明細書で互換的に使用され、本開示のクローニングおよび形質転換方法によって遺伝的に改変された宿主細胞を指す。よって、この用語は、宿主細胞（例えば、真菌細胞など）であって、それが由来した天然に存在するまたは親の生物と比較して、それが変更された、改変された、または異なる遺伝子型および／または表現型（例えば、遺伝子改変が微生物のコーディング核酸配列に影響するとき）を呈するように遺伝的に変更、改変、または操作された、宿主細胞を含む。この用語は、問題の特定の組換え宿主細胞だけでなく、このような宿主細胞の子孫または潜在的な子孫も指すことが理解される。
用語「野生型微生物」または「野生型株」は、天然に存在する細胞、すなわち、遺伝的に改変されていない細胞を記述する。
用語「親株（ｐａｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ）」または「親株（ｐａｒｅｎｔａｌ ｓｔｒａｉｎ）」または「親」は、変異体株が由来する宿主細胞を指す場合がある。したがって、「親株（ｐａｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ）」または「親株（ｐａｒｅｎｔａｌ ｓｔｒａｉｎ）」とは、１つまたは複数の変異体株を生成するように、当技術分野で公知かつ／または本明細書に提供される任意の様式によってゲノムが撹乱されている、宿主細胞または細胞である。「親株（ｐａｒｅｎｔ ｓｔｒａｉｎ）」または「親株（ｐａｒｅｎｔａｌ ｓｔｒａｉｎ）」は、野生型株のものと同一のゲノムを有する場合もあれば、有しない場合もある。
用語「遺伝子操作された（ｇｅｎｅｔｉｃａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ）」は、宿主細胞のゲノムの任意の操作（ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ）（例えば、核酸の挿入、欠失、変異または置換による）を指すことができる。
用語「対照」または「対照宿主細胞」は、遺伝子改変または実験処置の効果を決定するための適切な比較宿主細胞を指す。一部の実施形態では、対照宿主細胞は、野生型細胞である。他の実施形態では、対照宿主細胞は、処置宿主細胞を識別する遺伝子改変を除いて、遺伝的に改変された宿主細胞と遺伝的に同一である。一部の実施形態では、本開示は、対照宿主細胞としての親株の使用を教示する。他の実施形態では、宿主細胞は、処置宿主細胞において試験されている特定のＳＮＰを欠く遺伝的に同一の細胞であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「対立遺伝子」は、遺伝子の１つまたは複数の代替形態のいずれかを意味し、これらの対立遺伝子すべては、少なくとも１つの形質または特徴と関係する。二倍体細胞では、所与の遺伝子の２つの対立遺伝子は、一対の相同染色体上の対応する遺伝子座を占有する。本開示は、複数の実施形態では、ＱＴＬ、すなわち、１つまたは複数の遺伝子または調節配列を含み得るゲノム領域に関するため、一部の事例では、「対立遺伝子」の代わりに「ハプロタイプ」（すなわち、染色体セグメントの対立遺伝子）に言及する方がより正確な場合がある。しかしながら、こうした事例では、用語「対立遺伝子」は、用語「ハプロタイプ」を含むものと理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子座（ｌｏｃｕｓ）」（遺伝子座（ｌｏｃｉ）複数形）は、例えば、遺伝子または遺伝子マーカーが見出される染色体上の特定の１つもしくは複数の場所または部位を意味する。
本明細書で使用される「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）」または「組換え事象」は、染色体交差または独立性組合せを指す。用語「組換え（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）」は、生物が組換え事象の結果として生じた新たな遺伝子構造を有することを指す。
本明細書で使用される場合、用語「表現型」は、個々の遺伝子構造（すなわち、遺伝子型）と環境との間の相互作用から生じる個々の細胞、細胞培養物、生物体、または生物体の群の観察可能な特徴を指す。
本明細書で使用される場合、用語「核酸」は、リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドのいずれか、またはこれらの類似体の、任意の長さのヌクレオチドのポリマー形態を指す。この用語は、分子の一次構造を指し、よって、二本鎖および一本鎖ＤＮＡ、ならびに二本鎖および一本鎖ＲＮＡを含む。これは、修飾核酸、例えば、メチル化および／またはキャッピングされた核酸、修飾塩基、主鎖修飾を含有する核酸なども含む。用語「核酸」および「ヌクレオチド配列」は、互換的に使用される。
本明細書で使用される場合、用語「遺伝子」は、生物学的機能と関連したＤＮＡの任意のセグメントを指す。よって、遺伝子は、これらに限定されないが、コード配列および／またはこれらの発現に要求される調節配列を含む。遺伝子は、例えば、他のタンパク質の認識配列を形成する非発現ＤＮＡセグメントも含み得る。遺伝子は、目的の源からのクローニング、または公知のもしくは予測された配列情報からの合成を含めた、様々な源から得ることができ、所望のパラメータを有するように設計された配列を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「相同の」または「相同体」または「オルソログ」は、当技術分野で公知であり、共通の祖先またはファミリーメンバーを共有し、配列同一性の程度に基づいて決定される関連配列を指す。用語「相同性」、「相同の」、「実質的に同様の」、および「実質的に対応する」は、本明細書で互換的に使用される。これらは、核酸断片であって、１つまたは複数のヌクレオチド塩基の変化が、遺伝子発現を媒介し、またはある特定の表現型を生じさせる核酸断片の能力に影響しない、核酸断片を指す。これらの用語は、本開示の核酸断片の修飾、例えば、最初の無修飾断片と比べて得られる核酸断片の機能的特性を実質的に変更しない１つまたは複数のヌクレオチドの欠失または挿入も指す。したがって、当業者が十分に理解するように、本開示は、具体的な例示的な配列より多くを包含することが理解される。これらの用語は、１つの種、亜種、種類、栽培品種、または株内に見出される遺伝子と、別の種、亜種、種類、栽培品種、または株内の対応するまたは等価な遺伝子との間の関係を記述する。本開示の目的に関して、相同配列が比較される。「相同配列」または「相同体」または「オルソログ」は、機能的に関連していると見なされ、考えられ、または知られている。機能的関係は、これらに限定されないが、（ａ）配列同一性の程度および／または（ｂ）同じもしくは同様の生物学的機能を含めた、いくつかのやり方のいずれか１つにおいて示され得る。好ましくは、（ａ）および（ｂ）の両方が示される。相同性は、当技術分野で容易に利用可能なソフトウェアプログラム、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌら編、１９８７年）補遺３０、セクション７．７１８、表７．７１に論じられたものなどを使用して決定することができる。いくつかの整列プログラムは、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ（Ｏｘｆｏｒｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｌｔｄ、Ｏｘｆｏｒｄ、Ｕ．Ｋ．）、ＡＬＩＧＮ Ｐｌｕｓ（Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ ａｎｄ Ｅｄｕｃａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｆｔｗａｒｅ、Ｐｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａ）、およびＡｌｉｇｎＸ（Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）である。別の整列プログラムは、デフォルトパラメータを使用するＳｅｑｕｅｎｃｈｅｒ（Ｇｅｎｅ Ｃｏｄｅｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、Ｍｉｃｈｉｇａｎ）である。
本明細書で使用される場合、用語「内在性の」または「内在性遺伝子」は、天然に存在する遺伝子であって、それが宿主細胞ゲノム内に天然で見出される場所における天然に存在する遺伝子を指す。本開示との関連で、異種プロモーターを内在性遺伝子に作動可能に連結することは、既存の遺伝子が天然に存在する場所において、その遺伝子の前に異種プロモーター配列を遺伝的に挿入することを意味する。本明細書に記載の内在性遺伝子は、本開示の方法のいずれかに従って変異された天然に存在する遺伝子の対立遺伝子を含み得る。
本明細書で使用される場合、用語「外因性の」は、用語「異種の」と互換的に使用され、その天然源以外の何らかの源に由来する物質を指す。例えば、用語「外因性タンパク質」または「外因性遺伝子」は、非天然の源または場所由来であり、生物系に人工的に供給されたタンパク質または遺伝子を指す。
本明細書で使用される場合、用語「ヌクレオチド変化」は、当技術分野でよく理解されているように、例えば、ヌクレオチド置換、欠失、および／または挿入を指す。例えば、変異は、サイレント置換、付加、または欠失を生じさせるが、コードされるタンパク質の特性もしくは活性、またはタンパク質が作製される方法を変更しない変更を含有する。
本明細書で使用される場合、用語、核酸またはポリペプチドの「少なくとも一部」または「断片」は、このような配列の最小限のサイズ特徴を有する部分、または最大で全長分子の、および全長分子を含めた、全長分子の任意のより大きい断片を意味する。本開示のポリヌクレオチドの断片は、遺伝子調節エレメントの生物活性部分をコードすることができる。遺伝子調節エレメントの生物活性部分は、遺伝子調節エレメントを含む本開示のポリヌクレオチドの１つの部分を単離し、本明細書に記載の活性を評価することによって調製することができる。同様に、ポリペプチドの部分は、４アミノ酸、５アミノ酸、６アミノ酸、７アミノ酸などであり得、最大で全長ポリペプチドまで伸び得る。使用される部分の長さは、特定の適用に依存する。ハイブリダイゼーションプローブとして有用な核酸の部分は、１２ヌクレオチドという短さであり得；一部の実施形態では、それは、２０ヌクレオチドである。エピトープとして有用なポリペプチドの部分は、４アミノ酸という短さであり得る。完全長ポリペプチドの機能を果たすポリペプチドの部分は一般に、４アミノ酸より長いはずである。
改変体ポリヌクレオチドは、ＤＮＡシャッフリングなどの、変異を誘発する、および組換えを生じる手順に由来する配列も包含する。そのようなＤＮＡシャッフリングのストラテジーは、当技術分野で公知である。例えば、Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４年）、ＰＮＡＳ、９１巻：１０７４７〜１０７５１頁；Ｓｔｅｍｍｅｒ（１９９４年）、Ｎａｔｕｒｅ、３７０巻：３８９〜３９１頁；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９７年）、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．、１５巻：４３６〜４３８頁；Ｍｏｏｒｅら（１９９７年）、Ｊ． Ｍｏｌ． Ｂｉｏｌ．、２７２巻：３３６〜３４７頁；Ｚｈａｎｇら（１９９７年）、ＰＮＡＳ、９４巻：４５０４〜４５０９頁；Ｃｒａｍｅｒｉら（１９９８年）、Ｎａｔｕｒｅ、３９１巻：２８８〜２９１頁；ならびに米国特許第５，６０５，７９３号および同第５，８３７，４５８号を参照されたい。
本明細書に開示のポリヌクレオチドのＰＣＲ増幅に関して、オリゴヌクレオチドプライマーを、目的の任意の生物体から抽出されたｃＤＮＡまたはゲノムＤＮＡから対応するＤＮＡ配列を増幅するためのＰＣＲ反応で使用するのに設計することができる。ＰＣＲプライマーを設計しＰＣＲクローニングするための方法は、当技術分野で一般に公知であり、Ｓａｍｂｒｏｏｋら（２００１年）、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｐｌａｉｎｖｉｅｗ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）に開示されている。Ｉｎｎｉｓら編（１９９０年）、ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ： Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；ＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ編（１９９５年）、ＰＣＲ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）；ならびにＩｎｎｉｓおよびＧｅｌｆａｎｄ編（１９９９年）ＰＣＲ Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｍａｎｕａｌ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）も参照。ＰＣＲの公知の方法としては、これらに限定されないが、対プライマー、ネステッドプライマー、単一特異的プライマー、縮重プライマー、遺伝子特異的プライマー、ベクター特異的プライマー、部分ミスマッチプライマーなどを使用する方法が挙げられる。
本明細書で使用される用語「プライマー」は、増幅標的にアニールし、ＤＮＡポリメラーゼを結合させ、それによって、プライマー伸長産物の合成が誘導される条件下で、すなわち、ヌクレオチド、およびＤＮＡポリメラーゼなどの重合のための作用物質の存在下で、かつ適当な温度およびｐＨで配置されたとき、ＤＮＡ合成の開始点として機能を果たすことができるオリゴヌクレオチドを指す。（増幅）プライマーは、好ましくは、増幅の効率を最大にするために一本鎖である。好ましくは、プライマーは、オリゴデオキシリボヌクレオチドである。プライマーは、重合のための作用物質の存在下で伸長産物の合成をプライムするのに十分長くなければならない。プライマーの正確な長さは、プライマーの温度および組成（Ａ／Ｔ対Ｇ／Ｃ含有量）を含めた多くの因子に依存する。一対の双方向性プライマーは、ＰＣＲ増幅などのＤＮＡ増幅の技術分野で一般に使用されるように、１つの順方向プライマーおよび１つの逆方向プライマーからなる。
用語「ストリンジェンシー」または「ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件」は、例えば、温度、塩濃度、ｐＨ、ホルムアミド濃度など、ハイブリッドの安定性に影響するハイブリダイゼーション条件を指す。これらの条件は、プライマーまたはプローブのその標的核酸配列への特異的な結合を最大にし、非特異的な結合を最小限に抑えるように、経験的に最適化される。使用されるこれらの用語には、プローブまたはプライマーが、他の配列よりも検出可能に高い程度（例えば、バックグラウンドに対して少なくとも２倍）まで、その標的配列とハイブリダイズする条件への言及が含まれる。ストリンジェントな条件は配列に依存し、異なる状況下では異なる。より長い配列はより高い温度で特異的にハイブリダイズする。一般に、ストリンジェントな条件は、規定のイオン強度およびｐＨにおける特定の配列の熱的融点（Ｔｍ、ｔｈｅｒｍａｌ ｍｅｌｔｉｎｇ ｐｏｉｎｔ）よりも約５℃低くなるように選択される。Ｔｍは、（規定のイオン強度およびｐＨ下で）相補性標的配列の５０％が完全にマッチしたプローブまたはプライマーとハイブリダイズする温度である。典型的に、ストリンジェントな条件とは、塩濃度が、ｐＨ７．０〜８．３においてＮａ＋イオン約１．０Ｍ未満、典型的にはＮａ＋イオン濃度（または他の塩）が約０．０１〜１．０Ｍであり、短いプローブまたはプライマー（例えば１０〜５０ヌクレオチド）の場合は温度が少なくとも約３０℃であり、長いプローブまたはプライマー（例えば５０ヌクレオチド超）の場合は少なくとも約６０℃であるような条件である。ストリンジェントな条件は、ホルムアミドなどの不安定化剤の付加により達成することもできる。例示的な低ストリンジェント条件または「ストリンジェンシーの低い条件」には、３０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳの緩衝溶液を用いた３７℃のハイブリダイゼーション、および４０℃の２×ＳＳＣでの洗浄が含まれる。例示的な高ストリンジェンシー条件には、５０％ホルムアミド、１Ｍ ＮａＣｌ、１％ ＳＤＳにおける３７℃のハイブリダイゼーション、および６０℃の０．１×ＳＳＣでの洗浄が含まれる。ハイブリダイゼーション手順は当技術分野で周知であり、例えば、Ａｕｓｕｂｅｌら、１９９８年およびＳａｍｂｒｏｏｋら、２００１年に記載されている。一部の実施形態では、ストリンジェントな条件は、１ｍＭ Ｎａ２ＥＤＴＡ、０．５〜２０％（例えば０．５％、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１１％、１２％、１３％、１４％、１５％、１６％、１７％、１８％、１９％、または２０％）ドデシル硫酸ナトリウムを含有する０．２５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４緩衝液（ｐＨ７．２）中で４５℃のハイブリダイゼーションに続いて、０．１％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウムを含有する５×ＳＳＣでの５５℃〜６５℃での洗浄である。
本明細書で使用される場合、「プロモーター」は、コード配列または機能ＲＮＡの発現を制御することができるＤＮＡ配列を指す。プロモーター配列は、近位およびより遠位の上流エレメントからなり、後者のエレメントは、エンハンサーと呼ばれることが多い。したがって、「エンハンサー」は、プロモーター活性を刺激することができるＤＮＡ配列であり、プロモーターの元からあるエレメントまたはプロモーターのレベルもしくは組織特異性を増強するために挿入される異種エレメントであり得る。プロモーターは、その全体が天然遺伝子に由来する場合があり、または天然で見出される異なるプロモーターに由来する異なるエレメントから構成される場合があり、または合成ＤＮＡセグメントを含むことさえできる。異なるプロモーターが、異なる組織もしくは細胞型において、または発生の異なる段階において、または異なる環境条件に応じて遺伝子の発現を指示することができることは、当業者によって理解されている。ほとんどの場合、調節配列の正確な境界は、完全に画定されていないので、あるバリエーションのＤＮＡ断片は、同一のプロモーター活性を有し得ることがさらに認識されている。
本明細書で使用される場合、「ターミネーター」とは、一般に、ゲノムＤＮＡ内の遺伝子またはオペロンの末端をマークし、転写を停止させることができる、ＤＮＡ配列のセクションを指す。ターミネーターは、その全体が天然遺伝子に由来する場合があり、または天然で見出される異なるターミネーターに由来する異なるエレメントから構成される場合があり、または合成ＤＮＡセグメントを含むことさえできる。異なるターミネーターが、異なる組織もしくは細胞型において、または発生の異なる段階において、または異なる環境条件に応じて遺伝子の発現を指示することができることは、当業者によって理解されている。
本明細書で使用される場合、語句「組換えコンストラクト」、「発現コンストラクト」、「発現カセット」、「キメラコンストラクト」、「コンストラクト」、および「組換えＤＮＡコンストラクト」は、本明細書で互換的に使用される。組換えコンストラクトは、核酸断片の人工の組合せ、例えば、天然に一緒に見出されない調節配列およびコード配列を含む。例えば、キメラコンストラクトは、異なる源に由来する調節配列およびコード配列、または同じ源に由来するが、天然に見出されるものと異なる様式で配列されている調節配列およびコード配列を含み得る。このようなコンストラクトは、それ自体で使用することができ、またはベクターと併せて使用することができる。ベクターが使用される場合、ベクターの選択は、当業者に周知であるように、宿主細胞を形質転換するのに使用される方法に依存する。例えば、プラスミドベクターを使用することができる。当業者は、本開示の単離核酸断片のいずれかを含む宿主細胞を順調に形質転換、選択、および増殖させるためにベクター上に存在しなければならない遺伝子エレメントをよく知っている。当業者は、異なる独立した形質転換事象は、異なるレベルおよびパターンの発現をもたらし（Ｊｏｎｅｓら（１９８５年）、ＥＭＢＯ Ｊ．、４巻：２４１１〜２４１８頁；Ｄｅ Ａｌｍｅｉｄａら（１９８９年）、Ｍｏｌ． Ｇｅｎ． Ｇｅｎｅｔｉｃｓ、２１８巻：７８〜８６頁）、よって、所望の発現レベルおよびパターンをディスプレイする系（ｌｉｎｅ）を得るために、複数の事象がスクリーニングされなければならないことも認識する。このようなスクリーニングは、とりわけ、ＤＮＡのサザン分析、ｍＲＮＡ発現のノーザン分析、タンパク質発現のイムノブロッティング分析、または表現型分析によってなしとげることができる。ベクターは、自発的に複製する、または宿主細胞の染色体内に組み込むことができるプラスミド、ウイルス、バクテリオファージ、プロ−ウイルス、ファージミド、トランスポゾン、人工染色体などであり得る。ベクターは、自律複製していない裸のＲＮＡポリヌクレオチド、裸のＤＮＡポリヌクレオチド、同じ鎖内のＤＮＡおよびＲＮＡの両方から構成されるポリヌクレオチド、ポリリシンコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、ペプチドコンジュゲートＤＮＡまたはＲＮＡ、リポソームコンジュゲートＤＮＡなどでもあり得る。本明細書で使用される場合、用語「発現」は、機能的最終産物、例えば、ｍＲＮＡまたはタンパク質（前駆体または成熟）の産生を指す。
「作動可能に連結した」は、本文脈において、本開示によるプロモーターポリヌクレオチドのさらなるオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドとの、前記さらなるポリヌクレオチドの転写をもたらす連鎖配列（ｓｅｑｕｅｎｔｉａｌ ａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔ）を意味する。
本明細書で使用される用語「目的の産物」または「生体分子」は、供給原料から微生物によって産生される任意の産物を指す。一部の場合では、目的の産物は、低分子、酵素、ペプチド、アミノ酸、有機酸、合成化合物、燃料、アルコール、医薬などであり得る。例えば、目的の産物または生体分子は、任意の一次または二次細胞外代謝産物であり得る。一次代謝産物は、とりわけ、エタノール、クエン酸、乳酸、グルタミン酸、グルタメート、リシン、トレオニン、トリプトファン、および他のアミノ酸、ビタミン、多糖などであり得る。二次代謝産物は、とりわけ、ペニシリンのような抗生物質化合物、またはシクロスポリンＡのような免疫抑制剤、ジベレリンのような植物ホルモン、ロバスタチンのようなスタチン薬、グリセオフルビンのような殺真菌薬などであり得る。目的の産物、または生体分子は、微生物によって産生される任意の細胞内コンポーネント、例えば、カタラーゼ、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペクチナーゼ、グルコースイソメラーゼ、セルラーゼ、ヘミセルラーゼ、リパーゼ、ラクターゼ、ストレプトキナーゼ、および多くのその他を含めた微生物酵素でもあり得る。細胞内コンポーネントとして、組換えタンパク質、例えば、インスリン、Ｂ型肝炎ワクチン、インターフェロン、顆粒球コロニー刺激因子、ストレプトキナーゼなども挙げることができる。目的の産物は、「目的のタンパク質」を指す場合もある。
用語「目的のタンパク質」とは、一般に、糸状菌において発現することが所望される任意のポリペプチドを指す。そのようなタンパク質は、酵素、基質結合タンパク質、界面活性タンパク質、構造タンパク質などであってよく、高レベルで発現することができ、商業化を目的とするものであってよい。目的のタンパク質は、改変体株および／または親株に対して、内在性遺伝子または異種遺伝子によってコードされ得る。目的のタンパク質は、細胞内で、または分泌タンパク質として発現させることができる。目的のタンパク質が天然で分泌されない場合、このタンパク質をコードするポリヌクレオチドを、シグナル配列を有するように、当技術分野で公知の技法に従って改変してもよい。分泌されるタンパク質は、天然で発現される内在性タンパク質であり得るが、異種であってもよい。異種とは、タンパク質によってコードされる遺伝子が、天然条件下では糸状菌宿主細胞において産生されないことを意味する。本開示の糸状菌によって産生され得る酵素の例は、カルボヒドラーゼ、例えば、セルラーゼ、例えばエンドグルカナーゼ、ベータ−グルカナーゼ、セロビオヒドロラーゼ、またはベータ−グルコシダーゼ、ヘミセルラーゼまたはペクチン分解性酵素、例えばキシラナーゼ、キシロシダーゼ、マンナナーゼ、ガラクタナーゼ、ガラクトシダーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、アラバナーゼ、ガラクツロナーゼ、リアーゼ、またはアミロース分解性酵素；ホスファターゼ、例えばフィターゼ、エステラーゼ、例えばリパーゼ、タンパク質分解酵素、オキシドレダクターゼ、例えばオキシダーゼ、トランスフェラーゼ、またはイソメラーゼである。
用語「炭素源」は一般に、細胞成長のための炭素の源として使用されるのに適した物質を指す。炭素源としては、これらに限定されないが、バイオマス加水分解物、デンプン、スクロース、セルロース、ヘミセルロース、キシロース、およびリグニン、ならびにこれらの基質のモノマーコンポーネントが挙げられる。炭素源は、これらに限定されないが、ポリマー、炭水化物、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、ペプチドなどを含めた様々な形態での様々な有機化合物を含み得る。これらとしては、例えば、様々な単糖、例えば、グルコース、デキストロース（Ｄ−グルコース）、マルトース、オリゴ糖、多糖、飽和もしくは不飽和脂肪酸、スクシネート、ラクテート、アセテート、エタノールなど、またはこれらの混合物が挙げられる。光合成生物は、光合成の産物として炭素源をさらに産生することができる。一部の実施形態では、炭素源は、バイオマス加水分解物およびグルコースから選択され得る。
用語「供給材料」は、他の産物が作られ得る微生物または発酵プロセスに供給される原料または原料の混合物として定義される。例えば、バイオマスまたはバイオマスに由来する炭素化合物などの炭素源は、発酵プロセスにおいて目的の産物（例えば、低分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）を産生する微生物の供給材料である。しかし、供給材料は、炭素源以外の栄養分を含有し得る。
用語「体積生産性」または「生産速度」は、単位時間当たり、媒体の体積当たりに形成される産物の量として定義される。体積生産性は、１時間当たり１リットル当たりのグラム（ｇ／Ｌ／ｈ）で報告することができる。
用語「比生産性」は、産物の形成の速度として定義される。特定の生産性は、１時間当たり細胞乾燥重量（ＣＤＷ）１グラム当たりの産物のグラム（ｇ／ｇ ＣＤＷ／ｈ）での比生産性として本明細書でさらに定義される。所与の微生物のＯＤ６００に対するＣＤＷの関係を使用して、比生産性を、１時間当たり６００ｎｍにおける培養ブロスの光学密度（ＯＤ）当たり培養培地１リットル当たりの産物のグラム（ｇ／Ｌ／ｈ／ＯＤ）として表現することもできる。
用語「収率」は、原料の単位重量当たりに得られる産物の量として定義され、基質１ｇ当たりの産物のｇ（ｇ／ｇ）として表現することができる。収率は、理論的収率に対するパーセンテージとして表現することができる。「理論的収率」は、産物を作製するのに使用される代謝経路の化学量論によって決まる所与の量の基質あたりに生成され得る産物の最大量として定義される。
用語「力価（ｔｉｔｒｅ）」または「力価（ｔｉｔｅｒ）」は、溶液の強度または溶液中の物質の濃度として定義される。例えば、発酵ブロス中の目的の産物（例えば、低分子、ペプチド、合成化合物、燃料、アルコールなど）の力価は、発酵ブロス１リットル当たりの溶液中の目的の産物のｇ（ｇ／Ｌ）として記述される。
用語「総力価」は、プロセスにおける初期体積またはプロセスにおける操作体積に対する、プロセスから取り出され、回収される溶液中の目的の産物、適用可能な場合、気相中の目的の産物、および任意の目的の産物を含むがこれらに限定されない、プロセスにおいて産生されるすべての目的の産物の和として定義される。
本明細書で使用される場合、用語「ライブラリー」は、本開示による遺伝的摂動のコレクションを指す。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、ｉ）上述の一連の遺伝子エレメントをコードする遺伝子コンストラクトのコレクション、またはｉｉ）前記遺伝子エレメントを含む宿主細胞株として顕在化し得る。一部の実施形態では、本開示のライブラリーは、個々のエレメントのコレクション（例えば、ＳＮＰスワップライブラリーのＳＮＰのターミネーターのコレクション）を指すことができる。
本明細書で使用される場合、用語「ＳＮＰ」は、小規模核多型（Ｓｍａｌｌ Ｎｕｃｌｅａｒ Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ）を指す。一部の実施形態では、本開示のＳＮＰは、広く解釈されるべきであり、一塩基多型、配列挿入、欠失、反転、および他の配列の置き換えを含む。本明細書で使用される場合、用語「非同義の」または「非同義ＳＮＰ」は、宿主細胞タンパク質内のコード変化をもたらす変異を指す。
概要
本開示は、糸状菌細胞またはそれに由来するプロトプラストを形質転換し、ホモカリオンの形質転換体を精製し、精製された形質転換体をスクリーニングするためのハイスループット方法を提供することにより、上述した制限事項を回避する。一般に、本明細書に記載の方法およびシステムは、糸状菌細胞からプロトプラストを調製すること、調製されたプロトプラストを形質転換すること、プロトプラスト調製のための菌糸体を調製するために使用される増殖条件を変更することにより、単核を含有するプロトプラストを精製することを伴う。株精製は、選択および対抗選択と、任意選択で、正確な表現型を有し、かつ／または目的の産物を産生する、精製された形質転換体のスクリーニングとによって達成される。目的の産物は、所望の収率、生産性、または力価で産生され得る。好ましくは、プロトプラストが使用されるが、本方法は、他の真菌細胞型に適用可能である。一部の場合では、本明細書に提供される方法およびシステムは、ハイスループットである。一部の場合では、本明細書に提供される方法およびシステムは、半自動化されたステップ（例えば、形質転換または選択、対抗選択）を含む。一部の場合では、本明細書に提供される方法およびシステムは、完全に自動化されたステップを含む。一部の場合では、本明細書に提供される方法およびシステムはハイスループットであり、その中のステップは、半自動化されているか（例えば、形質転換または選択、対抗選択）、または完全に自動化されている。本明細書で使用される場合、ハイスループットは、１日あたり約１，０００またはそれよりも多くの形質転換体を評価することができる、本明細書に提供される部分的または完全に自動化された任意の方法、特に、１日あたり５，０００またはそれよりも多くの形質転換体を評価することができる方法、とりわけ、１日あたり１０，０００またはそれよりも多くの形質転換体を評価することができる方法を指す場合がある。さらに、本方法を実施する適当な体積は、商業的に利用可能な（ディープウェル）マイクロタイタープレートのもの、すなわち１ｍｌ未満、好ましくは５００ｕｌ未満、より好ましくは２５０ｕｌ未満、最も好ましくは１．５ｕｌ〜２５０ｕｌ、さらに最も好ましくは１０ｕｌ〜１００ｕｌである。
プロトプラストを調製するために使用される糸状菌細胞は、当技術分野で公知または本明細書に記載の任意の糸状菌株であってよく、これらのホロモルフ（ｈｏｌｏｍｏｒｐｈ）、完全世代、または不完全世代を含む。プロトプラストの調製は、プロトプラストを調製するための、本明細書に記載のもの、または当技術分野で公知の任意の方法を使用して実施することができる。
プロトプラストの形質転換は、本明細書に提供される糸状菌ゲノム内の所定の遺伝子座に組み込まれるように設計された、少なくとも１つのポリヌクレオチドを用いるものであり得る。好適な実施形態では、プロトプラストは、各ポリヌクレオチドコンストラクトが、糸状菌ゲノム内の異なる所定の遺伝子座に組み込まれるように設計されているような、本明細書に提供される少なくとも２つのポリヌクレオチドと共に同時形質転換される。別の好適な実施形態では、スプリットマーカー形質転換システムが利用される。所定の遺伝子座は、標的糸状菌遺伝子（例えば、タンパク質産物がクエン酸産生に関与する遺伝子）のためのものであっても、または糸状菌ゲノム内に存在する選択可能マーカー遺伝子のためのものであってもよい。本明細書に提供される方法またはシステムを使用して、プロトプラストを形質転換すること（例えば、スプリットマーカー設計システムによって）、または同時形質転換することにおいて使用するためのポリヌクレオチドは、変異および／または遺伝子制御エレメント（複数可）を含むまたは含有する標的糸状菌遺伝子（例えば、タンパク質産物がクエン酸産生に関与する遺伝子）の配列を含むことができる。変異は、小規模核多型（複数可）、例えば一塩基多型、配列挿入、欠失、反転、および他の配列の置き換えであり得る。遺伝子制御エレメントは、プロモーター配列（内在性または異種）および／またはターミネーター配列（内在性または異種）であり得る。本明細書に提供される方法またはシステムを使用して、プロトプラストを形質転換すること（例えば、スプリットマーカー設計システムによって）、または同時形質転換することにおいて使用するためのポリヌクレオチドは、選択可能マーカー遺伝子の配列を含むことができる。一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、第１のポリヌクレオチドが、変異および／または遺伝子制御エレメント（複数可）を含むまたは含有する標的糸状菌遺伝子（例えば、タンパク質産物がクエン酸産生に関与する遺伝子）の配列を含み、第２のポリヌクレオチドが、選択可能マーカー遺伝子の配列を含むような、２つのポリヌクレオチドを用いた、本明細書に提供されるプロトプラストの同時形質転換を伴う。本実施形態に付け加えて、第２のポリヌクレオチドは、プロトプラストゲノム内の追加の選択可能マーカー遺伝子に組み込まれるように設計することができ、第１のポリヌクレオチドは、標的糸状菌遺伝子の遺伝子座に、または代替として、なおもさらなる選択可能マーカー遺伝子の遺伝子座に組み込まれるように設計することができる。本明細書に提供される実施形態のいずれかにおける選択可能マーカー遺伝子は、本明細書に記載の選択可能マーカー遺伝子のうちのいずれであってもよい。他の実施形態では、同時形質転換方法の代わりにスプリットマーカー設計が利用される。
本開示はまた、糸状菌細胞から複数のプロトプラストを調製し保存するための方法を提供する。本方法は、真菌培養物中の糸状菌細胞から細胞壁を除去するステップと、プロトプラストを単離するステップと、少なくともジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む混合物中に、単離されたプロトプラストを再懸濁させるステップと、単離されたプロトプラストを保存するステップとを伴い得る。保存は、少なくとも１時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、１２時間、または２４時間にわたってよい。保存は、少なくとも１日、７日、１４日、３０日、またはそれよりも多くの日数にわたってよい。保存は、少なくとも３カ月、６カ月、１２カ月、またはそれよりも多くの月数にわたってよい。保存は、４℃、−２０℃、または−８０℃で行ってよい。真菌培養物は、少なくとも５００ｍｌ、１リットル、２リットル、３リットル、４リットル、または５リットルの体積を有する培養物であり得る。糸状菌細胞は、本明細書に提供される、または当技術分野で公知の、任意の糸状菌であってよい。プロトプラストの調製の前に、真菌培養物を少なくとも６時間、８時間、１０時間、１２時間、１４時間、１６時間、１８時間、２０時間、２２時間、または２４時間にわたって増殖させてよい。一実施形態では、真菌培養物を、プロトプラストの調製後にプロトプラストの少なくとも７０％がホモカリオンになる条件下で増殖させる。別の実施形態では、細胞壁を除去するステップは、酵素消化によって実施される。酵素消化は、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実施してもよい。酵素消化は、ＶｉｎｏＴａｓｔｅ濃縮物を用いて実施してもよい。さらに別の実施形態では、本方法は、プロトプラストを保存する前に、ＤＭＳＯを含む混合物にポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加するステップをさらに含む。ＰＥＧは、５０％、４０％、３０％、２０％、１５％、１０％、５％、またはそれ未満の最終濃度まで添加することができる。さらに別の実施形態では、本方法は、プロトプラストを保存する前に、プロトプラストをマイクロタイタープレートに分配するステップをさらに含む。マイクロタイタープレートは、６ウェル、１２ウェル、２４ウェル、９６ウェル、３８４ウェル、または１５３６ウェルのプレートであってよい。
糸状菌宿主細胞
一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、糸状菌に由来する真菌要素であって、培養培地中の他のそのような要素から容易に分離することができ、自己を複製することができる真菌要素を使用する。例えば、真菌要素は、胞子、栄養繁殖体、菌糸断片、プロトプラスト、またはマイクロペレットであり得る。好適な実施形態では、本明細書に提供されるシステムおよび方法は、糸状菌に由来するプロトプラストを利用する。適当な糸状菌宿主細胞としては、例えば、Ａｓｃｏｍｙｃｏｔａ、Ｄｅｕｔｅｒｏｍｙｃｏｔａ、Ｚｙｇｏｍｙｃｏｔａ、またはＦｕｎｇｉ ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ門の任意の糸状形態が挙げられる。適当な糸状菌宿主細胞としては、例えば、Ｅｕｍｙｃｏｔｉｎａ亜門の任意の糸状形態が挙げられる。（例えば、参照により本明細書に組み込まれている、Ｈａｗｋｓｗｏｒｔｈら、Ｉｎ Ａｉｎｓｗｏｒｔｈ ａｎｄ Ｂｉｓｂｙ’ｓＤｉｃｔｉｏｎａｒｙ ｏｆ Ｔｈｅ Ｆｕｎｇｉ、８版、１９９５年、ＣＡＢ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＵＫを参照）。ある特定の例示的であるが限定されない実施形態では、糸状菌宿主細胞は、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ、またはこれらの完全世代もしくは不完全世代および同義語もしくは分類学的等価物の種の細胞であり得る。一実施形態では、糸状菌は、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ、Ａ．ｏｒｙｚａｅ、Ａ．ｓｏｊａｅ、およびＡ．ｎｉｇｅｒ群のＡｓｐｅｒｇｉｌｌｉからなる群より選択される。好適な実施形態では、糸状菌は、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒである。
別の実施形態では、本開示は、本明細書に提供される方法およびシステムのために使用される真菌種の特定の変異体を提供する。一実施形態では、本明細書に提供されるハイスループットかつ／または自動化された方法およびシステムに適した真菌種の特定の変異体が使用される。そのような変異体の例は、非常によくプロトプラスト形成する株；主として、またはより好ましくは、単核を有するプロトプラストのみを産生する株；マイクロタイタープレート中で効率的に再生する株、より速く再生する株および／またはポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ）分子を効率的に取り込む株、例えば、培養下、単一クローンの単離を防止し、かつ／もしくは培養物の粘度を上昇させるほどもつれていない菌糸を産生する細胞など低粘度の培養物を産生する株、ランダム組込みが低減された（例えば、障害のある非相同末端接合経路）株、あるいはこれらの組合せであり得る。さらに別の実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムにおいて使用するための特定の変異体株は、例えば、ウリジン要求性変異体株などの選択可能マーカー遺伝子を欠く株であり得る。これらの変異体株は、それぞれｐｙｒＧまたはｐｙｒＥ遺伝子によってコードされるオロチジン５ホスフェートデカルボキシラーゼ（ＯＭＰＤ）またはオロテートｐ−リボシルトランスフェラーゼ（ＯＰＲＴ）を欠損している場合がある（Ｔ． Ｇｏｏｓｅｎら、Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ．、１９８７年、１１巻：４９９〜５０３頁；Ｊ． Ｂｅｇｕｅｒｅｔら、Ｇｅｎｅ．、１９８４年、３２巻：４８７〜９２頁）。
一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムにおいて使用するための特定の変異体株は、より短い菌糸およびより酵母様の外観によって特徴付けられる緻密な細胞形態を有する株である。そのような変異体の例は、ＵＳ２０１４０２２０６８９に記載されているｇａｓ１発現が変更された糸状菌細胞であり得る。
さらに別の実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムにおいて使用するための変異体株は、それらの相同組換えが極度に効率的であり、かつ／またはランダム組込みが極度に非効率的であるように、それらのＤＮＡ修復システムが改変されている。相同組換えによる宿主細胞のゲノムへの核酸コンストラクトの標的化組込み、すなわち、所定の標的遺伝子座における組込みの効率は、宿主細胞の強化された相同組換え能力および／または減少した非相同組換え能力によって増加させることができる。相同組換えの強化は、相同組換えに関与する１つまたは複数の遺伝子（例えば、Ｒａｄ５１および／またはＲａｄ５２タンパク質）を過剰発現させることによって達成することができる。本開示の宿主細胞における１つまたは複数の非相同組換え経路（例えば、正準な非相同末端接合（ＮＨＥＪ）経路、代替的ＮＨＥＪもしくはマイクロホモロジー媒介性末端接合（Ａｌｔ−ＮＨＥＪ／ＭＭＥＪ）経路、および／またはポリメラーゼシータ媒介性末端接合（ＴＭＥＪ）経路）の活性の除去、破壊、または低減は、例えば、特定の非相同組換え（ＮＨＲ）経路（例えば、ＮＨＥＪ経路、Ａｌｔ−ＮＨＥＪ／ＭＭＥＪ経路、および／またはＴＭＥＪ経路）のコンポーネントに対する抗体、化学阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、またはアンチセンスもしくはＲＮＡｉ分子の使用などといった、その技術分野で公知の任意の方法によって達成することができる。一実施形態では、単一の非相同末端接合経路の活性が阻害または低減される。別の実施形態では、非相同末端接合経路のうちの１つの活性がインタクトなままであるように、非相同末端接合経路の組合せの活性が阻害または低減される。さらに別の実施形態では、あらゆる非相同末端接合経路の活性が低減または阻害される。
単独または組合せの活性の阻害または低減のために標的化することができるＮＨＥＪ経路のコンポーネントの例は、これらに限定されないが、酵母ＫＵ７０もしくは酵母ＫＵ８０またはこれらの相同体もしくはオルソログを含み得る。単独または組合せの活性の阻害または低減のために標的化することができるＡｌｔ−ＮＨＥＪ／ＭＭＥＪ経路のコンポーネントの例は、これらに限定されないが、Ｐｏｌｑ遺伝子、Ｍｒｅ１１遺伝子、ＸＰＦ−ＥＲＣＣ１遺伝子、またはこれらの相同体もしくはオルソログを含み得る。活性の阻害または低減のために標的化することができるＴＭＥＪ経路のコンポーネントの例は、これらに限定されないが、Ｐｏｌｑ遺伝子、またはその相同体もしくはオルソログを含み得る。一部の場合では、本明細書に提供される方法において使用するための宿主細胞は、ＮＨＥＪ経路の１つまたは複数の遺伝子（例えば、酵母ｋｕ７０、ｋｕ８０、またはこれらの相同体もしくはオルソログ）を欠損している場合がある。そのような変異体の例は、ＷＯ０５／９５６２４に記載されている、ｈｄｆＡまたはｈｄｆＢ遺伝子が欠損した細胞である。一部の場合では、本明細書に提供される方法において使用するための宿主細胞は、代替的ＮＨＥＪもしくはマイクロホモロジー媒介性末端接合（Ａｌｔ−ＮＨＥＪ／ＭＭＥＪ）経路および／またはＴＭＥＪ経路の１つまたは複数の遺伝子を欠損している場合がある。そのような変異体の例は、Ｗｙａｔｔら、Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ ｒｏｌｅｓ ｆｏｒ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ θ ｍｅｄｉａｔｅｄ ｅｎｄ−ｊｏｉｎｉｎｇ ｉｎ ｒｅｐａｉｒ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ｂｒｅａｋｓ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ．、２０１６年８月１８日；６３巻（４号）：６６２〜６７３頁に記載されている、Ｐｏｌｑ遺伝子を欠くか、または変異体Ｐｏｌｑ遺伝子を有する細胞である。
本明細書に提供される方法において使用するための宿主細胞における１つまたは複数のＮＨＲ経路（例えば、ＮＨＥＪ経路、Ａｌｔ−ＮＨＥＪ／ＭＭＥＪ経路、および／またはＴＭＥＪ経路）を阻害することにおいて使用するための化学阻害剤の例は、Ｗ７、クロルプロマジン、バニリン、Ｎｕ７０２６、Ｎｕ７４４１、ミリン（ｍｉｒｉｎ）、ＳＣＲ７、ＡＧ１４３６１、またはこれらの組合せであり得る。さらに、ＮＨＥＪ経路の阻害は、内容が参照により本明細書に組み込まれているＡｒｒａｓ ＳＭＤ、Ｆｒａｓｅｒ ＪＡ（２０１６年）、「Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ ｏｆ Ｎｏｎ−Ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ Ｅｎｄ Ｊｏｉｎｉｎｇ Ｉｎｃｒｅａｓｅ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎ ｉｎ Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｎｅｏｆｏｒｍａｎｓ」、ＰｌｏＳ ＯＮＥ、１１巻（９号）：ｅ０１６３０４９頁に記載されているものなどの化学阻害剤を使用して達成することができる。
好適な実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムにおいて使用するための糸状菌細胞の変異体株は、障害のある、または低減した非相同末端接合経路（ＮＨＥＪ経路、Ａｌｔ−ＮＨＥＪ／ＭＭＥＪ経路、もしくはＴＭＥＪ経路、またはこれらの組合せのいずれか）を有し、培養下（例えば、液内培養）で増殖させた場合、酵母様の、菌糸体を形成しない表現型を有する。
プロトプラスト形成方法
一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、糸状菌細胞由来のプロトプラストの生成を必要とする。プロトプラストを調製するための適当な手順は、例えば、ＥＰ２３８，０２３およびＹｅｌｔｏｎら（１９８４年、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ、８１巻：１４７０〜１４７４頁）に記載されているものを含めて任意の当技術分野で公知のものであり得る。一実施形態では、プロトプラストは、１種もしくは複数の溶菌酵素またはこれらの混合物を用いて糸状菌細胞の培養物を処置することによって生成される。溶菌酵素は、ベータ−グルカナーゼおよび／またはポリガラクツロナーゼであり得る。一実施形態では、プロトプラストを生成するための酵素混合物は、ＶｉｎｏＴａｓｔｅ濃縮物である。酵素処置の後、プロトプラストは、当技術分野で公知の方法を使用して単離することができる。例えば、未消化の菌糸断片は、細孔のサイズが２０〜１００ミクロンの範囲である多孔質バリア（例えばＭｉｒａｃｌｏｔｈ）を通して混合物を濾過することによって除去することができる。次いで、プロトプラストを含有する濾液を中等度の速度で遠心分離して、遠心管の底にプロトプラストのペレットを形成させることができる。代替として、浸透圧強度が実質的により低い緩衝液を、濾過されたプロトプラストの表面に穏やかに適用してもよい。次いで、この層状調製物を遠心分離してよく、これにより、プロトプラストがつりあって浮いている管の中で、これらを層に蓄積させることができる。次いでこの層から、プロトプラストをさらなる処理のために単離することができる。プロトプラストの単離後、浸透圧緩衝液（典型的には、ＴＲＩＳを使用して緩衝された１Ｍソルビトール）中にプロトプラストを再懸濁させることにより、残りの酵素含有緩衝液を除去し、遠心分離によって再収集することができる。このステップは繰り返してもよい。酵素含有緩衝液が十分に除去された後、塩化カルシウムも含有する浸透圧的に安定化させた緩衝液中に、プロトプラストを再懸濁させてよい。一実施形態では、１ｍｌあたり１〜３＊１０７の間のプロトプラストの最終濃度まで、プロトプラストを再懸濁させる。
前培養および実際のプロトプラスト形成ステップを変えて、プロトプラストの数および形質転換効率を最適化することができる。典型的な調製は、ＹＰＤなどのリッチ培地１００ｍｌに１０６胞子／ｍｌを播種し、１４〜１８時間の間インキュベーションすることであり得る。これらのパラメータのうちの多くは変えることができる。例えば、播種物サイズ、播種方法、前培養培地、前培養時間、前培養温度、混合条件、洗浄緩衝液組成、希釈比、溶菌酵素処置中の緩衝液組成、使用される溶菌酵素のタイプおよび／または濃度、溶菌酵素とのインキュベーションの時間、プロトプラスト洗浄手順および／または緩衝液、実際の形質転換中のプロトプラストおよび／またはポリヌクレオチドおよび／または形質転換試薬の濃度、形質転換中の物理的パラメータ、形質転換後に形質転換体を得るまでの手順の変更が可能である。
プロトプラストは、浸透圧安定化緩衝液中に再懸濁させることができる。そのような緩衝液の組成は、種、適用、および必要性に応じて変えることができる。しかしながら、典型的には、これらの緩衝液は、０．５から２Ｍの間のスクロース、シトレート、マンニトール、またはソルビトールのような有機コンポーネントのいずれかを含有する。より好ましくは、０．７５から１．５Ｍの間であり、１Ｍが最も好適である。さもなければ、これらの緩衝液は、０．１から１．５Ｍの間の濃度でＫＣｌ、（ＮＨ４）２ＳＯ４、ＭｇＳＯ４、ＮａＣｌ、またはＭｇＣｌ２のような無機浸透圧安定化コンポーネントを含有する。好ましくは０．２から０．８Ｍの間、より好ましくは０．３から０．６Ｍの間、最も好ましくは０．４Ｍである。最も好適な安定化緩衝液は、ＳＴＣ（ソルビトール、０．８Ｍ；ＣａＣｌ２、２５ｍＭ；Ｔｒｉｓ、２５ｍＭ；ｐＨ８．０）またはＫＣｌ−シトレート（ＫＣｌ、０．３〜０．６Ｍ；シトレート、０．２％（ｗ／ｖ））である。プロトプラストは、１×１０５から１×１０１０細胞／ｍｌの間の濃度で使用することができる。好ましくは、濃度は、１×１０６から１×１０９の間であり、より好ましくは、濃度は、１×１０７から５×１０８の間であり、最も好ましくは、濃度は、１×１０８細胞／ｍｌである。ＤＮＡは、０．０１から１０ｕｇの間、好ましくは０．１から５ｕｇの間、さらにより好ましくは０．２５から２ｕｇの間、最も好ましくは０．５から１ｕｇの間の濃度で使用される。トランスフェクションの効率を増大させるため、キャリアＤＮＡ（サケ精子ＤＮＡまたは非コードベクターＤＮＡのような）を形質転換混合物に添加することができる。
一実施形態では、生成および後続の単離の後、プロトプラストは、１種または複数の凍結保護物質と混合される。凍結保護物質は、グリコール、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、ポリオール、糖、２−メチル−２，４−ペンタンジオール（ＭＰＤ）、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）、メチルセルロース、Ｃ結合型凍結防止糖タンパク質（Ｃ−ＡＦＧＰ）、またはこれらの組合せであり得る。本明細書に提供される方法およびシステムにおいて凍結保護物質として使用するためのグリコールは、エチレングリコール、プロピレングリコール、ポリプロピレングリコール（ＰＥＧ）、グリセロール、またはこれらの組合せから選択することができる。本明細書に提供される方法およびシステムにおいて凍結保護物質として使用するためのポリオールは、プロパン−１，２−ジオール、プロパン−１，３−ジオール、１，１，１−トリス−（ヒドロキシメチル）エタン（ＴＨＭＥ）、および２−エチル−２−（ヒドロキシメチル）−プロパン−１，３−ジオール（ＥＨＭＰ）、またはこれらの組合せから選択することができる。本明細書に提供される方法およびシステムにおいて凍結保護物質として使用するための糖は、トレハロース、スクロース、グルコース、ラフィノース、デキストロース、またはこれらの組合せから選択することができる。一実施形態では、プロトプラストは、ＤＭＳＯと混合される。ＤＭＳＯは、少なくとも、最大で、１％、２％、３％、４％、５％、６％、７％、８％、９％、１０％、１２．５％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、または７５％ｗ／ｖまたはｖ／ｖであるか、それ未満であるか、それを超えるか、それに等しいか、またはおおよそその値の最終濃度でプロトプラストと混合することができる。プロトプラスト／凍結保護物質（例えば、ＤＭＳＯ）混合物は、保存前にマイクロタイタープレートに分配することができる。プロトプラスト／凍結保護物質（例えば、ＤＭＳＯ）混合物は、本明細書に提供される長期保存（例えば、数時間、日（複数可）、週（複数可）、月（複数可）、年（複数可））にわたって、本明細書に提供される任意の温度、例えば、−２０℃または−８０℃などで保存することができる。一実施形態では、追加の凍結保護物質（例えば、ＰＥＧ）が、プロトプラスト／ＤＭＳＯ混合物に添加される。さらに別の実施形態では、追加の凍結保護物質（例えば、ＰＥＧ）が、保存前にプロトプラスト／ＤＭＳＯ混合物に添加される。ＰＥＧは、本明細書に提供される任意のＰＥＧであり得、本明細書に提供される任意の濃度（例えば、ｗ／ｖまたはｖ／ｖ）で添加することができる。一実施形態では、ＰＥＧ溶液は、ＳＴＣ緩衝液中４０％ｗ／ｖで調製される。次いで、この４０％ＰＥＧ−ＳＴＣの２０％ｖ／ｖをプロトプラストに添加してよい。例えば、８００マイクロリットルの１．２５×１０７プロトプラストは、２００マイクロリットルの４０％ＰＥＧ−ＳＴＣを有し、１ｍｌの最終体積をもたらすことになる。次いでこの１ｍｌに、７０マイクロリットルのＤＭＳＯを添加して、この調製物を７％ｖ／ｖのＤＭＳＯにすることができる。
形質転換方法
一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、本明細書に記載の糸状菌細胞に由来するプロトプラストへの核酸の移入を必要とする。別の実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムによって利用される形質転換は、本明細書に記載する通り、本質的にハイスループットであり、かつ／または部分的もしくは完全に自動化されている。本実施形態に付け加えて、形質転換は、本明細書に記載のコンストラクトまたは発現コンストラクトをマイクロタイタープレートのウェルに添加し、その後、本明細書に提供される方法によって生成されたプロトプラストをマイクロタイタープレートの各ウェルに分注することによって実施される。プロトプラストの形質転換／トランスフェクションの適当な手順は、例えば、国際特許出願第ＰＣＴ／ＮＬ９９／００６１８号、同第ＰＣＴ／ＥＰ９９／２０２５１６号、ＦｉｎｋｅｌｓｔｅｉｎおよびＢａｌｌ（編）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｏｆ ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓ ｆｕｎｇｉ， ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｐｒｏｄｕｃｔｓ、Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ−Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ（１９９２年）、ＢｅｎｎｅｔｔおよびＬａｓｕｒｅ（編）、Ｍｏｒｅ Ｇｅｎｅ Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ ｉｎ ｆｕｎｇｉ、Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９１年）、Ｔｕｒｎｅｒの、Ｐｕｈｌｅｒ（編）、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、完全に改訂された第２版、ＶＨＣ（１９９２年）において記載されているもの、プロトプラスト融合、ならびにＥＰ６３５５７４Ｂに記載されているＣａ−ＰＥＧ媒介性プロトプラスト形質転換を含めて、任意の当技術分野で公知のものであり得る。代替として、糸状菌宿主細胞またはそれに由来するプロトプラストの形質転換は、電気穿孔、例えば、ＣｈａｋｒａｂｏｒｔｙおよびＫａｐｏｏｒ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、１８巻：６７３７頁（１９９０年）によって記載されている電気穿孔など、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ媒介性形質転換、ＤＮＡの微粒子銃導入、例えば、Ｃｈｒｉｓｔｉａｎｓｅｎら、Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ．、２９巻：１００〜１０２頁（１９９５年）；Ｄｕｒａｎｄら、Ｃｕｒｒ． Ｇｅｎｅｔ．、３１巻：１５８〜１６１頁（１９９７年）；およびＢａｒｃｅｌｌｏｓら、Ｃａｎ． Ｊ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、４４巻：１１３７〜１１４１頁（１９９８年）に記載されているものなど、または細胞の「磁気微粒子銃（ｍａｇｎｅｔｏ−ｂｉｏｌｉｓｔｉｃ）」トランスフェクション、例えば、米国特許第５，５１６，６７０号および同第５，７５３，４７７号に記載されているものなどによっても実施することができる。一実施形態では、糸状菌宿主細胞またはそれに由来するプロトプラストの形質転換は、衝撃波を利用する方法を使用して実施される。衝撃波による方法は、当技術分野で公知の任意の衝撃波による方法、例えば、Ｄｅｎｉｓ Ｍａｇａｎａ−Ｏｒｔｉｚ、Ｎａｎｃｙ Ｃｏｃｏｎｉ−Ｌｉｎａｒｅｓ、Ｅｌｉｚａｂｅｔｈ Ｏｒｔｉｚ−Ｖａｚｑｕｅｚ、Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ、Ａｃｈｉｍ Ｍ． Ｌｏｓｋｅ、Ｍｉｇｕｅｌ Ａ． Ｇｏｍｅｚ−Ｌｉｍ（２０１３年）、Ａ ｎｏｖｅｌ ａｎｄ ｈｉｇｈｌｙ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ ｆｕｎｇｉ ｅｍｐｌｏｙｉｎｇ ｓｈｏｃｋ ｗａｖｅｓ．、Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ａｎｄ Ｂｉｏｌｏｇｙ．、５６巻：９〜１６頁によって記載されている、単一パルスの水中衝撃波による方法などであり得る。本明細書における方法において使用するための衝撃波による方法は、Ｌｏｓｋｅ ＡＭ、Ｆｅｒｎａｎｄｅｚ Ｆ、Ｍａｇａｎａ−Ｏｒｔｉｚ、Ｃｏｃｏｎｉ−Ｌｉｎａｒｅｓ Ｎ、Ｏｒｔｉｚ−Ｖａｚｑｕｅｚ Ｅ、Ｇｏｍｅｚ−Ｌｉｍ ＭＡ（２０１４年）、Ｔａｎｄｅｍ ｓｈｏｃｋ ｗａｖｅｓ ｔｏ ｅｎｈａｎｃｅ ｇｅｎｅｔｉｃ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｏｆ Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ．、Ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｓ．、５４巻（６号）：１６５６〜６２頁によって記載されている二重パルス衝撃波であってもよい。一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムにおいて使用される形質転換手順は、例えばＰＥＧ媒介性形質転換など、本明細書に提供されるハイスループット処理および／または自動化に対して修正可能なものである。
本明細書に記載の方法を使用して生成されるプロトプラストの形質転換は、当技術分野で公知の任意の形質転換試薬を使用することによって促進することができる。適当な形質転換試薬は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ＦＵＧＥＮＥ（登録商標）ＨＤ（Ｒｏｃｈｅ製）、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（登録商標）またはＯＬＩＧＯＦＥＣＴＡＭＩＮＥ（登録商標）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ製）、ＴＲＡＮＳＰＡＳＳ（登録商標）Ｄ１（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ製）、ＬＹＰＯＶＥＣ（登録商標）またはＬＩＰＯＧＥＮ（登録商標）（Ｉｎｖｉｖｏｇｅｎ製）から選択することができる。一実施形態では、ＰＥＧが最も好適な形質転換／トランスフェクション試薬である。ＰＥＧは、異なる分子量で入手可能であり、異なる濃度で使用することができる。好ましくは、ＰＥＧ４０００が、１０％から６０％の間、より好ましくは２０％から５０％の間、最も好ましくは４０％で使用される。一実施形態では、ＰＥＧは、本明細書に記載する通り、保存前にプロトプラストに添加される。
形質転換のためのコンストラクト
一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、少なくとも１つの核酸を用いた、糸状菌細胞またはそれに由来するプロトプラストの形質転換またはトランスフェクションを伴う。形質転換またはトランスフェクションは、本明細書に記載の方法および試薬の使用であり得る。プロトプラストの生成は、本明細書に提供される方法のいずれを使用して実施してもよい。プロトプラストの生成および／または形質転換は、本明細書に提供される通り、ハイスループットであり、かつ／または自動化されていてよい。核酸は、ＤＮＡ、ＲＮＡ、またはｃＤＮＡであり得る。核酸は、ポリヌクレオチドであってもよい。本明細書に提供される方法およびシステムを使用して糸状菌細胞またはそれに由来するプロトプラストを形質転換することにおいて使用するための核酸またはポリヌクレオチドは、改変体株および／または親株に対して、内在性遺伝子であっても異種遺伝子であってもよい。内在性遺伝子または異種遺伝子は、本明細書に記載される目的の産物またはタンパク質をコードし得る。本明細書に記載する通り、目的のタンパク質は、糸状菌において発現することが所望されるポリペプチドを指す場合がある。そのようなタンパク質は、酵素、基質結合タンパク質、界面活性タンパク質、構造タンパク質などであってよく、高レベルで発現することができ、商業化を目的とするものであってよい。目的のタンパク質は、細胞内で、または分泌タンパク質として発現させることができる。内在性遺伝子または異種遺伝子は、変異を含み、かつ／あるいは、１つもしくは複数の遺伝子制御エレメントもしくは調節エレメントの制御下にあるか、またはそれらに作動可能に連結していてもよい。変異は、例えば、挿入、欠失、置換、および／または一塩基多型など、本明細書に提供される任意の変異であり得る。１つまたは複数の遺伝子制御エレメントまたは調節エレメントは、プロモーター配列および／またはターミネーター配列であり得る。
プロモーター配列および／またはターミネーター配列は、改変体株および／または親株に対して、内在性であっても異種であってもよい。プロモーター配列は、発現させようとする配列の５’末端に作動可能に連結していてもよい。例えば、Ｃ１エンドグルカナーゼ、５５ｋＤａセロビオヒドロラーゼ（ＣＢＨ１）、グリセルアルデヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼＡ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ由来のＣ．ｌｕｃｋｎｏｗｅｎｓｅ ＧＡＲＧ ２７Ｋおよび３０ｋＤａキシラナーゼ（Ｘｙ１Ｆ）プロモーター、ならびに、例えば米国特許第４，９３５，３４９号、同第５，１９８，３４５号、同第５，２５２，７２６号、同第５，７０５，３５８号、および同第５，９６５，３８４号、ならびにＰＣＴ出願第ＷＯ９３／０７２７７号に記載されているＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓプロモーターのプロモーター配列といった、様々な公知の真菌プロモーターが、本開示の宿主株において機能的である可能性が高い。ターミネーター配列は、発現させようとする配列の３’末端に作動可能に連結していてもよい。様々な公知の真菌ターミネーターが、本開示の宿主株において機能的である可能性が高い。例は、Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ ｔｒｐＣターミネーター、Ａ．ｎｉｇｅｒアルファ−グルコシダーゼターミネーター、Ａ．ｎｉｇｅｒグルコアミラーゼターミネーター、Ｍｕｃｏｒ ｍｉｅｈｅｉカルボキシルプロテアーゼターミネーター（米国特許第５，５７８，４６３号を参照）、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍターミネーター配列、例えばＥＧ６ターミネーター、およびＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ ｒｅｅｓｅｉセロビオヒドロラーゼターミネーターである。
一実施形態では、糸状菌細胞から生成されたプロトプラストを、２つまたはそれよりも多くの核酸またはポリヌクレオチドと共に同時形質転換する。本実施形態に付け加えて、２つまたはそれよりも多くのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、プロトプラストが生成された糸状菌株に対して、内在性遺伝子または異種遺伝子であり、２つまたはそれよりも多くのポリヌクレオチドのうちの少なくとも１つは、選択可能マーカーの遺伝子である。選択可能マーカー遺伝子は、本明細書に提供される任意の選択可能マーカーであってよい。他の実施形態では、スプリットマーカーシステムが利用される。
一実施形態では、糸状菌細胞またはそれに由来するプロトプラストを形質転換することまたはそれらにトランスフェクトすることにおいて使用するための各核酸またはポリヌクレオチドは、核酸またはポリヌクレオチドの５’末端、３’末端、または５’末端および３’末端の両方のいずれかに、形質転換しようとする糸状菌細胞またはそれに由来するプロトプラストのゲノムの所定の標的遺伝子座に存在するＤＮＡ配列に相同な配列を含む。核酸またはポリヌクレオチドは、糸状菌宿主細胞ゲノム内の所定の遺伝子座に相同な配列が、内在性遺伝子、異種遺伝子、または選択可能マーカー遺伝子に隣接するように、形質転換に使用される糸状菌細胞に対して内在性遺伝子もしくは異種遺伝子、または選択可能マーカー遺伝子であり得る。一実施形態では、各核酸またはポリヌクレオチドは、当技術分野で公知の任意の方法を使用して、例えばｐＢＬＵＥＳＣＲＩＰＴ（登録商標）（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）などのクローニングベクターにクローニングされる。適当なクローニングベクターは、使用される糸状菌宿主細胞の染色体における所定の標的遺伝子座で組み込まれることができるものであり得る。好適な組込みクローニングベクターは、この所定の遺伝子座へのクローニングベクターの組込みを標的化するために、欠失または置き換えを行おうとするＤＮＡ配列に相同なＤＮＡ断片を含み得る。標的化組込みを促進するために、宿主細胞またはそれに由来するプロトプラストの形質転換の前に、クローニングベクターを直線化してもよい。好ましくは、直線化は、クローニングベクターの少なくとも一方の末端だが好ましくは両末端に、欠失または置き換えを行おうとするＤＮＡ配列に相同な配列が隣接するように実施される。一部の場合では、ＤＮＡの短い相同性ストレッチが、例えばＰＣＲによって、組み込まれる核酸またはポリヌクレオチドの両側に付加され得る。組み込まれる核酸またはポリヌクレオチド配列に隣接する相同配列の長さは、好ましくは２ｋｂ未満、さらに好ましくは１ｋｂ未満、さらにより好ましくは０．５ｋｂ未満、さらにより好ましくは０．２ｋｂ未満、さらにより好ましくは０．１ｋｂ未満、さらにより好ましくは５０ｂｐ未満、最も好ましくは３０ｂｐ未満である。組み込まれる核酸またはポリヌクレオチド配列に隣接する相同配列の長さは、約３０ｂｐ〜約１０００ｂｐ、約３０ｂｐ〜約７００ｂｐ、約３０ｂｐ〜約５００ｂｐ、約３０ｂｐ〜約３００ｂｐ、約３０ｂｐ〜約２００ｂｐ、および約３０ｂｐ〜約１００ｂｐと様々であり得る。糸状菌細胞またはそれに由来するプロトプラストを形質転換することにおいて使用するための核酸またはポリヌクレオチドは、発現カセットとして存在してもよい。一実施形態では、クローニングベクターはｐＵＣ１９である。本実施形態に付け加えて、当技術分野で公知のギブソンアセンブリーを使用することによってコンストラクトを構築することにより、本明細書に提供されるマーカー配列を含有するクローニングベクターを標的化配列に付随させることができる。代替として、融合ＰＣＲによって標的化配列を付加してもよい。マーカーに連結していない同時形質転換のための標的化配列を、ゲノムＤＮＡから増幅させてもよい。
理論上は、本明細書に提供される核酸またはポリヌクレオチドを含む発現カセットの標的化組込みのために、糸状菌ゲノム内のすべての遺伝子座が選択され得る。好ましくは、標的化が起こる遺伝子座は、この遺伝子座に存在する野生型遺伝子が、発現カセットに含まれる遺伝子によって置き換えられたとき、得られる変異体が、例えば本明細書に記載の選択／対抗選択スキームなどの所与のアッセイによって検出可能な変化を示すようなものである。一実施形態では、本明細書に記載の糸状菌細胞から生成されたプロトプラストは、第１のコンストラクトまたは発現カセットが、プロトプラストゲノムの第１の遺伝子座に組み込まれるように設計され、第２のコンストラクトまたは発現カセットが、プロトプラストゲノムの第２の遺伝子座に組み込まれるように設計されているような、第１のコンストラクトまたは発現カセットおよび第２のコンストラクトまたは発現カセットと共に同時形質転換される。第１の遺伝子座および第２の遺伝子座への組込みを容易にするために、第１のコンストラクトまたは発現カセットには、第１の遺伝子座に相同な配列が隣接し、第２のコンストラクトまたは発現カセットには、第２の遺伝子座に相同な配列が隣接している。一実施形態では、第１のコンストラクトまたは発現カセットは、内在性遺伝子の配列を含み、第２のコンストラクトは、選択可能マーカー遺伝子の配列を含む。本実施形態に付け加えて、第２の遺伝子座は、本明細書に提供される方法およびシステムにおいて使用されるプロトプラストゲノムに存在する追加の選択可能マーカー遺伝子の配列を含有し、第１の遺伝子座は、本明細書に提供される方法およびシステムにおいて使用されるプロトプラストゲノムに存在する内在性標的遺伝子の配列を含有する。別個の実施形態では、第１のコンストラクトまたは発現カセットは、内在性遺伝子または異種遺伝子の配列を含み、第２のコンストラクトは、第１の選択可能マーカー遺伝子の配列を含む。この別個の実施形態に付け加えて、第２の遺伝子座は、本明細書に提供される方法およびシステムにおいて使用されるプロトプラストゲノムに存在する第２の選択可能マーカー遺伝子の配列を含有し、第１の遺伝子座は、本明細書に提供される方法およびシステムにおいて使用されるプロトプラストゲノムに存在する第３の選択可能マーカー遺伝子の配列を含有する。上記実施形態のそれぞれでは、内在性遺伝子および／または異種遺伝子は、本明細書に提供される変異（例えば、ＳＮＰ）および／または遺伝子制御エレメントもしくは調節エレメントを含み得る。別の態様では、スプリットマーカーシステムが利用される。
スプリットマーカー形質転換
Ｃａｔｌｅｔｔ， Ｎ． Ｌ．、Ｂ． Ｌｅｅ、Ｏ．Ｃ． Ｙｏｄｅｒ、およびＢ．Ｇ． Ｔｕｒｇｅｏｎ（２００３年）、「Ｓｐｌｉｔ−Ｍａｒｋｅｒ Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｆｏｒ Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ Ｔａｒｇｅｔｅｄ Ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｓ」、Ｆｕｎｇａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｒｅｐｏｒｔｓ：５０巻、論文４に記載されている「スプリットマーカー」形質転換は、選択可能な表現型を付与する遺伝子の断片を利用する。個々の断片は、株に個々に組み込まれた場合、標的株における変異を補完しないか、または抗生物質耐性を付与しない。選択可能マーカーの適切な発現は、２つの断片が耐性遺伝子または栄養要求性マーカーを組み換え、修復するときに起こる。
図１Ｂには、スプリットマーカーの一例が図示されている。この例において、マーカー遺伝子はｐｙｒＧである。表されているＤＮＡの断片は、ｐｙｒＧ遺伝子の５’側の半分である「ｐｙｒ」および３’側の半分である「ｙｒＧ」である。これらのコンストラクトは、標的株におけるｐｙｒＧ変異を補完するために使用される。ｐｙｒ部分がｙｒＧ部分と組み換わることなく組み込まれた場合、補完はない。所望のＳＮＰを含有する配列の領域のダイレクトリピートが付加される。
スプリットマーカーコンストラクトを使用した遺伝子標的化は、標的遺伝子座と同一のＤＮＡが、２つのコンポーネントのそれぞれに融合した場合に起こる。例えば、単一塩基対変化の標的化は、ＳＮＰの上流の５’領域に対応するＤＮＡを、スプリットマーカーの５’側の半分に融合させることによって実施される。対応する３’ＤＮＡは、３’スプリットマーカーに融合させる。これらが相同組込みによって細胞中で組み換わるとき、２つのダイレクトリピートは、ＳＮＰライブラリーにおけるものとマッチする、標的株におけるＳＮＰ遺伝子座にある。ＳＮＰ交換の完了は、２つのダイレクトリピート同士の間の相同組換えによってマーカーがループアウトされると起こる。
ホモカリオン状プロトプラストの精製
当業者には理解されるように、糸状菌に由来するプロトプラストは、多くの場合、プロトプラスト中に存在する複数の核のうちのサブセットのみに発現コンストラクトが組み込まれるように、本明細書に提供される発現コンストラクトを用いた後続の形質転換により、ヘテロカリオンであるプロトプラストが産生され得るように、１つを超える核を含有し得る。形質転換前の糸状菌宿主細胞に由来するプロトプラストの集団における単核プロトプラストのパーセンテージを増加させるためには、例えば、Ｒｏｎｃｅｒｏら、１９８４年、Ｍｕｔａｔ． Ｒｅｓ．、１２５巻：１９５頁に記載されているようなストラテジーを使用することができる。
選択可能マーカーは、多くの場合、非形質転換株にとって外来性である特定のタイプの耐性をもたらす遺伝子産物をコードし得る。これは、重金属、抗生物質、または殺生物剤全般に対する耐性であり得る。原栄養性も、抗生物質ではない種類の有用な選択可能マーカーであり得る。栄養要求性マーカーは、宿主細胞における栄養欠乏をもたらすことができ、こうした欠乏を補正する遺伝子を選択のために使用することができる。
当技術分野では広い範囲の選択マーカーが使用されており、これらのうちのいずれかまたはすべてが、本明細書に提供される方法およびシステムに適用され得る。本明細書において使用するための選択可能マーカー遺伝子は、栄養要求性マーカー、原栄養性マーカー、優性マーカー、劣性マーカー、抗生物質耐性マーカー、異化マーカー、酵素マーカー、蛍光マーカー、発光マーカー、またはこれらの組合せであり得る。本明細書に提供される方法において使用するための選択可能／対抗選択可能マーカーの例としては、これらに限定されないが、ａｍｄＳ（アセトアミドでの選択／フルオロアセトアミドでの対抗選択）、ｔｋ（ヘルペスウイルス由来のチミジンキナーゼ；５−フルオロ−２’−デオキシウリジンでの対抗選択）、ｂｌｅ（ブレオマイシン（ｂｅｌｏｍｙｃｉｎ）−フレオマイシン耐性）、ｈｙｇ（ハイグロマイシンＲ）、ｎａｔ（ノウルセオトリシン（ｎｏｕｒｓｅｏｔｒｉｃｉｎ）Ｒ）、ｐｙｒＧ（ウラシル＋ウリジンでの選択／５’ＦＯＡでの対抗選択）、ｎｉａＤまたはｎｉａＡ（ナイトレートでの選択／クロレートでの対抗選択）、ｓｕｔＢ（サルフェートでの選択／セレネートでの対抗選択）、ｅＧＦＰ（緑色蛍光タンパク質）および異なる色の改変体のすべて、ａｙｇＡ（発色マーカー）、ｍｅｔ３（メチオニンでの選択／セレネートでの対抗選択）、ｓＣ／ｍｅｔＡ（サルフェートでの選択／セレネートでの対抗選択）、ｐｙｒＥ（オロテートＰ−リボシルトランスフェラーゼ）、ｔｒｐＣ（アントラニル酸シンターゼ）、ａｒｇＢ（オルニチンカルバモイルトランスフェラーゼ）、ｂａｒ（ホスフィノトリシンアセチルトランスフェラーゼ）、変異体アセト乳酸シンターゼ（スルホニル尿素耐性）、ならびにネオマイシンホスホトランスフェラーゼ（アミノグリコシド耐性）を含む。
本開示の別の実施形態は、糸状菌中で活性のある２つまたはそれよりも多くの選択マーカーの使用を伴う。使用することができる選択マーカーには広い範囲の組合せがあり、これらのすべてが、本明細書に提供される選択／対抗選択スキームに適用され得る。例えば、選択／対抗選択スキームは、栄養要求性マーカー、原栄養性マーカー、優性マーカー、劣性マーカー、抗生物質耐性マーカー、異化マーカー、酵素マーカー、蛍光マーカー、および発光マーカーの組合せを利用することができる。第１のマーカーを使用して、フォワードモード（すなわち、能動的な組込みが起きた場合）において選択することができ、追加のマーカーを使用して、リバースモード（すなわち、正しい遺伝子座における能動的な組込みが起きた場合）において選択することができる。選択／対抗選択は、選択マーカーが、本明細書に記載される内在性遺伝子または異種遺伝子とは別個のベクター上にあってもよく、または同じ核酸断片もしくはベクター内にあってもよいように、同時形質転換によって実行することができる。
一実施形態では、本開示のホモカリオン状プロトプラスト精製スキームは、第１のコンストラクトが、除去または不活性化しようとする標的遺伝子の配列を含むプロトプラストゲノムの第１の遺伝子座を対象とし、第２のコンストラクトが、第２の選択可能マーカー遺伝子の配列を含むプロトプラストゲノムの第２の遺伝子座を対象とするように、糸状菌宿主細胞から生成されたプロトプラストを、内在性遺伝子または異種遺伝子の配列を含む第１のコンストラクト、および第１の選択可能マーカー遺伝子の配列を含む第２のコンストラクトと共に同時形質転換することを伴う。一実施形態では、第１のコンストラクトは、内在性遺伝子または異種遺伝子の配列を含み、除去または不活性化しようとする標的遺伝子は、第３の選択可能マーカー遺伝子のためのものである。別個の実施形態では、第１のコンストラクトは、内在性遺伝子の配列を含み、除去または不活性化しようとする標的遺伝子は、形質転換前のプロトプラストのゲノムに存在する内在性遺伝子のコピーである。本明細書に記載する通り、第１のコンストラクトの内在性遺伝子または異種遺伝子は、変異（例えば、ＳＮＰ）および／または遺伝子調節エレメントもしくは制御エレメント（例えば、プロモーターおよび／またはターミネーター）を含み得る。第１、第２、および／または第３の選択可能マーカーは、当技術分野で公知かつ／または本明細書に記載の任意の栄養要求性マーカー、原栄養性マーカー、優性マーカー、劣性マーカー、抗生物質耐性マーカー、異化マーカー、酵素マーカー、蛍光マーカー、発光マーカーであり得る。特定の遺伝子座を対象とするために、コンストラクトのそれぞれには、本明細書に記載する通り、プロトプラストゲノムにおける所望の遺伝子座に相同なヌクレオチドが隣接している。
第１のコンストラクトが、内在性遺伝子または異種遺伝子の配列を含み、除去または不活性化しようとする標的遺伝子が、第３の選択可能マーカー遺伝子のためのものである実施形態の一例は、図４Ａに示されている。この例において、第１のコンストラクトは、発色性の選択可能マーカー遺伝子ａｙｇＡの遺伝子座に組み込まれるＳＮＰを含む、糸状菌におけるクエン酸産生に関与する内在性遺伝子の配列を含み、第２のコンストラクトは、栄養要求性マーカー遺伝子ｍｅｔ３の遺伝子座に組み込まれる栄養要求性マーカー遺伝子ｐｙｒＧの配列を含む。この例において、糸状菌宿主細胞は、ｐｙｒＧ陰性またはウラシル栄養要求性である。したがって、ホモカリオン状プロトプラスト形質転換体の精製は、ウラシルを欠く最少培地で前記形質転換体を増殖させることを伴う。図４Ａに示したように、ホモカリオンの形質転換体は、ウラシル原栄養株になるだけでなく、純粋な黄色にもなり、ｐｙｒＧ遺伝子の組込みおよびａｙｇＡ遺伝子の除去を示している。残留しているあらゆるヘテロカリオンコロニーの対抗選択および除去は、セレネートを含有する最少培地（ウラシルありまたはなし）に形質転換体を続いて平板培養し、それにより、ｍｅｔ３＋核を有する形質転換体をセレネートの存在下で死滅させることによって達成することができる。ｍｅｔ３遺伝子と同様に作動する別のマーカーは、例えば、本実施形態に記載の選択／対抗選択スキームにおいて使用することができる、硝酸レダクターゼをコードするｎｉａＡ遺伝子であり得る。ｎｉａＡ遺伝子に関して、糸状菌宿主細胞は、第２のコンストラクトの正確な組込みにより、対抗選択中に使用されるクロレートへの耐性があるｎｉａＡ−子孫が生成されるように、ｎｉａＡ＋であってよい。一実施形態では、プロトプラストゲノムへの第１および／または第２のコンストラクトの正確な組込みの確認は、例えば次世代シーケンシング（ＮＧＳ）などを使用してプロトプラストのゲノムをシーケンシングすることにより確認される。
第１のコンストラクトが、内在性遺伝子の配列を含み、除去または不活性化しようとする標的遺伝子が、形質転換前のプロトプラストのゲノムに存在する内在性遺伝子のコピーである実施形態の一例は、図５に示されている。この例において、第１のコンストラクトは、ＳＮＰを含む、糸状菌におけるクエン酸産生に関与する内在性遺伝子の配列であって、前記ＳＮＰを欠く前記内在性遺伝子の遺伝子座に組み込まれる配列を含み、第２のコンストラクトは、発色マーカー遺伝子ａｙｇＡの遺伝子座に組み込まれる栄養要求性マーカー遺伝子ｐｙｒＧの配列を含む。この例において、糸状菌宿主細胞は、ｐｙｒＧ陰性またはウラシル栄養要求性である。したがって、ホモカリオン状プロトプラスト形質転換体の精製は、ウラシルを欠く最少培地で前記形質転換体を増殖させることを伴う。図５に示したように、ホモカリオンの形質転換体は、ウラシル原栄養株になるだけでなく、純粋な黄色にもなり、ｐｙｒＧ遺伝子の組込みおよびａｙｇＡ遺伝子の除去を示している。一実施形態では、プロトプラストゲノムへの第１および／または第２のコンストラクトの正確な組込みの確認は、例えば次世代シーケンシング（ＮＧＳ）などを使用してプロトプラストのゲノムをシーケンシングすることにより確認される。
一実施形態では、第２のコンストラクトは、再利用可能または可逆的なマーカーをコードする発現カセットを含む。再利用可能または可逆的なマーカーは、破壊ｎｅｏ−ｐｙｒＧ−ｎｅｏ発現カセットであり得る。ｎｅｏ−ｐｙｒＧ−ｎｅｏコンストラクトは、糸状菌宿主細胞（例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ）のｕｒａ−株において、上記実施形態に記載の第１のコンストラクトと共に同時形質転換することができ、ホモカリオンの形質転換体は、上述したように、ウラシル欠乏培地上で平板培養し、純粋な黄色のウラシル原栄養株を選択することにより、選択することができる。その後、ｐｙｒＧ選択の使用は、前記ホモカリオンの形質転換体を５−ＦＯＡ含有培地上で平板培養し、前記５−ＦＯＡ培地上で増殖する（これは、前記形質転換体が、ｐｙｒＧ遺伝子の切除をもたらすｎｅｏリピート間の染色体内組換えを受けたことを示す）形質転換体を選択することにより、再生することができる。
ライブラリーの生成
本開示のさらなる態様は、真菌変異体ライブラリーの構築およびスクリーニング、ならびに本明細書に開示される方法によって調製された真菌変異体ライブラリーを含み得る。ライブラリーは、当業者に公知の方法を使用した、組込み形質転換の任意の手段を用いる、本開示による真菌宿主の形質転換によって得ることができる。本明細書に提供される方法およびシステムを使用して生成される好適な宿主株に基づく真菌のライブラリーは、小型化および／またはハイスループットフォーマットのスクリーニング方法において、ハンドリングし、外因性タンパク質の所望の特性または活性についてスクリーニングすることができる。目的の特性または活性は、ライブラリーメンバーの外因性タンパク質に関連した、任意の物理的、物理化学的、化学的、生物学的、もしくは触媒的特性、またはそのような特性の何らかの改善、増大、もしくは減少を意味し得る。ライブラリーは、外因性タンパク質および／または内在性タンパク質の存在の結果としてもたらされた、代謝産物について、または代謝産物に関連した特性もしくは活性についてスクリーニングすることもできる。ライブラリーは、そのようなタンパク質または代謝産物を増加または減少した量で産生する真菌についてスクリーニングすることもできる。
一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、複数のプロトプラストのうちの各プロトプラストが、複数の第１のコンストラクトのうちの単一の第１のコンストラクトおよび複数の第２のコンストラクトのうちの単一の第２のコンストラクトで形質転換されるように、複数のプロトプラストを生成する。本実施形態に付け加えて、複数の第１のコンストラクトのうちそれぞれの第１のコンストラクトにおける第１のポリヌクレオチドは、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントもしくは調節エレメントを含み、複数の第２のコンストラクトのうちそれぞれの第２のコンストラクトにおける第２のポリヌクレオチドは同一である。本方法は、本明細書に記載する通り、ライブラリー中の各糸状菌細胞が、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントもしくは調節エレメントを有する第１のポリヌクレオチドを含むような、糸状菌細胞のライブラリーを生成するために、２回またはそれよりも多く、選択／対抗選択を使用してホモカリオンの形質転換体を形質転換および精製するステップをさらに含む。一実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、変異を含む標的糸状菌遺伝子または異種遺伝子の配列を含み、その結果、反復プロセスにより、プロトプラストが再生されると、ライブラリーの各メンバーが、明確に異なる変異を有する標的糸状菌遺伝子または異種遺伝子を含むような糸状菌細胞のライブラリーが生成される。一実施形態では、変異はＳＮＰであり、本方法はそれにより、ＳＮＰスワップライブラリーをもたらす。一実施形態では、標的糸状菌遺伝子は、クエン酸産生に関与する遺伝子であり、複数の第１のコンストラクトは、表１に提供するＳＮＰのライブラリーである。別の実施形態では、第１のポリヌクレオチドは、遺伝子制御エレメントまたは調節エレメントに作動可能に連結した標的糸状菌遺伝子または異種遺伝子の配列を含み、その結果、本明細書に記載の反復プロセスにより、プロトプラストが再生されると、ライブラリーの各メンバーが、明確に異なる遺伝子制御エレメントまたは調節エレメントに作動可能に連結した標的糸状菌遺伝子または異種遺伝子を含むような糸状菌細胞のライブラリーが生成される。一実施形態では、遺伝子制御エレメントまたは調節エレメントはプロモーターであり、本方法はそれにより、プロモーターまたはＰＲＯライブラリーをもたらす。一実施形態では、遺伝子制御エレメントまたは調節エレメントはターミネーターであり、本方法はそれにより、ターミネーターまたはＳＴＯＰライブラリーをもたらす。プロモーターおよび／またはターミネーター配列は、本明細書に提供される方法およびシステムにおいて使用される糸状菌宿主細胞における発現のための、本明細書に提供され、かつ／または当技術分野で公知のプロモーターまたはターミネーター配列であってよい。
ＳＮＰスワッピング
一実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、個々のＳＮＰまたはＳＮＰの組合せを有する糸状菌を含む糸状菌ライブラリーを生成するために、ＳＮＰスワッピングに利用される。
このプロセスを介して操作された結果として生じる微生物は、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーを形成する。
ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、このプロセスを介して形成される実際の物理的な微生物株コレクションを指すことができ、各メンバー株は、その他は同一の遺伝的バックグラウンドにおいて所与のＳＮＰの存在または非存在を代表し、前記ライブラリーは、「ＳＮＰスワップ微生物株ライブラリー」と呼ばれる。
さらに、ＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーは、遺伝的摂動のコレクションを指すことができ、この場合、所与のＳＮＰは存在するか、または所与のＳＮＰは存在せず、前記コレクションは、「ＳＮＰスワップライブラリー」と呼ばれる。
よって、ＳＮＰスワッピングには、同定された有益な性能効果を有する標的ＳＮＰ「構成要素」の最適な組合せを用いた宿主生物の再構築が含まれる。よって、一部の実施形態では、ＳＮＰスワッピングには、反復プロセスにおいて１つずつ、または単一ステップにおける複数の変化として、単一株バックグラウンドに複数の有益な変異を併合することが含まれる。複数の変化は、規定された変化の特定のセット、または変異の部分的にランダム化されたコンビナトリアルライブラリーであり得る。
他の実施形態では、ＳＮＰスワッピングには、反復プロセスにおいて１つずつ、または単一ステップにおける複数の変化として、有害と同定された複数の変異を株から除去することも含まれる。複数の変化は、規定された変化の特定のセット、または変異の部分的にランダム化されたコンビナトリアルライブラリーであり得る。一部の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、有益なＳＮＰの付加ならびに有害なおよび／または中性の変異の除去の両方を含む。
一部の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、変異した株（例えば、Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎの中の株）において同定された１つまたは複数のＳＮＰを参照株（Ｓ１Ｇｅｎ１）または野生型株に導入するステップを含む。
他の実施形態では、本開示のＳＮＰスワッピング方法は、変異した株（例えば、Ｓ２−ｎＧｅｎ２−ｎの中の株）において同定された１つまたは複数のＳＮＰを除去するステップを含む。
一部の実施形態では、１つまたは複数のＳＮＰ変化（導入または除去のいずれか）を含むそれぞれの生成された株は、培養され、本開示の１つまたは複数の判定基準（例えば、目的の化学物質または産物の産生）下で分析される。分析された宿主株のそれぞれからのデータは、宿主株内に存在する特定のＳＮＰまたはＳＮＰの群と関連付けられ、または相関付けられ、将来使用するために記録される。よって、本開示は、任意の数の目的の微生物の遺伝形質または表現型形質に対する所与のＳＮＰの効果を同定することができる、大型で高度にアノテートされたＨＴＰ遺伝子設計微生物株ライブラリーの作出を可能にする。これらのＨＴＰ遺伝子設計ライブラリーに記憶された情報は、ＨＴＰゲノム操作プラットフォームを機械学習アルゴリズムに通知され、プロセスの将来の反復を指示し、これにより、高度に望ましい特性／形質を有する進化した微生物が最終的にもたらされる。
ＨＴＰ自動化システム
一部の実施形態では、本明細書に提供される方法およびシステムは、自動化されたステップを含む。例えば、本明細書に記載されるプロトプラストの生成、プロトプラストの形質転換、および／または選択／対抗選択によるホモカリオン状プロトプラストの精製は、自動化されていてよい。本明細書に記載する通り、本方法およびシステムは、目的のタンパク質または代謝産物の産生のために、精製されたホモカリオンの形質転換体をスクリーニングするさらなるステップを含有し得る。本開示の自動化された方法は、ロボットシステムを含み得る。本明細書に概説したシステムは一般に、９６ウェルまたは３８４ウェルのマイクロタイタープレートの使用を対象とし得るが、当業者には理解されるように、任意の数の異なるプレートまたは構成を使用することができる。さらに、本明細書に概説したステップのいずれか、またはすべてを自動化することができる。よって、例えば、本システムは、完全または部分的に自動化されていてよい。自動化された方法およびシステムは、ハイスループットであり得る。本開示の目的に関して、ハイスループットスクリーニングは、１日あたり約１，０００またはそれよりも多くの形質転換体を評価することができる、任意の部分的または完全に自動化された方法、特に、１日あたり５，０００またはそれよりも多くの形質転換体を評価することができる方法、とりわけ、１日あたり１０，０００またはそれよりも多くの形質転換体を評価することができる方法を指す場合がある。
本明細書に記載する通り、本明細書に提供される方法およびシステムは、本明細書に記載する通り生成および精製された形質転換体が、目的の産物の産生についてスクリーニングまたは試験されるような、スクリーニングステップを含み得る。目的の産物は、例えば、アルコール、医薬品、代謝産物、タンパク質、酵素、アミノ酸、または酸（例えば、クエン酸）など、本明細書に提供される任意の目的の産物であり得る。したがって、本明細書に提供される方法およびシステムは、本開示の方法に従って精製されたクローンのコロニーまたは培養物を、目的の産物の発現および分泌を可能にする条件下で培養するステップと、その後産生された目的の産物を回収するステップとをさらに含み得る。本明細書に記載する通り、目的の産物は、外因性タンパク質および／もしくは異種タンパク質、または外因性タンパク質およびもしくは異種タンパク質の発現の結果として産生された代謝産物であり得る。
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、１つまたは複数の作業モジュールを含む。例えば、一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、ＤＮＡ合成モジュール、ベクタークローニングモジュール、株形質転換モジュール、スクリーニングモジュール、およびシーケンシングモジュールを含む（図７を参照）。
当業者には理解されるように、自動化システムは、これらに限定されないが、液体ハンドラー；１つまたは複数のロボットアーム；マイクロプレートを位置決めするためのプレートハンドラー；プレートシーラー、プレート穿孔機、非交差汚染プレート上のウェルの蓋を除去および交換するための自動化蓋ハンドラー；使い捨てチップを用いて試料分配するための使い捨てチップアセンブリー；試料分配のための洗浄可能なチップアセンブリー；９６ウェルローディングブロック；一体型サーマルサイクラー；冷却された試薬ラック；マイクロタイタープレートピペットポジション（任意選択で冷却された）；プレートおよびチップのためのスタッキングタワー；磁気ビーズ処理ステーション；濾過システム；プレートシェーカー；バーコードリーダーおよびアプリケーター；ならびにコンピュータシステムを含めた多種多様なコンポーネントを含み得る。
一部の実施形態では、本開示のロボットシステムは、ハイスループットピペット操作を可能にして遺伝子標的化および組換え適用のプロセスにおけるすべてのステップを実施する自動化された液体および粒子のハンドリングを含む。これは、液体および粒子の操作、例えば、吸引、分注、混合、希釈、洗浄、正確な容量測定移送；ピペットチップの回収および廃棄；ならびに単回の試料吸引から複数回送達するための同一体積の繰り返しピペット操作などを含む。これらの操作は、交差汚染のない液体、粒子、細胞、および生物の移送である。機器は、フィルター、膜、および／または娘プレートへのマイクロプレート試料の自動化複製、高密度移送、フルプレート連続希釈、ならびに大容量オペレーションを実施する。
自動化システムは、当技術分野で公知のいかなる公知の自動化ハイスループットシステムであってもよい。例えば、自動化システムは、日本特許出願公開第１１−３０４６６６号に記載されている自動化された微生物ハンドリングツールであり得る。このデバイスは、個々の細胞を含有する微小滴を移送することができ、本開示の真菌株は、それらの形態のおかげで、このデバイスを用いた個々のクローンの微小操作に適していると期待される。本開示の方法およびシステムにおいて使用するための自動化システムの追加の例は、Ｂｅｙｄｏｎら、Ｊ． Ｂｉｏｍｏｌ． Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ、５巻：１３〜２１頁（２０００年）に記載されている自動化された微生物学的ハイスループットスクリーニングシステムである。本明細書において使用するための自動化システムは、カスタマイズされた自動化液体ハンドリングシステムであり得る。一実施形態では、本開示のカスタマイズされた自動化液体ハンドリングシステムは、ＴＥＣＡＮ機械（例えば、カスタマイズされたＴＥＣＡＮ Ｆｒｅｅｄｏｍ Ｅｖｏ）である。
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、マルチウェルプレート、ディープウェルプレート、スクウェアウェルプレート、試薬トラフ、試験管、ミニチューブ、微量遠心チューブ、クライオバイアル、フィルター、マイクロアレイチップ、光ファイバー、ビーズ、アガロースおよびアクリルアミドゲルのためのプラットフォームに適合し、他の固相マトリックスまたはプラットフォームは、アップグレード可能なモジュラーデッキ上に収容される。一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、ソースおよび出力試料、試薬、試料および試薬希釈、アッセイプレート、試料および試薬リザーバー、ピペットチップ、ならびにアクティブチップ洗浄ステーションを配置するための多位置作業面のための少なくとも１つのモジュラーデッキを含有する。
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、プロトプラストを形質転換するためのハイスループット電気穿孔システムを含む。一部の実施形態では、ハイスループット電気穿孔システムは、９６または３８４ウェルプレート内で細胞を形質転換することができる。一部の実施形態では、ハイスループット電気穿孔システムとしては、ＶＷＲ（登録商標）ハイスループット電気穿孔システム、ＢＴＸ（商標）、Ｂｉｏ−Ｒａｄ（登録商標）Ｇｅｎｅ Ｐｕｌｓｅｒ ＭＸｃｅｌｌ（商標）、または他のマルチウェル電気穿孔システムが挙げられる。
一部の実施形態では、自動化システムは、０℃〜１００℃に試料をインキュベーションする正確な温度制御をもたらすように、制御ブロックまたはプラットフォームなどの熱交換器の温度を安定化させるために使用される一体型サーマルサイクラーおよび／または温度調節器を含む。
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、液体、粒子、細胞、および多細胞生物をロボットで操作することができる、単一または複数の磁気プローブ、親和性プローブ、レプリケーター、またはピペッタを有する交換可能なマシンヘッド（単一またはマルチチャネル）に適合する。マルチウェルまたはマルチチューブ磁気分離器および濾過ステーションは、単一または複数の試料フォーマットにおいて液体、粒子、細胞、および生物を操作する。
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、カメラビジョンおよび／または分光計システムに適合する。よって、一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、進行中の細胞培養における色および吸収の変化を検出およびロギングすることができる。
一部の実施形態では、本開示の自動化システムは、複数のハードウェアアドオンに柔軟であり、適応できることによって、システムが複数のアプリケーションを実行することを可能にするように設計される。本明細書に提供される方法において使用するための自動化システムは、ソフトウェアプログラムモジュールを含み得る。ソフトウェアプログラムモジュールは、方法の作出、改変、および実行を可能にし得る。システムは、診断モジュールをさらに含むことができる。診断モジュールは、セットアップ、機器アラインメント、およびモータオペレーションを可能にし得る。システムは、カスタマイズされたツール、実験器具、液体および粒子移送パターン、ならびに／またはデータベース（複数可）をなおもさらに含むことができる。カスタマイズされたツール、実験器具、ならびに液体および粒子移送パターンは、異なるアプリケーションをプログラムおよび実施することを可能にし得る。データベースは、方法およびパラメータの記憶を可能にし得る。さらに、システム内に存在するロボットおよびコンピュータインターフェースは、機器間の通信を可能にし得る。
当業者には、本開示のＨＴＰ方法を実行することができる様々なロボットプラットフォームが認識されよう。
コンピュータシステムハードウェア
図８は、本開示の実施形態による非一時的コンピュータ可読媒体（例えば、メモリー）内に記憶されたプログラムコードを実行するのに使用され得るコンピュータシステム８００の一例を例示する。コンピュータシステムは、入力／出力サブシステム８０２を含み、これは、アプリケーションに応じて人間のユーザーおよび／または他のコンピュータシステムとインターフェースをとるのに使用することができる。Ｉ／Ｏサブシステム８０２は、例えば、キーボード、マウス、グラフィカルユーザーインターフェース、タッチスクリーン、または入力のための他のインターフェース、および例えば、ＬＥＤもしくは他のフラットスクリーンディスプレイ、またはアプリケーションプログラムインターフェース（ＡＰＩ）を含めた出力のための他のインターフェースを含み得る。ＬＩＭＳシステムのコンポーネントなどの本開示の実施形態の他のエレメントは、コンピュータシステム８００のもののようなコンピュータシステムで実装することができる。
プログラムコードは、二次メモリー８１０もしくはメインメモリー８０８または両方における永続記憶装置などの非一時的媒体内に記憶することができる。メインメモリー８０８としては、ランダムアクセスメモリー（ＲＡＭ）などの揮発性メモリー、または読み取り専用メモリー（ＲＯＭ）などの不揮発性メモリー、ならびに命令およびデータにより速くアクセスするための異なるレベルのキャッシュメモリーを挙げることができる。二次メモリーとしては、永続記憶装置、例えば、ソリッドステートドライブ、ハードディスクドライブ、または光ディスクなどを挙げることができる。１つまたは複数のプロセッサー８０４は、１つまたは複数の非一時的媒体からプログラムコードを読み込み、コードを実行して、コンピュータシステムが本明細書の実施形態によって実施される方法を達成することを可能にする。当業者には、プロセッサーが、ソースコードを取り込み、ソースコードを解釈またはコンパイルして、プロセッサー８０４のハードウェアゲートレベルで理解可能である機械コードにし得ることが理解されよう。プロセッサー８０４は、計算集約型タスクをハンドリングするためのグラフィックス処理ユニット（ＧＰＵ）を含み得る。特に、機械学習では、１つまたは複数のＣＰＵ ８０４は、大量のデータの処理を１つまたは複数のＧＰＵ ８０４にオフロードすることができる。
プロセッサー８０４は、１つまたは複数の通信インターフェース８０７、例えば、ネットワークインターフェースカード、ＷｉＦｉトランシーバーなどを介して外部ネットワークと通信することができる。バス８０５は、Ｉ／Ｏサブシステム８０２、プロセッサー８０４、周辺デバイス８０６、通信インターフェース８０７、メモリー８０８、および永続記憶装置８１０を通信可能にカップリングする。本開示の実施形態は、この代表的なアーキテクチャに限定されない。代替的な実施形態は、異なる配置およびタイプのコンポーネント、例えば、入出力コンポーネントおよびメモリーサブシステムのための別個のバスを使用することができる。
当業者には、本開示の実施形態のエレメントの一部またはすべて、およびこれらの付随するオペレーションが、コンピュータシステム８００のもののような１つまたは複数のプロセッサーおよび１つまたは複数のメモリーシステムを含む１つまたは複数のコンピュータシステムによって完全または部分的に実装され得ることが理解されよう。特に、本明細書に記載の任意のロボットおよび他の自動化システムまたはデバイスは、コンピュータ実装することができる。一部のエレメントおよび機能性は、ローカルに実装することができ、他のものは、例えば、異なるサーバーを通じたネットワークにわたって分散した様式で、例えば、クライアント−サーバー様式で実装することができる。特に、サーバー側オペレーションを、サービスとしてのソフトウェア（ＳａａＳ）様式で複数のクライアントに利用可能にすることができる。
本文脈におけるコンポーネントという用語は、ソフトウェア、ハードウェア、またはファームウェア（またはこれらの任意の組合せの）コンポーネントを広く指す。コンポーネントは、典型的には、指定された入力データを使用して有用なデータまたは他の出力を生成することができる機能コンポーネントである。コンポーネントは、自己完結型であってもよく、または自己完結型でなくてもよい。アプリケーションプログラム（「アプリケーション」とも呼ばれる）が、１つまたは複数のコンポーネントを含む場合もあれば、コンポーネントが、１つまたは複数のアプリケーションプログラムを含む場合もある。
一部の実施形態は、他のモジュールまたはアプリケーションコンポーネントと共にコンポーネントの一部を含むか、すべてを含むか、またはどれも含まない。なおさらに、様々な実施形態は、これらのコンポーネントのうちの２つもしくはそれよりも多くを単一のモジュール内に組み込み、かつ／またはこれらのコンポーネントのうちの１つもしくは複数の機能性の一部を異なるコンポーネントと関連付けることができる。
用語「メモリー」は、情報を記憶させるのに使用される任意のデバイスまたは機構であり得る。本開示の一部の実施形態によれば、メモリーは、これらに限定されないが、揮発性メモリー、不揮発性メモリー、およびダイナミックメモリーの任意のタイプを包含するように意図されている。例えば、メモリーは、ランダムアクセスメモリー、メモリー記憶デバイス、光学メモリーデバイス、磁気媒体、フロッピー（登録商標）ディスク、磁気テープ、ハードドライブ、ＳＩＭＭ、ＳＤＲＡＭ、ＤＩＭＭ、ＲＤＲＡＭ、ＤＤＲ ＲＡＭ、ＳＯＤＩＭＭＳ、消去可能プログラム可能読み取り専用メモリー（ＥＰＲＯＭ）、電気的消去可能プログラム可能読み取り専用メモリー（ＥＥＰＲＯＭ）、コンパクトディスク、ＤＶＤ、および／または同様のものであり得る。一部の実施形態によれば、メモリーは、１つまたは複数のディスクドライブ、フラッシュドライブ、データベース、ローカルキャッシュメモリー、プロセッサーキャッシュメモリー、リレーショナルデータベース、フラットデータベース、サーバー、クラウドベースプラットフォーム、および／または同様のものを含み得る。さらに、当業者は、情報を記憶するための多くの追加のデバイスおよび技法がメモリーとして使用され得ることを理解するであろう。
メモリーは、プロセッサー上の１つまたは複数のアプリケーションまたはモジュールを実行するための命令を記憶させるのに使用され得る。例えば、メモリーは、一部の実施形態では、本願に開示されるモジュールおよび／またはアプリケーションのうちの１つまたは複数の機能性を実行するのに必要な命令のすべてまたは一部を収納するのに使用することができる。
（実施例１：糸状菌のＨＴＰゲノム操作：糸状菌プロトプラストの生成と保存）
プロトプラストの生成
図１Ａに示したように、１００ミリリットルの完全培地に１０６分生子／ｍｌのＡｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒを播種し、１５０ｒｐｍで３０℃で一晩増殖させた。一晩の増殖の後、培養物をＭｉｒａｃｌｏｔｈで濾過することにより菌糸体を採取した。その後、菌糸体を滅菌水で十分にすすいだ。以下の実施例に記載する実験では、Ａ．Ｎｉｇｅｒ株１０１５およびＡ．ｎｉｇｅｒ株１１４１４の２種のＡ．ｎｉｇｅｒ株を使用した。採取し洗浄した菌糸体を、次いで、ＶｉｎｏＴａｓｔｅ Ｐｒｏ（ＶＴＰ）酵素カクテルを用いた酵素消化に供した。
Ａ．ｎｉｇｅｒ株１０１５については、まず、６０ｍｇ／ｍｌのＶＴＰを含むプロトプラスト形成緩衝液５０ｍｌ（１．２Ｍ硫酸マグネシウム、５０ｍＭリン酸緩衝液、ｐＨ５）を作製することにより、酵素消化を実施した。ＶＴＰを溶解した後、緩衝液を清潔なＯａｋｒｉｄｇｅ管に入れ、１５，０００×ｇで１５分間スピンした。次いで、遠心分離後のこの溶液を濾過滅菌した。作製されたら、採取した菌糸体の一部をＶＴＰ溶液に添加し、菌糸体を３０℃で８０ｒｐｍで２〜４時間消化した。ＶＴＰ消化中、様々な間隔において、小さな試料を４００倍の拡大率でプロトプラスト（すなわち、分生子より大きく、浸透圧溶解に対する感受性がある大きな円形細胞）の存在について検査した。菌糸体のほとんどまたはすべてが消化されたとき、プロトプラストを含有する２５ｍｌのフロースルーが、５０ｍｌのＦａｌｃｏｎ管２本のうちの１本に分離されるように、培養物を無菌のＭｉｒａｃｌｏｔｈで濾過した。２５ｍｌ試料のそれぞれに、５ｍｌの０．４Ｍ ＳＴ緩衝液（０．４Ｍソルビトール、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８）を穏やかに重層した。次いで、ＳＴと消化緩衝液との間に視認できる層を形成するために、重層された試料を８００×ｇで１５分間４℃でスピンした。次いで、プロトプラストをピペットで取り出し、２５ｍｌのＳＴ溶液（１．０Ｍソルビトール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、Ｐｈ８．０）と穏やかに混合し、８００×ｇで１０分間再度スピンした。プロトプラストは、管の底でペレットになるはずである。次いで、プロトプラストを２５ｍｌのＳＴ溶液中に再懸濁させ、８００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集した。
Ａ．ｎｉｇｅｒ株１１４１４については、まず、３０ｍｇ／ｍｌのＶＴＰを含むプロトプラスト形成緩衝液４０ｍｌ（０．６Ｍ硫酸アンモニウム、５０ｍＭマレイン酸、ｐＨ５．５）を作製することにより、酵素消化を実施した。採取した菌糸体のすべてをＶＴＰ溶液に添加し、菌糸体を３０℃で７０ｒｐｍで３〜４時間消化した。ＶＴＰ消化中、様々な間隔において、小さな試料を４００倍の拡大率でプロトプラストの存在について検査した。菌糸体のほとんどまたはすべてが消化されたとき、培養物を無菌のＭｉｒａｃｌｏｔｈで濾過した。次いで、濾液を８００×ｇで１０分間４℃でスピンして、細胞をペレットにした。２５ｍｌのＳＴ溶液（１．０Ｍソルビトール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０）を添加し、細胞を再懸濁させ、再度スピンした。次いで細胞を１０ｍｌのＳＴＣ緩衝液（１．０Ｍソルビトール、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、ｐＨ８．０、５０ｍＭ ＣａＣｌ２）中で洗浄し、８００×ｇで１０分間の遠心分離によって収集した。プロトプラスト（約１０８／ｍｌ）を計数し、１．２×１０７／ｍｌになるように調整した。
いずれのＡ．ｎｉｇｅｒ株（すなわち、１０１５または１１４１４）から生成されたプロトプラストについても、酵素消化後に、２０％ｖ／ｖの４０％ ＰＥＧ溶液（４０％ ＰＥＧ−４０００を含むＳＴＣ緩衝液））をプロトプラストに添加し、穏やかに混合し、続いて、７％ｖ／ｖのジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を添加して、８％ ＰＥＧ／７％ ＤＭＳＯ溶液を作製した。再懸濁の後、図１に示されている自動化された液体ハンドラーを使用して、プロトプラストを９６ウェル（２５〜５０マイクロリットル）のマイクロタイタープレートに分配し、続いて、形質転換の前に少なくとも−８０℃で保存した。
（実施例２：糸状菌のＨＴＰゲノム操作：糸状菌プロトプラストの同時形質転換の実証−原理証明。）
標的化ＤＮＡの調製
図１Ａに示されている自動化された糸状菌の形質転換およびスクリーニング方法の概念証明（ＰＯＣ）を行う取り組みにおいて、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのａｒｇＢ遺伝子のＤＮＡ配列を得て、適切なリーディングフレームを決定した。次いで、Ａ．ｎｉｇｅｒゲノムのａｒｇＢ遺伝子座へＳＮＰのうちのいずれを組み込んでもａｒｇＢ遺伝子のヌル変異がもたらされるような、前記ＳＮＰのセットを設計した。これらの設計は、ギブソンアセンブリーを使用してコンストラクトを構築するために使用したオリゴマーのセットを予測したｉｎ ｓｉｌｉｃｏのコンストラクトとして生成した。
プロトプラストの自動化された形質転換
実施例１に記載したように、９６ウェルプレートにおいて生成および保存したＡ．ｎｉｇｅｒ株１０１５に由来するプロトプラスト（１００マイクロリットルのプロトプラスト／ウェル）を、次いで、９６ウェルプレートにおいてＳＮＰ ＤＮＡコンストラクトをプロトプラスト−ＰＥＧ／ＤＭＳＯ混合物と組み合わせるために自動化された液体ハンドラーを使用した、従来型のＰＥＧカルシウム媒介性形質転換に供した。より具体的には、１００マイクロリットルのプロトプラストに、１〜１０マイクログラムのＳＮＰ ＤＮＡコンストラクトを（１０マイクロリットルまたはそれ未満の体積で）添加し、この混合物を氷上で１５分間インキュベーションした。この混合物に、１ｍｌの４０％ ＰＥＧを添加し、室温まで１５分間インキュベーションした。その後、１０ｍｌの最少培地と１Ｍソルビトールを添加し、８０ｒｐｍで１時間、３０℃で振とうした。このインキュベーション後、プロトプラストを８００×ｇで５分間スピンダウンし、次いで、１Ｍソルビトールおよび０．８％寒天を含有する１２ｍｌの最少培地中に再懸濁させた。翌日、追加の自動化された液体ハンドリングステップを使用し、選択培地（すなわち、最少培地＋アルギニン）および非選択培地（すなわち、最少培地）上でプロトプラストを平板培養した。自動化された形質転換プロトコールを用いて生成された形質転換に成功したプロトプラストは、アルギニン栄養要求性であり、そのため、ＳＮＰコンストラクトによるａｒｇＢ遺伝子の標的化に起因して、アルギニンを欠く最少培地では増殖しないと期待される。
図２に示したように、形質転換体の約３％が、アルギニンを欠く最少培地における増殖の欠如によって証明される通り、正確な（すなわち、ａｒｇＢ）遺伝子座における標的化ＤＮＡコンストラクトの組込みを示した。正確な遺伝子座におけるＳＮＰ含有コンストラクトの組込みの確認は、次世代シーケンシングによって確認される。
（実施例３：糸状菌のＨＴＰゲノム操作：糸状菌プロトプラストの同時形質転換の実証−発色による選択／対抗選択を使用した原理証明。この実施例は、糸状菌細胞の自動化されたＨＴＰ同時形質転換に関する追加の原理証明を実証し、所望の形質転換体を単離するための選択／対抗選択の使用をさらに実証する。）
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ Ｎｉｇｅｒのプロトプラストの形成および形質転換
実施例１に記載したように、ベータ−グルカナーゼ活性を含有する市販の酵素混合物を使用して、真核生物の真菌Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ株であるＡＴＣＣ１０１５のプロトプラストを大体積（５００ｍｌ）で生成した。実施例１に記載の方法によって、プロトプラストを、酵素混合物から遠心分離により単離し、最終的に、塩化カルシウムを含有する緩衝液中に再懸濁させた。
実施例１に記載したように、ジメチルスルホキシドおよびポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の懸濁物を含有する容器中に、プロトプラストを分注し、−８０℃で凍結した。一部の実施形態では、本開示は、各ウェル中に２５〜５０マイクロリットルのプロトプラストを含有する９６ウェルマイクロタイタープレートのストックを、この技法を使用するゲノム編集の大規模なキャンペーンのための大きなバッチ中で調製し、凍結することができることを教示する。
従来型のＰＥＧカルシウム媒介性形質転換を、９６ウェル中でＤＮＡとプロトプラスト−ＰＥＧの混合物とを組み合わせる自動化された液体ハンドラーにより実行した。形質転換の後に、追加の自動化された液体ハンドリングステップを使用して、選択培地上で、形質転換したものを平板培養した。
形質転換体の自動化されたスクリーニング
下記でより詳細に論じるように、この実施例で使用した機能的なｐｙｒＧ遺伝子を欠く（すなわち、ｐｙｒＧ−）Ａ．ｎｉｇｅｒ細胞を、機能的なｐｙｒＧ遺伝子で形質転換したところ、形質転換細胞が、ウラシルの非存在下で増殖することが可能になった。図４Ａ〜Ｂに示したように、この実施例のｐｙｒＧ遺伝子をさらに、Ａ．ｎｉｇｅｒの野生型ｍｅｔ３遺伝子の場所に組み込まれるように設計することで、天然に存在するｍｅｔ３遺伝子に破壊を組み込んだ。ｍｅｔ３遺伝子の破壊はさらに、形質転換体をメチオニン栄養素要求株にし、形質転換体を同定するための二次スクリーニング方法を提供する。
ウラシルを有しない選択培地上で増殖させた形質転換体を単離し、第２のマイクロタイタープレートの個々のウェル中に入れた。第２のマイクロタイタープレート中の形質転換体を２〜３日間増殖および胞子形成させた後、水および少量の洗剤からなる液体中に再懸濁させて、保存および下流の自動化されたスクリーニングに適した胞子のストックを生成した。
次いで、上述の胞子のストックのそれぞれの小アリコートを使用して、第３の９６ウェルＰＣＲプレート中の液体培地に播種した。これら少量の培養物を、静置したインキュベーター中で一晩増殖させ、その結果、黄色色素を含有する胞子が出芽し、選択および下流のステップにより適している菌糸を形成する。
培養するステップの後に、第３のＰＣＲプレートの菌糸を、市販の緩衝液を添加し、培養物を９９℃に２０分間加熱することによって溶解した。次いで、プレートを遠心分離して、ＤＮＡ懸濁物の上清を細胞／オルガネラのペレットから分離した。次いで、ＤＮＡ抽出を使用して、ＰＣＲ分析を行って、所望のＤＮＡ改変を含む細胞株を同定した。
ＳＮＰの組込みのための同時形質転換−ＳＮＰの設計
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ遺伝子ａｙｇＡのＤＮＡ配列を得、適切なリーディングフレームを決定した。組み込まれた場合にはヌル変異をもたらす、４つの明確に異なるタイプの変異を設計した。
変異は、インフレーム停止コドンを組み込む単一塩基対変化と、小さな２塩基対欠失と、３塩基対の組込みと、より大きな、１００塩基対の欠失を含んだ。これらはいずれも、適切に組み込まれた場合には、ａｙｇＡ活性を排除する。ａｙｇＡ活性を欠く株は、黄色胞子の表現型を有する。これらの設計は、ギブソンアセンブリーを使用してコンストラクトを構築するために使用したオリゴマーのセットを予測したｉｎ ｓｉｌｉｃｏのコンストラクトとして生成した。
同時形質転換によるＳＮＰの組込み
上述した形質転換のアプローチを使用して、小さな変化を含有するアンプリコンを、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ株１０１５のゲノム中に組み込んだ。これまでに論じたように、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒのこの株は、非機能性のｐｙｒＧ遺伝子を含み、したがって、外因性ウラシルの非存在下で増殖することは不可能であった。ｐｙｒＧ遺伝子の組込みに成功した細胞は、この時点で、ウラシルの非存在下で増殖することが可能であった。これらのｐｙｒＧ＋形質転換体のうち、ａｙｇＡ遺伝子中に小さな変異も組み込んだ分離株は、黄色胞子の表現型を呈した。（図３および４Ａを参照）。変異の存在はまた、ＳＮＰの交換について標的化される領域を含有する小さなアンプリコンのシーケンシングによっても検出された（図４Ｂ）。
（実施例４：糸状菌のＨＴＰゲノム操作：真核生物Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ ＡＴＣＣ１１４１４におけるクエン酸産生を改善するためのＨＴＰ ＳＮＰライブラリー株改善プログラムの実装形態）
上記実施例３は、本開示の遺伝子操作技法をハイスループットの様式で自動化するための技法について記載した。この実施例は、上述した技法を、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ株ＡＴＣＣ１１４１４の特定のＨＴＰ株改善に適用する。
Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒは、発酵によるクエン酸の大規模産生のために使用される、糸状菌の種である。この種の複数の株が単離され、クエン酸および他の有機酸を産生する種々の能力を有することが示されている。クエン酸の産生を改善するために、本開示のＨＴＰ株操作方法を使用して、原因となる対立遺伝子を組み合わせ、有害な対立遺伝子を排除することができる。
スプリットマーカーアプローチを使用した遺伝子操作
スプリットマーカー媒介性ＳＮＰ交換の初期ステップは、実施例３におけるものと同じであり、図１Ｄにステップ１および２として表されている。ステップ２における形質転換ＤＮＡは、ＳＮＰを適切な遺伝子座に標的化するための相同ＤＮＡに融合したマーカーの非相補的な半分を含有する２つの別個の線形断片からなる。形質転換したものを選択培地に置き、増殖させる。安定に組み込まれたＤＮＡを有する適切に補完された株は、コロニーを形成する。これらのコロニーを手作業または自動化されたプラットフォームによって選んで、１００〜２００マイクロリットルの選択寒天培地を含有するマイクロタイタープレートの個々のウェルに入れる。選ばれた形質転換体を増殖させ、ステップ４に示されているように胞子を繁殖させる。Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒの胞子は単一核であり、本質的にクローン性である。少数の胞子を取り、それらを選択培地上で再び平板培養することにより、形質転換株を精製してホモカリオン（細胞中のすべての核が同一の遺伝子型をもつもの）にする。このプロセスは、図１Ｄにおいて矢印によって表されている。集団を少数のクローンの胞子まで繰り返し低減させることにより、各ウェルにおいてホモカリオンがもたらされる。次いで、ウェル中のこれらの精製された株を、選択可能マーカーを含有する株に対して有毒な対抗選択剤を含有する培地に蒔く。ＳＮＰを含有するダイレクトリピートが隣接したマーカーを取り込んだ株は、ダイレクトリピートのサイズと直接相関する頻度でマーカーを失う。例えば、１，０００塩基対のダイレクトリピートは、１００塩基対のダイレクトリピートよりも安定性が低い。このループアウトフェーズは、図１Ｄのステップ６である。次いで、ＮＧＳを使用し、実施例２で行ったものと同様の様式において、ループアウトされた株をスクリーニングする。図４Ｃは、スプリットマーカーの組込みおよびループアウトを利用して実施したＳＮＰＳＷＰキャンペーンからのデータを含有する。この実施例では、ＮＧＳを使用して、１２００を超える個々のループアウト試料をスクリーニングした。このセットからは、１１９の成功した株が生成され、そのウェルのアンプリコンの１００％が産生株からのＳＮＰを含有するため、図４Ｃの左上隅に赤色のドットとして現れている。青色で表示した試料は、この遺伝子座において、所望のＳＮＰを有するアンプリコンおよび天然の塩基対の両方を含有する。これらの株は、図１Ｄのステップ４および５に表されている胞子繁殖および継代培養を使用して、ホモカリオンにすることができる。ＱＣに合格した１１９の試料は、それらが所望の株改善形質に及ぼす影響について分析することができる。様々なＳＮＰ位置におけるＳＮＰ導入の成功率が、図６に示されている。
天然のＡ．ｎｉｇｅｒ株改変体に由来するＳＮＰについての遺伝子設計ライブラリーのライブラリーの同定。
２０世紀前半に、Ａ．ｎｉｇｅｒ株ＡＴＣＣ１０１５は、クエン酸の産生株であることが同定された。ＡＴＣＣ１１４１４と名付けられたこの株の分離株は、後に、その親と比べて増加したクエン酸の収率を呈することが見出された。例えば、Ａ．ｎｉｇｅｒ株ＡＴＣＣ１０１５は、硝酸アンモニウムを含有するが鉄カチオンおよびマンガンカチオンの両方を欠く培地中で、１４０グラムのグルコースから平均して７グラムのクエン酸を産生する。その一方で、分離株ＡＴＣＣ１１４１４は、同じ条件下で、収率の１０倍の増加（７０グラムのクエン酸）を呈する。さらに、クエン酸産生培地中で、株ＡＴＣＣ１１４１４の胞子は、株１０１５の胞子よりも良好に出芽および増殖する。
表現型のこれらの差についての、可能性がある遺伝的供給源を同定するために、株ＡＴＣＣ１０１５および株ＡＴＣＣ１１４１４の両方のゲノムについて、シーケンシングおよび分析した。結果として得られた分析から、株１０１５と株１１４１４とを区別する４２個のＳＮＰを同定した。
原因となる対立遺伝子の交換
実施例１に記載したように、形質転換のために、プロトプラストを株ＡＴＣＣ１０１５（「基準株」）から調製した。次いで、本開示の遺伝子編集の技法（図５参照）により、上記で同定した４２個のＳＮＰのそれぞれを、基準株に個々に導入した。各ＳＮＰを、上述した機能的ｐｙｒＧおよびａｙｇＡ遺伝子変異と共に同時形質転換した。ａｙｇＡ遺伝子座への遺伝子の標的化に成功した形質転換体は、黄色の胞子をもたらした（図５）。
成功した組込みについてのスクリーニング
上述の通り、推定ＳＮＰを含有する形質転換体を単離し、胞子のストックを繁殖させた。推定ＳＮＰを含有するＤＮＡ領域を含有するアンプリコンを、次世代シーケンシングにより分析した。このアプローチを使用すれば、親ＤＮＡの存在下であっても、各形質転換体内で、成功した組込みの事象を決定することが可能である。この能力は、同じ細胞中に異なる遺伝子型を有する核を含有するヘテロカリオンとして増殖することができる真菌中で標的化を決定するのに必須である。
所望のＳＮＰ変化の存在について、形質転換体をさらに検証した。分離株のおよそ３０％において、黄色胞子の表現型を有する同時形質転換体はまた、適切に組み込まれたクエン酸ＳＮＰも含有した。
次に、クエン酸の産生に有益なＳＮＰを同定するために、作出したＳＮＰスワップ微生物株ライブラリーを表現型によりスクリーニングする。この情報は、クエン酸の産生が増加したＡ．ｎｉｇｅｒ株を誘導するために、本明細書に記載されるゲノム操作のＨＴＰ方法との関連で利用される。
＊＊＊＊＊
参照による組込み
本明細書に引用したすべての参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願は、すべての目的に関してその全体が参照により組み込まれている。しかし、本明細書に引用した任意の参考文献、論文、刊行物、特許、特許公開、および特許出願の言及は、これらが有効な先行技術を構成するか、または世界のいずれかの国における共通の一般的知識の一部を形成するという承認または何らかの形式の示唆として解釈されず、かつそのように解釈されるべきでない。

Claims (81)

  1. 糸状菌株を産生するための方法であって、
    ａ．）糸状菌細胞の培養物から調製された、複数のプロトプラストを提供するステップと、
    ｂ．）前記複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換するステップであって、前記第１のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接した第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の第２の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接した第２のポリヌクレオチドを含み、形質転換が、相同組換えによる、前記第１の遺伝子座への前記第１のコンストラクトの組込み、および前記第２の遺伝子座への前記第２のコンストラクトの組込みをもたらし、少なくとも前記第２の遺伝子座が、前記プロトプラストゲノム内の第１の選択可能マーカー遺伝子であり、前記第１のポリヌクレオチドが、変異および／または遺伝子制御エレメントを含む、ステップと、
    ｃ．）選択および対抗選択を実施することにより、ホモカリオンの形質転換体を精製するステップと、
    ｄ．）前記糸状菌細胞の再生を促す培地において、精製された前記形質転換体を増殖させるステップと
    を含む、方法。
  2. 糸状菌株を産生するための方法であって、
    ａ．）糸状菌細胞の培養物から調製された、複数のプロトプラストを提供するステップと、
    ｂ．）前記複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換するステップであって、前記第１のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の遺伝子座に相同なヌクレオチドが隣接した第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の前記遺伝子座に相同なヌクレオチドが隣接した第２のポリヌクレオチドを含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、選択可能マーカーの相補的な部分を含み、前記第１のコンストラクトおよび／または前記第２のコンストラクトが、変異または遺伝子制御エレメントをさらに含み、形質転換が、相同組換えによる、前記遺伝子座への前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドならびに前記変異または前記遺伝子制御エレメントの組込みをもたらす、ステップと、
    ｃ．）選択および対抗選択を実施することにより、ホモカリオンの形質転換体を精製するステップと、
    ｄ．）前記糸状菌細胞の再生を促す培地において、精製された前記形質転換体を増殖させるステップと
    を含む、方法。
  3. 前記複数のプロトプラストのうちの各プロトプラストが、複数の第１のコンストラクトのうちの単一の第１のコンストラクトおよび複数の第２のコンストラクトのうちの単一の第２のコンストラクトで形質転換され、前記複数の第１のコンストラクトのうちそれぞれの第１のコンストラクトにおける前記第１のポリヌクレオチドが、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを含み、前記複数の第２のコンストラクトのうちそれぞれの第２のコンストラクトにおける前記第２のポリヌクレオチドが同一である、請求項１または２に記載の方法。
  4. ステップａ〜ｄを繰り返して糸状菌細胞のライブラリーを生成するステップをさらに含み、前記ライブラリーにおける各糸状菌細胞が、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを有する第１のポリヌクレオチドを含む、請求項１または２に記載の方法。
  5. 前記第１のポリヌクレオチドが、標的糸状菌遺伝子または異種遺伝子をコードする、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  6. 前記変異が、一塩基多型である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  7. 遺伝子制御が、プロモーター配列および／またはターミネーター配列である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  8. 前記複数のプロトプラストが、マイクロタイタープレートのウェルに分配される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  9. ステップａ〜ｄが、マイクロタイタープレートのウェルにおいて実施される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  10. 前記マイクロタイタープレートが、９６ウェル、３８４ウェル、または１５３６ウェルのマイクロタイタープレートである、請求項８または９に記載の方法。
  11. 前記糸状菌細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはこれらの完全世代もしくは不完全世代および同義語もしくは分類学的等価物から選択される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  12. 前記糸状菌細胞が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒである、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  13. 前記糸状菌細胞が、菌糸体を形成しない表現型を有する、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  14. 前記真菌細胞が、非機能性の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）経路を有する、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  15. 前記ＮＨＥＪ経路が、前記ＮＨＥＪ経路のコンポーネントに対する抗体、化学阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、またはアンチセンスもしくはＲＮＡｉ分子に前記細胞を曝露することによって非機能性にされている、請求項１４に記載の方法。
  16. 前記第１の遺伝子座が、前記標的糸状菌遺伝子のためのものである、請求項５から１５のいずれか一項に記載の方法。
  17. 前記第１の遺伝子座が、前記プロトプラストゲノムにおける第２の選択可能マーカー遺伝子のためのものである、請求項１および３から１５のいずれか一項に記載の方法。
  18. 前記第２の選択可能マーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子、発色マーカー遺伝子、または方向性マーカー遺伝子から選択される、請求項１７に記載の方法。
  19. 前記第１の選択可能マーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子、発色マーカー遺伝子、または方向性マーカー遺伝子から選択される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  20. 前記第２のポリヌクレオチドが、栄養要求性マーカー遺伝子、方向性マーカー遺伝子、または抗生物質耐性遺伝子から選択される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  21. 前記発色マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子である、請求項１８または１９に記載の方法。
  22. 前記栄養要求性マーカー遺伝子が、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
  23. 前記方向性マーカー遺伝子が、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子、硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）、または硫酸パーミアーゼ（Ｓｕｔ Ｂ）遺伝子から選択される、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
  24. 前記抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌｅ遺伝子であり、前記ｂｌｅ遺伝子が、フレオマイシン（ｐｈｅｏｍｙｃｉｎ）への耐性を付与する、請求項２０に記載の方法。
  25. 前記第１の選択可能マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドが、ｐｙｒＧ遺伝子である、請求項１６に記載の方法。
  26. 前記第１の選択可能マーカー遺伝子が、ｍｅｔ３遺伝子であり、前記第２の選択可能マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドが、ｐｙｒＧ遺伝子である、請求項１７から２４のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記複数のプロトプラストが、糸状菌細胞の前記培養物中の前記糸状菌細胞から細胞壁を除去するステップと、前記複数のプロトプラストを単離するステップと、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む混合物中に、単離された前記複数のプロトプラストを再懸濁させるステップであって、ＤＭＳＯの最終濃度が７％ｖ／ｖまたはそれ未満である、ステップとによって調製される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
  28. 前記混合物が、ステップａ〜ｄを実施する前に少なくとも−２０℃または−８０℃で保存される、請求項２７に記載の方法。
  29. 前記培養物が、少なくとも１リットルの体積である、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
  30. 前記培養物を、前記プロトプラストの調製前に少なくとも１２時間にわたって増殖させる、請求項２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
  31. 真菌培養物を、前記プロトプラストの少なくとも７０％がより小さくなり、かつより少ない核を含有する条件下で増殖させる、請求項２７から３０のいずれか一項に記載の方法。
  32. 前記細胞壁を除去するステップが、酵素消化によって実施される、請求項２７から３１のいずれか一項に記載の方法。
  33. 前記酵素消化が、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実施される、請求項３２に記載の方法。
  34. 前記プロトプラストを保存する前に、ＤＭＳＯを含む前記混合物に４０％ｖ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加するステップをさらに含む、請求項２７から３３のいずれか一項に記載の方法。
  35. 前記ＰＥＧが、８％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度まで添加される、請求項３４に記載の方法。
  36. ステップａ〜ｄが自動化されている、上記請求項のいずれかに記載の方法。
  37. 保存のための糸状菌細胞を調製するための方法であって、
    糸状菌細胞を含む真菌培養物からプロトプラストを調製するステップであって、前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞から細胞壁を除去することを含む、ステップと、
    前記プロトプラストを単離するステップと、
    ７％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む混合物中に、単離された前記プロトプラストを再懸濁させるステップと
    を含む、方法。
  38. 前記混合物が、少なくとも−２０℃または−８０℃で保存される、請求項３７に記載の方法。
  39. 前記真菌培養物が、少なくとも１リットルの体積である、請求項３７から３８のいずれか一項に記載の方法。
  40. 前記真菌培養物を、前記プロトプラストの調製前に少なくとも１２時間にわたって増殖させる、請求項３７から３９のいずれか一項に記載の方法。
  41. 前記真菌培養物を、前記プロトプラストの少なくとも７０％がより小さくなり、かつより少ない核を有する条件下で増殖させる、請求項３７から４０のいずれかに記載の方法。
  42. 前記細胞壁を除去するステップが、酵素消化によって実施される、請求項３７から４１のいずれか一項に記載の方法。
  43. 前記酵素消化が、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実施される、請求項４２に記載の方法。
  44. 前記プロトプラストを保存する前に、ＤＭＳＯを含む前記混合物に４０％ｖ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加するステップをさらに含む、請求項３７から４３のいずれか一項に記載の方法。
  45. 前記ＰＥＧが、８％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度まで添加される、請求項４４に記載の方法。
  46. 前記プロトプラストを保存する前に、前記プロトプラストをマイクロタイタープレートに分配するステップをさらに含む、請求項３７から４５のいずれか一項に記載の方法。
  47. 前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞が、菌糸体を形成しない表現型を有する、請求項３７から４６のいずれか一項に記載の方法。
  48. 前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはこれらの完全世代もしくは不完全世代および同義語もしくは分類学的等価物から選択される、請求項３７から４７のいずれか一項に記載の方法。
  49. 前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒまたはその完全世代もしくは不完全世代である、請求項４７に記載の方法。
  50. 真菌産生株を生成するためのシステムであって、
    １つまたは複数のプロセッサー、ならびに
    前記１つまたは複数のプロセッサーのうちの少なくとも１つに作動可能にカップリングされた１つまたは複数のメモリーであって、前記１つまたは複数のプロセッサーのうちの少なくとも１つによって実行されるとき、前記システムに、
    ａ．）糸状菌細胞の培養物に由来する複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換するステップであって、前記第１のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接した第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の第２の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接した第２のポリヌクレオチドを含み、形質転換が、相同組換えによる、前記第１の遺伝子座への前記第１のコンストラクトの組込み、および前記第２の遺伝子座への前記第２のコンストラクトの組込みをもたらし、少なくとも前記第２の遺伝子座が、前記プロトプラストゲノム内の第１の選択可能マーカー遺伝子であり、前記第１のポリヌクレオチドが、変異および／または遺伝子制御エレメントを含む、ステップと、
    ｂ．）選択および対抗選択を実施することにより、ホモカリオンの形質転換体を精製するステップと、
    ｃ．）前記糸状菌細胞の再生を促す培地において、精製された前記形質転換体を増殖させるステップと
    をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
    を含む、システム。
  51. 前記複数のプロトプラストのうちの各プロトプラストが、複数の第１のコンストラクトのうちの単一の第１のコンストラクトおよび複数の第２のコンストラクトのうちの単一の第２のコンストラクトで形質転換され、前記複数の第１のコンストラクトのうちそれぞれの第１のコンストラクトにおける前記第１のポリヌクレオチドが、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを含み、前記複数の第２のコンストラクトのうちそれぞれの第２のコンストラクトにおける前記第２のポリヌクレオチドが同一である、請求項５０に記載のシステム。
  52. ステップａ〜ｃを繰り返して糸状菌細胞のライブラリーを生成する命令をさらに含み、前記ライブラリーにおける各糸状菌細胞が、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを有する第１のポリヌクレオチドを含む、請求項５０に記載のシステム。
  53. 前記変異が、一塩基多型である、上記請求項のいずれか一項に記載のシステム。
  54. 遺伝子制御が、プロモーター配列および／またはターミネーター配列である、上記請求項のいずれか一項に記載のシステム。
  55. ステップａ〜ｃが、マイクロタイタープレートのウェルにおいて実施される、上記請求項のいずれか一項に記載のシステム。
  56. 前記マイクロタイタープレートが、９６ウェル、３８４ウェル、または１５３６ウェルのマイクロタイタープレートである、請求項５５に記載のシステム。
  57. 前記糸状菌細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはこれらの完全世代もしくは不完全世代および同義語もしくは分類学的等価物から選択される、上記請求項のいずれか一項に記載のシステム。
  58. 前記糸状菌細胞が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒである、上記請求項のいずれか一項に記載のシステム。
  59. 前記糸状菌細胞が、菌糸体を形成しない表現型を有する、上記請求項のいずれか一項に記載のシステム。
  60. 前記真菌細胞が、非機能性の非相同末端接合経路を有する、上記請求項のいずれか一項に記載のシステム。
  61. 前記ＮＨＥＪ経路が、前記ＮＨＥＪ経路のコンポーネントに対する抗体、化学阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、またはアンチセンスもしくはＲＮＡｉ分子に前記細胞を曝露することによって非機能性にされている、請求項６０に記載のシステム。
  62. 前記第１の遺伝子座が、前記標的糸状菌遺伝子のためのものである、上記請求項のいずれか一項に記載のシステム。
  63. 前記第１の遺伝子座が、前記プロトプラストゲノムにおける第２の選択可能マーカー遺伝子のためのものである、請求項５０から６１のいずれか一項に記載のシステム。
  64. 前記第２の選択可能マーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子、発色マーカー遺伝子、または方向性マーカー遺伝子から選択される、請求項６３に記載のシステム。
  65. 前記第１の選択可能マーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子、発色マーカー遺伝子、または方向性マーカー遺伝子から選択される、上記請求項のいずれか一項に記載のシステム。
  66. 前記第２のポリヌクレオチドが、栄養要求性マーカー遺伝子、方向性マーカー遺伝子、または抗生物質耐性遺伝子から選択される、上記請求項のいずれか一項に記載のシステム。
  67. 前記発色マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子である、請求項６４または６５に記載のシステム。
  68. 前記栄養要求性マーカー遺伝子が、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される、請求項６４から６６のいずれか一項に記載のシステム。
  69. 前記方向性マーカー遺伝子が、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子、硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｌａＤ）、または硫酸パーミアーゼ（Ｓｕｔ Ｂ）遺伝子から選択される、請求項６４から６６のいずれか一項に記載のシステム。
  70. 前記抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌｅ遺伝子であり、前記ｂｌｅ遺伝子が、フレオマイシン（ｐｈｅｏｍｙｃｉｎ）への耐性を付与する、請求項６６に記載のシステム。
  71. 前記第１の選択可能マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドが、ｐｙｒＧ遺伝子である、請求項６２に記載のシステム。
  72. 前記第１の選択可能マーカー遺伝子が、ｍｅｔ３遺伝子であり、前記第２の選択可能マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドが、ｐｙｒＧ遺伝子である、請求項５０から６１のいずれか一項に記載のシステム。
  73. 前記複数のプロトプラストが、糸状菌細胞の前記培養物中の前記糸状菌細胞から細胞壁を除去するステップと、前記複数のプロトプラストを単離するステップと、７％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む混合物中に、単離された前記複数のプロトプラストを再懸濁させるステップステップとによって調製される、上記請求項のいずれか一項に記載のシステム。
  74. 前記混合物が、ステップａ〜ｃを実施する前に少なくとも−２０℃または−８０℃で保存される、請求項７３に記載のシステム。
  75. 前記培養物が、少なくとも１リットルの体積である、請求項７３から７４のいずれか一項に記載のシステム。
  76. 前記培養物を、前記プロトプラストの調製前に少なくとも１２時間にわたって増殖させる、請求項７３から７５のいずれか一項に記載のシステム。
  77. 真菌培養物を、前記プロトプラストの少なくとも７０％がより小さくなり、かつより少ない核を有する条件下で増殖させる、請求項７３から７６のいずれか一項に記載のシステム。
  78. 前記細胞壁を除去するステップが、酵素消化によって実施される、請求項７３から７６のいずれか一項に記載のシステム。
  79. 前記酵素消化が、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実施される、請求項７８に記載のシステム。
  80. 前記プロトプラストを保存する前に、ＤＭＳＯを含む前記混合物に４０％ｖ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加するステップをさらに含む、請求項５０から７９のいずれか一項に記載のシステム。
  81. 前記ＰＥＧが、８％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度まで添加される、請求項８０に記載のシステム。
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