JP2020503037A5

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Publication number: JP2020503037A5
Application number: JP2019535247A
Authority: JP
Filing date: 2017-12-29
Publication date: 2021-02-04

Description

本発明の実施形態において、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
糸状菌株を産生するための方法であって、
ａ．）糸状菌細胞の培養物から調製された、複数のプロトプラストを提供するステップと、
ｂ．）前記複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換するステップであって、前記第１のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接した第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の第２の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接した第２のポリヌクレオチドを含み、形質転換が、相同組換えによる、前記第１の遺伝子座への前記第１のコンストラクトの組込み、および前記第２の遺伝子座への前記第２のコンストラクトの組込みをもたらし、少なくとも前記第２の遺伝子座が、前記プロトプラストゲノム内の第１の選択可能マーカー遺伝子であり、前記第１のポリヌクレオチドが、変異および／または遺伝子制御エレメントを含む、ステップと、
ｃ．）選択および対抗選択を実施することにより、ホモカリオンの形質転換体を精製するステップと、
ｄ．）前記糸状菌細胞の再生を促す培地において、精製された前記形質転換体を増殖させるステップと
を含む、方法。
（項目２）
糸状菌株を産生するための方法であって、
ａ．）糸状菌細胞の培養物から調製された、複数のプロトプラストを提供するステップと、
ｂ．）前記複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換するステップであって、前記第１のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の遺伝子座に相同なヌクレオチドが隣接した第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の前記遺伝子座に相同なヌクレオチドが隣接した第２のポリヌクレオチドを含み、前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドが、選択可能マーカーの相補的な部分を含み、前記第１のコンストラクトおよび／または前記第２のコンストラクトが、変異または遺伝子制御エレメントをさらに含み、形質転換が、相同組換えによる、前記遺伝子座への前記第１のポリヌクレオチドおよび前記第２のポリヌクレオチドならびに前記変異または前記遺伝子制御エレメントの組込みをもたらす、ステップと、
ｃ．）選択および対抗選択を実施することにより、ホモカリオンの形質転換体を精製するステップと、
ｄ．）前記糸状菌細胞の再生を促す培地において、精製された前記形質転換体を増殖させるステップと
を含む、方法。
（項目３）
前記複数のプロトプラストのうちの各プロトプラストが、複数の第１のコンストラクトのうちの単一の第１のコンストラクトおよび複数の第２のコンストラクトのうちの単一の第２のコンストラクトで形質転換され、前記複数の第１のコンストラクトのうちそれぞれの第１のコンストラクトにおける前記第１のポリヌクレオチドが、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを含み、前記複数の第２のコンストラクトのうちそれぞれの第２のコンストラクトにおける前記第２のポリヌクレオチドが同一である、項目１または２に記載の方法。
（項目４）
ステップａ〜ｄを繰り返して糸状菌細胞のライブラリーを生成するステップをさらに含み、前記ライブラリーにおける各糸状菌細胞が、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを有する第１のポリヌクレオチドを含む、項目１または２に記載の方法。
（項目５）
前記第１のポリヌクレオチドが、標的糸状菌遺伝子または異種遺伝子をコードする、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目６）
前記変異が、一塩基多型である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目７）
遺伝子制御が、プロモーター配列および／またはターミネーター配列である、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目８）
前記複数のプロトプラストが、マイクロタイタープレートのウェルに分配される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目９）
ステップａ〜ｄが、マイクロタイタープレートのウェルにおいて実施される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１０）
前記マイクロタイタープレートが、９６ウェル、３８４ウェル、または１５３６ウェルのマイクロタイタープレートである、項目８または９に記載の方法。
（項目１１）
前記糸状菌細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはこれらの完全世代もしくは不完全世代および同義語もしくは分類学的等価物から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１２）
前記糸状菌細胞が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒである、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１３）
前記糸状菌細胞が、菌糸体を形成しない表現型を有する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１４）
前記真菌細胞が、非機能性の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）経路を有する、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目１５）
前記ＮＨＥＪ経路が、前記ＮＨＥＪ経路のコンポーネントに対する抗体、化学阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、またはアンチセンスもしくはＲＮＡｉ分子に前記細胞を曝露することによって非機能性にされている、項目１４に記載の方法。
（項目１６）
前記第１の遺伝子座が、前記標的糸状菌遺伝子のためのものである、項目５から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１７）
前記第１の遺伝子座が、前記プロトプラストゲノムにおける第２の選択可能マーカー遺伝子のためのものである、項目１および３から１５のいずれか一項に記載の方法。
（項目１８）
前記第２の選択可能マーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子、発色マーカー遺伝子、または方向性マーカー遺伝子から選択される、項目１７に記載の方法。
（項目１９）
前記第１の選択可能マーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子、発色マーカー遺伝子、または方向性マーカー遺伝子から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２０）
前記第２のポリヌクレオチドが、栄養要求性マーカー遺伝子、方向性マーカー遺伝子、または抗生物質耐性遺伝子から選択される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２１）
前記発色マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子である、項目１８または１９に記載の方法。
（項目２２）
前記栄養要求性マーカー遺伝子が、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される、項目１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２３）
前記方向性マーカー遺伝子が、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子、硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｉａＤ）、または硫酸パーミアーゼ（ＳｕｔＢ）遺伝子から選択される、項目１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
（項目２４）
前記抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌｅ遺伝子であり、前記ｂｌｅ遺伝子が、フレオマイシン（ｐｈｅｏｍｙｃｉｎ）への耐性を付与する、項目２０に記載の方法。
（項目２５）
前記第１の選択可能マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドが、ｐｙｒＧ遺伝子である、項目１６に記載の方法。
（項目２６）
前記第１の選択可能マーカー遺伝子が、ｍｅｔ３遺伝子であり、前記第２の選択可能マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドが、ｐｙｒＧ遺伝子である、項目１７から２４のいずれか一項に記載の方法。
（項目２７）
前記複数のプロトプラストが、糸状菌細胞の前記培養物中の前記糸状菌細胞から細胞壁を除去するステップと、前記複数のプロトプラストを単離するステップと、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む混合物中に、単離された前記複数のプロトプラストを再懸濁させるステップであって、ＤＭＳＯの最終濃度が７％ｖ／ｖまたはそれ未満である、ステップとによって調製される、上記項目のいずれか一項に記載の方法。
（項目２８）
前記混合物が、ステップａ〜ｄを実施する前に少なくとも−２０℃または−８０℃で保存される、項目２７に記載の方法。
（項目２９）
前記培養物が、少なくとも１リットルの体積である、項目２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３０）
前記培養物を、前記プロトプラストの調製前に少なくとも１２時間にわたって増殖させる、項目２７から２９のいずれか一項に記載の方法。
（項目３１）
真菌培養物を、前記プロトプラストの少なくとも７０％がより小さくなり、かつより少ない核を含有する条件下で増殖させる、項目２７から３０のいずれか一項に記載の方法。
（項目３２）
前記細胞壁を除去するステップが、酵素消化によって実施される、項目２７から３１のいずれか一項に記載の方法。
（項目３３）
前記酵素消化が、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実施される、項目３２に記載の方法。
（項目３４）
前記プロトプラストを保存する前に、ＤＭＳＯを含む前記混合物に４０％ｖ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加するステップをさらに含む、項目２７から３３のいずれか一項に記載の方法。
（項目３５）
前記ＰＥＧが、８％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度まで添加される、項目３４に記載の方法。
（項目３６）
ステップａ〜ｄが自動化されている、上記項目のいずれかに記載の方法。
（項目３７）
保存のための糸状菌細胞を調製するための方法であって、
糸状菌細胞を含む真菌培養物からプロトプラストを調製するステップであって、前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞から細胞壁を除去することを含む、ステップと、
前記プロトプラストを単離するステップと、
７％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度でジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む混合物中に、単離された前記プロトプラストを再懸濁させるステップと
を含む、方法。
（項目３８）
前記混合物が、少なくとも−２０℃または−８０℃で保存される、項目３７に記載の方法。
（項目３９）
前記真菌培養物が、少なくとも１リットルの体積である、項目３７から３８のいずれか一項に記載の方法。
（項目４０）
前記真菌培養物を、前記プロトプラストの調製前に少なくとも１２時間にわたって増殖させる、項目３７から３９のいずれか一項に記載の方法。
（項目４１）
前記真菌培養物を、前記プロトプラストの少なくとも７０％がより小さくなり、かつより少ない核を有する条件下で増殖させる、項目３７から４０のいずれかに記載の方法。
（項目４２）
前記細胞壁を除去するステップが、酵素消化によって実施される、項目３７から４１のいずれか一項に記載の方法。
（項目４３）
前記酵素消化が、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実施される、項目４２に記載の方法。
（項目４４）
前記プロトプラストを保存する前に、ＤＭＳＯを含む前記混合物に４０％ｖ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加するステップをさらに含む、項目３７から４３のいずれか一項に記載の方法。
（項目４５）
前記ＰＥＧが、８％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度まで添加される、項目４４に記載の方法。
（項目４６）
前記プロトプラストを保存する前に、前記プロトプラストをマイクロタイタープレートに分配するステップをさらに含む、項目３７から４５のいずれか一項に記載の方法。
（項目４７）
前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞が、菌糸体を形成しない表現型を有する、項目３７から４６のいずれか一項に記載の方法。
（項目４８）
前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはこれらの完全世代もしくは不完全世代および同義語もしくは分類学的等価物から選択される、項目３７から４７のいずれか一項に記載の方法。
（項目４９）
前記真菌培養物中の前記糸状菌細胞が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒまたはその完全世代もしくは不完全世代である、項目４７に記載の方法。
（項目５０）
真菌産生株を生成するためのシステムであって、
１つまたは複数のプロセッサー、ならびに
前記１つまたは複数のプロセッサーのうちの少なくとも１つに作動可能にカップリングされた１つまたは複数のメモリーであって、前記１つまたは複数のプロセッサーのうちの少なくとも１つによって実行されるとき、前記システムに、
ａ．）糸状菌細胞の培養物に由来する複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換するステップであって、前記第１のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接した第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の第２の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接した第２のポリヌクレオチドを含み、形質転換が、相同組換えによる、前記第１の遺伝子座への前記第１のコンストラクトの組込み、および前記第２の遺伝子座への前記第２のコンストラクトの組込みをもたらし、少なくとも前記第２の遺伝子座が、前記プロトプラストゲノム内の第１の選択可能マーカー遺伝子であり、前記第１のポリヌクレオチドが、変異および／または遺伝子制御エレメントを含む、ステップと、
ｂ．）選択および対抗選択を実施することにより、ホモカリオンの形質転換体を精製するステップと、
ｃ．）前記糸状菌細胞の再生を促す培地において、精製された前記形質転換体を増殖させるステップと
をさせる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を含む、システム。
（項目５１）
前記複数のプロトプラストのうちの各プロトプラストが、複数の第１のコンストラクトのうちの単一の第１のコンストラクトおよび複数の第２のコンストラクトのうちの単一の第２のコンストラクトで形質転換され、前記複数の第１のコンストラクトのうちそれぞれの第１のコンストラクトにおける前記第１のポリヌクレオチドが、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを含み、前記複数の第２のコンストラクトのうちそれぞれの第２のコンストラクトにおける前記第２のポリヌクレオチドが同一である、項目５０に記載のシステム。
（項目５２）
ステップａ〜ｃを繰り返して糸状菌細胞のライブラリーを生成する命令をさらに含み、前記ライブラリーにおける各糸状菌細胞が、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを有する第１のポリヌクレオチドを含む、項目５０に記載のシステム。
（項目５３）
前記変異が、一塩基多型である、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目５４）
遺伝子制御が、プロモーター配列および／またはターミネーター配列である、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目５５）
ステップａ〜ｃが、マイクロタイタープレートのウェルにおいて実施される、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目５６）
前記マイクロタイタープレートが、９６ウェル、３８４ウェル、または１５３６ウェルのマイクロタイタープレートである、項目５５に記載のシステム。
（項目５７）
前記糸状菌細胞が、Ａｃｈｌｙａ、Ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ、Ａｕｒｅｏｂａｓｉｄｉｕｍ、Ｂｊｅｒｋａｎｄｅｒａ、Ｃｅｒｉｐｏｒｉｏｐｓｉｓ、Ｃｅｐｈａｌｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｈｒｙｓｏｓｐｏｒｉｕｍ、Ｃｏｃｈｌｉｏｂｏｌｕｓ、Ｃｏｒｙｎａｓｃｕｓ、Ｃｒｙｐｈｏｎｅｃｔｒｉａ、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ、Ｃｏｐｒｉｎｕｓ、Ｃｏｒｉｏｌｕｓ、Ｄｉｐｌｏｄｉａ、Ｅｎｄｏｔｈｉｓ、Ｆｕｓａｒｉｕｍ、Ｇｉｂｂｅｒｅｌｌａ、Ｇｌｉｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｈｕｍｉｃｏｌａ、Ｈｙｐｏｃｒｅａ、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａ（例えば、Ｍｙｃｅｌｉｏｐｈｔｈｏｒａｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌａ）、Ｍｕｃｏｒ、Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ、Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｐｏｄｏｓｐｏｒａ、Ｐｈｌｅｂｉａ、Ｐｉｒｏｍｙｃｅｓ、Ｐｙｒｉｃｕｌａｒｉａ、Ｒｈｉｚｏｍｕｃｏｒ、Ｒｈｉｚｏｐｕｓ、Ｓｃｈｉｚｏｐｈｙｌｌｕｍ、Ｓｃｙｔａｌｉｄｉｕｍ、Ｓｐｏｒｏｔｒｉｃｈｕｍ、Ｔａｌａｒｏｍｙｃｅｓ、Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ、Ｔｈｉｅｌａｖｉａ、Ｔｒａｍａｔｅｓ、Ｔｏｌｙｐｏｃｌａｄｉｕｍ、Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ、Ｖｅｒｔｉｃｉｌｌｉｕｍ、Ｖｏｌｖａｒｉｅｌｌａ種、またはこれらの完全世代もしくは不完全世代および同義語もしくは分類学的等価物から選択される、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目５８）
前記糸状菌細胞が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒである、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目５９）
前記糸状菌細胞が、菌糸体を形成しない表現型を有する、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目６０）
前記真菌細胞が、非機能性の非相同末端接合経路を有する、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目６１）
前記ＮＨＥＪ経路が、前記ＮＨＥＪ経路のコンポーネントに対する抗体、化学阻害剤、タンパク質阻害剤、物理的阻害剤、ペプチド阻害剤、またはアンチセンスもしくはＲＮＡ
ｉ分子に前記細胞を曝露することによって非機能性にされている、項目６０に記載のシステム。
（項目６２）
前記第１の遺伝子座が、前記標的糸状菌遺伝子のためのものである、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目６３）
前記第１の遺伝子座が、前記プロトプラストゲノムにおける第２の選択可能マーカー遺伝子のためのものである、項目５０から６１のいずれか一項に記載のシステム。
（項目６４）
前記第２の選択可能マーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子、発色マーカー遺伝子、または方向性マーカー遺伝子から選択される、項目６３に記載のシステム。
（項目６５）
前記第１の選択可能マーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子、発色マーカー遺伝子、または方向性マーカー遺伝子から選択される、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目６６）
前記第２のポリヌクレオチドが、栄養要求性マーカー遺伝子、方向性マーカー遺伝子、または抗生物質耐性遺伝子から選択される、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目６７）
前記発色マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子である、項目６４または６５に記載のシステム。
（項目６８）
前記栄養要求性マーカー遺伝子が、ａｒｇＢ遺伝子、ｔｒｐＣ遺伝子、ｐｙｒＧ遺伝子、またはｍｅｔ３遺伝子から選択される、項目６４から６６のいずれか一項に記載のシステム。
（項目６９）
前記方向性マーカー遺伝子が、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子、硝酸レダクターゼ遺伝子（ｎｌａＤ）、または硫酸パーミアーゼ（ＳｕｔＢ）遺伝子から選択される、項目６４から６６のいずれか一項に記載のシステム。
（項目７０）
前記抗生物質耐性遺伝子が、ｂｌｅ遺伝子であり、前記ｂｌｅ遺伝子が、フレオマイシン（ｐｈｅｏｍｙｃｉｎ）への耐性を付与する、項目６６に記載のシステム。
（項目７１）
前記第１の選択可能マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドが、ｐｙｒＧ遺伝子である、項目６２に記載のシステム。
（項目７２）
前記第１の選択可能マーカー遺伝子が、ｍｅｔ３遺伝子であり、前記第２の選択可能マーカー遺伝子が、ａｙｇＡ遺伝子であり、前記第２のポリヌクレオチドが、ｐｙｒＧ遺伝子である、項目５０から６１のいずれか一項に記載のシステム。
（項目７３）
前記複数のプロトプラストが、糸状菌細胞の前記培養物中の前記糸状菌細胞から細胞壁を除去するステップと、前記複数のプロトプラストを単離するステップと、７％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度のジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む混合物中に、単離された前記複数のプロトプラストを再懸濁させるステップステップとによって調製される、上記項目のいずれか一項に記載のシステム。
（項目７４）
前記混合物が、ステップａ〜ｃを実施する前に少なくとも−２０℃または−８０℃で保存される、項目７３に記載のシステム。
（項目７５）
前記培養物が、少なくとも１リットルの体積である、項目７３から７４のいずれか一項に記載のシステム。
（項目７６）
前記培養物を、前記プロトプラストの調製前に少なくとも１２時間にわたって増殖させる、項目７３から７５のいずれか一項に記載のシステム。
（項目７７）
真菌培養物を、前記プロトプラストの少なくとも７０％がより小さくなり、かつより少ない核を有する条件下で増殖させる、項目７３から７６のいずれか一項に記載のシステム。
（項目７８）
前記細胞壁を除去するステップが、酵素消化によって実施される、項目７３から７６のいずれか一項に記載のシステム。
（項目７９）
前記酵素消化が、ベータ−グルカナーゼおよびポリガラクツロナーゼを含む酵素の混合物を用いて実施される、項目７８に記載のシステム。
（項目８０）
前記プロトプラストを保存する前に、ＤＭＳＯを含む前記混合物に４０％ｖ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を添加するステップをさらに含む、項目５０から７９のいずれか一項に記載のシステム。
（項目８１）
前記ＰＥＧが、８％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度まで添加される、項目８０に記載のシステム。
定義
以下の用語は、当業者であればよく理解していると考えられるが、以下の定義を、本開示の主題の説明を容易にするために示す。

Claims

糸状菌株を産生するための方法であって、
（ａ）糸状菌細胞の培養物から調製された複数のプロトプラストを第１のコンストラクトおよび第２のコンストラクトで形質転換するステップであって、前記第１のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の第１の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接した第１のポリヌクレオチドを含み、前記第２のコンストラクトが、前記プロトプラストのゲノム内の第２の遺伝子座に相同なヌクレオチドが両側に隣接した第２のポリヌクレオチドを含み、前記形質転換が、相同組換えによる、前記第１の遺伝子座への前記第１のコンストラクトの組込み、および前記第２の遺伝子座への前記第２のコンストラクトの組込みをもたらし、少なくとも前記第２の遺伝子座が、前記プロトプラストゲノム内の第１の選択可能マーカー遺伝子であり、前記第１のポリヌクレオチドが、変異および／または遺伝子制御エレメントを含み、そうすることでホモカリオンの形質転換体およびヘテロカリオンの形質転換体の混合物を生成する、ステップと、
（ｂ）選択および対抗選択を実施することにより、ホモカリオンの形質転換体を精製するステップと、
（ｃ）前記糸状菌細胞の再生を促す培地において、精製された前記形質転換体を増殖させるステップと
を含み、ステップ（ａ）〜（ｃ）が自動化される、方法。
前記複数のプロトプラストのうちの各プロトプラストが、複数の第１のコンストラクトのうちの単一の第１のコンストラクトおよび複数の第２のコンストラクトのうちの単一の第２のコンストラクトで形質転換され、前記複数の第１のコンストラクトのうちそれぞれの第１のコンストラクトにおける前記第１のポリヌクレオチドが、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを含み、前記複数の第２のコンストラクトのうちそれぞれの第２のコンストラクトにおける前記第２のポリヌクレオチドが同一である、請求項１に記載の方法。
ステップ（ａ）〜（ｃ）を繰り返して糸状菌細胞のライブラリーを生成するステップをさらに含み、前記ライブラリーにおける各糸状菌細胞が、異なる変異および／または遺伝子制御エレメントを有する第１のポリヌクレオチドを含む、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記第１のポリヌクレオチドが、標的糸状菌遺伝子または異種遺伝子をコードする、請求項１に記載の方法。
前記変異が、一塩基多型であり、前記遺伝子制御エレメントが、プロモーター配列および／またはターミネーター配列である、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
ステップ（ａ）〜（ｃ）が、マイクロタイタープレートのウェルにおいて実施される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記糸状菌細胞が、Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒである、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記糸状菌細胞が、液内培養条件下で成長させた場合に菌糸体を形成しない表現型を有する、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記真菌細胞が、非機能性の非相同末端接合（ＮＨＥＪ）経路を有する、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記第１の遺伝子座が、前記標的糸状菌遺伝子または前記プロトプラストゲノムにおける第２の選択可能マーカー遺伝子のためのものであり、前記第２の選択可能マーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子、発色マーカー遺伝子、または方向性マーカー遺伝子から選択される、請求項４から９のいずれか一項に記載の方法。
前記第１の選択可能マーカー遺伝子が、栄養要求性マーカー遺伝子、発色マーカー遺伝子、または方向性マーカー遺伝子から選択される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記複数のプロトプラストが、糸状菌細胞の前記培養物中の前記糸状菌細胞から酵素消化によって細胞壁を除去するステップと、前記複数のプロトプラストを単離するステップと、ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）を含む混合物中に、単離された前記複数のプロトプラストを再懸濁させるステップであって、ＤＭＳＯの最終濃度が７％ｖ／ｖまたはそれ未満である、ステップと、４０％ｖ／ｖのポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を前記混合物に８％ｖ／ｖまたはそれ未満の最終濃度まで添加するステップとによって調製される、上記請求項のいずれか一項に記載の方法。
前記混合物が、ステップ（ａ）〜（ｃ）を実施する前に少なくとも−２０℃または−８０℃で保存される、請求項１２に記載の方法。
前記培養物が、少なくとも１リットルの体積である、請求項１２または１３に記載の方法。
ステップ（ａ）〜（ｃ）が、１日あたり少なくとも１０００、少なくとも５０００または少なくとも１０，０００の形質転換体を生成する、請求項１に記載の方法。
ステップ（ａ）〜（ｃ）が、自動化されたロボットシステムを使用して実施される、請求項１に記載の方法。
前記自動化されたロボットシステムが、ステップ（ａ）〜（ｃ）を実施するためのハイスループットピペット操作を可能にするロボット液体および粒子ハンドラーを含む、請求項１６に記載の方法。
前記自動化されたロボットシステムが、システムにおける１つまたは複数のプロセッサーと通信しており、前記１つまたは複数のプロセッサーはそれぞれ１つまたは複数のメモリーと通信している、請求項１６に記載の方法。
前記１つまたは複数のプロセッサーが、前記１つまたは複数のプロセッサーによって実行されるとき、前記システムにステップ（ａ）〜（ｃ）を実施させる、記憶された命令を含む、請求項１８に記載の方法。
真菌産生株を生成するためのシステムであって、
１つまたは複数のプロセッサー、ならびに
前記１つまたは複数のプロセッサーのうちの少なくとも１つに作動可能にカップリングされた１つまたは複数のメモリーであって、前記１つまたは複数のプロセッサーのうちの少なくとも１つによって実行されるとき、前記システムに請求項１に記載の方法のステップ（ａ）〜（ｃ）を実施させる、記憶された命令を有する１つまたは複数のメモリー
を含む、システム。