CN109136252B - 用于改变里氏木霉菌丝形态的重组表达载体及其应用 - Google Patents

用于改变里氏木霉菌丝形态的重组表达载体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于农业生物技术领域，具体涉及用于改变里氏木霉菌丝形态的重组表达载体及其应用。本发明构建含有barA1基因和/或barA2基因的重组表达载体，并用其转化里氏木霉，得到菌性形态改变的重组里氏木霉，进而提高了里氏木霉的蛋白表达量和纤维素酶酶活。

Description

用于改变里氏木霉菌丝形态的重组表达载体及其应用
技术领域
本发明属于农业生物技术领域，具体涉及用于改变里氏木霉菌丝形态的重组表达载体及其应用。
背景技术
丝状真菌具有菌丝极性生长的独有特性，其能产生一种热稳定性抗真菌因子类化合物，该类化合物能够调节菌丝端点处隔膜和甲酸精定位，进而影响菌丝极性的生长。里氏木霉(Trichoderma reesei)是当今生产纤维素酶的主要工业丝状真菌，其纤维素酶产量高、稳定性好、易于分离纯化。里氏木霉不但具有菌丝极性生长的丝状真菌特性，而且里氏木霉也具有好氧真菌的特性，其产酶过程和线粒体的呼吸代谢紧密相关。在液体发酵过程中，一方面里氏木霉需要充足的氧气来维持细胞的生长、代谢和产酶，另一方面极性生长、粘度高的菌丝则严重阻碍搅拌和氧气传递，导致细胞生长代谢活动减慢，生长发育迟缓甚至凋亡。
因此，现有的里氏木霉的菌丝形态导致发酵过程中溶氧及氧气传递能力较低，进而影响其蛋白生产能力，使其不能满足工业上的需求。
发明内容
为了解决现有的里氏木霉溶氧能力差、蛋白产量不能满足工业需要的问题，本发明提供一种用于改变里氏木霉菌丝形态的重组表达载体。
本发明的目的在于提供用于改变里氏木霉菌丝形态的重组表达载体。
本发明的再一目的在于提供含有上述载体的重组里氏木霉。
本发明的再一目的在于提供含有上述载体的重组里氏木霉的制备方法。
本发明的再一目的在于提供上述重组表达载体的应用。
本发明提供了用于改变里氏木霉菌丝形态的重组表达载体，所述重组表达载体中包括barA1基因和/或barA2基因。
根据本发明的具体实施方式，用于改变里氏木霉菌丝形态的重组表达载体的基因表达盒中由上游到下游依次包括表达原件：pdc1启动子、barA1基因和/或barA2基因、eno1启动子，其中，所述barA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述barA2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
barA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
ACTGACACCACTGGCGGAAGCCTGCTTCTTAAGCCCGTTGCGTCGCTCCCAGCTCTTGAGGTCCAGCTCTTCCACGCCCACCTCCTGCTCCAGCGGCTGCACCTCTTCGTAGATGAGCTCCTCCTCGTCCTCTCCCTCCTCACCCTCGTCATCGCTTCGGGTATCCTCTGCGCCGTCTCCGCGGAGAACCTTGATGGCAACGCGGACGATCATGCAGAACCAGAAAATCGTAATGCCCTGCAGCAGGAGGAGGGGCGTGAGGAAAGCCCACTTGACCGTCTCGTTGTAGCACACGCGACCCGTCGAGTTGAAGAAGGGCTCAATCAGGTACGTGAAGCCCGAGGGGGCTTCAAAGGGGCCCTGCAGCGACGAATTCGGTCCGGCGAAGCATCCGTTGGGCATGATCTCGGGGGTGTGGGCGTAGATGGACCAGCAGACGGCCAGGTAGAAGACGTGACGCGCGATGAACCAGGTCACCATGAAGAGGCCAAAGGTCACGTCGCACAGCGTGGAGAAGCCGC
barA2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示:
GTCAAAGTGTTCGTAGTCGGCAGGATTCAGGCCTTCCAGCTCACGCGGCAGATCTTCGCCTTCTTCCTCCTCCTCGTCTTCGCTGCGGACGTCGTCTGCGTTGTGGCCTCCGAGGACGCGGAGGGCGACTTGCAAGATGGAGTAGCCCCAAATGAGCATGAGACCCTCCAGAACGGCGAGGTAGGCGAAGAAGCCGTTGAGGATGCCGCTGCTGACGCAGACGATGCCCTGTGGCTGGCTGAACGGCTCGAGCATCCACGACCATCCCTCGGGCTGTGGGAGCGGACCCTGGAGGTCGGACATGGAGCCCCGGTAGCACGCGCGCGGGAGGATGCTTCGAGCGTCAAAGTAGACGCTGTAGAGAACCATGCTGAAGAAGACGTGGCGGGTGGCCAGCCAGACGGCGACGAAGAGGCCAAAGAGACAGTCGCAGACGCGGCTGTAGCCCAGGTAGC
pdc1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：
CGATGAAAGCCTTGCAACTGTGGTGATGTGGCTCATCAATGTGCGACGTCGTATCCATGTCTGAGGCCATTCGATATCGTGATGCGACTACCTAGTAAAGCCCGGCCAGAGGGCAAACCGGGGCGACAGGGGCAGGCAATTGACCGGATGGCTGCATGTGCCGAAGCAGCCCCGATGGAATCGAGATGTCTGTCGGATGGACCGCTGAGCGGCCTGGCAAGGTGTCCCAGATACGAAGATGGAAGTGAAGTCAGAGGTGGTCGTTAATTGTCCGACGAGCGAATCGGCCGCTCCTTCGGATTGCCGGCTCTGCTGTATGTACCGTGCATGAAGCCACCCGGGATCCATGTTACGATGGATAGGTTCCAACTCTCTAGTAGCTATAGTGGACCTGAGGCTATCTAGTATCACTGGAGGAGCAGCCGTCCACTATCGTCGAGCGCTGTAGAAGCAGCTGCATTAGCGGCTGCCCACCCGCGCAGAAATGGCCCCATTACATCACTATCATGACAGCGGCGCGTCCAAAAGTGAGCTCATGCTTGCCGATGGCACGAGCAGCTGCAACTGGCGGGGCTCCTGCCTGCCGTCTCCGGTGCCGCTGCCCATTTGAGTTTGTCCGAGCTGTTGATGGTTGAAACCGAGACCGATGGATGATTCAACACTTCGAAGTCTAGGTAGATAAAAAACATCTATATATCCTCATTCATTGCCCTGTCAGTGTGTTGGCTCACGTCTCCAATCCTCCGCCCCTCCTCCTGCAAAGTAAATACCTTCTCAAAACACGTCTGGAATCCTGCAAGTCTCCATCACAAGGAGCTTCTTCATCAACCACCTTATACGAGCAACATCATTTGCATCATCGTTGATCCACATCTCCTCGCGCCTCAGAGTGTCGTCACCAGTATAAATAACCGCATCAAGCTCTCGTCCTTCTTCGTTCCACAATCCAAGAAGCACCTCAAAACGATCAAAGCAGCGCAGCTACAGCACAATC
eno1启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：
TTTGAAGCTATTTCAGGTGGCTGGATGGACCCAATGTCTGTTAGCAGGTGTATTCGAAGCTATCTCGGGAGGTAGGTAGCTGGGCGATCACGACATCGAAAGTGAAGCCCGCGCGAGATGACGGAGCCAAGTTCGATGGCAATGCATCATTCCTCTGGTATACAAGAGCTCCCGCGGATAGCAAAATCCAGCCAGAGGAGCGAAACAAGTATATTGAGAATATGCCTCAACACGTTCCGCCAGACGCCGCGTCTTTCAGCAGCTCTGCCCCCCCAAATGGAGGGGTAGCTGGGAAGGCTGAAACGGGAAAGAGGGGCAGAAGCTTGGACGACAGAGAACAAGGTCTGCCTCTTGTAGAGATCAAGTAAAGGGAGGCACCGTACCTGTAGTGGAGAAATGGATTGAGTGTCTCAGGCTCTTGCTGTGAGGCGTGATTGAGCAAGTCGAGAGAATCTTGGGGAGGGAAAAGGAAGAAGGATGGTGTTTTTGTTGTCGAGAGAAATGGAGGGGTCCAGAGAGAGCGAGACGGGTGGGGCAAGTCATGCCTTCCCTCGCAGATAACTGGATTAGCACTGCAAGTTACCTAACGAGAAACGGAGCTCTCAACCGGCAGGGCAGGCGCAGCTGGGGTGCTTGTGAGGTAATAATTGGGCCACTTGCCTGCCGGGTTACGTGAATCGGTAGACAGCGAGAAACGCTAGTCCTATTTCTCCGGCCTCTCAGCGAAAAAGTTTCTATCGCGACGCAGCGGCCGCTTGGCCTGATGCGGGCAGATACCTAAGATACGAAGAAGATCATGGACGAAAGACGCAGCGCTTTGTAATATCATTGCGACCATTTCTGATCCCGCTCGCTTCTCGCTTCTCATTCTCTCGTCATTTGTCTTACTTCCTACATAGTACTGCCTATACGTAGTACCTACACGTCCATTGAGCCTCCCCCCCCCCATGGATGCGTCACATCAGTTCGCGGCCGATGTCGCCTCTGCGGTATTTGAGAA
本发明构建了重组质粒pAPA-pdc1P-barA1-eno1P和pAPA-pdc1P-barA2-eno1P。上述质粒是将pdc1启动子、barA1和/或barA2基因、eno1启动子插入到pAPA质粒的EcoRI酶切位点后获得。
根据本发明的具体实施方式，制备菌丝形态改变的重组里氏木霉的方法包括以下步骤：
(1)将pdc1启动子、barA1基因和/或barA2基因、eno1启动子与质粒骨架连接，构建重组表达载体，其中，所述barA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述barA2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
(2)用步骤(1)得到的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组里氏木霉。
根据本发明的具体实施方式，上述重组表达载体可用于改良里氏木霉的菌丝形态、提高里氏木霉的纤维素酶表达量或提高里氏木霉的纤维素酶酶活等方面。
本发明将里氏木霉来源的、能够调控里氏木霉菌丝形态的基因(barA1/barA2)转化入里氏木霉并干扰其表达，从而筛选到里氏木霉菌丝形态发生改变、具有高分枝表型的菌株。在不同的MM碳源中培养基中，barA1及barA2转化子的生长速度都慢于原始菌株SUS1，且在MM葡萄糖液体培养基中，barA1及barA2转化子的菌丝形态呈小球状，发生明显变化；显微镜下观察菌丝分枝增多。
本发明构建的pAPA-pdc1P-barA1-eno11P质粒和pAPA-pdc1P-barA2-eno11P为双启动子质粒，载体构建效率高，干扰效率高，且干扰程度不一，可以从中选择不同干扰程度的转化子转录。经转入里氏木霉中，在pdc1启动子和eno1启动子的驱动下，转录出两段RNA，转录出的RNA在胞内会相互识别、退火并形成双链RNA结构，为RISC识别，进而被Dicer蛋白剪切为21-25nt的小RNA片段，指导里氏木霉基因组中barA1和barA2基因的mRNA的剪切。
本发明通过改变里氏木霉的菌丝形态，从而影响发酵过程中里氏木霉发酵液的粘度和溶氧，进而影响其产纤维素酶能力。结果表明，对里氏木霉进行基因工程改造，使其菌丝形态高枝化，有利于形成更多的菌丝端点，进而提高其蛋白分泌能力。
附图说明
图1显示PCR鉴定pAPA-pdc1P-barA1-eno1P质粒转化里氏木霉的情况，其中，M为DNA分子量，序号9为SUS1出发菌株，序号1-8和10-17为barA1各个转化子；
图2为48h时不同碳源下barA1和barA2代表性转化子与对照菌株SUS1的菌丝生长状态图；
图3为MM-液体葡萄糖培养基中barA1和barA2代表性转化子与对照菌株SUS1的菌丝状态图，其中，a为目测菌株在液体培养基中状态；b为显微镜下的菌丝形态。
具体实施方式
下述实施例中所述MM培养基的成分包括：(NH4)2SO4，5.0g/L；KH2PO4，15.0g/L；MgSO4·7H2O，0.6g/L；CaCl2·2H2O，0.6g/L；CoCl2·6H2O，0.0037g/L；FeSO4·7H2O，0.005g/L；ZnSO4·7H2O，0.0014g/L；MnSO4·H2O，0.0016g/L；葡萄糖(或微晶纤维素等碳源)，20g/L；所用溶剂为水。
实施例1.获得重组里氏木霉
1.构建重组质粒pAPA-pdc1P-barA1-eno1P、pAPA-pdc1P-barA2-eno1P
将pAPA-质粒用NotI和AscI酶切，电泳、回收线性化质粒载体，再将其和pdc1启动子、barA1基因、eno1启动子用同源重组的方法连接。转化大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞，涂布在LB培养基上，37℃静置培养12h。对平板上长出的大肠菌落做菌落PCR，以鉴定三个片段是否已经连接到pAPA上。将PCR鉴定为阳性的大肠菌落挑取并接种于3ml LB培养基(含100μg/ml氨苄)中，37℃、180rpm振摇培养过夜，提取质粒。将测序正确的质粒命名为pAPA-pdc1P-barA1-eno11P。
2.转化里氏木霉
将里氏木霉SUS1接种于土豆培养基(PDA)。平板上，30℃静置培养5d待其产孢，将孢子刮下并接种于100ml含有尿嘧啶的PDB培养基。在28℃、180rpm振摇培养过夜。在12层纱布上过滤收集萌发的菌丝，加入10mg/ml的酵母破壁酶，在28℃消化1-2小时。收集原生质体，将上述制备的pAPA-pdc1P-barA1-eno11P质粒以PEG介导的原生质体转化法转入里氏木霉SUS1菌株。
3.筛选重组转化子SUS1-barA1
转化子在含1M山梨醇的MM-葡萄糖琼脂培养基上生长、选择。挑取单个克隆，提取基因组DNA，通过PCR验证pAPA-pdc1P-barA1-eno11P质粒是否已经成功转化进入里氏木霉细胞。将PCR产物在1％琼脂糖胶上电泳，结果如图1所示，有9个转化子(5、10、11、12、13、14、15、16、17)出现和预期一致的条带，即500bp的DNA条带。因此，这些转化子为转入质粒pAPA-pdc1P-barA1-eno11P的阳性转化子。提取阳性转化子的质粒送去测序，将测序正确的阳性转化子命名为barA1-i。
用与上述方法相同的方法，构建质粒pAPA-pdc1P-barA2-eno11P、转化里氏木霉、筛选阳性转化子，将筛选得到的阳性转化子命名为barA2-i。
实施例2.SUS1、barA1-i和barA2-i重组转化子的菌丝形态观察
1.固体平板菌丝形态观察
接种1.0μL 2×107里氏木霉SUS1和barA1、barA2转化子菌株的孢子到MM+2％葡萄糖、MM+2％木聚糖、MM+2％乳糖、MM+2％纤维二糖、MM+2％木糖、MM+2％甘油、MM+2％微晶纤维素以及PDA培养基中,每个样品做三个平行。28℃静置培养，每12h观察并记录菌丝及孢子的生长状态，并测量菌丝长度。
如图2所示，在不同碳源的固体培养基中，重组菌barA1-i和barA2-i的代表性菌株bar1-5和bar2-15与出发菌株SUS1相比，其产孢及菌丝生长都发生了变化，在PDA培养基中的产孢速度明显减慢，在葡萄糖培养基上，其菌丝生长速度与野生型相似，但在木聚糖、乳糖、纤维二糖、木糖以及甘油培养基上的菌丝长度明显低于野生型，菌丝的分枝增多，高枝化程度明显。
2.液体培养基菌丝宏观及微观形态观察
接种2.0mL 2×107里氏木霉SUS1和重组转化子菌株的孢子到MM+2％葡萄糖液体培养基中，每隔24h观察菌丝的形态变化，并取样于40倍显微镜下观察菌丝的分枝状态。
实验结果如图3所示，在MM+葡萄糖液体培养基中，重组菌bar1-5和bar2-15与出发菌株SUS1相比，重组菌株的发酵液悬浮着紧实的小球状菌丝球，发酵液黏稠度明显降低；显微镜下观察菌丝的形态变化，里氏木霉中的同源基因被干扰的转化子菌株的菌丝端点处有较多的分枝生成，菌丝分枝数目明显增多。
本发明还对barA1-i、barA2-i转化子与出发菌株SUS1的纤维素酶酶活及分泌蛋白的浓度进行测定，结果表明，barA1-i和barA2-i重组转化子的蛋白浓度高于出发菌株SUS1，且对barA1-i和barA2-i重组转化子产纤维素酶酶活高于出发菌株SUS1。
序列表
<110> 中国农业科学院饲料研究所
<120> 用于改变里氏木霉菌丝形态的重组表达载体及其应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 521
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
actgacacca ctggcggaag cctgcttctt aagcccgttg cgtcgctccc agctcttgag 60
gtccagctct tccacgccca cctcctgctc cagcggctgc acctcttcgt agatgagctc 120
ctcctcgtcc tctccctcct caccctcgtc atcgcttcgg gtatcctctg cgccgtctcc 180
gcggagaacc ttgatggcaa cgcggacgat catgcagaac cagaaaatcg taatgccctg 240
cagcaggagg aggggcgtga ggaaagccca cttgaccgtc tcgttgtagc acacgcgacc 300
cgtcgagttg aagaagggct caatcaggta cgtgaagccc gagggggctt caaaggggcc 360
ctgcagcgac gaattcggtc cggcgaagca tccgttgggc atgatctcgg gggtgtgggc 420
gtagatggac cagcagacgg ccaggtagaa gacgtgacgc gcgatgaacc aggtcaccat 480
gaagaggcca aaggtcacgt cgcacagcgt ggagaagccg c 521
<210> 2
<211> 455
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gtcaaagtgt tcgtagtcgg caggattcag gccttccagc tcacgcggca gatcttcgcc 60
ttcttcctcc tcctcgtctt cgctgcggac gtcgtctgcg ttgtggcctc cgaggacgcg 120
gagggcgact tgcaagatgg agtagcccca aatgagcatg agaccctcca gaacggcgag 180
gtaggcgaag aagccgttga ggatgccgct gctgacgcag acgatgccct gtggctggct 240
gaacggctcg agcatccacg accatccctc gggctgtggg agcggaccct ggaggtcgga 300
catggagccc cggtagcacg cgcgcgggag gatgcttcga gcgtcaaagt agacgctgta 360
gagaaccatg ctgaagaaga cgtggcgggt ggccagccag acggcgacga agaggccaaa 420
gagacagtcg cagacgcggc tgtagcccag gtagc 455
<210> 3
<211> 994
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
cgatgaaagc cttgcaactg tggtgatgtg gctcatcaat gtgcgacgtc gtatccatgt 60
ctgaggccat tcgatatcgt gatgcgacta cctagtaaag cccggccaga gggcaaaccg 120
gggcgacagg ggcaggcaat tgaccggatg gctgcatgtg ccgaagcagc cccgatggaa 180
tcgagatgtc tgtcggatgg accgctgagc ggcctggcaa ggtgtcccag atacgaagat 240
ggaagtgaag tcagaggtgg tcgttaattg tccgacgagc gaatcggccg ctccttcgga 300
ttgccggctc tgctgtatgt accgtgcatg aagccacccg ggatccatgt tacgatggat 360
aggttccaac tctctagtag ctatagtgga cctgaggcta tctagtatca ctggaggagc 420
agccgtccac tatcgtcgag cgctgtagaa gcagctgcat tagcggctgc ccacccgcgc 480
agaaatggcc ccattacatc actatcatga cagcggcgcg tccaaaagtg agctcatgct 540
tgccgatggc acgagcagct gcaactggcg gggctcctgc ctgccgtctc cggtgccgct 600
gcccatttga gtttgtccga gctgttgatg gttgaaaccg agaccgatgg atgattcaac 660
acttcgaagt ctaggtagat aaaaaacatc tatatatcct cattcattgc cctgtcagtg 720
tgttggctca cgtctccaat cctccgcccc tcctcctgca aagtaaatac cttctcaaaa 780
cacgtctgga atcctgcaag tctccatcac aaggagcttc ttcatcaacc accttatacg 840
agcaacatca tttgcatcat cgttgatcca catctcctcg cgcctcagag tgtcgtcacc 900
agtataaata accgcatcaa gctctcgtcc ttcttcgttc cacaatccaa gaagcacctc 960
aaaacgatca aagcagcgca gctacagcac aatc 994
<210> 4
<211> 1000
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
tttgaagcta tttcaggtgg ctggatggac ccaatgtctg ttagcaggtg tattcgaagc 60
tatctcggga ggtaggtagc tgggcgatca cgacatcgaa agtgaagccc gcgcgagatg 120
acggagccaa gttcgatggc aatgcatcat tcctctggta tacaagagct cccgcggata 180
gcaaaatcca gccagaggag cgaaacaagt atattgagaa tatgcctcaa cacgttccgc 240
cagacgccgc gtctttcagc agctctgccc ccccaaatgg aggggtagct gggaaggctg 300
aaacgggaaa gaggggcaga agcttggacg acagagaaca aggtctgcct cttgtagaga 360
tcaagtaaag ggaggcaccg tacctgtagt ggagaaatgg attgagtgtc tcaggctctt 420
gctgtgaggc gtgattgagc aagtcgagag aatcttgggg agggaaaagg aagaaggatg 480
gtgtttttgt tgtcgagaga aatggagggg tccagagaga gcgagacggg tggggcaagt 540
catgccttcc ctcgcagata actggattag cactgcaagt tacctaacga gaaacggagc 600
tctcaaccgg cagggcaggc gcagctgggg tgcttgtgag gtaataattg ggccacttgc 660
ctgccgggtt acgtgaatcg gtagacagcg agaaacgcta gtcctatttc tccggcctct 720
cagcgaaaaa gtttctatcg cgacgcagcg gccgcttggc ctgatgcggg cagataccta 780
agatacgaag aagatcatgg acgaaagacg cagcgctttg taatatcatt gcgaccattt 840
ctgatcccgc tcgcttctcg cttctcattc tctcgtcatt tgtcttactt cctacatagt 900
actgcctata cgtagtacct acacgtccat tgagcctccc cccccccatg gatgcgtcac 960
atcagttcgc ggccgatgtc gcctctgcgg tatttgagaa 1000

Claims (6)

1.用于改变里氏木霉菌丝形态的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中包括barA1基因和/或barA2基因，其中，所述barA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述barA2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.根据权利要求1所述的用于改变里氏木霉菌丝形态的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体的基因表达盒中由上游到下游依次包括表达原件：pdc1启动子、barA1基因和/或barA2基因、eno1启动子。
3.菌丝形态改变的重组里氏木霉，其特征在于，所述重组里氏木霉是由权利要求1所述的用于改变里氏木霉菌丝形态的重组表达载体转化而成。
4.权利要求1所述的用于改变里氏木霉菌丝形态的重组表达载体用于提高里氏木霉的纤维素酶表达量或提高里氏木霉的纤维素酶酶活方面的应用。
5.一种改变里氏木霉的菌丝形态的方法，其特征在于，所述方法包括向里氏木霉中导入barA1基因和/或barA2基因的步骤。
6.根据权利要求5所述的改变里氏木霉菌丝形态的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将pdc1启动子、barA1基因和/或barA2基因、eno1启动子与质粒骨架连接，构建重组表达载体，其中，所述barA1基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述barA2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
(2)用步骤(1)得到的重组表达载体转化宿主细胞，得到重组里氏木霉。
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