JP2013017408A - 微生物のコウジ酸生産性を向上させる方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】本発明に係るコウジ酸生産性を向上させる方法は、麹菌やペニシリウム属菌等のコウジ酸生産能を有する微生物において、Hst4遺伝子、Hos2遺伝子及びSpt3遺伝子並びにこれらにコードされるタンパク質から成る群より選択される少なくとも1つの機能を阻害する工程を含む。該工程は、例えば遺伝子破壊により行なわれる。あるいは、該工程は、HDAC阻害剤等の、上記遺伝子にコードされるタンパク質の阻害剤で微生物を処理することにより行なわれる。
【選択図】図3
Description
(1) 配列番号3に示す塩基配列中の1nt-2000ntの領域内の連続する30塩基以上の領域と相同な領域からなる第1の相同領域と、配列番号3に示す塩基配列中の3785nt-5142ntの領域内の連続する30塩基以上の領域と相同な領域からなる第2の相同領域とを含み、正常なHst4遺伝子を含まないDNA断片。
(2) 配列番号6に示す塩基配列中の1nt-2856ntの領域内の連続する30塩基以上の領域と相同な領域からなる第1の相同領域と、配列番号6に示す塩基配列中の4318nt-5694ntの領域内の連続する30塩基以上の領域と相同な領域からなる第2の相同領域とを含み、正常なHos2遺伝子を含まないDNA断片。
(3) 配列番号9に示す塩基配列中の1nt-2000ntの領域内の連続する30塩基以上の領域と相同な領域からなる第1の相同領域と、配列番号9に示す塩基配列中の4299nt-5594ntの領域内の連続する30塩基以上の領域と相同な領域からなる第2の相同領域とを含み、正常なSpt3遺伝子を含まないDNA断片。
(1) Sirtuin系(クラスIII)HDAC用阻害剤(Hst4を含むSirtuinの阻害剤)
Nicotinamide
2-Anilino-benzamide
(2) 古典的(クラスI又はクラスII)HDAC用阻害剤(Hos2を含む古典的HDACの阻害剤)
HC-toxin
Trichostatin A
酪酸(n-Butyrate)
麹菌ゲノムDNAを鋳型としたPCRにより、AOhst4遺伝子、AOhos2遺伝子及びAOspt3遺伝子の5'側上流領域及び3'側下流領域について各1kb程度のDNA領域を増幅した。また、遺伝子破壊株の選択用のマーカーとしてアデニンの合成に関わるadeA栄養要求性マーカー遺伝子(AO080527000383)とその上流及び下流の一部を含む断片もPCRで増幅した。その後、5'側上流領域, adeA, 3'側下流領域を混合してPCRを行い、5'側上流領域(上流側相同領域), adeA, 3'側下流領域(下流側相同領域)の順にDNA断片をつなぎ合わせた遺伝子破壊用DNA断片をFusion PCRにより作製した。尚、Fusion PCRの模式図を図1に記す。また、用いたプライマー配列を表1に示す。表中のプライマーの名称は、図1記載のプライマーに対応する。
5'側上流領域, adeA, 3'側下流領域の各DNA断片は、KOD PLUS Version 1(東洋紡)で増幅した。テンプレートは、全てアスぺルギルス・オリゼ野生株RIB40の染色体DNAを用いた(QIAGEN社製のDNeasy Plant Maxi Kitを用いて抽出)。
94℃、2分 1サイクル
94℃、20秒 55℃、30秒 68℃ 2分 30サイクル
68℃、5分 4℃、O/N 1サイクル
精製した5'側上流領域, adeA, 3'側下流領域の各DNA断片の濃度を、NanoDrop ND-1000 Spectrophotometerを用いて計測し、それぞれのDNA断片を50 ng/μlになるように調整した後、5'側上流領域断片 : adeA断片 : 3'側下流領域断片=1 : 1.6 :1になるようにして、且つ3つのDNA断片の合計液量が3.6μlになるように混合し、これをTemplateとして用いて、以下の反応液でFusion PCRを行った。
94℃、2分 1サイクル
94℃、20秒 55℃、30秒 68℃ 5分 30サイクル
68℃、5分 4℃、O/N 1サイクル
アスペルギルス・オリゼ NSR-ΔlD2株を宿主麹菌として利用した。この株の分生子縣濁液を、アデニンを0.05%添加した酵素生産培地(1L中の組成で、グルコース 20g, トリプトン 1g(ディフコ), 酵母エキス 5g (ディフコ), NaNO3 1g, K2HPO4 0.5g, MgSO4・7H2O 0.5g, FeSO4・7H2O 0.01g, pH6.0)に植菌し、30℃で24時間振盪培養した。菌体を、ミラクロスを用いて集菌後、菌体を滅菌0.8 M NaCl/10mM Phosphate buffer (pH6.0)で3回洗浄した。その後、菌体をマイレックスHV(ミリポア)でフィルター滅菌した30mlプロトプラスト化溶液(100mg / 30ml Yatalase(タカラバイオ)になるよう0.8 M NaCl/10mM Phosphate buffer (pH6.0)にYatalaseを溶解)の入った50ml容の滅菌済み遠心チューブに移して懸濁し、30℃、80rpm、3時間振盪しプロトプラスト化反応を行った。滅菌した3G1ガラスフィルターにてろ過し、濾液中のプロトプラストを5 分間遠心分離することで沈殿を得た。30mlの滅菌0.8M NaClにてプロトプラストを洗浄し3,000rpm、4 ℃で5 分間遠心分離することで沈殿を得た。このプロトプラストを滅菌0.8M NaCl 10mlとSolution I (0.8 M NaCl, 10 mM CaCl2, 10 mM Tris-HCl 、pH 8.0) 20mlに懸濁し、懸濁液中のプロトプラスト数をトーマの血球計数機で計測した。計測後、3,000rpm、4 ℃で5 分間遠心分離することで沈殿を得た。
形質転換体から遺伝子破壊株の確認は、Fusion PCRに用いたAとDプライマー並びに、欠失破壊の対象とした遺伝子の内500bp程度を増幅できるように設計したFとGプライマー(下記表4)を用いてPCRを行った。各断片の増幅には、KOD FX(東洋紡)を用いた。テンプレートは、滅菌した1.5ml容のマイクロチューブに100μlずつ分注したBufferA(1M KCl、10mM EDTA、100mM Tris-HCl、pH8.5)に各形質転換体の菌糸と胞子をそれぞれ懸濁し、5分間ボルテックスした後に、95℃で10分間煮沸後、さらに5分間ボルテックスし、15000rpm、 4℃で1分間遠心分離して得られた上清1μlを用いた。PCRの結果、欠失破壊用DNA断片に相当する大きさのDNA断片の増幅が認められ、且つFG間の増幅が認められなかったものをホモカリオン欠失破壊株、野生株の場合と同じ大きさのDNA断片の増幅のみが見られ、且つFG間の増幅がみられたものはadeAがectopicに取り込まれた非欠失破壊株、欠失破壊用DNA断片に相当する大きさのDNA断片並びに野生株の場合と同じ大きさのDNA断片の増幅とFG間の増幅がみられたものは、ヘテロカリオン欠失株とした。以後の実験では、ホモカリオン欠失破壊株を使用した。
プレート上でのコウジ酸産生への影響は、遺伝子破壊株を、コウジ酸を産生する条件で生育させ、培地に分泌されたコウジ酸と予め培地に混入させた塩化第二鉄とのキレートによる赤色発色により判断した。
上述のようにコウジ酸は、第二塩化鉄とのキレート化合物の生成による赤色の発色により検出することが可能である。さらにコウジ酸量は、培養液を適宜希釈した試料に最終濃度として1mM〜5mMになるように塩化第二鉄溶液を添加した液の、495nmにおける吸光度を測定することで定量することができる。また、この495nmの吸光度は、0.1〜1.0程度の範囲でコウジ酸濃度に比例する。このような検出法により麹菌培養液を適宜希釈し、そのコウジ酸濃度の定量が可能である。
下記の組成に5mM になるように塩化第二鉄を添加したM培地(最小培地)を作製し、5*107 conidia/mlに調整した分生子懸濁液を培地の中心に2μl植菌し、30℃、飽和蒸気圧で5日間培養した。
上記で得られた遺伝子破壊株について、ジェノトキシン存在下での菌糸の成長を調べた。ジェノトキシンとして、トポイソメラーゼ阻害剤であるカンプトテシン(CPT)及びDNAのアルキル化剤であるメチルメタンスルフォネート(MMS)を用いた。終濃度1μMのCPT又は終濃度0.1%のMMSを加えたM培地(最小培地)の中央に麹菌分生子を播種し、30℃で5日間培養した。円状に繁殖した菌糸の直径を測定し、ジェノトキシン非添加(Non-stress)の培地上での直径と相対評価した。結果を図5に示す。
control株の分生子と遺伝子破壊株の分生子を表6に示すInitial conditionで混和し、5μM CPTまたは0.05%MMS存在下で穏やかに振とうしながら30℃、8時間培養した。その後、孔経が5μmのフィルターで濾過し、ろ液を0.3% Triton-X100を含んだプレートに塗布し、30℃で4-5日間培養した。得られたコロニーの形状(分生子の着生が悪いものを破壊株と判断)から各破壊株とコントロール株の比を算出した。
上記のコウジ酸産生培地に0, 50, 100mMのニコチンアミドを添加した培地を作成し、5*107 conidia/ ml に調整したcontrol株の分生子懸濁液を培地の中心に2μl植菌し、30℃、飽和蒸気圧で5日間培養した。
Claims (23)
- コウジ酸生産能を有する微生物において、Hst4遺伝子、Hos2遺伝子及びSpt3遺伝子並びにこれらにコードされるタンパク質から成る群より選択される少なくとも1つの機能を阻害する工程を含む、微生物のコウジ酸生産性を向上させる方法。
- 前記工程が、Hst4遺伝子、Hos2遺伝子及びSpt3遺伝子から成る群より選択される少なくとも1つの遺伝子を破壊することにより行なわれる請求項1記載の方法。
- 前記工程が、HST4、HOS2及びSPT3から成る群より選択される少なくとも1つのタンパク質の阻害剤で前記微生物を処理することにより行なわれる請求項1記載の方法。
- 前記阻害剤が、サーチュイン阻害剤及び古典的ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤から成る群より選択される少なくとも1つである請求項3記載の方法。
- 前記サーチュイン阻害剤が、ニコチンアミド及び2-アニリノベンズアミドから成る群より選択される少なくとも1種であり、前記古典的ヒストン脱アセチル化酵素阻害剤が、HC毒素、トリコスタチンA及びn-酪酸から成る群より選択される少なくとも1種である請求項4記載の方法。
- 前記微生物が麹菌を含むアスペルギルス属菌又はペニシリウム属菌である請求項1ないし5のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が麹菌である請求項6記載の方法。
- 請求項1ないし7のいずれか1項に記載の方法でコウジ酸の生産性が向上された微生物を培養し、該微生物が生産したコウジ酸を回収することを含む、コウジ酸の製造方法。
- Hst4遺伝子、Hos2遺伝子及びSpt3遺伝子から成る群より選択される少なくとも1つの遺伝子の機能が阻害されている、コウジ酸生産性の高い微生物。
- 前記少なくとも1つの遺伝子が破壊されたゲノムを有する請求項9記載の微生物。
- 麹菌を含むアスペルギルス属菌又はペニシリウム属菌である請求項9又は10記載の微生物。
- 麹菌である請求項11記載の微生物。
- コウジ酸生産能を有する微生物をジェノトキシンで処理し、ジェノトキシン感受性が高い菌株を選抜することを含む、コウジ酸生産性の高い微生物の育種方法。
- 変異原処理した微生物をジェノトキシンで処理する請求項13記載の方法。
- 前記ジェノトキシンが、トポイソメラーゼ阻害剤又はDNAアルキル化剤である請求項13又は14記載の方法。
- 前記微生物が麹菌を含むアスペルギルス属菌又はペニシリウム属菌である請求項13ないし15のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が麹菌である請求項16記載の方法。
- 配列番号3に示す塩基配列中の1nt-2000ntの領域内の連続する30塩基以上の領域と相同な領域からなる第1の相同領域と、配列番号3に示す塩基配列中の3785nt-5142ntの領域内の連続する30塩基以上の領域と相同な領域からなる第2の相同領域とを含み、正常なHst4遺伝子を含まないDNA断片を、コウジ酸生産能を有する微生物の細胞に導入し、該DNA断片と微生物ゲノムとの間で相同組換えを生じさせることを含む、コウジ酸生産性が向上した微生物の製造方法。
- 配列番号6に示す塩基配列中の1nt-2856ntの領域内の連続する30塩基以上の領域と相同な領域からなる第1の相同領域と、配列番号6に示す塩基配列中の4318nt-5694ntの領域内の連続する30塩基以上の領域と相同な領域からなる第2の相同領域とを含み、正常なHos2遺伝子を含まないDNA断片を、コウジ酸生産能を有する微生物の細胞に導入し、該DNA断片と微生物ゲノムとの間で相同組換えを生じさせることを含む、コウジ酸生産性が向上した微生物の製造方法。
- 配列番号9に示す塩基配列中の1nt-2000ntの領域内の連続する30塩基以上の領域と相同な領域からなる第1の相同領域と、配列番号9に示す塩基配列中の4299nt-5594ntの領域内の連続する30塩基以上の領域と相同な領域からなる第2の相同領域とを含み、正常なSpt3遺伝子を含まないDNA断片を、コウジ酸生産能を有する微生物の細胞に導入し、該DNA断片と微生物ゲノムとの間で相同組換えを生じさせることを含む、コウジ酸生産性が向上した微生物の製造方法。
- 前記微生物が麹菌を含むアスペルギルス属菌又はペニシリウム属菌である請求項18ないし20のいずれか1項に記載の方法。
- 前記微生物が麹菌である請求項21記載の方法。
- 下記のいずれかのDNA断片。
(1) 配列番号3に示す塩基配列中の1nt-2000ntの領域内の連続する30塩基以上の領域と相同な領域からなる第1の相同領域と、配列番号3に示す塩基配列中の3785nt-5142ntの領域内の連続する30塩基以上の領域と相同な領域からなる第2の相同領域とを含み、正常なHst4遺伝子を含まないDNA断片。
(2) 配列番号6に示す塩基配列中の1nt-2856ntの領域内の連続する30塩基以上の領域と相同な領域からなる第1の相同領域と、配列番号6に示す塩基配列中の4318nt-5694ntの領域内の連続する30塩基以上の領域と相同な領域からなる第2の相同領域とを含み、正常なHos2遺伝子を含まないDNA断片。
(3) 配列番号9に示す塩基配列中の1nt-2000ntの領域内の連続する30塩基以上の領域と相同な領域からなる第1の相同領域と、配列番号9に示す塩基配列中の4299nt-5594ntの領域内の連続する30塩基以上の領域と相同な領域からなる第2の相同領域とを含み、正常なSpt3遺伝子を含まないDNA断片。
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